BRPI0914624B1 - Uso de uma composição que compreende iga secretora e pelo menos um probiótico, e composição alimentícia - Google Patents

Abstract

uso de uma composição que compreende iga secretória e pelo menos um probiótico e composição alimentícia. a presente invenção refere-se genericamente ao campo de nutrição, saúde e bem-estar. particularmente, a presente invenção refere-se a probióticos e maneiras para aumentar sua eficácia. uma modalidade da presente invenção refere-se a uma combinação de probióticos com lga secretória e possíveis usos desta combinação. por exemplo, descreve-se um uso de uma composição que compreende lga secretória e pelo menos um probiótico para a preparação de um produto para tratar ou prevenir infecção.

Description

[0001] A presente invenção se refere genericamente ao campo de nutrição, saúde e bem-estar. Particularmente, a presente invenção se refere a probióticos e maneiras para aumentar sua eficácia. Uma modalidade da presente invenção se refere a uma combinação de probióticos com IgA secretora e possíveis usos desta combinação.

[0002] Uma infecção é a colonização prejudicial de um organismo hospedeiro por espécies estranhas. Usualmente, o organismo infectante tenta utilizar os recursos do hospedeiro para promover sua própria multiplicação. Desta forma, o organismo infectante, ou patógeno, pode interferir com o funcionamento normal do hospedeiro e pode levar a mais distúrbios relacionados a infecções que podem ter uma gravidade e que pode levar no pior caso à morte.

[0003] Caso haja uma sinergia entre o organismo infectante e o hospedeiro, pela qual a relação é benéfica para o organismo infectante, mas prejudicial para o último, isto se caracteriza como parasitismo.

[0004] A lista de doenças ligadas a uma infecção é enorme e os custos associados ao tratamento e prevenção de infecções são significativos.

[0005] O mercado para agentes antibacterianos apenas nos Estados Unidos é considerado como sendo de cerca de 26 bilhões de dólares norte-americanos.

[0006] Uma infecção pode ser tratada atualmente por medicação apropriada. Entretanto, a seleção de uma medicação apropriada requer a definição do tipo de infecção a ser tratada. As infecções bacterianas são frequentemente tratadas com antibióticos antibacterianos. Escolher os antibióticos antibacterianos errados para tratar uma infecção não-viral específica não tratará a infecção e pode mesmo ser nocivo. Além disso, tal medicação pode sempre resultar em efeitos colaterais indesejados e frequentemente requer a supervisão de pessoal médico.

[0007] Adicionalmente, um uso extensivo de antibióticos poderia contribuir para a geração de espécies infecciosas resistentes a antibióticos. A Revista Forbes afirmou em junho de 2006 que as infecções resistentes a fármacos matam mais norte-americanos que a AIDS e o câncer de mama combinados.

[0008] Assim sendo, o desenvolvimento de composições que podem contribuir para reduzir a necessidade de antibióticos na sociedade é presentemente um foco de pesquisa importante.

[0009] Consequentemente, há uma necessidade nessas técnicas de se obter composições não-antibióticas que podem ser administradas, de preferência em base diária, sem efeitos colaterais indesejados e que podem ser usadas de forma segura para tratar ou prevenir infecções, sem a necessidade de definir primeiro a natureza exata do agente causador.

[00010] Uma maneira para atingir este objetivo é administrar uma composição alimentícia que compreende probióticos.

[00011] Os micro-organismos probióticos reconhecidamente têm um efeito benéfico sobre a saúde e o bem-estar do hospedeiro. Nas poucas últimas décadas, o uso de bactérias probióticas ganhou atenção considerável como uma forma segura e acessível de tratamento, por exemplo, para doenças gastrointestinais (Isolauri E., et al., Dig. Dis. Sci. 39:2595-2600 (1994)). As bactérias probióticas típicas que foram empregadas a este respeito pertencem aos gêneros Lactobacillus ou Bifidobacterium.

[00012] A eficácia de probióticos depende, em parte, da sua capacidade de resistir a condições do trato digestivo e aderir ao epitélio intestinal. Além disso, um aspecto crítico que condiciona seu benefício potencial para o hospedeiro é a interação com o ambiente do hospedeiro e seu impacto sobre a barreira epitelial e sua função.

[00013] Embora alguns probióticos já tenham atingido resultado muito respeitável em termos de colonização do trato gastrointestinal e interação com o hospedeiro, seria desejável ter disponível uma ferramenta para melhorar ainda mais a eficácia com a qual os microorganismos probióticos colonizam o intestino.

