BRPI0913384A2 - efeitos antitumorais de combinações de canabinóides - Google Patents

Abstract

efeitos antitumorais de combinações de canabinóides. a invenção refere-se ao uso de uma combinação de canabinóides, particularmente, tetraidrocanabinol (thc) e canabidiol (cbd), na fabricação de um medicamento para uso no tratarnento de câncer. em particular, o câncer a ser tratado é um tumor cerebral, mais particularmente, um glioma, ainda mais particularmente, um glioblastoma multiforme (gbm).

Description

§ . .Y 1/13

EFEITOS ANTITUMORAIS DE COMBINAÇÕES DE CANABINÓIDES q A presente invenção refere-se ao uso de uma combinação " de canabinóides na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de câncer. Em particular, o câncer a ser tratado 5 é um tumor cerebral, mais particularmente, um glioma, ainda mais particularmente, um glioblastoma multiforme (GBM) e a combinação de canabinóide preferencial compreendem tetraidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 10 O câncer é uma doença na qual um grupo de células exibe traços de crescimento descontrolado. Isto significa que as células crescem e se dividem alem dos níveis dos limites normais. As células também são capazes de invadir e destruir tecidos circundantes. Além disso, as células 15 cancerígenas, algumas vezes chamadas de metástase, significando que estas se espalham para outros locais no corpo através do sangue ou linfa.

A maioria dos cânceres é causada por anormalidades no material genético das células. Estas anormalidades podem 20 ocorrer devido aos efeitos de carcinógenos. Outras anormalidades genéticas promotoras de câncer podem ser aleatoriamente adquiridas através de erros na replicação de DNA ou são herdadas, e, dessa forma, presentes em todas as células desde o nascirnento.

25 As anormalidades genéticas encontradas no câncer tipicamente afetam duas classes gerais de genes. Os oncogenes promotores de câncer são frequentemente ativados em células cancerígenas, dando a estas células novas propriedades, tais como divisão e crescimento hiperativo, 30 proteção contra morte celular programada, perda de respeito

2 /13 por Iimites teciduais normais, e a capacidade de se q tornarem estabilizadas em diversos ambientes teciduais. Os genes supressores de tumor são frequentemente inativados em % células cancerígenas, resultando na perda de funções 5 normais náquelas células, tais como replicação de DNA acurada, controle sobre o ciclo celular, orientação e adesão no interior de tecidos, e interação com células protetoras do sistema imunológico.

Existem muitos tipos diferentes de câncer e o câncer é 10 usualmente classificado de acordo com o tipo de tecido do qual é originado.

O câncer é usualmente tratado por um ou mais dos seguintes: cirurgia, quimioterapia, terapia com radiação, imunoterapia e terapia com anticorpo monoclonal. O tipo de 15 terapia depende do local e do grau do tumor e do estágio da doença.

A remoção completa do câncer sem dano ao resto do corpo é o objetivo do tratamento. Algumas vezes isto pode ser realizado por cirurgia, mas a propensão de cânceres em 20 invadir tecido adjacente ou se espalhar para sítios distantes por metástase microscópica frequentemente lirnita sua eficácia. A eficácia da quimioterapia é frequentemente limitada pela toxicidade a outros tecidos no corpo. A radiação também causa dano ao tecido normal.

25 Os cânceres são conhecidos por are afetarem muitas áreas do corpo com os tipos mais comuns de cânceres incluindo: câncer do tubo bílico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer de intestino (incluindo câncer do cólon e câncer retal), câncer cerebral, câncer de mama, câncer do 30 sistema neuroendócrino (comurnente conhecido como um carcinóide), câncer de cérvice, câncer ocular, câncer do q esôfago, câncer da cabeça e de pescoço (este grupo inclui " carcinornas que começam nas células que formam o revestimento da boca, nariz, garganta, orelha ou a camada 5 superficial que cobre a língua), sarcorna de Kaposi, câncer renal, câncer da laringe, leucemia, câncer hepático, câncer pulmonar, câncer dos nós de linfa, linfoma de Hodgkin, Iinfoma de não Hodgkin, melanoma, mesotelioma, mieloma, câncer do ovário, câncer do pâncreas, câncer do pênis, 10 câncer da próstata, câncer de pele, sarcomas de tecido mole, câncer da medula espinhal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer de tireóide, câncer vaginal, câncer da vulva e câncer de útero.

