BRPI0916601B1 - Método de diagnóstico de doença de alzheimer (da), neurodegeneração em síndrome de down (nsd) ou comprometimento cognitivo leve (mci) em um indivíduo - Google Patents

Método de diagnóstico de doença de alzheimer (da), neurodegeneração em síndrome de down (nsd) ou comprometimento cognitivo leve (mci) em um indivíduo Download PDF

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Abstract

método e kit de diagnóstico de uma doença neurodegenerativa, e uso de um anticorpo que se llga a glutaminil ciclase (qc) ou uma isoforma da mesma. a presente invenção refere-se a um método de predizer, diagnosticar e prognosticar uma doença neurodegenerativa, tais como doença de alzheimer (da), comprometimento cognitivo leve (mcl) e neurodegeneração em sindrome de down (nsd) usando glutaminil ciclase (qc) como um indicador diagnóstico/prognóstico. o uso de anticorpos que se ligam a qc e kits para realização do método diagnóstico é também proporcionado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método de predizer, diagnosticar e prognosticar uma doença neurodegenerativa, tal como doença de Alzheimer (DA), Comprometimento Cognitivo Leve (Mild Cognitive Impairment (MCI)) e Neurodegeneração em Síndrome de Down (NSD) utilizando glutami- nil ciclase (QC) como um indicador diagnóstico/prognóstico.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que causa demência. Os termos “Doença de Alzheimer) e “Doença do Alzheimer” são ambos utilizados no estado da técnica, esses termos sendo equivalentes e são usados intercambiavelmente aqui, e em outro lugar. O período de primeira detecção de DA para terminação pode variar de alguns anos a 15 anos, durante esse tempo o paciente progressivamente sofre perda de, tanto função mental quanto controle de funções corpóreas. Há variabilidade significativa no progresso da doença. Embora a maioria dos pacientes apresente uma progressão gradual, inexorável (perdendo em média 3 a 4 pontos no escore de estado minimental Folstein de 30 pontos, anualmente), aproximadamente, 30% de casos de DA apresentam uma fase de platô inicial estável prolongada que dura vários anos (Haxby J. V., e outros, Individual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type, J. Clin. Exp. Neuropsychol. 14: 575-592, 1992). Um subgrupo de pacientes apresenta um curso descendente fulminante rapidamente progressivo durante vários anos (Mann, U., e outros, Heterogeneity in Alzheimer’s disease: Progression rate segregated by distinct neuropsychological and cerebral metabolic profiles, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:956:959, 1992). Outros pacientes (aproximadamente 10% de coortes) permanecem lentamente progressivos, mostrando apenas declínio gradual de ano a ano (Grossi, D., e outros, Senile dementias, II International Symposium (pp. 97-99), Paris: John Libbey Eurotext, 1988). As bases patológicas, químicas e moleculares dessa heterogeneidade permanecem indeterminadas. Reco-nhecimento da variabilidade de progressão de DA representa uma percepção clínica importante, e poderá explicar as dificuldades diagnósticas apresentadas por casos “atípicos”. Embora em certos casos, há uma manifestação familiar da doença de Alzheimer, parece que a maioria de casos de DA são não-familiar, e até recentemente (ver abaixo), nenhum marcador biológico simples para a doença foi determinado.
Métodos correntes usados para diagnosticar DA envolve análise de fluido cerebroespinhal (FCS) ou tecido cerebral obtido de pacientes pós- mortes. Desse modo, entre os marcadores, atualmente, sob consideração estão aqueles relacionados com as proteínas, os quais são responsáveis por características encontradas em cérebros com doença de Alzheimer pós- morte. O emaranhamento neurofibrilar é composto principalmente de uma proteína tau hiperfosforilada, uma proteína citoesquelética. A placa neurítica contém um núcleo de proteína amiloide, muito dos quais é um peptídeo de 42 aminoácidos (Aβ42) derivado de clivagem proteolítica de uma proteína precursora maior. Uma outra forma dessa proteína derivada do mesmo precursor contém apenas 40 aminoácidos (Aβ42). Depósitos dessa proteína são encontrados nos cérebros de vítimas de DA. Contudo, alterações em tau e os peptídeos beta-amiloides acima mencionados não ocorrem com frequência e magnitude suficientes a fim de proporcionar valor diagnóstico e, portanto, testes sanguíneos baseados nessas proteínas não parecem correlacio-nar-se bem com DA. Além da variabilidade terminal C peptídeos Aβ terminalmente N-modificados são abundantes (Saido, T.C. e outros. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species Aβ N3(pE) in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Russo, C. e outros. Presenilin- 1 mutations in Alzheimer’s disease. Nature 405, 531-532 (2000); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited im human brain. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)). Parece que uma proporção maior dos peptídeos Aβ sofre truncamento de término N por dois aminoácidos, expondo um resíduo de glutamato, o qual é subsequentemente ciclizado para piroglutamato (pE), resultando em peptídeos Aβ3(PE)-42 (Saído, T.C. e outros. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species Aβ N3(pE) in senile plaques. Neuron 14, 457-466 peptídeos beta-amiloide, Aβ N3(pE), em placas senis. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C., Yamao, H., Iwat- subo, T. & Kawashima, S. Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 173- 176 (1996)). Alternativamente, pE poderá ser formado seguindo clivagem de β por BACE1, resultando em Aβ N1(pE)-42 (Naslund, J. e outros. Relative abundance of Alzheimer Aβ amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91, 8378-8382 (1994); Liu, K. e outros. Caracterization of Abeta11-40/42 peptide deposition in Alzheimer’s disease and Young Down’s syndrome brains: implication of N-terminally truncated Aβ species in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Acta Neu- ropathol. 112, 163-174 (2006)). Em particular, Aβ N3(pE)-42 mostrou ser um constituinte principal de depósitos de Aβ em DA esporádica e familiar (Saido, T.C. e outros., Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species Aβ N3(pE) in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Miravalle, L. e outros. Amino-terminally truncated Aβ peptide species are the main component of cotton wool plaques. Biochemistry 44, 10810-10821 (2005)).
Os peptídeos Aβ N3pE-42 coexistem com peptídeos Aβ 1-40/1- 42 (Saido, T.C. e outros. Dominant and differential deposition of distinct betaamyloid peptide species Aβ N3(pE) in senile plaques. Neuron 14, 457-466 (1995); Saido, T.C., Yamao, H., Iwatsubo, T & Kawashima, S. . Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215, 173-176 (1996)), e, baseada em várias observações podem desempenhar um papel proeminente na patogênese de DA. Por exemplo, uma neurotoxicidade particular de peptídeos Aβ N3pE-42 foi descrita (Russo, C. e outros, Pyroglutamato-modified amyloid beta-peptides- AbetaN3(pE)—strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neu- rochem. 82, 1480-1489 (2002) e a modificação de pE de peptídeos N truncados confere resistência à degradação por maior parte de aminopeptida- ses, bem como endopeptidases que degradam Aβ (Russo, C. e outros, P- yroglutamate-modified amyloid beta-peptides-AbetaN3(pE)-strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002); Saido, T.C. Alzheimer’s Disease as proteolytic disorders: anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19, S69-S75 (1998)). A ciclização de ácido glutâmico para pE leva a uma perda de carga de término N resultando na agregação acelerada de Aβ N3pE comparada com os peptfdeos Aβ não-modificada (He, W. & Barrow, C.J. The Aβ 3-pyroglutamyl and 11- pyroglutamil peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vivo than full-length Aβ. Biochemistry 38, 10871-10877 (1999); Schilling, S., e outros. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vivo). Biochemistry 45, 12393-12399 (2006)). Desse modo, redução da formação de Aβ N3pE-42 pode desestabi- lizar os peptfdeos, tornando-os mais acessíveis à degradação e impediria, por sua vez, a formação de agregados de Aβ de maior peso molecular e a- centuaria sobrevivência neuronal.
