BRPI0913446A2 - método e conjunto de indentificação eletroquímica de sequências alvos de nucleotídeos - Google Patents
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Abstract
MÉTODO E CONJUNTO DE IDENTIFICAÇÃO ELETROQUÍMICA DE SEQUÊNCIA ALVOS DE NUCLEOTÍDEOS.
A invenção refere-se a um método e um conjunto de identificação eletroquímica de sequência alvos nucleotídeos. De acordo com o método, fornece-se, a princípio, uma amostra biológica susceptível de conter uma sequência alvo de nucleotídeos determinada. Depois, fornecem-se meios de amplificação ativáveis de nucleotídeos livres, para formar sequência alvos de nucleotídeos livres, para formar sequência alvos de nucleotídeos replicados. Fornece-se, igualmente, um composto oxido-redutível apto a ser intercalado durante a replicação, entre os nucleotídeos formando as referidas sequências alvos replicadas. E, ativam-se os referidos meios de amplificação ativáveis antes de ampliar um campo alétrico à referida amostra para ativar o referido composto oxido-redutível. As referidas sequências alvos replicadas provocam, então, a inibição da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível intercalado e determina-se a presença da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada se a corrente diminui.
Description
ar - “MÉTODO E CONJUNTO DE IDENTIFICAÇÃO ELETROQUÍMICA DE SEQUÊNCIAS ALVOS DE NUCLEOTÍDEOS” A presente invenção refere-se um método e a um conjunto de identificação eletroquímica de sequências alvos de nucleotídeos.
Um domínio de aplicação visado é notadamente o domínio da análise rápida de amostras biológicas susceptíveis de conter bactérias ou ' vírus, e mais geralmente qualquer ácido nucléico. : Métodos de detecção eletroquímica conhecidos permitem já destacar sequências alvos de ácidos nucléicos. Alguns recorrem ao mesmo tempo a processos de amplificação dos ácidos nucléicos, por exemplo, de tipo “PCR” para Polymerase Chain Reaction, em língua inglesa e métodos de | voltamperometria cíclica. De acordo com uma destes métodos, provê-se uma ' amostra biológica contendo um ácido nucléico, a qual apresenta uma sequência alvo de nucleotídeos determinada, e acrescenta-se à amostra biológica um agente oxidante apto a oxidar pelo menos uma das bases nucleotídicas da sequência alvo. Os meios de amplificação compreendem nucleotídeos de um tipo que inclui a base nucleotídica oxidável e os nucleotídeos são destinados obviamente a serem consumidos durante a aplicação do método de amplificação para produzir sequências de ácidos —nucléicos replicados. Simultaneamente, ou após cada etapa de amplificação, aplica-se um campo elétrico a amostra para provocar a reação do agente oxidante com a base nucleotídica oxidável e mede-se a corrente elétrica que atravessa consequentemente a amostra. De acordo com este método, descrito mais precisamente no documento PCT/FR2007/000373, determina-se a — presença da sequência alvo determinada bem como a sua quantidade inicial quando a corrente elétrica diminui durante as amplificações. Com efeito, durante o processo de amplificação o número nucleotídeos livres dos meios de amplificação diminui dado que são incorporados aos ácidos nucléicos sintetizados. O agente oxidante pode então reagir apenas com uma quantidade
” 2 - cada vez mais limitada de nucleotídeos livres. Consequentemente, cada vez menos transferências eletrônicas devido à reação de oxidação são produzidas, e a corrente elétrica diminui. Assim, tal método permite detectar e quantificar rapidamente a — presençade um ácido nucléico dado em amostra biológica qualquer. Um problema que se coloca e que visa resolver a presente ' invenção é não somente prover outro método de detecção eletroquímico que . permita detectar a presença de uma sequência alvo de nucleotídeos em uma amostra biológica, mas também poder identificar a sua natureza e quantificar amesma.
Com o objetivo de resolver este problema, de acordo com um i primeiro aspecto, a presente invenção propõe um método de identificação ' eletroquímico de sequências alvos de nucleotídeos. O referido método sendo do tipo segundo o qual se provê uma amostra biológica susceptível de conter uma sequência alvo de nucleotídeos determinada e os meios de amplificação ativáveis comportando nucleotídeos livres, para provocar a replicação da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada e a formação de sequências alvos de nucleotídeos replicadas. De acordo com o método provê- se igualmente um composto oxido-redutível apto a reagir frente aos referidos — nucleotídeos e coloca-se em contato o referido composto oxido-redutível com a referida amostra biológica. Ativam-se então os referidos meios de amplificação ativáveis e aplica-se um campo elétrico à referida amostra para ativar o referido composto oxido-redutível e mede-se a corrente elétrica representativa da atividade eletroquímica do composto oxido-redutível, que atravessa a referida amostra. Assim, determina-se a presença da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada se a corrente elétrica diminui. De acordo com a invenção, provê-se um composto oxido-redutível apto a vir se intercalar durante a replicação entre os nucleotídeos formando as referidas sequências alvos replicadas, as referidas sequências alvos replicadas
- 3 7 provocando a inibição da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível intercalado, pelo que a corrente elétrica diminui.
Além de nucleotídeos livres, os meios de amplificação ativáveis comportam iniciadores que são ácidos oligonucleotídicos específicos e complementares da sequência alvo de nucleotídeos a detectar e uma polimerase. Além disso, assim como explicado a seguir de modo ' detalhado, o campo elétrico é aplicado à referida amostra colocando em . contato eletrodos com a referida amostra e aplicando uma diferença de potencial entre estes eletrodos. Assim, uma característica da invenção é prover um composto oxido-redutível que não irá oxidar as bases nucleotídicas dos nucleotídeos : livres na amostra, como este é o caso no documento da arte anterior acima ' citada, mas que vai vir intercalar-se entre os nucleotídeos formando as sequências alvos replicadas. De modo preferencial, ativam-se os referidos meios de amplificação ativáveis de acordo com ciclos de amplificação sucessivos e a cada ciclo de amplificação, duplica-se a referida sequência alvo replicada. O composto oxido-redutível vem então intercalar-se entre os nucleotídeos que formam as referidas sequências alvos replicadas e perde a sua atividade —oxido-redutível frente ao campo elétrico aplicado. Consequentemente durante os ciclos de amplificação o sinal elétrico medido diminui.