[00014] Foi, consequentemente, o objetivo da presente invenção oferecer para as técnicas existentes uma composição que tem as mesmas vantagens que a administração de probióticos a um indivíduo que deles necessitam, mas que é ainda mais eficaz em tratar ou prevenir infecções do que a administração de probióticos isoladamente.

[00015] Os presentes inventores atenderam a esta necessidade e constataram que poderiam atingir este objetivo pelo uso de acordo com a reivindicação 1 e uma composição alimentícia de acordo com a reivindicação 13.

[00016] A presente invenção se refere assim a uma composição que compreende anticorpos, particularmente IgA secretora, e pelo menos um probiótico e seu uso para tratar, modular, reduzir e/ou prevenir infecções.

[00017] Os anticorpos são frequentemente glicoproteínas, que reconhecem especificamente antígenos. Em vertebrados, cinco classes de imunoglobulinas são descritas, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, sendo que todas elas diferem em sua função no sistema imunológico. IgA secretora (SIgA), que é a imunoglobulina predominante e mais estável em secreções da mucosa intestinal, demonstrou ser particularmente eficaz para o propósito da presente invenção.

[00018] Sem desejar se atar à teoria, os inventores acreditam que SIgA e probióticos podem formar complexos que podem potencializar a interação de probióticos com o hospedeiro e melhorar seu benefício para a saúde.

[00019] O mecanismo de interação sugerido desta combinação com a mucosa intestinal do hospedeiro está apresentado na Figura 1.

[00020] A primeira interação de probióticos com o hospedeiro ocorre no nível da mucosa intestinal. Dentre os critérios importantes para a seleção de um micro-organismo probiótico está sua capacidade de aderir à mucosa intestinal.

[00021] Esta adesão parece ser necessária para bloquear a entrada de patógenos e contribuir para modular funções imunológicas protetoras, por exemplo.

[00022] Uma das características mais distinguida do sistema imunológico de mucosas na maioria dos mamíferos é a presença dominante de anticorpos secretores, particularmente IgA secretora (SIgA), uma classe de anticorpo singular para mucosas.

[00023] A biossíntese de IgA polimérica ocorre na lamina própria da mucosa, e seu transporte através do epitélio que reveste as superfícies das mucosas é assegurado pelo receptor polimérico de Ig (pIgR) expressado por células epiteliais da cripta e colunares.

[00024] Em secreções, uma parte significativa do pIgR, denominada componente secretor (SC), permanece associada com IgA polimérica, liberando SIgA.

[00025] A liberação de SIgA para dentro do lume é dependente da produção de SC, cuja expressão é regulada de forma ascendente depois do nascimento. pIgR parece ser crítico para a estabilidade de ancoragem do anticorpo na mucosa (Phalipon et al., "Secretory component : A new role in secretory IgA-mediated immune exclusion in vivo", Immunity 17:107-115 (2002)).

[00026] Os neonatos, nos quais os anticorpos SlgA são escassamente detectáveis, dependem de IgG materna transferida através da placenta, e de um suprimento exógeno de SlgA encontrada abundantemente no leite mamário.

[00027] Em conjunto, isto confere imunização passiva no intestino, essencial para a proteção do hospedeiro durante a fase de modelagem e maturação do sistema imunológico gastrointestinal.

[00028] Assim sendo, a composição da presente invenção será particularmente benéfica para recém-nascidos e lactentes (até 2 anos de idade), pois eles não produzem SIgA em quantidades suficientes, mas dependem de suprimento externo.

[00029] Os inventores acreditam presentemente que é esta associação de SIgA com probióticos que potencializa a interação de probióticos com o hospedeiro, de tal modo que os benefícios para a saúde resultantes para o hospedeiro sejam melhorados.

[00030] Os presentes inventores identificaram anticorpos de IgA secretora capazes de se associar com cepas de bactérias comensais.

[00031] Os presentes inventores usaram monocamadas de células epiteliais Caco-2 in vitro para examinar como SIgA favorece a interação entre bactérias não-patogênicas e a superfície epitelial. Duas cepas probióticas representativas dos dois principais gêneros Lactobacilli e Bifidobacteria foram avaliadas como comprovação de princípio, isto é, Lactobacillus rhamnosus NCC4007 (LPR) e Bifidobacterium lactis NCC2818 (BL818).

[00032] Constatou-se que SIgA e/ou SC, quando associados com probióticos, promovem a interação de probióticos com o hospedeiro e modulam a jusante processos envolvidos em mecanismos de defesa.

