BRPI0913547A2

BRPI0913547A2 - célula bacteriana ácido-lática recombinante, método para a produção de 2-butanol e método para a produção de 2-butanona

Info

Publication number: BRPI0913547A2
Application number: BRPI0913547-2A
Authority: BR
Inventors: Brian James Paul
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels Llc
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2020-08-18
Also published as: US20100112655A1; US20130316414A1; US8455224B2; WO2010037114A1; EP2337869A1; EP2337869B1; US9080179B2; CA2735948A1; AU2009296227A1

Abstract

CÉLULA BACTERIANA ÁCIDO-LÁTICA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2-BUTANOL E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2-BUTANONA. Por meio de engenharia genética foi alcançado em lactovacillus plantarum um alto fluxo de metabólitos a partir do piruvato para 2,3-butanodiol. A eliminação substancial da atividade de lactato desidrogenase na presença da atividade de butanodiol desidrogenase expressa de maneira heteróloga levou a produção de 2,3 butanodiol que foi pelo menos 49% do tital doas principais produtos derivados do piruvato.

Description

"CÉLULA BACTERIANA ÁCIDO-LÁTICA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA

V . A PRODUÇÃO DE 2-BUTANOL E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2- BUTANONA" a ReferÊncia Cruzada Para Os Pedidos Relacionados 5 Este pedido está relacionado e reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/100.786, depositado em 29 de setembro de 2008, a divLl|gação do qual é incorporada ao presente pela referência em sua totalidade.

Campo DA Invenção 10 A invenção refere-se ao campo da microbiologia industrial e do metabolismo de bactérias ácido-láticas, Mais especificamente, o desenvolvimento por engenharia genética de bactérias ácido-láticas para um alto fluxo a partir do piruvato para 2,3 butanodiol permite o aumento da produção de 2,3-butanodiol e de compostos nas vias incluindo o 2,3-butanodiol 15 como um substrato a montante. Antecedentes Da Invenção O 2,3-butanodiol, 2-butanona, e 2-butanol são importantes produtos quimicos industriais. O 2,3-butanodioi pode ser utilizado na sÍntese química de buteno e butadieno, importantes produtos químicos industriais 20 obtidos atualmente a partir do petróleo craqueado (cracked), e ésteres de 2,3 butanodiol podem ser usados como plastificantes (VoIoch et al Fermentation Derived 2,3-Butanedio/, em: Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press Ltd, Vol 2, Capitulo 3:933-947 (1986)). A 2-butanona, também conhecida como metil etil cetona (MEK), é um solvente amplarnente 25 utilizado e, depois da acetona, é a mais importante cetona produzida comercialmente. Ela é usada como solvente para tintas, resinas e adesivos, bem como um extrator seletivo, ativador de reações oxidativas, e pode ser convertida quimicamente em 2-butanol pela reação com o hidrogênio na presença de um catalisador (Nystrom, R.F. e Brown, W.G. (J. Am. Chem.

W d Soc. (1947) 69:1198). O butanol é um importante produto químico industrial, útil como aditivo combustivel, como matéria-prima de químicos na indústria . de plásticos, e como um extrator grau alimenticio na indústria de alimentos e 5 condimentos. Todos os anos, 10 a 12 bilhões de libras de butanol são produzidas por meios petroquimicos e a necessidade deste produto químico provavelmente aumentará. Os microrganismos podem ser projetados para expressão das vias biossintéticas para a produção de 2,3-butanodiol, 2-butanona e/ou 2- 10 butanol. A patente US 20070292927A1 divulga a engenharia de microrganismos recombinantes para expressão de uma via biossintética possuindo 2,3-butanodiol e 2-butanona como intermediários e 2-butanol como produto final. A via se inicia com o piruvato celular. Desse modo, a produção de 2,3-butanodiol, 2-butanona, e 2-butanol é limitada pela disponibilidade do fluxo 15 do substrato piruvato a partir das vias do hospedeiro natural nesta via biossintética projetada. Em bactérias ácido-láticas, uma quantidade Iimitada de 2,3 butanodiol pode ser produzida naturalmente, mas a via metabólica principal de piruvato é a conversão de lactato através da atividade da lactato desidrogenase 20 (LDH). A engenharia metabólica para redirecionar o piruvato a partir do lactato em outros produtos nas bactérias ácido-lácticas teve resultados imprevisíveis. A produção de alanina em Lactococcus lactis deficientes de LDH expressando a alanina desidrogenase foi demonstrada por Hols et al. (Nature Biotech. 17:588-592 (1999). No entanto, a produção de etanol em Lactobaci//us 25 p/antarum deficiente de LDH expressando piruvato descarboxilase foi muito limitada, com fluxo de carbono que não melhorou significativamente em direção ao etanol e lactato ainda produzido (Liu et al (2006) J, lnd. M/cro, Biotech. 33:1- 7).

Sendo uma bactéria ácido-lática um hospedeiro preferencial para

W

W a produção de 2-butanol e 2-butanona, existe uma necessidade, portanto, de bactérias ácido-láticas que tenham um fluxo de carbono fortemente regulado a ^ partir de piruvato para 2,3-butanodiol. Até ao momento, nenhuma bactéria foi 5 desenvolvida para a produção desta vantagem e o estado da técnica sugere que a simples redução do fluxo de carbono a partir do piruvato para lactato pela via da lactato desidrogenase pode não ser suficiente. Os depositantes resolveram o problema indicado pela descoberta inesperada de que a introdução de um polipeptídeo heterólogo com atividade butanodiol 10 desidrogenase em combinação com a redução na Iactato desidrogenase endógena resulta em taxas inesperadamente altas de conversão de piruvato em produtos de baixo fluxo e especialmente, 2,3-butanodiol.

DescrjçÃo Resumida da InvençÃo São fornecidas na presente invenção células de bactérias ácido- 15 láticas recombinantes que compreendem pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo heterólogo com atividade butanodiol desidrogenase, em que a célula bacteriana é substancialmente livre de atividade lactato desidrogenase e, em que, a célula produz 2,3-butanodiol. Em um exemplo de realização, a célula bacteriana compreende um inter-rompimento em pelo menos um gene 20 endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo atividade lactato desidrogenase. Em um exemplo de realização, a célula é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo constituído por Lactococcus, Lactobaci//us, Leuconostoc, Oenococcus,, Pediococcus e Streptococcus.

Em um exemplo de realização, a célula compreende pelo menos 25 uma modificação genética que reduz a atividade da piruvato-formato liase. Em alguns exemplos de realização, a modificação genética afeta um gene que codifica a piruvato-formato liase, um gene que codifica a enzima ativadora da piruvato-formato liase, ou ambos. Em alguns exemplos de realização, o gene que codifica a piruvato-formato liase é selecionado a partir do grupo constituído por pfl, pfl81 e PFL B2 e o gene que codifica a enzima ativadora da formato C- acetiltransferase é selecionado a partir do grupo constituido por pflA, pflA1 e pflA2.

5 Também são fornecidos exemplos de realizações em que a célula produz um produto selecionado a partir do grupo consistindo de lactato, acetoína, etanol, succinato, e formato. Em alguns exemplos de realização, o 2,3-butanodiol compreende pelo menos cerca de 49 °/) molar de todos os produtos produzidos a partir do piruvato.

Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo que possui atividade lactato desidrogenase é codificado por um gene selecionado a partir do grupo que consiste de ldhL, ldhD, /dhL1 e /dhL2. Em um exernplo de realização, a célula hospedeira ácido-lática é Lactobaci//us p/antarum e o polipeptideo possuindo atividade lactato desidrogenase tem uma sequência de aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID NO: 2, 4 e 6. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira ácido-lática é Lactococcus lactls e o polipeptídeo possuindo atividade lactato desidrogenase tem uma sequência de aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 20- Em outro exemplo de realização, a célula hospedeira ácido-lática é Leuconostoc mesenteroides e o polipeptídeo possuindo atividade lactato desidrogenase tem uma sequência de aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22. Em outro exemplo de realização, a célula hospedeira ácido-iática é Streptococcus thermophilus e o poIipeptídeo possuindo atividade lactato desidrogenase tem uma sequência de aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com a

« sequência estabelecida na SEQ ID NO: 24. Em outro exemplo de realização, e a a célula hospedeira ácido-lática é Pediococcus pentosaceus e o polipeptídeo possuindo atividade lactato desidrogenase tem uma sequência de

W aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com uma 5 sequência selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID NO: 26 e 28. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira ácido-lática é Lactobaci//us acidophilus e o polipeptídeo possuindo atividade lactato desidrogenase tem uma sequência de aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo 10 consistindo da SEQ ID NO: 30, 32 e 34. Em um exemplo de realização, o polipeptideo heterólogo possuindo atividade butanodiol desidrogenase tem uma sequência de aminoácidos que possui cerca de pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID NO: 13, 64 e 15 66. Em alguns exemplos de realização, a célula produz 2-butanona, e em algumas realizações, a célula compreende uma via biossintética da 2- butanona. Em alguns exemplos de realização, a célula produz 2-butanol, e em um exemplo de realização, a célula produz uma via biossintética do 2-butanol.

20 Também são fornecidos métodos na presente invenção para a produção de 2-butanol compreendendo: O fornecimento de uma célula bacteriana ácido-lática recombinante compreendendo uma via biossintética de 2-butanol, e o cultivo da célula bacteriana da etapa (a) sob condições em que o 2-butanol é produzido.

25 Também são fornecidos métodos na presente invenção para a produção de 2-butanona compreendendo: O fornecimento de uma célula bacteriana ácido-lática recombinante compreendendo uma via biossintética da 2-butanona, e o cultivo da célula bacteriana da etapa (a) sob condições em que a 2-butanona é produzida.

D Breve Descrição das Figuras e Descrições das SequÊncias « Os vários exemplos de realização da invenção podem ser mais

W bem compreendidos a partir da seguinte descrição detalhada, das Figuras e da 5 Lista de Sequências anexa, que fazem parte do presente pedido. A Figura 1 exibe a via biossintética para a biossintese de 2,3- butanodiol, 2-butanona e 2-butanol. A Figura 2 exibe um gráfico de produtos feitos em L. p/antarum cepas PN0512 (controle) e PNPOOOl (/dhD/dhL1 cepa de deleção).

10 A Figura 3 exibe um gráfico de produtos feitos em L. p/antarum cepas BP134 (controle com os genes budC e sadB), PNPOOOl (deleção de ldh), e PNPO002 (deleção de ldh com os genes budC e sadB) cultivados em meio rico. A Figura 4 ilustra as vias comuns de fermentação de lactato nas 15 bactérias ácido-lácticas. A presente invenção pode ser mais bem compreendida a partir da seguinte descrição detalhada e da descrição das sequências anexa que fazem parte do presente pedido. As sequências a seguir estão em conformidade com Título 37 20 do CFR §1-821-1-825 ("Requirements for Patent App//cations Containing Nuc/eotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disc/osures - the Sequence Ru/es") e são consistentes com a Organização Mundial da Propriedade lntelectual (OMPINVIPO), Standard ST.25 (1998) e os requisitos de Iistagem de sequências EPO e PCT (Regras 5.2 e 49,5 (a-bis), e na 25 secção 208 e no Anexo C das instruções administrativas). Os sÍmbolos e formatos utilizados para os dados de sequências de nucleotídeos e aminoácidos obedecem as regras estabelecidas no Título 37 do CFR § 1,822.

Tabela 1

SEQ ID NOS De Regiões Codificadoras De Lactato Desidrogenase E

ProteÍnas

Organismo e nome do gene nuc,Ê?c:::?'Q :Eã°D'kd:

Lactobaci//us plantarum ld hO 1 2 Lactobaci//us p/antarum ldhL1 3 4 Lactobaci/lus p/antarum IdhL2 5 6 Lactococcus lactis ldhL 19 20 Leuconostoc mesenteroides ldhD 21 22 Streptococcus thermophi/us ldhL 23 24 Pediococcus pentosaceus ldhD 25 26 Ped/ococcus pentosaceus ldh L 27 28 Lactobaci/lus acidophi/us ldhL1 29 30 Lactobaci/lus acidophi/us ldhL2 31 32 Lactobacil/us acidophi/us ldhD 33 34

Tabela 2

SEQ ID NOS De Regiões Codificadoras De Butanodiol Desidrogenase E ProteÍnas

Ácido nucleico Amino ácido Descrição SEQ ID NO: SEQ ID NO:

budC, butanodiol desidrogenase de K/ebsie//a 12 13 pneumoniae I AM 1063 butanodiol desidrogenase de Baci//us cereus 63 64 but8, butanodiol desidrogenase de Lactococcus 65 66 lactis

W

Tabela 3 m

SEQ ID NOS Das Regiões Codificadoras De PIRUVATO-FORMATO LIASE E 0

Enzima Ativadora Da P]RUVATO-FORMATO LIASE E PROTEÍNAS a Acido nucleico Amino ácido Organismo e nome do gene |SEQIDNO: |SEQ|DNO:|

Pfl81 de Lactobaci//us p/antarum I 69 ! 70 Pfl82 de Lactobaci//us p/antarum i 71 ) 72 PflA1 de Lactobaci//us p/antarum i 73 I 74 PflA2 de Lactobaci//us p/antarum I 75 I 76 Pfl de Lactococcus lactis 77 78 PflA de Lactococcus lactis 79 80 Pfl de Streptococcus thermophi/us 81 82 PflA de Streptococcus thermophi/us I 83 I 84

Tabela 4

5 SEQ ID NOS De Regiões Codificadoras De Expressão E ProteÍnas Acido Amino ácido Descrição |nuc|:icNoOi!EQ I SEQ ID NO: I

: Achromobacter xy/osoxidans secondary alcohol ' desidrogenase sadt3 i 9 10 I Roseburia inu//nivorans butanodiol desidratase ) 15 l 16 rdhtA I Roseburia inu/inivorans butanodiol desidratase I 17 I 18 reativase rdht8 ALS de Baci//us subti/is I 85 I 86 ALS de Baci//us subti/is região codificadora I 87 I 86* otimizada para Lactobaci//us p/antarum ALS de K/ebsie//a pneumoniae (budB) 88 89

ALS de Lactococcus lactis I 90 I 91

ALS de Staphy/ococcus aureus Í 92 : 93

ALS de Listeria monocytogenes I 94 I 95

ALS de Streptococcus mutans I 96 I 97

ALS de Streptococcus themophi/us I 98 | 99

ALS de Vibrio angustum I 100 I 101

ALS de Baci/lus cereus l 102 I 103

* mesma sequência de proteina codificada pela sequência nativa e otimizada A SEQ ID NO: 7 é a sequência nucleotídica da região codificadora da ortidina-5'-fosfatase descarboxilase de L. p/antarum.

A SEQ ID NO:8 é a sequência nucleotídica do promotor ldhL1 de 5 L. p/antarum. A SEQ ID NO:11 é a sequência nucleotídica do promotor FBA da S. cerevisae.

A SEQ ID NO:14 é a sequência nucleotídica do promotor GPMl da S. cerevisae.

As SEQ ID NOS :35-38 são plasmídeos pFP996, pFP996PldhL1, pFP996PldhL1-budC-sadB e pFP996PldhL1-budC, respectivamente. As SEQ ID NOS :39-50, 52-62 e 104-113 são primers de PCR, clonagem e sequenciamento. A SEQ ID NO:51 é a seqüência nucleotídica de um sÍtio de ligação de ribossomos. A SEQ ID NO: 67 é a seqüência de um fragmento sintético contendo regiões codificantes para reativase e diol desidratase independente de B12 da Roseburia inu/inivorans. Descrição Detalhada Da InvençÃo A presente invenção refere-se a células bacterianas ácido-láticas (LAB) recombinantes que são geneticamente modificadas para terem melhor conversão de piruvato, especificamente piruvato endógeno, para 2,3- butanodiol. As células LAB expressam uma butanodiol desidratase heteróloga e são substancialmente livres de atividade lactato desidrogenase. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos de produção de 2,3-butanodiol, 2- butanona, ou 2-butanol usando as células LAB geneticamente rnod ificadas da presente invenção. A produção desses compostos nas bactérias ácido-lácticas irá reduzir a necessidade de petroquimicos para a produção de produtos químicos industriais para aplicações como solventes e/ou extratores, e estes a compostos podem substituir os combustíveis fósseis, seja de maneira direta ou * como intermediários para a sintese química de novos substitutos dos » combustíveis fósseis.

