BRPI0917192B1 - Produção de metionina sem n-acil-metionina - Google Patents
Produção de metionina sem n-acil-metionina Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0917192B1 BRPI0917192B1 BRPI0917192B1 BR PI0917192 B1 BRPI0917192 B1 BR PI0917192B1 BR PI0917192 B1 BRPI0917192 B1 BR PI0917192B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- methionine
- amino acid
- acylase
- acyl
- expression
- Prior art date
Links
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 title claims description 108
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims description 101
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 45
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 claims description 38
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 claims description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 30
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 30
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 30
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 26
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 12
- RBAAEQRITQHPJM-LURJTMIESA-N N-propanoyl-L-methionine Chemical compound CCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC RBAAEQRITQHPJM-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 11
- 101150072344 argA gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101100485337 Bacillus subtilis (strain 168) xylB gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100513608 Escherichia coli (strain K12) mnaT gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100129646 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) yncA gene Proteins 0.000 claims description 9
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 8
- 101001074429 Bacillus subtilis (strain 168) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog PksD Proteins 0.000 claims description 6
- 101000936617 Bacillus velezensis (strain DSM 23117 / BGSC 10A6 / FZB42) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog BaeD Proteins 0.000 claims description 6
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101100488178 Escherichia coli (strain K12) yedL gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100213289 Escherichia coli (strain K12) yfaP gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100106376 Escherichia coli (strain K12) yjhQ gene Proteins 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 108010003977 aminoacylase I Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 6
- 101150052631 yjdJ gene Proteins 0.000 claims description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101150105638 argE gene Proteins 0.000 claims description 5
- -1 dithionate Chemical compound 0.000 claims description 5
- 101150065300 yncA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NZIOTNYOYJRBSN-UHFFFAOYSA-N 2-(butanoylamino)-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CCCC(=O)NC(C(O)=O)CCSC NZIOTNYOYJRBSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108030006759 Acetylornithine deacetylases Proteins 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 7-[(6,8-dichloro-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino]-n-[2-(1h-indol-3-yl)ethyl]heptanamide Chemical compound C1CCCC2=NC3=CC(Cl)=CC(Cl)=C3C(NCCCCCCC(=O)NCCC=3C4=CC=CC=C4NC=3)=C21 ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 229940075933 dithionate Drugs 0.000 claims description 2
- 101100107519 Escherichia coli (strain K12) aaaT gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000011882 N-acyl-L-amino-acid amidohydrolases Human genes 0.000 claims 1
- 108050002335 N-acyl-L-amino-acid amidohydrolases Proteins 0.000 claims 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-M dithionite(1-) Chemical compound OS(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 101150019398 fabY gene Proteins 0.000 claims 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 113
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 26
- 229940099459 n-acetylmethionine Drugs 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 101150086633 metAA gene Proteins 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 8
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 4
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 101150094831 cysK gene Proteins 0.000 description 3
- 101150112941 cysK1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150029709 cysM gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 101150036810 eco gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 241000370685 Arge Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 2
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 2
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150015622 pyk gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108020000318 saccharopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101150003830 serC gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XUBATEVJJZIKPI-ZETCQYMHSA-N (2s)-4-methylsulfanyl-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCSC XUBATEVJJZIKPI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 description 1
- 101710184601 Acetolactate synthase 2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 102100035709 Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 101000889837 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) Protein CysO Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310802 Dictyostelium discoideum splA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100498062 Escherichia coli (strain K12) cysK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100420922 Escherichia coli (strain K12) sdaB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010016979 Homoserine O-succinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101100433987 Latilactobacillus sakei subsp. sakei (strain 23K) ackA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N N(2)-acetyl-L-ornithine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC[NH3+] JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N N-acetyl-L-glutamic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 1
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001135788 Pinus taeda (+)-alpha-pinene synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 101100386153 Rhodopirellula baltica (strain DSM 10527 / NCIMB 13988 / SH1) cysNC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000204060 Streptomycetaceae Species 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710188371 Sulfate-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000006843 Threonine synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 101150015189 aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077561 aceF gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 101150006213 ackA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 108010061206 arginine succinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- UUQMNUMQCIQDMZ-UHFFFAOYSA-N betahistine Chemical compound CNCCC1=CC=CC=N1 UUQMNUMQCIQDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150116694 cysC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111924 cysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000850 deacetylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 101150097303 glyA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079604 glyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150051471 metF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042623 metH gene Proteins 0.000 description 1
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 101150065062 purU gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100525 pykA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150053304 pykF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 101150100082 sdaA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 101150031436 sucD gene Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 108010062110 water dikinase pyruvate Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Description
(54) Título: PRODUÇÃO DE METIONINA SEM N-ACIL-METIONINA (51) lnt.CI.: C12P 13/12 (30) Prioridade Unionista: 12/02/2009 US 12/370,422, 22/08/2008 EP PCT/EP2008/061005 (73) Titular(es): EVONIK DEGUSSA GMBH (72) Inventor(es): GWÉNAÉLLE BESTEL-CORRE; RAINER FIGGE; PHILIPPE SOUCA1LLE (85) Data do Início da Fase Nacional: 21/02/2011
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: PRODUÇÃO
DE METIONINA SEM N-ACIL-METIONINA.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para a produção de metionina ou seus derivados cultivando um microorganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre.
microorganismo e/ou o meio de cultura e/ou os parâmetros do processo foram modificados de um modo que o acúmulo do subproduto N-acil-metionina (NAM) é reduzido. O isolamento de metionina ou seus derivados a partir do meio de fermentação também é reivindicado.
TÉCNICA ANTERIOR
Os compostos contendo enxofre, tais como cisteína, homocisteína, metionina ou S-adenosilmetionina são críticos para o metabolismo celular e são produzidos industrialmente para serem usados como aditivos de alimento ou de alimentação e farmacêuticos. Em particular, metionina, um aminoácido essencial, que não pode ser sintetizado por animais, desempenha um papel importante em muitas funções do corpo. Atualmente, D,L-metionina é produzida por síntese química de acroleína, metil mercaptano e cianeto de hidrogênio. 0 aumento dos preços para os precursores de derivados de petróleo acroleína e metil mercaptano, somados à procura aumentada de metionina torna a produção microbiana de metionina atrativa.
A via para a síntese de L-metionina é bem conhecida em muitos microorganismos (revisado em Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbíol Monogr (5) Amino acid biosynthesis pl64-185). As cepas de E. coli e C. glutamícum produtoras de metionina são descritas nos pedidos de patente
W02005/111202, W02007/077041, W02007/012078 e
WO2007/135188.
A metionina produzida por fermentação precisa ser purificada a partir do caldo de fermentação. A purificação de metionina de custo eficaz depende das cepas produtoras e dos processos de produção que minimizam a quantidade de subprodutos no caldo de fermentação. Os subprodutos originam-se das vias de transformação e/ou degradação de metionina. Em particular, estes produtos são S-adenosilmetionina (SAM), tio-metil-ribose e N-acil-metioninas (NAM) tal como N-acetil-metionina e N-propionil-metionina. Como no pedido de patente PCT/EP2007/060433, as cepas de E. coli produtoras de metionina produzem N-acetil-metionina. E.
coli também produz N-propionil-metionina.
A produção de NAM não é desejável, já que ela reduz o rendimento de metionina e torna a purificação de metionina mais difícil. NAM pode ser transformado em metionina e acetato pela adição de NAM acilases ao término do ciclo de fermentação, mas isto aumenta drasticamente o custo do produto. Portanto, é necessário reduzir ou eliminar o acúmulo de NAM durante o ciclo de fermentação. Isto requer uma boa compreensão das reações que são responsáveis pelo acúmulo de NAM.
A aciiação no término N de metionina como um processo co-translacional é uma das modificações de proteína mais comuns em eucariotos. Contudo, é improvável que a N-acetil10 metionina seja produzida por acetilases no término N (para revisão ver Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 3647936482), desde que metionina parece ser acetilada como um aminoácido livre em metionina produzindo bactérias e a acetilação de metionina como um processo co-translacional é rara em procariotos (Driessen et al. 1985, CRC Crit. Rev.