Registra-se então com vantagem o número de ciclo de amplificação correspondendo à diminuição da corrente elétrica para determinar a concentração da referida sequência alvo de nucleotídeos na referida amostra. Com efeito, a diminuição do sinal medido é proporcional à quantidade de sequência alvo de nucleotídeos replicada. Desta proporcionalidade, é possível deduzir a quantidade de sequência alvo de nucleotídeo determinada presente inicialmente na referida amostra. Assim, repete-se a ativação dos referidos meios de amplificação ativáveis de acordo
- 4 7 com diversos ciclos de amplificação, e registra-se o número de ciclo dos referidos meios de amplificação quando a corrente elétrica diminui para determinar a concentração da referida sequência alvo de nucleotídeos na referida amostra. Com efeito, mais a amostra biológica contém sequências — alvosde nucleotídeos determinados, mais o número de ciclos de amplificação necessários para que a intensidade da corrente elétrica caia seja fraca. E, : inversamente, menos a amostra contem sequências alvos determinadas, mais . o número de ciclos de amplificação será elevado. Assim, assim como explicado mais em detalhe na sequência da descrição, este método permite igualmente quantificar a concentração em sequência alvo determinada no interior da amostra biológica.
Precisa-se que “composto oxido-redutível” qualifica não ' somente o composto redox, mas também os compostos aptos a oxidar em certas condições, e a reduzir-se em outras.
De acordo com um modo de realização da invenção particularmente vantajoso, posterior à sequência alvo de nucleotídeos determinada ter sido amplificada, provê-se, além disso, energia térmica à referida amostra para provocar a liberação do referido composto oxido- redutível intercalado, e aplica-se um campo elétrico à referida amostra para registrar simultaneamente as variações de corrente elétrica que atravessa a referida amostra. Determina-se então a quantidade de energia térmica Q correspondendo às variações máximas da corrente elétrica registradas para identificar a natureza da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada. Com vantagem, supre-se energia térmica à referida amostra de modo a — provocar um aumento progressivo da temperatura da referida amostra. Assim, registra-se as variações de corrente elétrica em função da energia térmica fornecida, ou mais concretamente a temperatura sobre uma gama dada. Da variação máxima da corrente elétrica a uma temperatura dada, identifica-se a natureza da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada. Com efeito,
7 de acordo com a natureza da sequência alvo amplificada, a variação máxima da corrente elétrica a uma temperatura dada é característica da referida sequência alvo de nucleotídeos replicada.
Assim, quando se fornece suficientemente energia térmica à amostrae, portanto, às sequências alvos de nucleotídeos replicadas, os duplos filamentos das sequências alvos de nucleotídeos replicadas tendem a separar- se em dois monofilamentos e a liberar consequentemente o composto oxido- redutível intercalado que encontra então novamente a sua atividade eletroquímica. Os duplos filamentos das sequências alvos de nucleotídeos —replicadas separam-se uns dos outros para uma agitação térmica dada, ou seja, a uma temperatura dada de modo que a liberação do composto oxido- redutível, que então é medida por intermédio da corrente elétrica gerada nos eletrodos, intervenha abruptamente, de um modo quase discreto, ou seja, sobre uma gama de temperatura estreita, quando uma quantidade determinada deenergia térmica é cedida à amostra.
Com vantagem, fornece-se a energia térmica à referida amostra de modo a provocar um aumento progressivo da temperatura da referida amostra, por exemplo, entre 40ºC e 98ºC. Nesta gama de temperaturas, os duplos filamentos da sequência alvo de nucleotídeos replicada vão progressivamente evoluir de um estado emparelhado ou cada uma das bases nucleotídicas das sequências alvos replicadas são associadas de modo complementar para um estado dissociado onde cada sequência alvo replicada irá terminar sendo um monofilamento. A passagem de um estado duplo filamento em um estado monofilamento efetua-se, portanto, em uma gama estreita de temperatura, se caracterizando por uma temperatura dita de dissociação, geralmente denotada Tm, característica da natureza da sequência alvo de nucleotídeos replicada.
Além disso, mede-se de preferência a corrente elétrica representativa da atividade eletroquímica do referido composto oxido-
- 6 7 redutível a uma temperatura pré-determinada da referida amostra, na qual nenhuma outra molécula formada ou em curso de formação, inibe o composto oxido-redutível, por exemplo, os dímeros de iniciação. Com vantagem, a referida temperatura pré-determinada é sensivelmente inferior, mas mesmo assim próxima da temperatura da referida amostra correspondendo à quantidade de energia térmica Q determinada, de modo que nesta temperatura elevada, todas as outras moléculas, de um tamanho mais modesto que a sequência alvo de nucleotídeos replicada, são des-hibridadas, enquanto que a sequência alvo de nucleotídeos replicada permanece intacta. Assim, elimina- se da corrente elétrica medida, a quantidade de corrente procedente da liberação do composto oxido-redutível pelos diversos dímeros de iniciadores ou de todas as moléculas menores, que a energia térmica já fornecida permitiu dissociar.
De modo preferido, utiliza-se a voltamperometria para medir e registrar a corrente elétrica ou as referidas variações de corrente elétrica. Este método potenciodinâmico consiste em aplicar entre dois eletrodos, assim como explicado em mais detalhes na sequência da descrição, um potencial variável no tempo e registrar concomitantemente a variação de corrente que resulta. De preferência, utiliza-se a voltamperometria de onda quadrada. — Outras técnicas eletroquímicas são obviamente potencialmente aplicáveis, a voltamperometria “com impulso diferencial, por exemplo, ou o voltamperometria de varredura linear ou cíclica ou ainda a voltamperometria de corrente amostrada e a voltamperometria com corrente variante. De acordo com um modo de aplicação da invenção — particularmente vantajoso, o referido composto oxido-redutível fornecido é um complexo de um metal de transição, por exemplo, um metal da coluna VIIIA da tabela de Mendeleiev, e mais precisamente o ósmio. Além disso, o composto oxido-redutível apresenta com vantagem pelo menos um ligando intercalando de sequência de ácido nucléico e, por exemplo, um ligando de
- 7 7 dipiridofenazina, o qual é adaptado a vir intercalar-se entre os filamentos emparelhados formados pelas sequências alvos de nucleotídeos replicadas. Além disso, o composto oxido-redutível apresenta pelo menos um ligando bipiridina e com vantagem dois ligandos deste tipo. Descreve-se em maiores detalhes na sequência da descrição um complexo do ósmio suprido com um ligando de dipiridfenazina e dois ligandos de bipiridina. Observa-se, além disso, que certos compostos oxido-redutíveis completamente orgânicos podem igualmente ser empregados com benefício, sendo, por exemplo, o caso do azul de metileno.