5 As seguintes abreviaturas e definições serão usadas para a interpretação do relatório descritivo e reivindicações. Conforme utilizado na presente invenção, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "possuindo", "contém" ou "contendo" ou qualquer outra variação destes, se destinam a cobrir 10 uma inclusão não-exclusiva. Por exemplo, uma composição, uma mistura, processo, método, artigo ou aparelho que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas tais elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente enumerados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a 15 menos que indicado expressamente de outra forma, "ou" refere-se a um inclusivo ou, e urn não exclusivo ou. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfatória por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

20 Além disso, o artigo indefinido "um(uns)" e "uma(s)" que precede um elemento ou componente da presente invenção destina-se a ser não restritivo com relação ao número de casos (ou seja, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto, '°um(uns)" ou "uma(s)" devem ser interpretados por incluir um ou pelo menos um, e a forma singular da palavra do elemento ou 25 componente também inclui o plural, a menos que seja o número que, obviamente, pretende-se que seja singular.

O termo "invenção" ou "presente invenção", conforme utilizado no presente não tem a intenção de se referir a qualquer exemplo de realização

P único específico invenção, mas abrange todos os exemplos de realização "P· possiveis descritos no relatório descritivo e reivindicações. * Como usado no presente, o termo "cerca de" altera a quantidade 0 de um ingrediente ou reagente empregado na invenção, referindo-se a variação 5 na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através da medição tipica e procedimentos de manuseio de líquido usado para fazer concentrados ou soluções de uso no mundo real, através de erro involuntário nesses processos; através de diferenças na produção, origem ou grau de pureza dos ingredientes utilizados para fazer as composições ou realizar os métodos, e 10 similares. O termo "cerca de" também engloba valores que diferem devido a diferentes condições de equilibrio para uma composição resultante de uma mistura inicial especifica. Seja ou não modificadas pelo termo "cerca de", as reivindicações incluem equivalentes para as quantidades. Em um exemplo de realização, o termo "cerca de" significa até 10% do valor numérico descrito, 15 preferencialmente, dentro de 5°/0 do valor numérico descrito.

O termo "via biossintética do 2-butanol" se refere a uma via enzimática para a produção de 2-butanol a partir do piruvato.

O termo "via biossintética da 2-butanona" se refere a uma via enzimática para a produção de 2-butanona a partir do piruvato.

20 O termo "butanodiol desidrogenase" também conhecido como "acetoina reductase" refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), com uma atividade enzimática que catalisa a conversão de acetoina para 2,3-butanodiol.

As butanodiol desidrogenases são um subconjunto da ampla familia da álcool desidrogenase. As enzimas butanodiol desidrogenases podem ter 25 especificidade para produção de estereoquímica-(R) ou —(S) no produto álcool. As butanodiol desidrogenases S-específicas são conhecidas como EC 1.1.1.76 e estão disponíveis, por exemplo, a partir da K/ebsie//a pneumoniae (DNA: SEQ ID NO: 12, proteina: SEQ ID NO: 13). As butanodio! desidrogenases (R)-

específicas são conhecidas como EC 1.1.1.4 e estão disponíveis, por exemplo, » a partir do Baci//us cereus (DNA: SEQ ID NO:63, proteína: SEQ ID NO:64), e

O Lactococcus lactis (DNA: SEQ ID NO:65, proteina: SEQ ID NO:66). " O termo "lactato desidrogenase" refere-se a um polipeptideo (ou 5 polipeptideos), possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de piruvato em lactato. As lactato desidrogenases são conhecidas como EC

1.1.1.27 (L-lactato desidrogenase) ou EC 1.1.1.28 (D-lactato desidrogenase) e estão descritas em maiores detalhes na presente invenção.

O termo "substancialmente livre" quando usado em referência à 10 presença ou ausência de atividade enzimática da Iactato desidrogenase significa que o nível da enzima é substancialmente menor do que o nível da mesma enzima no hospedeiro tipo-selvagem, em que é preferivel uma atividade 50% menor no nivel em comparação com o tipo selvagem e é mais preferido uma atividade 9Õ°/o menor no nlvel em comparação com o tipo 15 selvagem. A redução do nível de atividade enzimática pode ser atribuída à modificação genética de genes que codificam essa enzima, de modo que os níveis de expressão da enzima são reduzidos.

O termo "anaeróbios facultativos" refere-se a um micro-organismo que pode crescer em ambientes aeróbios e anaeróbios.

20 O termo "substrato de carbono" ou "substrato de carbono fermentável" refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos organismos hospedeiros da presente invenção e, em especial, fontes de carbono selecionados a partir do grupo consistindo de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarideos e substratos de um carbono ou misturas 25 destes. O termo "reservatório de elétron adicional" refere-se a um reseNatório de elétron"s ou produção de um reservatório de elétrons que não está incluido na via biossintética para o produto desejado.

P O termo "gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que é b 0 capaz de ser expresso como uma proteína específica, incluindo opcionalmente sequências regulatórias precedentes (sequências não codificantes 5') e 0 seguintes (sequências não codificantes 3') à sequência de codificação. "Gene 5 nativo" refere-se a um gene na forma como encontrado na natureza, com as suas próprias sequências regulatórias. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, incluindo sequências regulatórias e de cod ificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente um gene quimérico pode incluir sequências regulatórias e sequências 10 codificantes que são provenientes de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua posição natural no genoma de um organismo. Um gene "estrangeiro" ou "gene heterólogo" refere-se a um 15 gene que normaimente não é encontrado no organismo hospedeiro, mas que está introduzido no organismo hospedeiro pela transferência de genes. Os "gene heterólogo" inclui uma região codificante nativa, ou parte dela, que é reintroduzida no organismo de origem de uma forma que é diferente do gene nativo correspondente . Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma 20 região de codificação nativa que é uma porção de um gene quimérico, incluindo regiões regulatórias não nativas que são reintroduzidas no hospedeiro nativo. Também um gene estrangeiro pode compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação.

25 Conforme utilizado no presente, o termo "região de codificação" refere-se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácido específico. "Sequências regulatórias adequadas" referem-se a sequências nucleotidicas localizadas a montante (sequências não codificadoras 5'), dentro,

« ou a jusante (sequências não codificadoras 3') de uma sequência codificadora,

P e as quais influenciam na transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, » ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências r regulatórias podem incluir proniotores, sequências líderes de tradução, Íntrons, 5 sequências de reconhecimento de poliadenilação, sitio de processamento de RNA, sítio de ligação efetora e estrutura stem-loop.

O termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma sequência de codificação está localizada a 3' de uma sequência 10 promotora. Os promotores podem ser obtidos em sua totalidade, a partir de um gene nativo, ou ser compostos por diversos elementos provenientes de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É compreendido pelos técnicos no assunto que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes 15 tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos celulares são na maioria das vezes comumente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, como na maioria dos casos, os limites exatos das 20 sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.

O termo "operacionalmente ligado" refere-se a associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor é 25 operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando esta é capaz de afetar a expressão da sequência de codificação (ou seja, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientaçâo sense ou antisense. 6 O termo "expressão", conforme utilizado no presente, refere-se a * transcrição e acúmulo estável de (RNAm) sense ou RNA antisense derivado do » fragmento de ácido nucleico da invenção. A expressão também pode se referir 5 à tradução do RNAm em um poIipeptídeo. Conforme utilizado no presente, o termo "transformação" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para dentro de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável.

Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácidos nucleicos 10 transformados são referidos como organismos "transgênicos" ou "recombinantes" ou "modificados".

Os termos "plasmídeo" e "vetor" conforme utilizados na presente invenção, se referem a um elemento extracromossômico que geralmente carrega genes que não fazem parte do metabolismo central da célula e, 15 normalmente, estão sob a forma de moléculas de DNA circular de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências que se replicam autonomamente, sequências de integração do genoma, fago ou sequências de nucleotídeos, lineares ou circulares, de fita simples ou de fita-dupla, de DNA ou RNA, provenientes de qualquer fonte, no qual uma variedade de sequências 20 nucleotídicas foram unidas ou recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA de um produto gênico selecionado, junto com a sequência 3' não traduzida adequada em uma célula.

Conforme utilizado no presente, "degenerescência do códon" 25 refere-se a natureza do código genético que permite uma variação na sequência de nucleotídeos sem afetar a sequência de aminoácidos de Llm polipeptídeo codificado. Os técnicos hábeis no assunto estão cientes do "códon-bias" exibido por uma célula hospedeira específica no uso de códons n nucleotídicos para especificar um determinado aminoácido. Portanto, quando

D sintetizando um gene para a expressão melhorada em uma célula hospedeira, * é desejável projetar o gene de forma que a frequência dos códons de uso

W preferencial (codon usage) se aproxime da frequência dos códons de uso 5 preferencial da célula hospedeira. O termo "códon otimizado" quando se refere a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácidos nucleicos para a transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons nos genes ou regiões de codificação das moléculas de ácidos nucleicos para refletir os códons de uso 10 preferencial (codon usage) típicos do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptideo codificado pelo DNA.

Conforme utilizado na presente invenção, um "fragmento de ácido nucleico isolado" ou "molécula de ácido nucleico isolada" são utilizados de maneira intercambiável e significa um polímero de RNA ou DNA, que é de fita 15 simples ou fita dupla, contendo opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucleico isolado na forma de um polímero de DNA pode ser composto por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genõmico ou DNA sintético.

Um fragmento de ácido nucleico é "hibridizável" a outro fragmento 20 de ácido nucleico, tal como um DNA, DNA genômico, ou molécula de RNA, quando uma forma de fita-simples do fragmento de ácido nucleico pode parear com o fragmento de ácido nucleico sob condições adequadas de temperatura e força iônica da soIução. As condições de hibridização e de lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, j., Fritsch, E.F. e Maniatis, T.

25 Mo/ecu/ar C/oning." A Laboratory Manual, 2" Ed, Cold Spring Harbor Laboratory:. Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989), especialmente o Capítulo 11 e Tabela 11.1 nele (integralmente incorporado ao presente pela referência).

As condições de temperatura e força iônica determinam a "estringência" da hibridização. Condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar e

P fragmentos moderadamente similares, (tais como sequências homólogas a partir de organismos distantemente relacionados) até fragmentos muito

O similares (tais como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de 5 organismos estreitamente relacionados). A lavagem pós-hibridização determina as condições de estringência. Um conjunto de condições preferenciais usa uma série de lavagens iniciais com 6X SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente por 15 min, em seguida, repetido com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 °C por 30 min, e depois repetido duas vezes com 0,2 X SSC, 0,5% de SDS a 50 °C por 10 30 min. Um conjunto de condições de estringência mais preferido utiliza altas temperaturas em que lavagens são idênticas às mencionadas anteriormente, exceto que a temperatura das duas últimas lavagens de 30 min em 0,2 X SSC, 0,5% de SDS foi aumentada para 60 °C. Outro conjunto de condições de estringência preferenciais usa duas lavagens finais em 0,1 X SSC, 0,1% de 15 SDS a 65 °C. Um conjunto adicional de condições de estringência inclui a hibridização a O,1X de SSC, O,i°/o de SDS a 65 °C e lavagens com 2X SSC, a 0,1% de SDS, seguido por O,1X de SSC, 0,1°/o de SDS, por exemplo.

A hibridização exige que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, contudo, dependendo da estringência da 20 hibridização, pareamentos inadequados entre as bases são possiveis. A estringência adequada para hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas no estado da técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre as duas sequências de nucleotldeos, maior o valor de Tm para 25 os híbridos de ácidos nucleicos com essas sequências, A estabilidade relativa (correspondendo a um Tm maior) de hibridizações de ácidos nucleicos diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para hibridos com mais de 100 nucleotídeos de comprimento, as equações para o cálculo de Tm foram e derivados (vide Sambrook et al. Supra, 9,50-9,51). Para hibridizações com e

W ácidos nucleicos mais curtos, ou seja, oligonucleotÍdeos, a posição de pareamentos inadequados se torna mais importante, e o comprimento do + oligonucleotÍdeo determina a sua especificidade (vide Sambrook et al. Supra, 5 11,7-11,8). Em um exemplo de realização, o comprimento de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Preferencialmente, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 20 nucleotideos, e mais preferencialmente ainda de pelo menos cerca de 30 10 nucleotídeos de comprimento. Além disso, o técnico hábil no assunto irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário de acordo com fatores como o comprimento da sonda.

Uma "porção substancial" de um aminoácido ou uma sequência 15 de nucleotídeos é a porção que compreende uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou sequência de nucleotídeos de um gene que é suficiente para identificar putativamente o polipeptídeo ou gene, seja pela avaliação , manual da sequência por um técnico do assunto, ou por comparação e identificação de sequência automatizada por computador utilizando algoritmos 20 como o BLAST (Altschul, S.F,, et al. J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993))- Em geral, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou de trinta ou mais nucleotídeos é necessária para identificar putativamente um polipeptídeo ou sequência de ácidos nucléicos como homóloga a um gene ou proteína conhecida. Além disso, com relação às sequências nucleotídicas, sondas de 25 oligonucleotÍdeos gene específicas compreendendo de 20-30 nucleotídeos contiguos podem ser usadas em métodos de identificação de genes dependente de sequência (por exemplo, a hibridização Southem) e isolamento (por exernplo, hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas de bacteriófago). Além disso, oIigonucleotídeos curtos de 12-15 bases podem ser 0 e usados como primers para amplificação por PCR, a fim de se obter um fragmento de ácido nucleico específico compreendendo os primers. Assim,

O uma "porção substancial" de uma sequência de nucleotídeos compreende o 5 suficiente da sequência para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento de ácido nucleico que compreende a dita sequência. O presente relatório descritivo ensina as sequências completas de aminoácido e nucleotideos que codificam proteinas específicas. O técnico hábil assunto, possuindo o beneficio das sequências conforme descrito na presente invenção, 10 pode agora utiiizar a totalidade ou uma porção substancial das sequências reveladas para fins conhecidos pelos técnicos hábeis neste assunto. Assim, a presente invenção compreende as sequências completas conforme descrito na Listagem de Sequências anexa, bem como as porções substanciais dessas sequências definidas acima.

15 O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina.

A expressão "porcentagem de identidade", como é conhecida no 20 estado da técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas, duas ou mais sequências nucleotidicas, conforme determinado pela comparação das sequências. No estado da técnica, "identidade" significa também o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptideos ou polinucleotÍdeos, conforme o caso, como determinado pelo pareamento 25 entre as cadeias de tais sequências. A "identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculadas por meio de métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando aos descritos em: 1) Computational Mo/ecu/ar Bio/ogy (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988): 2) Biocomputinq: lnfonnatics and Genome

Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993): 3) Computer Ana/ysis of Sequence Data, Part / (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4) Sequence Ana/ysis in Mo/ecu/ar Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e 5) Sequence Ana/ysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) 5 Stockton: NY (1991). Métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar o melhor pareamento entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade estão codificados em programas de computador disponiveis publicamente. Os Alinhamentos de sequência e cálculos de percentagem da identidade foram realizados utilizando o programa Megalign" da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR" lnc., Madison, Wl). O alinhamento múltiplo das sequências é realizado utilizando o "método de alinhamento de Clustal", que abrange diversas variedades do algoritmo, incluindo o "método de alinhamento Clustal V", correspondente ao método de alinhamento marcado Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, CAB/OS 5:151-153 (1989);. Higgins, D.G. et al, Comput Appl Biosci, 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign" da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR lnc.). Para alinhamentos múltiplos, os valores padrão correspondem a GAP PENALTY = 10 e GAP LENGTH PENALTY = 10.

