BRPI0915517B1 - Método para a produção de um conjugado de vi, conjugado, e, composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

sacarídeos vi conjugados. dois conjugados de vi foram preparados por síntese mediada por carbodiimida, com o uso de ácido adípico dihidrazida derivatizada crm197 (uma variante não tóxica de toxina diftérica) e toxóide tetânico, como proteínas veículoas.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de patente da Grã-Bretanha 0810894,6, depositado em 13 de junho de 2008, cujo conteúdo está aqui incorporado por referência.

Campo técnico

[002] A invenção relaciona-se a vacinas, mais particularmente àquelas contra febre tifoide.

Técnica de fundamento

[003] A febre tifoide é uma doença séria comum em várias partes do mundo. Polissacarídeo capsular purificado de Salmonella typhi (Vi) é usado como uma vacina, que fornece cerca de 70% de proteção contra febre tifoide em indivíduos de 5 a 45 anos de idade. No entanto, a vacina é incapaz de estabelecer memória imunológica e é ineficaz em bebês [1]. Uma vacina conjugada de Vi ligada a exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa recombinante mutante (Vi-rEPA) gerou uma resposta de reforço em crianças pequenas e foi levemente eficaz [2].

[004] É um objetivo da invenção fornecer novos processos para a produção de vacina conjugadas de Vi que podem ser empregadas em uma escala industrial.

Revelação da invenção

[005] Os inventores prepararam um novo método para a confecção de conjugados de Vi e também produziram um novo conjugado que compreende Vi ligado a CRMiç?-

[006] Um primeiro aspecto da invenção fornece um método para a preparação de um conjugado de Vi. Um vinculador, como ácido adípico dihidrazida (ADH), e uma carbodiimida, como l-etil-3(3- dimetilaminopropiljcarbodiimida (EDAC), são simultaneamente adicionados a uma solução que contém uma proteína veículo, como CRM197 ou toxóide tetânico (TT), para gerar uma proteína veículo derivatizada.

[007] Um tampão, como ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), pode ser adicionado à solução que contém a proteína veículo antes da adição de ADH and ED AC. A proporção de peso da carbodiimida para a proteína é tipicamente 0,1 a 0,15, uma vez que proporções maiores de carbodiimida/proteína podem causar formação de agregado.

[008] Após a derivatização da proteína veículo, qualquer vinculador em excesso (por exemplo, ADH) é removido por, por exemplo, diálise ou filtração de fluxo tangencial (TFF).

[009] Vi é também ativado com uma carbodiimida e é subseqüentemente combinado com a proteína veículo derivatizada. Para a ativação de Vi, várias proporções de Vi e carbodiimida podem ser usadas. Uma proporção molar de 1:1 (grupos COOH de Vi para carbodiimida) pode ser usada, mas, para reduzir a quantidade de derivados de carbodiimida não conjugada residual (por exemplo, uréias como EDU; N- etil-N’-(3-dimetilaminopropil)uréia, um produto de reação solúvel de ligação de EDAC), proporções maiores podem ser usadas, ou seja, com um excesso molar de Vi, por exemplo, >1,5:1 e idealmente >3:1, como 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou maior. Proporções de até 200:1 devem ser usadas. Essas proporções são maiores que aquelas usadas na referência 3. A ativação de Vi pode ser realizada em temperatura ambiente, por exemplo, em cerca de 2 minutos.

[0010] Portanto, o método compreende as etapas de: a) combinação simultânea de um vinculador, uma carbodiimida e uma proteína veículo. b) reação de Vi com uma carbodiimida c) reação do produto da etapa a) com o produto da etapa b). As etapas a) e b) podem ser realizadas em qualquer ordem.

[0011] Depois da etapa a), mas antes da etapa c), qualquer excesso de vinculador pode ser removido.

[0012] Esse aspecto da invenção também fornece um método para a preparação de um conjugado VÍ-CRM197, em que Vi é combinado com CRM197 derivatizado. O método compreende as etapas de: a) reação de Vi com uma carbodiimida b) reação do produto da etapa a) com CRM197 derivatizado.

[0013] Esse aspecto da invenção também fornece um método para a preparação de um conjugado VÍ-CRM197, que compreende a etapa de: a) Reação de Vi ativado com CRM197 derivatizado.

[0014] A Referência 3 descreve um processo para a preparação de conjugados de Vi com rEPA e albumina sérica bovina (BSA) por síntese mediada por carbodiimida com ADH como 0 vinculador. No entanto, esse processo não envolve a combinação simultânea de rEPA/BSA, ADH e EDAC. Ao contrário, rEPA/BSA e ADH são combinados e misturados antes da adição de EDAC.

[0015] Um segundo aspecto da invenção fornece um conjugado de VÍ-CRIV1197. Esse conjugado pode ser preparado pelo método acima, ou pode ser obtido por outro meio.

Sacarídeo Vi

[0016] Vi é o sacarídeo capsular de Salmonella typhi(previamente classificada como uma espécie em si, mas agora referida como o sorovar typhi de S.eníerica). Vi também pode ser encontrado em outros soro vares de Salmonella (como S.eníerica sorovar paratyphiC ou sorovar dubliri) e em outras bactérias, como Citrobacter (por exemplo, C.freundii e C.youngae). O polissacarídeo Vi é um homopolímero linear de um ácido hexosaminurônico, ácido ocl,4-N-acetilgalactos-aminourônico, que é 60 — 90% acetilado na posição C-3 [4-9]. A substituição de O-acetil em Vi é um fator em sua capacidade de despertar uma resposta imune protetora [10]. A imunogenicidade de Vi é intimamente relacionada a seu grau de O- acetilação. Des-O-acetilação parcial pode aumentar levemente a imunogenicidade; a des-O-acetilação completa elimina a imunogenicidade de Vi [11].

[0017] O sacarídeo Vi usado na presente invenção pode ser quimicamente modificado em relação ao sacarídeo capsular como encontrado na natureza. Por exemplo, o sacarídeo Vi pode ser parcialmente des-O-acetilado, des-N-acetilado (parcialmente ou totalmente), N- propionado (parcialmente ou totalmente) etc. A desacetilação pode ocorrer antes, durante ou depois da conjugação, mas ocorre preferivelmente antes da conjugação. O efeito da desacetilação etc. pode ser avaliado por ensaios rotineiros.

[0018] O sacarídeo Vi pode ser hidrolisado para formar polissacarídeos encurtados (por exemplo, com um grau de polimerização (DP) de pelo menos 10, por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60 ou mais) ou oligossacarídeos (por exemplo, com um grau de polimerização de 2 a 10). Os oligossacarídeos são preferidos aos polissacarídeos para uso em vacinas. O grau de polimerização médio pode ser convenientemente medido por cromatografia de troca iônica ou por ensaios colorimétricos [12].

[0019] Além disso, foi constatado por imunodifusão dupla que a pectina, quando O-acetilada em C-2 e C-3, é antigenicamente idêntica a Vi. A estrutura de Vi difere daquela da pectina, pois ela é N-acetilada em C-2 e O-acetilada em C-3. A pectina O-acetilada conjugada ao toxóide tetânico desperta anticorpos de Vi em camundongos, e reinjeção despertou uma resposta de reforço [13,14]. Portanto, a pectina O-acetilada pode ser usada na invenção no lugar de Vi. Entretanto, conjugados de Vi se mostraram significativamente mais imunogênicos que seus análogos de pectina O- acetilada, e assim Vi de fontes naturais é preferida [13]. Não obstante, será compreendidos que referências a “Vi” podem incluir “pectina O-acetilada” e quaisquer outras moléculas que podem ser estruturalmente ou antigenicamente idênticas a Vi e são capazes de despertar anticorpos que reconhecem Vi nativo.

[0020] “Vi” pode referir-se a um polissacarídeo Vi (por exemplo, com um grau de polimerização de pelo menos 10, por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60 ou mais) ou um oligossacarídeo Vi (por exemplo, com um grau de polimerização de 2 a 10) e pode ter sido quimicamente modificado. Os oligossacarídeos podem ser o resultado de despolimerização e/ou hidrólise de um polissacarídeo parente.