Biochem. 18, 281-325). A N-acetil-metionina é mais provavelmente obtida acetilando L-metionina livre. As enzimas de N-acetilação, que possivelmente podem acetilar metionina, são descritas. Por exemplo, ArgA codifica um N20 acetil-glutamato sintase em E. coli (Marvil & Leisinger
1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303).
Até agora, as enzimas capazes de catalisar a produção biossintética de N-acetil-metionina, N-propil-metionina ou outros derivados de metionina com cadeias de acila mais longas eram desconhecidas. A identificação das atividades maiores de metionina-N-acil transferase e sua atenuação em metionina produzindo microorganismos são assim cruciais para a redução da produção de NAM.
0 acúmulo de NAM também pode ser reduzido desacetilando o NAM acumulado para obter metionina. A desacetilação de grupos N-acila de aminoácidos é demonstrada em bactérias. Por exemplo, N-acetilornitina codificada por ArgE tem um amplo espectro de substrato e desacetila eficazmente N-acetilmetionina (Javid-Majd &
Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93). Assim, a superexpressão de argE ou outro aminoácido desacetilase, tal como acilase I de rim de rato (Giardina et al 2000 Eur. J.
Biochem. 267, 6249-55), Aspergillus niger ou rim de porco aminoácido acilase de (Gentzen et al. 1980 Z. Naturforsch c, 544-50) pode reduzir o acúmulo de NAM.
Desde que NAM é exportado no espaço extracelular, a exportação de NAM acilases no espaço periplásmico ou extracelular pode ser uma vantagem. Vários sistemas de exportação são conhecidos em E. coli, que permitem a exportação no periplasma, por exemplo sistemas TAT e Sec (revisado em Manting & Driessen 2000 Mol Microbiol 37, 22638, Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625635). Exportação através da via de TAT ou Sec requer a presença de peptídeos de sinal específicos. Se a exportação no espaço extracelular é favorecida, a proteína de interesse pode ser fundida a proteínas transportadoras que são normalmente exportadas no meio, tal como ompF ou hemolisina (Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol.
64, 625-635). A proteína também pode ser exportada no meio ou exibida sobre a superfície das células fundindo a mesma a domínios de proteína que são requeridos para a exportação de proteínas auto-transportadoras, tal como IgAl de N.
gonorrhoeae ou AIDA-I de E. coli. As proteínas também podem ser exportadas através da via de dois parceiros ou exibição de fago (Jacob-Dubuisson et al. 2004 Biochim et Biophys Act
1694 235-257, José & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol
Rev 71, 600-19). O projeto do processo também mostra impactar sobre a exportação de certas proteínas (Shokri et al 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64).
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Os requerentes resolveram o problema de reduzir o acúmulo do subproduto N-acil-metionina (NAM) em cepas produtoras de metionina.
Os inventores identificaram a atividade maior de metionina N-acriltransferase (MNAT), que catalisa a conversão de metionina em NAM, a ser codificada pelo gene yncA em E. coli.
Um microorganismo modificado apresentando uma atenuação da expressão do gene yncA, e, portanto, uma produção reduzida de NAM, é divulgado no presente.
Os inventores também mostraram que a super-expressão de enzimas de desacilação, tal como o aminoácido acilase de
Aspergillus oryzae ou rim de porco aminoácido acilase, que convertem NAM em metionina, leva a uma quantidade diminuída de NAM. De preferência, as ditas enzimas de desacetilação são exportadas no periplasma ou no espaço extracelular.
Em outro aspecto, as condições de cultura foram adaptadas para obter uma redução da produção e/ou acúmulo de NAM.
Estes três meios para reduzir o acúmulo de NAM foram aplicados individualmente ou em combinação, para reduzir o acúmulo de NAM.
Glicose é usada como um substrato modelo e E. coli recombinante como organismo modelo, mas a invenção não está limitada a estas características.
Consequentemente, o objeto da presente invenção é prover um microorganismo em que a expressão dos genes codificando MNAT (metionina N-acil-transferase) maiores é atenuada, de preferência os genes correspondentes deletados, e/ou as enzimas de desacilação de NAM homólogas ou heterólogas foram supre-expressadas, para reduzir o acúmulo de NAM.
Este microorganismo com produção e/ou acúmulo de NAM diminuída mostra uma produção/rendimento da fonte de carbono de metionina melhorada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a um método para a produção de metionina, seus derivados, ou precursores em um processo fermentativo compreendendo as seguintes etapas:
- cultivar um microorganismo modificado em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono, uma fonte de enxofre e uma fonte de nitrogênio, e
- recuperar metionina e/ou seus derivados do meio de cultura, sendo que comparado a um microorganismo ou método não modificado, o microorganismo ou o método foi modificado para reduzir o acúmulo do subproduto N-acil metionina.
Em um aspecto particular da invenção, a N-acil metionina cujo acúmulo é reduzido é escolhida dentre o seguinte grupo: N-acetil-metionina, N-propionil-metionina,
N-butiril-metionina, e combinações dos mesmos.
O acúmulo do subproduto N-acil metionina pode ser obtido em pelo menos uma das seguintes modificações:
- A atenuação da expressão de pelo menos uma metionina
N-acil transferase (isto é, transacilases) no microorganismo, e/ou
- A expressão (ou intensificação da expressão) de pelo menos uma amino acilase específica de metionina no microorganismo; e/ou
- A variação das condições de cultura tais como pH, temperatura de oxigenação, e/ou adição de um NAM acilase no meio de cultura, e combinações dos mesmos.
De acordo com a invenção, os termos 'cultura', 'fermentação' ou 'processo fermentativo' são usados intercambiavelmente para denotar um crescimento de bactérias em um meio de crescimento contendo uma fonte de carbono simples.
Um meio de cultura apropriado é um meio apropriado para a cultura e crescimento do microorganismo. Tais meios são bem conhecidos na técnica de fermentação de microorganismos, dependendo do microorganismo a ser cultivado.
A frase recuperar metionina e/ou seus derivados do meio de cultura designa a ação de recuperar metionina, e possivelmente SAM e NAM e todos os outros derivados que podem ser úteis.
O termo microorganismo designa uma bactéria, levedura ou fungo. De preferência, o microorganismo é selecionado dentre Enterobacteriaceae, Bacillaceae,
| Streptomycetaceae e | Corynebacteriaceae. | Mais | |
| preferivelmente, | o microorganismo é uma espécie | de | |
| Escherichia, | Klebsiella, | Pantoea, Salmonella | ou |
| Corynebacterium. | Ainda | mais preferivelmente, | o |
| microorganismo | é tanto a | espécie Escherichia coli | ou |
| Corynebacterium | glutamicum. | ||
| 0 termo | microorganismo modificado denota | um |
microorganismo que foi modificado geneticamente com o objetivo de reduzir o acúmulo de NAM no caldo de fermentação. O perito na técnica sabe como modular a expressão de genes específicos. Modificações comuns incluem transformar microorganismos com elementos genéticos, incluindo deleções de genes, substituições de genes, modificação de promotores, e introdução de vetores para a expressão de genes heterólogos.
Os inventores mostraram que NAM é formado pela acilação de metionina e identificaram o gene yncA como a maior enzima produzindo NAM. yncA, também conhecido como gene bl448 de E. coli, foi mencionado no pedido de patente
| 20 WO 2001070776. Ele é | parte de um | grupo de | genes | induzidos |
| pelo regulador Mar, | envolvido na | resistência a | múltiplas | |
| drogas. | ||||
| As enzimas de | aminoácido | acilases | (EC | 3.5.1.14), |
também denominadas desacetilases, catalisam a divagem hidrolítica de um aminoácido de acila para produzir o aminoácido livre e o ácido carbônico correspondente ao resto de acila. Mais especificamente, N-acil metionina acilases catalisam a reação de NAM em metionina e o ácido carbóxi correspondente.