No entanto, há muito tempo não se sabia como ocorre a modificação de pE de peptfdeos Aβ. O presente requerente descobriu que gluta- minil ciclase (QC) é capaz de catalisar formação de Aβ N3pE-42 sob condições moderadamente ácidas, que inibidores de QC impedem geração de Aβ N3pE-42 in vitro e que, portanto, inibição de glutaminil ciclase é um novo conceito terapêutico para o tratamento causativo de doença de Alzheimer (Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. & Demuth, H.-U. Glu- taminyl cyclases unfold glutaminyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett. 563, 191-196 (2004); Cynis, H. e outros. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formtion in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764, 1618-1625 (2006); Schilling e outros. Inhibition of glutaminyl cyclase - a novel therapeutic concept for the causative treatment of Alzheimer’s disease. Nature Medicine 14,1106-1111 (2008)).
Atualmente, parece ser marcador diagnóstico não satisfatório de existência de DA, ou de um indivíduo, que embora exibindo respostas cognitivas normais; inevitavelmente, ou mais provável, desenvolverá DA.
Declínio Cognitivo Associado à Idade (DCAI) e Comprometimento Cognitivo Leve (Mild Cognitive Impairment) (MCI) são termos usados para identificar indivíduos que sofrem um declínio cognitivo que está aquém de demência. Esses termos são equivalentes, MCI sendo um termo mais recen-temente adotado, e são usados intercambiavelmente em todo este relatório descritivo. Satisfação de critérios (World Health Organization) para esse diagnóstico exige um relato pelo indivíduo ou família de um declínio na função cognitiva, a qual é gradual, e presente pelo menos 6 meses. Pode haver dificuldades em todos os domínios cognitivos (embora memória seja prejudicada na maioria vasta de casos), e esses devem ser suportados por desempenho anormal em avaliações cognitivas quantitativas para que idade e normas de educação sejam disponíveis para indivíduos relativamente saudáveis (isto é, o paciente é comparado com indivíduos normais seu/sua idade própria). Desempenho deve ser pelo menos DP 1 abaixo do valor médio em relação à população apropriada nesses testes. Nem demência, nem depressão significativa ou efeitos de fármaco poderão estar presentes. Nenhuma doença cerebral ou sistêmica ou condição conhecida para causar disfunção cognitiva poderão estar presentes. Na experiência do requerente todos os pacientes que foram classificados CDR.5 (“demência questionável”) na escala de classificação de Demência Clínica e que satisfizeram essas exclusões, também satisfizeram os critérios de AACD/MCI. Aproximadamente, 1/3 de pacientes com Alzheimer apresentavam um período claramente definível de déficit de memória isolado que precedeu seu declínio cognitivo mais global. (Haxby J. V., e outros; Individual trajectories of cognitive decline in patients with dementia of the Alzheimer type J. Clin. Exp. Neuropsychology 14:575-592, 1992). Usando critérios de AACD/MCI, os quais contam com outros domínios além da memória, a porcentagem com um pródromo identificável é provavelmente maior. Felizmente, nem todos os indivíduos com AACD/MCI parecem declinar. Evidencia-se que um número significativo desses indivíduos mostra um déficit de memória estável não-progressivo em teste.
Tentativas em predizer o início de DA, MCI ou NDS, ou monitorar sua progressão são satisfeitas com sucesso limitado. Descobriu-se pelos inventores deste pedido que uma quantidade de QC em uma amostra biológica obtida de um indivíduo que desvia de uma quantidade de referência em uma pessoa de controle pode ser positivamente correlacionada com um estado de doença neurológica. Desse modo, a correlação da presença de QC com o estado de doença representa um teste positivo e mais direto para diagnóstico em um paciente sofrendo de uma das doenças neurodegenerati- vas descritas acima.
Consequentemente, a invenção proporciona um teste de amostra biológica facilmente administrada para predizer, diagnosticar ou prognosticar DA, MCI e NDS usando QC como um marcador diagnóstico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção baseia-se na descoberta de que uma quantidade de glutaminil ciclase (QC) em uma amostra biológica obtida de um indivíduo sofrendo de DA ou MCI é elevada comparada com uma quantidade de QC na amostra biológica obtida de um indivíduo de controle normal (isto é, saudável). A indicação de que a quantidade de QC difere entre essas doenças neurológicas e controle normal, forma a base para o desenvolvimento de um teste para diagnóstico de DA, MCI ou NDS em um indivíduo. Como tal, os métodos de diagnóstico de DA, MCI ou NDS da presente invenção por meio de medição da quantidade de QC em amostra de paciente grandiosamente aperfeiçoará avaliação diagnóstica clínica atual para pacientes que sofrem dessas doenças neurodegenerativas.
Com base nas diferenças recentemente descobertas na quantidade de QC presente em uma amostra biológica obtida de um paciente comparado com aquele de um controle normal, uma correlação forte da quantidade de QC pode ser feita para um diagnóstico provável de uma doença neurodegenerativa. Uma elevação estatisticamente significativa na quantidade de QC relativa às amostras de controle é razoavelmente predita que o paciente apresenta DA, NDS ou MCI. Uma quantidade normal de QC conforme determinada por uma quantidade de característica de QC de uma amostra de controle de QC isolada de uma população emparelhada com a idade normal indica que o paciente não apresenta uma doença neurodege- nerativa, tais como DA, MCI ou NDS. Uma indicação positiva de uma doença neurodegenerativa com base em uma quantidade elevada ou reduzida de QC em uma amostra biológica relativa a um controle normal é geralmente considerada juntamente com outros fatores na produção de uma determinação definitiva de uma doença particular. Portanto, os níveis elevados ou reduzidos de QC do indivíduo que é testado usualmente serão considerados juntamente com outros sintomas clínicos aceitos de condições relacionadas com DA, MCI ou NDS na produção de um diagnóstico determinativo de uma doença neurodegenerativa.
Desse modo, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um método de diagnosticar Doença de Alzheimer provável (DA), Neurodegeneração em Síndrome de Down (NDS) ou Comprometimento Cognitivo Leve (MCI) em um indivíduo, método este que compreende: (a) detectar a quantidade de glutaminil ciclase (QC), ou suas iso- formas, em uma amostra biológica obtida desse indivíduo; e (b) comparar a quantidade detectada de QC na amostra biológica com uma quantidade de característica de QC de um controle normal; por meio do qual uma quantidade elevada de QC nessa amostra biológica relativa ao controle normal é um indicador positivo de DA ou MCI.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a amostra biológica é uma amostra de corpo fluido tais como fluido de soro, plasma, urina ou cerebrospinal. Mais preferencialmente, a amostra de corpo fluido é plasma.
De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, a quantidade de QC é detectada com base do nível de proteína de QC ou o nível de mRNA de QC.
A quantidade de QC detectada ou quantificada em uma amostra biológica de um indivíduo pode ser concluída por quaisquer meios conhecidos no estado da técnica. Tais meios poderão incluir, mas sem se limitar os mesmos, por exemplo, mediante ensaio imunoturbidimétrico, imunofluores- cência, imunodifusão, ensaio imunoadsorvente enzimático (enzyme-linked immunosorbent assay) (ELISA/ rádio-imunoensaio (RIA), Western Blot, ensaio de atividade proteica ou, para a determinação do nível de mRNA de QC, Northern Blotou análise de reação em cadeia de polimerase (RCP), por exemplo, RCP em tempo real. Também úteis são Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), Espectrometria de Massa (EM) e Cromatografia Gasosa (CG), bem como suas várias configurações; incluindo Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa (CG-EM), Cromatografia Liquida- Espectrometria de Massa (CL-EM) e Sistemas de Cromatografia Líquida em tandem-Espectrometria de Massa (CL-EM/EM).