[00033] Isto contribui para intensificar os benefícios de probióticos para a saúde. Através da sua combinação com probióticos, SIgA e/ou SC poderiam otimamente ajudar a disparar reações de defesa protetora do hospedeiro, incluindo respostas imunes contra infecções por vários patógenos. Dado seu efeito homeostático, SIgA, combinado com probióticos, ajudará a disparar um efeito reforçador imunológico contra infecções e, ao mesmo tempo, prevenindo qualquer processo inflamatório prejudicial potencial.

[00034] Consequentemente, uma modalidade da presente invenção é uma composição que compreende IgA secretora e pelo menos um probiótico para a preparação de um produto para tratar ou prevenir infecções não-virais.

[00035] A presente invenção se refere também ao uso de uma composição que compreende IgA secretora e pelo menos um probiótico para a preparação de um produto para tratar ou prevenir infecções não-virais.

[00036] A presente invenção se refere adicionalmente a uma composição que compreende SIgA e pelo menos um probiótico para uso no tratamento e/ou prevenção de infecções não-virais.

[00037] A presente invenção estende-se a uma composição que compreende SIgA e pelo menos um probiótico para tratar e/ou prevenir infecções não-virais.

[00038] O tratamento de infecções não-virais inclui a redução de infecções não-virais.

[00039] "Probiótico" significa preparações de células microbianas ou componentes de células microbianas com um efeito benéfico sobre a saúde ou bem-estar do hospedeiro (Salminen S., Ouwehand A., Benno Y. et al. "Probiotics: how should they be defined", Trends Food Sci. Technol. 10:107-10 (1999)).

[00040] Todos micro-organismos probióticos podem ser usados de acordo com a presente invenção. De preferência, eles são selecionados no grupo que consiste em Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus e Saccharomyces ou misturas dos mesmos; selecionados particularmente no grupo que consiste em Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii e Lactobacillus reuteri ou misturas dos mesmos, de preferência, selecionados no grupo que consiste em Lactobacillus johnsonii (NCC533; CNCM I-1225), Bifidobacterium longum (NCC490; CNCM I2170), Bifidobacterium longum (NCC2705; CNCM I-2618), Bifidobacterium lactis (2818; CNCM I-3446), Lactobacillus paracasei (NCC2461; CNCM I-2116), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus (NCC4007; CGMCC 1.3724), Enterococcus faecium SF 68 (NCIMB10415), e misturas dos mesmos.

[00041] A composição da presente invenção pode conter também prebióticos. A adição de prebióticos é benéfica, pois ela pode, quando combinada com probióticos, proporcionar efeitos sinérgicos em termos de benefícios para a saúde. Uma composição que compreende uma combinação de prebióticos e probióticos é conhecida comumente como uma composição simbiótica.

[00042] "Prebiótico" significa substâncias alimentícias que promovem o crescimento de probióticos nos intestinos. Eles não são degradados no estômago e/ou no intestino superior ou absorvidos no trato gastrointestinal da pessoa que os ingere, mas eles são fermentados pela microflora gastrointestinal e/ou por probióticos. Os prebióticos são definidos, por exemplo, por Glenn R. Gibson e Marcel B. Roberfroid, "Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics", J. Nutr. 125:1401-1412 (1995).

[00043] Os prebióticos que podem ser usados de acordo com a presente invenção não são particularmente limitados e incluem todas substâncias alimentícias que promovem o crescimento de bactérias benéficas tais como bifidobactérias e/ou lactobacilos e/ou probióticos no intestino. De preferência, eles podem ser selecionados no grupo que consiste em oligossacarídeos, contendo opcionalmente frutose, galactose, manose; fibras dietéticas, particularmente fibras solúveis, fibras de soja; inulina; ou misturas dos mesmos. Os prebióticos preferidos são fruto-oligossacarídeos (FOS), galacto-oligossacarídeos (GOS), isomalto-oligossacarídeos, xilo-oligossacarídeos, oligossacarídeos de soja, glicosilsacarose (GS), lactossacarose (LS), lactulose (LA), palatinoseoligossacarídeos (PAO), malto- oligossacarídeos, pectinas e/ou seus hidrolisados.

[00044] A infecção não-viral da presente invenção pode ser uma infecção bacteriana e/ou parasítica. Ela pode ser também uma infecção fúngica.

[00045] A infecção não-viral pode ser uma infecção bacteriana selecionada entre infecção por Escherichia coli, uma infecção por Vibrio cholerae, uma infecção por salmonela, uma infecção por clostrídios, uma infecção por Shigella, uma infecção parasítica, incluindo Giardia lamblia, Entamoeba histolytica e Cryptosporidium spp ou misturas das mesmas.