O termo N-acil metionina designa N-formil-metionina,
N-acetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butiril metionina e, em geral, qualquer derivado de metionina compreendendo um grupo funcional derivado de qualquer ácido carboxílico em que falta a função hidroxila.
Para medir o acúmulo de N-acetil-metionina, a quantidade de N-acetil-metionina é determinada no caldo de fermentação usando HPLC refratométrica usando N-acetilmetionina (Sigma, Ref. 01310) como um padrão. N-propionil15 metionina é determinada no caldo de fermentação por GC-MS usando N-acetil-metionina como um padrão.
O acúmulo de NAM deveria ser reduzido pelo menos em
20%, de preferência 50%, mais preferivelmente, 80% e ainda mais preferivelmente 95% da quantidade acumulada em um processo com o organismo não modificado ou no processo não modificado.
O termo fonte de carbono, de acordo com a presente invenção, denota qualquer fonte de carbono que pode ser usada pelos peritos na técnica para suportar o crescimento normal de um microorganismo, que pode ser hexoses (tal como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarídeos, dissacarídeos (tal como sacarose, celobiose ou maltose), oligossacarídeos, melaços, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e combinações dos mesmos. Uma fonte de carbono especialmente preferida é glicose. Outra fonte de carbono preferida é sacarose.
Em uma modalidade particular da invenção, a fonte de carbono é derivada de matéria-prima renovável. A matéria10 prima renovável é definida como o material bruto requerido para certos processos industriais que podem ser regenerados dentro de um breve retardo e em quantidade suficiente para permitir sua transformação no produto desejado.
O termo fonte de nitrogênio corresponde tanto a um sal de amônio ou a gás amoníaco. A fonte de nitrogênio é suprida na forma de amônio ou amoníaco.
A fonte de enxofre usada para a produção fermentativa de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, pode ser qualquer um dos seguintes: sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, sulfeto de dimetila ou uma combinação dos mesmos.
Em uma modalidade preferida da invenção, a fonte de enxofre é sulfato e/ou tiossulfato.
Ά fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura apropriado adaptado ao microorganismo que é usado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, co-substratos para a produção de metabólitos.
Os peritos na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20°C e 55°C, de preferência entre 25°C 10 e 40°C, e mais especificamente cerca de 30°C para C.
glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.
Como um exemplo de meio de cultura conhecido para E.
coli, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 32:120-128), e meio M63 (Miller, 1992; A Short
Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and
Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio tal como definido por Schaefer et ai.
(1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).
Como um exemplo de meio de cultura conhecido para C. glutamicum, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) ou a um meio tal como descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol.
Biotechnol. 3: 573-583).
Em uma modalidade específica da invenção, a produção de N-acil-metionina é reduzida atenuando pelo menos uma das metionina transacilases. As metionina transacilases são também denominadas metionina N-aciltransferase (MNAT). argA codifica enzimas com atividade de metionina transacilase putativa. Os inventores purificaram a atividade de MNAT a partir de uma cepa de E. coli com uma delação de argA, sequenciaram a proteína purificada e mostraram que a proteína purificada, YncA, tem atividade de MNAT (pedido de patente PCT/EP2008/060999). A atenuação da expressão do gene yncA elimina uma grande quantidade da atividade de
MNAT residual, levando a uma redução dramática da produção de NAM, especialmente dos compostos N-acetil-metionina e Npropionil-metionina. Em uma modalidade preferida da invenção, YncA é inteiramente deletado do genoma de E.
coli.
Outras aciltransferases com uma atividade mais baixa foram identificadas, que permitem obter uma produção de NAM reduzida quando atenuadas; estas enzimas são codificadas pelos seguintes genes: yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ. Qualquer uma das metionina N-acil transferases descritas pode ser atenuada individualmente ou em combinação com as outras.
Os termos atenuar um gene ou 'atenuação da expressão de um gene' de acordo com a invenção denota a supressão parcial ou completa da expressão de um gene, que é então dito ser 'atenuado' . Esta supressão de expressão pode ser tanto uma inibição da expressão do gene, uma inserção em ou uma deleção de toda ou parte da região de promotor necessária para expressão do gene, uma deleção ou inserção na região de codificação do gene, ou a troca do promotor do tipo selvagem por um promotor natural ou sintético mais fraco. De preferência a atenuação de um gene é essencialmente a deleção completa desse gene, que pode ser substituído por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das cepas de acordo com a invenção. Um gene é inativado de preferência pela técnica de recombinação homóloga (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal· genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 97: 6640-6645).
Em outra modalidade específica da invenção, o acúmulo de N-acil-metionina pode ser reduzido pela expressão nas enzimas amino acilases específicas de microorganismo nativo ou metionina heteróloga.
• Ãsperçrillus N-acil amino ácido acilase • Porco N-acil amino ácido acilase • Acetilornitina desacetilase codificando E. coli argE, agindo também em N-acetilmetionina.
A expressão aumentada de amino acilases específicas de metionina aumenta a taxa de conversão de NAM em metionina com a produção concomitante de uma molécula do ácido carbóxi correspondente, tal como acetato, propionato ou butirato. O favorecimento do consumo de acetato superexpressando os genes acs, pta-ackA ou genes codificando a derivação de glioxilato também é parte da invenção.
Os termos intensificado ou super-expressado neste contexto descreve o aumento na atividade intracelular de uma atividade enzimática que é codificada pelo DNA correspondente, por exemplo, aumentando o número de cópias do gene, usando um promotor mais forte ou usando um alelo com atividade aumentada e possivelmente combinando estas medidas.
Os termos expressão aumentada, expressão intensificada ou super-expressão são usados 20 intercambiavelmente no texto e têm significado similar.
Para aumentar a expressão de um gene, ele pode ser codificado cromossomicamente ou extra-cromossomicamente.
Cromossomicamente pode haver uma ou várias cópias no genoma que podem ser introduzidas por métodos de recombinação conhecidos dos peritos no campo.
Extra-cromossomicamente, os genes podem ser transportados por diferentes tipos de plasmideos que diferem com respeito à sua origem de replicação e, assim, seu número de cópias na célula.
Eles podem estar presentes como 1-5 cópias, cerca de ou até 500 cópias, correspondendo a plasmideos com baixo número de cópias com replicação firme (pSClOl, RK2), plasmideos com baixo número de cópias (pACYC, pRSFlOlO) ou plasmideos com alto número de cópias (pSK bluescript II).
Em uma modalidade preferida da invenção, o gene pode ser expresso usando promotores com força diferente que podem ser indutíveis. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. O perito na técnica sabe que os promotores são os mais convenientes, por exemplo, os promotores Ptrc,
Ptac, Plac ou o promotor lamba cl são amplamente usados.
A expressão das enzimas pode ser reforçada ou reduzida por elementos estabilizando ou desestabilizando o RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998)
Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou as proteínas (por exemplo,
GST tags, Amersham Biosciences).
A presente invenção refere-se também a microorganismos que contêm um ou vários alelos do gene a ser intensificado de acordo com a invenção.
Todas as técnicas para transformar os microorganismos e elementos reguladores usados para intensificar a produção da proteína da invenção são bem conhecidas na técnica e disponíveis na literatura, incluindo os pedidos de patente de propriedade do requerente sobre a modificação das vias de biossíntese em vários microorganismos, incluindo
W02008/052973, W02008/052595, W02008/040387, WO2007/144346,
W02007/141316, W02007/077041, W02007/017710, W02006/082254,
W02006/082252, W02005/111202, W02005/073364, WO2005/047498,
W02004/076659, o conteúdo dos quais é incorporado ao presente por referência.