Os parâmetros padrão para alinhamentos pareados e o cálculo da percentagem de identidade das sequências de proteínas utilizando o método Clustal são KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5. Para ácidos nucleicos estes parâmetros são KTUPLE = 2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal V, é possÍvel obter uma "percentagem de identidade" pela visualização da tabela "distâncias de sequência" no mesmo programa. Além disso, o "método de alinhamento Clustal W" está disponível e corresponde ao método de alinhamento Clustal W marcado (descrito por Higgins e Sharp, CAB/OS 5:151-153 (1989);. Higgins, * D.G. et al, Comput Appl Biosci. . 8:189-191 (1992), Thompson, J. D., Higgins,

W D. G., e Gibson T. J- (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673 4680) e encontrado no

B MegAlign® v6.1 programa da LASERGENE bioinformatics computing su/te 5 (DNASTAR lnc.). Os parâmetros padrão para o alinhamento múltiplo são: (GAP PENALTY=1Q GAP LENGTH PENALTY=0.2, De/ay Divergen Seqs(°6)=30, DNA Transitlon Weight=0. 5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=/UB). Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal W, é possivel obter uma "percentagem de identidade" pela visualização da 10 tabela "distâncias de sequência" no mesmo programa. É bem compreendido por um técnico no assunto que muitos niveis de identidade da sequência são úteis na identificação de polipeptídeos, a partir de outras espécies, onde tais poiipeptídeos têm a mesma ou similar função ou atividade, Exemplos úteis de percentagem de identidade incluem, 15 mas não estão limitados a: 24%, 3O°/j, 35%, 4Õ°/o, 45%, 50°/o, 55%, 60%, 65%, 70%, 75°/o, 8Ó°/o, 85%, 9Õ°/o ou 95%; ou qualquer percentual de inteiros a partir de 24% até 1OO°/o pode ser útil para descrever a presente invenção, tal como 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 3Ó°/o, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 20 51 °6, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71°/,, 72%, 73%, 74%, 75°/,, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81°6, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89°/,, 90°6, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Fragmentos de ácidos nucleicos adequados não só possuem as homologias acima, mas 25 normalmente codificam um polipeptídeo possuindo pelo menos 50 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 100 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 200 aminoácidos, e mais preferencialmente pelo menos 250 aminoácidos.

W A expressão "software de análise de sequência" refere-se a qualquer algoritmo ou programa de computador que seja útil para a análise de

E sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. "Som/vare de análise de 5 sequência" pode ser comercialmente disponivel ou desenvolvido de forma independente. SoRwares de análise de sequência típicos incluem, mas não estão limitados a: 1) o suite de programas GCG (Wisconsin Package versão

9.0, Genetics Computer Group {GCG), Madison, Wl); 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215, 403-410); 3) DNASTAR (DNASTAR, 10 lnc., Madison, Wl), 4) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml); e 5) programa FASTA incorporando o algoritmo Smith-Waterman (Pearson, W.

R. Comput. Methods Genome Res., [Proc. lnt. Symp] (1994) Meeting Date 1992, 111-20. Ed(s). Suhai, Sandor. P/enum, Nova lorque, NY). No contexto do presente pedido, é preciso entender que, quando o soRware de análise de 15 sequência é utilizado para a análise, os resultados da análise serão baseados nos "valores padrões" ou "parâmetros predefinidos" do programa referenciado, salvo quando ind icado de outra forma. Conforme utilizado no presente "valores padrões" (defau/t) significa qualquer conjunto de valores ou parâmetros originalmente carregados com o soRware quando este é inicializado pela 20 primeira vez. Técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular padrões utilizadas na presente invenção são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Mo/ecu/ar C/oning: A Laboratory Manual, 2" Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory Press: 25 Cold Spring Harbor, NY (1989) (acima como "Maniatis"); e por Silhavy, T. j., Bennan, M. L. e Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F. M.

et al., Em: Current Protoco/s in Mo/ecu/ar Bio/ogy, publicado por Greene

Pub/ishing and Wi/ey-/nterscience, (1987). 0 0 Alto Fluxo De Piruvato Para 2,3-BUTANOD|OL Em BACTÉRiAS ÁCIDO-LÁTICAS A presente invenção revela que uma elevada proporção de k piruvato pode ser convertida em 2,3-butanodiol em células bacterianas ácido- 5 láticas, quando as células são geneticamente modificadas para serem substancialmente livres da atividade da lactato desidrogenase e geneticamente modificadas para expressarem polipeptídeos heterólogos com atividade butanodiol desidrogenase.

As bactérias ácido-láticas são bem caracterizadas e têm sido 10 utilizadas comercialmente há muitos anos para a produção de uma grande variedade de produtos. Existe uma variedade de vias de fermentação na natureza para o metabolismo de açúcares até o piruvato (vide Figura 4), no entanto as bactérias ácido-láticas possuem sistemas que favorecem a conversão de piruvato em ácido láctico via desidrogenase de ácido Íáctico. Este 15 é um objeto da presente invenção para maximizar o fluxo de carbono a partir do piruvato para 2,3-butanodiol para a produção de 2-butanol e 2-butanona (Figura 4 e 1). Surpreendentemente, conforme descrito na presente invenção, verificou-se que as modificações nas vias da presente invenção resultaram em uma célula ácido-iática hospedeira que, ao invés de produzir principalmente 20 lactato, com uma pequena quantidade de acetoína, como em células sem tais modificações genéticas, as células modificadas produziram 2,3-butanodiol, etanol, succinato, formato, lactato e produtos acetoína. A quantidade produzida de 2,3-butanodiol é, pelo menos, cerca de 49 Mol °/) do total desses 6 produtos. Pelo menos cerca de 0,4 g de 2,3-butanodiol pode ser produzida por grama de 25 glicose consumida. O 2,3 butanodiol é produzido a partir do piruvato através de etapas de conversão do piruvato em acetolactato, conversão de acetolactato em acetoína e conversão de acetoina em 2,3-butanodiol. Esta via biossintética constitui as três primeiras etapas (a, b e i) da via exibida na Figura 1, que é y B descrita mais adiante. As atividades que realiza a primeira e segunda conversão podem ser fornecidas pelas enzimas endógenas do hospedeiro, m conforme exemplificado na presente invenção, ou podem ser fornecidas pela 5 expressão heteróloga de enzimas, conforme descrito a seguir. A produção de 2,3-butanodiol pode ser alcançada em células que são bactérias ácido-láticas (LAB), devido ao redirecionamento do fluxo de carbono na produção de ácido láctico. As LABS que podem ser células hospedeiras na presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a, 10 Lactococcus, Lactobaci//us, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus e Streptococcus.

Além disso, foi determinado que não é necessário fornecer um reservatório de elétron adicional para equilibrar equivalentes redox a fim de atingir o fluxo descrito a partir do piruvato para 2,3-butanodiol. Como o lactato é 15 o principal produto final para o Lactobaci//us p/antarum, as lactato desidrogenases dependentes de NAD são os principais contribuintes para o equilíbrio de equivalentes redox. Na ausência das lactato desidrogenases, era, esperado que um reservatório de elétrons adicional fosse necessário para ajudar o equilibrio redox. No entanto, os depositantes encontraram que a 20 coprodução de etanol e succinato pelas enzimas nativas foi suficiente para equilibrar os equivalentes redox a obter o fluxo descrito na presente invenção, de forma que um reservatório de elétrons adicional não foi necessário.

Atividade Da Lactato Desidrogenase Reduzida A atividade endógena da lactato desidrogenase nas bactérias 25 ácido-lácticas (LAB) converte o piruvato em iactato. A LAB pode ter um ou mais genes, normalmente um, dois ou três genes, que codifica a iactato desidrogenase. Por exemplo, o Lactobacil/us p/antarum possui três genes codificadores da lactato desidrogenase que são denominados de ldhL2

(proteína SEQ ID NO: 6, região codificadora SEQ ID NO: 5), ldhD (proteína

W ¢ SEQ ID NO: 2, região codificadora SEQ ID NO: 1), e ldhL1 (proteina SEQ ID NO: 4, região codificadora SEQ ID NO: 3). O Lactococcus lactis possui um

W gene codificador da lactato desidrogenase que é denominado de ldhL (proteína 5 SEQ ID NO: 20, região codificadora SEQ ID NO: 19), e o Pediococcus pentosaceus possui dois genes codificadores da lactato desidrogenase denominados de ldhD (proteína SEQ ID NO: 26, região codificadora SEQ ID NO: 25), e IdhL (proteina SEQ ID NO: 28, região codificadora SEQ ID NO: 27).

Nas cepas LAB da presente invenção, a atividade da lactato 10 desidrogenase está reduzida de modo que as células são substancialmente livres de atividade da lactato desidrogenase. A modificação genética é feita em pelo menos um gene que codifica a lactato desidrogenase para reduzir a atividade desta. Quando mais de um gene da lactato desidrogenase está ativo nas condições de crescimento que serão utilizadas, cada um desses genes 15 ativos poderá ser modificado para que a expressão seja reduzida, e, dessa forma, a atividade da lactato desidrogenase será reduzida ou eliminada. Por exemplo, no L. p/antarum os genes ldhL1 e ldhD são modificados. Não é necessário modificar o terceiro gene, ldhL2, para o crescimento em condições típicas, pois este gene parece estar inativo nestas condições. Normalmente, a 20 expressão de um ou mais genes que codificam a lactato desidrogenase é interrompido para reduzir a atividade da enzima expressa. Exemplos de genes da lactato desidrogenase em LAB que podem ser alvos da interrupção são representados pelas regiões codificadoras da SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 e 33 listadas na Tabela 1, Outros genes alvos, tais como aqueles 25 que codificam as proteínas lactato desidrogenase que possuem cerca de pelo menos 80-85%, 85% - 90%, 90% -95%, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com as lactato desidrogenases das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 20, 22 24, 26, 28, 30, 32 e 34 listadas na Tabela 1, podem ser identificados na literatura e pelo uso de abordagens de bioinformática, como é bem conhecido pelo técnico y a hábil no assunto, uma vez que as lactato desidrogenases são bem conhecidas.

Normalmente a pesquisa BLAST (descrita acima) de base de dados de acesso público com sequências de aminoácidos da lactato desidrogenase conhecidas, 5 tais como aquelas fornecidas na presente invenção, é usada para identificar as lactato desidrogenases e suas sequências de codificação que podem ser alvos da interrupção para reduzir a atividade da lactato desidrogenase. As identidades são baseadas no método de alinhamento CIustal W usando os parâmetros preestabelecidos GAP PENALTY=1O, GAP LENGTH 10 PENALTY=O,1; e matriz de peso proteico Gonnet 250 serles. Além disso, as sequências descritas na presente invenção ou aquelas recitadas no estado da técnica podem ser usadas para identificar outros homólogos na natureza em outras cepas LAB. Por exemplo, cada um dos fragmentos de ácidos nucleicos de codificação da lactato desidrogenase 15 descrito no presente pode ser usado para isolar genes que codificam proteínas homólogas. O isolamento de genes homólogos usando protocolos dependentes de sequência é bem conhecido no estado da técnica. Exemplos de protocolos dependentes de sequência incluem, mas não estão limitados a: 1) métodos de hibridização de ácidos nucleicos; 2) métodos de amplificação de DNA e RNA, 20 conforme exemplificado por vários usos de tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos [por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), Mullis et al, Patente US 4.683.202;. reação em cadeia da ligase (LCR) Tabor, S. et al.

Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985), ou amplificação por deslocamento de fita (SDA), Walker et al, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA, 89:392 (1992)], e 3) métodos 25 de construção de bibliotecas e seleção por complementação.

Por exemplo, genes que codificam proteínas ou polipeptldeos semelhantes aos genes que codificam a lactato desidrogenase descritos no presente podem ser isolados de maneira direta utilizando todo ou uma parte dos fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção como sondas de 4 hibridização de DNA para selecionar bibliotecas a partir de qualquer levedura - desejada utilizando a metodologia bern conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. Sondas de oligonucleotideos específicas baseadas nas sequências 5 divulgadas de ácidos nucleicos podem ser desenhadas e sintetizadas por métodos bem conhecidos no estado da técnica (Maniatis, supra). Além disso, as sequências inteiras podem ser usadas diretamente para sintetizar sondas de DNA por métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto (por exemplo, marcação de primers de DNA aleatórios, tradução por cortes ou técnicas de 10 marcação de extremidades) ou sondas RNA utilizando sistemas de transcrição in vltro disponiveis. Além disso, primers específicos podem ser criados e utilizados para amplificar uma parte (ou todo o comprimento) das presentes sequências. Os produtos de amplificação resultantes podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou marcados após as reações 15 de amplificação, e utiiizados como sondas para isolar fragmentos de DNA de comprimento total por hibridização em condições adequadas de estringência.

Normalmente, em técnicas de amplificação do tipo PCR, os primers têm sequências diferentes e não são complementares entre si.

Dependendo das condições de ensaio desejadas, as sequências de pritners 20 devem ser projetadas para oferecer tanto eficiência quanto fidelidade de replicação do ácido nucleico alvo. Métodos de desenvolvimento de primers para PCR são comuns e bem conhecidos no estado da técnica (Thein e Wallace, "The use of o/igonuc/eotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", em Human Genetic Diseases: A Practical 25 Approach, K. E. Davis Ed., (1986) págs 33-50, IRL: Herndon, VA; e Rychlik, W., em Methods in Mo/ecu/ar Bio/ogy, White, B.A. Ed., (1993) Vol. 15, págs 31-39, PCR Protoco/s.' Current Methods and App/ications. Humania: Totowa, NJ).

Geralmente dois segmentos curtos das sequências descritas podem ser utilizados em protocolos de reação em cadeia da polimerase para amplificar

D

D fragmentos de ácidos nucleicos maiores que codificam genes homólogos a partir do DNA ou RNA. A reação em cadeia da polimerase também pode ser

F realizada em uma biblioteca de fragmentos de ácidos nucleicos clonados em 5 que a sequência de um primer é derivada a partir dos fragmentos de ácidos nucleicos descritos, e a sequência dos outros primers aproveita a presença dos setores de ácido poliadenílico na extremidade 3' do gene microbiano que codifica o precursor do mRNA.

Alternativamente, a segunda sequência de primer pode ser 10 baseada em sequências derivadas a partir do vetor de clonagem. Por exemplo, um técnico no assunto pode seguir o protocolo RACE (Frohman et al. PNAS USA 85:8998 (1988)) para gerar cDNAS por PCR para amplificar cópias da região entre um único ponto na transcrição e a extremidade 3' ou 5'. Primers orientados no sentido 3 'e 5' podem ser projetados a partir das sequências da 15 presente invenção. Usando sistemas comercialmente disponiveis 3' RACE ou 5' RACE (por exemplo, BRL, Gaithersburg, MD), fragmentos de CDNA 3' ou 5" específicos podem ser isolados (Ohara et al. PNAS USA 86:5673 (1989); Loh et al . Science 243:217 (1989)).

Alternativamente, as sequências codificadoras da lactato 20 desidrogenase descritas podem ser empregadas como reagentes de hibridização para a identificação de homólogos. Os componentes básicos de um teste de hibridização de ácido nucleico incluem uma sonda, uma amostra suspeita de conter o gene ou fragmento do gene de interesse, e um método de hibridização especlfico. As sondas normalmente são sequências de ácidos 25 nucleicos de fita simples que são complementares com as sequências de ácidos nucleicos a serem detectadas. As sondas são "hibridizáveis" com a sequência de ácidos nucleicos que será detectada. O comprimento da sonda pode variar de 5 bases até dezenas de milhares de bases, e irá depender do teste específico a ser feito. Normalmente, um comprimento de sonda de

B aproximadamente 15 bases até cerca de 30 bases é adequado. Somente parte * da molécula da sonda precisa ser complementar à sequência de ácido nucleico 0 a ser detectada. Além disso, a complementaridade entre a sonda e a sequência 5 alvo não precisa ser perfeita. A hibridização ocorre entre as moléculas imperfeitamente complementares com o resultado de que certa fração das bases na região hibridizada não está pareada adequadamente com a base complementar.