[00046] As doenças infecciosas bacterianas típicas que podem ser tratadas ou prevenidas pela presente invenção incluem salmonelose, shigelose, febre tifoide, meningite bacteriana, antrax, botulismo, brucelose, campilobacteriose, doença da arranhadura do gato, cólera, difteria, tifo epidêmico, gonorreia, impetigo, legionelose, lepra (Doença de Hansen), leptospirose, listeriose, doença de de Lyme, melioidose, febre reumática, infecção por MRSA, nocardiose, coqueluche, peste, pneumonia pneumocócica, psitacose, febre Q, febre maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), febre escarlatina, sífilis, tétano, tracoma, tuberculose, tularemia, tifo, e/ou infecções do trato urinário.

[00047] As doenças infecciosas parasíticas típicas que podem ser tratadas ou prevenidas pela presente invenção incluem tripanossomíase africana, amebíase, ascaríase, babesiose, doença de Chagas, clonorquíase, criptosporidiose, cisticercose, difilobotríase, dracunculíase, equinococose, enterobíase, fasciolíase, fasciolopsíase, filaríase, infecção por amebas de vida livre, giardíase, gnatostomíase, himenolepíase, isosporíase, calazar, leishmaniose, malária, metagonimíase, miíase, oncocercíase, pediculose, infecção por oxiúro, escabiose, esquistossomose, teníase, toxocaríase, toxoplasmose, triquinelose, triquinose, tricuríase, tricomoníase, e/ou tripanossomíase.

[00048] As doenças infecciosas fúngicas típicas que podem ser tratadas ou prevenidas pela presente invenção incluem aspergilose, blastomicose, candidíase, coccidioidomicose, criptococose, histoplasmose, e/ou tinha do pé.

[00049] O produto preparado pelo uso da presente invenção pode ser um produto alimentício, uma ração animal ou uma composição farmacêutica. Por exemplo, o produto pode ser uma composição nutricional, um nutracêutico, uma bebida, um aditivo alimentício ou um medicamento.

[00050] Um aditivo alimentício ou um medicamento pode ser na forma de comprimidos, cápsulas, pastilhas ou um líquido, por exemplo. Os aditivos alimentícios ou medicamentos são, de preferência, fornecidos como formulações com liberação prolongada, permitindo um fornecimento constante de SIgA e probióticos por tempos prolongados.

[00051] O produto é selecionado, de preferência, no grupo que consiste em produtos baseados em leite em pó; bebidas instantâneas; formulações prontas para beber; pós nutricionais; líquidos nutricionais; produtos lácteos, particularmente iogurtes ou sorvetes; produtos baseados em cereais; bebidas; água; café; cappuccino; bebidas de malte; bebidas com sabor de chocolate; produtos culinários; sopas; tabletes; e/ou xaropes.

[00052] O leite pode ser qualquer leite obtenível de origem animal ou vegetal, e é, de preferência, leite de vaca, leite humano, leite de ovelha, leite de cabra, leite de égua, leite de camela, leite de arroz ou leite de soja.

[00053] Em vez de leite, podem ser usadas frações proteicas derivadas do leite ou colostro.

[00054] A composição pode conter ainda hidrocoloides protetores (tais como gomas, proteínas, amidos modificados), aglutinantes, agentes formadores de película, agentes/materiais de encapsulação, materiais com parede/casca, compostos matriciais, revestimentos, emulsificantes, agentes tensoativos, agentes que promovem solubilização (óleos, gorduras, ceras, lecitinas, etc.), adsorventes, veículos, cargas, co-compostos, agentes dispersantes, agentes umectantes, auxiliares de processamento (solventes), agentes de fluidez, agentes mascarantes de sabor, agentes encorpantes, agentes geleificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes e antimicrobianos. Elas podem conter também aditivos e adjuvantes farmacêuticos convencionais, excipientes e diluentes, incluindo, porém sem limitações, água, gelatina de qualquer origem, gomas vegetais, lignossulfonato, talco, açúcares, amido, goma-arábica, óleos vegetais, polialquilenoglicóis, agentes flavorizantes, conservantes, estabilizadores, agentes emulsificantes, tampões, lubrificantes, colorantes, agentes umectantes, cargas, e similares. Além disso, elas podem conter um material veículo orgânico ou inorgânico apropriado para administração oral ou entérica, bem como vitaminas, microelementos minerais e outros micronutrientes de acordo com as recomendações de entidades governamentais tais como a USRDA.