As enzimas N-acil-metionina serão expressas no espaço intracelular e podem permanecer no espaço intracelular ou ser exportadas no periplasma ou ser exportada no espaço extracelular. O perito no campo será capaz de identificar meios para marcar a proteína para o periplasma. A exportação também pode ser baseada na fusão de N-acetilmetionina acilases a proteínas como OmpF, por exibição de fago ou usando os sistemas de exportação de proteínas tal como via de dois parceiros ou auto-transporte. Em uma modalidade preferida da invenção, as enzimas NAM acilases são expostas no periplasma ou no compartimento extracelular para evitar a ciclização inútil entre NAM e metionina.
Em uma modalidade desta invenção, os inventores adaptaram os parâmetros do processo de fermentação, isto é, as condições de cultura, para reduzir a produção de NAM.
Isto é realizado trocando o pH do caldo de fermentação, modificando os parâmetros de alimentação de oxigenação ou do substrato. Outra opção é adicionar no meio de cultura uma acilase especifica de NAM.
Em uma modalidade, a troca dos parâmetros de fermentação não inclui a privação do microorganismo para um substrato inorgânico tal como fosfato, potássio, magnésio.
Estes três meios para modular o acúmulo de NAM podem ser usados sozinhos ou combinados com um ou dois de outros meios.
Consequentemente, a atenuação da atividade de MNAT é obtida atenuando a expressão dos seguintes genes: yncA e/ou argA e/ou, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ, estes genes codificando as enzimas com metionina-N-aciltransferases. Esta atenuação pode ser combinada com a expressão aumentada das enzimas Nacil-metionina desacilase, tais como Aspergillus N20 aminoácido acilase, porco N-aminoácido acilase ou acetilornitina desacetilase codificada pelo gene argE.
Similarmente, a atenuação de pelo menos uma enzima
MNAT, como descrito acima, pode ser combinada com a adaptação dos parâmetros do processo, tal como pH, oxigenação, temperatura e/ou adicionando NAM acilase ao caldo de fermentação, permitindo juntos uma redução do acúmulo de NAM.
Similarmente, a expressão das enzimas NAM acilases pode ser combinada com a adaptação do processo. Detalhes de ambos os meios foram descritos acima.
Finalmente, todos os três meios podem ser combinados:
a atenuação da atividade de MNAT, a expressão aumentada das enzimas NAM acilases e a adaptação das condições de processo.
Na descrição da presente invenção, os genes e as proteínas são identificadas usando as denominações dos genes correspondentes em E. coli. No entanto, e a menos que especificado ao contrário, o uso destas denominações tem um significado mais geral de acordo com a invenção e cobre todos os genes e proteínas correspondentes em outros organismos, mais particularmente microorganismos.
PFAM (famílias de proteínas na base de dados de alinhamentos e modelos Markov ocultos;
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteína.
Cada PFAM torna possível visualizar múltiplos alinhamentos, ver domínios, avaliar a distribuição entre os organismos, ganhar acesso a outras bases de dados e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.
COGs (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ são obtidos comparando as sequências de proteína a partir de genomas completamente sequenciados representando linhagens filogênicas maiores.
Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, que permite a identificação dos primeiros domínios conservados.
Os meios para identificar sequências homólogas e suas homologias de percentagem são bem conhecidos dos peritos na técnica, e incluem em particular os programas BLAST, que podem ser usados a partir de um site da web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros default indicados no site da web. As sequências obtidas podem então ser exploradas (por exemplo, alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), com os parâmetros default indicados nos sites da web.
Usando as referências dadas em GenBank para genes conhecidos, os peritos na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando sequências de consenso que podem ser determinadas realizando os alinhamentos de sequência com genes derivados de outros microorganismos, e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos dos peritos na técnica, e são reivindicados, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. 2- ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor,
New York.).
A presente invenção também se refere a um microorganismo tal como descrito acima. Um microorganismo com um acúmulo e/ou produção reduzida de N-acil metionina é de particular utilidade para produzir metionina com alto rendimento. De preferência, o microorganismo de acordo com a invenção já é um alto produtor de metionina antes de ser usado no processo de acordo com a invenção.
A produção eficaz de metionina requer a otimização da via específica de metionina e várias vias que provêem precursores. As cepas que produzem metionina foram descritas nos pedidos de patente WO 2005/111202,
W02007/077041 e PCT/EP2007/060433 e são incorporadas como referência neste pedido.
Uma cepa que produz metionina que super-expressa alelos de homoserina succiniltransferase com sensibilidade à matéria-prima reduzida para seus inibidores SAM e metionina é descrita no pedido de patente WO 2005/111202.
Este pedido descreve também a combinação destes alelos com uma deleção do repressor de metionina MetJ (GenBank
1790373), responsável pela regulação para baixo do regulon de metionina como foi sugerido no pedido de patente JP
2000/157267. Além disso, as combinações das duas modificações com a super-expressão de aspartocinase/homoserina desidrogenase são descritas no pedido de patente WO 2005/111202.
A super-expressão dos genes cysE, metH e metF foi sugerida em WO 2007/077041.
A produção de metionina pode ser mais aumentada usando um alelo metB alterado que usa preferivelmente ou exclusivamente H2S e assim produz homocisteína de 0succinil-homoserina como foi descrito no pedido de patente
WO 2004/076659 que é incorporado ao presente por referência.
Outro aumento na produção de metionina pode ser obtido deletando os genes pykA, pykF e/ou purU como descrito no pedido de patente PCT/EP2007/060433. Este pedido também descreve cepas produzindo metionina em que os operons cysPUWAM, cysJIH e gevTHP e os genes será, serB, serC, Ipd e glyA são super-expressos.
Em E. coli, outras enzimas podem ser aumentadas em sua atividade para aumentar a produção de metionina (seguidas por números de acesso e da função do polipeptídeo correspondente):
A expressão dos genes envolvidos na assimilação de enxofre pode ser aumentada:
| gene | número de | acesso função | |
| cysK | 1788754 | cisteína sintase | |
| CysZ | gl788753 | ORF a montante de cysK | |
| 10 | cysK | gl789108 | ATP sulfurilase |
| cysV) | gl789109 | sulfato adenililtransferase | |
| cysC | gl789107 | adenililsulfato cinase | |
| cysZ | 1788753 | transporte de sulfato | |
| sbp | 1790351 | Proteína de ligação a sulfato |
periplásmico
As reações anapleróticas podem ser reforçadas
| expressando | ||
| ppc | 1790393 | fosfoenolpiruvatocarboxilase |
| pps | 1787994 | fosfoenolpiruvato sintase |
| 20 As reações que consomem | acetato podem ser reforçadas | |
| super-expressando | ||
| - a cs | 1790505 | acetil-CoA sintetase |
Além disso, a expressão de genes nas vias de degradação de metionina (ver lista abaixo) ou desviando da
4 via de produção de metionina pode ser atenuada ou os genes podem ser deletados.
A atenuação deste contexto descreve a redução da atividade intracelular de uma enzima por medidas tais como
| 5 | reduzir sua | expressão, | reduzir a estabilidade da | enzima, |
| aumentar sua | degradação | e/ou outras soluções conhecidas dos | ||
| peritos no campo. | ||||
| Gene | entrada no GenBank atividade | |||
| ackA | 1788633 | acetato cinase | ||
| 10 | pta | 1788635 | fosfotransacetilase | |
| aceE | 1786304 | piruvato desidrogenase El | ||
| aceF | 1786305 | piruvato desidrogenase E2 | ||
| Ipd | 1786307 | piruvato desidrogenase E3 | ||
| sucC | 1786948 | succinil-CoA sintetase, subunidade | ||
| 15 | beta | |||
| sucD | 1786949 | succinil-CoA sintetase, subunidade | ||
| alfa | ||||
| pck | 1789807 | fosfoenolpiruvato carboxicinase | ||
| poxB | 1787096 | piruvato oxidase | ||
| 20 | il vB | 1790104 | ácido aceto-hidróxi sintase | I, |
subunidade grande ilvN 1790103
1790202 il vG ácido aceto-hidróxi sintase I, subunidade pequena ácido aceto-hidróxi sintase II, subunidade grande
| 1790203 | |||
| i IvM | 1790204 | ácido aceto-hidróxi sintase II, 1 subunidade pequena | |
| 5 | ilvl | 1786265 | ácido aceto-hidróxi sintase III, subunidade grande |
| ilvh | 1786266 | ácido aceto-hidróxi sintase III, subunidade pequena | |
| aroF | 1788953 | DAHP sintetase | |
| 10 | aroG | 1786969 | DAHP sintetase |
| ar oh | 1787996 | DAHP sintetase | |
| trB | 1786184 | homoserina cinase | |
| trC | 1786185 | treonina sintase | |
| sdaA | 1788116 | serina desaminase | |
| 15 | sdaB | 1789161 | serina desaminase |
| speD descarboxilase | gl786311 | S-Adenosilmetionina | |
| speC | gl789337 | Ornitina descarboxilase | |
| as tA | gl788043 | Arginina succiniltransferase | |
| 20 | dapA | gl788823 | Diidrodipicolinato sintase |
| A invenção também | diz respeito a processo para a |
produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, compreendendo a fermentação do microorganismo que produz metionina descrito acima, a concentração de metionina, seus precursores ou derivados e o isolamento do(s) produto(s) desejado(s) do caldo de fermentação.