Os métodos de hibridização são bem definidos. Normalmente, a 10 sonda e a amostra devem ser misturadas sob condições que irão permitir a hibridização dos ácidos nucleicos. lsto envolve o contato da sonda e amostra na presença de um sal inorgânico ou orgânico sob condições adequadas de concentração e temperatura. A sonda e a amostra de ácidos nucleicos devem estar em contato por um periodo de tempo suficiente para que qualquer 15 hibridização possÍvel entre a sonda e amostra de ácido nucleico possa ocorrer. A concentração da sonda ou alvo na mistura vai determinar o tempo necessário para que ocorra a hibridização. Quanto maior a concentração de sonda ou alvo, menor o tempo necessário para a incubação da hibridização. Opcionalmente, um agente caotrópico pode ser adicionado. O agente caotrópico estabiliza os 20 ácidos nucleicos pela inibição da atividade nuclease- Além disso, o agente caotrópico permite a hibridização sensível e estringente de sondas curtas de oligonucleotÍdeos em temperatura ambiente (Van Ness e Chen, Nucl. Ácidos Res. 19:5143-5151 (1991)). Agentes caotrópicos adequados incluem o cIoreto de guanidina, cloreto de tiocianato, tiocianato de sódio, tetracloroacetato de 25 lítio, perclorato de sódio, tetracloroacetato de rubídio, iodeto de potássio, trifluoroacetato de césio, entre outros. Normalmente, o agente caotrópico estará presente em uma concentração final de cerca de 3 M. Se desejado, pode-se acrescentar formamida à mistura de hibridização, normalmente a 30-

50% (V/V).

Várias soIuções de hibridização podem ser empregadas. Normalmente, estas soluções compreendem entre cerca de 20 a 60% em volume, de preferência 3O°/j, de um solvente orgânico polar. Uma solução de 5 hibridização comum emprega cerca de 30-50% v/v de formamida, cerca de 0,15-1 M de cIoreto de sódio, cerca de 0,05-0,1 M de tampão (por exemplo, citrato de sódio, Tris-HCl, PIPES ou HEPES (pH variando entre 6 - 9)), cerca de 0,05-0,2% de detergente (por exemplo, dodecilsulfato de sódio) ou entre 0,5-20 mM de EDTA, FICOLL (Pharmacia lnc.) (cerca de 300-500 kdal), polivinilpirrohdona (cerca de 250-500 kdal) e albumina sérica. Também incluldo na solução de hibridização típica será um transportador não marcado de ácidos nucleicos de cerca de 0,1 a 5 mg/ml, o DNA nucleico fragmentado (por exemplo, DNA de timo de vitelo ou DNA de esperma do salmão, ou RNA de levedura), e, opcionalmente, cerca de 0,5 a 2°/0 peso/vol de glicina. Outros aditivos podem tambérn estar inc|LlÍdos, tais como agentes de exclusão de volume que incluem uma variedade de agentes polares solúveis em água ou agentes expansíveis (por exemplo, polietileno glicol), polímeros aniônicos (por exemplo, poliacrilato ou polimetilacrilato) e polímeros sacaridicos aniônicos (por exemplo, sulfato de dextrano).

A hibridização de ácidos nucleicos é adaptável a uma variedade de formas de ensaio. Uma das mais adequadas é o ensaio na forma de ensaio tipo sanduíche. O ensaio sanduiche é particularmente adaptável a hibridização em condições não desnaturantes. Um componente principal de um ensaio tipo sanduíche é um suporte sólido. O suporte sólido foi absorvido a esta ou acoplado covalentemente a esta sonda imobilizada de ácido nucleico que é marcada e é complementar a uma porção da sequência. Nas cepas LAB da presente invenção, pelo menos uma modificação por engenharia genética resulta em células substancialmente livres da atividade da lactato desidrogenase. Isso pode ser obtido por meio da b ' eliminação da expressão de pelo menos um gene endógeno que codifica a * ' lactato desidrogenase. Qualquer método de modificação genética conhecido

W por um técnico hábil no assunto para a redução da expressão de uma proteína 5 pode ser usado para alterar a expressão da lactato desidrogenase. Métodos incluem, mas não são Iimitados a, deleção do gene inteiro ou parte do gene que codifica a lactato desidrogenase, a inserção de um fragmento de DNA em um gene que codifica a lactato desidrogenase (seja no promotor ou na região de codificação) de modo que a proteina não possa ser expressa ou é expressa 10 em níveis mais baixos, introdução de uma mutação em uma região de codificação da Iactato desidrogenase, que acrescenta um códon de parada ou uma mudança no quadro de leitura de tal forma que uma proteína funcional não é expressa, introdução de uma ou mais mutações em uma região de cod,ificação da lactato desidrogenase para alterar os aminoácidos de modo que 15 uma proteína não funcional ou menos ativa enzimaticamente seja expressa. Além disso, a expressão da lactato desidrogenase pode ser bloqueada pela expressão de um RNA antisense ou um RNA interferente, e construções que resultam na cosupressão podem ser introduzidas. Todos esses métodos podem ser facilmente praticados por um técnico hábil no assunto fazendo uso 20 das sequências que codificam a lactato desidrogenase conhecidas, tais como aquelas das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 e 33.

Para alguns métodos, são úteis as sequências de DNA genômico que flaqueiam a região de codificação da lactato desidrogenase, tais como, métodos baseados na recombinação homóloga. Essas sequências podem 25 estar disponíveis a partir de projetos de sequenciamento do genoma, como para o Lactobaci//us p/antarum, que está disponivel no banco de dados do Centro Nacional de lnformações sobre Biotecnologia (National Center for Blotechno/ogy lnformation - NCBI), com a identificação Genbank'"

gi|28376974|ref|NC_ 004567.1|[28376974]. As sequências da DNA genômico adjacentes também podem ser obtidas pelo sequenciamento para fora da * sequência de codificação da lactato desidrogenase utilizando primers dentro da 0 sequência de codificação, bem conhecido pelo técnico hábil no assunto.

5 Um método particularmente apropriado para a criação de uma cepa LAB geneticamente modificada substancialmente livre de atividade lactato desidrogenase, conforme exemplificado na presente invenção no Exemplo 1, utiliza a recombinação homóloga mediada pelas sequências de DNA que flanqueiam a região codificadora da lactato desidrogenase para deletar todo o 10 gene. As sequências que flanqueiam são clonadas adjacentes entre si de modo que um evento de crossover duplo usando essas sequências de flanqueamento deleta a região de codificação da lactato desidrogenase. ExpressÃo Da Atividade Butanodiol Desidrogenase HETEBgLogA As bactérias ácido-láticas podem ter naturalmente uma baixa 15 quantidade de sintese de 2,3-butanodiol, que pode variar dependendo das condições de crescimento. Na presente invenção, a expressão heteróloga da atividade butanodiol desidrogenase fornece uma via para a sÍntese de 2,3- butanodiol que compete com sucesso com outras vias que utilizam o piruvato como substrato inicial, na ausência da atividade da lactato desidrogenase. A 20 atividade butanodiol desidrogenase heteróloga é expressa em uma célula LAB que é substancialmente livre de atividade da lactato desidrogenase, conforme descrito anteriormente.

As enzimas butanodiol desidrogenases são bem conhecidas e estão descritas nas definições acima. O técnico hábii no assunto irá apreciar 25 que polipeptideos possuindo atividade butanodiol desidrogenase isolados de uma variedade de fontes será útil na presente invenção independente da homologia da sequência. Alguns exemplos de enzimas butanodiol desidrogenase adequadas incluem, mas não estão limitadas a, aquelas da

K/ebsie//a pneumoniae (DNA: SEQ ID NO: 12; proteina: SEQ ID NO: 13), b Baci//us cereus (DNA: SEQ ID NO: 63; proteina: SEQ ID NO: 64), e « Lactococcus lactis (DNA: SEQ ID NO: 65: proteína: SEQ ID NO: 66). e Pelo fato das butanodiol desidrogenases serem bem conhecidas, 5 e por causa da prevalência do sequenciamento genômico, as butanodiol desidrogenases adequadas podem ser facilmente identificadas por um técnico hábil no assunto, com base em similaridade da sequência utilizando abordagens de bioinformática. Normalmente a pesquisa em base de dados de acesso público BLAST (descrita acima) com sequências de aminoácidos da 10 butanodiol desidrogenase conhecidas, tais como as fornecidas no presente, é usada para identificar butanodiol desidrogenases, e suas sequências de codificação que podem ser utilizadas nas cepas cIa presente invenção.

Exemplos de genes que codificam a butanodiol desidrogenase, que podem ser usados para fornecer a expressão heteróloga da atividade 15 butanodiol desidrogenase nas células LAB da presente invenção, possuem as SEQ ID NOS: 12, 63 e 64 e estão listadas na Tabela 2. Genes adicionais que codificam a buatnodiol desidrogenase que podem ser utilizados pata a expressão heteróloga em LAB podem ser identificados na literatura e em bancos de dados de bioinformática bem conhecidos pelos técnicos do assunto.

20 As sequências que codificam proteinas butanodiol desidrogenase possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 70-75%, 75% - 80%, 80-85%, 85°/j-90°/), 9O°/o-95°/o, ou uma identidade de sequência de 98% com qualquer proteína butanodiol desidrogenase das SEQ ID NOS: 13, 64 e 66 listadas na Tabela 2, podem ser expressas nas cepas da presente invenção.

25 As identidades são baseadas no método de alinhamento CIustal W usando os parâmetros preestabelecidos GAP PENALTY=1O, GAP LENGTH PENALTY=O,1; e matriz de peso proteico Gonnet 250 series.

Além disso, as sequências que codificam a butanodiol desidrogenase descritas na presente invenção ou aquelas recitadas no estado

F da técnica podem ser usadas para identificar outros homólogos na natureza.

Por exemplo, cada um dos fragmentos de ácidos nucleicos de codificação da ' butanodiol desidrogenase descrito na presente invenção pode ser usado para 5 isolar genes que codificam proteinas homólogas. O isolamento de genes homólogos usando protocolos dependentes de sequência é bem conhecido no estado da técnica, como descrito acima para os fragmentos de ácido nucleico que codifica a lactato desidrogenase.

A expressão da butanodiol desidrogenase é alcançada pela 10 transformação de céluías hospedeiras adequadas com uma sequência de codificação de uma proteína butanodiol desidrogenase. Normalmente, a sequência de codificação é parte de um gene quimérico utilizado para transformação, que inclui um promotor operacionalmente ligado à seqüência de codificação, bem como um sitio de ligação ao ribossomo e uma região de 15 controle de terminação. Um gene quimérico é heterólogo, mesmo que este inclua a sequência de codificação de uma butanodiol desidrogenase da célula hospedeira a ser transformada, se a sequência codificadora é combinada com sequências regulatórias que não são nativas ao gene natural que codifica a butanodiol desidrogenase.

20 Os códons podem ser otimizados para expressão com base na utilização preferencial de códon (codon usage) no hospedeiro selecionado, como é do conhecimento de um técnico hábil no assunto. Os vetores úteis para a transformação de uma grande variedade de células hospedeiras são comuns e descritos na literatura. Normalmente, o vetor contém um marcador 25 selecionável e sequências que permitem a replicação autônoma ou a integração cromossômica no hospedeiro desejado. Além disso, os vetores adequados podem incluir uma região promotora que abriga os controles de iniciação de transcrição e uma região de controle de término de transcrição,

b entre os quais um fragmento de DNA da região de codificação pode ser

Ô + inserido, para fornecer a expressão da região de codificação inserida. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos a célula ¶ hospedeira modificada, mas é preciso entender que tais regiões controladoras 5 também podem ser derivadas de genes que não são nativos da espécie especifica escolhida como hospedeira de produção.

As regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para conduzir a expressão de uma região de codificação da butanodiol desidrogenase na LAB são familiares para os técnicos qualificados no assunto.

10 Alguns exemplos incluem os promotores amy, apr e npg Promotor nisA (útil para a expressão ern bactérias Gram positivas (Eichenbaum et al Appl Environ Microbiol 64(8):2763-2769 (1998)), e o promotor sintético P11 (útil para a expressão em Lactobaci//us p/antarum, Rud et al. Microbio/ogy 152:1011-1019 (2006)).

15 Além disso, os promotores ldhL1 e fabZl do L p/antarum são úteis para a expressão de genes quiméricos em LAB. O promotor fabZl direciona a transcrição de um operon com o primeiro gene fabZl, codificando (3R)- hidroximiristoil [proteina transportadora acil] desidratase.

As regiões de controle de terminação também podem ser 20 derivadas de vários genes nativos para os hospedeiros preferidos, Opcionalmente, um sitio de terminação pode ser desnecessário, no entanto, é mais preferido, se presente.

Vetores úteis na LAB incluem vetores possuindo duas origens de replicação e dois marcadores selecionáveis que permitem a replicação e 25 seleção em ambas; Escherichia co/i e LAB. Um exemplo é o pFP996, cuja sequência é fornecida como SEQ ID NO: 35, que é útil em L. p/antarum e outras LAB. Muitos plasmídeos e vetores utilizados na transformação de Baci//us subti/ls e Streptococcus podem ser usados de modo geral para LAB.

Exemplos não Iimitantes de yetores adequados incluem pAMj31 e derivados » deste (Renault et al, Gene 183:175-182 (1996); e O'Sullivan et al, Gene 0 137:227-231 (1993)); pMBBI e pHW800, um derivado do pMBBI (Wyckoff et m al, Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996).); pMGl, um plasmídeo 5 conjugativo (Tanimoto et al, J. Bacteriol 184:5800-5804 (2002)): pNZ9520 (Kleerebezem et al, Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al, Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al. Antimicrob. Chemother Agents. 38:1899-1903 (1994)). Vários plasmídeos para Lactobaci//us p/antarum também foram descritos (por 10 exemplo, van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer RJ, de Vos WM, Siezen RJ, Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. Março de 2005; 71(3):1223- 1230).

Os vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira usando métodos conhecidos no estado da técnica, tal como a eletroporação 15 (Cruz-Rodz et al. Mo/ecu/ar Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990), Bringel, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990), Alegre et al., FEMS M/crobiology letters 241:73-77 (2004)), e conjugação (Shrago et al., Appl. Environ. Microbiol. 52:574-576 (1986)). Um gene do butanodiol desidrogenase quimérico também pode ser integrado no cromossomo da LAB 20 usando vetores de integraçâo (Hols et al, Appl- Environ- Microbiol- 60:1401- 1403 (1990), Jang et al., Micro. Lett. 24:191-195 (2003)).

ReduçÃo Da Atjvidade Da PjRUVATO-FORMaTO Liase Além das alterações descritas acima com relação a lactato desidrogenase e butanodiol desidrogenase nas células da presente invenção, 25 opcionalmente, essas células podem ainda ter pelo menos uma modificação que reduz a atividade da piruvato-formato liase endógena. A atividade da piruvato-formato liase converte o piruvato em formato. A atividade da piruvato- formato (iase na célula pode ser reduzida ou eliminada. A atividade é r 37 0 preferencialmente eliminada. b

W São necessários para a expressão da atividade piruvato-formato liase um gene que codifica a piruvato-formato liase (pfl) e um gene que codifica a enzima de ativação da piruvato-formato liase. Para reduzir a atividade da 5 piruvato-formato liase pode ser feita uma modificação em um ou ambos os genes citados. Pode haver um ou mais genes que codificam cada piruvato- formato Iiase e enzima de ativação da piruvato-formato liase em uma cepa especifica de LAB. Por exemplo, o Lactobaci//us p/antarum WCFSl contém dois genes pfl (pfl81: região codificadora SEQ ID NO: 69; proteína SEQ ID NO: 10 70; e pfl82: região codificadora SEQ ID NO: 71; proteína SEQ ID NO: 72) e dois genes de enzimas ativadoras de pfl (pfIA1: região codificadora SEQ ID NO: 73; proteína SEQ ID NO: 74: e pflA2: região codificadora SEQ ID NO: 75; proteína SEQ ID NO: 76), o Lactobaci//us p/antarum PN0512 contém apenas um gene pfl (pfl82) e um gene da enzima ativadora de pfl (pflA2). Em um 15 exemplo de realização, a expressão é reduzida para todos os genes que codificam pfl que estão ativos em uma célula hospedeira de produção sob as condições de produção desejadas e/ou em todos genes que codificam enzimas de ativadoras de pfl que atuam em uma célula hospedeira de produção sob as condições de produção desejadas.