[00055] A composição da presente invenção pode conter uma fonte de proteína, uma fonte de carboidrato e/ou uma fonte de lipídeo.

[00056] Qualquer proteína dietética apropriada pode ser usada; por exemplo, proteínas animais (tais como proteínas do leite, proteínas de carne, e proteínas do ovo); proteínas vegetais (tais como proteína de soja, proteína de trigo, proteína de arroz, e proteína de ervilha); misturas de aminoácidos livres; ou combinações das mesmas. As proteínas do leite tais como caseína e soro, e proteínas de soja são particularmente preferidas.

[00057] Caso a composição inclua uma fonte de gordura, a fonte de gordura fornece, mais preferivelmente, 5% a 40% da energia da fórmula; por exemplo, 20% a 30% da energia. DHA pode ser adicionado. Um perfil apropriado de gordura pode ser obtido usando uma mistura de óleo de canola, óleo de milho e óleo de girassol com alto teor de ácido oleico.

[00058] Uma fonte de carboidratos pode fornecer, mais preferivelmente, entre 40% e 80% da energia da composição. Qualquer carboidrato apropriado pode ser usado; por exemplo, sacarose, lactose, glicose, frutose, sólidos de xarope de milho, maltodextrinas, e misturas dos mesmos.

[00059] O produto preparado pela presente invenção pode ser administrado a seres humanos ou animais, particularmente animais domésticos, animais de estimação ou animais de criação. Ele tem efeitos benéficos para qualquer grupo etário. De preferência, o produto é intencionado para lactentes, jovens, adultos ou idosos. Entretanto, ele pode ser administrado também a mães durante a gravidez e lactação para tratar o lactente.

[00060] A composição da presente invenção será eficaz desde que os probióticos e SIgA sejam administrados simultaneamente, brevemente um depois do outro, por exemplo, em um intervalo de tempo máximo menor do que 60 minutos, de preferência, menor do que 30 minutos, mais preferivelmente menor do que 15 minutos e com a maior preferência, menor do que 5 minutos, e/ou são combinados antes da administração como já presentes no produto alimentício.

[00061] Entretanto, constatou-se que a combinação de probióticos e SIgA é particularmente eficaz caso SIgA e probióticos sejam combinados em complexos antes da administração. Isto tem a vantagem que os complexos benéficos não precisam se formar depois do consumo do produto, mas que eles já estão presentes no produto alimentício.

[00062] Consequentemente, uma modalidade da presente invenção se refere ao uso de uma composição que compreende SIgA e probióticos, onde a molécula de SIgA e pelo menos um probiótico estão pelo menos parcialmente associados na composição.

[00063] SIgA e pelo menos um probiótico estão, de preferência, presentes como complexos imunes, por exemplo, de uma maneira tal que de preferência pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente todas bactérias probióticas estão presentes como um complexo imune em associação com pelo menos 1 molécula de SIgA, por exemplo, com pelo menos 5 moléculas de SIgA.

[00064] A composição pode conter também pelo menos um outro tipo de bactéria de grau alimentício, de preferência, selecionada no grupo que consiste em bactérias do ácido lático, bifidobactérias, enterococos ou misturas das mesmas. Estas outras bactérias de grau alimentício podem contribuir para obter uma microflora sadia do intestino e, portanto, contribuirão para atingir o objetivo da presente invenção ainda mais eficazmente.

[00065] A presente invenção se refere também a uma composição alimentícia que compreende SIgA e pelo menos um micro-organismo probiótico. A SIgA e o micro-organismo probiótico podem ser, de preferência, combinados na composição alimentícia. SIgA e o micro- organismo probiótico podem estar, de preferência, presentes em uma razão estequiométrica de pelo menos 10:1, de preferência pelo menos 100:1, mais preferivelmente pelo menos 2.000:1 a 100.000:1. O limite superior de saturação de SIgA é determinado pela superfície dos micro-organismos probióticos e pelo número de sítios de ligação disponíveis para SIgA.

[00066] Tipicamente, os probióticos serão eficazes em uma grande faixa de quantidade. Caso as bactérias atinjam o intestino vivas, uma única bactéria pode ser suficiente para atingir um efeito potente por persistir no intestino e por multiplicação. Entretanto, em geral, pse refere caso o produto compreenda entre 102 e 1010 células de probióticos por dose diária.