De acordo com um modo de aplicação da invenção preferido, provoca-se a replicação da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada e a formação de sequências alvos de nucleotídeos replicadas sob forma de filamentos duplos de ácidos nucléicos. Também, os referidos meios de amplificação ativáveis são de tipo PCR.
De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção propõe um conjunto de identificação eletroquímica de sequências alvos nucleotídeos. O referido conjunto compreende meios para receber uma amostra biológica susceptível de conter uma sequência alvo de nucleotídeos determinada e meios de amplificação ativáveis comportando nucleotídeos livres, para provocar a replicação da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada e a formação de sequências alvos de nucleotídeos replicadas. Além disso, o conjunto inclui um composto oxido-redutível apto a reagir frente aos nucleotídeos, o referido composto oxido-redutível sendo colocado em contato com a referida amostra biológica. Meios de ativação permitem —ativaros referidos meios de amplificação ativáveis, e meios permitem aplicar um campo elétrico à referida amostra de forma a ativar o referido composto oxido-redutível, enquanto meios de medição permitem medir a corrente elétrica representativa da atividade eletroquímica do composto oxido- redutível, que atravessa a referida amostra. Por último, meios de determinação
- 8
7 permitem determinar a presença da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada se a corrente elétrica diminui.
De acordo com a invenção, o referido composto oxido-redutível é escolhido entre os compostos aptos a vir se intercalar durante a replicação entre os nucleotídeos formando as referidas — sequências alvos replicadas, seja nos duplos filamentos da sequência alvo de nucleotídeos replicada, as referidas sequências alvos replicadas provocando a inibição da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível intercalado, pelo que a corrente elétrica diminui.
Além disso, e de acordo com um modo de aplicação vantajoso, o conjunto de identificação compreende, além disso, meios para fornecer energia térmica à referida amostra de forma a provocar a liberação do referido composto oxido-redutível intercalado, e meios para aplicar um campo elétrico à referida amostra, graças a eletrodos colocados em contato com a amostra, de modo a registrar simultaneamente, em função da temperatura, as variações de corrente elétrica que atravessa a referida amostra; e também, meios para determinar a quantidade de energia térmica correspondendo às variações máximas da corrente elétrica registradas para controlar a presença da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada.
Estes meios determinam a partir da variação máxima da corrente elétrica registrada a temperatura de dissociação (Tm) característica da presença de sequência alvo de nucleotídeos a detectar.
Explica-se mais em detalhes na descrição seguinte, o conjunto de identificação eletroquímica acima citado que permite realizar o método de acordo com a invenção.
Em particular, descreve-se os meios de ativação, os quais são adaptados com vantagem para ativar os referidos meios de amplificação ativáveis de acordo com ciclos de amplificação sucessivos para duplicar a referida sequência alvo replicada a cada ciclo de amplificação.
Por outro lado, o conjunto de identificação de acordo com a invenção compreende meios de registro para registrar o número de ciclo de amplificação
” 9 - correspondendo à diminuição da corrente elétrica de modo a determinar a concentração da referida sequência alvo de nucleotídeos na referida amostra. Além disso, outras particularidades e vantagens da invenção aparecerão na leitura da descrição feita a seguir de um modo de realização particular da invenção, dado a título indicativo, mas não limitativo, em referência aos desenhos anexos nos quais: -a Figura 1 é uma vista esquemática de um conjunto de identificação eletroquímica de acordo com a invenção; -as Figuras 2A 2C são vistas esquemáticas de um elemento do conjunto de identificação representado na figura 1, de acordo com uma variante de realização.
-As Figuras 3A e 3B são diagramas de intensidade/potencial obtidos graças ao conjunto de identificação representado na figura 1; -a Figura 3C é uma vista de um diagrama obtido por dedução —dosdiagramas representados nas figuras 3A e 3B; -a Figura 4 é uma vista de um diagrama de um tipo análogo ao da Figura 3C; -a Figura SA ilustra um diagrama de intensidade/temperatura obtido graças ao conjunto de identificação representado na figura 1 e em uma primeira etapa; -a Figura 5B ilustra um diagrama obtido em uma segunda etapa por transposição do diagrama ilustrado na figura SA; -a Figura 6 ilustra um diagrama do tipo representado na figura SB, em uma aplicação particular.
O método de identificação eletroquímico de acordo com a invenção necessita a realização de um conjunto de identificação eletroquímica comportando, por um lado, meios de controle e de medida que foram descritos em um primeiro tempo, e por outro lado, constituintes biológicos e químicos específicos. Assim, uma instalação de identificação eletroquímica c 10 - 10 de acordo com a invenção foi representada de modo esquemático na figura
1. Esta Figura 1 mostra duas micro-cavidades 12, 14, adaptadas para receber em seu interior uma amostra biológica cujas características serão definidas a seguir. Estas micro-cavidades 12, 14, já conhecidas de acordo com a arte anterior, apresentam respectivamente um fundo 16, 18, sobre o qual estão presentes um eletrodo 20, um contra-eletrodo 22, e um eletrodo de referência não representado, obtidos, por exemplo, por serigrafia e respectivamente ligados a um potenciostato 24, os dois primeiros através de fios condutores 26, 28. Além disso, eles são tomados em sanduíche entre um módulo de efeito —Pelletier 32 que os suporta e uma tampa aquecedora 30, ligados a um gerador
34. Assim como explicado a seguir, o módulo com efeito Pelletier 32, permite ceder uma quantidade de energia térmica dada ao conteúdo das micro- cavidades 12, 14. Além disso, o gerador 34 e potenciostato 24 são controlados por um microcomputador 36, o qual contém um programa de computador e os meiosde gravação.