Purificação de Vi

[0021] Os sacarídeos capsulares podem ser purificados por técnicas conhecidas, como descrito nas referências nesta especificação. Um processo típico envolve a extração de base, centrifugação, filtração, tratamento com RNase/DNase, tratamento com protease, concentração, cromatografia de exclusão por tamanho, ultrafiltração, cromatografia de troca aniônica, e ultrafiltração adicional.

[0022] Um método particularmente útil é revelado na referência 15, que é aqui incorporada por referência.

[0023] Um processo para a purificação de Vi pode compreender as etapas de (a) precipitação de Vi, seguida por (b) solubilização do Vi precipitado com o uso de um álcool, como etanol.

Precipitação e solubilização de álcool

[0024] Várias técnicas para a precipitação de polissacarídeos solúveis, como Vi, são conhecidas na técnica. Métodos preferidos usam um ou mais detergentes catiônicos. Os detergentes preferivelmente têm a seguinte fórmula geral:

em que: Ri, R2 e R3 são o mesmo ou diferentes e cada um significa alquil ou aril; ou Ri e R2 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são anexados formam um anel heterocíclico saturado de 5 ou 6 membros, e R3 significa alquil ou aril; ou Ri, R2 e R3 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são anexados formam um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, insaturado no átomo de nitrogênio, R4 significa alquil ou aril, e X- significa um ânion.

[0025] Detergentes particularmente preferidos para uso no método são sais de tetrabutilamônio e cetiltrimetilamônio (por exemplo, os sais brometo). Brometo de cetiltrimetilamônio (‘CTAB’) é particularmente preferido [16]. CTAB é também conhecido como brometo de hexadeciltrimetilamônio, brometo de cetrimônio, Cetavlon e Centimida. Outros detergentes incluem brometo de hexadimetrina e sais de miristiltrimetilamônio.

[0026] Vi pode ser liberado em meio durante cultura. Portanto, o material inicial para precipitação será tipicamente o sobrenadante de uma cultura bacteriana centrifugada ou será uma cultura concentrada. Esse material pode ser filtrado para remover turvação.

[0027] A etapa de precipitação pode ser seletiva para Vi, mas ela também co-precipitará tipicamente outros componentes (por exemplo, proteínas, ácido nucléico etc.).

[0028] O Vi precipitado pode ser coletado por centrifugação antes da solubilização.

[0029] Depois da precipitação, Vi (tipicamente na forma de um complexo com o detergente catiônico) é re-solubilizado. É preferível usar um solvente que seja relativamente seletivo para Vi para minimizar contaminantes (por exemplo, proteínas, ácido nucléico etc.). Constatou-se que etanol é vantajoso com relação a isso, e ele é altamente seletivo para o complexo CTAB-Vi. Outros álcoois inferiores podem ser usados (por exemplo, metanol, propan-l-ol, propan-2-ol, butan-l-ol, butan-2-ol, 2- metil-propan-l-ol, 2-metil-propan- 2-ol, dióis etc.). O álcool é preferivelmente adicionado ao Vi precipitado para gerar uma concentração final de álcool (com base no conteúdo total de álcool e água) de entre 50% e 99% (por exemplo, por volta de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ou por volta de 90%), e preferivelmente entre 75% e 95%.

[0030] O álcool pode ser adicionado ao Vi precipitado em forma pura ou pode ser adicionado em uma forma diluída com um solvente miscível (por exemplo, água). Misturas preferidas de solvente são misturas álcool:água, com uma proporção preferida entre cerca de 70:30 e cerca de 95:5 (por exemplo, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10).

[0031] Comparado com os processos convencionais para a preparação de polissacarídeos capsulares, o processo de duas etapas de precipitação seguida por extração de álcool é mais rápido e simples.

[0032] Em contraste ao processo descrito na ref. 17, o processo usa detergente catiônico em vez de detergente aniônico. Diferente do processo da ref. 18, a precipitação não requer um suporte poroso inerte.

[0033] Além disso, diferente do processo da técnica prévia, um álcool é usado para ressolubilizar Vi em vez de o precipitar.

Processamento adicional do polissacarídeo solubilizado

[0034] Depois da ressolubilização, Vi é também tratado para remover contaminantes uma vez que, na produção de vacina humana, até mesmo uma contaminação pequena não é aceitável.

[0035] Esse tratamento pode incluir centrifugação do complexo CTAB-Vi solubilizado, seguida por precipitação de Vi a partir do sobrenadante obtido por troca de cátions (por exemplo, pela adição de sais de cálcio ou sódio) para gerar um Vi precipitado que é insolúvel em álcool, mas solúvel em água.

[0036] Esse precipitado pode ser coletado por centrifugação e também lavado em álcool e ressolubilizado em uma solução aquosa, se desejado.

[0037] O processo de tratamento envolverá tipicamente uma ou mais etapas de filtração. Filtração profunda pode ser usada. Essa é particularmente útil para clarificação.

[0038] A filtração através de carbono ativado pode ser usada. Isso é útil para a remoção de pigmentos e compostos orgânicos de traço. Ela pode ser repetida até, por exemplo, OD275nm<0,2.

[0039] Filtração por tamanho ou ultrafiltração pode ser usada.

[0040] Se Vi é hidrolisado, o hidrolisado será geralmente dimensionado de modo a remover oligossacarídeos de comprimento curto. Isso pode ser realizado de várias formas, como ultrafiltração seguida por cromatografia de troca iônica.

[0041] A invenção não é limitada a sacarídeos purificados de fontes naturais, no entanto, e os sacarídeos podem ser obtidos por outros métodos, como síntese total ou parcial.

Conjugados

[0042] Vi puro é um imunógeno pobre. Para eficácia protetora, portanto, Vi pode ser apresentado ao sistema imune como um conjugado Vi-veículo. O uso de conjugação a proteínas veículos para aumentar a imunogenicidade de antígenos de carboidrato é bem conhecido [por exemplo, revisto nas refs. 19 a 27 etc.] e é usado em particular para vacinas pediátricas [28]. Como acima descrito, um sacarídeo pode ser conjugado a uma proteína veículo ou a uma mistura de diferentes proteínas veículos. De forma similar, uma proteína veículo pode carregar um sacarídeo ou uma mistura de diferentes sacarídeos, ou seja, sacarídeos diferentes múltiplos [29],

[0043] A invenção fornece um conjugado de (i) Vi, e (ii) CRM197 como uma proteína veículo. O CRM197 pode ser co valentemente conjugado a Vi diretamente ou por meio de um vinculador.

[0044] Qualquer reação de conjugação adequada pode ser usada, com qualquer vinculador adequado quando necessário.

[0045] Oligossacarídeos serão tipicamente dimensionados antes da conjugação. Quando a composição da invenção inclui um sacarídeo despolimerizado, é preferível que a despolimerização preceda a conjugação.

[0046] A anexação de Vi a CRM197 é feita preferivelmente por um grupo -NH2, por exemplo, na cadeia lateral de um resíduo de lisina em CRM197, ou de um resíduo de arginina. A anexação a CRM197 também pode ser por meio de um grupo -SH, por exemplo, na cadeia lateral de um resíduo de cisteína. Alternativamente, Vi pode ser anexado a CRM197 por meio de uma molécula vinculadora como descrito abaixo.

[0047] Vi será tipicamente ativado ou funcionalizado antes da conjugação. Uma técnica preferida usa carbodiimidas (por exemplo, 1-etil- 3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC)). Outras técnicas adequadas usam hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N- hidroxissuccinimida, S-NHS, EDAC, TSTU (veja também a introdução da referência 30).