Um tumor que se desenvolve no cérebro pode destruir ou 15 danificar as células cerebrais através da produção de inflamação, comprimindo outras partes do cérebro, induzindo o edema cerebral (inchaço cerebral) e podendo causar aumento na pressão intracraniana (pressão no interior do crânio).

20 A cada ano, aproximadamente 4300 pessoas no Reino Unido são diagnosticas com um tumor cerebral. Um tumor cerebral primário é urna massa criada pelo crescimento ou proliferação descontrolada de células no cérebro. Os tumores cerebrais primários malignos são mais propensos a 25 causar problemas através do espalhamento no tecido cerebral normal que circunda os mesmos e causando pressão e dano às áreas circundantes do cérebro. Estes tumores raramente se espalham para fora do cérebro, para outras partes do corpo.

Entretanto, os tumores cerebrais secundários ocorrem quando 30 as células cancerígenas de outras partes do corpo, tais como pulrnão ou seio se espalham para o cérebro. + A cirurgia é a opção de tratamento escolhida para " muitos tumores cerebrais. Alguns podem ser completamente excisados, mas aqueles que são profundos ou que infiltram 5 no tecido cerebral podem ter seu volume reduzido em vez de removidos.

A terapia com radiação e a quimioterapia podem ser recomendadas dependendo do tipo de tumor envolvido.

Os tumores celulares de glioma podem frequentemente 10 ser letais. O crescimento tumoral infiltrador difundido característico de gliomas frequentemente torna a remoção cirúrgica dos mesmos impossível e complicando profundamente o gerenciamento clínico destes pacientes.

O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum e 15 o tipo mais agressivo de tumor cerebral primário e corresponde a 52% de todos os casos de tumor cerebral primário e 20°ó de todos os tumores intracranianos.

Diferentes abordagens estão sendo pesquisadas a fim de melhorar a taxa de mortalidade de pacientes diagnosticados 20 com um glioma. Estas incluem terapias que têm como alvo as células de glioma, rnas deixam as células normais não danificadas, métodos que limitam o espalhamento das células cancerígenas e tratamentos que bloqueiam as moléculas de sobrevivência dos tumores.

25 Uma área de pesquisa envolve o uso de canabinóides como agentes antitumorais.

Os canabinóides são constituintes ativos de plantas cânabis e concluiu-se que os mesmos demonstram diversas propriedades farmacológicas.

30 Por exemplo, o documento EP1177790 (Guzman et al.)

descreve o tratamento de tuniores cerebrais pela . administração de um canabinóide natural ou sintético, " especificamente THC. Isto reivindica que a ativação de receptores específicos leva à morte seletiva das células 5 transformadas.

Recentemente, o canabinóide CBD tem mostrado que possui propriedades antitumorais (Massi et al. 2004). O trabalho descrito por este documento descreve efeitos antiproliferativos com o uso in-vitro de em linhagens de 10 células de glioma humano U87 e U373 e corn o uso in-vivo de células de glioma humano U87 subcutaneamente implantadas em camundongos nus.

Os gliomas malignos são tumores altamente infiltradores e proliferativos, que seguem um padrão 15 característico de crescimento. As células de glioma invadem as estruturas cerebrais normais adjacentes e vasos sanguíneos grandes circundantes.

Além disso, a patente anterior do depositante EP1802274 descreve o uso do canabinóide CBD para impedir o 20 progresso de células cancerígenas que migram de seu local do tumor primário para um sítio secundário.