Assim, estas micro-cavidades 12, 14, constituem meios de recepção aptos a receber uma amostra biológica, a qual amostra biológica é susceptível de incluir uma sequência de ácido nucléico, e notadamente de DNA, a qual contém uma sequência alvo de nucleotídeos determinada que se — procura detectar. Por outro lado, o módulo de efeito Pelletier 32, e gerador 34 aptos a serem comandados através do microcomputador 36, constituem uma primeira parte de meios de amplificação ativáveis, a segunda parte sendo constituída por material biológico e compostos químicos. Obviamente, outros meios de recepção bem conhecidos, não — representados, compreendendo um tubo em cujo caldo se encontra a amostra biológica. O tubo então é equipado de eletrodos aptos a imergir nesta amostra biológica e a serem ligados ao potenciostato. O tubo então é destinado a ser instalado em um termociclador para levar as amostras biológicas a temperaturas pré-determinadas e de acordo com ciclos de tempos pré-
e 11
- definidos.
Outros meios de recepção são ainda ilustrados nas figuras 2A 2C, e permitem receber as amostras biológicas.
Eles compreendem um recipiente 11 de dimensão pequena, por exemplo, uma tampa de tubo, representado na figura 2A, autorizando uma capacidade de 1uL a ImL, por exemplo, e aberta —naparte superior 13. Ele é susceptível de receber a mistura de reação.
Então é fechado novamente hermeticamente através de um filme 15 sobre o qual são serigrafados três eletrodos disjuntos 17, 19, 21. Os eletrodos 17, 19, 21 são orientados para o interior do recipiente 11 e aparecem na junção entre a borda do recipiente e o filme 15. Em seguida, o recipiente 11 munido do seu filme é então voltado para ser levado em apoio sobre um módulo com efeito Pelletier e, portanto, a mistura reacional inicialmente no fundo do recipiente
11 entra em contato com os eletrodos 17, 19, 21, que ele banha.
O método de amplificação aqui utilizado é o método dito PCR.
Também, graças ao módulo de efeito Pelletier 32, o interior das micro- 15 cavidades 12, 14, é adaptado para ser levado a temperaturas determinadas durante tempos determinados igualmente e de acordo com o protocolo seguinte: o protocolo começa com um patamar preliminar de 1 para 15 minutos de acordo com o tipo de polimerase onde o interior das micro- cavidades 12, 14, é levado a uma temperatura de 94-95º C; em seguida, diversos ciclos consecutivos de temperatura em função da amplificação necessária para a detecção da sequência alvo de nucleotídeos replicada, classicamente entre 10 e 50 ciclos, são impostos às micro-cavidades 12, 14, segundo quatro patamares sucessivos por ciclo, um primeiro patamar dito de desnaturação classicamente de 1 a 60 segundos a uma temperatura de 94-95º —C;um segundo patamar dito formação de pares dos iniciadores, classicamente de 1 a 60 segundos a uma temperatura compreendida entre 40ºC e 72ºC, característica dos iniciadores específicos da sequência alvo de nucleotídeos determinada; um terceiro patamar dito de alongamento, classicamente de 1 para 60 segundos a 72ºC e um último patamar de alguns segundos a uma
" 12 i temperatura compreendida entre 40ºC e 95ºC, a qual é determinada pelo tempo necessário para a medida eletroquímica. Explica-se a seguir as condições de realização desta primeira parte de meios de amplificação após ter descrito a segunda parte compreendendo notadamente material biológico e compostos químicos.
Um dos objetos da invenção sendo de amplificar uma sequência de ácido nucléico por replicação e de medir eletroquimicamente a sua presença no meio durante do processo de amplificação, convém dispor, logo a princípio, de material biológico permitindo esta amplificação. À fim de empregar a técnica de PCR, convém colocar em contato com o ácido nucléico a amplificar, uma enzima polimerase, um par de iniciadores (“primer” em língua inglesa) e quatro nucleotídeos livres: dGTP, dATP, dTTP e dCTP constituindo o DNA, respectivamente desoxi-guanina-tri-fosfato, desoxi- adenosina-tri-fosfato, desoxi-timidina-tri-fosfato e desoxi-citocina-tri-fosfato.
—Análogos de bases do tipo desoxirribonucleotídeo-trifosfatos como o desoxi- desazaguanina-trifosfato podem igualmente ser empregados.
Assim, são introduzidas em uma das micro-cavidades 12, e de acordo com um primeiro exemplo de aplicação, além de uma amostra biológica a testar e precisamente um extrato de DNA de citomegalovírus contendo uma sequência alvo de ácidos nucléicos de 283 pares de bases, o DNA polimerase, ou seja, a enzima, os iniciadores, e os quatro tipos de nucleotídeos, e o todo formando uma mistura reacional que é, como evidente, líquida e tamponada. Além disso, a fim de poder medir a intensidade de um sinal elétrico, acrescenta-se à mistura reacional um composto oxido-redutível, —enaespécieo complexo do ósmio: bis (2,2 '-bipiridina) dipirido [3,2-a: 2 3 '.c] fenazina ósmio (II) cujo número CAS pode ser 3555395-37-8 notado no presente caso [Os"(bpy).DPPZ]* e de fórmula I: Fórmula
CC 13 - 2+ ” es GS. ? LD. . & ) Fórmula I Outros compostos oxido-redutíveis são notadamente possíveis, e com o rutênio em vez do ósmio. Outros ligandos são também susceptíveis de serem empregados . A vantagem do ligando dipiridofenazina reside na sua capacidade de vir a se intercalar entre nucleotídeos formando as sequências alvos do ácido nucléico. Cita-se, por exemplo, como outros ligandos possíveis, o DPPX: 7,8-dimetil-dipirido [3,2-a: 2 , 3 -c] fenazina; o PTDB: 3-(piridina--2-11)-5,6-difenil-as-triazina; ou DPT: 3-(pirazin-2il)-as-triazino [5,6-f]] fenantreno; ou ainda os ligandos apresentando uma função quinona, como PHI: fenantreno quinona diimina.
Compostos orgânicos intercalando o DNA e oxido-redutíveis são igualmente susceptíveis de serem empregados no método objeto da invenção. Cita-se, por exemplo, o brometo de etídio, a acridina e os seus derivados, os derivados do acridona ou ainda os derivados de fenazina.
