BRPI0913949B1 - Composição farmacêutica compreendendo proteínas inibidoras inter- alfa purificadas - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PURIFICAÇÃO DE UMA PROTEÍNA INIBIDORA INTER-ALFA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO A REFERIDA PROTEÍNA, KITS E PROTEÍNA INIBIDORA INTER-ALFA PURIFICADA. A presente invenção refere-se a processos para a purificação de proteínas inibidora inter alfa (IalfaIp) e composições da mesma a partir de sangue.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/130,269 depositado em 28 de maio de 2008, cujo conteúdo em sua totalidade é aqui incorporado a título de referência.

DECLARAÇÃO DE DIREITOS PARA INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA

[002] Este trabalho foi patrocinado pelo National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences Grant, Grants Nos. 2R44GM65667-02 e 1R43GM079071-01A1. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Sepse e Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) (Systemic Inflammatory Response Syndrome) referem-se ambas a uma reação bioquímica severa seguindo exposição a um agente infeccioso (por exemplo, toxina bacteriana tal como Antrax) ou de uma lesão ou trauma. A resposta sistêmica pode levar a choque séptico, que é caracterizado por uma queda brusca na pressão sanguínea, colapso cardiovascular e/ou falência múltipla dos órgãos. Apesar da introdução de antibióticos nos últimos cinquenta anos, a taxa de mortalidade de indivíduos diagnosticados com choque séptico é 30-50%, maior do que aquela de câncer de mama, colo ou próstata. Há aproximadamente 800.000 casos de sepse por ano nos Estados Unidos a um custo de $17 bilhões, com um número igual no resto do mundo. A sepse e a SIRS estão aumentando rapidamente em todo o mundo devido à resistência a antibiótico e ameaças biológicas crescentes. A população "sob risco" é substancialmente maior quando considerando as implicações potenciais de pandemias mundiais (por exemplo, gripe aviária) ou bioterrorismo. Em bioterrorismo ou em exposição em campo de batalha, as taxas de mortalidade são esperadas ser muito maiores. Tratamento rápido e confiável de sepse, SIRS e choque séptico tem sido difícil usando medicações convencionais.

[004] A família da proteína inibidora inter-alfa (IαIp) é um grupo de inibidores da serina protease associadas ao plasma que modulam a resposta do corpo para a inflamação sistêmica severa que acompanha sepse, infecção, trauma e lesão. A proteína inibidora inter-alfa (IαIp) foi mostrada melhorar a sobrevivência ou condição de animais de teste que sofrem de sepse; infectados com antrax, Ebola ou Vírus da Dengue; ou sofrendo de lesão pulmonar devido à exposição a agentes químicos tóxicos ou radiação ionizante. IαIp é uma proteína grande que é isolada do sangue. Devido ao fato do uso de proteínas inibidoras inter-alfa no tratamento de sepse e SIRS, métodos para purificação ou preparação de IαIp são urgentemente necessários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Conforme descrito abaixo, a presente invenção refere-se a um método para a purificação de proteínas inibidoras inter-alfa (IαIp) e seu uso para tratamento de doença ou seus sintomas, incluindo doenças tais como sepse, doenças inflamatórias agudas, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, doenças infecciosas e parto prematuro; ou redução do risco de mortalidade associado com sepse, doenças inflamatórias agudas, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, doenças infecciosas e parto prematuro.

[006] Em um aspecto, a invenção provê um método para purificação de uma proteína inibidora inter-alfa (proteína IαIp), o método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor (por exemplo, 3,7, 3,5, 3,4, 3,3, 3,1, 3,0, 2,9, 2,0).

[007] Em um aspecto, a invenção provê uma composição contendo uma proteína IαIp purificada de acordo com um método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor.

[008] Em outro aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica contendo uma dose eficaz de uma proteína IαIp purificada de acordo com um método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[009] Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método para tratamento ou prevenção de doença ou sintomas de doença em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição contendo uma proteína IαIp purificada de acordo com um método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor.

[010] Em ainda outro aspecto, a invenção provê um kit para purificação de uma proteína IαIp tendo pelo menos uma solução tampão com um pH de cerca de 4,0 ou menor e instruções para uso do kit. Em uma modalidade, o kit tem pelo menos uma solução tampão que é um tampão de lavagem com um pH de cerca de 4,0 ou menor. Em outra modalidade, o kit tem pelo menos duas soluções tampão que são tampões de lavagem com um pH de cerca de 4,0 ou menor. Em uma modalidade específica, um primeiro tampão de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 e um segundo tampão de lavagem tem um pH de cerca de 3,3. Em outra modalidade específica, um primeiro tampão de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 e um segundo tampão de lavagem tem um pH de cerca de 2,9.

[011] Em um aspecto adicional, a invenção provê um kit para uso terapêutico tendo uma composição contendo uma proteína IαIp purificada de acordo com um método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor.

[012] Em um aspecto adicional, a invenção provê um kit para uso analítico tendo uma composição contendo uma proteína IαIp purificada de acordo com um método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor.

[013] Em um aspecto relacionado, a invenção provê um método para purificação de uma proteína inibidora inter-alfa (proteína IαIp), o método envolvendo: colocação de sangue, uma fração de plasma sanguíneo ou uma fração de plasma intermediário em uma coluna de cromatografia, submissão da coluna a um tampão de lavagem com um pH de cerca de 4,0 ou menor.

[014] Em ainda outro aspecto relacionado, a invenção provê uma proteína inibidora inter-alfa purificada (proteína IαIp) feita através de um método envolvendo uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 4,0 ou menor e onde a proteína IαIp atinge ligação aumentada em um ensaio de imunoabsorção por ligação à enzima (ELISA) comparado com uma referência. Em uma modalidade, a ligação da proteína IαIp é aumentada em mais de 1-, 1,5-, 2-, 3-, 4-, 5- ou 10- vezes comparado com a referência (por exemplo, proteína IαIp sem tratamento com pH baixo).

[015] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, o método envolve uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 3,6 ou menor. Em várias modalidades, o método envolve uma etapa on de a proteína IαIp é exposta a condições de pH de cerca de 3,3 ou menor. Em várias modalidades, o método envolve uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH entre cerca de 3,3 e 3,1. Em várias modalidades, o método envolve uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a condições de pH entre cerca de 3,1 e cerca de 2,9.

[016] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, o método envolve uma etapa de cromatografia ou etapa de extração de fase sólida. Em várias modalidades, a etapa de cromatografia compreende cromatografia líquida, cromatografia de coluna, cromatografia de troca de íon ou uma combinação das mesmas. Em várias modalidades, a cromatografia envolve o uso de um suporte monolítico ou suporte à base de partícula. Em várias modalidades, o suporte monolítico ou suporte de partícula envolve um ligante de troca de ânion imobilizado. Em várias modalidades, o ligante com íon trocado imobilizado é dietilaminoetano (DEAE) ou amina quaternária (Q).

[017] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, o método envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão, onde o tampão de lavagem de pelo menos uma etapa de lavagem com tampão tem um pH de cerca de 4,0 ou menor. Em várias modalidades, o método envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão, onde o tampão de lavagem de pelo menos uma etapa de lavagem com tampão tem um pH de cerca de 3,6 ou menor. Em várias modalidades, o método envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão, onde o tampão de lavagem de pelo menos uma etapa de lavagem com tampão tem um pH de cerca de 3,3 ou menor. Em várias modalidades, o método envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão, onde o tampão de lavagem de pelo menos uma etapa de lavagem com tampão tem um pH de cerca de 3,1 ou menor. Em várias modalidades, o método envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão, onde o tampão de lavagem de pelo menos uma etapa de lavagem com tampão tem um pH entre cerca de 3,1 a cerca de 2,9. Em várias modalidades, a proteína inibidora inter-alfa (proteína IαIp) se liga à coluna. Em várias modalidades, a proteína inibidora inter-alfa (proteína IαIp) é isolada.

[018] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, o método envolve uma etapa onde a proteína IαIp é exposta a concentrações de sal de cerca de 250 mM de NaCl ou maior (por exemplo, 260, 270, 280, 290 mM de NaCl). Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima delineados aqui, o método envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão, onde o tampão de lavagem tem uma concentração de sal de cerca de 250 mM de NaCl ou maior (por exemplo, 260, 270, 280, 290 mM de NaCl).

[019] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, a proteína IαIp é purificada a partir do sangue. Em várias modalidades, a proteína IαIp é purificada a partir de plasma sanguíneo ou uma fração de plasma sanguíneo. Em várias modalidades, o plasma sanguíneo é crioplasma pobre ou a fração de plasma sanguíneo é uma fração de plasma intermediário. Em várias modalidades, a fração de plasma intermediário é uma fração contendo IαIp. Em várias modalidades, o sangue, fração de plasma sanguíneo ou fração de plasma intermediário é humana, de primata, bovino, equino, porcino, ovino, felino, canino ou combinações dos mesmos.

[020] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, a proteína IαIp tem um peso molecular aparente entre cerca de 60 a cerca de 280 kDa. Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, a proteína IαIp ou composição tem uma pureza variando de a partir de cerca de 85% a cerca de 100% pura. Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, a proteína IαIp ou composição tem um rendimento variando de a partir de cerca de 85% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, a proteína IαIp ou composição pode ser usada para um uso analítico (por exemplo, para quantificar a quantidade de IαIp em uma amostra de concentração de IαIp desconhecida). Em algumas modalidades, a proteína IαIp ou composição tem atividade biológica. Em várias modalidades, a atividade biológica é uma atividade inibidora de citocina, atividade inibidora de quimiocina ou atividade inibidora de serina protease. Em várias modalidades, o método envolve uma etapa de inativação viral ou etapa de nanofiltragem ou antes ou após a etapa de cromatografia.

[021] Em várias modalidades de qualquer um dos aspectos acima ou de qualquer outra invenção delineada aqui, a composição ou composição farmacêutica é para o tratamento em um indivíduo com necessidade da mesma. Em várias modalidades, o indivíduo é identificado com necessidade de tratamento com a composição. Em várias modalidades, o indivíduo é identificado com necessidade de tratamento para doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, trauma/lesão, doença infecciosa ou parto prematuro. Em várias modalidades, de qualquer um dos aspectos acima, o indivíduo com necessidade é um ser humano, primata, bovino, equino, porcino, ovino, felino ou canino.

[022] A invenção provê métodos de preparação ou purificação de proteínas inibidoras inter-alfa (IαIp) a partir de plasma sanguíneo. Outras características e vantagens da invenção se tornarão aparentes a partir do relatório descritivo e a partir das reivindicações.

DEFINIÇÕES

[023] Conforme aqui usado, "alteração" significa uma mudança (aumento ou diminuição) no rendimento, quantidade, concentração, atividade, pureza ou níveis de uma proteína IαIp conforme detectado através de métodos conhecidos na técnica padrão tais como aqueles descritos aqui. Conforme aqui usado, uma alteração inclui uma mudança de 10% em rendimento, pureza ou atividade, preferivelmente uma mudança de 25%, mais preferivelmente uma mudança de 40% e mais preferivelmente uma mudança de 50% ou mais em níveis de expressão.

[024] Por "análogo" quer dizer um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico estruturalmente relacionado tendo a função de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico de referência.

[025] Por "composto" quer dizer qualquer composto químico de molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo ou fragmentos do mesmo.

[026] Por "reduz" ou "aumenta" quer dizer uma alteração negativa ou positiva, respectivamente, de pelo menos 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

[027] Por "indivíduo" quer dizer qualquer mamífero, incluindo, mas não limitado a, um mamífero humano ou não-humano, tal como primata, bovino, equino, porcino, ovino, felino ou canino.

[028] Conforme aqui usado, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e similar referem-se à redução ou melhora de um distúrbio e/ou sintomas associados com o mesmo. Será compreendido que, embora não precludido, tratamento de um distúrbio ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas associados com o mesmo sejam completamente eliminados.

[029] Conforme aqui usado, os termos "prevenir", "prevenindo", "prevenção", "tratamento profilático"e similar referem-se à redução da probabilidade de desenvolvimento de um distúrbio ou condição em um indivíduo, que não tem, mas está sob risco de ou é suscetível a desenvolvimento de um distúrbio ou condição.

[030] Por "referência" quer dizer uma condição padrão ou controle.

[031] No presente relatório, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e similar podem ter o significado dado a eles na lei de Patente U.S. e podem incluir "inclui", "incluindo" e "similar"; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente" da mesma maneira tem o significado dado na lei de Patente U.S. e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que é mencionado contanto que características básicas ou novas daquelas que são mencionadas não sejam mudadas pela presença de mais do que é mencionado, mas exclui modalidades da técnica anterior.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[032] As figuras 1A-1B mostram esquemas para purificação de IαIp de plasma humano usando uma etapa de cromatografia única. A figura 1A mostra um esquema para a purificação de IαIp de plasma humano usando uma etapa de lavagem com pH baixo. A figura 1B mostra um esquema para a purificação de IαIp de plasma humano usando uma etapa de lavagem de tampão com sal e uma etapa de lavagem com pH baixo.

[033] As figuras 2A-2C mostram a purificação de proteína de plasma (Fração D e Fração C) através de cromatografia DEAE usando uma etapa de lavagem com pH baixo (pH 4,0 ou pH 3,3). A figura 2A mostra um traço UV de plasma (1 mL de diluição 1:100 em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado por cromatografia DEAE (suporte monolítico; taxa de fluxo: 5 mL/min) com uma etapa de lavagem com um tampão de lavagem (Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 2B mostra um traço de UV de plasma (1 mL de diluição 1:100 em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado por cromatografia DEAE (suporte monolítico; taxa de fluxo: 5 mL/min) com uma etapa de lavagem usando um tampão de lavagem de pH baixo (Ácido acético 150 mM, pH 4,0) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 2C mostra um traço de UV de plasma (1 mL, de diluição 1:100 em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado por cromatografia DEAE (suporte monolítico; taxa de fluxo: 5 mL/min) com uma etapa de lavagem usando um tampão de lavagem com pH baixo (Ácido acético 150 mM, pH 3,3) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6).