[00067] A quantidade de SIgA necessária para atingir um efeito não é igualmente limitada. Em princípio, uma molécula de SIgA combinada com um micro-organismo probiótico, de preferência na forma de um complexo, será eficaz para a presente invenção. Entretanto, pse refere genericamente caso o produto compreenda entre 0,0001 mg de SIgA secretora e 10 mg de SIgA por dose diária.

[00068] Os versados nessas técnicas devem entender que eles podem combinar livremente todas características da presente invenção aqui descrita, sem fugir do âmbito da invenção como descrita. Particularmente, as características descritas para os usos da presente invenção podem ser aplicadas à composição, por exemplo, a composição alimentícia, da presente invenção e vice-versa.

[00069] Outras vantagens e características da presente invenção ficarão evidentes a partir dos Exemplos e Figuras que se seguem.

[00070] A Figura 1 ilustra esquematicamente como se acredita que SIgA melhora os efeitos de bactérias comensais, quando associada com elas, aumentando a interação com a mucosa intestinal do hospedeiro.

[00071] A Figura 2 ilustra o resultado de experimentos que testaram as propriedades de ligação de duas cepas probióticas, Lactobacillus rhamnosus NCC4007 (LPR) e Bifidobacterium lactis NCC2818 (BL818), representativas para os dois gêneros principais Lactobacilos e Bifidobactérias a células epiteliais. Os dados estão expressos como média de CFU por 100 células Caco-2 ± SEM.

[00072] A Figura 3 ilustra o resultado de experimentos que testaram as propriedades de ligação de duas cepas probióticas, Lactobacillus rhamnosus NCC4007 (LPR) e Bifidobacterium lactis NCC2818 (BL818), representativas para os dois principais gêneros lactobacilos e bifidobactérias a células epiteliais, e a influência de IgA secretora (SIgA) ou componente secretor (SC). Os dados estão expressos como média de CFU por 100 células Caco-2 ± SEM.

[00073] A Figura 4 ilustra o resultado de um experimento que testou o efeito de duas cepas probióticas, Lactobacillus rhamnosus NCC4007 (LPR) e Bifidobacterium lactis NCC2818 (BL818), representativas para os dois principais gêneros lactobacilos e bifidobactérias, isoladamente ou em combinação com SIgA ou SC, sobre a resistência elétrica transepitelial (TER) que mede a permeabilidade epitelial. Os dados estão expressos como médias de ohms por cm2 ± SEM.

[00074] A Figura 5 ilustra o resultado de um experimento que testou o efeito de LPR, combinado ou não com SIgA ou SC, sobre a ativação de NF-KB em monocamada de células Caco-2. Um decréscimo na atividade de ligação de NF-kB é indicativo de vias inflamatórias atenuadas dentro da célula Caco-2.

[00075] A Figura 6 ilustra o resultado de um experimento que testou o efeito de LPR, combinado ou não com SIgA ou SC, sobre a invasão de S. flexneri de célula Caco-2. Duas moléculas de SIgA monoclonal foram usadas: um SIgA inespecífico (SIgA inespecífico) que reconhece um epítopo de salmonela, e um SIgA específico anti-S. flexneri (SIgAC5). Os dados estão expressos como médias de CFU por filtro Transwell ± SEM.

[00076] A Figura 7 ilustra o resultado de um experimento que testou o efeito de probióticos sobre a expressão de receptor de Ig polimérico (pIgR) em uma monocamada de Caco-2. (A) Diferentes tratamentos foram testados em 16 h, incluindo combinação de probióticos com SIgA inespecífico e combinação de S. flexeneri com SIgA específico anti-S. flexneri. A presença de pIgR foi avaliada por western blot, assim como foi a de β-actina. (B) Análise semiquantitativa dos níveis de expressão de pIgR normalizados para β-actina por análise densitométrica das bandas identificadas nos géis em A. (C) Cinética da expressão de pIgR durante incubação por 24 h de células Caco-2 com várias preparações, medida por ELISA.

Exemplo 1: LIGAÇÃO A CÉLULAS EPITELIAIS

[00077] Aproximadamente 106 células Caco-2 foram semeadas por 1 cm2 de filtro Transwell. As células foram incubadas por 16 h a 37 °C na ausência de antibiótico ou FCS com diferentes doses de bactérias, indicadas na legenda da figura. Culturas noturnas frescas de bactérias LPR, BL818 e E. coli TG-1 foram usadas. As células foram então lavadas antes da contagem. As bactérias ligadas foram contadas plaqueando sobre placas MRS ou LB. Para cada experimento, foram realizados testes em triplicata. Os dados foram expressos como médias de bactérias ligadas por 100 células Caco-2 ± SEM. Triplicatas foram realizadas para cada experimento. Em um experimento subsequente, as células foram incubadas com 2 x 107 bactérias por 16 horas a 37°C, na presença de doses crescentes de SIgA ou SC, como indicado na legenda da Figura 3. As células foram então lavadas antes da contagem. As bactérias ligadas foram contadas plaqueando sobre placas MRS ou LB. Para cada experimento, foram realizados testes em triplicata. Os dados foram expressos como médias de bactérias ligadas por células 100 Caco-2 ± SEM. Triplicatas foram realizadas para cada experimento.