Adicionalmente, Medical hypothesis (2006) vol. 66, páginas 234 a 246 discute os efeitos clínicos e fisiológicos de THC e CBD e apresenta um raciocínio para 25 sua combinação. Sob "neoplastic disease" (página 242) é atestado que o THC tem benefícios citotóxicos e que CBD também provou apresentar citostático/citotóxico. Sugere-se, erri vista dos efeitos analgésicos da combinação CBD:THC no tratamento do câncer, o beneficio colateral de THC e CBD na 30 náusea induzida por quimioterapia, e estes efeitos primários sobre o crescimento e espalhamento do tumor que a apresentam um forte argumento para ensaios clínicos " adicionais. Entretanto, a generalidade deste ensinamento não poderia prever os benefícios que poderiam ser 5 alcançados em combinação com o que, de outro modo, seria considerado sub-ideal (ou quantidades não efetivas) para o composto sozinho.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO De acordo com a presente invenção, é fornecido o uso 10 de uma combinação de canabinóides na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de câncer.

De preferência, os canabinóides compreendem ao menos tetraidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD).

De preferência, o THC e o CBD estão a uma razão entre 15 20:1 e 1:20 (THC:CBD).

Mais preferencialmente, o THC e o CBD estão a uma razão entre 5:1 e 1:5 (THC:CBD).

Mais preferencialmente, ainda, o THC e o CBD estão a uma razão entre 2:1 e 1:2, ainda mais preferencialmente, 20 aproximadamente 1:1.

Cada canabinóide é fornecido em uma quantidade terapeuticamente efetiva. As faixas de dosagem para o THC e o CBD podem ser determinadas por referência ao teor de canabinóide que está, de preferência, na faixa entre 5 e 25 100 mg do total de canabinóides.

O câncer a ser tratado pode ser um tumor cerebral.

Os tumores cerebrais são usualmente classificados de acordo com o local do tumor e o tipo de célula na qual o câncer começou a se desenvolver. Por exemplo, diferentes 30 tipos de tumor cerebral incluem: neuroma acústico,

7 /13 astrocitoma, linfoma do CNS, ependimoma, hemangioblastoma, © ineduloblastoma, meningioma, glioma, glioma misto, ' oligodendroglioma, tumores da região pineal e tumores pituitários.

5 Os gliomas são tumores das células gliais; estas células suportam e protegem as células nervosas no cérebro.

Os gliomas compreendem quase metade de todos os tumores cerebrais primários e um quinto de todos os tumores da medula espinhal primários.

10 A combinação de canabinóide da invenção é particularmente útil onde o tumor cerebral for um tumor glioma, rriais particularmente, glioblastoma multiforme (GBM).

Os um ou mais canabinóides podem estar presentes como 15 extratos vegetais, como compostos puros ou uma combinação dos dois.

Um extrato vegetal é definido como um extrato de um material vegetal conforme descrito por Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, August 20 2000, do US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Centre for Drug Evaluation and Research.

O material vegetal é definido como um vegetal ou parte do vegetal (por exemplo, casca, madeira, folhas, caules, 25 raízes, flores, frutos, sementes, bagas ou partes dos mesmos) bem como extrudados.

Mais preferencialmente, o extrato vegetal está na forma de uma substância de droga botânica.

As substancias de droga botânica são derivadas de 30 plantas cânabis e incluem extratos primários preparados por

8 /13 tais processos como, por exemplo, maceração, percolação, - extração com solventes tais como alcoóis Cl a c5 (por " exemplo, etanol), Norflurano (HFA134a), hfa227, diáxido de carbono líquido sob pressão e extração com o uso de um gás 5 quente. Um extrato primário pode ser purificado adicionalmente através da extração, vaporização e cromatografia supercrítica ou subcrítica. Quando os solventes tais como aqueles mencionados acima são usados, o extrato resultante pode conter material solúvel em lipídeo 10 não específico. Isto pode ser removido por uma variedade de processos incluindo "winterização", que envolve resfriamento para -20° C seguido pela filtração para remover cascalho ceroso, extração com dióxido de carbono líquido e destilação.