[034] A figura 3 mostra um traço de UV de Crioplasma pobre (1 mL de diluição 1:100 em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado por cromatografia DEAE (suporte monolítico) com duas etapas de lavagem usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0; Tampão de Lavagem No. 2: Ácido Acético, pH 3,3) e eluído com Tris 100 mM + NaCl 1000 mM, pH 7,6.

[035] As figuras 4A-4D mostram o fracionamento de plasma intermediário (Fração D e Fração C) através de cromatografia DEAE usando uma etapa de lavagem com pH baixo única (pH 3,3) ou duas etapas de lavagem com pH baixo (pH 4,0 e pH 3,3). A figura 4A mostra um traço de UV de plasma intermediário (1 mL de diluição 1:200 de Fração D em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (suporte monolítico; taxa de fluxo: 5 mL/min) com uma etapa de lavagem usando um tampão de lavagem com pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0) e eluído com tampão de eluição (tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 4B mostra um traço de UV de fração de plasma intermediário (1 mL de diluição 1:200 de Fração C em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (suporte monolítico 1 mL; taxa de fluxo: 5 mL/min) com uma etapa de lavagem usando um tampão de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 4C mostra um traço de UV de plasma intermediário (1 mL de diluição 1:200 de Fração D em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (1 mL de suporte monolítico; taxa de fluxo: 5 mL/min) com duas etapas de lavagem usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0; Tampão de Lavagem No. 2: Ácido Acético 200 mM, pH 3,3) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 4D mostra um traço de UV de fração de plasma intermediário (1 mL de diluição 1:200 de Fração C em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (1 mL de suporte monolítico; taxa de fluxo: 5 mL/min) com duas etapas de lavagem usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0; Tampão de Lavagem No. 2: Ácido Acético 200 mM, pH 3,3) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, Nacl 1000 mM, pH 7,6).

[036] A figura 5 mostra a purificação da proteína IαIp através de cromatografia de coluna monolítica DEAE conforme analisado através de Western blot. Análises de duas separações cromatográficas de frações de plasma intermediário (Fração D e Fração C) são mostradas. Para cada separação cromatográfica, quantidades equivalentes que foram carregadas por faixa do Material de Partida (SM), da Fração de lavagem No. 1 (W#1), da Fração de lavagem No. 2 (W#2) e do Eluato (E)) foram separadas através de SDS-PAGE (6%; não-desnaturação). O eluato (E) de uma separação cromatográfica de crioplasma pobre é mostrado para comparação. As proteínas separadas através de SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose, que foi sondada com IαIp anti-humana (MAb 69,26) como o anticorpo primário.

[037] As figuras 6A-6F mostram que a purificação de proteína IαIp a partir de crioplasma pobre ou plasma intermediário (Fração D e Fração C) através de cromatografia DEAE usando duas etapas de lavagem de pH baixo (pH 4,0 e pH 3,3) é extrapolável. A figura 6A mostra um traço de UV de crioplasma pobre (Material de partida: 25 mL de diluição 1:10 de Fração C em Tris 25 mM; NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (8 mL de suporte monolítico; taxa de fluxo: 40 mL/min) com duas etapas de lavagem usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0; Tampão de Lavagem No. 2: Ácido Acético 200 mM, pH 3,3) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 6B mostra frações da separação de crioplasma pobre através de cromatografia monolítica DEAE (Material de partida (SM), Lavagem No. 1 (W#1), Lavagem No. 2 (W#2) e Eluato (EL)) analisadas através de SDS-PAGE (gradiente 4-20%). A figura 6C mostra um traço de UV de plasma intermediário (Material de partida: 2 mL de diluição 1:125 de Fração D em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (8 mL de suporte monolítico; taxa de fluxo: 40 mL/min) com duas etapas de lavagem usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0; Tampão de Lavagem No. 2: Ácido Acético 200 mM, pH 3,3) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 6D mostra frações da separação de plasma intermediário (Fração D) através de cromatografia monolítica DEAE (Material de partida (SM), Lavagem No. 1 (W#1), Lavagem No. 2 (W#2) e Eluato (EL)) analisadas através de SDS-PAGE (gradiente 4-20%). A figura 6E mostra um traço de UV de fração de plasma intermediário (Material de partida: 2 mL de diluição 1:125 de Fração C em Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,8) separado através de cromatografia DEAE (8 mL de suporte monolítico; taxa de fluxo: 40 mL/min) com duas etapas de lavagem usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Tampão de Lavagem No. 1: Ácido Acético 150 mM, pH 4,0; Tampão de Lavagem No. 2: Ácido Acético 200 mM, pH 3,3) e eluído com tampão de eluição (Tris 100 mM, NaCl 1000 mM, pH 7,6). A figura 6F mostra frações da separação de plasma intermediário (Fração C) através de cromatografia monolítica (Material de partida (SM), Lavagem No. 1 (W#1), Lavagem No. 2 (W#2) e Eluato (EL)) analisadas através de SDS-PAGE (gradiente 4-20%).

[038] As figuras 7A e 7B mostram a purificação de proteína IαIp a partir de crioplasma pobre ou fração de plasma intermediário através de cromatografia DEAE usando uma etapa de lavagem com um tampão de sal (mais de 250 mM de NaCl) e uma etapa de lavagem de pH baixo (pH 2,95). A figura 7A mostra um traço de UV de crioplasma pobre (volumes de coluna de 12,5 de diluição 1:100 em Tris 40 mM, NaCl 200 mM, pH 7,6, filtrado em 0,2 μM) separado através de cromatografia DEAE (suporte monolítico) com duas etapas de lavagem usando um tampão de lavagem de sal (volumes de 10 colunas de 400 mM de Tris-HCl, 290 mM de NaCl, pH 7,6) e um tampão de lavagem de pH baixo (volumes de 10 colunas de 200 mM de Na-Acetato, pH 2,95) e eluído com tampão de eluição com alto teor de sal (volumes de 5 colunas de 40 mM de Na-Citrato, pH 6,50, NaCl 1000 mM). A figura 7B mostra um traço de UV de fração de plasma intermediário (Fração D) (volumes de 2,5 colunas, diluição de 1:10 em 40 mM de Tris, 200 mM de NaCl, pH 7,6; filtrada em 0,2 μM) separado através de cromatografia DEAE (suporte monolítico) com duas etapas de lavagem usando um tampão de lavagem de sal (volumes de 10 colunas de 40 mM de Tris-HCl, 290 mM de NaCl, pH 7,6) e um tampão de lavagem de pH baixo (volumes de 10 colunas de 200 mM de Acetato de Na-pH 2,95) e eluído com tampão de eluição com alto teor de sal (volumes de 5 colunas de Citrato de Na 400 mM, pH 6,50, NaCl 1000 mM). Uma coluna monolítica de DEAE de 8 mL comercialmente disponível (DEAE-CIM; BIA Separations) em uma taxa de fluxo de 2,5 volumes de coluna (cv) por minuto foi usada para realizar a cromatografia. O fluxo foi coletado. Tampão de carga adicional foi aplicado à coluna até que o pico de fluxo retornasse para a linha de base (por exemplo, na Figura 7A, 7 volumes de colunas, 25 mM de Tris, 200 mM de NaCl, pH 7,6). Todos os picos eluídos pelas lavagens foram coletados. O pico eluído pelo tampão de eluição com alto teor de sal foi coletado e esta fração continha IαIp altamente pura.

[039] A figura 8 mostra análise de SDS-PAGE de frações da purificação da proteína IαIp incluindo uma etapa de lavagem com sal (290 mM de NaCl) e uma etapa de lavagem de pH baixo (pH 2,95) comparado com frações da purificação da proteína IαIp usando uma etapa de lavagem de pH baixo (pH 2,95). As frações foram eluídas por Tampão de lavagem pH 2,95 (lavagem de pH), Tampão de lavagem contendo NaCl 290 mM (Lavagem com Sal) e Tampão de eluição contendo NaCl 1000 mM (Eluição) e separadas através de SDS-PAGE (gradientes de 4-12%; não-desnaturação). Em ambos os procedimentos cromatográficos, a proteína IαIp foi purificada a partir da fração de plasma intermediário (Fração D). Proteínas de Peso Molecular Padrão (MW Padrão) foram ativadas para comparação. As setas - Inibidor Inter-alfa 250 kDa e Inibidor Pre-alfa de 125 kDa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[040] A presente invenção provê em geral um método para purificação de IαIp de plasma e composições terapêuticas para tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão caracterizado por doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, doença infecciosa e trabalho de parto prematuro. O método envolve exposição de IαIp a um tampão de pH baixo durante sua purificação.

PROTEÍNA INIBIDORA INTER-ALFA (IAIP)

[041] Conforme aqui usado, "Proteínas inibidoras inter-alfa (IαIp)"refere- se a polipeptídeos multicomponentes, grandes, em uma família de inibidores da serina protease estruturalmente relacionados. Por "polipeptídeo" quer dizer qualquer cadeia de aminoácidos, sem importar o comprimento ou modificação pós-traducional. O complexo mostrou ser importante na inibição de uma disposição de proteases incluindo elastase de neutrófilo, plasmina, tripsina, quimiotripsina, catepsina G e acrosina, incluindo inibidores da protease do tipo tripsina. Em plasma humano, proteínas IαIp são encontradas em concentrações relativamente altas (400-800 mg/L). Diferente de outras moléculas inibidoras, esta família de inibidores consiste em uma combinação de cadeias de polipeptídeo (cadeias leves e pesadas) covalentemente ligadas unicamente por uma cadeia de sulfato de condroitina.

[042] As cadeias pesadas de proteínas Inter-alfa (H1, H2 e H3) são também chamadas proteínas de ligação de Ácido Hialurônico (HA). As principais formas encontradas em plasma humano são inibidor inter-alfa (IaI), que consiste em duas cadeias pesadas (H1 & H2) e uma cadeia leve única (L), e inibidor pre-alfa (PaI), que consiste em uma cadeia pesada (H3) e uma cadeia leve (L). A cadeia leve (também chamada bikunina (inibidor bi-kunitz) com dois domínios Kunitz) é conhecida inibir amplamente serinas proteases no plasma. IαI e PαI presentes da fração de plasma têm um peso molecular aparente entre cerca de 60 kDa a cerca de 280 kDa. O peso molecular pode ser determinado através de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE). IαI e PαI foram também verificadas ser complexadas com H4, outra cadeia pesada de proteínas Iαp. Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria científica particular, acredita-se que as cadeias pesadas de IαIp, após serem liberadas do complexo, se ligam a HA (Ácido hialurônico) prevenindo que HA se ligue a seu receptor, CD44. Na ausência de cadeias pesadas de IαIp, HA vai se ligar a CD44 e disparar a secreção de fatores pró-inflamatórios, por exemplo, TNF-alfa e causar inflamação. Nesse ínterim, as cadeias leves de IαIp, uma vez liberadas do complexo, exibem atividade antiprotease.

SEPSE E SÍNDROME DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA SISTÊMICA (SIRS)

[043] Sepse e Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) referem- se ambas a uma reação físico-química severa seguindo exposição a um agente infeccioso (por exemplo, toxina bacteriana tal como Antrax) ou trauma/lesão. A sepse é uma reação exagerada do indivíduo a um agente com consequências potencialmente ameaçadoras à vida que não surgem tipicamente diretamente do agente causador. A sepse, se não tratada, pode resultar em dano sério a tecidos vivos que põe um paciente em perigo de progressão para disfunção de órgão múltipla, choque e por fim morte.

[044] Sepse, SIRS e choque séptico estão associados com ativação de sistemas de imunidade e coagulação inatos. A sepse e o choque séptico são caracterizados clinicamente por inflamação sistêmica, coagulopatia, hipotensão e disfunção de órgão múltipla (J.L. Vincent e outros, Annuals of Medicine 34 (2002) 606-613). Durante sepse severa, uma rede de proteases específica ativa fatores de coagulação, fibrinolíticos e de complemento. Essas proteases podem também disparar dano a tecido e órgão e aumentar a proteólise não-específica de fatores de coagulação e complemento em plasma (J. Wite e outros, Intensive Care Medicine 8 (1982) 215-222; S.J. Weiss, New England Journal of Medicine 320 (1989) 365-376). Sintomas "tipo sepse" são observados nos indivíduos expostos principalmente devido à resposta inflamatória sistêmica devastadora do corpo. A reação exagerada tipicamente inclui produção excessiva de citocinas ("tempestade de citocina") e proteases destrutivas e distúrbios em funções metabólica, de oxigenação, coagulação e vascular levando à disfunção multi- órgão.

[045] IαIp são proteínas do sangue naturais e são parte do sistema imune inato do corpo. A IαIp modula a resposta do corpo para uma inflamação sistêmica severa acompanhando sepse, infecção, trauma e lesão. IαIp são uma defesa natural vital contra sepse e SIRS e, desta maneira, elas modulam a defesa do corpo contra "reação exagerada" aos efeitos de inflamação sistêmica. IαIp são inibidores de serina protease, enzimas de digestão de proteína envolvidas em uma ampla variedade de processos fisiológicos incluindo coagulação, inflamação e resposta imune. IαIp serve como um modificador de resposta biológica de espectro amplo para regular os níveis em circulação de substâncias inflamatórias secretadas tais como reguladores de resposta imune (citocinas), proteínas que atraem leucócitos para sítios de lesão ou inflamação (quimiocinas) e proteases destrutivas que causam morbidez severa e mortalidade excessiva em pacientes afetados. Proteínas IαIp se ligam a citocinas, quimiocina e proteases em circulação que causam e sustentam uma condição séptica. Durante processos de inflamação severa, o nível de IαIp do corpo é rapidamente depletado resultando em processo de doença incontrolado. Existe uma relação inversa, altamente significante, entre níveis de IαIp no plasma e a severidade de doença e mortalidade em pacientes com sepse (Lim e outros, J. Infect. Dis. 2003, 188:919-926).