[00078] Uma ligação preferencial a células Caco-2 polarizadas de LPR ou BL818 é observada em comparação com E. coli TG-1 (Figura 2). Há uma capacidade de ligação dependente da dose de probióticos às células epiteliais intestinais. Pode-se observar que as propriedades de ligação puderam ser diferenciadas entre as duas cepas.

[00079] Para experimentos subsequentes, 2 x 107 CFU de probióticos foram usadas, pois por um lado esta quantidade não levava a qualquer mudança de pH no meio, e por outro lado, apresentou uma razão de ligação eficiente.

[00080] Aumentar a dose de SIgA monoclonal potencializou a capacidade de LPR e BL818 se ligarem a monocamadas de células Caco-2 polarizadas. Quando associado com as bactérias, o componente secretor não apresentou tais propriedades (Figura 3). A dose de 1 μg de SIgA que confere uma melhora significativa na capacidade de ligação do probiótico foi selecionada para experimentos subsequentes. Esta dose leva à formação de um complexo final constituído de aproximadamente 50.000 a 100.000 unidades de SIgA para 1 bactéria.

[00081] Os resultados estão ilustrados nas Figuras 2 e 3.

Exemplo 2: FUNÇÃO DE BARREIRA EM MONOCAMADA DE CÉLULAS CACO-2 POLARIZADAS

[00082] Aproximadamente 106 células Caco-2 foram semeadas por 1 cm2 de filtro Transwell. As células foram incubadas por 24 h a 37 °C com 2 x 107 CFU de bactérias na ausência de antibiótico ou FCS. As bactérias foram testadas isoladamente ou em combinação com SIgA ou SC nas concentrações indicadas na legenda da Figura 4. A resistência elétrica transepitelial (TER) foi medida em 3, 6, 9, 15 e 24 h. Os controles incluem incubação com SIgA e SC isoladamente. Triplicatas foram realizadas para cada experimento.

[00083] Um aumento de 20-25% na resistência elétrica transepitelial (TER) resultou da incubação de monocamada de células Caco-2 polarizadas com LPR ou BL818 isoladamente, sugerindo que os probióticos potencializaram a função de barreira epitelial. Isto permaneceu verdadeiro quando as bactérias foram combinadas com SIgA ou SC (Figura 4). SIgA ou SC sozinhos não levaram a qualquer mudança da TER.

[00084] Os resultados estão ilustrados na Figura 4.

Exemplo 3: ATIVAÇÃO DE NF-kB EM MONOCAMADA DE CÉLULAS CACO-2 POLARIZADAS

[00085] Aproximadamente 106 células Caco-2 foram semeadas por 1 cm2 de filtro Transwell. As células foram incubadas por 16 h a 37 °C com 2 x 107 CFU de LPR na ausência de antibiótico ou FCS. As bactérias foram testadas isoladamente ou em combinação com SIgA ou SC nas concentrações indicadas na legenda da Figura 5. S. flexneri, S. typhi e H. pylori (2 x 107 UFC) foram usadas como patógenos em experimentos de controle. Extratos nucleares foram preparados e analisados pelo ensaio de deslocamento da mobilidade em eletroforese (EMSA) para examinar a ligação de NF-KB a uma sonda de DNA específica. Extratos citoplasmáticos foram obtidos paralelamente e a presença de kBa foi analisada por Western blot usando anticorpo monoclonal específico anti-kBa para a proteína.

[00086] A exposição de monocamadas de células Caco-2 polarizadas a bactérias patogênicas levou a uma ativação muito mais acentuada de NF-kB nuclear em comparação com bactérias não patogênicas (Figura 5).

[00087] O desaparecimento de kBa (quadro inferior) reflete a ativação da via que leva à translocação nuclear de NF-KB. A este respeito, embora LPR isoladamente tenha um efeito brando sobre a ativação de NF-kB, a combinação de LPR com SIgA ou SC reduziu a ativação de NF-kB em células Caco-2 (BL818 não testada). Como esperado, a incubação de células epiteliais com S. flexneri patogênica levou ao desaparecimento completo da expressão de kBa.