Os peritos na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20°C e 55°C, de preferência entre 25°C e 40°C, e mais especificamente cerca de 30°C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.
A fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura inorgânico da composição definida conhecida adaptada às bactérias usadas, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, um cosubstrato necessário para a produção do metabólito.
Em particular, o meio de cultura orgânico para E. coli pode ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial
Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio tal como definido por Schaefer et al
96) .
1999, Anal. Biochem. 270:
De modo análogo, o meio de cultura inorgânico para C.
glutamicon pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.
32: 205-210) ou a um meio tal como descrito por Ríedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583) . Os meios podem ser suplementados para compensar auxotrofias introduzidas por mutações.
Após fermentação, L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, é/são recuperado(s) e purificado(s) se necessário. Os métodos para a recuperação e purificação do composto produzido tal como metionina nos meios de cultura são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Opcionalmente, de 0 a 100%, de preferência pelo menos
90%, mais preferivelmente 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% da biomassa podem ser eliminados durante a purificação do produto de fermentação.
Em uma modalidade preferida da invenção, o método para a produção de metionina compreende uma etapa de isolamento dos aminoácidos/constituintes desejados do caldo de fermentação e/ou a biomassa opcionalmente restante em porções ou na quantidade total (0-100%) no produto final.
Os meios para reduzir a quantidade de NAM podem ser combinados com limitação ou privação de fosfato e/ou potássio. O perito no campo será capaz de determinar as quantidades de fosfato ou potássio necessárias para o crescimento do organismo escolhido.
Submeter um organismo a uma limitação de um substrato inorgânico define uma condição sob a qual o crescimento dos microorganismos é governado pela quantidade de um produto químico inorgânico suprido que ainda permite um crescimento fraco. Exemplos destes substratos são fosfato, potássio, magnésio ou uma combinação dos mesmos.
Privar um microorganismo de um substrato inorgânico define a condição sob qual condição do microorganismo para completamente devido à ausência do substrato inorgânico.
Exemplos para estes substratos são fosfato, potássio, magnésio ou uma combinação dos mesmos.
A invenção também se refere a um microorganismo tal como descrito anteriormente que é otimizado para a produção fermentativa de metionina com um acúmulo reduzido de NAM, isto é, acumulando quantidades mais baixas de NAM comparado a um microorganismo não modificado, e o microorganismo que compreende as modificações genéticas descritas acima.
EXEMPLOS
0 Exemplo 1 - Construção da cepa MG1655 metA*ll AmetJ
Ptrc-mefcH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
ApykA ApykF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA: :Km (pMElOl-thrA*lcysE-PgapA-me fcA* 11) (pCCIBAC- serB- serA- serC)
Para deletar o aciltranferase gene yncA putativa em uma cepa produtora de metionina, os requerentes usaram a cepa BW25113 EyncA de Escherichia coli:: Km da coleção do mutante Keio (Baba et al., 2006). A deleção de AyncA::Km foi transferida por transdução do fago PI (ver abaixo) a partir da cepa BW25113 AyncA::Km para a cepa MG1655 metA*ll
AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF ApurU (descrita em
PCT/EP2007/060433). Transformantes resistentes a canamicina foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos
YncAF e YncAR definidos abaixo (sequência de referência no site da web http: // ecogene. org /) . A cepa retida foi designada MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF
ApurU AyncA::Km.
YncAF: GTTTGCCGATTTGCCCCACCG (homólogos à região yncA de 1517564 a 1517544) (SEQ ID NO 01)
YncAR: CGCCCATCACGGTCGCAAGC (homólogo à região yncA de
1515827 a 1515846) (SEQ ID NO 02)
Então, os plasmideos pMElOl-thrA*l-cysF-PgapA-metA^ll and pCCIBAC-serB-serA-serC foram introduzidos na cepa
MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcFcysPUWAM PtrcF-cys JIH PtrcO 9-gcvTHP ApykA ApykF ApurJ
AyncA::Km, dando origem a MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP ApyAA ApykF ApurU AyncA::Km (pME101-thrA*l-cysEPgapA-metA*ll) (pCCIBAC-serB-serA-serC).
Preparação do lisado de fago PI:
- Inoculação de 10 ml de LB suplementado com canamicina (50 μς/πιΐ), glicose (0,2%) e CaCl3 (5 mM) com
100 μΣ de cultura durante a noite da cepa BW25113
AyncA::Km. Incubação durante 30 min a 37°C com agitação
- Adição de 100 μΕ de lisado de fago PI preparado na cepa BW25113 AyncA::Km (cerca de 1.109 fago/ml)
- Agitação a 37°C durante 3 horas até todas as células estarem lisadas
- Adição de 200 μΐ, de clorofórmio e vórtice
- Centrifugação durante 10 min a 4500 g para eliminar resíduos de células
- Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 μ! de clorofórmio
- Armazenamento do lisado a 4°C
Transdução:
- Centrifugação durante 10 min a 1500 g de 5 ml de cultura durante a noite da cepa MG1655 metA*ll AmetJ PtrcmetH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
PtrcO9-gcvTHP ApyAA ApykF ApurFS em meio LB
- Suspensão da pelota de células em 2,5 ml 10 mM de
MgSO4, 5 mM de CaCl2
- Tubos de controle:
100 pL de células
100 pL de fagos PI da cepa BW25113 AyncA::Km
- Tubos de teste: 100 pL de células + 100 pL de fagos
PI da cepa BW25113 AyncA::Km
- Incubação durante 30 min a 30°C sem agitação
- Adição de 100 pL 1M citrato de sódio a cada tubo e vórtice
- Adição de 1 ml de LB
- Incubação durante 1 hora a 37°C com agitação
Espalhar em pratos petri de LB suplementado com canamicina (50 pg/ml) (após centrifugação dos tubos durante
3 min a 7000 rpm
- Incubação a 37°C durante a noite
Verificação da cepa:
Os transformantes resistentes a canamicina foram selecionados e a presença da modificação de AyncA::Rm foi verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos YncAF e
YncAR definidos acima.
Construção da cepa MG1655 metA*ll AmefcJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cys PUWAM PtrcF-cysJIH SpykA.
ApyJcF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyzicA: :Km AargA: :Cm
Para inativar o gene argA aminoácido acetiltransferase, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol, enquanto deletando a maior parte dos genes de interesse. Para este fim, dois oligonucleotídeos, DargAF e DargAR, foram usados (sequência de referência no site da web http://ecogene.org/) :
DargAF (SEQ ID NO: 03) gtggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccc tatatcaatacccaccggggaaaaacgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com
- uma região (caixa inferior) homólogo à região argA de 2947264 a 2947344, uma região (caixa superior) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,
97: 6640-6645)
DargAR (SEQ ID NO: 04) ccctaaatccgccatcaacactttggatttacgctggtagttgtacaactgctt tttgctctcgggcagtaaatcaatatccCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caixa inferior) homóloga à região argA de 2848592 a 2948511, uma região (caixa superior) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,
97: 6640-6645).