[046] IαIp foi mostrada melhorar significantemente a sobrevivência de animais experimentais sofrendo de sepse e aqueles infectados com antrax bem como animais sofrendo de lesão pulmonar aguda seguindo exposição a agentes químicos tóxicos ou radiação ionizante (Yang e outros, Crit. Care Med., 2002, 30(3):617-622; Lim e outros, J. Infect. Dis., 2003, 188:919-926; Wu e outros, Crit. Care Med., 2004, 32(8):1747-1752; e Opal e outros, Infect. And Immun., 2005, 73(8):5101-5105). Efeitos terapêuticos sobre coagulação, metabolismo, lesão do fígado, citocina inflamatória e funções de oxigenação eram independentes de estímulos ou agentes causativos. Em casos severos de inflamação aguda, quando os níveis de IαIp se tornam severamente depletados, foi demonstrado que progressão para um processo de doença incontrolado pode ser parcialmente ou completamente prevenida através de administração exógena de IαIp (Yang e outros, Crit. Care Med., 2002, 30(3):617-622; Wu e outros, Crit. Care Med., 2004, 32(8):1747-1752). Citocinas, quimiocinas e proteases em circulação podem ser removidas ou inativadas através da administração de IαIp e esta remoção ou inativação resulta em sobrevivência aprimorada, morbidez reduzida e tempo maior para tratar qualquer condição de doença ou infecção de base. Um fragmento de protease de IαIp isolada de urina demonstrou eficácia significante na redução da mortalidade em pacientes sépticos (Lin, H.Y. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 13 de fevereiro de 2007;87(7):451-7). Através da restauração do controle, terapia de reposição com IαIp tem o potencial de melhorar a sobrevivência, reduzir a morbidez e prover tempo para tratar as condição de doença ou infecção de base. Terapia de reposição tem uma margem de segurança alta porque IαIp está normalmente presente em níveis relativamente altos no sangue. IαIp é um agente útil, seguro, para manutenção da estabilidade homodinâmica, prevenção de lesão a órgão e melhora da sobrevivência em pacientes com sepse e aqueles expostos à "tempestade de citocina".

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[047] É descrito aqui um método terapêutico para administração de IαIp purificada a um indivíduo para tratar doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, doença infecciosa e trabalho de parto prematuro. A invenção pode ser usada para o tratamento de virtualmente qualquer doença associada com uma diminuição em níveis de proteína inibidora Inter-alfa (IαIp) em um indivíduo. A diminuição em níveis de proteínas inibidoras Inter-alfa (IαIp) pode estar associada com um aumento indesejável em quimiocinas, citocinas ou proteases. Por exemplo, o mamífero pode ter uma doença, distúrbio ou condição que resulta em um aumento indesejável em quimiocina, citocinas ou proteases. Condições tratadas exemplares incluem doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, trauma/lesão, doença infecciosa ou trabalho de parto prematuro. Em outras modalidades, o mamífero tem um risco aumentado de desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição que é retardado ou prevenido pelo método.

[048] Os métodos da invenção envolvem a administração de IαIp em uma dose terapeuticamente eficaz. Em várias modalidades, o método aumenta o nível de IαIp em um indivíduo em pelo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% ou até mesmo um máximo de 300%, 400% ou 500%, comparado com uma referência. Em outras modalidades, o método diminui o nível de uma citocina, quimiocina ou protease em pelo menos 5%,10%, 20%, mais desejavelmente em pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ou até mesmo um máximo de 70%, 80%, 90% ou 100% comparado com uma referência. Métodos para ensaio dos níveis de compostos biológicos são rotina e são conhecidos do versado na técnica (por exemplo, Guyton e outros, Textbook of Medical Physiology, Décima edição, W.B. Saunders Co., 2000).

[049] Embora não sendo ligado a nenhuma teoria particular, efeitos de níveis elevados de citocinas, quimiocinas e proteases em uma patologia referida aqui resultam em respostas locais e sistêmicas que consequentemente resultam em dano a tecido. Dano a tecido pode levar à falência de órgão. Em modalidades preferidas, o método aumenta a atividade biológica do tecido ou órgão em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150% ou até mesmo um máximo de 200%, 300%, 400% ou 500% comparado com um tecido ou órgão de ocorrência natural, correspondente. Funções biológicas do tecido ou órgão condescendentes a ensaio incluem digestão, excreção de resto, secreção, atividade elétrica, atividade muscular, produção de hormônio ou outra atividade metabólica. Métodos para ensaio da atividade biológica de tecidos e órgãos são rotina e são conhecidos do versado na técnica (por exemplo, Guyton e outros, Textbook of Medical Physiology, Décima edição, W.B. Saunders, Co., 2000).

[050] Os métodos da invenção são úteis para tratamento ou estabilização em um paciente (por exemplo, um ser humano ou mamífero) de uma condição, doença ou distúrbio afetando um tecido ou órgão. Eficácia terapêutica é opcionalmente ensaiada através da medição da, por exemplo, função biológica do tecido ou órgão tratado (por exemplo, bexiga, osso, cérebro, mama, cartilagem, esôfago, tubo falopiano, coração, pâncreas, intestinos, vesícula biliar, rim, fígado, pulmão, tecido nervoso, próstata, músculo esqueletal, pele, cordão espinhal, baço, estomago, testículos, timo, tireoide, traqueia, uréter, uretra, trato urogenital e útero). Tais métodos são padrão na técnica. Por exemplo, a função da bexiga é ensaiada através da medição da retenção e excreção da urina. Função do cérebro, cordão espinhal ou tecido nervoso é ensaiada através da medição da atividade neural (por exemplo, atividade elétrica). A função do esôfago é ensaiada através da medição da habilidade do esôfago em levar comida para o estômago. A função cardíaca é ensaiada através de eletrocardiograma. A função pancreática é ensaiada através da medição da produção de insulina. A função intestinal é ensaiada através da medição da habilidade dos conteúdos intestinais em passar pelo intestino, e pode ser avaliada usando um enema de bário ou série gastrointestinal. A função da vesícula biliar é ensaiada usando uma varredura de radionuclídeo da vesícula biliar. A função do rim é ensaiada através da medição dos níveis de creatinina, níveis de creatinina na urina ou através de testes clínicos quanto à excreção de creatinina ou nitrogênio ureia no sangue. A função do fígado é ensaiada usando testes de função do fígado ou um painel de fígado que mede os níveis de enzima no fígado, níveis de bilirrubina e níveis de albumina. A função do pulmão é ensaiada usando espirometria, volume do pulmão e testes de capacidade de difusão. A função do ovário é ensaiada através da medição dos níveis de hormônios ovarianos (por exemplo, hormônio de estimulação de folículo). Anormalidade na próstata é ensaiada através da medição do antígeno específico de próstata. A função do baço é ensaiada usando uma varredura de fígado-baço. A função do estômago é ensaiada usando um teste de ácido do estômago ou ensaiando o esvaziamento gástrico. A função testicular é ensaiada através da medição dos níveis de hormônios testiculares (por exemplo, testosterona). Outros métodos para ensaio de função de órgão são conhecidos do versado na técnica e são descritos, por exemplo, no Textbook of medical Physiology, Décima edição (Guyton e outros, W.B. Saunders, Co., 2000).

COMPOSIÇÕES DE IAIP

[051] Conforme aqui usado, "composição de IαIp"refere-se a uma preparação de proteínas IαIp, incluindo IαI e PαI em proporções fisiológicas. Proporções fisiológicas, conforme aqui usado, pretende incluir proporções encontradas em uma pessoa ou animal que não está sofrendo de uma infecção ou condição e/ou a razão de IαI para PαI que aparece naturalmente em plasma humano. As proporções fisiológicas estão geralmente entre cerca de 60% a cerca de 80% de IαI e entre cerca de 40% a cerca de 20% de PαI. As proporções fisiológicas podem variar dessas faixas devido a variações normais em formação genética de indivíduos.

[052] Conforme aqui usado, "complexo de IαIp"pretende compreender todas as variantes biologicamente ativas de ocorrência natural das proteínas IαIp, incluindo proteínas contendo deleções, inserções, adições e substituições. Uma "variante natural" de uma proteína IαIp é definida como um peptídeo obtido de plasma tendo uma sequência que é alterada por um ou mais aminoácidos. A variante pode ter mudanças "conservativas", onde um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, substituição de leucina com isoleucina. Em outras modalidades, uma variante pode ter mudanças "não-conservativas", por exemplo, substituição de uma glicina com um triptofano. Variações similares podem também incluir deleções ou inserções de aminoácido ou ambas. Orientação na determinação de quais e quantos resíduos de aminoácido podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir atividade biológica ou imunológica pode ser encontrada usando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, software DNASTAR. "Funcionalmente equivalente" conforme aqui usado refere-se a qualquer proteína capaz de exibir uma atividade in vitro ou in vivo substancialmente similar às proteínas IαIp descritas aqui, por exemplo, que afetam uma diminuição em sepse.

[053] Conforme aqui usado, "mistura de proteína inibidora inter-alfa (IαI) e proteína pré-alfa (PαI)"refere-se a uma composição contendo ambos os complexos de IαI e PαI. A mistura pode também conter tampões, sais ou outros componentes que são usados para isolar o complexo de IαIp. Em certos aspectos, a IαI e a PαI estão presentes na mistura em uma proporção fisiológica.

[054] IαI e a PαI presentes na fração de plasma têm um peso molecular aparente entre cerca de 60 a cerca de 280 kDa. O peso molecular pode ser determinado através de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio.

[055] As composições de IαIp da invenção podem ter uma atividade específica inibidora de tripsina alta. A atividade específica inibidora de tripsina das composições de IαIp de acordo com a invenção podem variar entre cerca de 100 a cerca de 200 UI/mg. Preferivelmente, a atividade específica do inibidor de tripsina está acima de 120 UI/mg e ainda mais preferivelmente acima de 150 UI/mg. A atividade específica do inibidor de tripsina pode ser medida, por exemplo, através do ensaio de inibição de tripsina usando L-BAPA como um substrato. Vide, H.U. Bergmeyer, ed.: Vol. 5, 35 ed., 119 (1984) Verlag Chemie, Weinheim: Chromogenic substrate for the assay of trypsin: R. Geiger, H. Fritz, Methods of Enzymatic Analysis.

[056] Uma composição de IαIp pode ser uma mistura de proteína inibidora inter-alfa (IαI) e proteína pré-alfa (PαI), onde a IαI e a PαI estão presentes na dita mistura em uma proporção fisiológica compreendendo uma proteína inibidora inter-alfa de cadeia leve associada com pelo menos uma de três cadeias pesadas H1, H2 e H3. Uma composição de acordo com a invenção pode também ter uma cadeia leve de proteína inibidora inter-alfa associada com pelo menos uma de quatro cadeias pesadas H1, H2, H3 e H4. Exemplos de cada proteína no complexo IαIp são como segue: Bikunina Número de acesso no GenBank: AAB84031, P02760; H1 Número de acesso no GenBank: P19827, NP--002206; H2 Número de acesso no GenBank: NP--002207, P19823; H2 Número de acesso no GenBank: NP--002208; H4 Número de acesso no GenBank: Q14624, NP--002209, que são cada uma aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA INIBIDORA INTER-ALFA (IAIP)

[057] IαIp pode ser purificada através de cromatografia. "Purificação", conforme aqui usado, refere-se a etapas ou processos de remoção de proteínas ou componentes indesejados ou contaminantes de uma IαIp para produzir uma IαIp purificada. Por exemplo, uma fração de plasma contendo IαI e PαI em proporção fisiológica pode ser ativada através de pelo menos uma etapa de cromatografia para purificar a IαIp. Conforme aqui usado, "cromatografia" pode incluir cromatografia líquida ou cromatografia de coluna. É conhecido na técnica que cromatografia tem muitas descrições e/ou classificações que não são mutuamente exclusivas. Por exemplo, cromatografia líquida pode ser realizada em uma coluna. Cromatografia de coluna pode incluir cromatografia de troca de ânion.

[058] Tipicamente, preparação de IαIp envolve isolamento da amostra e coleta de frações determinadas conter as proteínas de interesse. Métodos de isolamento incluem, por exemplo, extração de fase sólida, cromatografia, por exemplo, cromatografia de troca de ânion, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca de íon, cromatografia de heparina, cromatografia de afinidade, extração sequencial, eletroforese em gel e cromatografia líquida. Preparação pode também incluir purificação, que pode incluir as etapas de cromatografia, por exemplo, cromatografia de troca de íon, cromatografia de heparina, cromatografia de afinidade, extração sequencial, eletroforese em gel e cromatografia líquida.

[059] "Suporte sólido"refere-se a um material sólido que pode ser derivatizado com, ou de outra maneira ligado a, um reagente de captura. Suportes sólidos exemplares incluem suportes monolíticos, suportes à base de partícula, sondas e placas de microtitulação. Conforme aqui usado, "suportes à base de partícula"refere-se a partículas homogêneas para revestimento de uma coluna de cromatografia, incluindo resinas cromatográficas.

[060] "Analito"refere-se a qualquer componente de uma amostra que é desejado ser detectado. O termo pode se referir a um componente único ou uma pluralidade de componentes na amostra.

[061] "Adsorção"refere-se a uma ligação não-covalente detectável de um analito a um reagente adsorvente ou de captura. Uma superfície adsorvente refere-se a uma superfície à qual é ligado um adsorvente (também chamado um "reagente de captura" ou um "reagente de afinidade"). Um adsorvente é qualquer material capaz de ligação a um analito (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico alvo).

[062] Um adsorvente cromatográfico refere-se a um material tipicamente usado em cromatografia. Adsorventes cromatográficos incluem, por exemplo, materiais de troca de íon, quelantes de metal (por exemplo, ácido nitrilotriacético ou ácido iminodiacético), quelatos de metal imobilizados, adsorventes de interação hidrofóbica, adsorventes de interação hidrofílica, corantes, biomoléculas simples (por exemplo, nucleotídeos, aminoácidos, açúcares simples e ácidos graxos) e adsorventes de modo misto (por exemplo, adsorventes de atração hidrofóbica/repulsão eletrostática).