15 As substâncias de droga botânica são formuladas em Produtos de Droga Botânica (Botanical Drug Products) que são definidas no Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, August 2000, do US Department of Health and Hurnan Services, Food and Drug Administration 20 Centre for Drug Evaluation and Research como: "A botanical product that is intended for the use as a drug; a drug product that is prepared from a botanical drug substance." Um ou rnais canabinóides podem ser administrados separada, sequencial ou simultaneamente entre si.

25 Certos aspectos desta invenção são descritos adicionalmente, somente por meio de exemplo, com referência aos desenhos em anexo, nos quais: A Figura 1 é um gráfico em barras que mostra a viabilidade celular de células humanas de astrocitoma U87 30 MG após o tratamento com THC, CBD ou uma combinação de THC e CBD em comparação com um controle; As Figuras 2a e 2b são gráficos em barras que mostram dados de viabilidade celular in vivo em diferentes concentrações em duas linhagens de célula, U87MG (Figura 5 2a) e T98G (Figura 2b); e As Figuras 3a, 3b e 3c fornecem dados sugestivos do mecanismo de ação da combinação para as células u87mg.

DESCRIÇÃO ESPECÍFICA Os seguintes exemplos de s crevem experimentos empregados para confirmar o efeito de combinações de canabinóides como agentes antitumorais.

Exemplo 1: Efeito de THC e CBD na inibição de crescirnento de célula de câncer in vitro.

Tetraidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD) na forma de extratos vegetais de cânabis foram dissolvidos em etanol a uma concentração de 100 mM, isto foi armazenado a -20 °C até necessário.

Antes do uso, os extratos vegetais de cânabis foram diluídos adicionalmente até a concentração desejada, assegurando que a concentração de etanol estivesse abaixo de 0, 001%.

As células humanas de glioma U87 foram usadas por todo este experimento. As células foram mantidas a 37° C em uma atmosfera umidificada com 5°0 de CO2 e 95% de ar.

As células foram cultivadas em um frasco de cultura de 75 cm' em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), que foi suplementado com 4mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais e 10% de soro bovino fetal desativado por calor.

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P 10/13 A viabilidacíe das células humanas de astrocitoma U87 MG foram examinadas em várias concentrações de canabinóide.

Os extratos de THC e CBD foram comparados com THC e CBD puros.

5 Resultados: Tabela 1: Viabilidade celular de células humanas de astrocitoma U87 MG em cultura I IC50 µM|IC50 µM| IC50 µM I (canabinóides I (extrato de! (equivalente de !Puros) jplanta jpuro de extrato de |cânabis) jplanta cânabis) THC 0,37 0,64 0,43 CBD 0,47 0,72 0,47 Conforme pode ser visto a partir da Tabela 1 acima, os extratos de THC e CBD se compararn muito favoravelmente em 10 atividade com seus compostos puros correspondentes, quando a quantidade de canabinóide no extrato é ajustada para uma quantidade equivalente de composto puro.

Isto mostra que o THC e o CBD, e seus extratos são efetivos na inibição de crescimento de célula de glioma.

15 Exemplo 2: Efeito de uma combinação de extratos de THC e CBD na inibição de crescimento de célula de câncer in vitro.

Este experimento testou se uma combinação de extratos de THC e CBD foram tão efetivas na inibição do crescimento 20 celular quanto os extratos sozinhos. Os métodos usados foram descrito no Exemplo 1 acima.

Resultados: A Figura 1 detalha um gráfico ein barras que descreve a viabilidade celular de células humanas de astrocitoma U87

MG versus os extratos de THC e CBD sozinhos e em combinação urn com o outro.

" Conforme pode ser visto, quando o THC e o CBD são usados em combinação, a viabilidade celular é 5 significativarnente reduzida em comparação à viabilidade celular após o tratamento com THC ou CBD sozinho.

Estes dados sugerem que o THC e o CBD dos canabin6ides seriam mais efetivos no tratamento de tumores quando usados em combinação.

10 Exemelo 3: Efeito de uma cornbinação de THC e CBD na inibição do crescimento de célula de câncer in vivo.

Este experirnento testou se a combinação de extratos de THC e CBD também foi efetiva in vivo.

As células humanas de astrocitoma U87 MG foram 15 xenoenxertadas em carnundongos nus e os compostos de teste foram injetados peritumoralrnente a uma concentração de 15 mg/kg por dia.

Resultados: Tabela 2: Volume de tumor em relação ao tempo zero 20 após 15 dias de tratamento.

Volume de tumor Veículo 9, 2 ± 0, 6 THC puro 5, 1 ± 0 ,4 Extrato de THC 6, 6 ± 0 ,3 Extrato de THC:CBD (1:1) 4,8 ± 0,3 Conforme pode ser observado na Tabela 2 acima, o volume de tumor após o tratamento com a combinação 1:1 de extratos de THC e CBD é significativamente superior ao tratamento com o THC puro ou o extrato de THC sozinho.

25 Estes dados sugerem que o THC e o CBD de canabinóides seriam mais efetivos no tratamento de tumores quando usados - em combinação.

" Exemplo 4: Efeito de concentração de canabinóide sobre viabilidade celular em duas linhagens de célula diferentes.

5 a ação de THC, CBD, e uma mistura com razão 1:1 de THC e CBD foi estudada ern diferentes concentrações ern duas linhagens de célula: U87MG e T98G. Os dados de viabilidade celular são ilustrados nas Figuras 2a e 2b.

Referindo-se à Figura 2a, será observado que doses não 10 efetivas/sub-ideal de THC e CBD em 0,1 ug/ml e 0,25 ug/ml (maior que 90% de viabilidade celular) possibilitam uma diminuição estatisticamente significativa em viabilidade celular em combinação (SAT), cujos dados mostraram uma relação dependente de dose com concentração aumentada 15 (maior citotoxicidade a 0,25 ug/ml).

Resultados similares foram obtidos com a linhagem de célula T98G, (uma linhagem de célula de glioma humana alternativa) conforme é mostrado na Figura 2b.

Exemplo 5: Investigação de mecanismo de ação.

20 THC é conhecido por induzir a morte celular com um uso de uma via de sinalização que envolve o gene ATGI e pan- caspase. Os resultados de uma investigação, que observa a fosforilação em S6, lipidação em LC3 e o efeito de um inibidor de ATGI e pan-caspase, são mostrados nas Figuras 25 3a, 3b e 3c respectivamente.

Pode ser visto a partir da Figura 3a que a combinação THC:CBD (comparar com controle C): - Inibe a atividade de mTORCI (conforme determinado pelos níveis de fosforilação S6); e 30 - Promove o acúmulo da forma lipidada LC3 (uma autofagia marcada).

W A Figura 3b mostra que a paralisação do gene atgi de " autofagia essencial, com um inibidor de S1RNA (S1ATG1O) seletivo reduz a morte celular induzida em comparação a 5 células transfectadas com um controle siC. Finalmente, a Figura 3c mostra que as células tratadas com o inibidor de pan-capase Z-VAD também previnem a morte celular induzida.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES ¶

1. Uso de uma combinação de canabinóides, " CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de câncer.

5 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ao menos tetraidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD).

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o THC e o CBD estão em uma razão entre 10 20:1 e 1:20 (THC:CBD).

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o THC e o CBD estão em uma razão de aproximadamente 1:1.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 1, 2, 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o teor de canabinóide está na faixa entre 5 e 100 mg do total de canabinóides presentes.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que cada 20 canabinóide é usado em um nível que seria considerado sub- ideal se usado sozinho.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reívindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer a ser tratado é um tumor cerebral.

25 8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor cerebral é um tumor glioma.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor cerebral é um glioblastoma multiforme (GBM).

30

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1,

2 /2 CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais canabinóides - estão presentes como extratos vegetais, como compostos

Q puros ou urna combinação dos dois.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, 5 CARACTERIZADO pelo fato de que o extrato vegetal está na forma de uma substância de droga botânica.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais canabinóides são administrados 10 separada, sequencial ou simultaneamente um aos outros.