[00088] Os resultados estão ilustrados na Figura 5.

Exemplo 4: ATIVIDADE ANTIPATOGÊNICA

[00089] Aproximadamente 106 células Caco-2 foram semeadas por 1 cm2 de filtro Transwell. As células foram incubadas por 16 h a 37 °C com 2 x 107 CFU de LPR na ausência de antibiótico ou FCS. LPR foi testada isoladamente ou em combinação com 0,2 μg de SC, 1 μg de SIgA policlonal ou 1 μg de SIgAC5 específico anti-S. flexneri LPS. Depois da incubação com LPR as células foram lavadas e depois incubadas com 107 S. flexneri por 6 horas, lavadas novamente e incubadas com 50 μg/mL de gentamicina por 45 min. Finalmente, as células foram lisadas e S. flexneri intracelulares foram contadas sobre placas de ágar LB. Triplicatas foram realizadas para cada experimento.

[00090] A adição de LPR reduziu a infecção da monocamada de células Caco-2 polarizadas por S. flexneri de uma maneira dependente da dose. O efeito foi altamente intensificado depois da combinação com SIgA. Uma prevenção completa da infecção foi conseguida quando o anticorpo SIgAC5 específico de S. flexneri LPS foi usado (Figura 6).

[00091] Os resultados estão ilustrados na Figura 6.

Exemplo 5: EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE Ig POLIMÉRICO EM MONOCAMADA DE CÉLULAS CACO-2 POLARIZADAS

[00092] Aproximadamente 106 células Caco-2 foram semeadas por 1 cm2 de filtro Transwell. As células foram incubadas por 16 h a 37 °C com 2 x 107 CFU de LPR ou BL818 na ausência de antibiótico ou FCS. Os probióticos foram testados isoladamente ou em combinação com 0,2 μg de SC ou 1 μg de SIgA policlonal. S. flexneri do controle foi testada isoladamente ou em combinação com 1 μg de SIgAC5 específico anti-S. flexneri LPS. Depois da lavagem, as células Caco-2 foram recuperadas diretamente a partir dos filtros Transwell e lisadas. Os núcleos foram removidos e os detritos celulares bem como os citoplasmas foram analisados por Western blot usando anticorpo anti-pIgR e antissoros para SC humano e β-actina como controles. Triplicatas foram realizadas para cada experimento.

[00093] Em um experimento subsequente, as células forma incubadas seguindo o mesmo procedimento e depois recuperadas a partir do filtro Transwell depois de 8, 16 e 24 h de incubação. A análise quantitativa de pIgR foi realizada por ELISA em frações de detrito/citoplasma celular. As proteínas totais foram determinadas pelo ensaio de proteínas BCA. Os valores foram normalizados para teor de proteína e os dados foram expressos como.

Claims (5)

1. Composição alimentícia, caracterizada pelo fato de que compreende: SIgA pelo menos um microrganismo probiótico, e leite, sendo que a referida composição é uma composição alimentícia animal, ou uma composição farmacêutica, sendo que o referido SIgA e pelo menos um probiótico estão presentes como complexos imunes na composição, sendo que o referido probiótico é selecionado a partir do grupo que consiste em Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii e Lactobacillus reuteri, ou misturas dos mesmos, e sendo que o leite é obtido de uma fonte animal ou vegetal e é preferencialmente leite de vaca, leite humano, leite de ovelha, leite de cabra, leite de cavalo, leite de camelo, leite de arroz ou leite de soja.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que em substituição ao leite são utilizadas frações proteicas derivadas do leite ou colostro.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o probiótico é selecionado do grupo que consiste em: Lactobacillus johnsonii (NCC533; CNCM I-1225), Bifidobacterium longum (NCC490; CNCM I-2170), Bifidobacterium longum (NCC2705 ; CNCM I-2618), Bifidobacterium lactis (2818; CNCM I-3446), Lactobacillus paracasei (NCC2461; CNCM I-2116), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus (NCC4007; CGMCC 1.3724us, (NCC4007; CGMCC 1.3724) NCIMB10415), e misturas dos mesmos.

4. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento, redução ou prevenção de uma infecção bacteriana.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana é selecionada a partir de uma infecção por Escherichia coli, uma infecção por Vibrio cholerae, uma infecção por salmonela, uma infecção por clostridia, uma infecção por shigella.

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