[063] Um adsorvente bioespecífico refere-se a um adsorvente compreendendo uma biomolécula, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um aptâmero), um polipeptídeo, um polissacarídeo, um lipídeo, um esteroide ou um conjugado desses (por exemplo, uma glicoproteína, uma lipoproteína, um glicolipídeo, um ácido nucleico (por exemplo, conjugado de DNA-proteína). Em certos casos, o adsorvente bioespecífico pode ser uma estrutura macromolecular tal como um complexo multiproteína, uma membrana biológica ou um vírus. Exemplos de adsorventes bioespecíficos são anticorpos, proteínas receptoras e ácidos nucleicos. Adsorventes bioespecíficos tipicamente têm especificidade maior para um analito alvo do que adsorventes cromatográficos.

[064] "Eluente" ou "tampão de lavagem" refere-se a um agente, tipicamente uma solução, que é usado para afetar ou modificar adsorção de um analito a uma superfície adsorvente e/ou remover materiais não-ligados da superfície. As características de eluição de um tampão de lavagem ou eluente podem depender, por exemplo, do pH, resistência iônica, hidrofobicidade, grau de caotropismo, resistência do detergente e temperatura. Em algumas modalidades da invenção, o método de purificação envolve pelo menos uma etapa de lavagem com tampão. Nos métodos da invenção, uma etapa de lavagem com tampão envolve aplicação de um tampão de lavagem tendo um pH baixo à coluna (por exemplo, 4,0, 3,7, 3,5, 3,4, 3,3, 3,1, 2,9, 2,0). Em uma modalidade, o tampão de lavagem com pH baixo tem um pH de menos do que cerca de 4,0. Em uma modalidade preferida, a solução de lavagem tem um pH de menos do que cerca de 3,6. Em uma modalidade ainda mais preferida, a solução de lavagem tem um pH de menos do que cerca de 3,3. Mais preferivelmente, a solução de lavagem tem um pH de menos do que cerca de 3,3 a cerca de 2,9. Em outras modalidades, o método de purificação envolve mais de uma etapa de lavagem com tampão. É preferido que a etapa de lavagem com tampão subsequente tenha um pH menor do que a etapa de lavagem com tampão precedente. Em uma modalidade, o primeiro tampão de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 e o segundo tampão de lavagem tem um pH de cerca de 3,6. Em outra modalidade, o primeiro tampão de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 e o segundo tampão de lavagem tem um pH de cerca de 3,1. Em outra modalidade, o primeiro tampão de lavagem tem um pH de cerca de 4,0 e o segundo tampão de lavagem tem um pH de cerca de 2,9. Em modalidades da invenção, o tampão de lavagem é ácido acético ou acetato de sódio. Outros tampões de lavagem adequados para uso na invenção incluem ácido cítrico, glicina ou tampão de fosfato. Em ainda outras modalidades, o método de purificação envolve uma etapa de lavagem com um tampão contendo sal. É preferido que a concentração de sal no tampão contendo sal seja maior do que 250 mM de NaCl (por exemplo, 260, 270, 280, 290 mM de NaCl). Em uma modalidade, o primeiro tampão de lavagem tem uma concentração de sal de 290 mM de NaCl e o segundo tampão de lavagem tem um pH de cerca de 2,9. Foi constatado que a adição da etapa de lavagem com sal ao protocolo de purificação envolvendo uma etapa de pH baixo aumenta o rendimento e a pureza da IαIp o que não acontece quando a etapa de lavagem com sal está ausente. Em modalidades da invenção, o sal no tampão de lavagem contendo sal é cloreto de sódio (NaCl). Outros sais adequados para uso na invenção incluem cloreto de potássio (KCl).

[065] Cromatografia de troca de ânion pode ser através de suporte monolítico, por exemplo, CIM com ligantes de troca de ânion imobilizados tal como DEAE-CIM ou Q-CIM (BIA Separations). Cromatografia de troca de ânion pode ser também baseada em partícula, por exemplo, DEAE Sepharose, DEAE Sephadex A50, Toyopearl DEAE, TMAE Fractogel, DEAE Fractogel ou Q- Sepharose. SEPHAROSE é uma marca registrada da Pharmacia, Inc. de Nova Jersey para uma substância de peso molecular alto para a separação através de filtragem em gel de macromoléculas. Colunas de troca de ânion têm dois componentes, uma matriz e um ligante. A matriz pode ser, por exemplo, celulose, dextranos, agarose ou poliestireno. O ligante de troca de ânion imobilizado pode ser dietilaminoetano (DEAE), polietilenoimina (PEI) ou um grupo funcional amina quaternária (Q). A resistência de uma coluna de troca de ânion refere-se ao estado de ionização do ligante. Colunas de troca aniônica forte, tais como aquelas tendo um ligante de amônio quaternário, carregam uma carga positiva permanente em uma faixa de pH ampla. Em colunas de troca de ânion fraca, tais como DEAE e PEI, a existência da carga positiva depende do pH da coluna. Colunas de troca de ânion forte tais como Q Sepharose FF ou Sepharose de quelação de metal (por exemplo, Sepharose de quelação de Cu2+) são preferidas. Colunas de troca de ânion são geralmente carregadas com um tampão com pouco sal em um pH acima do pH da proteína a ser purificada. A seleção de tampões, concentrações de tampão, concentrações de sal e eluentes são conhecidas do versado na técnica (por exemplo, vide Scopes "Protein Purification: Principles and Practice" Springer; 3^ edição (19 de novembro de 1993)).

[066] Em uma modalidade da invenção, uma amostra pode ser purificada através de cromatografia de troca de ânion. Cromatografia de troca de ânion permite a purificação da proteína em uma amostra mais ou menos de acordo com suas características de carga. Por exemplo, uma resina de troca de ânion Q pode ser usada (por exemplo, Q HyperD F, Biosepra) e uma amostra pode ser sequencialmente eluída com eluentes tendo pHs diferentes. Cromatografia de troca de ânion permite separação de biomoléculas em uma amostra que são mais negativamente carregadas de outros tipos de biomoléculas. As proteínas que são eluídas com um eluente tendo um pH alto é provável que sejam fracamente negativamente carregadas, e uma fração que é eluída com um eluente tendo um pH baixo é provável de ser fortemente negativamente carregada. Desta maneira, em adição à redução da complexidade de uma amostra, cromatografia de troca de ânion separa proteínas de acordo com suas características de ligação.

[067] Em ainda outra modalidade, uma amostra pode ser purificada mais através de cromatografia com heparina. Cromatografia com heparina permite purificação adicional dos complexos de IαIp em uma amostra também com base na interação de afinidade com heparina e características de carga. A heparina, um mucopolissacarídeo sulfatado, se ligará a complexos de IαIp com porções positivamente carregadas e uma amostra pode ser sequencialmente eluída com eluentes tendo pHs ou concentrações de sal diferentes. Complexos de IαIp eluídos com um eluente tendo um pH baixo são mais prováveis de ser fracamente positivamente carregados. Complexos de IαIp eluídos com um eluente tendo um pH alto são mais prováveis de ser fortemente positivamente carregados. Desta maneira, cromatografia com heparina também reduz a complexidade de uma amostra e separa complexos de IαIp de acordo com suas características de ligação. Em outra modalidade, uma amostra pode ser purificada mais através de cromatografia com hidroxiapatita. Em ainda outra modalidade, uma amostra pode ser purificada mais através de cromatografia de interação hidrofóbica.

[068] Complexos de IαIp podem então ser capturados com reagentes de captura imobilizados em um suporte, tal como qualquer biochip, uma placa de microtitulação multicavidade, uma resina ou membranas de nitrocelulose que são subsequentemente testadas quanto à presença de proteínas. Em particular, os complexos de IαIp da presente invenção podem ser capturados em biochips de proteína de Dessorção/Ionização a Laser Realçado na Superfície (SELDI). A captura pode ser em uma superfície cromatográfica ou uma superfície bioespecífica. Qualquer um dos biochips de proteína de SELDI compreendendo superfícies negativas pode ser usado para capturar e detectar os complexos de IαIp da presente invenção. Esses biochips podem ser derivatizados com os anticorpos que capturam especificamente os complexos de IαIp ou eles podem ser derivatizados com reagentes de captura, tal como proteína A ou proteína G, que ligam imunoglobulinas. Então os complexos de IαIp podem ser capturados em solução usando anticorpos específicos e os complexos de IαIp capturados isolados em um chip através do reagente de captura.

[069] A purificação de IαIp pode ser extrapolada de acordo com volume e quantidade. Em algumas modalidades, uma coluna de 1 mL ou 8 mL é usada para purificar IαIp. Em outras modalidades uma coluna de 80 mL, 800 mL ou 8 L é usada para purificar IαIp.

[070] Tipicamente a IαIp purificada é trocada em um tampão para manter a estabilidade ou atividade após eluição a partir da coluna. A IαIp purificada pode ser também processada através de ultrafiltragem ou diafiltragem para remover contaminantes de proteína de peso molecular baixo. Em algumas modalidades, etapas de inativação viral são incorporadas à purificação. Antes da separação cromatográfica, um tratamento do plasma com solvente e detergente pode ser usado para inativar partículas de vírus. Após ultrafiltragem ou diafiltragem a IαIp purificada pode ser processada mais através de Nanofiltragem (por exemplo, para inativar vírus). IαIp purificada pode ser também liofilizada e embalada para armazenamento a longo prazo (empilhada).

[071] As composições de IαIp da invenção são preferivelmente de a partir de cerca de 85% a cerca de 100% puras. Conforme aqui usado, o termo "puro" refere-se à composição de IαIp que é removida de seu ambiente natural, isolada ou separada, e é pelo menos entre cerca de 85% a cerca de 100% livre, preferivelmente 90% livre e mais preferivelmente 95% livre, de outros componentes com os quais ela está naturalmente associada. Em modalidades preferidas, uma proteína substancialmente purificada vai constituir mais de 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 99% ou ainda mais das proteínas na composição.

[072] Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína que é "purificado até homogeneidade", conforme aplicado à presente invenção, significa que o peptídeo, polipeptídeo ou proteína tem um nível de pureza onde o peptídeo, polipeptídeo ou proteína é substancialmente livre de outras proteínas e componentes biológicos. Quaisquer materiais e métodos adequados podem ser usados para realizar a etapa ou etapas de isolamento de plasma sanguíneo para obter IαIp purificada.

[073] Vários métodos para quantificação do grau de purificação de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos serão conhecidos daqueles versados na técnica à luz da presente invenção. Esses incluem, por exemplo, determinação da atividade de proteína específica de uma fração ou avaliação do número de polipeptídeos dentro de uma fração através de eletroforese em gel. O termo "biologicamente ativo"refere-se a ter funções estruturais, reguladoras ou bioquímicas de um complexo de IαIp de ocorrência natural. Da mesma maneira "imunologicamente ativo" define a capacidade do complexo de IαIp natural, recombinante ou sintético, ou qualquer outro oligopeptídeo do mesmo, em induzir uma resposta imune específica em animais ou células apropriados e se ligar com anticorpos específicos. As concentrações de IαIp podem ser medidas através de um ensaio de imunoabsorção por ligação à enzima (ELISA) usando Mab 69.31 conforme descrito em Lim (J. of Infectious Disease, 2003). No ELISA competitivo, anticorpos que se ligam à cadeia leve de IαIp, por exemplo, Mab 69.26 e Mab 69.31 (Lim e outros, J. of Infectious Diseases, 2003), podem ser usados para detectar se o sítio ativo de IαIp é exposto. Quando usando anticorpos que se ligam à cadeia leve de IαIp no ELISA competitivo, uma medição maior obtida do que seria previsto com base em concentração de proteína pode indicar que o sítio ativo de IαIp está exposto. A ligação de anticorpo anti-IαIp à IαIp purificada é aumentada em mais de 1-, 1,5-, 2-, 3-, 4-, 5- ou 10- vezes, conforme determinado através de ELISA competitivo. Métodos para a medição de concentração de proteína são conhecidos na técnica e pode ser também medida através de ensaios de proteína comercialmente disponíveis (Ensaios de proteína do ácido bicinoninic (BCA); ensaio de proteína BioRad). A estrutura e a pureza do produto de IαIp podem ser confirmadas através de, por exemplo, HPLC ou outro método cromatográfico conhecido de um versado na técnica. Atividade inibidora especifica de IαIp purificada pode ser medida em um ensaio de inibição de tripsina usando o substrato cromogênico L-BAPA cloridrato de (N(alfa)-Benzoil-L-arginina-4-nitroanilida (Fluka Chemicals). Este ensaio é baseado na habilidade de IαIp em inibir a hidrólise de L-BAPA. Inibição pode ser monitorada através de uma diminuição na taxa de Δ absorbância/minuto a 410 nm.

[074] IαIp purificada tem um peso molecular aparente entre cerca de 60 a cerca de 280 kDa. O peso molecular pode ser determinado através de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. A IαIp purificada também tem atividade biológica (por exemplo, atividade inibidora de citocina, atividade inibidora de quimiocina ou atividade inibidora de serina protease) que pode ser determinada através de métodos descritos aqui ou conhecidos na técnica. IαIp purificada tem atividade biológica pelo menos igual comparado com aquela de IαIp não tratada com pH baixo incluindo IαIp presente em sangue, plasma ou frações de plasma ou IαIp purificada através de outros meios.

[075] O método também se presta à quantificação de proteína inibidora inter-alfa (IαIp) em uma amostra de concentração de IαIp desconhecida. A amostra de concentração de IαIp desconhecida é aplicada a uma coluna de cromatografia. Em algumas modalidades, o volume da coluna de cromatografia é menos do que 1 mL. A coluna à qual a amostra é aplicada é lavada com um tampão de pH baixo (por exemplo, pH de menos do que 4,0). A coluna é subsequentemente eluída com um tampão com alto teor de sal (por exemplo, >500 mM). A proteína eluída, consistindo substancialmente em IαIp (por exemplo, pureza de >90%), é medida através de métodos conhecidos na técnica para determinação da concentração de proteína. Tais métodos podem incluir absorbância de UV, ensaios de proteína ou um ELISA competitivo para determinação da concentração de IαIp, conforme aqui descrito. A quantidade de IαIp presente na amostra pode ser obtida através da comparação da quantidade da proteína com uma ou mais referências. Tais referências incluem amostras contendo quantidades conhecidas de IαIp que foram processadas através do método usado para processar a amostra de concentração de IαIp desconhecida.