[0048] As ligações por meio de um grupo vinculador às proteínas veículos em geral podem ser feitas com o uso de qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 31 e 32. Um tipo útil de ligação é um vinculador de ácido adípico, que pode ser formado por ligação de um grupo—NH2 livre (por exemplo, introduzido a Vi por aminação) com ácido adípico (usando, por exemplo, ativação de diimida), e então ligação da proteína ao intermediário sacarídeo-ácido adípico resultante [23, 33, 34]. Outro tipo útil de ligação é um vinculador de carbonil, que pode ser formado por reação de um grupo hidroxil livre de um Vi modificado com CDI [35, 36] seguida por reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Um vinculador útil é ácido adípico dihidrazida ADH [37]. A proteína veículo pode ser derivatizada com ADH (por exemplo, por ligação de carbodiimida em um grupo lateral de ácido carboxílico) e subseqüentemente anexada a Vi [3] (novamente, por exemplo, por ligação de carbodiimida). Outros vinculadores incluem β- propionamido [38], nitrofenil-etilamina [39], haloacil haletos [40], ligações glicosídicas [41], ácido 6-aminocapróico [42], N-succinimidil-3-(2- piridilditio)-propionato (SPDP) [43], porções C4 a Cl2 [44] etc. Condensação de carbodiimida também pode ser usada [45].

[0049] Um processo útil para a ligação de Vi a CRM197 envolve a tiolação de Vi com cistamina ou cisteamina (ligação de carbodiimida) e subseqüente reação com CRM197 derivatizado com SPDP [46].

[0050] Outro processo útil envolve a introdução de grupos amino em Vi seguida por derivatização com um diéster adípico (por exemplo, ácido adípico N-hidroxisuccinimido diéster) e reação com CRM197.

[0051] Um vinculador bifuncional pode ser usado para fornecer um primeiro grupo para ligação a um grupo amina que foi introduzido em Vi e um segundo grupo para ligação a veículo (tipicamente para ligação a uma amina no veículo).

[0052] O primeiro grupo no vinculador bifuncional é assim capaz de reagir com um grupo amina (-NH2) em Vi. Essa reação envolverá tipicamente uma substituição eletrofílica do hidrogênio da amina. O segundo grupo no vinculador bifuncional é capaz de reagir com um grupo amina no veículo. Essa reação envolverá tipicamente uma substituição eletrofílica da amina.

[0053] Quando as reações com Vi e a proteína veículo envolvem aminas, então é preferível usar um vinculador bifuncional, por exemplo, um vinculador homobifuncional de fórmula X-L-X, em que: os dois grupos X são os mesmos e podem reagir com as aminas; e em que L é uma porção de ligação no vinculador. Um grupo X útil é N-oxissuccinimida. L pode ter a fórmula L’-L2-L’, em que L’ é carbonil. Grupos L2 úteis são grupos alquil de cadeia linear com 1 a 10 átomos de carbono (por exemplo, Ci, C2, C3, C4, C5, Cβ,C7, Cs, C9, Cio), por exemplo, -(CH2)4-.

[0054] Outros grupos X são aqueles que formam ésteres quando combinados com HO-L-OH, como norborano, ácido p-nitrobenzóico e sulfo-N-hidroxisuccinimida.

[0055] Vinculadores bifuncionais adicionais para uso com a invenção incluem acriloil haletos (por exemplo, cloreto) e haloacilhaletos.

[0056] O vinculador será geralmente adicionado em excesso molar ao Vi modificado.

[0057] Proteínas veículos preferidas são toxinas bacterianas, como toxinas diftérica ou tetânica, ou toxóides ou mutantes destes. Esses são comumente usados em vacinas conjugadas. O mutante de toxina diftérica de CRM197 é particularmente preferido [47].

[0058] Outras proteínas veículos adequadas incluem o complexo de proteína de membrana externa de N.meningitidis[48], peptídeos sintéticos [49,50], proteínas heat shock[51,52], proteínas de pertussis[53,54], citocinas [55], linfocinas [55], hormônios [55], fatores de crescimento [55], proteínas artificiais que compreendem epitopos de célula T + CD4 humano múltiplo de vários antígenos derivados de patógeno [56] como NI9 [57], proteína D de H.influenzae [58-60], pneumolisina [61] ou seus derivados não tóxicos [62], proteína de superfície pneumocócica PspA [63], proteínas de captação de ferro [64], toxina A ou B de C.difficile [65], exoproteína A de Pseudomonas aeruginosarecombinante (rEPA) [66] etc. E possível usar misturas de proteínas veículos. Uma única proteína veículo pode carregar sacarídeos múltiplos Vi [67].

[0059] Conjugados podem ter excesso de proteína veículo (w/w) ou excesso de Vi (w/w), por exemplo, na faixa de proporção de 1:5 a 5:1. Os conjugados com excesso de proteína veículo são típicos, por exemplo, na faixa de 0,2:1 a 0,9:1, como 0,5:1, ou com pesos iguais (1:1). Em algumas modalidades, a proporção de Vi: proteína é entre 0,4:1 e 1,2:1.

[0060] Quando o conjugado forma o componente de Vi em uma composição imunogênica da invenção, a composição também pode compreender proteína veículo livre [68].

[0061] A porção Vi no conjugado é preferivelmente um polissacarídeo Vi de baixo peso molecular ou um oligossacarídeo, como acima definido. Oligossacarídeos serão tipicamente dimensionados antes da conjugação.

[0062] O conjugado proteína-Vi é preferivelmente solúvel em água e/ou em um tampão fisiológico.

Composições farmacêuticas

[0063] A invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende (a) conjugado de Vi, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma discussão completa de tais veículoes é disponível na ref. 69.

[0064] As infecções microbianas afetam várias áreas do corpo e assim as composições da invenção podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. Formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção, também podem ser preparadas. A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, ou como um xarope (opcionalmente flavorizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalante, com o uso de um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotas, como um spray, ou como um pó [por exemplo, 70]. A composição pode ser incluída em um colutório. A composição pode ser liofilizada.

[0065] A composição farmacêutica é preferivelmente estéril. Ela é preferivelmente livre de pirógeno. Ela é preferivelmente tamponada, por exemplo, entre pH 6 e pH 8, geralmente por volta de pH 7.

[0066] A composição da invenção pode compreender um conjugado de Vi e solução salina.

[0067] A invenção também fornece um dispositivo de liberação que contém a composição farmacêutica da invenção. O dispositivo pode ser, por exemplo, uma seringa ou um inalante.

[0068] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente composições imunogênicas, pois elas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de imunógeno de Vi. Por “quantidade imunologicamente eficaz”, entende-se que a administração daquela quantidade a um indivíduo, em uma dose única ou como parte de uma série, é eficaz para o tratamento ou prevenção. Essa quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata etc.), da capacidade do sistema imune do indivíduo de sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do médico que conduz o tratamento, e de outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade estará dentro de uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de experimentos rotineiros. Uma dose entre 1 pg e 20 pg de sacarídeo é esperada, por exemplo, cerca de 5 pg/dose. A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas (por exemplo, incluindo doses de reforço). A composição pode ser administrada junto com outros agentes imunorreguladores.

[0069] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais; em particular, seres humanos podem ser tratados.

[0070] As composições imunogênicas da invenção podem ser usadas terapeuticamente (ou seja, para tratar uma infecção existente) ou profilaticamente (ou seja, para prevenir infecção futura).