20 Exemplos de genes pfl que podem ser modificados para reduzir a atividade da piruvato-formato liase são representados pelas regiões codificadoras SEQ ID NOs: 39, 41, 47 e 51. Outros genes alvos para a modificação incluem aqueles que codificam proteínas piruvato-formato liase com SEQ ID NOs: 40, 42, 48 e 52 e aqueles que codificam uma proteína com 25 cerca de pelo menos 80-85%, 85°/)-90°/), 90°/)-95°/), ou cerca de pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na sequência com uma dessas proteínas, que podem ser identificadas na literatura e por meio de abordagens usando a bioinformática, como é bem conhecido pelo técnico do assunto conforme descrito acima para as proteínas Iactato desidrogenases. Além disso, ¥ as sequências descritas na presente invenção ou aquelas recitadas no estado da técnica podem ser usadas para identificar outros homólogos na natureza e conforme descrito acima.

5 Exemplos de genes de enzimas ativadoras da pfl que podem ser modificados para red uzir a atividade da piruvato-formato Iiase são representados pelas regiões codificadoras SEQ ID NOS: 73, 75, 79 e 83.

Outros genes alvos para a modificação incluem aqueles que codificam proteínas enzimas ativadoras da piruvato-formato liase possuindo as SEQ ID 10 NOS: 74, 76, 80 e 84 e aqueles que codificam uma proteína com cerca de pelo menos 80-85°6, 85°/)90°/), 90°/j-95°/), ou cerca de pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade na sequência com uma dessas proteínas, que podem ser identificadas na literatura e por meio de abordagens usando a bioinformática, como é bem conhecido pelo técnico do assunto conforme descrito acima para 15 as proteinas lactato desidrogenases. Além disso, as sequências descritas na presente invenção ou aquelas recitadas no estado da técnica podem ser usadas para identificar outros homólogos na natureza conforme descrito acima.

Qualquer método de modificação genética conhecido por um técnico hábil no assunto para a redução da expressão de uma proteína pode ' 20 ser usado para alterar a atividade da piruvato-formato liase. Métodos para reduzir ou eliminar a expressão da piruvato-formato liase e/ou genes da enzima ativadora da piruvato-formato liase incluem, mas não estão limitados a, deleção do gene inteiro ou parte do gene, inserção de um fragmento de DNA no gene (seja no promotor ou na região de codificação) de modo que a proteína não 25 possa ser expressa ou tenha uma expressão reduzida, introdução de uma mutação em uma região codificadora que acrescenta um códon de parada ou uma mudança no quadro de leitura de tal forma que uma proteína funcional não é expressa, introdução de uma ou mais mutações em uma região codificadora

D para alterar os aminoácidos de modo que uma proteina não funcional ou > e enzimaticamente menos ativa seja expressa. Além disso, a expressão de um gene alvo pode ser bloqueada parcialmente ou substancialmente pela 0 expressão de um RNA antisense ou um RNA interferente, e construções que 5 resultam na cosupressão podem ser introduzidas.

BiossÍntese De Produto Em LAB Projetada Para Alto Fluxo De Piruvato Para 2,3-BUTANOD1OL O 2,3-butanodiol e qualquer produto que tenha 2,3-butanodiol como uma via intermediária pode ser produzido com maior eficácia (tal como 10 maior taxa, titulação, rendimento e/ou eficiência dos mesmos) em uma célula LAB divulgada na presente invenção possuindo alto fluxo de piruvato para 2,3- butanodiol. Tais produtos incluem, mas não estão Iimitados a, 2,3-butanodiol, 2-butanona e 2-butanol.

A via biossintética para a sÍntese de 2,3-butanodiol, 2-butanona e 15 2-butanol é divulgada na Publicação de Patente US 20070292927A1, que é incorporada ao presente pela referência. Um diagrama da via biossintética do 2,3-butanodiol, 2-butanona e 2-butanol é fornecida na Figura 1. O 2,3- butanodiol é o produto das três primeiras etapas, que são Iistadas abaixo- 2- butanona é o produto feito quando a última etapa ilustrada convertendo 2 20 butanona em 2-butanol é omitido. A produção de 2-butanona ou 2-butanol em uma cepa divulgada na presente invenção beneficia com o aumento da produção de 2,3-butanodiol. Conforme descrito na Publicação de Patente US 20070092957A1, as etapas na via biossintética do isobutanol incluem a conversão de: 25 - piruvato em acetolactato (vide Fig. 1 etapa a) catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase (ASL) conhecida pelo número EC 2.2,1.69; - acetolactato em acetoína (vide Fig. 6 etapa b) catalisada, por exemplo, pela acetolactato descarboxilase;

- acetoína em 2,3-butanodiol (vide Fig. 2 etapa 1) catalisada, por

W

F exemplo, pela butanodiol desidrogenase; - 2,3-butanodiol em 2-butanona (vide Fig. 2 etapa j) catalisada,

V por exemplo, pela diol desidratase ou glicerol desidratase; 5 - 2-butanona em 2-butanol (vide Fig. 2 etapa f) catalisada, por exemplo, pela butanol desidrogenase.

Os genes que podem ser utilizados para projetar a expressão dessas enzimas são descritos na Publicação de Patente US 20070292927A1.

Alternativamente, as enzimas endógenas nas LABs podem realizar algumas 10 etapas da via, tais como acetolactato sintase e acetolactato decarboxilase. A utilização da butanodiol desidratase nesta via da Roseburia inu/inivorans, RdhtA, (proteína SEQ ID NO: 16, região codificadora SEQ ID NO: 15) é divulgada na Publicação de Patente US 20090155870A1. Esta enzima é usada em conjunto com a butanodiol desidratase reativase da Roseburia 15 inu/inivorans, Rdht8, (proteina SEQ ID NO: 18, região codificadora SEQ ID NO: 17). Este butanodiol desidratase é desejada em muitos hospedeiros, pois não requer a coenzima B12.

Algumas enzimas ALS representativas que podem ser usadas incluem aquelas codificados pela a/sS de Baci//us e budB de K/ebsie//a (Gollop 20 et al., J. Bacteriol. 172(6):3444-3449 (1990): Holtzclaw et al., J. Bacteriol. 121 (3):917-922 (1975)). São fornecidas na presente invenção ALS de Baci//us subti/is (DNA: SEQ ID NO: 85; proteína: SEQ ID NO: 86), de K/ebsie//a pneumoniae (DNA: SEQ ID NO: 88; proteina: SEQ ID NO: 89), e de Lactococcus lactis (DNA: SEQ ID NO: 90: proteína: SEQ ID NO: 91). As 25 regiões codificadoras de Als e proteinas codificadas adicionais que podem ser utilizadas incluem as de Staphy/ococcus aureus (DNA: SEQ ID NO: 92; proteina: SEQ ID NO: 93), Listeria monocytogenes (DNA: SEQ ID NO: 94; proteína: SEQ ID NO: 95), Streptococcus mutans (DNA: SEQ ID NO: 96;

proteína: SEQ ID NO: 97), Streptococcus thermophi/us (DNA: SEQ ID NO: 98; à m proteína: SEQ ID NO: 99), Vibrio angustum (DNA: SEQ ID NO: 100, proteína: SEQ ID NO: 101), e Baci//us cereus (DNA: SEQ ID NO: 102, proteina: SEQ ID

W NO: 103). Qualquer gene A/s que codifica uma enzima acetolactato sintase 5 possuindo pelo menos cerca de 80-85%, 85°/0-90°/), 90°/)-95°/j, ou cerca de pelo menos 96%, 97% ou 98% de identidade na sequência com qualquer uma dentre as SEQ ID NOS: 86, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 ou 103 que converte piruvato em acetolactato pode ser utilizado. As identidades são baseadas no método de alinhamento Clustal W usando os parâmetros preestabelecidos 10 GAP PENALTY=1O, GAP LENGTH PENALTY=O,1; e matriz de peso proteico Gonnet 250 series.

Além disso, o pedido de Patente US 12/477942 fornece uma árvore filogenética descrevendo as acetolactato sintases que são os 100 vizinhos mais próximos da seqüência AlsS de B. subti/is, sendo que qualquer 15 um destes podem ser utilizados. Sequências a/s adicionais que podem ser utilizadas na presente invenção podem ser identificadas na literatura e em bancos de dados de bioinformática bem conhecidos pelos técnicos do assunto.

A identificação das sequências de codificação e/oü de proteinas usando a bioinformática é normalmente realizada por meio da busca de bases de dados 20 disponiveis publicamente BLAST (descrita acima) com as sequências codificadoras de Als conhecidas ou sequências de aminoácidos codificados, tais como as fornecidas no presente documento. As identidades são baseadas no método de alinhamento Clustal W conforme especificado acima. Além disso, as sequências listadas no presente ou aquelas recitadas no estado da técnica 25 podem ser usadas para identificar outros homólogos na natureza conforme descrito acima. É útil para a última etapa de conversão de 2 butanona em 2- butanol uma nova butanol desidrogenase isolada a partir de um ambiente isolado de uma bactéria identificada como Achromobacter xy/osoxidans que é » divulgada no Pedido de Patente Norte-Americano US 12/430356 (DNA: SEQ ID r NO: 9, proteína SEQ ID NO: 10).

W Os genes quiméricos que incluem as regiões que codificam 5 enzimas da via, ou uma porção desejada da via, podem ser construídos e utilizados em vetores confornie descrito acima para a butanodiol desidrogenase, e conforme divulgado na Patente US 20070292927A1, para desenvolver células produtoras de 2,3-butanodiol, 2-butanona ou 2-butanol.

Cultivo Para Produção 10 As células LAB recombinantes divulgadas na presente invenção podem ser utilizadas para a produção de fermentação de 2,3-butanodiol, 2- butanol e 2-butanona. As células recombinantes são cultivadas em meios de fermentação que contém substratos de carbono apropriados. Substratos de carbono apropriados podem incluir, mas não estão limitados a; 15 monossacarídeos corno a glicose e a frutose, oligossacarideos como a lactose ou sacarose, polissacarídeos, como amido ou celulose ou misturas destes e misturas impuras de matérias-primas renováveis, tais como permeado do soro de queijo, água de maceração de milho, melaço de beterraba, e malte da cevada.

20 Embora seja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e suas misturas sejam adequados para a presente invenção, os substratos de carbono preferenciais são a glicose, frutose e sacarose ou misturas de monossacarídeos incluindo açúcares C5 como a xilose e arabinose. A sacarose pode ser derivada de fontes renováveis, como 25 cana-de-açúcar, beterraba, mandioca, sorgo doce, e misturas destes. A glicose e dextrose pode ser derivada de fontes de grãos renováveis da sacarificação de matérias-primas à base de amido, incluindo grãos como o milho, trigo, centeio, cevada, aveia e misturas destes. Além disso, os açúcares fermentáveis podem ser derivados a partir de fontes renováveis de biomassa 0

O celulósica ou |jgnoceIu|ósica por meio de processos de pré-tratamento e sacarificação, como descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Publicado US " 2007/0031918A1 que é incorporado ao presente pela referência. A biomassa 5 se refere a qualquer material celulósico ou |ignoce|u|ósico e inclui materiais compreendendo celulose, hemicelulose e, opcionalmente, compreendendo ainda, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos, A biomassa pode também incluir componentes adicionais, tais como proteínas e/ou lipidios.

A biomassa pode ser derivada de uma fonte única, ou a biomassa pode 10 compreender uma mistura de derivados de mais de uma fonte, por exemplo, a biomassa pode compreender uma mistura de sabugo de milho e palha de milho, ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa inclui, mas não é limitada a, bioenergia, residuos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, residuos verdes, madeira e resíduos 15 florestais. Exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a, grão de milho, sabugo de milho, reslduos de colheitas, como a casca de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramínea (Panicum virgatum), residuos de papel, bagaço de cana-de- açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos a partir de moagem de grãos, 20 árvores, galhos, raízes, folhas, lascas de madeira, serragem e arbustos, vegetais, frutas, flores, esterco animal, e misturas destes.

Além de uma fonte de carbono adequada, os meios de fermentação devem conter minerais, sais, cofatores, tampões e outros componentes apropriados, conhecidos pelos técnieos hábeis no assunto, 25 adequados para o crescimento das culturas e a promoção da via enzimática necessária para a produção de 2,3-butanodiol, 2-butanol e 2-butanona.

Normalmente, as células são cultivadas a uma temperatura na faixa de cerca de 25 °C até cerca de 40 °C em um meio apropriado. Os meios de cultura adequados são meios comuns comercialmente preparados como o caldo ou + ágar Bacto Lactobacilli (Difco), caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouroud » Dextrose (SD) ou caldo Meio de levedura (YM). Outros meio de cultura - definidos ou sintéticos também podem ser usados, e o meio adequado para o 5 crescimento da cepa bacteriana especifica será do conhecimento de um técnico no assunto da ciência da microbiologia ou fermentação. O uso de agentes que modula a repressão catabólica, de maneira direta ou indireta, por exemplo, a adenosina ciclica 2':3'-monofosfato, também pode ser incorporado ao meio de fermentação.

10 lntervalos de pH apropriados para a fermentação estão entre pH 5,0 e pH 9,0, onde o pH 6,0 até pH 8,0 é preferido como condição inicial.

A fermentação pode ser realizada em condições aeróbias ou anaeróbias, de modo que as condições anaeróbicas ou microaeróbia são as condições preferidas.

15 O 2,3-butanediol, 2-butanol ou 2-butanona pode ser produzido usando um método de fermentação descontinuo (em batelada ou "batch"). Uma fermentação clássica em batelada é um sistema fechado onde a composição do meio é estabelecia no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Uma variação no sistema em batelada padrão 20 é o sistema descontlnuo alimentado (ou sistema batelada-alimentado — "Fed- batch"). Os processos de fermentação descontínuo alimentado são aplicáveis também na presente invenção e compreendem um sistema em batelada "batch" típico, com a exceção de que o substrato é adicionado em incrementos enquanto a fermentação progride. Os sistemas descontínuos alimentados são 25 úteis quando a repressão catabólica é capaz de inibir o metabolismo das células e onde é desejável dispor de uma quantidade limitada de substrato no meio. As fermentações descontínuas (Batch) e descontínuas alimentadas (Fed- Batch) são comuns e bem conhecidas no estado da técnica e exemplos podem ser encontrados em Thomas D. Brock em Biotechno/ogy: A Textbook of

F > /ndustria/ Microbio/ogy, Segunda Edição, (1989), Sinauer Associates, lnc., Sunderland, MA, ou em Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol.,

W 36:227, (1992), incorporados ao presente pela referência.

5 O 2,3-butanediol, 2-butanol ou 2-butanona também pode ser produzido usando métodos de fermentação contínua. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é acrescentado continuamente a um reator e uma quantidade igual de meio condicionado é removido ao mesmo tempo para o processamento. A fermentação contínua, 10 geralmente mantém as culturas com uma densidade elevada e constante, em que as células estão essencialmente na fase de crescimento Iog. A fermentação contínua possibilita a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Os métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para os processos de 15 fermentação contínua, bem como as técnicas para maximizar a taxa de formação do produto são bem conhecidos no estado da técnica da microbiologia industrial e uma variedade de métodos são detalhados por Brock, supra.