SANGUE, PLASMA E FRAÇÕES DO PLASMA

[076] Devido ao fato da IαIp ser abundante no sangue, a IαIp é tipicamente purificada a partir de sangue, plasma sanguíneo ou uma fração de plasma sanguíneo isolada de plasma sanguíneo. "Isolamento" conforme aqui usado refere-se à produção de uma fração do plasma a partir de plasma sanguíneo, o qual contém IαI e PαI em proporções fisiológicas. Por exemplo, isolamento de uma fração do plasma pode ser conseguido de acordo com a invenção através de cromatografia do plasma sanguíneo. Isolado refere-se a material removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural de sua ocorrência natural) e então é alterado "pela mão do homem" de seu estado natural. Por exemplo, um polipeptídeo ou proteína isolado poderia ser um componente de plasma sanguíneo ou poderia estar contido em uma célula e ser considerado "isolado" porque o plasma sanguíneo ou célula particular poderia não estar no ambiente original do polipeptídeo.

[077] Conforme aqui usado, "derivado do plasma sanguíneo" refere-se a ser originalmente isolado ou purificado de plasma sanguíneo. Isto é, o ambiente neutro da composição é plasma sanguíneo.

[078] Conforme aqui usado, "uma fração de plasma" é uma fração de uma etapa de isolamento ou purificação, por exemplo, cromatografia, que foi originalmente derivada de plasma sanguíneo. As frações de plasma de acordo com a invenção podem ser, por exemplo, uma fração colateral obtida da purificação de fator de coagulação IX, uma fração colateral da purificação de um concentrado de complexo de pró-trombina, um criossobrenadante resultante da crioprecipitação (descrito em Hoffer e outros, Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196) de plasma sanguíneo ou crioplasma pobre. Conforme aqui usado, "crioplasma pobre" ou "criossobrenadante" é o sobrenadante obtido da crioprecipitação de plasma. Crioplasma pobre pode ser preparado através de descongelamento de plasma congelado fresco (por exemplo, a 4 graus Celsius e centrifugação a 10k rpm por 30 minutos).

[079] Ao invés de plasma, este protocolo de purificação pode ser usado em qualquer fração de plasma contendo IαIp. Frações de plasma contendo IαIp incluem frações colaterais ou intermediários de plasma durante o processamento industrial de fatores de coagulação e outros derivados do plasma ou durante o processo de purificação de outras proteínas terapêuticas tais como fatores de coagulação. Um exemplo de uma fração colateral de acordo com a invenção é um obtido da purificação do fator de coagulação IV. Uma mistura de IαI/PαI foi mostrada estar presente em frações colaterais geradas durante a purificação do fator IX (FIX). O método para obtenção da fração colateral obtida da purificação do fator de coagulação IX é descrito em Hoffer e outros, Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Outros exemplos de frações colaterais incluem frações colaterais da purificação de FIX ou uma fração colateral da purificação de uma concentração de complexo de pró-trombina, como é descrito em D. Josic e outros, Thrombosis Research 100 (2000) 433-441, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Outros exemplos de frações colaterais incluem frações colaterais de purificação de FIX chamadas aqui Fração D e Fração C. A Fração D e a Fração C referem-se a frações contendo IαIp obtidas durante a purificação de FIX e outros fatores de coagulação, etc, através de cromatografia de troca de ânion. A Fração D é uma fração contendo IαIp eluída da coluna de troca de ânion sob condições de alto teor de sal (por exemplo, >500 mM de NaCl). A Fração C é uma fração contendo IαIp que é derivada da fração de plasma purificada de uma coluna de troca de ânion e eluída com 25 mM de Citrato, pH 6,0, NaCl 0,5 M. A Fração C é a fração não-ligada, isto é, o fluxo, de uma etapa de purificação por afinidade de anti-Fator IX onde o eluente da coluna de troca de ânion (em 25 mM de Citrato, pH 6,0, NaCl 0,5 M) é aplicado à coluna por afinidade do anti-Fator IX.

[080] Um exemplo de fração colateral isolada como um criossobrenadante resultante de crioprecipitação de plasma sanguíneo. Por exemplo, métodos de crioprecipitação adequados são descritos em Hoffer e outros, Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196.

[081] Sangue e plasma sanguíneo podem ser obtidos de fontes humanas, primatas, bovinas, equinas, porcinas, aviárias, felinas ou caninas. O sangue pode ser adquirido e/ou comprado de, por exemplo, bancos de sangue, hospitais, hospícios, companhias privadas, fundações de pesquisa ou qualquer outra fonte de sangue. O plasma sanguíneo pode ser adquirido e/ou comprado de, por exemplo, bancos de sangue, hospitais, hospícios, companhias privadas, fundações de pesquisa ou qualquer outra fonte de sangue. Alternativamente, plasma sanguíneo pode ser também isolado de sangue uma vez o sangue sendo obtido. Métodos adequados de isolamento de plasma sanguíneo incluem gravidade e centrifugação. Frações do plasma, de acordo com a invenção, podem ser de fontes humanas, primatas, bovinas, equinas, porcinas, aves, felinas ou caninas.

[082] Algumas purificações de IαIp anteriores de frações colaterais continham contaminação pelo fator X (FX), que foi detectado através de análise Western blot como uma faixa de 80 kDa e em um ensaio de coagulação. A remoção de FX é importante porque FX é trombogênico e pode ser perigoso se administrado a humanos. Os métodos de purificação de IαIp descritos aqui removem contaminação por FX. Ainda, tratamento de plasma com um solvente ou detergente antes de separação cromatográfica pode ser realizado para inativar quaisquer vírus presentes no plasma ou fração de plasma.

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[083] A invenção provê o tratamento de doenças e distúrbios associados com uma diminuição em níveis de IαIp ou um aumento no nível de uma quimiocina, citocina ou protease. Muitas doenças ou condições associadas com uma deficiência em número de célula são caracterizadas por um aumento no nível de uma quimiocina, citocina ou protease. Tais doenças ou condições patológicas incluem, mas não estão limitadas a, inflamação, trauma/lesão, invasão de tumor, metástase de tumor, sepse, choque séptico ou uma doença infecciosa. Os métodos da invenção melhoram tais doenças, distúrbios ou lesões ao diminuir o nível ou atividade de uma quimiocina, citocina ou protease.

[084] A presente invenção provê métodos de tratamento de doença e/ou distúrbios ou seus sintomas que compreendem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína IαIp purificada aqui a um indivíduo (por exemplo, um mamífero tal como um ser humano). Desta maneira, uma modalidade é um método de tratamento de um indivíduo sofrendo de ou suscetível a uma doença ou distúrbio ou sintoma do mesmo caracterizada por uma deficiência em IαIp. O método inclui a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapêutica de uma quantidade de uma composição da invenção suficiente para tratar a doença ou distúrbio ou sintoma do mesmo, sob condições de maneira que a doença ou distúrbio seja tratado.

[085] Em várias modalidades, os agentes da invenção são administrados através de injeção local a um sítio de doença ou lesão, através de infusão sustentada ou através de microinjeção sob condições cirúrgicas (Wolff e outros, Science 247:1465, 1990). Em outras modalidades, os agentes são administrados sistemicamente a um tecido ou órgão de um paciente tendo uma deficiência em IαIp.

[086] Os presentes métodos incluem administração ao indivíduo (incluindo um indivíduo identificado como necessitando de tal tratamento) de uma quantidade eficaz de proteína IαIp purificada descrita aqui ou uma composição descrita aqui para produzir tal efeito. Identificação de um indivíduo com necessidade de tal tratamento pode estar no julgamento de um indivíduo ou um profissional de cuidado de saúde e pode ser subjetiva (por exemplo, opinião) ou objetiva (por exemplo, mensurável através de um teste ou método de diagnóstico).

[087] Os métodos terapêuticos da invenção (que incluem tratamento profilático) em geral compreendem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos presentes compostos, tal como um composto da presente fórmula, a um indivíduo (por exemplo, animal, ser humano) com necessidade do mesmo, incluindo um mamífero, particularmente um ser humano. O indivíduo pode ser primata, bovino, equino, porcino, ovino, felino ou canino. Os indivíduos adequados para tratamento com IαIp podem ser identificados como tendo inflamação, trauma/lesão, invasão de tumor, metástase de tumor, sepse, choque séptico ou uma doença infecciosa. Tal tratamento será adequadamente administrado a indivíduos, particularmente humanos, sofrendo de, tendo, suscetíveis a ou sob risco de uma doença, distúrbio ou sintoma do mesmo. A determinação daqueles indivíduos "sob risco" pode ser feita através de qualquer determinação objetiva ou subjetiva através de um teste de diagnóstico ou opinião de um indivíduo ou provedor de cuidado de saúde (por exemplo, teste genético, marcador de enzima ou proteína, Marcador (conforme aqui definido), história familiar e similar). O indivíduo pode ser auto-identificado ou diagnosticado por um praticante de medicina como tendo inflamação, invasão de tumor, metástase de tumor, sepse, choque séptico ou uma doença infecciosa. Os indivíduos podem ser primatas, humanos ou outros animais. As presentes composições podem ser também usadas no tratamento de quaisquer outros distúrbios onde uma deficiência em número de célula pode estar implicada.

[088] Em uma modalidade, a invenção provê um método de monitoramento do progresso do tratamento. O método inclui a etapa de determinação de um nível de marcador de diagnóstico (Marcador) (por exemplo, qualquer alvo delineado aqui modulado por um presente composto, uma proteína ou indicador da mesma, etc) ou medida de diagnóstico (por exemplo, avaliação, ensaio) em um indivíduo sofrendo de ou suscetível a um distúrbio ou sintomas do mesmo associado com uma deficiência em níveis de IαIp ou um aumento nos níveis de quimiocina, citocina ou protease. O indivíduo pode ter sido administrado com uma quantidade terapêutica de um presente composto suficiente para tratar a doença ou sintomas da mesma. O nível de Marcador determinado no método pode ser comparado com níveis conhecidos de Marcador em controles normais saudáveis ou em outros pacientes afligidos para estabelecer o estado de doença do indivíduo. Em modalidades preferidas, um segundo nível de Marcador no indivíduo é determinado no ponto de tempo depois da determinação do primeiro nível, e os dois níveis são comparados para monitorar o curso de doença ou a eficácia da terapia. Em certas modalidades preferidas, um nível de pré-tratamento de Marcador no indivíduo é determinado antes de começar o tratamento de acordo com a presente invenção; este nível de pré-tratamento de Marcador pode então ser comparado com o nível de Marcador no indivíduo depois do tratamento começar, para determinar a eficácia do tratamento.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[089] A presente invenção refere-se a preparações farmacêuticas compreendendo agentes capazes de diminuir os níveis de ou inibir a atividade de citocinas, quimiocina e proteases. Tais preparações têm ambas as aplicações terapêuticas e profiláticas. Os agentes úteis nos métodos descritos aqui incluem aqueles que diminuem o nível de uma citocina, quimiocina ou protease. Se desejado, as composições da invenção são formuladas junto com agentes que diminuem os níveis de citocinas, quimiocinas e proteases presentes na circulação de um indivíduo. Os agentes que diminuem a resposta de citocina ou quimiocina incluem, mas não estão limitados a, anticorpo anti-TNF-alfa ou inibidores de TNF.

[090] Os compostos da invenção podem ser administrados como parte de uma composição farmacêutica. As composições devem ser estéreis e conter uma quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes da invenção em uma unidade de peso ou volume adequada para administração a um indivíduo. As composições e combinações da invenção podem ser parte de uma embalagem farmacêutica, onde cada um dos compostos está presente em quantidades de dosagem individual.

[091] As composições farmacêuticas da invenção a serem usadas para administração profilática ou terapêutica devem ser estéreis. A esterilidade é prontamente conseguida através de filtragem em membranas de filtragem estéreis (por exemplo, membranas de 0,2 μm), através de irradiação gama ou qualquer outro meio adequado conhecido daqueles versados na técnica. As composições de polipeptídeo terapêuticas geralmente são postas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco tendo uma rolha que pode ser furada por uma agulha de injeção hipodérmica. Essas composições serão normalmente armazenadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas ou frascos vedados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição.

[092] Os compostos podem ser combinados, opcionalmente, com um excipiente farmaceuticamente aceitável. O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" conforme aqui usado significa um ou mais de carga, diluentes ou substâncias de encapsulação sólidos ou líquidos compatíveis que são adequados para administração a um ser humano. O excipiente contém preferivelmente quantidades pequenas de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química. Tais materiais são não-tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato, acetato, lactato, tartrato e outros ácidos orgânicos ou seus sais; tris-hidroximetilaminometano (TRIS), bicarbonato, carbonato e outras bases orgânicas e seus sais; antioxidantes, tal como ácido ascórbico; polipeptídeos de peso molecular baixo (por exemplo, menos do que cerca de dez resíduos), por exemplo, poliarginina, polilisina, poliglutamato e poliaspartato; proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulina; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona (PVP), polipropileno glicóis (PPGs) e polietileno glicóis (PEGs); aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, histidina, lisina ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose, sacarose, dextrinas ou derivados de carboidrato sulfatados, tais como heparina, sulfato de condroitina ou dextrano sulfato; íons de metal polivalentes, tais como íons de metal divalentes incluindo íons de cálcio, íons de magnésio e íons de manganês; agentes de quelação, tal como ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA); álcoois de açúcar, tal como manitol ou sorbitol; contra-íons, tal como sódio ou amônio; e/ou tensoativos não-iônicos, tais como polisorbatos ou poloxâmeros. Outros aditivos podem ser também incluídos, tais como estabilizadores, antimicrobianos, gases inertes, repositores de fluido e nutriente (isto é, dextrose de Ringer), repositores de eletrólito, e similar, que pode estar presentes em quantidades convencionais.

[093] As composições, conforme acima descrito, podem ser administradas em quantidades eficazes. A quantidade eficaz vai depender do modo de administração, da condição particular sendo tratada e do resultado desejado. Ela pode depender também do estágio da condição, da idade e da condição física do indivíduo, da natureza de terapia concomitante, se alguma, e fatores similares bem conhecidos do praticante de medicina. Para aplicações terapêuticas, é aquela quantidade suficiente para atingir um resultado medicinalmente desejável.