[0071] Uma composição imunogênica pode não compreender adjuvante. Em outras modalidades, no entanto, uma composição imunogênica pode incluir um adjuvante, que pode agir para melhorar as respostas imunes (humoral e/ou celular) despertadas em um paciente que recebe a composição. Adjuvantes que podem ser usados com a invenção incluem, sem limitação: - uma composição que contém mineral, incluindo sais de cálcio e sais de alumínio (ou misturas destes). Sais de cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as partículas de “CAP” reveladas na ref. 71). Os sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos etc., com os sais tendo qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa etc.). A adsorção a esses sais é preferida. As composições que contêm mineral também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico [72]. - Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Esses nomes são convencionais, mas são usados por conveniência apenas, uma vez que nenhum deles é uma descrição precisa do composto químico real que está presente (por exemplo, veja o capítulo 9 da referência 155). A invenção pode usar qualquer um dos adjuvantes de “hidróxido” ou “fosfato” que são usados em geral como adjuvantes. Os adjuvantes conhecidos como “hidróxido de alumínio” são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que são comumente, pelo menos parcialmente, cristalinos. Os adjuvantes conhecidos como “fosfato de alumínio” são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, freqüentemente também contendo uma pequena quantidade de sulfato (ou seja, hidroxifosfato sulfato de alumínio). Eles podem ser obtidos por precipitação, e as condições da reação e concentração durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato por hidroxil no sal. A invenção pode usar uma mistura de hidróxido de alumínio e um fosfato de alumínio. Nesse caso, pode haver mais fosfato de alumínio que hidróxido, por exemplo, uma proporção de peso de pelo menos 2:1, por exemplo, >5: 1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1 etc. A concentração de Al+++ em uma composição para administração a um paciente é preferivelmente menos que 10 mg/ml, por exemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml etc. Uma faixa preferida é entre 0,3 e 1 mg/ml. Um máximo de 0,85 mg/dose é preferido. - Saponinas [capítulo 22 da ref. 155], que são um grupo heterólogo de glicosídeos de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóides que são encontrados na casca, folhas, galhos, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla variedade de espécies de plantas. Saponina da casca da árvore Quillaia saponariaMolina tem sido amplamente estudada como adjuvantes. Saponina também pode ser comercialmente obtida de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (véu de noiva), e Saponaria officianalis (raiz sabão). Formulações com adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, como QS21, bem como formulações lipídicas, como ISCOMs. QS21 é comercializado como Stimulon™. Composições de saponina foram purificadas com o uso de HPLC e RP-HPLC. Frações purificadas específicas que usam essas técnicas foram identificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QHB e QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na ref 73. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, como colesterol [74]. Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas únicas chamadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 da ref 155]. ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferivelmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA & QHC. ISCOMs são também descritos nas refs. 74-76. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional [77]. Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes com base em saponina pode ser encontrada nas refs. 78 & 79. - toxinas bacterianas de ribosilação de ADP (por exemplo, a enterotoxina instável ao calor de E. coli “LT”, toxina de cólera “CT”, ou toxina de pertussis “PT”) e derivados desintoxicados destas, como as toxinas mutantes conhecidas como LT-K63 e LT-R72 [80]. O uso de toxinas de ribosilação de ADP desintoxicadas como adjuvantes de mucosa é descrito na ref. 81 e como adjuvantes parenterais na ref 82. - bioadesivos e mucoadesivos, como microesferas de ácido hialurônico esterificado [83] ou quitosana e seus derivados [84]. - micropartículas (ou seja, uma partícula de -100 nm a -150 pm de diâmetro, mais preferivelmente -200 nm a -30 pm de diâmetro, ou -500 nm a 10 pm de diâmetro) formadas de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(oc-hidroxi), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida) sendo preferido, opcionalmente tratado para ter uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, como CTAB). - lipossomos (capítulos 13 & 14 da ref. 155). Exemplos de formulações em lipossomo adequadas para uso como adjuvantes são descritos nas refs. 85-87. muramil peptideos, como N-acetilmuramil-L-treonil-D- isoglutamina (“thr-MDP”), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-N- acetilmuramil-L-Al -D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (“DTP- DPP”, ou “Theramida™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L- alanina-2-(r-nipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (“MTP- PE”). - um polímero de polioxidônio [88,89] ou outro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado. um ligante de CDld, como uma oc-glicosilceramida [90-97] (por exemplo, oc-galactosilceramida), oc-glicosilceramidas que contêm fitosfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-l-0-(oc-D-galactopiranosil)-2- (N-hexacosanoilamino)-l,3,4-octadecanotriol], CRONY-101, 3”-O- sulfo- galactosilceramida etc. - uma gama inulina [98] ou derivado desta, como algamulina. - uma emulsão óleo-em-água. Várias de tais emulsões são conhecidas, e elas incluem tipicamente pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com o óleo(s) e tensoativo(s) sendo biodegradáveis (metabolisáveis) e biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão têm geralmente menos que 5 pm de diâmetro, e têm um diâmetro até mesmo na escala sub-mícron, com esses pequenos tamanhos sendo atingidos com um microfluidificador para fornecer emulsões estáveis. As gotículas com um tamanho menor que 220 nm são preferidas, uma vez que elas podem ser individualizadas para esterilização em filtro.

[0072] Um oligonucleotídeo imunoestimulante como um que contém um motivo CpG (uma seqüência de dinucleotídeo que contém um resíduo de citosina não metilado ligado por uma ligação de fosfato a um resíduo de guanosina), ou um motivo Cpl (uma seqüência de dinucleotídeo que contém citosina ligada a inosina), ou um RNA de filamento duplo, ou um oligonucleotídeo que contém uma seqüência palindrômica ou um oligonucleotídeo que contém uma seqüência poli(dG). Oligonucleotídeos imunoestimulantes podem incluir modificações de nucleotídeo/análogos como modificações de fosforotioato e podem ser de filamento duplo ou (exceto por RNA) de filamento único. Referências 99, 100 e 101 revelam possíveis substituições de análogo, por exemplo, substituição de guanosina com 2’-desoxi-7-deazaguanosina. O efeito de adjuvante de oligonucleotídeos CpG é também discutido nas refs. 102-107. Uma seqüência de CpG pode ser direcionada a TLR9, como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [108]. A seqüência de CpG pode ser específica para indução de uma resposta imune de Thl, como CpG-A ODN (oligodesoxinucleotídeo), ou ela pode ser mais específica para indução de uma resposta de célula B, como CpGB ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidos nas refs. 109-111. Preferivelmente, o CpG é um CpG-A ODN. Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo que a extremidade 5’ é acessível para reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas seqüências de oligonucleotídeo CpG podem ser anexadas em suas extremidades 3’ para formar “imunômeros”. Veja, por exemplo, as referências 108 & 112-114. Um adjuvante de CpG útil é CpG7909, também conhecido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Outro é CpG1826. Como uma alternativa, ou em adição, ao uso de seqüências de CpG, as seqüências de TpG podem ser usadas [115] e esses oligonucleotídeos podem ser livres de motivos CpG não metilados. O oligonucleotídeo imunoestimulante pode ser rico em pirimidina. Por exemplo, ele pode compreender mais que um nucleotídeo consecutivo de timidina (por exemplo, TTTT, como revelado na ref. 115), e/ou ele pode ter uma composição de nucleotídeos com >25% de timidina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% etc.). Por exemplo, ele pode compreender mais que um nucleotídeo consecutivo de citosina (por exemplo, CCCC, como revelado na ref. 115), e/ou ele pode ter uma composição de nucleotídeos com >25% citosina (por exemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% etc.). Esses oligonucleotídeos podem ser livres de motivo de CpG não metilados. Oligonucleotídeos imunoestimulantes tipicamente compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Eles podem compreender menos que 100 nucleotídeos. - um adjuvante particularmente útil com base em oligonucleotídeos imunoestimulantes é conhecido como IC31™ [116]. Assim, um adjuvante usado com a invenção pode compreender uma mistura de (i) um oligonucleotídeo (por exemplo, entre 15-40 nucleotídeos) incluindo pelo menos um (e preferivelmente múltiplos) motivos Cpl, e (ii) um polímero policatiônico, como um oligopeptídeo (por exemplo, entre 5-20 aminoácidos) incluindo pelo menos uma (e preferivelmente múltiplas) seqüência de tripeptídeo Lys-Arg-Lys. O oligonucleotídeo pode ser um desoxinucleotídeo que compreende a seqüência 26-mer 5’-(IC)i3-3’. O polímero policatiônico pode ser um peptídeo que compreende aminoácido 11-mer Lys-Leu-Lys-Leus-Lys-Leu-Lys. - monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado (‘3dMPL’, também conhecido como MPL™) [117-120]. Em condições aquosas, 3dMPL pode formar agregados ou partículas micelares com diferentes tamanhos, por exemplo, com um diâmetro <150 nm ou >500 nm. Cada um ou ambos destes podem ser usados com a invenção, e as melhores partículas podem ser selecionadas por ensaio rotineiro. Partículas menores (por exemplo, pequenas o suficiente para gerar uma suspensão aquosa transparente de 3dMPL) são preferidas para uso de acordo com a invenção por causa de sua atividade superior [121]. As partículas preferidas têm um diâmetro médio de menos que 220 nm, mais preferivelmente menos que 200 nm ou menos que 150 nm ou menos que 120 nm, e podem ainda ter um diâmetro médio de menos que 100 nm. Na maioria dos casos, no entanto, o diâmetro médio não será menor que 50 nm. - metil inosina 5’-monofosfato (“MIMP”) [122]. - um composto de pirrolizidina polihidroxilada [123], como um que tem a fórmula:

em que R é selecionado do grupo que compreende hidrogênio, grupos acil, alquil (por exemplo, cicloalquil), alquenil, alquinil e aril de cadeia linear ou ramificada, substituídos ou não substituídos, saturados ou insaturados, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitável destes. Exemplos incluem, sem limitação: casuarina, casuarina-6-oc-D- glicopiranose, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7- diepi-casuarina etc. - um composto de imidazoquinohna, como Imiquimod (“R-837”) [124,125], Resiquimod (“R-848”) [126], e seus análogos; e sais destes (por exemplo, os sais de cloridrato). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinas imunoestimulantes podem ser encontrados nas referências 127 a 131. - um composto de tio-semicarbazona, como aqueles revelados na referência 132. Métodos de formulação, manufatura e rastreamento por compostos ativos são também descritos na referência 132. As tio- semicarbazonas são particularmente eficazes no estímulo de células mononucleares de sangue periférico humano para a produção de citocinas, como TNF-oc. - um composto de triptantrin, como aqueles revelados na referência 133. Métodos de formulação, manufatura e rastreamento por compostos ativos são também descritos na referência 133. As tio-semicarbazonas são particularmente eficazes no estímulo de células mononucleares de sangue periférico humano para a produção de citocinas, como TNF-oc. - um análogo de nucleosídeo, como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia- 8-oxoguanosina):

e pró-fármacos destes; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) os compostos revelados nas referências 134 a 136 ; Loxoribina (7-alil-8- oxoguanosina) [137]. - Compostos revelados na referência 138, que incluem: compostos de Acilpiperazina, compostos de Indoldiona, compostos de Tetrahidraisoquinolina (THIQ), compostos de Benzociclodiona, compostos de Aminoazavinil, compostos de Aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [139,140], compostos de Hidraftalamida, compostos de Benzofenona, compostos de Isoxazol, compostos de Esterol, compostos de Quinazilinona, compostos de Pirrol [141], compostos de Antraquinona, compostos de Quinoxalina, compostos de Triazina, compostos de Pirazalopirimidina, e compostos de Benzazol [142]. - um derivado de aminoalquil glicosaminida fosfato, como RC-529 [143,144]. um fosfazeno, como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] (“PCPP”), como descrito, por exemplo, nas referências 145 e 146. - um composto de fórmula I, II ou III, ou um sal destes:

como definido na referência 147, como ‘ER 803058’, ‘ER 803732’, ‘ER 804053’, ER 804058’, ‘ER 804059’, ‘ER 804442’, ‘ER 804680’, ‘ER 804764’, ER 803022 ou ‘ER 804057’ por exemplo:

- derivados de lipídeo A de Escherichia coli como OM-174 (descrito nas refs. 148 & 149). - compostos que contêm lipídeos ligados a uma estrutura acíclica que contém fosfato, como o antagonista de TLR4 E5564 [150,1511:

[0073] Essas e outras substâncias ativas de adjuvante são discutidas em maiores detalhes nas referências 155 & 156.

[0074] Antígenos e adjuvantes em uma composição estarão tipicamente em uma mistura.

[0075] As Composições podem incluir dois ou mais dos referidos adjuvantes. Por exemplo, elas podem incluir, vantajosamente, uma emulsão óleo-em-água e 3dMPL etc.

[0076] Adjuvantes específicos de emulsão óleo-em-água úteis com a invenção incluem, sem limitação: - uma emulsão sub-mícron de esqualeno, Tween 80 e Span 85. A composição da emulsão em volume pode ser cerca de 5% esqualeno, cerca de 0,5% polissorbato 80 e cerca de 0,5% Span 85. Em termos de peso, essas proporções se tornam 4,3% esqualeno, 0,5% polissorbato 80 e 0,48% Span 85. Esse adjuvante é conhecido como ‘MF59’ [152-154], como descrito em maiores detalhes no capítulo 10 da ref. 15 e capítulo 12 da ref. 156. A emulsão MF59 inclui vantajosamente ions de citrato, por exemplo, 10 rnM de tampão de citrato de sódio. - uma emulsão de esqualeno, tocoferol e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada por fosfato. Ela pode também incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% esqualeno, de 2 a 10% tocoferol e de 0,3 a 3% Tween 80, e a proporção de peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente <1 uma vez que essa fornece uma emulsão mais estável. Esqualeno e Tween 80 podem estar presentes em uma proporção de volume de cerca de 5:2. Uma tal emulsão pode ser feita por dissolução de Tween 80 em PBS para gerar uma solução a 2%, então mistura de 90 ml dessa solução com uma mistura de (5 g de DL-oc- tocoferol e 5 ml de esqualeno), então microfluidificação da mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo sub-mícron, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de 180 nm. - uma emulsão de esqualeno, tocoferol, e um detergente de Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A emulsão pode conter um tampão de fosfato. - uma emulsão que compreende um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente de Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de oc-tocoferol). A emulsão pode incluir esses três componentes em uma proporção de massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 pg/ml de polissorbato 80, 110 ug/ml de Triton X-100 e 100 pg/ml de succinato de oc-tocoferol), e essas concentrações devem incluir qualquer contribuição desses componentes de antígenos. A emulsão também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A fase aquosa pode conter um tampão de fosfato. - uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e poloxâmero 401 (“Pluronic™ LI21”). A emulsão pode ser formulada em solução salina tamponada por fosfato, pH 7,4. Essa emulsão é um veículo de liberação útil para muramil dipeptídeos, e tem sido usada com treoonil-MDP no adjuvante “SAF-1” [157] (0,05-1% Thr-MDP, 5% esqualano, 2,5% Pluronic L121 e 0,2% polissorbato 80). Ele também pode ser usado sem o Thr-MDP, como no adjuvante “AF” [158] (5% esqualano, 1,25% Pluronic L121 e 0,2% polissorbato 80). Microfluidificação é preferida. - uma emulsão que tem de 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipídeo, e 0,05-5% de um tensoativo não iônico. Como descrito na referência 159, componentes de fosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Os tamanhos das gotículas sub-mícron são vantajosos. - uma emulsão óleo-em-água sub-mícron de um óleo não metabolizável (como óleo mineral leve) e pelo menos um tensoativo (como lecitina, Tween 80 ou Span 80). Aditivos podem ser incluídos como QuilA saponina, colesterol, um conjugado saponina-lipófilo (como GPI-0100, descrito na referência 160, produzido por adição de amina alifática a desacilsaponina por meio do grupo carboxil de ácido glicurônico), brometo de dimetildioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecilN,N-bis (2- hidroxietil)propanodiamina. - uma emulsão em que uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados como micelas helicoidais [161].

Tratamentos médicos e usos

[0077] A invenção também fornece um conjugado de Vi da invenção, para uso em medicina, por exemplo, para uso no despertar de uma resposta de anticorpo em um mamífero.

[0078] A invenção também fornece um método para despertar uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração de um conjugado de Vi ou composição farmacêutica da invenção ao mamífero.

[0079] A invenção também fornece o uso de um conjugado de Vi da invenção na manufatura de um medicamento para a prevenção ou tratamento de febre tifoide em um mamífero.

[0080] A resposta imune despertada por esses métodos e usos incluirá geralmente uma resposta de anticorpo, preferivelmente uma resposta de anticorpo protetora. Métodos para avaliar as respostas de anticorpo depois da imunização de sacarídeo são bem conhecidos na técnica. A resposta de anticorpo é preferivelmente uma resposta de IgA ou IgG. A resposta imune pode ser profilática e/ou terapêutica. O mamífero é preferivelmente um humano.