Para experimentação e controle, são introduzidos na outra micro-cavidade 14, os elementos idênticos acima citados, excluído a amostra biológica a testar De acordo com um exemplo de realização, as concentrações dos diferentes elementos introduzidos nas cavidades 12, 14, são dadas na tabela I abaixo.
e 14 - Tabela 1 E Micro-cavidade 12. | Micro-cavidade 14 250 nM 250 nM Nucleotídeos livres : dnTP 200 uM Tampão PCR Enzima: Hot Star Tag 0,1 U/uL Extrato de DNA de citomegalo | 100.000 cópias O cópias vírus de 283 pares de bases Assim, a mistura reacional contida nas duas micro-cavidades 12, 14, é levada graças ao módulo a efeito Pelletier 32, comandado pelo microcomputador 36, a diferentes temperaturas durante períodos — determinados.
Após o patamar preliminar onde a mistura reacional é levada só uma vez a uma temperatura de 95º C durante 15 minutos, a mistura reacional é levada sobre o primeiro patamar, a uma temperatura de 94º C durante 30 segundos de modo a des-hibridar as sequências alvos dos ácidos nucléicos, ou seja, dissociar os dois filamentos complementares das sequências alvos dos ácidos nucléicos; em seguida, ela é levada sobre o segundo patamar a 53º C durante 60 segundos para que os iniciadores respectivos venham hibridar-se sobre os filamentos de DNA dissociados; em seguida é levada sobre o terceiro patamar a 72ºC durante 60 segundos para permitir às polimerases sintetizar um filamento complementar e formar assim o amplicon e a sequência alvo replicado incluindo o mesmo.
Por último, a mistura reacional é levada a uma temperatura de 85ºC, sobre um quarto patamar durante 10 segundos durante o que se comanda a aplicação do potenciostato 24 por intermédio do microcomputador 36. De acordo com o primeiro exemplo de realização definido acima, sobre o quarto patamar pré-definido e durante o período de 10 segundos, graças ao potenciostato 24, registra-se por voltamperometria de ondas quadradas, a curva intensidade/potencial em uma zona de potencial que enquadra o potencial padrão do composto oxido-redutível.
Impõe-se assim uma diferença de potencial entre o eletrodo 20 e contra-eletrodo 22 e faz-se
C 15 c variar esta diferença de potencial de acordo com um perfil de ondas quadradas. Paralelamente, mede-se a corrente elétrica que atravessa estes eletrodos e obtém-se então uma curva intensidade/potencial na forma de pico cujo valor de corrente máximo, após subtração de uma linha de base, é representativo da concentração em composto oxido-redutível não intercalado, presente em solução.
Faz-se referência, assim, às figuras 3A a 3B em primeiro lugar, em seguida na figura 3 C. Precisamente, 31 ciclos de replicação foram impostos às amostras biológicas contidas nas micro-cavidades 12, 14. À Figura3A ilustra a evolução das curvas intensidade/potencial em função dos ciclos, para as amostras biológicas incluindo a sequência alvo de nucleotídeos procurada, enquanto a Figura 3B representa a evolução das curvas intensidade/potencial em função dos ciclos, para a mistura reacional desnudada de sequência alvo. Na figura 3A, é a partir do décimo oitavo ciclo 31 que o topo 33 da curva abaixa-se de modo significante, ou seja, que o consumo em composto oxido-redutível é sensível, para atingir uma meia altura 35 ao vigésimo-segundo ciclo. No trigésimo primeiro ciclo, a curva 37 fica praticamente plana e o seu topo atinge um valor de intensidade inferior a 5% aos dos primeiros ciclos. Assim, o composto oxido-redutível foi incorporado no interior das moléculas de duplo filamento de DNA formadas. Isto implica que a sequência alvo de nucleotídeos procurada estava bem presente nas amostras biológicas.
Pelo contrário, na figura 3B, o extremo 39 da curva reside a um valor sensivelmente constante até o trigésimo-primeiro ciclo, em — comparação com a curva precedente, porque nestas amostras a sequência alvo de nucleotídeos procurada não está presente. No entanto, diminui levemente notadamente devido à formação de dímeros de iniciação na mistura reacional.
e 16 : " Assim, detecta-se rapidamente a presença de uma sequência alvo de nucleotídeos procurada, em qualquer amostra biológica por meio do processo descrito acima.
Observa-se que o valor da corrente de pico é normalizado, — dividindo-o pelo valor médio corrigido da derivada das correntes de pico obtidas durante os primeiros ciclos de amplificação, ou seja, quando a quantidade de sequência alvo de nucleotídeos replicada não é ainda suficiente para fazer cair significativamente à corrente de pico medida, por exemplo, no quinto ciclo.
Mostra-se na figura 3C ilustrando as curvas tiradas das duas séries de curvas acima citadas e mostrando o valor da corrente de pico assim normalizado em função do número de ciclos realizados e, para as duas micro- cavidades 12, 14, comportando respectivamente a amostra biológica a testar e o material biológico destinado à replicação bem como o composto oxido- redutível e o outro, o único material biológico com o composto oxido- redutível.
Assim, observa-se que, até o vigésimo-quinto ciclo, o valor da corrente que atravessa as misturas reacionais das duas micro-cavidades 12, 14, é sensivelmente paralelo e relativamente constante. Em contrapartida, entreo vigésimo-quinto ciclo, e além do trigésimo ciclo, observa-se que o valor da corrente elétrica que atravessa a micro-cavidade 12 incluindo a amostra biológica a testar cai brutalmente em comparação da corrente elétrica que atravessa a outra micro-cavidade 14, desnudada, ela mesma, da sequência alvo de ácidos nucléicos determinada. Esta queda brutal e exponencial da corrente elétrica, de acordo com uma função em £º, c sendo o número de ciclos e € a intensidade de amplificação próxima de 2, confirma a amplificação da sequência alvo de nucleotídeos determinada, cujos iniciadores eram consequentemente específicos, e da produção de sequências alvos replicadas. Com efeito, a produção de moléculas de sequências alvos de ec 17 - ácido nucléicos replicadas provoca então a inativação do composto oxido- redutível acima citado, via intercalação deste no duplo filamento formado da sequência de ácido nucléico replicada.