[094] Com relação a um indivíduo tendo uma doença ou distúrbio caracterizado por uma diminuição em IαIp, uma quantidade eficaz é suficiente para reduzir os níveis ou atividade de uma quimiocina, citocina ou protease; ou suficiente para estabilizar, diminuir ou reduzir um sintoma associado com uma patologia. As composições da presente invenção que podem ser usadas para tratar doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, doença infecciosa ou trabalho de parto prematuro podem ser determinadas diretamente. Em geral, as doses dos compostos da presente invenção seriam de a partir de cerca de 0,01 mg/kg por dia a cerca de 1000 mg/kg por dia. É esperado que doses variando de a partir de cerca de 50 a cerca de 200 mg/kg sejam adequadas. Doses menores vão resultar em certas formas de administração, tal como administração intravenosa. No caso de uma resposta em um indivíduo ser insuficiente na dose inicial aplicada, doses maiores (ou doses eficazmente maiores através de uma via de aplicação diferente, mais localizada) podem ser empregadas até o ponto que a tolerância do paciente permitir. Doses múltiplas por dia são compreendidas para atingir níveis sistêmicos apropriados de uma composição da presente invenção.

[095] Uma variedade de vias de administração está disponível. Os métodos da invenção, falando de um modo geral, podem ser praticados usando qualquer modo de administração que seja medicinalmente aceitável, significando qualquer modo que produza níveis eficazes dos compostos ativos sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Outros modos de administração incluem vias orais, retais, tópicas, intraoculares, bucais, intravaginais, intracisternais, intracerebroventriculares, intratraqueais, nasais, transdermais, dentro/sobre implantes ou parenterais. O termo "parenteral"inclui subcutâneo, intratecal, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal ou infusão. Adminis tração oral pode ser preferida para tratamento profilático por causa da conveniência do paciente bem como o programa de dosagem.

[096] As composições farmacêuticas da invenção podem conter opcionalmente uma ou mais proteínas adicionais conforme desejado. As proteínas ou material biológico adequados podem ser obtidos de plasma de ser humano ou mamífero através de qualquer um dos métodos de purificação conhecidos e disponíveis àqueles versados na técnica; a partir de sobrenadantes, extratos ou lisatos de cultura de tecido recombinante, vírus, levedura, bactérias ou similar que contêm um gene que expressa uma proteína humana ou de mamífero que foi introduzida de acordo com técnicas de DNA recombinante padrão; ou dos fluidos biológicos humanos (por exemplo, sangue, leite, linfo, urina ou similar) ou de animais transgênicos que contêm um gene que expressa uma proteína humana que foi introduzida de acordo com técnicas transgênicas padrão.

[097] As composições farmacêuticas da invenção podem compreender um ou mais compostos de tamponamento de pH para manter o pH da formulação em um nível predeterminado que reflete o pH fisiológico, tal como na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0. O composto de tamponamento de pH usado na formulação líquida aquosa pode ser um aminoácido ou mistura de aminoácidos, tal como histidina ou uma mistura de aminoácidos tal como histidina e glicina. Alternativamente, o composto de tamponamento de pH é preferivelmente um agente que mantém o pH da formulação em um nível predeterminado, tal como na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0, e que não realiza quelação de íons de cálcio. Exemplos ilustrativos de tais compostos de tamponamento de pH incluem, mas não estão limitados a, imidazol e íons de acetato. O composto de tamponamento de pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível predeterminado.

[098] As composições farmacêuticas da invenção podem também conter um ou mais agentes de modulação osmótica, isto é, um composto que modula as propriedades osmóticas (por exemplo, tonicidade, osmolalidade e/ou pressão osmótica) da formulação para um nível que é aceitável para a corrente sanguínea e células sanguíneas de indivíduos recipientes. O agente de modulação osmótica pode ser um agente que não realiza quelação de íons de cálcio. O agente de modulação osmótica pode ser qualquer composto conhecido ou disponível àqueles versados na técnica que modula as propriedades osmóticas da formulação. Um versado na técnica pode determinar empiricamente a adequabilidade de um dado agente de modulação osmótica para uso na formulação da invenção. Exemplos ilustrativos de tipos adequados de agentes de modulação osmótica incluem, mas não estão limitados a: sais, tal como cloreto de sódio e acetato de sódio; açúcares, tais como sacarose, dextrose e manitol; aminoácidos, tal como glicina; e misturas de um ou mais desses agentes e/ou tipos de agentes. O(s) agente(s) de modulação osmótica pode(m) estar presente(s) em qualquer concentração suficiente para modular as propriedades osmóticas da formulação.

[099] As composições compreendendo um composto da presente invenção podem conter íons de metal multivalentes, tais como íons de cálcio, íons de magnésio e/ou íons de manganês. Qualquer íon de metal multivalente que ajude a estabilizar a composição e que não vai afetar de modo adverso os indivíduos recipientes pode ser usado. O versado na técnica, com base nesses critérios, pode determinar íons de metal adequados empiricamente e fontes adequadas de tais íons de metal são conhecidas e incluem sais inorgânicos e orgânicos.

[100]As composições farmacêuticas da invenção podem ser também uma formulação líquida não-aquosa. Qualquer líquido não-aquoso adequado pode ser empregado, contanto que ele proveja estabilidade ao(s) agente(s) ativo(s) contido(s) nele. Preferivelmente, o líquido não-aquoso é um líquido hidrofílico. Exemplos ilustrativos de líquidos não-aquosos adequados incluem: glicerol; dimetil sulfóxido (DMSO); polidimetilsiloxano (PMS); etileno glicóis, tal como etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, polietileno glicol ("PEG") 200, PEG 300 e PEG 400; e propileno glicóis, tais como dipropileno glicol, tripropileno glicol, polipropileno glicol ("PPG") 425, PPG 725, PPG 1000, PPG 2000, PPG 3000 e PPG 4000.

[101]As composições farmacêuticas da invenção podem ser também uma formulação líquida aquosa/não-aquosa mista. Qualquer formulação líquida não- aquosa adequada, tais como aquelas descritas aqui, pode ser empregada junto com qualquer formulação líquida aquosa, tais como aquelas descritas acima, contanto que a formulação líquida aquosa/não-aquosa mista proveja estabilidade para o composto contido nela. Preferivelmente, o líquido não- aquoso em tal formulação é um líquido hidrofílico. Exemplos ilustrativos de líquidos não-aquosos adequados incluem: glicerol; DMSO; PMS; etileno glicóis, tais como PEG 200, PEG 300 e PEG 400; e propileno glicóis, tais como PPG 425, PPG 725, PPG 1000, PPG 2000, PPG 3000 e PPG 4000.

[102]Formulações estáveis adequadas podem permitir armazenamento dos agentes ativos em um estado líquido congelado ou não congelado. Formulações líquidas estáveis podem ser armazenadas em uma temperatura de pelo menos -70°C, mas podem ser também armazenadas em temperaturas maiores de pelo menos 0°C e entre cerca de 0,1°C e cerca de 42°C, dependendo das propriedades da composição. É geralmente conhecido dos versados na técnica que proteínas e polipeptídeos são sensíveis a mudanças em pH, temperatura e uma multiplicidade de outros fatores que podem afetar a eficácia terapêutica.

[103]Outros sistemas de aplicação podem incluir sistemas de liberação temporizada, liberação retardada ou liberação sustentada. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas de composições da invenção, aumentando a conveniência para o indivíduo e o médico. Muitos tipos de sistemas de aplicação de liberação estão disponíveis e conhecidos dos versados comuns na técnica. Eles incluem sistemas à base de polímero tais como polilactídeos (Patente U.S. No. 3.773.919; Patente Europeia No. 54.481), poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácidos pol- hidroxibutíricos, tal como ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (Patente Europeia No. 133.988), copolímeros de ácidoL-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman, K.R. e outros, Biopolymers, 22: 547-556), poli (metacrilato de 2- hidroxietila) ou acetato de etileno vinila (Langer, R. e outros, J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277; Langer, R. Chem. Tech. 12:98-105) e polianidridos.

[104]Outros exemplos de composições de liberação sustentada incluem matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Sistemas de aplicação também incluem sistemas de não-polímero que são: lipídeos incluindo esteróis tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras tais como mono-, di- e tri-glicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel tal como hidrogel biorreabsorvível biologicamente derivado (isto é, hidrogéis de quitina ou hidrogéis de quitosana); sistemas silásticos; sistemas baseados em peptídeo; revestimentos cerosos; comprimidos prensados usando ligantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e similar. Exemplos específicos incluem, mas não estão limitados a: (a) sistemas de erosão onde o agente está contido em uma forma dentro de uma matriz tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos. 4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 e 5.239.660 e (b) sistemas de difusão onde um componente ativo permeia em uma taxa controlada de um polímero tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 3.832.253 e 3.854.480.

[105]Outro tipo de sistema de aplicação que pode ser usado com os métodos e composições da invenção é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidais incluem sistemas à base de lipídeo incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Os lipossomas são recipientes de membrana artificiais que são úteis como um vetor de aplicação in vivo ou in vitro. Recipientes unilamelares grandes (LUV), que variam em tamanho de a partir de 0,2-4,0 μm, podem encapsular macromoléculas grandes dentro do interior aquoso e ser aplicados a células em uma forma biologicamente ativa (Fraley, R. e Papahadjopoulos, D., Trends Biochem. Sci. 6: 77-80).

[106]Os lipossomas podem ser direcionados a um tecido particular através de acoplamento do lipossoma a um ligante específico tal como um anticorpo monoclonal, açúcar, glicolipídeo ou proteína. Os lipossomas estão comercialmente disponíveis da Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN® e LIPOFECTACE®, que são formados de lipídeos catiônicos tais como cloreto de N- [1-(2,3-dioleilóxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Métodos para fabricação de lipossomas são bem conhecidos na técnica e foram descritos em muitas publicações, por exemplo, na DE 3.218.121; Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de Patente Japonês 83-118008; Patente U.S. No. 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. Lipossomas foram também revistos por Gregoriadis, G., Trends Biotechnol. 3:235-241).

[107]Outro tipo de veículo é uma micropartícula ou implante biocompatível que é adequado para implante no recipiente mamífero. Implantes bioerosivos exemplares que são úteis de acordo com o presente método são descritos no Pedido Internacional PCT No. PCT/US/03307 (Publicação No. WO 95/24929 intitulado "Polymeric Gene Delivery System"). O PCT/US/0307 descreve matrizes poliméricas biocompatíveis, preferivelmente biodegradáveis, para conter um gene exógeno sob o controle de um promotor apropriado. As matrizes poliméricas podem ser usadas para obter liberação sustentada do gene exógeno ou produto de gene no indivíduo.

[108]A matriz polimérica está preferivelmente na forma de uma micropartícula tal como uma microesfera (onde um agente é disperso em uma matriz polimérica sólida) ou uma microcápsula (onde um agente é armazenado no núcleo de uma casca polimérica). As microcápsulas dos polímeros acima contendo fármacos são descritas na, por exemplo, Patente U.S. 5.075.109. Outras formas da matriz polimérica para conter um agente incluem películas, revestimentos, géis, implantes e stents. O tamanho e a composição do dispositivo de matriz de polímero são selecionados para resultar em cinética de liberação favorável no tecido onde a matriz é introduzida. O tamanho da matriz polimérica é ainda selecionado de acordo com o método de aplicação que deve ser usado. Preferivelmente, quando uma via aerossol é usada a matriz polimérica e a composição são compreendidas em veículo tensoativo. A composição de matriz polimérica pode ser selecionada para ter ambos taxas de degradação favoráveis e também ser formada de um material, que é um bioadesivo, para aumentar mais a eficácia de transferência. A composição de matriz pode ser também selecionada para não degradar, mas ao contrário para liberar através de difusão durante um período de tempo prolongado. O sistema de aplicação pode ser também uma microesfera biocompatível que é adequada para aplicação específica de sítio, local. Tais microesferas são descritas em Chickering, D. E. e outros, Biotechnol. Bioeng., 52: 96-101; Mathiowitz, E. e outros, 386: 410 414.

[109]Ambas as matrizes poliméricas não-biodegradáveis e biodegradáveis podem ser usadas para aplicar as composições da invenção ao indivíduo. Tais polímeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. O polímero é selecionado com base no período de tempo durante o qual liberação é desejada, geralmente da ordem de algumas horas a um ano ou mais. Tipicamente, liberação durante um período variando entre algumas horas a três a doze meses é mais desejável. O polímero está opcionalmente na forma de um hidrogel que pode absorver até cerca de 90% de seu peso em água e ainda é opcionalmente reticulado com íons multivalentes ou outros polímeros.

[110]Polímeros sintéticos exemplares que podem ser usados para formar o sistema de aplicação biodegradável incluem: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, polialquileno tereftalatos, álcoois polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, haletos de poli-vinila, polivinilpirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos e copolímeros dos mesmos, alquil celulose, hidroxialquil celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro celuloses, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, metil celulose, etil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil-propil metil celulose, hidroxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, butirato de acetato de celulose, ftalato de acetato de celulose, carboxietil celulose, triacetato de celulose, sal de sulfato de sódio de celulose, poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila), poli(metacrilato de butila), poli(metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de laurila), poli (metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila), poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila), poli(acrilato de octadecila), polietileno, polipropileno, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(etileno tereftalato), poli(vinil álcoois), acetato de polivinila, cloreto de polivinila, poliestireno, polivinilpirrolidona e polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidridos, poli(orto)ésteres, ácido poli(butírico), ácido poli(valérico) e poli(lactídeo-cocaprolactona) e polímeros naturais tal como alginato e outros polissacarídeos incluindo dextrano e celulose, colágeno, seus derivados químicos (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquila, alquileno, hidroxialquilações, oxidações e outras modificações rotineiramente feitas por aqueles versados na técnica), albumina e outras proteínas hidrofílicas, zeína e outras prolaminas e proteínas hidrofóbicas, copolímeros e misturas dos mesmos. Em geral, esses materiais degradam ou através de hidrólise enzimática ou exposição à agua in vivo, através de erosão na superfície ou bruta.

[111]Aqueles versados na técnica vão reconhecer que os melhores regimes de tratamento para uso de compostos da presente invenção para tratar doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, doença infecciosa ou trabalho de parto prematuro podem ser diretamente determinados. Isto não é uma questão de experimentação, mas, ao contrário, de otimização, que é rotineiramente conduzida na técnica médica. Estudos in vivo em camundongos nus frequentemente proveem um ponto de partida a partir do qual começar a otimizar a dosagem e os regimes de aplicação. A frequência de injeção será inicialmente de uma vez por semana e foi feita em alguns estudos de camundongo. No entanto, esta frequência seria opcionalmente ajustada de um dia a cada duas semanas a mensalmente, dependendo dos resultados obtidos a partir dos testes clínicos iniciais e as necessidades de um paciente particular.

[112]As quantidades de dosagem humana podem ser inicialmente determinadas através de extrapolação da quantidade de composto usado em camundongo, como um versado na técnica reconhece é rotina na técnica modificar a dosagem para humanos comparado com modelos animais. Em certas modalidades é pretendido que a dosagem possa variar entre cerca de 1 mg de composto/Kg de peso do corpo a cerca de 5000 mg de composto/Kg de peso do corpo; ou de a partir de cerca de 5 mg/Kg de peso do corpo a cerca de 4000 mg/Kg de peso do corpo ou de a partir de cerca de 10 mg/Kg de peso do corpo a cerca de 3000 mg/Kg de peso do corpo; ou de a partir de cerca de 50 mg/Kg de peso do corpo a cerca de 2000 mg/Kg de peso do corpo; ou de a partir de cerca de 100 mg/Kg de peso do corpo a cerca de 1000 mg/Kg de peso do corpo; ou de a partir de cerca de 150 mg/Kg de peso do corpo a cerca de 500 mg/Kg de peso do corpo. Em outras modalidades esta dose pode ser cerca de 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 mg/Kg de peso do corpo. Em outras modalidades, é pretendido que doses maiores possam ser usadas, tais doses podem estar na faixa de cerca de 5 mg de composto/Kg de peso do corpo a cerca de 20 mg de composto/Kg de peso do corpo. Em outras modalidades, as doses podem ser cerca de 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 mg/Kg de peso do corpo. Com certeza, esta quantidade de dosagem pode ser ajustada para cima ou para baixo, como é rotineiramente feito em tais protocolos de tratamento, dependendo dos resultados dos testes clínicos iniciais e das necessidades de um paciente particular.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO

[113]As composições e métodos da invenção podem ser administrados em combinação com qualquer terapia padrão conhecida na técnica. Por exemplo, os agentes terapêuticos adicionais podem ser agentes anticâncer, agentes anti- inflamatórios, anticoagulantes e imunomoduladores. Por exemplo, didesoxinucleosídeos, por exemplo, zidovudina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddl) e 2',3'-didesoxicitidina (ddC), lamivudina (3TC), estavudina (d4T) e TRIZIVIR (abacavir+zidovudina+lamivudina), não-nucleosídeos, por exemplo, efavirenz (DMP-266, DuPont Pharmaceuticals/Bristol Myers Squibb), nevirapina (Boehringer Ingleheim) e delaviridina (Pharmacia-Upjohn), antagonistas de TAT tais como Ro 3-3335 e Ro 24-7429, inibidores de protease, por exemplo, indinavir (Merck), ritonavir (Abbott), saquinavir (Hoffmann LaRoche), nelfinavir (Agouron Pharmaceuticals), 141 W94 (Glaxo-Wellcome), atazanavir (Bristol Myers Squibb), amprenavir (GlaxoSmithKline), fosamprenavir (GlaxoSmithKline), tipranavir (Boehringer Ingleheim), KALETRA (lopinavir+ritonavir, Abbott) e outros agentes tais como 9-(2-hidroxietoximetil) guanina (aciclovir), interferon, por exemplo, alfa-interferon, interleucina II e fosfonoformato (Foscarnet) ou inibidores de entrada, por exemplo, T20 (efuvirtida Roche/Trimeris) ou UK- 427.857 (Pfizer), levamisol ou timosina, cisplatina, carboplatina, docetaxel, paclitaxel, fluoruracila, capecitabina, gemcitabina, irinotecano, topotecano, etoposídeo, mitomicina, genfitinib, vincristina, vimblastina, doxorrubicina, ciclofosfamida, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, ibuprofeno, naproxeno, cetoprofeno, dexametasona,prednisona,prednisolona,hidrocortisona, acetaminofeno, misonidazol,amifostina,tamsulosina,fenazopiridina, ondansetron, granisetron,alosetron,palonosetron,prometazina, proclorperazina, trimetobenzamida, aprepitanto, difenoxilato com atropina e/o loperamida. Anticoagulantes tais como Anti-trombina III, Proteína C ativada e inibidores de protease tais como inibidores de furina.

[114]Se desejado, um agente que induz reparo ou regeneração de tecido ou previne morte celular é administrado junto com uma proteína IαIp. Tais agentes incluem células-tronco, colágenos, fibronectinas, lamininas, integrinas, fatores angiogênicos, fatores anti-inflamatórios, glicosaminoglicanos, vitrogênio, anticorpos e fragmentos dos mesmos, equivalentes funcionais desses agentes e combinações dos mesmos. As combinações da invenção podem ser administradas concomitantemente ou dentro de algumas horas, dias ou semanas umas das outras. Em uma abordagem, um agente que induz reparo ou regeneração de tecido ou previne morte celular é administrado antes da, concomitante com ou seguindo administração de um agente terapêutico convencional descrito aqui.

KITS

[115]A invenção provê kits para a purificação de uma proteína IαIp. Em uma modalidade, o kit inclui reagentes para a purificação cromatográfica de proteína IαIp. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente estéril que contém um tampão de lavagem de pH baixo (por exemplo, pH 3,1-4,0); tais recipientes podem ser ampolas, garrafas, frascos, tubos, bolsas, sacos, blister packs ou outras formas de recipiente adequadas conhecidas na técnica. Tais recipientes podem ser feitos de plástico, vidro ou outros materiais adequados para conter reagentes.

[116]Se desejado um kit da invenção provê reagentes para a purificação de proteína IαIp junto com instruções para o protocolo de purificação. As instruções vão incluir geralmente informação sobre as condições do tampão e volumes usados no protocolo de purificação. Em outras modalidades, as instruções incluem pelo menos uma das que seguem: descrição dos reagentes ou combinação de reagentes; precauções; avisos; estudos científicos; e/ou referências. As instruções podem ser impressas diretamente como uma folha, panfleto, cartão ou folder separado ou em um recipiente (quando presente) ou rótulo aplicado a um recipiente fornecido em ou com o kit.

[117]A invenção provê kits para o aumento dos níveis de proteína inibidora inter-alfa (IαIp) em um indivíduo ou a diminuição dos níveis de citocina, quimiocina ou protease em um indivíduo. A invenção também provê estojos para o tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou sintomas dos mesmos associados com a diminuição dos níveis de IαIp em um indivíduo ou o aumento dos níveis de citocina, quimiocina ou protease em um indivíduo. Doenças, distúrbios ou sintomas dos mesmos podem incluir doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, trauma/lesão, doença infecciosa ou trabalho de parto prematuro. Em uma modalidade, o kit inclui uma embalagem farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de IαIp purificada. Preferivelmente, as composições estão presentes em forma de dosagem unitária. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente estéril que contém uma composição terapêutica ou profilática; tais recipientes podem ser caixas, ampolas, garrafas, frascos, tubos, bolsas, sacos, blister-packs ou outras formas de recipiente adequadas conhecidas na técnica. Tais recipientes podem ser feitos de plástico, vidro, papel laminado, folha de metal ou outros materiais adequados para conter medicamentos.

[118]Se desejado, as composições da invenção ou combinações das mesmas são providas junto com instruções para administração das mesmas a um indivíduo com necessidade das mesmas. As instruções vão geralmente incluir informação sobre o uso dos compostos para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio condescendente a tratamento com IαIp (por exemplo, doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, metástase de câncer, trauma/lesão, doença infecciosa ou trabalho de parto prematuro). Em outras modalidades, as instruções incluem pelo menos uma das que seguem: descrição do composto ou combinação de compostos; programa de dosagem e administração para níveis de IαIp altos em um indivíduo e/ou diminuição dos níveis de citocina, quimiocina ou protease em um indivíduo; o programa de dosagem e a administração para tratamento de doença inflamatória aguda, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, metástase de câncer, trauma/lesão, doença infecciosa ou trabalho de parto prematuro ou sintomas dos mesmos; precauções; avisos; indicações; contraindicações; informação de superdosagem; reações adversas; farmacologia animal; estudos clínicos; e/ou referências. As instruções podem ser impressas diretamente no recipiente (quando presente) ou como um rótulo aplicado ao recipiente ou como uma folha, panfleto, cartão ou folder separado no ou com o recipiente.

[119]A invenção também provê kits para a análise de proteína inibidora inter-alfa (IαIp) em uma amostra. Em uma modalidade, o kit inclui uma quantidade conhecida de IαIp purificada. A quantidade conhecida de IαIp purificada pode ser usada como uma referência analítica para a medição de IαIp em uma amostra de concentração de IαIp conhecida. Preferivelmente, as composições estão presentes em alíquotas. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente estéril que contém uma alíquota da IαIp purificada; tais recipientes podem ser caixas, ampolas, garrafas, frascos, tubos, bolsas, sacos, blister-packs ou outras formas de recipiente adequadas conhecidas na técnica. Tais recipientes podem ser feitos de plástico, vidro, papel laminado, folha de metal ou outros materiais adequados para conter compostos ou soluções. Em outras modalidades, as instruções incluem pelo menos uma das que seguem: descrição do composto ou combinação de compostos. As instruções podem ser impressas diretamente no recipiente (quando presente) ou como um rótulo aplicado ao recipiente ou como uma folha, panfleto, cartão ou folder separado fornecido no ou com o recipiente.

EXEMPLOS Exemplo 1. IαIp foi purificada em uma etapa cromatográfica única que envolve lavagem com tampão de pH baixo

[120]Um esquema para a purificação de IαIp a partir de plasma humano usando uma etapa cromatográfica única envolve uma lavagem com pH baixo (figura 1A). O protocolo de purificação de IαIp com uma etapa de lavagem de pH baixo foi usado para purificar IαIp a partir de crioplasma pobre. Crioplasma pobre (diluição 1:10 em Tris 25 mM + NaCl 200 mM, pH 7,6: filtrado em 0,2 μm). Plasma diluído (cinquenta (50) volumes de coluna) foi aplicado a uma coluna monolítica DEAE de 1 mL comercialmente disponível (DEAE-CIM; BIA Separations) em uma taxa de fluxo de 5 volumes de coluna (cv) por minuto. A capacidade de ligação da coluna foi prevista ser cerca de 50 mL de plasma diluído por 1 mL de volume de coluna. O fluxo foi coletado. Tampão de diluição de plasma adicional (20 volumes de coluna de Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,6) foi aplicado à coluna para permitir que o material de partida passasse através da coluna completamente. Quando o pico de fluxo retornou para a linha de base, a coluna foi lavada com tampão de lavagem (5 volumes de coluna de Ácido acético 150 mM, pH 4,0 ou Ácido acético 200 mM, pH 3,3) e o pico foi coletado. Após a lavagem de pH baixo, a coluna foi lavada mais com um tampão para aumentar o pH para aquele antes da lavagem com pH baixo (15 volumes de coluna de Tris 100 mM, NaCl 100 mM, pH 7,6) em preparação para a eluição. A proteína ligada foi eluída com um tampão de eluição de teor de sal alto (15 volumes de coluna de Tris 25 mM, Nacl 1000 mM, pH 7,6). O pico foi coletado e esta fração continha IαIp altamente pura. Para trocar tampão e remover solutos e sais de peso molecular baixo, ultrafiltragem ou diafiltragem foi realizada usando um limite de membrana de 30 kDa. A IαIp purificada pode ser também liofilizada.

[121]Fracionamento de quantidades idênticas de plasma através de cromatografia monolítica DEAE usando três tampões de lavagem diferentes em três separações individuais foi usado para determinar o efeito de diminuição do pH durante a etapa de lavagem na purificação da proteína IαIp. Fracionamento de plasma através de cromatografia monolítica DEAE sem uso de uma lavagem de pH baixo (pH 7,6) resultou na eluição de um pico relativamente grande eluído com NaCl 1000 mM (pH 7,6) (Figura 2A). A IαIp purificada tinha um rendimento maior do que 95% de IαIp com uma pureza entre cerca de 10-15%. Aplicação de uma lavagem de pH baixo (pH 4,0) resultou em um pico grande representando a separação de contaminantes adicionais através da lavagem de pH baixo antes da eluição com NaCl 100 mM (pH 7,6). Na fração eluída cerca de 95% de IαIp foram recuperados com 40-50% de pureza (Figura 2B). Diminuição do pH da etapa de lavagem para pH 3,3 resultou em uma redução no tamanho do pico de eluição comparado com aquele em pH 4,0 (Figura 2C). O rendimento da eluição foi cerca de 90% de IαIp em uma pureza de 80-90% (Figura 2C). Esses estudos mostram que diminuição do pH durante a etapa de lavagem resulta em pureza maior de IαIp com redução mínima no rendimento.

[122]Crioplasma pobre que foi separado através de cromatografia monolítica DEAE usando dois tampões de lavagem de pH baixo (Ácido acético 150 mM, pH 4,0 e Ácido acético 200 mM, pH 3,3) foi usado para examinar o efeito sobre o fracionamento das proteínas (Figura 3). Cada lavagem de pH baixo resultou na remoção de uma quantidade de proteína a partir da coluna. Devido ao fato dos dois picos terem sido observados correspondendo à aplicação dos dois tampões de lavagem de pH baixo, este resultado sugere que uma segunda lavagem de pH baixo em pH 3,3 poderia remover mais contaminantes que não foram removidos pela primeira lavagem de pH baixo em pH 4,0. Resultados similares mostrando a remoção de proteínas adicionais por uma segunda etapa de lavagem de pH baixo foram observados quando a Fração D e a Fração C foram usadas como material de partida (figuras 4A-4D).