Contempla-se que a produção de 2,3-butanodiol, 2-butanol ou 2- butanona possa ser praticada usando os processos descontlnuo (Batch), 20 descontinuo alimentado (Fed-Batch), ou contínuo, e que qualquer modalidade conhecida de fermentação seria adequada. Adicionalmente, é contemplado que as células podem ser imobilizadas em um substrato, como catalisadores de células inteiras e submetidas a condições de fermentação para a produção de 2,3-butanodiol, 2-butanol ou 2-butanona.

25 MÉtodos Para O Isolamento De 2,3-BUTANoDjoL, 2-butanol ou 2-butanona A Partir Do Meio De FermentaçÃo O 2,3-butanodiol, 2-butanol ou 2-butanona bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação usando métodos conhecidos no estado da técnica para fermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. « Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot et al. Process. Biochem 27:61-75 (1992),

X e as referências citadas). Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do . meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação, ou algum 5 método similar. Em seguida, o 2,3-butanodiol, 2-butanol ou 2-butanona pode ser isolado do meio de fermentação utilizando métodos como a destilação, destilação azeotrópica, extração líquido-liquido, adsorção, evaporação gasosa, evaporação em membrana ou pervaporação.

Exemplos 10 A presente invenção é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos. Deve ser cornpreendido que estes exemplos, embora indicando realizações preferidas da presente invenção, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um técnico hábil no assunto pode determinar as características essenciais da presente invenção, e 15 sem se afastar do espírito e do escopo da presente invenção, pode fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la aos diversos usos e condições.

O significado das abreviações utilizadas são as seguintes: "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "segundo" significa segundo(s), "µ1" 20 sign ifica microlitro(s), "ml" significa mililitro(s), "L" significa litro(s), "nm" significa nanômetros(s), "mm" significa milímetro(s), "cm" significa centímetro(s), "µm" significa micrômetro(s), "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimole(s), "µmol" significa micromole(s), "g" significa grama(s)", "µg" significa micrograma(s), "mg" significa miligrama(s), "rpm" significa rotações por 25 minuto, "p/v" significa peso/volume, "OD" significa densidade óptica, e "OD600" significa densidade óptica medida no comprimento de onda de 600 nm.

MÉtodos Gerais As técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular padrões utilizadas nos Exemplos são bem conhecidas no estado da técnica e & são descritas por Sambrook, J,, Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: ^ A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory Press: Cold - Spring Harbor, NY 1989; por Silhavy, T. j., Bennan, M. L. e Enquist, L. W.

5 Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY 1984: e por Ausubel, F. M. et al., Em: Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Pub/ishin,q and Wi/ey-/nterscience,

1987. Métodos complementares utilizados nos exemplos são descritos nos manuais, incluindo "Advanced Bacterial Genetics" (Davis, Roth e Botstein, Co/d 10 Spring Harbor Laboratory, 1980), "Experiments with Gene Fusions" (Silhavy, Berman e Enquist, Co/d Spring Harbor Laboratory, 1984), "Experiments in Molecular Genetics" (Miller, Co/d Spring Harbor Laboratoiy, 1972) "Experimental Techniques in Bacterial Genetics" (Maloy, Em: Jones e Bartlett, 1990), e "A Short Course in Bacterial Genetics" (Miller, Co/d Spring Harbor 15 Laboratory 1992). Exemplo 1 Construção Do Lactobac/llus PLANTARUM PN0512 ALDHDLj/DHL1 Cepa PNPOOOl o objetivo deste exemplo é descrever a construção de uma cepa 20 de Lactobaci/lus p/antarum PN0512 que apresenta a deleção dos dois genes que codificam as principais lactato desidrogenases. O principal produto final da fermentação no Lactobacil/us p/antarum é o ácido láctico. O piruvato é convertido em lactato pela ação de duas lactato desidrogenases codificadas pelos genes ldhD e /dhL1. A deleção dupla de ldhD e /dhL1 foi feita no 25 Lactobaci//us plantarum cepa PN0512 (ATCC # PTA-7727). Os genes nocautes foram construídos pelo uso de um procedimento baseado na recombinação homóloga em duas etapas para produzir uma deleção não marcada (Ferain et al., 1994, J. Bact. 176:596). O procedimento utilizou um vetor transportador, pFP996 (SEQ ID NO: 35). O ^ . pFP996 é um vetor transportador para bactérias gram-positivas. Ele pode se replicar tanto em E. co/i como em bactérias gram-postivas. Ele contém as e origens de replicação do pBR322 (nucleotídeos #2628 a 5323) e pE194 5 (nucleotídeos #43 a 2627). O pE194 é um plasmídeo pequeno isolado originalmente a partir de uma bactéria gram-positiva, Staphy/ococcus aureus (Horinouchi e Weisblum J. Bacteriol. (1982) 150(2):804-814). No pFP996, os sitios de clonagem múltipla (nucleotídeos # 1 a 50) contêm sÍtios de restrição para ECoRI, Bglll, Xhol, Smal, Clal, Kpnl e Hindlll. Existem dois marcadores de 10 resistência antibiótica, um é para a resistência à ampicilina e o outro para a resistência à eritromicina. Para os propósitos de seleção, a ampicilina foi utilizada para transformação em E. co/i e a eritromicina foi usada para seleção no L p/antarum.

Dois segmentos de DNA contendo cada uma de 900 a 1200 pb de 15 sequências tanto a montante quanto a jusante da deleção pretendida, foram cIonados no piasmídeo para fornecer as regiões de homologia para os dois cruzamentos genéticos. As células foram cultivadas por um número aumentado de gerações (30-50) para permitir que ocorressem os eventos de cruzamento. O primeiro cruzamento (cruzamento único) integrou o plasmídeo no 20 cromossomo por recombinação homóloga através de uma das duas regiões de homologia no plasmideo. O segundo evento de cruzamento (cruzamento duplo) resultou tanto na sequência de tipo selvagem como na deleção do gene pretendido. Um cruzamento entre as sequências que levou ao evento de integração inicial renderia a sequência tipo selvagem, enquanto que um 25 cruzamento entre as outras reg iões de homologia renderia a deleção pretendida. O segundo evento de cruzamento foi selecionado pela sensibilidade aos antibióticos. Os eventos de cruzamento únicos ou duplos foram analisados por PCR e sequenciamento de DNA.

Todas as enzimas de restrição e de modificação de DNA e a

B & mistura para PCR "Phusion High-Fidelity PCR Master Mix" foram adquiridas da NEB lnc. (lpswich, MA). As misturas para PCR "PCR Supermix" e "P/atinum " PCR Supermix High Fide/ity" foram adquiridas da lnvitrogen Corp (Carlsbad, 5 CA). Os fragmentos de DNA foram purificados em gel utilizando o kit de recuperação "Zymoc/ean'" Gel DNA Recovery Kit" (Zymo Research Corp, Orange, CA) ou o kit de purificação "Qiaquick PCR Purification Kit" (Qiagen lnc., Valencia, CA). O DNA plasmidial foi preparado com o kit "Q/Aprep Spin M/niprep Kit" (Qiagen lnc., Valencia, CA). Os olionucleotídeos foram 10 sintetizados pela Sigma-Genosys (Woodlands, TX) ou lnvitrogen Corp (Carlsbad, CA). O DNA genômico da L. p/antarum PN0512 foi preparado com o kit de purificação de DNA "MasterPure DNA Purification Kit" (Epicentre, Madison, CT).

O Lactobaci//us p/antarum PN0512 foi transformado pelo seguinte 15 procedimento: 5 ml de meio MRS para Lactobacilos (Accumedia, Neogen Corporation, Lansing, Ml) contendo 1°/0 de glicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi inoculado com as células PN0512 e cultivado durante a noite a 30 °C. 100 ml de meio MRS com 1°/0 de glicina foi inoculado com a cultura durante a noite a uma OD600 de 0,1 e cultivado até uma OD600 de 0,7 a 30 °C. As células 20 foram coletadas por centrifugação a 370Oxg por 8 min a 4 °C, lavadas com 100 ml de MgC]2 1 mM frio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), centrifugadas a 3700 x g ' por 8 min a 4 °C, lavadas com 100 ml de PEG-1OOO a 3Ó°/o frio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), recentrifugadas a 3700 x g por 20 min a 4 °C, e então ressuspensas em 1 ml de PEG-1OOO a 30% frio. 60 µ1 de células foram 25 misturadas com - 100 ng de DNA plasmdial em uma cubeta de eletroporação resfriada de 1 milimetro de lacuna e foram eletroporadas em um eletroporador "Gene 81oRad Pu/ser" (Hercules, CA) de 1,7 kV, 25 µF, e 400 Q. As células foram ressuspenssas em 1 ml de meio MRS contendo 500 mM de sacarose

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e MgC|2 100 mM, incubadas a 30 °C por 2 horas

O 0 e, em seguida semeadas em pIacas contendo meio MRS 2 µg/ml de eritromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)k, e então colocadas em uma caixa

Q contendo um sachê para deixar o ambiente anaeróbio "Pack-Anaero sachet" 5 (Mitsubishi Gas Chemical Co., Tóquio, Japão) e incubadas a 30 °C. A/dhD A cassete nocaute para deleção do gene ldhD foi criado por meio da amplificação do DNA genômico da PN0512 em uma região de flanqueamento a montante com primers Top D Fl (SEQ ID NO: 39) que contém 10 um sÍtio ECORI e Top D Rl (SEQ ID NO: 40). A região de homologia a jusante incluindo parte da sequência de codificação do ldhD foi amplificada com os primers Bot D F2 (SEQ ID NO: 41) e Bot D R2 (SEQ ID NO: 42) que contém um sÍtio Xhol. As duas regiões de homologia foram unidas por PCR SOE da seguinte forma: Os produtos da PCR de 0,9 kpb a montante e a jusante foram 15 purificados em gel. Os produtos de PCR foram misturados em quantidades iguais em uma reação de PCR e reamplificados com os primers Top D Fl e Bot D R2. O produto final da PCR de 1,8 kpb foi purificado em gel e clonado TOPO em pCR4BIuntll-TOPO (lnvitrogen) para criar o vetor pCRBluntlL:ldhD. Para criar o vetor de integração carregando a deleção interna do gene ldhD, o 20 pFP996 foi digerido com EcoRI e Xhol e o fragmento de 5311 pb foi purificado em gel. O vector pCRBlunth::ldhD foi digerido com EcoRI e Xhol e o fragmento de 1,8 kpb foi purificado em gel. A cassete e vetor nocaute de ldhD foram ligados utilizando uma T4 DNA ligase, resultando no vetor pFP996::ldhD ko.

Células de Lactobaci//us p/antarum PN0512 eletrocompetentes 25 foram preparadas, transformadas com pFP996::ldhD ko, e semeadas em meio MRS contendo 1 µg/ml de eritromicina. Para a obtenção do evento de cruzamento único (SCO), os transformantes foram passados por cerca de 50 gerações em meio MRS, a 37 °C. Após o crescimento, aliquotas foram semeadas em colônias únicas em meio MRS contendo 1 µg/ml de eritromicina. « As colônias resistentes à eritromicina foram examinadas pela amplificação por b PCR com oligonucleotÍdeos ldhD Seq Fl (SEQ ID NO: 43) e D check R (SEQ

B ID NO: 44) para distinguir entre o tipo selvagem e clones carregando o evento 5 sco. Para a obtenção de clones com um cruzamento duplo, as cepas sco foram passadas por cerca de 30 gerações em meio MRS, com 20 mM de D,L-lactato (Sigma, St. Louis, MO) a 37 °C e, em seguida, semeados em colônias únicas em meio CRM com lactato. As coIônias foram escolhidas e corrigidos em meio MRS com lactato e MRS com lactato contendo 1 µg/ml de eritromicina para 10 encontrar colônias sensiveis à eritromicina. As colônias sensiveis foram selecionadas por amplificação de PCR usando o primer D check R (SEQ ID NO: 44) e D check F3 (SEQ ID NO: 45). As colônias tipo selvagens resultaram em um produto de 3,2 kpb e os cIones de deleção, denominados de PN0512A/dhD, deram um produto da PCR de 2,3 kpb.

15 A/dhDA/dhL1 A deleção do gene /dhL1 foi feita na cepa de base genética PN0512L1/dhD, a f'im de fazer uma cepa de dupla deleção Lj/dhL1L1ldhD. a cassete nocaute para a deieção do gene /dhL1 foi amplificado a partir do DNA genômico da PN0512. O braço homólogo esquerdo /dhL1 foi amplificado com 20 os primers oBP31 (SEQ ID NO: 46) que contém um sítio de restrição Bglll e OBP32 (SEQ ID NO: 47) que contém um sÍtio de restrição Xhol. O braço homólogo direito de /dhL1 foi amplificado com os primers oBP33 (SEQ ID NO: 48) que contém um sÍtio de restrição Xhol e OBP34 (SEQ ID NO: 47) que contém um sÍtio de restrição Xmal. O braço homólogo esquerdo do /dhL1 foi 25 clonado nos sÍtios Bglll/Xhol e o braço homólogo direito ldhL1 foi clonado nos sítios Xhol/Xmal do pFP996pyrFAerm, um derivado do pFP996. O pFP996pyrFAerm contém a sequência pyrF (SEQ ID NO: 7) que codifica uma orotidina-5'-fosfato descarboxilase do Lactobaci//us p/antarum PN0512 em lugar da região de codificação da eritromicina no pFP996. O gene pyrF de origem & 0 plasmidial, em conjugação com o produto químico ácido 5-fluororótico em uma cepa ApyrF, pode ser usado como um método de contra-seleção eficaz a fim " de isolar o segundo cruzamento homólogo. O fragmento Xmal contido no braço 5 homologo de /dhL1 foi isolado após a digestão com Xmal e clonado no sÍtio de restrição Xmal do pFP996, produzindo uma região homologa esquerda de 900 pb e uma região homóloga direita de 1200 pb, resultando no vetor pFP996- ldhL l-arms.

O PN0512NdhD foi transformado com pFP996-ldhL1-arms e 10 cultivado a 30 °C em meio de iactobacilo MRS com lactato (20 mM) e eritromicina (1 µg/ml) durante cerca de 10 gerações. Os transformantes foram então cultivados sob condições não seletivas a 37 °C por aproximadamente 50 gerações por inoculação seriada em MRS + lactato antes das culturas serem semeadas em MRS contendo lactato e eritromicina (1 µg/ml). Os isolados 15 foram selecionados por PCR de colônia para um cruzamento único com o primer cromossômico específico OBP49 (SEQ ID NO: 53) e primer plasmídeo especifico oBP42 (SEQ ID NO: 54). lntegrantes com cruzamentos únicos foram cultivados a 37 °C por aproximadamente 40 gerações por inoculação seriada sob condições não seletivas em MRS com lactato antes das culturas serem 20 semeadas em meio MRS com lactato. Os isolados foram corrigidos em pIacas MRS com lactato, cultivadas a 37 °C e, em seguida, corrigidas em placas com MRS com lactato e eritromicina (1 µg/ml). Os isolados sensíveis a eritromicina foram selecionados por PCR de colônia para detectar a presença de um tipo selvagem ou segundo cruzamento de deleção usando primers específicos 25 OBP49 (SEQ ID NO: 53) e OBP56 (SEQ ID NO: 55). Uma sequência do tipo selvagem rendeu um produto de 3505 pb e uma sequência de deleçao rendeu um produto de 2545 pb. As deleções foram confirmadas pelo sequenciamento do produto da PCR enquanto a ausência de plasmideo foi testada por PCR de colônia usando primers OBP42 (SEQ ID NO: 54) e OBP57 (SEQ ID NO: 58).

G

W O Lactobaci//us p/antarum PN0512 cepa de dupla deleção /dhD/dhL1 foi designado PNPOOOl. A deleção de NdhD incluíu 83 pb a 0 montante do local do códon de iniciação do ldhD até o aminoácido 279 de 332.