Preferencialmente, a quantidade de QC na amostra biológica é detectada usando um anticorpo que se liga a QC em um formato imunoen- saio. Desse modo, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, é proporcionado um método de diagnosticar uma doença neurodegenerativa em um indivíduo, método este que compreende: (a) obter uma amostra biológica do indivíduo; (b) contatar essa amostra biológica com um anticorpo que se liga a glutaminil ciclase (QC), ou suas isoformas; (c) permitir que o anticorpo e QC forme um complexo imune; e (d) detectar a quantidade de complexo imune formado como uma indicação da quantidade de QC nessa amostra biológica; e (e) comparar a quantidade detectada com um controle normal; por meio do qual uma quantidade detectada que é elevada ou reduzida em relação ao controle normal é um indicador positivo de uma doença neurodegenerativa.
De acordo com ainda um aspecto adicional da invenção, é pro-porcionado um kit diagnóstico para determinar se um indivíduo está sofrendo de uma doença neurodegenerativa, kit este que compreende um anticorpo que se liga a QC e um padrão estabelecido de uma quantidade de característica de QC de um controle normal. Reagentes e instruções para realização dos ensaios poderão também ser incluídos.
DESCRIÇÃO CONCISA DAS FIGURAS
Figura 1 figura 1 (a) mostra a análise de níveis de transcritos de
QC aplicando TR-RCP quantitativa. RNA total de amostras de cérebro neo- cortical humano (área de Brodmann 22) foi isolado de cérebros normalmente envelhecidos e DA de diferentes estágios de Braak conforme indicado. O nível de transcrito de QC foi normalizado para concentração de transcrito infra-estrutura. Figura 1 (b) mostra a análise Western-Blot de QC a partir dos mesmos casos e região cerebral conforme usada para análise de mRNA de QC. A extração de proteína solúvel foi normalizada para o peso tissular. Figura 1 (c) mostra a quantificação de concentrações de Aβ N3(PE)-42 (indicada como AβT-42) a partir dos mesmos casos e região cerebral aplicando análise ELISA de extratos de SDS e ácido fórmico de amostras de cérebro neocortical humano. Nota-se o aumento robusto em concentrações peptídi- cas de Aβ N3(pE)-42. Figura 1 (d) mostra a detecção imuno-histoquímica de peptídeos Aβ pelo anticorpo 4G8 e de peptídeos Aβ N3(pE)-42 na área de Brodmann 22 de indivíduos normalmente envelhecidos e diferentes estágios de DA. Placas esparsas Aβ foram detectadas em envelhecimento normal, porém esses depósitos faltaram imunorreatividade de Aβ N3(pE)-42. Em todos os estágios de DA, contudo, a maioria de placas Aβ contém peptídeos de Aβ N3(pE)-42.
Figura 2 mostra os resultados da determinação da taxa de expressão gênica de QC e CCL2 em células THP-1 estimuladas.
Figura 3 mostra os resultados da determinação da atividade específica de QC em meio condicionado de células THP-1.
SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS AMILQIDES E QUIMIOCINAS
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DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um método eficiente e rápido in vitro para diagnosticar uma doença neurodegenerativa por meio de, diretamente, detectar uma quantidade de QC em uma amostra biológica obtida de 5 um indivíduo e comparando a quantidade detectada de QC com uma quanti dade de característica de QC de um controle normal. Uma quantidade elevada de QC na amostra biológica do indivíduo é uma indicação positiva de DA ou MCI ou NDS. Desse modo, conforme descrito neste relatório demonstra-se que QC é consistente e significativamente elevado em uma amostra biológica de pacientes com DA, NDS ou MCI comparada com controles normais. Como tal, os métodos para diagnosticar DA, MCI ou NDS da presente invenção, detectando ou quantificando a quantidade de QC em uma amostra de paciente grandemente aperfeiçoará avaliação diagnóstica clínica atual para pacientes que sofrem dessas doenças neurodegenerativas.
Consequentemente, proporciona-se um método para avaliar se um indivíduo pode estar sofrendo de DA, MCI ou NDS usando QC como um marcador biológico.
Glutaminil ciclase ou ciclotransferase glutaminil-peptfdeo (QC, EC 2.3.2.5) catalisa a ciclização intramolecular de resíduos de glutaminil de término N em ácido piroglutâmico (5-oxo-prolina, pGlu*) sob liberação de amónia e a ciclização intramolecular de resíduos de glutamil de término N em ácido piroglutâmico sob liberação de água.
Uma QC foi primeiro isolada por Messer a partir do látex da papaia Caríca planta tropical em 1963 (Messer, M. 1963 Nature 4874, 1299). 24 anos mais tarde, descobriu-se uma atividade enzimática correspondente em pituitária animal (Busby, W. H. J. e outros, 1987; J. Biol. Chem. 262, 8536; Fischer, W. H. e Spiess, J. 1987; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 3628- 3632). Em relação a QCs de mamíferos, a conversão de Gin em pGlu por QC pode ser mostrada para os precursores de TRH e GnRH (Busby, W. H. J. e outros, 1987; J. Biol. Chem. 262, 8532-8536; Fischer, W. H e Spiess, J. 1987; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 3628-3632). Além disso, experimentos de localização inicial de QC revelaram uma colocalização com seus produtos putativos de catálise no hipotálamo-hipofisário adicionalmente aperfeiçoando a função sugerida em maturação hormonal peptídica (Bockers, T. M. e outros; 1995 J. Neuroendocrinol. 7, 445-453). Em contraste, a função fisiológica da QC vegetal é menos clara. No caso da enzima de C.papaya, um papel na defesa da planta contra microorganismos patogênicos foi sugerido (El Moussaoui, A. e outros, 2001, Cell Mol. Life Sei. 58, 556-570). QCs putativos de outros vegetais foram identificados por meio de comparações de sequências, recentemente (Dahl, S. W. e outros; 2000 Protein Expr. Purif. 20, 27- 36). A função fisiológica dessas enzimas, contudo, é ainda ambígua.
As QCs conhecidas de vegetais e animais mostram uma especi-ficidade precisa de L-Glutamina na posição de término N dos substratos e seu comportamento cinético verificou-se obedecer à equação de Michaelis- Menten (Pohl, T. e outros, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 10059- 10063; Consalvo, A. P. e outros, 1988, Anal. Biochem. 175,131-138; Gololobov, M. Y. e outros, 1996, Biol. Chem. Hoppe Seyler 377, 395-398). Uma comparação das estruturas primárias dos QCs de C. papaya e aquela da QC altamente conservada de mamíferos, contudo, não revelou qualquer homo- logia de se quência (Dahl, S. W. e outros (2000) Protein Expr. Purif. 20, 27- 36). Visto que os QCs vegetais parecem pertencer a uma nova família de enzima (Dahl, S. W. e outros (2000) Protein Expr. Purif. 20, 27-36), os QCs de mamíferos foram verificados apresentar uma homologia de sequência pronunciada para aminopeptidase bacteriana (Bateman, R. C. e outros, 2001 Biochemistry 40, 11246-11250), levando à conclusão de que os QCs de vegetais e animais apresentam diferentes origens evolucionárias.
Gostranova e outros verificaram que atividade de glutaminil ci- clase é um aspecto característico de fluido cerebrospinal em pacientes de esclerose múltipla e controles (Gostranova e outros, Clin. Chim. Acta. 2008 389(1-2), pp. 152-159).