Assim inativo, o composto oxido- redutível não pode mais mudar de cargas com a superfície dos eletrodos 20, 22,e consequentemente, não ser mais detectado eletroquimicamente.
Isto se traduz em uma queda do sinal elétrico que é então reveladora da formação da sequência alvo de nucleotídeos determinada através dos iniciadores específicos, na amostra biológica explorada.
O registro da corrente é realizado a uma temperatura superior à temperatura dita de dissociação dos dímeros de iniciadores e/ou outras sequências de DNA não especificamente amplificadas.
A escolha da temperatura na qual se efetua a medida é um parâmetro crítico para discriminar entre uma amostra falsa positiva e uma verdadeira positiva.
Além disso, faz-se referência atualmente ao gráfico ilustrado na figura 4, para descrever, de acordo com um segundo exemplo de realização, o princípio da quantificação de uma sequência alvo de nucleotídeos determinada em uma amostra dada.
Sobre o eixo das abscissas 51 do gráfico, são colocados os números de ciclos de replicação dos meios de amplificação, e sobre o eixo das ordenadas 53 são relatados os valores normalizados da corrente máxima revelados em cada ciclo seguindo o modo de realização ilustrado na figura 3A.
Sobre este gráfico da Figura 4, nove curvas de calibração são representadas da direita para a esquerda, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, e apresentam porções intermediárias sensivelmente paralelas entre elas e ao longo de uma direção próxima da vertical.
Estas curvas correspondem respectivamente aos diferentes traçados obtidos partindo de uma amostra biológica compreendendo 10º cópias da sequência alvo contida no genoma do citomegalovírus para a primeira 70 das nove curvas, e 10" para a nona 86. Da e primeira curva 70 à última 86, o número de cópias é para cada curva seguinte, é multiplicado por dez.
Assim, constata-se que, mais a amostra biológica contém uma quantidade grande de sequência alvo de nucleotídeos determinada, mais a — corrente elétrica que atravessa o eletrodo diminui logo em função do número de ciclos.
Com efeito, mais a amostra contém ácidos nucléicos originalmente, incorporando a sequência alvo determinada, e menor é o número de ciclos necessários para produzir por replicação uma mesma quantidade de sequências alvos de nucleotídeos determinada, e, portanto mais cedo é a diminuição da corrente via intercalação do composto oxido-redutível nos duplos filamentos das sequências alvos de nucleotídeos replicadas.
Assim, compreende-se que uma medida da quantidade de ácidos nucléicos incorporando a sequência alvo é possível, determinando o número de ciclos a partir do qual, a quantidade de corrente que atravessa a amostra altera-se.
Além disso, a primeira curva 70 na figura 4 mostra que a presença da sequência alvo é ainda detectável quando apenas 1000 cópias da referida sequência alvo estão inicialmente presentes na amostra.
Um extrato inicialmente de concentração em sequência alvo de ácidos nucléicos determinado assim foi testado, e a sua curva 88 aparece em traços interrompidos ao longo da segunda curva 72 de calibração correspondendo a 104 cópias da sequência alvo.
Assim, portanto, o método de acordo com a invenção aplicado a uma amostra biológica susceptível de conter uma sequência alvo de nucleotídeos determinada permite não somente, graças à realização de um — método de amplificação e de uma medida eletroquímica de um agente oxido- redutível intercalando DNA duplo filamento de revelar a presença ou a ausência da sequência alvo de nucleotídeos determinada, mas igualmente quantificar a mesma com uma amplitude do sinal, uma reprodutibilidade e uma sensibilidade melhoradas em comparação com os outros métodos
VU 19 Y eletroquímicos de acordo com a arte anterior. Este método tira partido das propriedades oxido-redutíveis de um agente intercalando sequências de ácido nucléicos formando um duplo filamento que não é, de modo algum, empregado nos métodos de amplificação clássicos, para revelar a presença de uma sequência alvo de ácido nucléico.
Com o objetivo de refinar o método de detecção, notadamente em termos de especificidade de identificação da sequência alvo amplificada, provoca-se, proveniente da amplificação, a des-hibridação progressiva de todas as sequências alvos replicadas através de uma subida progressiva da amostra em temperatura, de modo a liberar o composto oxido-redutível intercalado. Tornando então de novo eletroquimicamente detectável, este composto oxido-redutível é outra vez apto a fornecer um sinal elétrico aos eletrodos, representativo da quantidade de composto oxido-redutível liberado e, portanto, da natureza e, portanto do comprimento da sequência alvo de nucleotídeos determinada.
Esta des-hibridação é realizada levando progressivamente, de acordo com uma rampa de temperatura apropriada, as moléculas de DNA de uma temperatura onde todos os duplos filamentos são emparelhados, ou seja, próximo de 40 ºC, até a uma temperatura onde todos os duplos filamentos são — dissociados, ou seja, próximo de 98 CC, e o módulo com efeito Pelletier 32 acima citado constitui um meio privilegiado para isto. Estes permitem, com efeito, fornecer a energia térmica à mistura reacional contida nas duas micro- cavidades 12, 14, representadas na figura 1, de forma a provocar a des- hibridação das sequências alvos de nucleotídeos replicadas e, portanto, a liberação do referido composto oxido-redutível intercalado. Além disso, graças ao potenciostato 24 e por intermédio do microcomputador 36, aplica-se então uma diferença de potencial entre o eletrodo 20 e o contra-eletrodo 22 e faz-se variar esta diferença de potencial de acordo com o perfil as ondas
” 20 o quadradas acima citado.
Mede-se a corrente elétrica que atravessa estes eletrodos e determina-se, assim, uma corrente de pico.
Assim, graças ao módulo com efeito Pelletier 32, incrementa- se a temperatura das misturas reacionais, por exemplo, grau por grau, entre 70ºCe95º C.
Paralelamente, logo que a temperatura das misturas reacionais aumenta em 1ºC, impõe-se uma diferença de potencial entre os eletrodos 20, 22, e mede-se a corrente que atravessa os mesmos, de acordo com o método voltamperométrico acima citado.
Faz-se referência agora à figura SA mostrando, de acordo com um terceiro exemplo de aplicação, um diagrama da corrente de pico então obtida em função da temperatura, e para as duas micro-cavidades 12, 14, uma que inclui a mistura reacional com a sequência alvo de nucleotídeos procurada, a outra, a mistura reacional sem esta sequência alvo.