5 A deleção de NdhL1 incluiu do fMet até o aminoácido final. Exemplo 2 AnÁlise Do Produto De Uma Cepa De Lactobac/llus plantarum Em QUE Foram Deletadas As Duas Lactato Desidrogenases, LDHD e LDHL1 o objetivo deste exemplo é demonstrar os produtos produzidos 10 pelo Lactobaci//us plantarum PN0512 cepa com dupla deleção /dhD/dhL1 em comparação com a cepa do tipo selvagem. As cepas PN0512 (tipo selvagem) e PNPOOOl (A/dhDA/dhL1) foram cultivadas em meio rico, meio de lactobacilos MRS (Accumedia, Neogen Corporation, Lansing, Ml), a 30 °C , sem agitação em condições anaeróbias em 15 câmara de anaerobiose (Coy Laboratories lnc., Grass Lake), Ambas as culturas foram cultivadas a uma OD600 semelhante de aproximadamente 8,5. A PNPOOOl cresceu a uma taxa que foi de aproximadamente 2,5 vezes mais lenta do que a cepa PN0512 do tipo selvagem- A fim de alcançar um OD600 semelhante, a cepa PN0512 foi cultivada por 16 horas e a cepa PNPOOOl foi 20 cultivada por 41 horas, As culturas foram centrifugadas a 3700 x g por 10 minutos a 4 °C e os sobrenadantes da cultura foram filtrados através de um filtro de 0,2 µm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Ml). Os sobrenadantes filtrados foram analisados por HPLC com uma coluna Shodex SUGAR SH1O11 (Showa Denko K.K., Kawasaki, Japão) e foi realizada a detecção do índice de refração 25 para os níveis de glicose, citrato, acetato, lactato, acetoína, etanol, succinato e formato. Os resultados na Figura 2 exibem o consumo dos constituintes do meio e os produtos que foram formados, 71°/o dos 114 mM de glicose foram consumidos na cultura PN0512 e 158 mM de ácido láctico foram produzidos.

W e Não foram detectadas quantidades significativas de outros produtos. 99% da glicose, assim como 100 °/0 dos 12 mM de citrato e 76 °/) dos 70 mM de acetato 0 foram consumidos na cultura PNPOOO1, A PNPOOOl produziu apenas 1 mM de 5 lactato. Em vez disso, os principais produtos foram acetoína (102 mM) e etanol (93 mM), juntamente com succinato (28 mM) e formato (31 mM). Estes dados demonstram que as deleções A/dhD e NdhL1 eliminaram de maneira eficaz a maior produção de ácido láctico e levou a um perfil de produto de fermentação misto.

10 Exemplo 3 Construção De PlasmÍdeos Para A Produção De MESO-2,3-BUTANODlOL o objetivo deste exemplo é descrever a construção de um plasmideo para a expressão de uma butanodiol desidrogenase heteróloga. A região promotora de /dhL1 (SEQ ID NO: 8) da L. p/antarum PN0512 foi 15 amplificada com os primers AA135 (SEQ ID NO: 61) , contendo sÍtios ECoRI, Spel e Aflll; e AA136 (SEQ ID NO: 62), contendo um sÍtio Xhol, a partir do DNA genômico da PN0512 utilizando a mistura para PCR "Phusion High-Fide//ty PCR Master M/x". O fragmento de PCR resultante e o pFP996 foram ligados após a digestão com ECORI e Xhol para criar o vetore pFP996PldhL1 (SEQ ID 20 NO: 36)- Uma álcool desidrogenase secundária codificada pelo gene sadB de Achromobacterxy/osoxidans (região codificadora SEQ ID NO: 9 e proteína SEQ ID NO: 10) foi divuígada no Pedido de Patente US 12/430356. A região decodificação SadB foi amplificada com os primers OPB112 (SEQ ID NO: 50), 25 contendo os sÍtios Xhol, Nhel e ecorv junto com um local de ligação de ribossomos (SEQ ID NO: 51), e oBP1i3 (SEQ ID NO: 52), contendo um sÍtio Kpnl , a partir do vetor pRS426::FBA-budC+GPM-sadB utilizando a mistura para PCR "Phusion High-Fide/ity PCR Master Mix". O pRS426 é um vetor transportador para levedura (American Type Cu/ture Co//ection, Rockville, MD), & . que contêm uma origem de replicação da E. co/i (por exemplo, pMBI), uma origem de replicação de levedura 2µ, e um marcador Ura3 para a seleção nutricional. O pRS426::FBA-budC+GPM-sadB contém o promotor FBA (SEQ ID 5 NO: 11) a partir do gene frutose 1,6-bifosfato aldolase da S. cerevisiae operacionalmente ligado à região que codifica budC para a butanodiol desidrogenase da K/ebsie/la pneumonia (região codificadora SEQ ID NO: 12).

Além disso, ele possui o promotor GPMl de levedura (SEQ ID NO: 14) operacionalmente ligado à região de codificação sadl3 do Achromobacter 10 xy/osoxidans (SEQ ID NO: 9). A construção do pRS426::FBA-budC+GPM-sadB é descrita no Exemplo 3 do Pedido de Patente 12/477942, que é incorporado ao presente pela referência.

O fragmento de PCR da região codificadora de sadB e o 15 pFP996PldhL1 foram ligados após a digestão com Xhol e Kpnl para criar o vetor pFP996PldhL1-sadB. A região codificadora budC da K/ebsie//a pneumoniae para butanodiol desidrogenase foi amplificada com os primers OPB114 (SEQ ID NO: 56), contendo um sítio Nhel e um sÍtio de ligação de ribossomo, e oBP115 (SEQ ID NO: 57), contendo um sítio ECORV, a partir do 20 vetor pRS426::FBA-budC+GPM-sadB utilizando a mistura para PCR "Phusion High-Fidelity PCR Master Mix". O fragmento de PCR resultante e o pFP996PldhL1-sadB foram ligados após a digestão com Nehl e EcoRI para criar o vetor pFP996PldhL1-budC-sad8 (SEQ ID NO: 37). O gene sad8 no vetor pFP996PldhL1-budC-sadB foi deletado para criar o vetore 25 pFP996PldhL1-budC (SEQ ID NO: 38). O vetor pFP996PldhL1-budC-sadB foi digerido com EcoRV e Hindlll , o sitio Hindll foi preenchido com T4 DNAP, e , em seguida o pIasmideo foi ligado novamente. Os candidatos foram selecionados por PCR de colônia com primers oBP42 (SEQ ID NO: 54) e

OBP57 (SEQ ID NO: 58) para plasmldeos que não continham o gene sadB e, » em seguida, sequenciados.

Exemplo 4 Produçâo De MESO-2,3-BUTANODlOL Usando Uma Cepa Recombinante De 5 Lactobac/llus plantarum Cultivadas EM MEIO RICO o objetivo deste exemplo é demonstrar a produção de meso-2,3- butanodiol usando uma cepa de Lactobaci//us p/antarum recombinante contendo uma via projetada em meio rico. Especificamente, uma cepa de Lactobaci//us p/antarum em que foram deletadas as duas lactato 10 desidrogenases endógenas, LdhD e LdhL1 , e que contém um pIasmídeo, pFP996PldhL1-budC-sadB, expressando a região de codificação budC da K/ebsie//a pneumoniae para butanodiol desidrogenase foi cultivada em meio MRS. As duas primeiras enzimas para a via do butanodiol, acetolactato sintase e acetolactato decarboxilase, foram fornecidas pela expressão nativa a partir 15 do cromossomo. O sadl3 codifica uma butanol desidrogenase que, na presença de 2-butanona irá fornecer um reservatório de elétron que poderia ser necessário para balancear os equivalentes redox para a produção de 2,3- butanodiol.

Os Lactobaci//us p/antarum cepas PN0512 tipo selvagem e 20 PNPOOOl foram transformados com plasrnideo pFP996PldhL1-budC-sadB. As cepas foram transformadas como no exemplo 1, exceto que a glicina foi omitida do meio para a cepa PNPOOO1. A cepa PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC-sadB resultante foi denominada PNPO002 e a cepa PN0512/pFP996-budC-sadB denominada BP134. As cepas foram cultivadas em meio MRS, com 0,5% de 2- 25 butanona, As cepas contendo plasmidios foram cultivadas em meio contendo também 2 µg/ml de eritromicina.

145 ml de meio foi inoculado com as cepas PNPOOOl, PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC-sadB (PNPO002), ou PN0512/pFP996PldhL1-

budC-sadB (BP134), a partir de cultivos durante a noite em uma diluição de 0

P 1:145 em frascos soro selados de 175 ml, As culturas foram cultivadas a 30 °C por 24 horas sem agitação. A cepa BP134 atingiu uma OD600 de 6,5, a cepa 0 PNPOOOl uma OD600 de 8,1, e a cepa PNPO002 uma OD600 de 6,2. As culturas 5 foram iniciadas com um inóculo maior, por isso houve uma menor latência e menos duplicações chegaram à saturação, de modo a reduzir a diferença de crescimento que foi observada no Exemplo 2. As amostras de culturas foram centrifugadas a 3700 x g por 10 minutos a 4 °C e os sobrenadantes da cultura foram filtrados através de liit) filtro de 0,2 µm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, 10 Ml). Os sobrenadantes filtrados foram analisados por HPLC com uma coluna Shodex SUGAR SH1O11 (Showa Denko K.K., Kawasaki, Japão) e foi realizada a detecção do índice de refração para os níveis de glicose, citrato, acetato, lactato, acetoína, meso-2,3-butanodiol, etanol, succinato e formato.

Os resultados na Figura 3 exibem o consumo dos constituintes do 15 meio e os produtos que foram formados. A cepa BP134 consumiu 84% da glicose, 64°/o do citrato, e não consumiu acetato. Esta cepa produziu, similar à cepa tipo selvagem sem o pIasmídeo, quase que totalmente o ácido láctico, 172 mM. A cepa PNPOOOl consumiu 91% da glicose, 100% do citrato, e 82% de acetato. Assim como no Exemplo 2, os principais produtos da cepa 20 PNPOOOl foram acetoína (86 mM) e etanol (73 mM), juntamente com succinato (21 mM) e formato (8 mM). A cepa PNPO002 consumiu 92% da glicose, 100% do citrato, e 53% de acetato. Em contraste com a cepa PNPOOO1, não foi detectada acetoina na cepa PNPO002. Em vez disso, o principal produto foi . meso-2,3-butanodiol (78 mM), juntamente com etanol (54 mM), succinato (19 25 mM) e formato (7 mM). O meso-2,3-butanodiol respondeu por 49 Mol °/0 dos produtos avaliados. Estes dados mostram que com a presença do plasmideo expressando budC heterólogo na cepa de dupla deleção de ldh, a acetoína foi convertida em meso-2,3-butanodiol quando as células foram cultivadas em meio rico . O título de meso-2,3-butanodiol foi de 7,0 g/L , com um rendimento h k de 0,41 g/g de glicose consumida.

Exemplo 5 e Produção De MESO-2,3-BUTANODlOL Usando Uma Cepa Recombinante De 5 Lactobac/llus plantarum Contendo O Vetor PFP996PLDHL1-BUDC-SADB Cultivadas Em Meio SintÉtico Com Glicose ou Sacarose o objetivo deste exemplo é demonstrar a produção de meso-2,3- butanodiol usando uma cepa de Lactobacillus plantarum recombinante contendo uma via projetada em meio sintético. Especificamente, uma cepa de 10 Lactobacillus plantarum em que forarn deletadas as duas lactato desidrogenases endógenas, LdhO e LdhL1 , contendo ainda um plasmídeo, pFP996PldhL1-budC-sadB, expressando a região de codificação budC da Klebsiella pneumoniae para butanodiol desidrogenase foi cultivada em meio sintético com glicose ou sacarose. As duas primeiras enzimas para a via do 15 butanodiol, acetolactato sintase e acetolactato decarboxilase, foram fornecidas pela expressão nativa a partir do cromossomo.

A cepa PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC-sadB (PNPO002) foi cultivada em meio sintético com 20 mM de glicose ou sacarose e 2 µg/ml de eritromicina. O meio sintético consistia de: Sulfato de amônio 10 mM, MES pH6 20 100 mM, fosfato de potássio pH 6 5 mM, 1°/, de mistura de metais SlO, glicose ou sacarose 20 mM, 0,5 °/) de extrato de levedura, 0,01 °/0 de ácidos casamino e citrato de amônio 10 mM. 100 °/0 de mistura de metais SlO é constituido por Mgc|2 200 mM, CaCl, 70 mM, MnCl, 5 mM, FeCl,, 100 µM, ZnC|2 100 µM, CuSO4 172 µM, CoCl, 253 µM, NaMoO, 242 µM e cloridrato de tiamina 200 25 µM. Todos os constituintes do meio foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St.

Louis , MO). 25 ml do meio foi inoculado com PNPO002 e cultivado a 30 °C durante a noite sem agitação em uma caixa contendo um sachê de anaerobiose "Pack-Anaero sachet" (Mitsubishi Gas Chemical Co., Tóquio,

japão) a uma OD600 de 0,72 (glicose) ou 0,88 (sacarose), As culturas foram .b b centrifugadas por 5 minutos a 5k RPM e então ressuspendidas em meio fresco a uma diluição final de 1:10. 25 ml da cultura foi cultivado em uma caixa b anaeróbica contendo um sachê de anaerobiose "Pack-Anaero sachet" a 30 °C 5 sem agitação por 28 horas em uma OD600 de 3,18 (glicose) ou 4,52 (sacarose). As amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram filtrados através de um filtro de 0,2 µm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Ml). Os sobrenadantes filtrados foram analisados por CG, com coluna HP-lnnowax Polietileno Glicol (19091N-113, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e foi realizada a 10 detecção por ionização de chama para os niveis de meso-2,3-butanodiol, acetoína e etanol. Os resultados da Tabela 5 mostram que o meso-2,3- butanodiol representou mais de 50% dos dois principais produtos, meso-2,3- butanodiol e etanol, similar aos resultados obtidos com meio rico.

Tabela 5 15 ProduçÃo De MESO-2,3-BUTANODlOL, AcetoÍna e Etanol Pela PNP0001/PFP996PLDHL1-BUDC-SADB Cultivada Em Meio SINTÉTICO COM Glicose ou Sacarose Concentração (mM) Meso-2,3- Cultura Acetoína Etanol butanodiol Glicose 12,9 2,4 10,9 Sacarose 25,5 3,1 10,0 Estes dados demonstram que uma cepa de Lactobaci//us p/antarum recombinante deletada para os genes /dhD e /dhL1 e que contém 20 um plasmldeo que expressa o gene budC heterólogo, produziu meso-2,3- butanodiol quando as células foram cultivadas em meio sintético com glicose ou sacarose como açúcares fermentáveis.

A produção de 2,3-butanodiol sem 2-butanona no meio indica que o reseNatório de elétron adicional não era necessário para proporcionar o * equilíbrio redox para o fluxo descrito. j Exemplo 6 " Produção De MESO-2,3-BUTANODlOL Usando Uma Cepa Rfcombinante De 5 Lactobac/llus plantarum CONTENDO O Vetor PFP996PLDH!-1-BUDC Cultivada Em Meio SintÉtico Com Sacarose o objetivo deste exemplo é demonstrar a produção de meso-2,3- butanodiol usando uma cepa de Lactobaci//us p/antarum recombinante contendo uma via projetada em meio sintético, Especificamente, uma cepa de Lactobacil/us 10 p/antarum em que foram deletadas as duas lactato desidrogenases endógenas, LdhD e LdhL1 , contendo ainda um plasmideo, pFP996PldhL1-budC, expressando a região de codificação budC da K/ebsie//a pneumoniae para butanodiol desidrogenase foi cultivada em meio sintético com sacarose. As duas primeiras enzimas para a via do butanodiol, acetolactato sintase e acetolactato 15 decarboxilase, foram fornecidas pela expressão nativa a partir do cromossomo.