[0081] As composições da invenção serão geralmente administradas diretamente a um paciente. A liberação direta pode ser realizada por injeção parenteral (por exemplo, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, ou ao espaço intersticial de um tecido), ou por administração retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intradérmica, ocular, nasal, aural, ou pulmonar. A administração por injeção ou intranasal é preferida.

[0082] A invenção pode ser usada para despertar imunidade sistêmica e/ou mucosa.

[0083] As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças (incluindo bebês) quanto adultos. Assim, o paciente pode ter menos que 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. Pacientes preferidos para receber as vacinas são os jovens (por exemplo, <5 anos de idade). Entretanto, as vacinas não são adequadas apenas para esses grupos, e podem ser usadas mais geralmente em uma população.

[0084] O tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podem ser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em um esquema de imunização de reforço. Em um esquema de doses múltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesma via ou por vias diferentes, por exemplo, uma dose inicial parenteral e um reforço mucoso, uma dose inicial mucosa e um reforço parenteral etc. A administração de mais de uma dose (tipicamente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente virgens. As doses múltiplas serão tipicamente administradas com intervalo de pelo menos 1 semana (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas etc.). Um esquema de exemplo fornece uma primeira dose em 6 semanas de idade e uma segunda dose em 10 semanas de idade, para coincidir com imunização existente para bebês (co-administração com vacinas de EPI). Esse esquema primário pode ser seguido por uma dose de reforço depois do primeiro aniversário da criança.

[0085] Os conjugados da invenção podem ser combinados com antígenos não Vi em uma composição única para imunização simultânea contra patógenos múltiplos. Como uma alternativa à confecção de uma vacina combinada, conjugados podem ser administrados aos pacientes substancialmente ao mesmo tempo (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde ou centro de vacinação centre) que outras vacinas. Antígenos para uso nessas vacinas de combinação ou para administração concomitante incluem, por exemplo, imunógenos de Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureuse/ou Pseudomonas aeuruginosa, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, Neisseria meningitidis(como sacarídeos ou sacarídeos conjugados, para sorogrupos A, C, W135 e/ou Y), Streptococcus pneumoniae(como sacarídeos ou sacarídeos conjugados) etc.

[0086] Em uma modalidade, a composição pode compreender um conjugado de Vi da invenção em combinação com um antígeno de Salmonella paratyphiA, como um antígeno H ou O (por exemplo, um antígeno sacarídeo 0:2), para fornecer uma vacina tifoide bivalente. Em outra modalidade, a composição pode compreender um conjugado de Vi da invenção em combinação com um antígeno de Salmonella typhimurium, como um antígeno H ou O (por exemplo, um sacarídeo 0:9). Em outra modalidade, a composição pode compreender um conjugado de Vi da invenção em combinação com um antígeno de Salmonella enteritidis, como um antígeno H ou O (por exemplo, um sacarídeo 0:4,5).

Definições

[0087] O termo “que compreende” engloba “que inclui” bem como “que consiste em”, por exemplo, uma composição “que compreende” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[0088] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que é “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra “substancialmente” pode ser omitida da definição da invenção.

[0089] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x + 10%.

[0090] Quando materiais animais (e particularmente bovinos) são usados na cultura de células, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatia espongiforme transmissível (TSE), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). No geral, é preferível cultivar células na ausência total de materiais derivados de animais.

[0091] Quando um composto é administrado ao corpo como parte de uma composição, então aquele composto pode ser alternativamente substituído por um pró-fármaco adequado.

Breve descrição dos desenhos

[0092] A Figura 1 mostra a fórmula estrutural de Vi de S.typhi (ácido al ,4-N-acetilgalactosaminourônico).

[0093] A Figura 2 mostra um esquema de reação para a preparação de proteínas derivatizadas.

[0094] A Figura 3 mostra uma análise SEC de CRM197 e CRM197 derivatizado com ADH.

[0095] A Figura 4 mostra uma análise SEC de toxóide tetânico derivatizado com ADH.

[0096] A Figura 5 mostra padrões de SDS page de, da esquerda para a direita, TT, TTADH, CRM e CRMADH-

[0097] A Figura 6 mostra um esquema de reação para a preparação de um conjugado Vi-proteína.

[0098] A Figura 7 e a Figura 8 mostram perfis de filtração em gel de Vi e toxóide tetânico em Sephacryl S-1000.

[0099] A Figure 9 mostra um perfil de filtração em gel de “pool 1”, e a Figura 10 mostra um perfil de “pool 2”.

[00100] A Figura 11 mostra uma análise SEC de Vi-TTADH.

[00101] A Figura 12 mostra um perfil de SDS-PAGE (gel 3-8%) de misturas de reação de VÍ-CRMADH depois de diálise.

[00102] A linha 2 é CRMADH (5 pg), linhas 3 — 5 são 10 pl das misturas de reações depois de diálise de Lotes 04 — 06, respectivamente.

[00103] A Figura 13 mostra a purificação de Lote 06 em Sephacryl S-1000.

[00104] A Figura 14 mostra um perfil de SDS-PAGE (gel 3-8%) de: “2” — CRMADH 3 pg, “3” — mistura de reação 10 pl e frações 1 — 11 e 12 — 22 da purificação de Lote 06.

[00105] As Figuras 15 a 17 mostram análise SEC que compara pools 1 obtidos de Lotes 04 — 06, pools 2 obtidos de Lotes 04 — 06, e pools 1 e 2 obtidos de Lote 06.

[00106] A Figura 18 mostra os valores médios de anticorpo anti-Vi. As Figuras 18A e 18B mostram dados de diferentes lotes de conjugados, mas os grupos de controle são os mesmos em cada. Da esquerda para a direita os grupos em 18A e 18B são : PBS; Vi; VÍ+CRM197; Vi+TT; Vi- CRM197; Vi-TT; VÍ-CRM197 com alume; Vi-TT com alume; e VÍ-CRM197 com CFA+IFA.

Modos de realizar a invenção Purificação de Vi

[00107] O sobrenadante de uma amostra de 5 L de C. freundii WR7001 em mod-LB foi concentrado (20 vezes) a 250 ml com uma mambrana de 100K. A amostra foi diafiltrada contra NaCl 1 M (2,5 L) e então com água (1,5 L), novamente com uma membrana de 100K, e o permeato é descartado. Um filtro de 0,22 pm foi usado para remover turvação. Subseqüentemente, 0,9% CTAB foi adicionado para formar um precipitado de Vi-CTAB. Esse foi centrifugado a 18.000 g por 15 minutos e o sobrenadante descartado.

[00108] O precipitado foi suspenso em etanol (96%, 110 ml) e misturado de um dia para o outro em temperatura ambiente antes de subseqüente centrifugação a 18.000 g por 50 minutos, depois da qual o precipitado resultante foi descartado. 0,1 M NaCl foi adicionado ao sobrenadante para formar um gel que foi centrifugado a 18.000 g por 10 minutos. O precipitado foi coletado e lavado com etanol, então solubilizado em NaCl aquoso (1 M, 50 ml) e filtrado. A parte retida foi trazida a 80% etanol e centrifugada a 18.000 g por 10 minutos. O precipitado foi novamente lavado com etanol. Uma parte do precipitado permaneceu em suspensão (Lote A). As duas partes foram coletadas separadamente como Lote A (97 mg) e Lote B (170 mg).

[00109] Em um processo modificado, o sobrenadante foi concentrado a 8,0-10,0 g/1 com uma membrana de 100K. A amostra foi diafiltrada contra NaCl 1 M, Tris 0,lM, EDTA 0,02 M pH 7,3 (2,5 1) e então com água (2,5 1), novamente com uma membrana de 100K, e o permeato foi descartado. Subseqüentemente, 2,0 % CTAB foi adicionado para formar um precipitado de Vi-CTAB. O precipitado foi centrifugado a 18.000 g por 15 minutos e o sobrenadante descartado. O precipitado foi então lavado com água, centrifugado e ressuspenso em etanol (85%) e misturado até estar completamente solubilizado. A solução foi passada através de filtros SPIO e de carbono. O filtrado foi precipitado com NaCl 0,2 M e centrifugado a 18.000 g por 5 minutos. O precipitado foi ressuspenso em NaCl 1,0 M para gerar uma concentração de 3-5 mg/mL. Essa solução foi diafiltrada contra água e 0,22 pM filtrada.