[123]Frações da purificação de proteína IαIp do material de partida da Fração D através de cromatografia de coluna monolítica DEAE foram também analisadas através de Western blot (Figura 5). Na primeira lavagem de pH baixo (Ácido acético 150 mM, pH 4,0) IαIp (250 kDa) poderia ser detectada. Na segunda lavagem de pH baixo (Ácido acético 200 mM, pH 3,3), um pouco de IαIp (250 kDa e 125 kDa) também ficou sem ligação a partir da coluna e eluiu na não-ligada. No entanto, a quantidade predominante de proteína IαIp purificada foi detectada no eluato. Resultados similares foram observados para a purificação de proteína IαIp a partir do material de partida da Fração C através de cromatografia de coluna monolítica DEAE usando duas lavagens de pH baixo.

[124]A quantificação do rendimento e da pureza foi também determinada para frações a partir da separação de material de partida da Fração D através de cromatografia de coluna monolítica DEAE (DEAE-CIM; BIA Separations) usando duas etapas de lavagem de pH baixo (pH 4,0 e pH 3,3) (Tabela 1). Tabela 1

[125]Análise das frações indicou que mais de >99% da IαIp no material de partida se ligaram à coluna em Tris 25 mM, NaCl 20 mM, pH 7,6, uma vez que cerca de 0,007% da IαIp total foi detectado no fluxo. Aplicação de uma primeira etapa de lavagem (Ácido acético 150 mM, pH 4,0) à coluna resultou na eliminação de uma grande quantidade de contaminantes (~50% de proteína total) com alguma perda de IαIp (4,4% de IαIp total). Aplicação de uma segunda etapa de lavagem (Ácido acético 200 mM, pH 3,3) à coluna resultou na eliminação adicional de uma grande quantidade de contaminantes (~19% de proteína total) com perda aceitável de IαIp (15% de IαIp total). Eluição da proteína ligada restante com alto teor de sal (Tris 25 mM + Nacl 1000 mM, pH 7,6) deu 76% de IαIp total que era 90% pura. Análise das frações se relacionava com a análise Western blotde frações similares (Figura 5). Esta análise mostra que IαIp foi substancialmente purificada em uma etapa cromatográfica única através de lavagem com tampão de pH baixo.

Exemplo 2. Purificação cromatográfica de proteína IαIp com uma etapa de lavagem de pH baixo pode ser extrapolada

[126]Para determinar se o protocolo de purificação de IαIp com a etapa de lavagem de pH baixo poderia ser extrapolado para um volume de coluna maior, cromatografia de crioplasma pobre e frações de plasma intermediário (Fração D e Fração C) foi realizada em uma coluna monolítica DEAE de 8 ml. UV foram similares em frações de crioplasma pobre e plasma intermediário separadas na coluna monolítica DEAE de 1 ml. (Figuras 6A, 6C e 6E). As frações de cada separação cromatográfica foram também analisadas através de SDS-PAGE de não-desnaturação (Figuras 6B, 6D e 6F). Frações eluídas para a purificação dos vários materiais de partida mostraram a presença de faixas de 250 kDa e 125 kDa, que corresponde aos pesos moleculares de proteína IαIp. Desta maneira, purificação de IαIp poderia ser extrapolada até 8 vezes para um volume de coluna maior. Os resultados sugerem que proteína IαIp pode ser purificada com o método de lavagem de pH baixo em uma escala maior (por exemplo, coluna de 800 mL e coluna de 8 L).

Exemplo 3. Proteína IαIp purificada com uma etapa de lavagem de pH baixo mostrou ligação aumentada de anticorpo à IαIp humana em um ensaio ELISA competitivo

[127]Para determinar a quantidade e a qualidade de IαIp purificada em cromatografia de coluna monolítica DEAE com uma lavagem de pH baixo comparado com aquela sem concentrações de IαIp purificada sob ambas as condições foram analisadas através de ensaio de imunoabsorção por ligação à enzima (ELISA) usando MAb 69.31 conforme descrito por Lim e outros (J. of Infectious Diseases, 2003). A fração purificada foi também quantitativamente medida através de um ensaio de proteína do ácido bicinconínico comercialmente disponível (BCA) para determinar a concentração de proteína total. Surpreendentemente, a concentração de IαIp medida através de ELISA competitivo era maior do que a concentração de proteína total medida através do ensaio de proteína BCA para IαIp purificada usando uma condição de lavagem de pH 3,3. A IαIp purificada usando a lavagem de pH baixo foi observada no ELISA competitivo ter uma concentração de 300% maior do que previsto, quando comparado ou com uma quantidade equivalente do material de partida carregado na coluna ou uma quantidade equivalente de IαIp purificada sem uso de uma condição de lavagem de pH baixo. Concentração de IαIp aparente aumentada no ELISA competitivo foi também observada para IαIp purificada usando condições de lavagem de pH baixo de pH 3,6 e 3,3 mas não foi observada para IαIp purificada usando uma condição de lavagem de pH 4,0.

[128]Devido ao fato da proteína total ter permanecido constante nas amostras ensaiadas no ELISA competitivo, este resultado sugere que alguma alteração, ou até mesmo ativação, poderia ser disparada durante a purificação. Sem ser limitado a nenhuma teoria particular, acredita-se que o sítio ativo de IαIp seja exposto através de condições de pH baixo. O anticorpo MAb 69.31 usado no ELISA competitivo reconhece um epítopo que está localizado no sítio ativo das moléculas. Se o sítio ativo fosse exposto, a concentração do ELISA competitivo aumentaria aparentemente para IαIp purificada sob condições de pH baixo, quando controlando a quantidade de proteína sendo medida. Então condições de pH baixo podem bloquear a atividade inibidora de IαIp, desta maneira aumentando a atividade.

[129]Para determinar se a atividade inibidora de IαIp foi alterada pelas condições de pH baixo, a atividade biológica de IαIp foi medida em um ensaio de inibição de tripsina usando o substrato cromogênico cloridrato de L-BAPA (N(alfa)-Benzoil-L-arginina-4-nitroanilida, Fluka Chemicals). Este ensaio mede a atividade inibidora específica com base na habilidade de IαIp em inibir a hidrólise de L-BAPA. Inibição pode ser monitorada por uma diminuição na taxa de Δ absorbância/minuto a 410 nm. Atividade inibidora específica de IαIp purificada com lavagem de pH baixo foi calculada e comparada com aquela de IαIp purificada sem uma lavagem com pH baixo. Condições de pH baixo durante cromatografia (isto é, pH acima de cerca de 3,3) não inativaram ou diminuíram a atividade biológica da IαIp purificada, comparado com IαIp purificada sem usar pH baixo. Esses resultados mostram que IαIp purificada com uma etapa de lavagem de pH baixo é pelo menos tão biologicamente ativa quanto aquela purificada sem usar condições de pH baixo.

Exemplo 4. IαIp foi purificada em uma etapa cromatográfica única que envolve lavagem com um tampão contendo sal e com um tampão de pH baixo

[130]Um esquema para a purificação de IαIp a partir de plasma humano usando uma etapa cromatográfica única envolve uma etapa de lavagem com tampão salino e uma etapa de lavagem de pH baixo (Figura 1B). O protocolo de purificação de IαIp com uma etapa de lavagem com tampão salino e uma etapa de lavagem com pH baixo foi usado para purificar IαIp a partir de crioplasma pobre (Figura 7A). Crioplasma pobre (12,5 volumes de coluna de diluição 1:10 em Tris 40 mM + NaCl 200 mM, pH 7,6; filtrado em 0,2 μM). Plasma diluído foi aplicado a uma coluna monolítica DEAE de 8 mL comercialmente disponível (DEAE-CIM; BIA Separations) em uma taxa de fluxo de 2,5 volumes de coluna (cv) por minuto. O fluxo foi coletado. Tampão de carga adicional (7 volumes de coluna de Tris 25 mM, NaCl 200 mM, pH 7,6) foi aplicado à coluna para permitir que o material de partida passasse através da coluna completamente. Quando o pico de fluxo retornou para a linha de base, a coluna foi lavada com tampão de lavagem contendo sal (10 volumes de coluna de Tris 40 mM-HCl, NaCl 290 mM, pH 7,6) e o pico foi coletado. Após a lavagem com sal, a coluna foi adicionalmente lavada com um tampão de pH baixo (10 volumes de coluna de Acetato de Na 200 mM, pH 2,95) e o pico foi coletado. Seguindo a segunda lavagem, a proteína ligada foi eluída com tampão de eluição de alto teor de sal (5 volumes de coluna de Na-Citrato 40 mM, pH 6,50, NaCl 1000 mM). O pico foi coletado e esta fração continha IαIp altamente pura.

[131]O protocolo de purificação de IαIp com uma etapa de lavagem de tampão com sal e uma etapa de lavagem de pH baixo foi usado para purificar IαIp a partir de fração de plasma intermediário (Fração D) (Figura 7B). Fração de plasma intermediário (2,5 volumes de coluna, diluição 1:10 em Tris 40 mM + NaCl 200 mM, pH 7,6; filtrado em 0,2 μM) foi aplicada a uma coluna monolítica DEAE de 8 mL comercialmente disponível (DEAE-CIM; Separação BIA) em uma taxa de fluxo de 2,5 volumes de coluna (cv) por minuto. O fluxo foi coletado. Tampão de carregamento foi aplicado à coluna para permitir que o material de partida passasse pela coluna completamente. Quando o pico de fluxo retornou para a linha de base, a coluna foi lavada com tampão de lavagem contendo sal (10 volumes de coluna de Tris 40 mM-HCl, NaCl 290 mM, pH 7,6) e o pico foi coletado. Após a lavagem com sal, a coluna foi adicionalmente lavada com um tampão de pH baixo (10 volumes de coluna de Acetato de Na 200 mM, pH 2,95) e o pico foi coletado. Seguindo a segunda lavagem, a proteína ligada foi eluída com tampão de eluição com alto teor de sal (5 volumes de coluna de Citrato de Na 40 mM, pH 6,5, NaCl 1000 mM). O pico foi coletado e esta fração continha IαIp altamente pura.

[132]Quantificação do rendimento e da pureza foi também determinada para frações de separação do material de partida da Fração D através de cromatografia de coluna monolítica DEAE (DEAE-CIM; BIA Separations) usando uma etapa de lavagem de tampão contendo sal (NaCl 290 mM) e uma etapa de lavagem de pH baixo (pH 2,95) (Tabela 2). Tabela 2 (n.d. = não-detectável)

[133]Esta análise mostra que adição de uma etapa de lavagem com tampão com sal a um protocolo de purificação envolvendo uma etapa de lavagem de tampão com pH baixo dá 88,2% de IαIp purificada de uma fração de plasma. Em comparação com os resultados da Tabela 1, a adição de uma etapa de lavagem com tampão com sal a um protocolo de purificação envolvendo uma etapa de lavagem com tampão de pH baixo aumenta o rendimento de IαIp purificada a partir de plasma ou uma fração de plasma.

[134]Ainda, análise SDS-PAGE das frações dos dois métodos mostrou a presença de uma faixa de ~75-80 kDa presente na fração eluída quando uma etapa de lavagem de pH baixo (pH 2,95) foi realizada, mas não quando uma etapa de lavagem com sal (NaCl 290 mM) e uma etapa de pH baixo (pH 2,95) foram ambas realizadas (Figura 8). A fração eluída do protocolo de purificação de IαIp com uma etapa de lavagem com sal e uma etapa de pH baixo consistia substancialmente em duas faixas de proteína correspondendo a inibidor inter alfa (250 kDa) e inibidor pré-alfa (125 kDa). Desta maneira, a fração eluída continha IαIp altamente pura quando o protocolo de purificação envolvia uma etapa de lavagem com sal e uma etapa de pH baixo.

OUTRAS MODALIDADES

[135]A partir do relatório acima, será aparente que variações e modificações podem ser feitas na invenção descrita aqui para adotá-la para vários usos e condições. Tais modalidades estão também dentro do escopo das reivindicações que seguem.

[136]A menção de uma listagem de elementos em qualquer definição de uma presente variável inclui definições dessas variáveis como qualquer elemento único ou combinação (ou subcombinação) de elementos listados. A menção de uma modalidade aqui inclui esta modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.

[137]Todas as patentes e publicações mencionadas no presente relatório são aqui incorporadas a título de referência até o mesmo ponto se cada patente e publicação independente fosse especificamente e individualmente indicada estar incorporada a título de referência.

Claims (2)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende proteínas inibidoras inter-alfa (proteínas IαIp) purificadas por um método compreendendo ligar, em uma etapa de cromatografia ou uma etapa de extração de fase sólida, proteínas IαIp derivadas de sangue, de uma fração de plasma sanguíneo ou de uma fração de plasma intermediário a um suporte monolítico ou à base de partículas compreendendo um ligante de troca aniônica imobilizado; e lavar, em uma etapa de lavagem, as proteínas lαlp ligadas ao suporte por exposição a um tampão de lavagem tendo um pH de 3,6 ou menor; em que o tampão de lavagem tem uma concentração de sal de 250 mM de NaCl ou superior; em que o ligante de troca aniônica imobilizado é um dietilaminoetano (DEAE) ou uma amina quaternária (Q); e em que as referidas proteínas têm uma pureza de proteínas IαIp que varia de 85% a 100%, e em que a composição compreende ainda pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em tampões, antioxidantes, proteínas, polímeros hidrofílicos, aminoácidos, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, íons metálicos polivalentes, agentes quelantes, álcoois de açúcar, contra-íons, tensoativos não iônicos, estabilizantes, antimicrobianos, gases inertes, repositores de fluidos e nutrientes e repositores de eletrólitos.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de doenças inflamatórias agudas, sepse, choque severo, choque séptico, artrite reumatoide, câncer, câncer metastático, trauma/ferimento, doença infecciosa ou parto prematuro.