Isoformas diferentes de QC, as proteínas semelhantes à ciclo- transferase glutaminil-peptídica (QPCTLs) são observadas (WO 2008/034891). Essas novas proteínas apresentam similaridade significativa de sequência a glutaminil ciclase, por exemplo, a QPCTL de humano (adicionalmente denominada como isoQC) (acesso GenBank no. NM 017659).
Isoformas múltiplas de uma proteína, tais como QC ou isoQC humano, podem também ser produzidas de um único gene por meio de uma variedade de mecanismos, incluindo processamento alternativo (splicing) de RNA, processamento proteolítico pós-translacional e glicosilação específica ao tipo celular. Desse modo, os termos “glutaminil ciclase”, “QC” e “isoQC” conforme usados neste relatório referem-se a QC em sua forma nativa, bem como qualquer uma de suas isoformas.
Preferidas para o uso da presente invenção são QC humana ou suas isoformas, apresentando uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de ID SEQ Nos: 1,2, 3, 4 e 5.
Mais preferido, para uso nos métodos da presente invenção é a QPCTL humana apresentando uma sequência de aminoácidos de ID SEQ NO. 2 ou ainda preferida de ID SEQ NO: 3.
Ainda preferida para uso nos métodos da presente invenção são formas de junção de QPCTL humana apresentando uma sequência de ami-noácidos de ID SEQ NO: 4 ou de ID SEQ NO: 5.
Mais preferido para uso nos métodos da presente invenção é QC humana apresentando a sequência de aminoácidos de ID SEQ NO: 1.
Desse modo, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de diagnóstico de Doença de Alzheimer provável (DA), Neurodegeneração em Síndrome de Down (NDS) ou Comprometimento Cognitivo Leve (MCI) em um indivíduo, método este que compreende: (a) detectar a quantidade de glutaminil ciclase (QC), ou uma iso- forma desta, em uma amostra biológica obtida do indivíduo; e (b) comparar a quantidade detectada de QC na amostra biológica com uma quantidade de característica de QC de um controle normal por meio do qual uma quantidade elevada de QC nessa amostra biológica relativa ao controle normal é um indicador positivo de DA, NDS ou MCI.
Tem sido demonstrado por inventores da presente invenção que uma quantidade elevada de QC em uma amostra biológica poderá correla- cionar-se com uma quantidade elevada de peptídeos beta-amiloide N- terminalmente truncados e piroglutamatados, tais como, por exemplo, Aβ N3pE-42 e/ou Aβ N3pE-40 e/ou Aβ N3pE-38.
Desse modo, de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método de diagnóstico de Doença de Alzheimer provável (DA), Neurodegeneração em Síndrome de Down (NDS) ou Comprometimento Cognitivo Leve (Mild Cognitive Impairment) (MCI) em um indivíduo, método este que compreende: (a) detectar a quantidade de glutaminil ciclase (QC), ou uma iso- forma da mesma, em uma amostra biológica obtida do indivíduo; e (b) adicionalmente, detectar a quantidade de Aβ N3pE-X, (c) comparar a quantidade detectada de QC e Aβ N3pE-X na amostra biológica com uma quantidade de característica de QC e Aβ N3pE- X de um controle normal. por meio do qual uma quantidade elevada de QC e Aβ N3pE-X na amostra biológica relativa ao controle normal é um indicador positivo de DA, NDS ou MCI, e em que X é um número inteiro selecionado de 38, 40 e 42. Em uma modalidade preferida, X é 42. Em uma modalidade adicionalmente preferida, X é 40. Em uma modalidade ainda preferida, X é 38.
Adicionalmente preferidos são métodos, em que não apenas uma única forma dos peptídeos beta-amiloide N-terminalmente truncados e piroglutamatados, mas uma combinação de Aβ N3pE-42 e/ou Aβ N3pE-40 e/ou Aβ N3pE-38 é detectada juntamente com QC.
Adicionalmente preferidos são métodos, em que não apenas uma única forma dos peptídeos beta-amiloide N-terminalmente truncados e piroglutamatados, mas uma combinação de Aβ N3pE-42 e/ou Aβ N3pE-40 e/ou Aβ N3pE-38 e/ou peptídeos que ocorrem em demências de Alzheimer familiar, tal como pGluABri ou pGluADan, é detectada juntamente com QC. “pGlu-Aβ” ou “Aβ N3pE” refere-se a formas N-terminalmente truncadas de Aβ, que começa no resíduo de ácido glutâmico sob posição 3 na sequência de aminoácidos de Aβ, e em que o resíduo de ácido glutâmico é ciclizado para formar um resíduo de ácido piroglutâmico. Em particular, por pGlu-Aβ conforme usado neste relatório entende-se aqueles fragmentos que são envolvidos em, ou associados às patologias de amiloide, incluindo, mas sem se limitar os mesmos, pGlu-Aβ 3-38, pGlu-Aβ 3-40, p-Glu-Aβ 3-42.
Tem sido adicionalmente demonstrado pelos inventores da presente invenção que uma quantidade elevada de QC em uma amostra biológica poderá correlacionar-se com uma quantidade elevada de uma quimioci- na, tais como, por exemplo, CCL2, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL13, CCL15, CCL16, CCL25 e Fractalcina.
Desse modo, de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método de diagnóstico de Doença de Alzheimer (DA), Neurodegeneração em Síndrome de Down (NDS) ou Comprometimento Cognitivo Leve (Mild Cognitive Impairment) (MCI) em um indivíduo, método este que compreende: (a) detectar a quantidade de glutaminil ciclase (QC), ou uma iso- forma da mesma, em uma amostra biológica obtida do indivíduo; e (b) adicionalmente detectar a quantidade de uma quimiocina, (c) comparar a quantidade detectada de QC e a quimiocina na amostra biológica com uma quantidade de QC e a característica de quimiocina de um controle normal; por meio do qual uma quantidade elevada de QC e quimiocina na amostra biológica relativa ao controle normal é um indicador positivo de DA, NDS ou MCI.
Em uma modalidade preferida, a quimiocina é de origem mamífera. Mais preferencialmente, a quimiocina é uma quimiocina humana. Mais preferencialmente, essa quimiocina é CCL2 humana.
Em uma modalidade adicionalmente preferida, qualquer um dos métodos acima mencionados para diagnóstico de Doença de Alzheimer (DA), Neurodegeneração em Síndrome de Down (NDS) ou Comprometimento Cognitivo Leve (Mild Cognitive Impairment) (MCI) poderão também ser realizados in vitro em uma amostra biológica de um indivíduo.
O termo “indivíduo” refere-se a um mamífero que sofre de, ou suspeito de uma doença neurogenerativa tais como DA, MCI ou NDS. Preferencialmente, “indivíduo” refere-se a um ser humano.
O termo “amostra biológica” refere-se a qualquer fonte de material biológico, incluindo, mas sem se limitar a mesma, sangue periférico, plasma, linfócitos, fluido cerebrospinal, urina, saliva, epitélio, fibroblastos, ou qualquer outra amostra compreendendo proteína QC.
Em uma modalidade preferida, a quantidade de QC é detectada em uma amostra de fluido corpóreo obtido de um mamífero, mais preferencialmente, um humano. O termo “fluido corpóreo” refere-se a todos os fluidos que estão presentes no corpo humano, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, sangue, linfa, urina e fluido cerebrospinal (CSF) compreendendo QC. A amostra sanguínea poderá incluir uma amostra plasmática ou uma amostra sérica, ou frações derivadas dessas amostras. A amostra pode ser tratada antes de uso, tais como preparação de plasma de sangue, diluição de fluidos viscosos, e similares. Preferencialmente, a amostra de plasma é tratada com um anticoagulante, tal como EDTA.