[00110] O processo de purificação teve bom rendimento e fornece sacarídeo com boa pureza (menos que 0,5% de proteína, menos que 0,01% de ácido nucleico) e é suave o suficiente para preservar altos níveis de O- acetilação.

Derivatização de toxóide tetânico

[00111] ADH (3,25 por mg de proteína) e l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida-cloridrato (EDAC) (EDAC/proteína = 0,152 w/w) foram adicionados ao toxóide tetânico (em tampão de ácido 2- (N-morfolino)etanossulfônico (MES) 50-100 mM, pH 6,18 a 6,20). A reação foi realizada por 1 hora em temperatura ambiente.

[00112] A mistura de reação foi dialisada contra 0,2 M NaCl, 5 mM tampão MES, pH 7,05, 2-8°C e 5 mM tampão MES, pH 7,00, 2-8°C. O toxóide tetânico derivatizado (86% rendimento) foi obtido.

Derivatização de CRM197

[00113] ADH (3,5 mg por mg de proteína) e EDAC (EDAC/proteína = 0,15 w/w) foram adicionados a CRM197 (11,5 mg/ml em tampão MES 50- 100 mM, pH 6,0). A reação foi realizada por 1 hora em temperatura ambiente, pH 6,0-6,2. A manutenção do pH nessa faixa evitou a precipitação da proteína.

[00114] A mistura de reação foi dialisada de um dia para o outro contra 5 mM tampão MES, NaCl 0,2 M, pH 7,0 e então contra 5 mM tampão MES, pH 7,0 a 4°C. Proteína foi medida por análise de microBCA (rendimento de 75-85%). Sacarose 10% w/v foi adicionada ao produto e ela foi estocada a -20°C. Em vez de estocar com sacarose, no entanto, ela pode ser estocada em 5mM MES, pH 7,0.

Caracterização da proteína derivatizada

[00115] A derivatização das proteínas com ADH foi verificada por um método colorimétrico (método TNBS). A proporção molar de ADH para TT foi medida por MS Maldi-Tof como cerca de 11.

[00116] A proporção molar de ADH para CRMI97 foi medida por MS Q-Tof. Isso mostrou a formação de vários produtos caracterizados pela presença de um número diferente de vinculadores ligados à proteína (de 3 a 10, o produto principal contendo 6 vinculadores ligados).

[00117] As proteínas derivatizadas (e, subseqüentemente, os conjugados) foram examinadas por elestrofores em gel de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) com o uso de 3-8% de géis tris-acetato (NuPAGE). As amostras (5-20 pl para ter um conteúdo de proteína de 5 pg) foram adicionadas de DTT 0,5 M (1/5 v/v) e de tampão de amostra NuPAGE LDS (1/5 v/v). As misturas foram aquecidas a 100°C por 1 minuto e as amostras aplicadas às cavidades. O gel foi submetido a eletroforese a 30 mA em tampão de passagem Tris-Acetato SDS (Invitrogen). Ao final ela foi corada com corante “Simply Blue Safe” (Invitrogen).

[00118] Os padrões de SDS-PAGE e perfis de SEC (214 nm, TSK gel 4.000; tampão de fosfato lOOmM + NaCl 100 mM + 5% CH3CN, pH 7,0) das proteínas derivatizadas foram similares àqueles das proteínas nativas (veja Figura 3 a Figura 5).

Conjugação de Vi ao toxóide tetânico derivatizado

[00119] EDAC (4,4 mg) foi adicionado a Vi (4,6 mg) em uma solução tamponada a pH 6,08 (1,5 ml 200 mM tampão MES) e reagiu por 2 minutos em temperatura ambiente.

[00120] O toxóide tetânico derivatizado (9,2 mg) em uma solução tamponada em pH 7,0 (1,5 ml 5 mM tampão MES) reagiu com o Vi ativado por 3 horas em temperatura ambiente ([TTADH] = 3,15 mg ml1, [Vi] = 1,53 mg ml1, proporção TTADH/VÍ (W) = 2, [EDAC] = 1,5 mg ml1).

[00121] A mistura de reação foi dialisada contra 0,2 M NaCl, 10 mM tampão fosfato, pH 7,07, 4°C e purificada por Sephacryl S-1000 (1,5 x 90 cm) em 10 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, pH 7,00.

[00122] Durante a purificação do conjugado, dois diferentes pools foram coletados (veja a Figura 7), que foram caracterizados por um peso molecular diferente. Os perfis de filtração a gel de Vi e de TT em Sephacryl S-1000 mostram (veja a Figura 7 e Figura 8): purificação do conjugado a partir de proteína livre é factível (pool1). - purificação do conjugado a partir de sacarídeo livre não é factível (pool2 —Vi livre co-elui com o conjugado).

[00123] O pool1 deve conter, portanto, menos Vi livre que o pool2.

[00124] A Figura 9 mostra o perfil em Sephacryl SI000 (1,6 x 90 cm) da proteína não conjugada com 10 mM fosfato, NaCl 200 mM, pH 7 em um fluxo de 0,2 ml/min. A Figura 10 mostra o perfil em Sephacryl SI000 (nas mesmas condições) de Vi livre.

[00125] Os pools1 e 2 foram dialisados contra 2 mM tampão fosfato pH 7,0 e seus conteúdos foram como se segue:

[00126] O conjugado foi caracterizado por análise SEC (veja a Figura 11, 214 nm, TSK gel 6000; tampão fosfato 100 mM + NaCl 100 mM + 5% CH3CN, pH7,0): - PSVi-TTADH pool1: polissacarídeo 26,8 qg/ml; proteína 64,64 pg/ml PSVÍ-TTADH pool2: polissacarídeo 82,8 pg/ml; proteína 123,68 pg/ml PS Vi: 1,4 mg/ml TTADH: 0,1 mg/ml

Conjugação de Vi a CRM197 derivatizado

[00127] Três lotes diferentes de VÍ-CRMADH(“04”, “05”, e “06”) foram preparados como se segue:

[00128] EDAC (4,4 mg) foi adicionado a Vi (4,6 mg, gerando uma proporção molar de EDAC:Vi de cerca de 1,43:1) em uma solução tamponada em pH 6,0 (1,65 ml 20 mM tampão MES) e misturado por 2 minutos em temperatura ambiente. Nos últimos experimentos, para comparação, a quantidade de EDAC foi reduzida, com o uso de proporções molares de 5:1 e 9:1. Os conjugados de CRM 197 obtidos com esses sacarídeos derivatizados foram melhor caracterizáveis e reprodutíveis com <5% de CRM-ADH não conjugado. A proporção 5:1 foi melhor que 1,4:1, e a proporção 9:1 foi melhor que 5:1).

[00129] CRM 197 derivatizado (9,2 mg) em uma solução tamponada em pH 7,0 (1,085 ml 5 mM tampão MES) reagiu com o Vi ativado por 3 horas em temperatura ambiente ([CRMADH] = 3,07 mg ml1, [Vi] = 1,53 mg ml1, porporcao CRMADH/VÍ (W) = 2, [EDAC] = 1,47 mg ml1), durante a qual o pH foi mantido a 6,0-6,20 pelo uso de tampão MES para evitar precipitação.

[00130] Como acima observado, CRMADH é adicionado em 5 mM tampão MES, pH 7. E necessário que a mistura final esteja em tampão MES em não menos que 50-60 mM em pH 6 para manter o pH constante durante a reação.

[00131] A mistura de reação foi purificada por coluna Sephacryl SI000 (1,5 x 90 cm) em 10 mM de tampão fosfato de sódio, 200 mM NaCl, pH 7 a 4°C.

[00132] Como um meio alternativo de purificação, CRMADH pode ser removido do conjugado por ultrafiltração tangencial (membrana de 100K ou 300K) como se segue: a mistura de reação diluída de 15 para 50 ml com 10 mM tampão fosfato pH 7,2; membrana: Vivafluxo 200 cm2 100K (celulose regenerada); Pint: 1,2-1,3 bar; Pext: 0,4 bar; fluxo: 22,4 ml/min; volume do permeato: 1.4 L; (28 ciclos com 10 mM tampão fosfato pH 7,2); volume final de 152 ml.

[00133] O conjugado foi caracterizado por microBCA (teor de proteína), titulação de laranja de acridina e NMR/HPAEC-PAD (teor de sacarídeo), 'H RMN (nível de O-acetil e quantificação do derivado de EDAC), HPLC e SDS-PAGE.

[00134] A Figura 13 mostra a purificação de Lote 06 em Sephacryl S-1000 (Sephacryl S1000 1,6 cm x 90 cm; Fluxo: 0,2 ml/min, Eluente: 200 mM NaCl, 10 mM Na^PCL, pH 7,0). Frações (1-11 e 12-22 para Lote 06) foram coletadas para cada Lote em dois diferentes pools,distintos por p.m.. O primeiro pool(frações anteriores) foi purificado de sacarídeo livre, enquanto o segundo continha uma quantidade indeterminada de sacarídeo livre.

[00135] Os poolsforam dialisados contra 2 mM NaH2PO4, pH 7,5, a 4°C, de um dia para o outro e os conteúdos foram:

[00136] As Figuras 15 a 17 mostram análises comparativas SEC desses pools (TSKgel 6000PW (TosoHaas) coluna analítica (7,5 mm x 30,0 cm), eluente: 100 mM NaCl, 100 mM NaHoPCL, 5% CFECN, pH 7,2; Fluxo: 0,5 mL/min; Vo: -13,5 min - Vt: -27,8 min).

[00137] O conjugado foi filtrado de modo estéril (0,22 pm), dividido em alíquotas e estocado a -80°C (4°C).

Determinação da atividade in vivo Antígenos usados

[00138] Os conjugados Vi-TT preparados no exemplo prévio foram usados. VÍ-CRMADH Lote 03 foi preparado com o uso de substancialmente as mesmas condições que VÍ-CRMADH Lotes 04 a 06. VÍ-CRMADH Lote 01 foi também preparado com o uso de substancialmente as mesmas condições que VÍ-CRMADH Lotes 04 a 06, mas com a diferença de que a proporção CRMADH/VÍ (W) foi igual a 1. O soro hiperimune de camundongo imunizado com Vi-rEPA foi obtido de NIH. Características do conjugado

a: conjugados tinham adjuvante de alume b: Ia imunização teve adjuvante com CFA, 2a e 3a imunizações com IFA

Imunizações

[00139] Fêmeas de camundongos Balb/c foram divididas em quatorze grupos de oito camundongos cada e foram imunizadas por via subcutânea com 2,5 pg de Vi, Vi-conjugado, ou uma mistura física de Vi e ADH-proteína veículo derivatizada. Apenas os grupos 13 e 14 receberam 10 pg de dose de imunização.

[00140] Três injeções de 200 pl cada foram dadas a cada duas semanas, com retirada de sangue duas semanas depois de cada imunização.

[00141] Os Grupos 9 a 12 receberam alume como adjuvante, enquanto o adjuvante para os grupos 13 & 14 foi adjuvante completo de Freund (CFA, laa injeção) e adjuvante incompleto de Freund (IFA, 2a e 3a injeções).

Método de ELISA

[00142] As cavidades de placas de ELISA de 96 cavidades (Maxisorp, Nunc) foram revestidas com 100 pl de Vi a 1 pg/ml em tampão de carbonato (0,05 M, pH: 9,6) e deixadas de um dia para o outro a 4°C. Vi usado para revestimento foi purificado de Citrobacter freundii WR7011. Na manhã seguinte, as placas foram bloqueadas com 200 pl/cavidade de leite desnatado a 5% em PBS-Tween 20 (PBST, 0,05%) por 1 hora em temperatura ambiente (RT). Depois de lavagem com PBST, 100 pl/cavidade de soro de camundongo (1:200 diluído em PBST com 0,1% BSA) foram incubados por 2 horas em temperatura ambiente. Depois de mais três lavagens, anticorpo secundário IgG anti-camundongo de cabra conjugado a fosfatase alcalina (Sigma A3438, 1:1.0000 diluído em PBST, 0,1% BSA) foi incubado a 100 pil/cavidade por 1 hora em temperatura ambiente (RT). Substrato de fosfatase alcalina (p-NPP, Sigma N2765) foi resolvido em tampão de dietanolamina (IM, pH: 9,8) e foi incubado depois de mais uma lavagem por 1 hora em temperatura ambiente (RT). As placas foram lidas a 405 e 490 nm com o uso de um leitor de ELISA. Os valores de absorbância usados para determinação de unidades de anticorpo foram obtidos por subtração dos valores a 490 nm e subtração a 405 nm. As unidades de anticorpo são expressas em relação a soro padrão anti-Vi de camundongo hiperimune, depois de análise de gráfico de Hill.

[00143] Um soro camundongo hiperimune imunizado com Vi-rEPA foi usado como controle positivo interno.

[00144] Cada soro de camundongo foi passado em triplicata em três diferentes placas de ELISA e os dados são apresentados como médias aritméticas e erros padrão. Uma unidade de anticorpo é definida como a recíproca da diluição do soro padrão que gera uma densidade ótica igual a 1 em um ELISA padrão. Valores de anticorpo Anti-CRM nos grupos I, 2, 3, 5, 6, 9,10,13,14

[00145] Os resultados são mostrados na Figura 18.

[00146] Várias modificações e variações da presente revelação serão aparentes para aqueles habilitados na técnica sem fugir do escopo e espírito da revelação. Embora a revelação tenha sido descrita junto com modalidades preferidas específicas, deve-se compreender que as reivindicações não devem ser limitadas a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da revelação, que são entendidos por aqueles habilitados na técnica, estão dentro do escopo das reivindicações. REFERÊNCIAS [1] Guzman e cols. (2006) Vaccine 24(18):3804-11. [2] Canh e cols. (2004) Infect Immun. 72(11):6.586-8. [3] Kossaczka e cols. (1997) Infect Immun 65(6):2.088-93. [4] Qlwkecols. (1958) J Biol Chem 230:81-89. [5] Heyns e cols. (1967) Carbohydr Res 3:340-353. [6] Heyns e cols. (1959) Chem Ber 92:2.435-2.438. [7] Webster e cols. (1954) Arch Biochem Biophys 50:223-224. [8] Webster e cols. (1954) J Immunol73:16-22. [9] Whiteside e cols. (1961) J Immunol86:538-542. 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Claims (12)

1. Método para a produção de um conjugado de Vi caracterizadopor compreender as etapas de: a) combinação simultânea de um vinculador de ácido adípico dihidrazida, l-etil-3(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) e uma proteína veículo; b) remoção de qualquer excesso de vinculador do produto da etapa a); c) reação de Vi comEDAC a uma a proporção molar de Vi:EDAC de>5:l;e d) reação do produto da etapa b) com o produto da etapa c).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção molar de Vi:EDAC é >9:1.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o excesso de vinculador é removido por diálise.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a proteína veículo é CRM197 ou toxóide tetânico.

5. Conjugado caracterizadopor ser obtenível por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Conjugado caracterizadopor compreender Vi ligado a CRM197.

7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o Vi é ligado ao CRM197 por um vinculador de ácido adípico dihidrazida (ADH).

8. Composição farmacêutica caracterizadapor compreender o conjugado como definido na reivindicação 6 ou 7 em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadapelo fato de que a composição é sem adjuvante.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizadapor compreender solução salina.

11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizadapelo fato de que uma dose unitária da composição inclui 5 pg de sacarídeo Vi.

12. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizadopelo fato de ser para uso em um método para despertar uma resposta imune em um mamífero.

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