Uma vez que o Exemplo 5 demonstrou que não foi necessário um reservatório de elétrons adicional para o equilíbrio redox, a expressão de sadB não foi incluida.

A cepa PNPOOO1 foi transformada, como no Exemplo 1, com a exceção de que a glicina foi omitido, com os plasmídeos pFP996PldhL1 e 20 pFP996PldhL1-budC. As cepas PNPOOO1/pFP996PldhL1 e PNPOOO1/pFP996PIdhL1-budC foram cultivadas durante a noite em meio de Iactobacilos MRS com 2 µg/ml de eritromicina a 30 °C em câmara de anaerobiose (Coy Laboratories lnc., Grass Lake, Ml). Os frascos contendo meio sintético, que tinham sido desoxigenados durante a noite em uma câmara 25 de anaerobiose, foram inoculados com a cultura durante a noite até uma OD600 de aproximadamente 0,02 e as culturas seladas na câmara de anaerobiose. O meio sintético consistia de: Sulfato de amônio 10 mM, MES pH6 100 mM, fosfato de potássio pH 6 5 mM, 1°/0 de mistura de metais SlO, sacarose 20 mM,

0,5 °/) de extrato de Ievedura, 0,01 °/) de ácidos casaminos, citrato de amônio

U

W 10 mM e 2µg/mL de eritromicina. As culturas foram cultivadas a 30 °C sem agitação por 48 horas a uma OD600 de aproximadamente 2,3, As amostras de b culturas foram centrifugadas a 3700 x g por 10 minutos a 4 °C e os 5 sobrenadantes da cultura foram filtrados através de um filtro de 0,2 µm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Ml). Os sobrenadantes filtrados foram analisados por CG, com coluna HP-lnnowax Polietileno Glicol (19091N-113, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e foi realizada a detecção por ionização de chama para os níveis de meso-2,3-butanodiol, acetoína e etanol, 10 Os resultados na Tabela 5 demonstram a produção de meso-2,3- butanodiol, acetoína e etanol pela cepa PNP0001/pFP996Pldhl1-budC cultivada em meio sintético com sacarose. A quantidade de meso-2,3- butanodiol produzida por esta cepa é comparável com a PNPOOO1 com o vetor pFP996PldhL1-budC-sadB (Exempio 5).

15 Tabela 5 Produção De MESO-2,3-BUTANOD|OL, ACETOÍNA e Etanol Pela PNP0001/PFP996PLDHL1 E PNP0001/PFP996PLDHL1-BUDC Cultivada Em Meio SintÉtico Com Sacarose Concentração (mM) Cepa Meso-2 '.3- . Acetoina Etanol butanodiol PNP0OO1/pFP996PI dhL1 0,5 26,2 24,9 PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC 33,3 2,7 18,1 20 Exemplo 7 (Teórico) ProduçÃo De 2-BUTANOL Por Uma Cepa De L. PL.ANTRAUM RECOMBINANTE EX,P,R,E,S.S,A,N,D,O_D.|,O.L DESIDRATASE INDEPENDENTE DE B12 É construído um vetor expressando uma butanodiol desidrogenase codificada pelo gene budC da Klebsie//a pneumoniae, uma álcool desidrogenase secundária codificada pelo gene sadB de Achromobacter 0

J xy/osoxidans e uma butanodiol desidratase independente de coenzima B12 (S- adenosilmetionina-dependente) e suas reativases associadas codificadas pelos e genes da de Roseburia inu/inivorans; rdhtA (DNA SEQ ID NO: 15; proteína 5 SEQ ID NO: 16) e rdhtB (DNA SEQ ID NO: 17; proteína SEQ ID NO: 18), respectivamente. A propanodiol desidratase independente de coenzima B12 e a reativase da Roseburia inu/inivorans são divulgadas na Publicação de Patente US20090155870A1. Nesta as sequências codificadoras de rdhtA e rdht8 foram sintetizadas como um fragmento de DNA (SEQ ID NO: 67) pelos métodos 10 convencionais e clonados em um vetor de E. co/i (por DNA2.0, lnc., Menlo Park, CA), resultando no pj206::rdhtl\8, As regiões cod ificadoras de rdhtA e rdhtB da Roseburia inu/inivorans são amplificadas com primers rdhtAB-up (SEQ ID NO: 59) e rdhtl\8-down (SEQ ID NO: 60), cada um contendo um sÍtio de restrição BsrGl, 15 do vetor pj206::rdhtAB. O fragmento de PCR resultante e o pFP996PldhL1- budC-sad8 são ligados após a digestão com BsrGl e usados para transformar células E. Co/i TOPlO. Os plasmideos que possuem as regiões codificadoras de rdhtAB na mesma orientação que budC e sadt3 são identificados por PCR com os primers rhdtAB-up (SEQ ID NO: 59) e OBP42 (SEQ ID NO: 54) e o 20 clone resultante, orientado corretamente é denominado pFP996PldhL1-budC- sadB-rdhtAB.

A cepa PNPOOO1 é transformada com o vetor pFP996PldhL1- budC-sadB-rdhtAB conforme descrito no exemplo 1, exceto que a glicina é omitida do meio. O meio MRS contendo 2 µg/ml de eritromicina é inoculado 25 com a cepa PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC-sadB-rdhtAB e cultivado durante a noite a 30 °C em câmara de anaerobiose. Os frascos contendo meio MRS com 2µg/ml de eritromicina, que foram desoxigenados durante a noite em uma câmara de anaerobiose, são inoculados com a cultura durante a noite em uma diluição de 1:100 e as culturas seladas na câmara de anaerobiose. As culturas h 4 foram cultivadas a 30 °C por 48 horas sem agitação- O sobrenadante da cultura é testado e o 2 -butanol é detectado por HPLC ou CG. b Exemplo 8 5 ConstruçÃo Do Lactobac/llus plantarum CEPA PN0512 ALDHDA|DHL1APFLB2A2 :: AlSS(O) o objetivo deste exemplo é descrever a construção de uma cepa de Lactobaci/lus plantarum na cepa de base genética PN0512NdhDAldhL1 que apresenta deleções dos genes pf/t32, codificando formato C-acetiltransferase 10 (piruvato-formato liase) e pfli42, codificando a enzima ativadora da formato de C-acetiltransferase e, portanto, não possui atividade formato C- acetiltransferase. Ao passo que o Lactobacil/us p/antarum WCFSl contém dois genes que codificam a formato C-acetiltransferase e dois genes que codificam a enzima ativadora da formato C-acetiltransferase, o Lactobaci//us p/antarum 15 PN0512 contém apenas um gene que codifica a formato C-acetiltransferase e um gene que codifica a enzima ativadora da formato C-acetiltransferase. Um gene (alsS) códon otimizado para a expressão em Lactobaci//us p/antarum, que codifica a enzima acetolactato sintase de Baci//us subti//s foi integrado no lugar dos genes pf/B2A2 excluidos.

20 O gene nocaute p/'/B2A2 e o gene de integração a/sS foram construídos usando um procedimento de recombinação homóloga de duas etapas descrito anteriormente. O nocaute teve a deleção de 351 aminoácidos da extremidade C-terminal (nucleotídeos 1204 até 2256 da sequência codificadora) do P/7B2 e toda a sequência de codificação do pI7A2. A sequência 25 deletada foi substituída por um códon de parada, no quadro com o pI1B2 truncado, seguido por uma sequência de ligação de ribossomo e o gene a/sS códon otimizado do Baci//us subti/is para a expressão em Lactobaci//us plantarum.

F O vetor nocaute/de integração foi construído no plasmídeo b 0 pFP996 da seguinte forma. As braços (arms) homólogos para a deleção do gene pHB2A2 foram amplificados a partir do DNA genômico do PN0512. O braço homólogo esquerdo p/1B2A2 foi amplificado com os primers oBP309 5 (SEQ ID NO: 104) que contém um sítio de restrição Xhol e OBP310 (SEQ ID NO: 105) que contém um códon de parada (complemento de TAA) e o sÍtio de restrição Xmal. O braço homóiogo direito pf/B2A2 foi amplificado com os primers oBP271 (SEQ ID NO: 106) que contém um sítio de restrição Kpnl e oBP272 (SEQ ID NO: 107) que contém um sitio de restrição BsrGl. O braço 10 homólogo esquerdo do p/1B2A2 foi clonado nos sÍtios Xhol/Xmal e o braço homólogo direito pi'/B2A2 foi clonado nos sítios Kpnl/8srGl do pFP996 para criar o pFP996-pfIB2A2arms. O gene a/sS códon otimizado do Baci//us subti/is para a expressão em Lactobaci//us p/antarum (SEQ ID NO: 87 : sintetizada pela GenScrjpt Corp., Piscataway, NJ) foi arnplificado utilizando os primers OBP282 15 (SEQ ID NO: 108) que contém um sÍtio de restrição Xmal; e OBP283 (SEQ ID NO: 109) contendo um sitio de restrição Kpnl. O gene a/sS códon otimizado foi clonado nos sÍtios Xmal/kpnl do pFP996-pflB2A2arms, para criar o pFP996- pflB2A2arms-als(o).

A PN0512 L1/dhDL1ldhL1 foi transformada com o pFP996- 20 pflB2A2arms-als(o) conforme descrito acima, exceto que as células competentes foram preparadas na ausência de glicina, e os transformantes foram selecionados em placas MRS contendo 1 µg/ml de eritromicina. O transformante foi cultivado a 30 °C por aproximadamente 35 gerações por inoculação seriada em MRS antes das culturas serem semeadas em MRS 25 contendo eritromicina (1 µg/ml). Os isolados foram selecionados por PCR de colônia para um cruzamento único com o primer cromossômico especifico OAA227 (SEQ ID NO: 110) e primer plasmídeo especifico OBP42 (SEQ ID NO: 54). Um integrante de cruzamento único foi cultivado a 37 °C por aproximadamente 35 gerações por inoculação seriada em meio MRS antes das » e culturas serem semeadas em meio MRS. Os isolados sensíveis a eritromicina foram selecionados por PCR de colônia para detectar a presença de um ·¥ segundo cruzamento tipo selvagem ou deleção/integração usando primers 5 específicos oAA228 (SEQ ID NO: 111) e um primer cromossomo específico OBP280 (SEQ ID NO: 112). A cepa de deleção/integração PN0512 A/dhDAldhL1Apf/B2A2::als(o)", denominada de BP556, foi confirmada por sequenciamento do produto da PCR amplificado com primers cromossorno específicos oBP278 (SEQ ID NO: 113) e oBP280 (SEQ ID NO: 112).

10 Exemplo 9 Producão De MESO-2,3-BUTAnod]ol Usando Uma Cepa Recombinante De Lactobacillus plantarum Sem Atividade Lactato Desidrogenase E Atividade Formato C-acetiltransferase Cultivadas Em Meio Rico o objetivo deste exemplo é demonstrar a produção de meso-2,3- 15 butanodiol usando uma cepa de Lactobaci//us p/antarum recombinante contendo uma via projetada em meio rico. Especificamente, uma cepa de Lactobacl//us p/antarum em que foram deletadas as duas lactato desidrogenases endógenas, LdhD e LdhL1, deletada a Pfbl82 para a formato C-acetiltransferase, e contendo um plasmídeo, pFP996PldhL1-budC, 20 expressando a região de codificação budC da K/ebsie//a pneumoniae para butanodiol desidrogenase foi cultivada em meio MRS. A segunda enzima para a via do butanodiol, acetolactato decarboxilase, foi fornecida pela expressão nativa a partir do cromossomo. A primeira enzima da via butanodiol, acetolactato sintase, foi fornecido pela expressão nativa do cromossomo e o 25 gene a/sS heterólogo de Baci//us subti/is integrado no lócus pf/B2A2. A cepa BP556 foi transformada como no Exemplo 1, com a exceção de que a glicina foi omitido, com o plasmídeo pFP996PldhL1-budC. As cepas PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC e BP556/pFP996PldhL1-budC foram cultivadas durante a noite em meio lactobacilo MRS com 2 µg/ml de 0

W eritromicina a 30 °C. As culturas de uma noite foram utilizadas para inocular 5 ml de meio MRS com 2 µg/ml de eritromicina em de tubos de tampa de rosca e de 15 ml. As culturas foram cultivadas a 30 °C sem agitação em uma caixa 5 anaeróbica contendo um sachê de anaerobiose "Pack-Anaero sachet" (Mitsubishi Gas Chemical Co., Tóquio, Japão) por 24 horas a uma OD600 de 6,5. As amostras de culturas foram centrifugadas a 3700 x g por 10 minutos a 4 °C e os sobrenadantes da cultura foram 'filtrados através de um filtro de 0,2 µm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Ml). Os sobrenadantes filtrados foram 10 analisados por HPLC com uma coluna Shodex SUGAR SH1O11 (Showa Denko K.K., Kawasaki, Japão) e foi realizada a detecção do índice de refração. Mais de 99 °/) da glicose foi consumida em ambas as culturas. A deleção de p1'/B2A2 levou a níveis não detectáveis de formato para a cepa BP556/pFP996PldhL1- budC, enquanto a cepa PNP0OO1/pFP996PldhL1-budC produziu 20 mM de 15 formato. A produção de meso-2,3-butanodiol aumentou 12% para a BP556/pFP996PldhL1-budC (92 mM) em relação a PNP0OO1/pFP996PldhL1- budC (82 mM).

Claims

Reivindicações D

1. CÉLULA BACTERIANA ÁCIDO-LÁTICA RECOMBINANTE, -. caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um gene que codifica u um polipeptideo heterólogo possuindo atividade butanodiol desidrogenase, em 5 que a célula bacteriana é substancialmente livre de atividade lactato desidrogenase e, em que, a célula produz 2,3-butanodiol.

2. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma interrupção em pelo menos um gene endógeno que codifica um polipeptideo possuindo atividade Iactato 10 desidrogenase.

3. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo constituído por Lactococcus, Lactobaci//us, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus e Streptococcus.

15 4. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade da piruvato-formato liase.

5- CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicaçâo 4, caracterizada pelo fato de que a modificação genética afeta um gene que : 20 codifica a piruvato-formato liase, um gene que codifica a enzima ativadora da piruvato-formato liase, ou ambos.

6. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o gene que codifica a piruvato-formato liase é selecionado a partir do grupo constituído por pfl, pf/t31 e pf/B2 e o gene que 25 codifica a enzima ativadora da formato C-acetiltransferase é selecionado a partir do grupo constituido por pI/A, pf/,41 e pf/A2.

7. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula produz um produto selecionado a partir m do grupo que consiste em lactato, acetoína, etanol, succinato, e formato.

P

8. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 7, . caracterizada pelo fato de que o 2,3-butanodiol compreende pelo menos cerca m de 49 °/0 molar de todos os produtos produzidos a partir do piruvato.

5 9. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o poIipeptídeo que possui atividade lactato desidrogenase é codificado por um gene selecionado a partir do grupo que consiste de ldhL, ldhD, /dhL1 e /dhL2.

10. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 9, 10 caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira ácido-lática é Lactobacil/us p/antarum, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesentero/des, Streptococcus thermophi/us, Pediococcus pentosaceus ou Lactobaci//us acidophilus.

11. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula produz 2-butanona.

15 12. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula produz 2-butanol.

13. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende uma via biossintética do 2-butanol.

14. CÉLULA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 11, 20 caracterizada pelo fato de que compreende uma via biossintética de 2- butanona.

15. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2-BUTANOL, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o fornecimento da célula bacteriana ácido-lática recombinante, 25 conforme definida na reivindicação 1, compreendendo uma via biossintética de 2-butanol; e (b) o cultivo da célula bacteriana da etapa (a) sob condições em que o 2-butanol é produzido.

eb

16. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2-BUTANONA, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o fornecimento da célula bacteriana ácido-lática recombinante, conforme definida na reivindicação 1, compreendendo uma via biossintética de 5 2-butanona; e (b) o cultivo da célula bacteriana da etapa (a) sob condições em que a 2-butanona é produzida.