De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a quantidade de QC é detectada em uma amostra sanguínea tomada do indivíduo, mais preferencialmente, uma amostra plasmática. Desse modo, a presente invenção preferencialmente refere-se a um método conforme descrito acima, método este que compreende as etapas de: obter uma amostra plasmática do indivíduo; detectar a quantidade de QC na amostra plasmática; comparar a quantidade detectada de QC na amostra plasmática com a quantidade de QC em uma amostra plasmática de um controle normal, por meio do qual uma quantidade elevada de QC relativa ao controle normal é uma indicação positiva
De DA, NDS ou MCI. Quantidades elevadas de QC mostram correlacionar-se com, e são úteis em auxiliar a diagnose de DA, NDS e MCI.
Uma “quantidade elevada” de QC (ou uma isoforma desta) significa que a quantidade de QC detectada nas amostras dos indivíduos é maior que a quantidade média de característica de QC de uma pessoa de controle normal além da faixa de erro experimental, conforme conhecida no estado da técnica. Preferencialmente, a quantidade de QC detectada nas amostras dos indivíduos é 10% maior que a quantidade média de característica de QC de uma pessoa de controle normal. Mais preferencialmente, a quantidade de QC (ou uma isoforma da mesma) detectada nas amostras dos indivíduos é 25% maior, ou, ainda mais preferida 50% ou 75% maior que a quantidade média de característica de QC de uma pessoa de controle normal. Mais preferencialmente, a quantidade de QC (ou uma isoforma da mesma) detectada nas amostras dos indivíduos é diversas vezes maior que a quantidade média de característica de QC de uma pessoa de controle normal, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes maior.
Um “controle normal” é uma amostra biológica do mesmo tipo obtida do indivíduo, por exemplo, aquela que é obtida de pelo menos uma pessoa de controle normal emparelhado à idade ou do paciente em outro tempo. Em uma modalidade, o controle normal é tomado do paciente em um tempo mais prematuro. Uma amostra de controle normal de uma população emparelhada à idade deve ser isolada de uma amostra de população ade- quada de controles saudáveis emparelhados à idade com nenhuma história de DA, MCI ou NDS em sua família. À guisa de exemplo, um nível plasmáti- co de QC maior que os níveis de controle de QC, conforme determinado por um tamanho de amostra de população de controle adequada, é indicativo de DA, NDS ou MCI. Aquele versado no estado da técnica considerará que a amostra do indivíduo que deve ser diagnosticado é avaliada contra um controle normal emparelhado à idade e que uma elevação ou redução significativa na quantidade de QC na amostra de proteína do indivíduo é determinada com base na comparação com os controles usados no ensaio fornecido.
De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, a quantidade de QC, ou uma isoforma da mesma, é detectada com a base do nível de proteína ou o nível de mRNA do QC ou isoforma da mesma.
A quantidade de QC detectada ou quantificada em uma amostra biológica do indivíduo pode ser realizada por quaisquer meios conhecido no estado da técnica. Tais meios poderão incluir, mas sem se limitar aos mesmos, por exemplo, por meio de ensaio imunoturbidimétrico, imunofluores- cência, imunodifusão, ensaio imunoadsorvente enzimático (ELISA), rádio- imunoensaio (RIA), Western Blot, ensaio de atividade proteica, ou, para a determinação do nível de mRNA de QC. Análise Northern Blot ou reação em cadeia de polimerase (RCP), por exemplo, RCP em tempo real. Também úteis são cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de massa (EM) e cromatografia gasosa (CG), bem como suas várias configurações, incluindo sistemas de cromatografia gasosa-espectrometria de massa (CG-EM), cromatografia líquida-espectrometria de massa (CL-EM) e cromatografia líquida em tandem-espectrometria de massa (CL-EM/EM), para citar alguns.
Embora detecção de QC possa ser realizada por métodos conhecidos no estado da técnica para detecção de peptídeos, o uso de técnicas de detecção imunológica usando anticorpos, fragmentos de anticorpos, anticorpos recombinantes, e similares, é preferido. Portanto, tal detecção de QC inclui, mas não se limita ao mesmo, o uso de anticorpos que se ligam especificamente a QC, ou suas isoformas, para formar um complexo imune, bem como reagentes para detecção da formação do complexo imune. Técnicas de detecção particularmente adequadas empregando um ou mais anticorpos incluem ensaios imunoturbidimétrico, imunofluorescência, imunodifu- são, ELISA, RIA e similares.
Tais anticorpos poderão ser policlonais ou monoclonais. Métodos para produzir anticorpos policlonais ou monoclonais são bem conhecidos no estado da técnica. Para uma revisão, ver Harlow e Lane (Harlow, E. e Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nl, 1988) e Yelton e outros (Yelton D. E. e Scharff M. D. Monoclonal Antibodies: a powerful new tool in biology and medicine. Ann. Rev. Biochem. 50:657-680, 1981), ambas as quais são neste relatório incorporadas como referência. Em relação a anticorpos monoclonais, ver Kohler e Milstein (Kohler G. e Milstein C., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497; 1975), neste relatório incorporado como referência. Os anticorpos da invenção são de qualquer isótopo, por exemplo, IgG ou IgA, e anticorpos policlonais são de um único isótopo ou uma mistura de isótopos.
De acordo com uma modalidade da invenção, o anticorpo anti- QC é um anticorpo monoclonal. Embora anticorpos anti-QC sejam ampla e comercialmente disponíveis, anticorpos para uso nos vários imunoensaios descritos neste relatório, podem ser produzidos de acordo com métodos padrões.
Adicionalmente, o anticorpo monoclonal anti-QC é capaz de re-conhecer QC em sua forma nativa, bem como qualquer uma de suas isoformas. Desse modo, qualquer anticorpo monoclonal que especificamente reconhece QC, incluindo suas isoformas, pode ser usado no método para a quantificação de QC.
Preferidos são anticorpos monoclonais, os quais especificamente reconhecem QC, mas mostram baixa reatividade cruzada, ou mais prefe-rencialmente, nenhuma reatividade cruzada com isoformas de QC. Alternati-vamente preferidos são anticorpos monoclonais que especificamente reconhecem uma isoforma particular de QC, porém mostram baixa ou mais pre- ferencialmente, nenhuma reatividade cruzada com QC.
Anticorpos anti-QC adequados são, por exemplo, aqueles que são comercialmente disponíveis de Abnova (Taipei City, Taiwan), por exemplo, um anticorpo policlonal de camundongo (No. de Cat. H00025797-B01P) e um anticorpo policlonal de coelho (No. de Cat. H00025797-D01P).
Um anticorpo anti-QPCTL adequado é, por exemplo, o anticorpo policlonal de camundongo comercialmente disponível de Abnova (Taipei City, Taiwan, No. de Cat. H00054814-B01P).
Também fragmentos derivados desses anticorpos monoclonais tais como Fab, F(ab)2/ssFv (fragmento variável de cadeia única) e outros constructos semelhantes a anticorpos que retêm a região variável do anticorpo, proporcionando-os ter retido as propriedades de ligação originais, podem ser usados em um método da presente invenção. Tais fragmentos são comumente gerados mediante, por exemplo, digestão enzimática dos anticorpos com papaína, pepsina, ou outras proteases. Sabe-se bem aquele versado no estado da técnica que anticorpos monoclonais, ou fragmentos destes, podem ser modificados para várias utilizações. Desse modo, anticorpos da invenção, podem ser recombinantes, por exemplo, quiméricos (por exemplo, constituídos por uma região variável de origem murina associada a uma região constante humana), humanizados (uma coluna dorsal de imunoglobulina constante humana juntamente com região hipervariável de animal, por exemplo, origem murina) e/ou cadeia única.