Os oligonucleotídeos DargAF e DargAR foram usados para ampliar o cassete de resistência a cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido foi introduzido por eletroporação na cepa MG1655 MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP ApykA ApykF ApurU AyncA::Km (pKD46) em que a enzima
Red recombinase expressa permitiu a recombinação homóloga.
Os transformantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos ArgAF e
ArgAR definidos abaixo (sequência de referência no site de web http://ecogene.org/). A cepa retida foi designada
MG1655 MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmstl7-metF
PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF ApurU
AyncA::Km AargA::Cm.
ArgAF: cagctgacgatttgattcc (homóloga à região argA de
2946859 a 2946877) (SEQ ID NO 05)
ArgAR: gggttgtttaatggcgatatcgg (homóloga à região argA de 2949010 a 2948988) (SEQ ID NO 06)
Construção da cepa MG1655 znetA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA
ApykF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA AargA
Para eliminar os cassetes de resistência a cloranfenicol e a canamicina, o plasmideo pCP20, transportando recombinase FLP agindo nos sítios FRT dos cassetes de resistência a cloranfenicol e a canamicina, é introduzido na cepa recombinante MG1655 metA*ll AmetJ PtrcmetH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF ApurU AyncA::Km AargA::Cm por eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda dos cassetes de resistência a cloranfenicol e canamicina é verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos descritos acima, YncAF / YncAR e ArgAF / ArgAR. A cepa retida é designada MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF
PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA AargA.
Construção da cepa MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA
ApykF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA AargA (pMElOl-thrA*l-cysEPgapA-metA* 11) (pCCIBAC-serB-serA-serC)
Os plasmídeos pMElOl-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll and pCCIBAC-serB-serA-serC são introduzidos na cepa MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM
PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA EpykF EpurF EyncA AargA dando origem a MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP
FpykA EpykF ApurU AyncA AargA (pMElOl-thrA*l-cysF-FgapA5 metA*ll) (pCCIBAC-serB-serA-serC) .
Construção de genes sintéticos expressando atividade de aminoácido acilase
Para transformar NAM em metionina, NAM acilases (aminoácido acilases) foram expressas no microorganismo de produção de metionina.
Para este fim, genes sintéticos dos genes de porco e
Aspergillus acyl aminoácido acilase foram preparados pela empresa Codon Devices (www.codondevices.com/). 0 uso do códon e do teor de GC dos genes foi adaptado a E. coli de acordo com a matriz do fornecedor. Todas as sequências com o uso de códon otimizado são mostradas abaixo. A expressão dos genes sintéticos foi conduzida pelos promotores Ptrc controlados pelas sequências operadoras. Os terminadores transcricionais foram adicionados a jusante dos genes. As construções foram clonadas nos vetores pUC19 e verificadas por sequenciamento, antes de transformar as mesmas nas cepas produtoras de metionina.
Aspergillus acyl aminoacilase
Sequência de promotor e operador
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgga taacaatttcatgacacaggaaacagacc (SEQ ID NO 07)
Aspergillus acyl aminoacilase sequência (XP_001827519.1) (SEQ ID NO 8)
Mttstvvsllsslmqtqstseheqelahflddhltnlgytverlpiaegstren vyaylgtqrktrvcltshldtvppyiplriegstiygrgacddkgpmaaqicaleelra egavkegdvgllfvvgeekggpgmiaanhqdlsfegvifgeptegklwghkghlvfel igegkachsgypqhgvnanfalietlsdfvqtefpsssllgpstfnvgkieggvsyniv petska1cavrvatdmagikkivsdtvarhsnvrlefkfeypetlldhdvegsfnvrsc cymnrsilvahgdneqieidelmegvraykkltmhalnsar (SEQ ID NO 9) atgaccacgtcgactgtcgtttctctgctgagttcactgatgcagacacaatcc acctcggaacacgagcaggaactggcgcactttctggatgaccatctgacaaacctggg atatactgtcgagcgtctgccgattgcagaagggtccactcgcgagaacgtctacgcat atctggggacccaacgtaaaacgcgtgtatgtctgacctctcacctggatactgttccg ccgtacatcccgctgcgtattgagggcagtacaatctatggtcgcggggcttgtgacga taagggcccgatggctgcacagatctgcgctctggaagagctgcgtgctgaaggtgcgg tcaaagaaggcgacgtaggtctgctgttcgtcgttggggaggaaaaaggcggtccgggc atgatcgcagcgaaccaccaggatctgtcttttgaaggggttatttttggggaaccgac ggaaggcaagctggtagtaggtcacaaagggcacctggtttttgagctgatcggtgagg gaaaggcttgtcactccggctacccgcaacacggtgtgaacgcgaatttcgccctgatt gagacactgtcggattttgtccagacggagtttcctagctctagtctgctggggccgtc aacatttaacgttggcaagatcgaaggtggcgtatcctataatattgtgccggaaacgt cgaaagccctgtgtgcagtgcgcgttgcgacggacatggccggtatcaaaaagattgtg agcgataccgtagcacgtcactctaacgtccgcctggagttcaagtttgaatatccaga gacactgctggaccatgatgttgaagggagttttaatgtgcgttcctgctgttatatga accgctccatcctggttgcccacggagacaatgagcaaattgaaatcgatgaactgatg gagggagtacgcgcctataaaaagctgacaatgcacgccctgaactcagcccgctaa
Sequência de terminador transcricional: (ref.:
Harrington K.J., Laughlin R.B. e Liang S. Proc Natl Acad
Sei USA. 24 de abril de 2001; 98(9):5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc (SEQ ID NO 10)
Porco acyl aminoacilase
Sequência de promotor e operador
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgga taacaatttcatgacacaggaaacagaac (SEQ ID NO 11)
Pig acyl aminoacilase sequência (NP_999061.1) (SEQ ID
NO 12)
Maskgregehpsvtlfrqylrirtvqpepdygaavafleerarqlglgcqkvev vpghvvtvltwpgtnptlssillnshtdvvpvfkehwshdpfegfkdadgyiygrgaqd mkcvsiqyleavrrlkveghhfprtihmtfvpdeevgghqgmelfvkrpefqalragfa ldeglasptdaftvfyserspwwlrvtstgkpghgsrfiedtaaeklhkvinsilafre kekqrlqsnqlkpgavtsvnltmleggvaynvvpatmsacfdfrvapdvdlkafeeqlq
0 swcqaagegvtf efvqkwmetqvt stddsdpwwaaf sgvf kdmklaleleicpastdar yiraagvpalgfspmnhtpvllhdhderlheavflrgvdiytqllsalasvpalpses (SEQ ID NO 13) atggcgagcaaaggccgtgaaggtgagcatccgtctgtgaccctgtttcgccag tatctgcgtattcgcacggttcagcctgaaccggattacggagcagctgtggctttcct ggaggaacgcgctcgtcagctgggtctgggttgccaaaaggtagaagttgtcccagggc acgtcgtaactgtactgacttggcctggaacgaatccgaccctgagttcaatcctgctg aactcccatacagatgtagtgccagtgttcaaggaacattggagtcacgaccctttcga agggtttaaagatgccgatggctatatttacggtcgtggggcacaggacatgaagtgtg tatccattcaatatctggaagctgttcgccgtctgaaagttgaagggcaccactttcca cgcactattcacatgactttcgtgcctgacgaggaagtcgggggtcaccaaggtatgga actgttcgtaaaacgccctgagtttcaggcactgcgtgcgggttttgctctggacgagg gtctggcgagcccgacagacgcgtttaccgtgttttacagtgaacgttcgccttggtgg ctgcgcgttacttccacaggtaagccggggcacggctcgcgtttcatcgaggatacagc cgctgaaaagctgcacaaagttattaatagcatcctggcctttcgcgagaaggaaaagc aacgtctgcagagcaaccagctgaaaccgggtgcggtcactagcgtgaatctgactatg ctggaggggggtgtcgcctataacgttgtgccggcaactatgagcgcatgcttcgactt tcgcgtagctccggatgttgacctgaaagccttcgaagaacaactgcagagctggtgtc aagcagcgggagaaggtgtaacctttgagttcgtccagaaatggatggaaacacaggtt acctcgactgatgatagcgatccttggtgggcagccttttctggtgtgttcaaagatat gaagctggcgctggaactggaaatctgcccagcgagtacagacgctcgttacatccgcg ccgcaggcgtaccagccctgggtttttcaccgatgaatcacacgccggtcctgctgcat gatcacgatgagcgcctgcatgaggcagttttcctgcgcggcgtcgacatttataccca actgctgagtgcactggcttctgttcctgcgctgccatcggaatca
Sequência de terminador transcricional: (ref.:
Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad
Sei USA. 24 de abril de 2001; 98(9):5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc (SEQ ID NO 10)
Exemplo 2: Produção de metionina sob condições de fermentação
As cepas que produziram quantidades substanciais de metabólitos de interesse foram testadas sob condições de produção em fermentadores de 2,5 1 (Pierre Guerin) usando uma estratégia de batelada alimentada com privação de fosfato.