A curva inferior 40 assim obtida corresponde à mistura —reacional incluindo a sequência alvo de nucleotídeos e, portanto uma pluralidade de sequências alvos de nucleotídeos replicadas.
Assim, observa-se que o aumento da temperatura da mistura reacional, entre 70º C e 88º C, não produz nenhum efeito sobre as moléculas de DNA incluindo as sequências alvos de nucleotídeos.
Em contrapartida, entre 88ºC e 92ºC, a corrente de pico é multiplicada por sete.
Esta corrente de pico é então diretamente proporcional à quantidade de composto oxido-redutível liberado e, portanto, da natureza e, portanto do comprimento da sequência alvo de ácido nucléico determinada que seja aqui de 283 pares de bases.
Observa-se com a curva superior 42, correspondendo à mistura — reacional desnudada de sequência alvo de ácido nucléico determinada, que o sinal elétrico medido duplo entre 70ºC e 85ºC.
Isto é a consequência da intercalação nos dímeros de iniciação e outros duplos filamentos sintetizados de modo não específico e de dimensão inferior à sequência alvo de ácido nucléico determinada.
e 21 - A evidência da sequência alvo de nucleotídeos procurada é então mais comprovadora ao se transpor cada ponto das curvas representadas na figura SA, no valor da derivada neste ponto. Obtém-se assim as curvas de fusão representadas na figura 5B.
Assim, a curva inferior 40 correspondendo à mistura reacional incluindo a sequência alvo, é transformada em uma curva típica 44 apresentando um pico significativo 46 a temperatura de 90ºC. Obviamente, este pico significativo 46 corresponde à brusca variação de corrente de pico observada na figura SA para a curva inferior 40. Este pico significativo 46 é representativo da natureza e, portanto, do comprimento da sequência alvo determinada pela temperatura na qual ele aparece. Com efeito, mais a sequência alvo procurada é principalmente longa, mais a quantidade de composto oxido-redutível incluída nos amplicons é grande, evidentemente para uma quantidade equivalente de amplicons. Também, para liberar as moléculas do composto oxido-redutível será necessário suprir uma maior quantidade de energia térmica a fim de des-hibridar o duplo filamento formado pela sequência alvo determinada. Portanto, a temperatura na qual este des-hibridação intervirá será mais elevada. Ao excesso, a quantidade de moléculas de composto oxido-redutível incluída nos amplicons sendo maior, uma vezliberado, o sinal elétrico recolhido será igualmente maior.
Consequentemente, mais a sequência alvo de nucleotídeos procurada é de natureza principalmente longa, mais o pico significativo 46 é grande e deslocado para uma temperatura elevada.
Em contrapartida, tratando-se da curva superior 42 representada na figura SA, sua transformação em curva derivada 48 representada na figura 5B, faz aparecer uma pico aumentado 50 uma temperatura compreendida entre 75ºC e 80ºC. Este pico aumentado 50 corresponde muito simplesmente à des-hibridação dos dímeros de iniciadores e de outros duplos filamentos sintetizados de modo não específico e dimensão
Vo 22 - inferior à sequência alvo de ácido nucléico determinada, que provoca então a liberação do composto oxido-redutível. Observa-se que este pico aumentado 50 aparece em uma gama de temperaturas inferior à da pico significativo 46, e que ele é mais difuso.
De acordo com um quarto exemplo de aplicação, mostra-se que se pode detectar a presença de pelo menos duas sequências alvos de nucleotídeos distintas, em uma mesma amostra biológica, graças ao método de identificação de acordo com a invenção.
Para o efeito, utiliza-se. evidentemente o conjunto de identificação representado na figura 1, e efetuam-se três séries de medidas em conformidade com os exemplos de aplicação descritos acima. Trata-se aqui de mostrar que se pode identificar em uma mesma amostra biológica, a presença de uma bactéria, Achromobacter Xylosoxidans, cujo tamanho da sequência alvo de nucleotídeos é de 100 pares de bases e o Citomegalovírus humano, previamente utilizado, cujo tamanho da sequência alvo de nucleotídeos é de 283 pares de bases. Uma primeira série de medidas corresponde ao Citomegalovírus humano e é realizada nas mesmas condições que as descritas acima. Uma segunda série de medidas corresponde precisamente à bactéria Achromobacter Xylosoxidans e consequentemente, o material de amplificação inclui os iniciadores específicos da sequência alvo correspondente. E uma terceira série de medidas corresponde à mistura do Citomegalovírus humano e a bactéria Achromobacter Xylosoxidans, e, portanto o material de amplificação inclui, neste caso, os dois iniciadores específicos correspondentes na mistura. Realiza-se então em conformidade com o terceiro exemplo de aplicação, as curvas de fusão para as três séries de medidas. Representou-se na figura 6, as três curvas então obtidas e para maior clareza elas foram deslocadas ao longo do eixo das ordenadas umas com relação às outras. Assim, encontra-se nesta Figura 6, uma primeira curva e 23 - 50, relativa ao Citomegalovírus humano, e que corresponde à curva típica 44 ilustrada na figura SB. Encontra-se assim um primeiro pico significativa 52 para um valor de temperatura equivalente a 90º C. Além disso, tratando-se da bactéria Achromobacter Xylosoxidans, a curva de fusão 54 correspondendo à — segunda série de medidas é caracterizada por um segundo pico significativo 56 para um valor de temperatura próximo de 85º C.
E por último, a terceira série de medidas conduz a uma terceira curva 58 que apresenta um terceiro 60 e um quarto 62 picos significativos respectivamente para valores de temperatura equivalente a 90º C e 85º C.
Estes valores correspondem exatamente aos da bactéria sozinha e o Citomegalovírus humano sozinho.
Mostra-se, assim, por intermédio deste quarto exemplo de aplicação, a possibilidade graças ao método de identificação de acordo com a invenção, de detectar uma pluralidade de sequência alvo de nucleotídeos em uma mesma amostra biológica.
De acordo com um modo de realização da invenção particularmente vantajoso, e não representado aqui, mas de acordo com a invenção, está previsto poder amplificar uma sequência alvo possuindo ou não certas diferenças na sua sequência e identificar a presença ou não destas diferenças por uma curva de fusão, como definido acima.
Claims (20)
1. Método de identificação eletroquímica de sequências alvos de nucleotídeos, o referido método sendo do tipo de acordo com o qual: -fornece-se uma amostra biológica susceptível de conter uma — sequência alvo de nucleotídeos determinada; -fornecem-se meios de amplificação ativáveis comportando nucleotídeos livres, para formar a replicação da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada e a formação de sequências alvos de nucleotídeos replicados; -fornece-se um composto oxido-redutível apto a reagir frente aos referidos nucleotídeos e coloca-se em contato o referido composto oxido- redutível com a referida amostra biológica; -ativam-se os referidos meios de amplificação ativáveis; aplica-se um campo elétrico à referida amostra para ativar o referido composto oxido-redutível e mede-se a corrente elétrica representativa da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível, que atravessa a referida amostra; e -determina-se a presença da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada se a corrente elétrica diminui; caracterizado pelo fato de que se fornece um composto oxido- redutível apto a se intercalar durante a replicação entre os nucleotídeos formando as referidas sequências alvos replicadas, as referidas sequências alvos replicadas provocando a inibição da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível intercalado, pelo que a corrente elétrica diminui.
2. Método de identificação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se ativam os referidos meios de amplificação ativáveis ao longo dos ciclos de amplificação sucessivos e em que em cada ciclo de amplificação duplica-se a referida sequência alvo replicada.
3. Método de identificação de acordo com a reivindicação 2,
e 2 - caracterizado pelo fato de que se registra o número de ciclo de amplificação correspondente à diminuição da corrente elétrica para determinar a concentração da referida sequência alvo de nucleotídeos na referida amostra.
4. Método de identificação de acordo com qualquer uma das — reivindicações | a 3, caracterizado pelo fato de que ele compreende por outro lado as seguintes etapas: -fornece-se energia térmica à referida amostra para provocar a liberação do referido composto oxido-redutível intercalado, e aplica-se um campo elétrico à referida amostra para registrar simultaneamente as variações decorrente elétrica que atravessa a referida amostra; e -determina-se a quantidade de energia térmica Q correspondente às variações máximas da corrente elétrica registrada para identificar a natureza da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada.
5. Método de identificação de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que se fornece energia térmica à referida amostra de modo a provocar um aumento progressivo da temperatura da referida amostra.
6. Método de identificação de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que se provoca o aumento progressivo da temperatura entre 40ºC e 98ºC.
7. Método de identificação de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 6, caracterizado pelo fato de que se mede a corrente elétrica representativa da atividade eletroquímica do referido composto oxido- redutível a uma temperatura pré-determinada da referida amostra.
8. Método de identificação de acordo com as reivindicações 5 ou 6 e 7, caracterizado pelo fato de que a referida temperatura pré- determinada é sensivelmente inferior à temperatura da referida amostra correspondendo à quantidade de energia térmica Q determinada.
9. Método de identificação de acordo com qualquer uma das o 3 s reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que se utiliza a voltamperometria para medir a referida corrente elétrica.
10. Método de identificação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que se utiliza a voltamperometria com onda quadrada
11. Método de identificação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido composto oxido-redutível fornecido é um complexo de um metal de transição.
12. Método de identificação de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido composto oxido-redutível apresenta pelo menos um ligando intercalante de sequência de ácido nucléico.
13. Método de identificação de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o referido composto oxido-redutível apresenta o ligando de dipiridofenazina.
14. Método de identificação de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido composto oxido-redutível apresenta pelo menos um ligando bipiridina.
15. Método de identificação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que se provoca a replicação da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada e a formação de sequências alvos de nucleotídeos replicados sob a forma de duplos filamentos de ácidos nucléicos.
16. Método de identificação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que os referidos meios de amplificação ativáveis são de tipo PCR.
17. Conjunto de identificação eletroquímica de sequências alvos de nucleotídeos, o referido conjunto compreendendo: -meios (12, 14) para receber uma amostra biológica susceptível de conter uma sequência alvo de nucleotídeos determinada;
e 4 - -meios de amplificação ativáveis comportando nucleotídeos livres, para provocar a replicação da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada e a formação de sequências alvos de nucleotídeos replicados; -um composto oxido-redutível apto a reagir referente aos referidos nucleotídeos, o referido composto oxido-redutível sendo colocado em contato com a referida amostra biológica; -meios de ativação (32, 34, 36) para ativar os referidos meios de amplificação ativáveis; -meios (20, 22, 24, 26, 28, 36) para aplicar um campo elétrico à referida amostra de modo a ativar o referido composto oxido-redutível e meios de medida de corrente elétrica representativa da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível , que atravessa a referida amostra; e -meios (24, 36) para determinar a presença da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada se a corrente elétrica diminui; caracterizado pelo fato de que o referido composto oxido- redutível é escolhido dentre os compostos aptos a vir se intercalar durante a replicação entre os nucleotídeos formando as referida sequências alvos replicadas, as referidas sequências alvos replicadas provocando a inibição da atividade eletroquímica do referido composto oxido-redutível intercalado, pelo que a corrente elétrica diminui.
18. Conjunto de identificação de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os referidos meios de ativação (32, 34, 36) são adaptados para ativar os referidos meios de amplificação ativáveis ao —longodeciclos de amplificação sucessivos para duplicar a referida sequência alvo replicada em cada ciclo de amplificação .
19. Conjunto de identificação de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que ele compreende, por outro lado, meios de registro (36) para registrar o número de ciclo de amplificação correspondendo e 5 - à diminuição da corrente elétrica de modo a determinar a concentração da referida sequência alvo de nucleotídeos na referida amostra.
20. Conjunto de identificação de acordo qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de compreende, por outro lado: -meios para fornecer energia térmica (32) à referida amostra de modo a provocar a liberação do referido composto oxido-redutível e meios (20, 22, 24, 26, 28, 36) para aplicar um campo elétrico à referida amostra de modo a registrar simultaneamente as variações de corrente elétrica que atravessa a referida amostra; e -meios para determinar a quantidade de energia térmica correspondendo às variações máximas da corrente elétrica registradas para identificar a natureza da referida sequência alvo de nucleotídeos determinada.
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