Um anticorpo específico de QC, ou suas isoformas, usado em um método da presente invenção poderá ser marcado por uma marca apropriada e identificado na amostra biológica com base na presença da marca. A marca permite a detecção do anticorpo quando este é ligado a QC. Exemplos de marcas incluem, mas sem se limitar os mesmos, os seguintes: radio- isótopos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 125l, 1311), marcas fluorescentes (por e- xemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos, marcas luminescentes, marcas enzimáticas (por exemplo, peroxidase de rábano-silvestre, beta- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimiluminescente, e grupos biotinila.
Métodos de conjugação ou marcação dos anticorpos discutidos acima poderão ser prontamente realizados por aquele versado no estado da técnica (ver, por exemplo, Inman, ‘"Methods in Enzymology", Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification'. Parte B, Jakoby e Wichek (eds), Academic Press, Nova Iorque, p. 30, 1974; e Wilchek e Bayer, “The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications”, Anal. Biochem. 171:1-32, 1988).
Para aplicações diagnósticas, o anticorpo anti-QC é em um estado livre ou imobilizado em um suporte sólido tais como um tubo, uma conta, ou qualquer outro suporte convencional usado no campo.
Imobilização é obtida usando meios diretos ou indiretos. “Meios diretos” incluem adsorção passiva (ligação não-covalente) ou ligação cova- lente entre o suporte e o reagente. Por “meios indiretos” entende-se que um composto antirreagente que interage com um reagente é primeiro ligado ao suporte sólido. Meios indiretos poderão também empregar um sistema de receptor ligante, por exemplo, em que uma molécula tal como uma vitamina é enxertada no reagente e o receptor correspondente imobilizado na fase sólida. Isso é ilustrado pelo sistema biotina-estreptavidina.
Aqueles versados no estado da técnica prontamente entenderão que um complexo imune é formado entre QC na amostra biológica e o anticorpo, e que qualquer material não-ligado é removido antes de detectar o complexo. Entende-se que um anticorpo da invenção é utilizado para quantificar uma quantidade de QC na amostra biológica, tais como, por exemplo, sangue, plasma, linfócitos, fluido cerebrospinal, urina, saliva, epitélio e fibro- blastos.
Conforme é conhecido no estado da técnica, a determinação de tal ligação de anticorpos pode ser realizada usando uma grande variedade de formatos de imunoensaios, incluindo, mas sem se limitar os mesmos, ensaio imunoturbidimétrico (aglutinação), ensaio imunoadsorvente enzimático (ELISA) e rádio-imunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, “Principles and Practice of Immunoassay” (1991) Christopher P. Price e David J. Neoman (eds.), Stockton Press, Nova Iorque, N.I. e Ausubel e outros (eds.) (1987) in “Current Protocols in Molecular Biology” John Wiley and Sons, Nova Iorque, N. I., ambos os quais são incorporados neste relatório como referência). Detecção poderá ser por meio de métodos colorimétricos ou radioativos ou quaisquer outros métodos convencionais conhecidos daquele versado no estado da técnica. Outras técnicas padrão conhecidas no estado da técnica são descritas in “Methods in Immunodiagnosis”, 2a. Edição, Rose e Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1980 e Campbell e outros, “Methods of Immunology”, W. A. Benjamin, Inc., 1964; Patente dos Estados Unidos Nos. 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288 e 4.837.168, cujas descrições são incorporadas neste relatório como referência. Para uma revisão dos imunoensaios gerais, ver também “Methods In Cell Biology”, Vol. 37, Asai, Ed. Academic Press, Inc. Nova Iorque (1993); “Basic and Clinical Immunology’, 7a. Edição, Stites & Terr, eds. (1991).
Tais ensaios de detecção de QC poderão ser um imunoensaio direto, indireto, competitivo ou não-competitivo conforme descrito no estado da técnica (ver, por exemplo, “Principles and Practice of Immunoassay (1991) Christopher P. Price e David J. Neoman (eds.), Stockton Press, Nova Iorque, N.I.; Ausubel e outros (eds.) (1987) in “Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, Nova Iorque, N. I.; e Oellirich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904, incorporados neste relatório como referência.
Imunoensaios não-competitivos são ensaios em que a quantidade de QC é diretamente detectada. No ensaio intercalado, por exemplo, os anticorpos anti-QC podem ser ligados diretamente a um substrato sólido onde são imobilizados. Esses anticorpos imobilizados em seguida capturam o QC presente na amostra biológica. O QC desse modo imobilizado é então ligado por um agente de marcação, tal como um segundo anticorpo QC humano que leva uma marca.
Em um imunoensaio competitivo, a quantidade de antígeno presente na amostra biológica é determinada indiretamente seguindo adição de uma quantidade conhecida de antígeno marcado para a amostra e detecção da quantidade de antígeno marcado ligado com anticorpos. Por exemplo, uma quantidade conhecida de, nesse caso, QC marcado é adicionada à a mostra biológica e a amostra é em seguida contatada com anticorpos anti- QC. A quantidade de QC marcado ligado ao anticorpo anti-QC é inversamente proporcional à concentração de QC na amostra biológica. Isso é porque quanto maior a quantidade de QC marcado detectada, menor a quantidade de QC que foi disponível na amostra biológica para competir com o QC marcado.
Kits diagnósticos para realização dos ensaios para diagnosticar DA, MCI ou NDS em um indivíduo são também proporcionados. Desse modo, a presente invenção pode ser praticada usando um kit diagnóstico que inclui pelo menos um anticorpo específico para QC, e suas isoformas, conforme descrito neste relatório, bem como quaisquer reagentes necessários para a detecção de complexos imunes de ligação a anticorpo-QC. Geralmente, o kit poderá incluir um anticorpo único que especificamente reconhece QC, e suas isoformas. Por outro lado, o kit poderá incluir um anticorpo primário que especificamente reconhece QC, e suas isoformas, bem como um anticorpo secundário que é conjugado com uma marca que produz sinal e é capaz de ligar-se ao anticorpo primário, ou sob um sítio diferente do sítio onde o anticorpo primário liga-se. A marca produzindo sinal que se liga ao anticorpo secundário poderá ser, mas sem se limitar a mesma, uma enzima, tal como peroxidase de rábano-silvestre ou fosfatase alcalina. Os kits pode-rão adicionalmente compreender outros reagentes para realização do ensaio tais como tampões, um suporte sólido, soluções e similares. O kit poderá também conter instruções para realização do método da invenção usando um ou mais anticorpos em ensaios diagnósticos.
EXEMPLOS DA INVENÇÃO Exemplo 1: Formação de Aβ N3pE-42 e expressão de QC in vivo Uma distribuição muito difundida de QC foi detectada em cérebro de mamífero com expressão considerável no hipocampo e córtex. A fim de avaliar se expressão de QC em DA pode ser correlacionada com geração de Aβ N3pE-42, mRNA de QC e proteína, concentrações foram analisadas em amostras cerebrais neocorticais humanas pós-morte (figura 1a, b). Curiosamente, os inventores verificaram uma indução de mRNA de QC e proteí- na em amostras cerebrais de DA, comparada com envelhecimento normal. Além disso, concentrações significativas de Aβ N3pE-42 foram detectadas em amostras de pacientes com DA em contraste com indivíduos não- dementes suportando um papel de QC na geração de Aβ N3pE-42 (figura 1c). Por outro lado, análise ELISA revelou altas concentrações de Aβ x-42 em indivíduos de controle normalmente envelhecidos e um aumento muito menor em estágios prematuros de DA (figura 1c). Essa observação foi corroborada por meio de imuno-histoquímica aplicando anticorpos que detectam Aβ (4G8) ou especificamente Aβ N3pE-42 (figura 1d). Imunorreatividade conspícua de Aβ foi detectada em seções cerebrais de todos os grupos. Em contraste, coloração de Aβ N3pE-42 foi ausente no envelhecimento normal, mas específico em relação a tecido cerebral de DA, em que carga de placa imunorreativa de Aβ N3pE-42 foi quase tão alta quanto o total de densidade de placa de Aβ.
Material e métodos Tecido Cerebral Humano A diagnose definida de DA para todos os casos usados nesse estudo foi baseada na presença de emaranhamento neurofibrilar e placas neuríticas na formação hipocampal e áreas neocorticais e satisfez os critérios do Instituto Nacional de Transtornos Neurológicos e Comunicativos e Acidente Vascular (NINDS) e a Doença de Alzheimer e Associação de Transtornos Relacionados (Related Disorders Association (ADRDA). Tecido cortical (área Brodmann 22) dos mesmos casos foi utilizado para a quantificação de concentrações de mRNA de QC, proteína de QC e Aβ N3pE-42. No total, 10 casos de controle e 10 casos de DA, cada um, de estadiamento de Braak l-ll e V-VI foram analisados. Os grupos foram emparelhados em relação a gênero e idade (controle: média 72 anos ± 6,6 anos; DA l-ll: média 73 anos ±3,1 anos; DA V-VI: média 77 anos ± 6,6 anos). O intervalo médio pós-morte (IMP) foi similar entre os grupos e variou de 26 a 96 horas. A du-ração de IMP foi nem relacionada com a detecção de QC por análise Western blot nem para quantificação de Aβ por ELISA. Para detecção de mRNA de QC por meio de qRT-RCP, apenas amostras tissulares com um IMP a- baixo de 48 horas foram incluídas. Quantificação de mRNA de QC e análise Western blot de QC Amostras tissulares foram homogeneizadas por meio do homo- geneizador Precellys com contas de cerâmica de 1,4 mm (5.000 rpm, 30 segundos, peqlab). RNA foi isolado usando o kit NucleoSpin de RNA II (Mache- rey Nagel) de acordo com as instruções do fabricante. 100 ng de RNA constante foram transcritos inversos para cDNA usando iniciadores aleatórios (Roche) e Superscript II (Invitrogen). RCP quantitativa em tempo real foi realizada em um Rotorgene3000 (Cobertt Research) usando o Ensaio Primer QuantiTect para QPCT (QT00013881, Qiagen), bem como o kit QuantiTect SYBR Green RT-RCP (Qiagen). Quantidades absolutas de QC foram determinadas usando seis diluições do DNA padrão externo de QC (QC de comprimento total clonado no vetor pcDNA3) em duplicata. Para verificação da RCP, curvas de fusão do produto foram geradas e amplicons simples foram confirmados por meio de eletroforese em gel de agarose. Quantidades abso-lutas foram determinadas com o software Rotorgene versão 4.6 no modo quantificação. Fez-se normalização contra os dois genes de infra-estrutura mais estavelmente expressos HPRT e GAPDH (geNorm). Para análise l/Ves- tern-Blot, as amostras cerebrais (50 mg) foram homogeneizadas em tampão (1 ml) contendo Tris 10 mM pH 7,5, NaCI 100 mM, EDTA 5 mM e Triton X- 100 a 0,5% e glicerol a 10%. O tecido foi homogeneizado por diversos acidentes vasculares cerebrais no homogeneizador Downs e submetido a 3 x/10 s de choque ultrassónico. O homogenato resultante foi depurado por meio de centrifugação sob 20.000xg por 25 minutos. Um total de 12 μg de proteína de cada amostra foi separada em Tris-Glicina SDS-PAGE. QC foi detectada usando anticorpos policlonais de coelho purificados elevada contra QC humana recombinante. Para visualização, membranas blot foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano- silvestre (Sinalização Celular) em TBS-T contendo 5% (p/v) de leite em pó e, subsequentemente, desenvolvidas usando o Sistema SuperSignal West Pico (Pierce) de acordo com o protocolo do fabricante. Exemplo 2: Determinação de taxa de expressão qênica de QC e CCL2 em células THP-1 estimuladas
Células THP-1 de linhagem celular de leucemia monocítica humana foram cultivadas em suspensão (meio 5 x 105 células por ml) em RP- MI-1640 (Rosewell Park Memorial Institute Medium 1640 (Invitrogen)) contendo FCS a 10% (=FBS (Fetal Bovine Serum), Soro Fetal Bovino (Invitrogen)) e 60 μg/ml de gentamicina (Invitrogen) a 37°C em CO2 a 5% e 95% de atmosfera de ar umidificado.
Para investigar efeitos de estimulação de QC e CCL2, células 2x 106 foram semeadas em placas de 24 poços (Greiner) para meio de cultura de 1 ml sem FCS contendo diferentes concentrações de lipopolissacarídeos (LPS; Sigma). Após 24 horas de incubação, o meio foi removido das células por meio de centrifugação (5 minutos 300 x g).
Isolamento de RNA foi realizado com o Kit Nucleo-Spin® RN A II (Macherey & Nagel) seguido pela determinação da concentração de RNA. Usando o Kit de Transcriptase Reversa SuperScript®l\ de Invitrogen, 1 μg de RNA foi transcrito para cDNA.
A taxa de expressão gênica de QC e CCL2 foi determinada via RCP quantitativa com o ciclador Rotor-Gene® 3000 em tempo real. Usando o método comparativo do software de operação, a alteração da taxa de expressão gênica das sondas estimuladas comparada com o controle não- estimulado pode ser mostrada. A normalização foi realizada contra o gene de referência YWHAZ (proteína de ativação tirosina 3-mono- oxigenase/triptofano 5-mono-oxigenase). Os resultados são mostrados na figura 2. Exemplo 3: Determinação da atividade específica de QC em meio condicionado de células THP-1
Células THP-1 5 x 106 foram semeadas em 5 ml de RPMI-1640 (Invitrogen) sem vermelho de fenol e sem FCS para frascos de suspensão de 25 cm2 (Greiner) e estimuladas com diferentes concentrações de LPS (Sigma). Após incubação de 24 horas a 37°C e CO2 a 5%, as células foram separadas do meio, o qual foi reduzido por centrifugação (4.000 x g) usando Concentradores U-Tube®6-'\Q (Merck, Novagen) com um MWCO (Molécula- re Weight Cut Off) Corte de Peso Molecular de 10 kDa para um volume final de 250 μl. Seguiu-se a análise da concentração proteica via método Bradford. A determinação da atividade específica de QC foi realizada usando um método de HPLC estabelecido in-house. Os resultados são mostrados na figura 3. Exemplo 4: Determinação de atividade de QC
Ensaios fluorométricos Todas as medições foram realizadas com um BioAssay Reader HTS-7000Plus para microplacas (Perkin Elmer) a 30°C. Atividade de QC foi avaliada fluorometricamente usando H-GIn-bNA. As amostras consistiram de substrato fluorogênico 0,2 mM, piroglutamil aminopeptidase 0,25 U (Unizy- me, H^rsholm, Dinamarca) em Tris 0,2 M/HCI, pH 8,0 contendo EDTA 20 mM e uma alíquota de QC apropriadamente diluída em um volume final de 250 μl. Comprimentos de ondas de excitação/emissão foram de 320/410 nm. As reações de ensaio foram iniciadas por meio de adição de glutaminil ciclase. Atividade de QC foi determinada a partir de uma curva padrão de b- naftilamina sob condições de ensaio. Uma unidade é definida como a quantidade de QC que catalisa a formação de 1 μmol de pGlu-bNA a partir de H- Gln-bNA por minuto sob as condições descritas.
Em um segundo ensaio fluorométrico, QC foi atividade determinada usando H-GIn-AMC como substrato. Reações foram realizadas a 30°C utilizando o leitor de microplacas NOVOStar (BMG Labtechnologies). As amostras consistiram de concentrações variáveis do substrato fluorogênico, piroglutamil aminopeptidase 0,1 U (Qiagen) em Tris 0,05 M/HCI, pH 8,0 contendo EDTA 5 mM e uma alíquota de QC apropriadamente diluída em um volume final de 250 μl. Comprimentos de ondas de excitação/emissão foram de 380/460 nm. As reações de ensaio foram iniciadas por meio de adição de glutaminil ciclase. Atividade de QC foi determinada a partir de uma curva padrão de 7-amino-4-metilcumarina sob condições de ensaio. Os dados cinéticos foram avaliados usando software GraFit.
Ensaio espectrofotométrico de QC Nesse ensaio, atividade de QC foi analisada espectrofotometri- camente usando um método contínuo que foi derivado adaptando um ensaio descontínuo anterior (Bateman, R. C. J. 1989; J. Neurosci. Methods 30, 23- 28) utilizando glutamato desidrogenase como enzima auxiliar. Amostras consistiram do substrato QC respectivo. NADH 0,3 mM, ácido a-cetoglutárico 5 14 mM e 30U/ml de glutamato desidrogenase em um volume final de 250 μl.
Reações foram iniciadas por meio de adição de QC e prosseguidas por meio de monitoração da diminuição na absorbância a 340 nm por 8-15 minutos.
As velocidades iniciais foram avaliadas e a atividade enzimática foi determinada a partir de uma curva padrão de amónia sob condições de 10 ensaio. Todas as amostras foram medidas a 30°C, usando o leitor de micro- placas SPECTRAFIuor Plus ou o Sunrise (ambos de TECAN). Dados cinéticos foram avaliados usando software GraFit.

Claims (9)

1. Método de diagnóstico de Doença de Alzheimer (DA), Neuro- degeneração em Síndrome de Down (NSD) ou Comprometimento Cognitivo Leve (MCI) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) detectar a quantidade de glutaminil ciclase (QC), ou uma isoforma da mesma, em uma amostra biológica obtida do indivíduo; e (b) comparar a quantidade detectada de QC na amostra bioló-gica com uma quantidade de característica de QC de um controle normal; em que uma quantidade elevada de QC na amostra biológica re-lativa ao controle normal é um indicador positivo de DA, NSD ou MCI.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) detectar a quantidade de glutaminil ciclase (QC), ou uma isoforma da mesma, em uma amostra biológica obtida do indivíduo; e (b) adicionalmente detectar a quantidade de Aβ N3pE-X; (c) comparar a quantidade detectada de QC e Aβ N3pE-X na amostra biológica com uma quantidade de QC e característica de Aβ N3pE-X de um controle normal; de forma que uma quantidade elevada de QC e Aβ N3pE-X na amostra biológica relativa ao controle normal é um indicador positivo de DA, NSD ou MCI, e X é um número inteiro selecionado de 38, 40 e 42.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é soro, plasma, urina ou fluido cerebros-pinal.
4. Método de acordo com a reivindicação1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade de QC é detectada por meio de ensaio imuno- turbidimétrico, imunofluorescência, imunodifusão, ensaio imunoadsorvente enzimático (ELISA), rádio-imunoensaio (RIA), WESTERN BLOT, ensaio de atividade proteica, NORTHERN BLOT, RCP, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de massa (EM), cromatografia gasosa (CG), CG-EM, CL-EM ou CL-EM/EM.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade de QC, ou uma isoforma da mesma, é detectada com base do nível de proteína ou do nível de RNAm da referida QC ou isoforma da mesma.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade de QC é detectada usando um anticorpo que especificamente se liga a QC, ou uma isoforma da mesma.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade de QC é detectada medindo a atividade enzimática de QC, ou uma isoforma da mesma.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que não apenas uma única forma dos peptídeos beta-amiloide N-terminalmente truncados e piroglutamatados, mas uma combinação de Aβ N3pE-42 e/ou Aβ N3pE-40 e/ou Aβ N3pE-38, e pGluABri e/ou pGluADan é detectada juntamente com QC.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) contatar a amostra biológica com um anticorpo que se liga a glutaminil ciclase (QC), ou suas isoformas; (b) permitir que o anticorpo e QC formem um complexo imune; (c) detectar a quantidade de complexo imune formado como uma indicação da quantidade de QC na amostra biológica; e (d) comparar a quantidade detectada com uma amostra de indi-víduo de controle normal; de forma que uma quantidade detectada que é elevada ou redu-zida relativa ao controle normal é um indicador positivo de uma doença neu- rodegenerativa.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2537029A1 (en) * 2010-02-18 2012-12-26 Probiodrug AG Methods of diagnosing inflammatory diseases by determining pyroglutamate-modified mcp-1 and screening methods for inhibitors of glutaminyl cyclase
SG194770A1 (en) 2011-05-27 2013-12-30 Probiodrug Ag Radiolabelled glutaminyl cyclase inhibitors
US20170363645A1 (en) 2014-12-19 2017-12-21 Probiodrug Ag Novel Method for the Detection of pGlu-Abeta Peptides
CN104946680A (zh) * 2015-06-11 2015-09-30 深圳大学 用于表达qc的重组载体及其制备方法、引物、基因工程菌
KR102362919B1 (ko) * 2016-07-08 2022-02-16 아지노모토 가부시키가이샤 경도 인지 장해 또는 알츠하이머형 인지증의 평가 방법
KR102858457B1 (ko) * 2023-06-07 2025-09-11 계명대학교 산학협력단 Ccl8 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 바이오마커 조성물

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4374316B2 (ja) * 1993-01-25 2009-12-02 武田薬品工業株式会社 β−アミロイドまたはその誘導体に対する抗体およびその用途
JP3590468B2 (ja) * 1996-01-22 2004-11-17 財団法人 東京都医学研究機構 アルツハイマー病診断薬
WO2004013172A2 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
US7732162B2 (en) * 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
PL1620082T3 (pl) * 2003-05-05 2010-10-29 Probiodrug Ag Medyczne zastosowanie inhibitorów cyklazy glutaminylowej i glutaminianowej do leczenia choroby Alzheimera i zespołu Downa
AU2004283461B2 (en) * 2003-10-15 2010-02-11 Probiodrug Ag Use of effectors of glutaminyl and glutamate cyclases
US20060094064A1 (en) * 2003-11-19 2006-05-04 Sandip Ray Methods and compositions for diagnosis, stratification, and monitoring of alzheimer's disease and other neurological disorders in body fluids
WO2005075436A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-18 Probiodrug Ag Novel inhibitors of glutaminyl cyclase
JP2008535892A (ja) * 2005-04-11 2008-09-04 プロビオドルグ エージー プロリルエンドペプチダーゼの阻害剤
ES2373048T3 (es) * 2006-06-08 2012-01-30 Fu Berlin Análisis para el diagnóstico de la enfermedad de alzheimer basado en la determinación de la proporción de productos de escisión ab de secretasa.
WO2008034891A2 (en) * 2006-09-21 2008-03-27 Probiodrug Ag Novel genes related to glutaminyl cyclase
EP2395095A1 (en) * 2007-01-19 2011-12-14 Probiodrug AG In vivo screening models for treatment of Alzheimer's disease and other QPCT-related disorders

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