Para interromper o crescimento em uma concentração celular de' 30 g.L'1, fosfato foi adicionado a 28,7 mM ao meio mineral Blb. 0 meio de batelada alimentada F1 era livre de fosfato. Resumidamente, uma cultura de 8 horas crescendo em 10 ml de meio LB com 2m5 g.L-1 de glicose foi usada para inocular uma pré-cultura de 24 horas em meio mínimo Bla. Estas culturas crescerem em frascos defletidos contendo 50 ml de meio mínimo (Bla) em um agitador giratório (200 RPM) a 37°C.
TABELA 1: Composições de meio mineral em batelada de cultura (Bla e Blb)
| Composto | Concentração (g.L-1) Bla | Concentração (g.L-1) Blb |
| Zn(CH3COO)2· 2H2O | 0,0130 | 0,0130 |
| CuCl2. 2H2O | 0,0015 | 0,0015 |
| MnCl2. 4H2O | 0,0150 | 0,0150 |
| Composto | Concentração (g.L-1) Bla | Concentração (g.L'1) Blb |
| CoCl2.6H2O | 0,0025 | 0,0025 |
| H3BO3 | 0,0030 | 0,0030 |
| Na2Mo04.2H2O | 0,0025 | 0,0025 |
| MgSO4.7H2O | 1,00 | 1,00 |
| CaCl2.2H2O | 0,08 | 0,08 |
| Ácido cítrico | 1,70 | 1,70 |
| KH2PO4 | 2,50 | 2,50 |
| K2HPO4. 3H2O | 1,38 | 1,38 |
| (NH4) 2hpo4 | 0,6040 | 0,6040 |
| Citrato de Fe(III) H2O | 0,11 | 0,11 |
| (NH4)2S2O3 | 3,70 | 3,70 |
| EDTA | 0,0080 | 0,0080 |
| Tiamina | 0,01 | 0,01 |
| Glicose | 15,00 | 20, 00 |
| Vitamina B12 | 0,01 | 0,01 |
| NaOH 8 N | Ajustado em pH 6,8 | Ajustado em pH 6, 8 |
| IPTG | 0,0024 | 0,0024 |
| MOPS | 5,00 | 0, 00 |
TABELA 2: Composição de meio de batelada cultura (Fl).
alimentada na
| Composto | Concentração (g.L-1) |
| Zn (CH3COO) 2, 2H2O | 0,0104 |
| CuC12, 2H2O | 0,0012 |
| MnCl2, 4H2O | 0,0120 |
| CoC12.6H2O | 0,0020 |
| H3BO3 | 0,0024 |
| Na2Mo04.2H20 | 0,0020 |
| Citrato de Fe(III) H2O | 0,0524 |
| MgSO4 | 5, 00 |
| (NH4)2S2O3 | 44, 10 |
| EDTA | 0,0067 |
| Tiamina | 0,01 |
| Glicose | 500,00 |
| Vitamina B12 | 0,01 |
| IPTG | 0,0190 |
Guerin) foram preenchidos com 600 ml de meio mínimo (Blb) e
Subsequentemente, os fermentadores de
2,5 L (Pierre foram inoculados em uma concentração de biomassa de 0,1 g.L-1 com um volume de pré-cultura na faixa de 25 a 45 ml.
A temperatura da cultura foi mantida constante a 37°C e o pH foi mantido no valor de trabalho (6,8) pela adição automática de soluções de NH4OH (NH4OH a 10% durante 10 horas e 24% até o final da cultura) . A taxa de agitação inicial foi fixada em 200 rpm durante a fase de batelada e foi aumentada até 1200 rpm durante a fase de batelada alimentada. A taxa de fluxo de ar inicial foi fixada em 40
NL.h durante a fase de batelada e foi aumentada a 100
NL.h-1 no início da fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvida foi mantida em valores entre 20 e 40%, de preferência 30% de saturação aumentando a agitação.
Quando a massa celular alcançou uma concentração próxima a 5 g.L-1, a batelada alimentada foi privada com uma taxa de fluxo inicial de 5 ml.h1. A solução de alimentação foi injetada com um perfil sigmóide com uma taxa de fluxo crescente que alcançou 21 ml.h-1 após 21 horas. As condições de alimentação exata foram calculadas pela equação:
p2
Ç(tj = pl+- ρ~· onde Q(t) é a taxa de fluxo de alimentação em ml.h-1 para um volume de batelada de 600 ml com pl=l,15, p2=18,32, p3=0,270, p4=5.
Após a batelada alimentada de 21 horas, a concentração celular alcançou 30 g.L-1, o fosfato foi esgotado do meio e as células entraram na privação de fosfato. Nesse ponto, injeção de solução de alimentação foi aumentada em um valor constante de 37 ml. h-1 durante 4 horas. Então, a taxa de fluxo constante foi diminuída para 10 ml-h-1 e este valor de fluxo foi mantido até o término da batelada alimentada (50 horas).
TABELA 3: Rendimento máximo de metionina/glicose (Ymet) ί rendimento de metionina + N-acil-metionina + Npropionil-metionina/glicose (Ymet + nam) , rendimento de Nacetil-metionina /glicose e rendimento de N-propionil15 metionina/glicose (N-acetil-metionina e N-propionilmetionina foram contados como metionina, % g/g ver abaixo) obtida em fermentações de batelada alimentada das cepas descritas acima. Para a definição exata dos rendimentos ver abaixo. Os valores médios de três ciclos de fermentação são
0 mostrados para a cepa de referência 1 DyncA. Strainl corresponde a MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF
PtrcO9-gcvTHP ApurU (pME101-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCCIBAC-serB-serA-serC).
| Cepa | Ymet (%g· | g1) | ^met + NAM (%g.g_1) | Y N-acetil- metionina (%g. g_1) | Y N-propionil metionina (%g. g’1) |
| Cepa de referência (cepa 1) | 16, 97 1,00 | ± | 20, 03 ± 0,83 | 2, 65 ± 0,17 | 0,41 ± 0,13 |
| Cepa 1 | 18,33 | ± | 18,62 ± | 0,27 ± | 0,02 ± |
| DyncA | 1,37 | 1,24 | 0,15 | 0,01 |
Determinação do rendimento de metionina/glicose (Ymet)
A concentração de metionina extracelular foi quantificada por HPLC após derivatização de OPA/FMOC. A Nacetil-metionina e as concentrações de glicose residuais foram analisadas usando HPLC com detecção refratométrica. A concentração de N-propionil metionina foi determinada por
GC-MS após sililação, ela foi expressa como equivalente de
N-acetil-metionina.
volume do fermentador foi calculado adicionando ao volume inicial a quantidade de soluções adicionadas para regular o pH e para alimentar a cultura e subtraindo o volume usado para amostragem e perdido por evaporação.
volume de batelada alimentada foi seguido continuamente pesando o estoque de alimentação. A quantidade de glicose injetada foi então calculada na base do peso injetado, a densidade da solução e a concentração de glicose controlada pelo método de Brix ([Glicose]). O rendimento de metionina foi expresso como a seguir:
Metioninat * — Metioninaa * Mg
100
V7 = 1 met
G lico se consumida.t Com Metionina0 e Metioninat, respectivamente as concentrações inicia e de metionina no tempo (t) e Vo e Vt os volumes iniciais e instante t.
A YN-acetii-metionina foi calculada como a seguir:
N — acetil metioninat * Mt
100* 0,1492,
F,v_,
Qcetii—e-ntfj-Q
Glicose consumidat
Com N-acetil-metioninat, a concentração em mmol por litro no instante t.
A YN-propioníi metionina foi calculada coiuo a seguir.
N — propion.il meticminat * Mt * 100 ’· 0,1492, σ t?c cm l i — mee t cm l na
Glicose consumidat Com N-propionil metionina, a concentração em mmol por litro no instante t.
A YMet+N-acetil-metionina + N-propionil-metionina (YmeT+NAm) foi calculada como a seguir:
_ ;·Γ;Γ1ΟΠίΠ£^Κί·>·ιν-2Γ*η'ί-Ι«Κ'Μ!1«!1-Γ[»ί.14?Σ4·ΑΓ-!ίΓΡρ{ΐ!·ηΐί-ΐη£η·οη-I Q Q “ gílío^s ronsumídcj
Com metioninat, a concentração de metionina em g por litro, N-acetil-metioninat e N-propionil-metioninat, as respectivas concentrações em mmol por litro no instante t.
A glicose consumida foi calculada como a seguir:
p eso aàTnentadoQ — p eso alimentado, volume alimentado. = — --— -----:—L densidade da solução alimentada
Glicose injetadat = volume alimentadot ★ [Glicose]
Glicose consumidat = [Glicose]o * Vo + Glicose
Injetada-[Glicose] residuai * Vt
Com [Glicose] o, [Glicose], [Glicose] residual, respectivamente a inicial, as concentrações de glicose alimentada e residual.
Exemplo 3: Adaptar as condições de cultura adicionando aminoácido acilase ao meio de fermentação
Para transformar N-acetil-metionina em metionina e acetato, 160 U de N-aminoácido acilase (rim de porco,
Sigma) foram adicionados a 200 μΐ de caldo de fermentação após o ciclo de fermentação da cepa 1 (realizado como descrito acima). A mistura da reação foi incubada a 37°C durante 2 horas. Subsequentemente, as concentrações metionina e N-acetil-metionina foram determinadas como descrito acima. 75-95% de N-acetil-metionina foram transformados em metionina por este tratamento enzimático.
REFERÊNCIAS
NÃO PATENTÁRIAS
- Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis pl64-185,
- Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 36479-36482,
- Driessen et al. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18,
281-325,
- Marvil & Leisinger 1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303,
- Javid-Majd & Blanchard 2000 Biochemistry 39, 128593,
- Giardina et al 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6249-55,
- Gentzen et al. 1980 Z. Naturforsch 35 c, 544-50,
- Manting & Driessen 2000 Mol Microbiol 37, 226-38,
- Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64,
625-635,
- Jacob-Dubuisson et al. 2004 Biochim et Biophys Act
1694 235-257,
- José & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71,
600-19,
- Shokri et al 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 65415 64,
- Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32:120128,
- Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics:
A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and 20 Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York,
- Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96),
- Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:
205-210,
- Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol.
3: 573-583),
Datsenko, K.A. & Wsnner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 66406645,
- Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15,
58-64,
Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory 10 Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring
Harbor, New York.) .
1/4
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para a produção de metionina ou seus precursores em um processo fermentativo caracterizado pelo fato de compreender reduzir o acúmulo de N-acil metionina pelas seguintes etapas:i. cultivar uma Escherichia coli modificada em um meio de cultura compreendendo:- uma fonte de carbono selecionada dentre glicose e sacarose;uma fonte de enxofre selecionada dentre sulfato, tiossulfato, ditionato, ditionito, sulfeto de hidrogênio, sulfito, metilmercaptano, sulfeto de dimetila ou uma combinação das diferentes fontes; e uma fonte de nitrogênio selecionada dentre amônio e amoníaco; e ii. recuperar a metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura, em que a Escherichia coli é modificada por:Atenuação da expressão de pelo menos um dos seguintes genes yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ que codificam uma enzima metionina transacilase, e/ouExpressão de pelo menos uma amino acilase específica de metionina; e/ouPetição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 20/23
- 2/4Adição de N-acil aminoácido acilase ao meio.2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a N-acil metionina, cujo acúmulo é reduzido, é escolhida dentre o seguinte grupo: Nacetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butirilmetionina e combinações dos mesmos.
- 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima metionina transacilase, cuja expressão é atenuada, é codificada pelo gene yncA.
- 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida pela expressão de pelo menos uma enzima N-acil-L-aminoácido amido-hidrolase nativa ou heteróloga no microorganismo, escolhida dentre as seguintes:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillusb. N-acil aminoácido acilase de porcoc. acetilornitina desacetilase codificada pelo gene argE.
- 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida:a) atenuando a expressão de pelo menos um dos genesPetição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 21/233/4 yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL e yjhQ codificando as enzimas metionina N-aciltransferase, eb) expressando pelo menos uma enzima N-acilmetionina desacilase, tal como:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillus,b. N-acil aminoácido acilase de porco, ec. acilornitina desacilase codificada pelo gene argE.
- 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida atenuando a expressão de pelo menos um dos genes yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ codificando as enzimas metionina N-aciltransferase e adicionando uma aminoácido acilase ao meio.
- 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida expressando pelo menos uma enzima Nacil-metionina acilase nativa ou heteróloga, tal como:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillus,b. Porco N-acil aminoácido acilase de porco,c. acilornitina desacetilase codificada pelo gene argE, ed. adicionando uma aminoácido acilase ao meio.
- 8. Método, de acordo com a reivindicação 1,Petição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 22/234/4 caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida:atenuando a expressão de pelo menos um dos seguintes genes yncA, argA, yiiD, yhhY, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ codificando as enzimas metionina N-aciltransferase, e expressando pelo menos uma enzima N-acil aminoácido acilase nativa ou heteróloga, tal como:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillus,b. N-acil aminoácido acilase de porco, ec. acilornitina desacetilase codificada pelo gene argE; e adicionando uma aminoácido acilase ao meio.
- 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre no meio de cultura é sulfato ou tiossulfato, ou uma mistura dos dois.Petição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 23/23
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2739466T3 (es) | Producción de metionina sin N-acil-metionina | |
| US8795990B2 (en) | Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity | |
| DK2314710T3 (en) | A process for the production of methionine by culturing a microorganism modified to enhance the production of cysteine | |
| KR101636662B1 (ko) | 메티오닌 수득량의 증가법 | |
| AU2012383221A1 (en) | Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine | |
| US20080286840A1 (en) | Microorganisms Comprising Enzymes Express with Low Gamma-Elimination Activity | |
| US10329591B2 (en) | Method and microorganism for methionine production by fermentation with improved methionine efflux | |
| KR101770150B1 (ko) | 메티오닌 히드록시 유사체 (mha)의 발효 생산 | |
| BRPI0917192B1 (pt) | Produção de metionina sem n-acil-metionina | |
| EP3296404A1 (en) | Modified microorganism for production of methionine | |
| BRPI0510819B1 (pt) | método para a preparação de metionina, seus precursores ou produtos derivados da mesma e microorganismo recombinante | |
| HK1102828A (en) | Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity |