BRPI0917418A2

BRPI0917418A2 - Anticorpos monoclonais contra o inibidor da via do fator tecidual (tfpi)

Info

Publication number: BRPI0917418A2
Application number: BRPI0917418-4A
Authority: BR
Inventors: Zhuozhi Wang; John E. Murphy; Junliang Pan; Haiyan Jiang; Bing Liu
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2008-08-04
Filing date: 2009-08-04
Publication date: 2021-01-05
Also published as: CN102143979A; CN105944100B; PE20141563A1; CU23880B1; PH12017502286A1; ZA201100888B; KR101769725B1; ECSP11010810A; MY161844A; EP2321356B1; UA120596C2; WO2010017196A2; CL2016003014A1; AU2009279804B2; SMT201800355T1; AU2018203753A1; KR20170005516A; CA3081514A1; CA2733075A1; LT2321356T

Abstract

anticorpos monoclonais contra o inibidor da via do fator tecidual (tfpi) a presente invenção refere-se aos anticorpos monoclonais isoiados que se ligam ao inibidor da via do fator tecidual humano (tfpi) e às moléculas de ácido nucleico isoladas que os codificam. composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos monoclonais anti-tfpl e métodos para tratar deficiências ou defeitos na coagulação através da administração dos anticorpos também são fornecidos. também são fornecidos métodos para a produção dos anticorpos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "ANTICOR- POS MONOCLONAIS CONTRA O INIBIDOR DA VIA DO FATOR TECI-

. DUAL (TFPI)". Submissão da listagem de sequências %

5 A listagem de sequências associada a este pedido é depositada em formato eletrônico através do EFS-Web e está aqui incorporada ao relatório descritivo por referência em sua totalidade.

O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequências é MSB7329PCT Sequence Listing _ ST25. Campo das modalidades 10 São fornecidos anticorpos monoclonais isolados e fragmentos dos mesmos, que se ligam ao inibidor da via do fator tecidual humano (TFPI) e invenções relacionadas.

Antecedentes A coagulação do sangue é um processo pelo qual o sangue for-

f " 15 ma coágulos estáveis para interromper o sangramento.

O processo envolve ' inúmeras pró-enzimas e pró-cofatores (ou "fatores da coagulação") que es- " tão circulando no sangue.

Estas pró-enzimas e pró-cofatores interagem atra- vés de várias vias através das quais eles são convertidos, sequencialmente ou simultaneamente, na forma ativada.

No fim, o processo resulta na ativa- 20 ção da protrombina em trombina pelo fator X (FXa) ativado na presença de fator Va, cálcio iônico, e plaquetas.

A trombina ativada, por sua vez, induz a agregação plaquetária e converte o fibrinogênio em fibrina, que é então Iiga- da de forma cruzada pelo fator Xlll ativado (FXllla) para formar um coágulo.

O processo que leva à ativação de fator X pode ser executado 25 por duas vias distintas: a via de ativação por contato (anteriormente conhe- cia como a via intrínseca) e a via do fator tecidual (anteriormente conhecida como a via extrínseca). Anteriormente, acreditava-se que a cascata da coa- gulação consistia em duas vias de igual importância unidas em uma via co- mum.

Agora se sabe que a via primária para o início da coagulação sanguí- 30 nea é a via do fator tecidual.

O fator X pode ser ativado pelo fator tecidual (TF) em combina- ção com o fator VIl ativado (FVlla). O complexo do fator Vlla e seu cofator essencial, TF, é um potente iniciador da cascata da coagulação.

A via do fator tecidual da coagulação é controlada negativamen-

. te pelo inibidor da via do fator tecidual ("TFPI"). O TFPI é um inibidor natural da retroalimentação dependente de FXa do complexo FVlla/TF.

Ele é um ©

5 membro dos inibidores de serina protease multivalentes do tipo Kunitz.

Fisio- Iogicamente, o TFPI se liga ao fator X ativado (FXa) para formar um comple- xo heterodimérico, que interage subsequentemente com o complexo FVII- a/TF para inibir sua atividade encerrando, assim, a via do fator tecidual da coagulação.

Em princípio, o bloqueio da atividade de TFPI pode restaurar a 10 atividade de FXa e FVlla/TF, prolongando, desta forma, a duração da ação da via do fator tecidual e amplificando a geração de FXa, que é o defeito comum na hemofilia A e B.

De fato, algumas evidências experimentais preliminares indica- ram que o bloqueio da atividade de TFPI por anticorpos contra TFPI normali-

k a 15 za o tempo de coagulação prolongado ou encurta o tempo de sangramento.

Por exemplo, Nordfang et al. mostraram que o tempo de protrombina diluída

" prolongado do plasma na hemofilia foi normalizado após tratamento do pIasma com anticorpos contra TFPI (Thromb.

Haemost., 1991, 66(4): 464- 467). De modo similar, Erhardtsen et al. mostraram que o tempo de sangra- 20 mento em modelo de coelho de hemofilia A foi significativamente encurtado por anticorpos anti-TFPl (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388- 394). Estes estudos sugerem que a inibição de TFPI por anticorpos anti- TFPI pode ser útil para o tratamento de hemofilia A ou B.

Apenas o anticorpo policlonal anti-TFPl foi usado nestes estudos. 25 Com o uso de técnicas de hibridoma, foram preparados e identi- ficados anticorpos monoclonais contra TFPI humano recombinante (rhTFPl). Vide Yang et al., Chin.

Med.

J., 1998, 111(8): 718-721. O efeito do anticorpo monoclonal sobre o tempo de protrombina diluída (PT) e sobre o tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) foi testado.

Os experimentos mostra- 30 ram que o anticorpo monoclonal anti-TFPl encurtou o tempo de coagulação da tromboplastina diluída de plasma deficiente em fator lX.

Sugere-se que a via do fator tecidual desempenha uma importante função não apenas na co-

agulação fisiológica, mas também na hemorragia da hemofilia (Yang et al., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300). A patente US N° 7.015.194 para Kjalke et al. apresenta compo- . sições que compreendem FVlla e um inibidor de TFPI, incluindo anticorpos

W 5 policlonais ou monoclonais, ou um fragmento dos mesmos, para o tratamen- to ou profilaxia de episódios de sangramento ou tratamento de coagulação. O uso desta composição para reduzir o tempo de coagulação em plasma normal de mamífero também é apresentado. Sugere-se, adicionalmente, que um fator Vlll ou uma variante do mesmo pode ser incluído na composição 10 apresentada de FVlla e inibidor de TFPI. Uma combinação de FVlll ou fator lX com anticorpo monoclonal para TFPI não é sugerida. Além do tratamento para hemofilia, também foi sugerido que os inibidores de TFPI, incluindo anticorpos policlonais ou monoclonais, podem ser usados para tratamento para câncer (vide Patente US n° 5.902.582 para "- P( 15 Hung). Consequentemente, anticorpos específicos para TFPI são ne- " cessários para o tratamento de doenças hematológicas e câncer. Em geral, foram gerados anticorpos terapêuticos para doenças em seres humanos com o uso de engenharia genética para criar anticorpos 20 murinos, quiméricos, humanizados ou completamente humanos. Os anticor- pos monoclonais murinos mostraram ter uso lim itado como agentes terapêu- ticos por causa de uma meia-vida sérica curta, incapacidade de desencade- ar funções efetoras humanas e a produção de anticorpos humanos anti- camundongo. Brekke e Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseas- 25 es at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2, 53, 52-62 (Jan. 2003). Foi mostrado que anticorpos quiméricos causam respostas humanas antian- ticorpo quimérico. Os anticorpos humanizados também minimizam o compo- nente de camundongo dos anticorpos. Entretanto, um anticorpo completa- mente humano evita completamente a imunogenicidade associada com os 30 elementos murinos. Desta forma, existe uma necessidade em desenvolver anticorpos completamente humanos para evitar a imunogenicidade associa- da com outras formas de anticorpos monoclonais geneticamente manipula-

dos. Em particular, o tratamento profilático crônico como seria necessário para o tratamento de hemofilia com um anticorpo monoclonal anti-TFPI tem - um alto risco de desenvolvimento de uma resposta imune à terapia se um anticorpo com um componente murino ou origem murina for usado devido à " 5 frequente dosagem necessária e à Ionga duração da terapia. Por exemplo, a terapia com anticorpos para hemofilia A pode exigir dosagens semanais du- rante todo o tempo de vida de um paciente. lsto seria um desafio contínuo para o sistema imune. Desta forma, existe uma necessidade por um anticor- po completamente humano para terapia com anticorpo para hemofilia e defi- lO ciências ou defeitos genéticos e adquiridos na coagulação relacionados. Anticorpos terapêuticos foram produzidos através da tecnologia de hibridoma descrita por Koehler e Milstein em "Continuous Cultures of Fu- sed Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256, 495-497 (1975). Anticorpos completamente humanos podem, também, ser produzi- " w 15 dos de forma recombinante em procariotos e eucariotos. A produção recom- binante de um anticorpo em uma célula hospedeira, ao invés da produção de " hibridoma é preferencial para um anticorpo terapêutico. A produção recom- binante tem as vantagens de maior consistência do produto, provavelmente, um maior nível de produção, e fabricação controlada que reduz ou elimina a 20 presença de proteínas derivadas de animais. Por estas razões, é desejável ter um anticorpo monoclonal anti-TFPI produzido de forma recombinante.

SUMÁRIO São fornecidos anticorpos monoclonais para o inibidor da via do fator tecidual humano (TFPI). Também são fornecidas as moléculas de ácido 25 nucleico isoladas que codificam os mesmos. Composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos monoclonais anti-TFPl e métodos de tra- tamento de deficiências ou defeitos genéticos e adquiridos na coagulação, como hemofilia A e B também são fornecidos. Também são fornecidos mé- todos para encurtar o tempo de sangramento pela administração de um anti- 30 corpo monoclonal anti-TFPl a um paciente que precisa do mesmo. Também são fornecidos métodos para produzir um anticorpo monoclonal que se liga ao TFPI humano, de acordo com a presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1: A atividade de ligação de exemplos representativos de

. Fabs, selecionados a partir de panning e seleção, TFPI humano ("h-TFPl") e TFPI de camundongo ("m-TFPl"). Um Fab de controle contra Estradiol-BSA 6

5 ("EsB") e 12 Fabs (1 a4 e 6 a 13) selecionados a partirde panningdeTFPl foram testados.

O eixo Y denota as unidades de fluorescência dos resulta- dos de ELISA.

Figura 2: A atividade funcional in vitro dose-dependente de qua- tro anticorpos anti-TFPl representativos (4B7: TP-4B7, 2A8: TP-2A8, 2G6: 10 TP-2G6, 2G7: TP-2G7) obtidos a partir de panning e seleção de uma biblio- teca de anticorpo humano, conforme mostrado por seu encurtamento do dPT.

O experimento envolveu 0,5 ug/mL de mTFPI reforçado em pIasma esgota- do em TFPI.

Figura 3: A atividade funcional in vitro de Fab anti-TFPl, Fab-2A8 b " 15 (de TP-2A8), como testado no teste ROTEM.

Figura 4: A atividade de ligação dos clones TP-2G6 ("2G6") a " TFPI humano e TFPI de camundongo após a conversão em lgG.

A: Iigação de lgG-2G6 a TFPI de camundongo; el ligação de lgG-2G6 a TFPI humano; Á: ligação da lgG de controle a TFPI de camundongo; m: ligação da lgG de 20 controle a IgG humana.

Figura 5: Os anticorpos anti-TFPl TP-2A8 ("2A8"), TP-3G1 ("3G1"), e TP-3C2 ("3C2") encurtaram o tempo de coagulação do sangue total em camundongos com hemofilia A, como testado no teste ROTEM.

Ca- da ponto representa um camundongo com hemofilia A individual. 25 Figura 6: Alinhamento da sequência de aminoácido entre as ca- deias leves variáveis dos anticorpos monoclonais anti-TFPl TP-2A1O (SEQ ID NO: 18), TP-2B1 (SEQ ID NO: 22), TP-2A2 (SEQ ID NO: 2), TP-2G2 (SEQ ID NO: 66), TP-2A5.1 (SEQ ID NO: 6), TP-3A3 (SEQ ID NO: 98), TP- 2A8 (SEQ ID NO: 14), TP-2B8 (SEQ ID NO: 34), TP-2G7 (SEQ ID NO: 82), 30 TP-4H8 (SEQ ID NO: 170), TP-2G4 (SEQ ID NO: 70), TP-3F2 (SEQ ID NO: 134), TP-2A6 (SEQ ID NO: 10), TP-3A2 (SEQ ID NO: 94), TP-2C1 (SEQ ID NO: 42), TP-3E1 (SEQ ID NO: 126), TP-3F1 (SEQ ID NO: 130), TP-3D3

(SEQ ID NO: 122), TP-4A7 (SEQ ID NO: 150), TP-4G8 (SEQ ID NO: 166), TP-2B3 (SEQ ID NO: 26), TP-2F9 (SEQ ID NO: 62), TP-2G5 (SEQ ID NO:

- 74), TP-2G6 (SEQ ID NO: 78), TP-2H1O (SEQ ID NO: 90), TP-2B9 (SEQ ID NO: 38), TP-2C7 (SEQ ID NO: 46), TP-3G3 (SEQ ID NO: 142), TP-3C2 %

5 (SEQ ID NO: 114), TP-3B4 (SEQ ID NO: 110), TP-2E5 (SEQ ID NO: 58), TP- 3C3 (SEQ ID NO: 118), TP-3G1 (SEQ ID NO: 138), TP-2D7 (SEQ ID NO: 50), TP-4B7 (SEQ ID NO: 158), TP-2E3 (SEQ ID NO: 54), TP-2G9 (SEQ ID NO: 86), TP-3C1 (SEQ ID NO: 86), TP-3A4 (SEQ ID NO: 102), TP-2B4 (SEQ ID NO: 30), TP-3H2 (SEQ ID NO: 146), TP-4A9 (SEQ ID NO: 154), TP-4E8 10 (SEQ ID NO: 162), e TP-3B3 (SEQ ID NO: 106). Figura 7: Alinhamento da sequência de aminoácido entre as ca- deias pesadas variáveis dos anticorpos monoclonais anti-TFPl TP-2A1O (SEQ ID NO: 20), TP-3B3 (SEQ ID NO: 108), TP-2G4 (SEQ ID NO: 72), TP- 2A5.1 (SEQ ID NO: 8), TP-4A9 (SEQ ID NO: 156), TP-2A8 (SEQ ID NO: 16), : 15 TP-2B3 (SEQ ID NO: 28), TP-2B9 (SEQ ID NO: 40), TP-2H1O (SEQ ID NO: 92), TP-3B4 (SEQ ID NO: 112), TP-2C7 (SEQ ID NO: 48), TP-2E3 (SEQ ID " NO: 56), TP-3C3 (SEQ ID NO: 120), TP-2G5 (SEQ ID NO: 76), TP-4B7 (SEQ ID NO: 160), TP-2G6 (SEQ ID NO: 80), TP-3C2 (SEQ ID NO: 116), TP-2D7 (SEQ ID NO: 52), TP-3G1 (SEQ ID NO: 140), TP-2E5 (SEQ ID NO: 20 60), TP-2B8 (SEQ ID NO: 36), TP-3F1 (SEQ ID NO: 132), TP-3A3 (SEQ ID NO: 100), TP-4E8 (SEQ ID NO: 164), TP-4A7 (SEQ ID NO: 152), TP-4H8 (SEQ ID NO: 172), TP-2A6 (SEQ ID NO: 12), TP-2C1 (SEQ ID NO: 44), TP- 3G3 (SEQ ID NO: 144), TP-2B1 (SEQ ID NO: 24), TP-2G7 (SEQ ID NO: 84), TP-3H2 (SEQ ID NO: 148), TP-2A2 (SEQ ID NO: 4), TP-3E1 (SEQ ID NO: 25 128), TP-2G2 (SEQ ID NO: 68), TP-3D3 (SEQ ID NO: 124), TP-2G9 (SEQ ID NO: 88), TP-2B4 (SEQ ID NO: 32), TP-3A2 (SEQ ID NO: 96), TP-2F9 (SEQ ID NO: 64), TP-3A4 (SEQ ID NO: 104), TP-3C1 (SEQ ID NO: 136), TP-3F2 (SEQ ID NO: 136), e TP-4G8 (SEQ ID NO: 168). Figura 8: Gráfico mostrando a taxa de sobrevida ao longo de 24 30 horas após transecção da veia da cauda para camundongos tratados com (1) anticorpo anti-TFPl TP-2A8 ("2A8"), (2) 2A8 e fator Vlll recombinante, (3) lgG de camundongo, e (4) fator Vlll recombinante.

Figura 9: Gráficos mostrando os testes de tempo de coagulação e de tempo para formação de coágulo para camundongos tratados com o - anticorpo anti-TFPl TP-2A8 ("2A8"), fator Vlla, e a combinação de 2A8 e fa- tor VIla. - 5 Figura 10: Gráfico mostrando o tempo de coagulação para san- gue humano normal tratado com um inibidor de FVlll com o anticorpo anti- TFPI TP-2A8 ("2A8") e o anticorpo anti-TFPl TP-4B7 ("4B7") em comparação ao inibidor de FVlll sozinho.

DESCRIÇÃO DETALHADA 10 Definições O termo "inibidor da via do fator tecidual" ou "TFPI" para uso na presente invenção refere-se a qualquer variante, isoforma e espécie homó- loga do TFPI humano que é naturalmente expressa pelas células. Em uma modalidade preferencial da invenção, a ligação de um anticorpo da invenção b " 15 ao TFPI reduz o tempo de coagulação do sangue. Para uso na presente invenção, um "anticorpo" refere-se a um " anticorpo inteiro e a qualquer fragmento de ligação ao antígeno (isto é, "por- ção de ligação ao antígeno") ou cadeia única do mesmo. O termo inclui uma molécula de imunoglobulina de extensão completa (por exemplo, um anti- 20 corpo de lgG) de ocorrência natural ou formada por processos normais de recombinação de fragmentos do gene da imunoglobulina, ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, como um fragmento de anticorpo, que retém a atividade de ligação específica. lnde- pendentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo se liga ao mesmo 25 antígeno reconhecido pelo anticorpo de extensão completa. Por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal anti-TFPl se liga a um epítopo de TFPI. A função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de extensão completa. Exemplos de frag- mentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de 30 um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios Vl, Vh, Cl e Ch1; (ii) um fragmento F(ab')2, um frag- mento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma liga-

ção de dissulfeto em uma região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que tem os domínios Vh e Ch1; (iv) um fragmento Fv que tem os domínios Vl e Vh de

- um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio Vh; e (vi) uma região de- - 5 terminante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e Vh, sejam codificados por genes sepa- rados, eles podem ser unidos com o uso de métodos recombinantes, por um Iigante sintético que permite que eles sejam produzidos como uma cadeia de proteína única na qual as regiões Vl e Vh pareiam para formar moléculas 10 monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (SCFv); vide, por exem- plo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85:5879-5883). Estes anticorpos de cadeia única também estão abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticor- po.

Estes fragmentos de anticorpo são obtidos com o uso de técnicas con- ·7 l 15 vencionais conhecidas dos versados na técnica, e os fragmentos são sele- cionados quanto a sua utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos. > Para uso na presente invenção, os termos "inibe a ligação" e "bloqueia ligação" (por exemplo, com relação à inibição/bloqueio da ligação de ligante de TFPI a TFPI) são usados de maneira intercambiável e abran- 20 gem inibição e bloqueio parcial e completo. lnibição e bloqueio também são destinados a incluir qualquer diminuição mensurável na afinidade de ligação de TFPI a um substrato fisiológico quando em contato com um anticorpo an- ti-TFPl, em comparação ao TFPI não estando em contato com um anticorpo anti-TFPl, por exemplo, o bloqueio da interação de TFPI com o fator Xa ou o 25 bloqueio da interação de um complexo de TFPl-fator Xa com o fator tecidual, fator Vlla ou o complexo de um fator tecidual/fator Vlla em pelo menos cerca de 10%, 20%, 3Õ°/o, 40°/o, 5Ô°/o, 6Õ°/o, 70%, 8Õ°/o, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99°6, ou 100%. Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo 30 monoclonal", para uso na presente invenção, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única.

Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de Iigação única e afinidade por um epítopo particular. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que apresentam uma única es- - pecificidade de ligação e que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anti- . 5 corpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não co- dificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa huma- na (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sÍtio- específica in vitro ou por mutação somática in vivo). Um "anticorpo isolado," para uso na presente invenção, se desti- lO na a fazer referência a um anticorpo que é substancialmente isento de ou- tros anticorpos que têm especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga ao TFPI é substancialmente isento de anti- corpos que se ligam a antígenos além de TFPI). Um anticorpo isolado que se liga a um epítopo, isoforma ou variante de TFPI humano pode, no entanto,

W "" 15 ter reatividade cruzada a outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécies de TFPI). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material ce- 0 lular e/ou produto químico. Para uso na presente invenção, "ligação específica" refere-se à 20 ligação do anticorpo a um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticor- po se liga com uma afinidade de pelo menos cerca de 105 M_1 e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade mais elevada, por exemplo, pelo menos duas vezes maior que sua afinidade pela ligação a um antígeno irrelevante (por exemplo, BSA, caseína) que não o antígeno predeterminado 25 ou um antígeno intimamente relacionado. As expressões "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas de maneira intercambiável na presente invenção com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno". Para uso na presente invenção, o termo "alta afinidade" para 30 uma anticorpo de lgG refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 107M"1, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 108M"1, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 109M"', 1010M-1, 1011M-1 ou mais,

por exemplo, até 1013M-1 ou mais.

Entretanto, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo.

Por exemplo, Iigação de "alta

- afinidade" para um isotipo de lgM refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1,0 x 107M-1. Para uso na presente invenção, "isotipo" ©

5 refere-se à classe do anticorpo (por exemplo, lgM ou lgGl) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada. "Região determinante de complementaridade" ou "CDR" refere- se a uma das três regiões hipervariáveis dentro da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve de uma molécula de anticorpo, 10 que forma a superfície de ligação ao antígeno N-terminal complementar à estrutura tridimensional do antígeno ligado. lniciando na terminação N de uma cadeia pesada ou leve, estas regiões determinantes de complementari- dade são chamadas "CDRI," "CDR2," e "CDR3," respectivamente.

As CDRS estão envolvidas na Iigação antígeno-anticorpo, e a CDR3 compreende uma ¥ 15 região única específica para a Iigação antígeno-anticorpo.

Um sÍtio de liga- . ção ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRS, compreendendo as regi- " ões de CDR de cada uma das regiões V da cadeia pesada e da cadeia leve.

Para uso na presente invenção, o termo "substituições conserva- tivas" refere-se a modificações de um polipeptídeo que envolvem a substitui- 20 ção de um ou mais aminoácidos por aminoácidos que possuem proprieda- des bioquímicas similares que não resultam em perda de uma função bioló- gica ou bioquímica do polipeptídeo.

Uma "substituição de aminoácido con- servativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resí- duo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar.

Famílias de resíduos 25 de aminoácido que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica.

Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias Iaterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, ciste- 30 Ína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, iso- Ieucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ra- mificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aro-

máticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Prevê-se que os anticorpos da presente invenção podem ter substituições de aminoá-

- cido conservativas e ainda reter atividade.

Para ácidos nucleicos e polipeptídeos, o termo "homologia subs- . 5 tancial" indica que dois ácidos nucleicos ou dois polipeptídeos, ou sequên- cias designadas dos mesmos, quando otimamente alinhadas e comparadas, são idênticas, com inserções ou deleções de nucleotídeos ou aminoácidos adequadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos ou aminoácidos, geralmente pelo menos cerca de 85%, de preferência, cerca de 90%, 91%, 10 92°/o, 93%, 94%, ou 95%, com mais preferência, pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, ou 99,5% dos nucleotídeos ou aminoácidos.

Alternativamente, homologia substancial para ácidos nucle- icos existe quando os segmentos hibridizarão sob condições de hibridização seletivas ao complemento da fita.

A invenção inclui sequências de ácido nu- " 15 cleico e sequências de polipeptídeo que possuem homologia substancial às ~ sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácido específicas cita- " das aqui.

O percentual de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, °/) 20 de homologia = n° de posições idênticas / n° total de posições x 100), levan- do em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências.

A comparação entre as sequências e a determinação do percentual de identi- dade entre duas sequências podem ser realizadas com o uso de um algorit- 25 mo matemático, como sem limitação, o módulo AlignX® de VectorNTl® (lnvi- trogen Corp., Carlsbad, CA). Para AlignX®, os parâmetros padrão de alinha- mentos múltiplos são: penalidade por abertura de lacuna: 10; penalidade por extensão da lacuna: 0,05; faixa de penalidade por separação de lacuna: 8; % de identidade para impedimento de alinhamento: 40. (detalhes adicionais 30 encontrados em hüp://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LlNNEA-Online- Guides/LINNEA-CommunitiesNector-NTl-Community/Sequence-analysis- and-datamanagement-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTl-

Advance.reg.us.html). Outro método para determinação do melhor pareamento global

- entre uma sequência pesquisada (uma sequência da presente invenção) e % uma sequência objeto, também chamado de um alinhamento de sequência 5 global, pode ser determinado com o uso do programa de computador CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673- 4680), que se baseia no algoritmo de Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). Em um alinhamento de sequência a sequência pesquisada e a objeto são sequências de DNA.

O 10 resultado deste alinhamento de sequências global é em percentual de iden- tidade.

Os parâmetros preferenciais usados em um alinhamento CLUSTALW de sequências de DNA para calcular a identidade percentual através de ali- nhamentos em pares são: matriz = IUB, k-tuple = 1, número de diagonais superiores = 5, penalidade por lacuna = 3, penalidade por abertura de lacuna : 15 = 10, penalidade por extensão da Iacuna = 0,1. Para alinhamentos múltiplos, os seguintes parâmetros de CLUSTALW são preferenciais: penalidade por . abertura de lacuna = 10, parâmetro da extensão da lacuna = 0,05; faixa de penalidade por separação de lacuna = 8; °/) de identidade para impedimento de alinhamento = 40. 20 Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substan- cialmente pura.

Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando ele é purificado de outros componentes celulares com os quais ele está normalmente associado no ambiente natural.

Para isolar um ácido 25 nucleico, técnicas padrão como as seguintes podem ser usadas: tratamento com agente alcalino/SDS, bandeamento em CSCI, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidos na técnica.

Anticorpos monoclonais Quarenta e quatro anticorpos de ligação a TFPI foram identifica- 30 dos a partir de panning e seleção de bibliotecas de anticorpo humano contra TFPI humano.

A região variável da cadeia pesada e a região variável da ca- deia Ieve de cada anticorpo monoclonal foram sequenciadas e suas regiões

CDR foram identificadas. Os números identificadores de sequência ("SEQ ID NO") correspondentes a estas regiões de cada anticorpo monoclonal estão - resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Sumário dos números identificadores de sequên- . 5 cia ("SEQ ID NO") da região variável da cadeia pesada ("VH") e da região variável da cadeia leve ("VL") de cada anticorpo monoclonal de ligação a TFPI. Os números identificadores de sequência para as regiões CDR ("C- DRI," "CDR2," e "CDR3") de cada cadeia pesada e Ieve também são forne- cidos. N.Aj: sequência de ácido nucleico; A.A.: sequência de aminoácido.

|Cione |VL , jvH , jvL , I |VH |N.A. |A.A. |N.A. jA.A. jCDR1 |CDR2 ,CDR3 CDRI |CDR2 )CDR3 |TP-2A2 j1 |2 j3 ,4 173 |216 |259 j302 j345 |388 , |TP-2Â5.I |5 )6 |7 )8 |174 j217 |260 |303 |346 |389 jTp-2A6 |9 |10 )11 |12 )175 |218 |261 j304 |347 j390 .' |TP-2A8 j13 )14 |15 |16 |176 j219 j262 |305 |348 |391 |TP-2A1O |17 j18 |19 j20 )177 |220 |263 |306 |349 )392 " jTp-2B1 )21 |22 j23 |24 |178 )221 )264 j307 j350 |393 |TP-2B3 |25 j26 |27 j28 )179 |222 |265 |308 |351 )394 jTp-2B4 j29 |30 j31 )32 |180 )223 j266 j309 j352 |395 |tp-2b8 |33 |34 |35 |36 j181 |224 |267 |310 |353 |396 |tp-2b9 |37 |38 j39 )40 |182 )225 |268 j311 |354 j397 |tp-2c1 j41 j42 |43 |44 j183 |226 |269 |312 |355 |398 jTp-2c7 |45 |46 j47 )48 |184 )227 |270 j313 |356 j399 jTp-2D7 j49 j50 |51 |52 |185 |228 |271 |314 |357 |400 |tp-2ê3 |53 |54 j55 j56 |186 )229 )272 j315 |358 j401 jTp-2E5 j57 )58 |59 |60 j187 |230 |273 |316 |359 |402 jTp-2F9 |61 |62 :63 j64 |188 )231 )274 j317 j360 j403 jTp-2g2 |65 |66 |67 |68 j189 |232 |275 |318 |361 |404 |tp-2g4 :69 j70 |71 j72 |190 |233 |276 |319 |362 |405 jTp-2g5 |73 |74 |75 |76 )191 |234 j277 |320 j363 j406 |tp-2g6 |77 )78 |79 j80 |192 |235 |278 |321 |364 |407 jTp-2g7 j81 |82 )83 |84 |193 j236 j279 |322 1365 1408

VL VH |VL , I |VH jclone N.A.

A.A. N.A.

A.A. |CDR1 )CDR2 |CDR3 |COR1 CDR2 |CDR3

- jTp-2g9 85 86 87 88 j194 |237 |280 |323 366 |409 |TP-2H1O 89 90 91 92 |195 |238 j281 |324 367 |410 t

)TP-3A2 93 94 95 96 j196 |239 |282 |325 368 |411 jTp-3A3 97 98 99 100 |197 )240 j283 j326 369 |412 jTp-3A4 101 102 103 104 |198 |241 |284 |327 370 |413

|TP-3B3 105 106 107 108 |199 j242 j285 j328 371 |414 jTp-3B4 109 110 111 112 |200 |243 |286 |329 372 j415

|TP-3C2 113 114 115 116 )201 j244 :287 j330 373 |416 jTp-3c3 117 118 119 120 |202 |245 |288 |331 374 |417

|TP-3D3 121 122 123 124 j203 j246 j289 |332 375 |418

)TP-3E1 125 126 127 128 |204 |247 |290 |333 376 |419

|TP-3F1 129 130 131 132 |205 j248 |291 |334 377 |420 q

- jTp-3F2 133 134 135 136 |206 |249 |292 |335 378 j421 |TP-3G1 137 138 139 140 |207 |250 |293 |336 379 |422 >

|TP-3G3 141 142 143 144 |208 )251 |294 |337 380 j423

|TP-3H2 145 146 147 148 |209 |252 |295 |338 381 )424

TP-4A7 149 150 151 152 210 253 296 339 382 425

TP-4A9 153 154 155 156 211 254 297 340 383 426

TP-4B7 157 158 159 160 212 255 298 341 384 427

TP-4E8 161 162 163 164 213 256 299 342 385 428

TP-4G8 165 166 167 168 214 257 300 343 386 429

TP-4H8 169 170 171 172 215 258 301 344 387 430

TP-3C1 85 86 135 136 194 237 280 335 378 421

Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo monoclonal iso-

lado que se liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anti-

corpo compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoá-

cido selecionada do grupo que conSiste nas SEQ ID NOs: 388-430. Estas

5 CDR3s são identificadas a partir das cadeias pesadas dos anticorpos identi-

ficados durante o panning e a seleção.

Em uma outra modalidade, o anticor-

po compreende, adicionalmente, (a) uma CDRI que compreende uma se-

quência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 302-344, (b) uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácido - selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 345-387, ou (C) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo % 5 que consiste nas SEQ ID NOS: 302-344 e uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 345-387. Em outra modalidade, são fornecidos anticorpos que comparti- lham uma CDR3 de uma das cadeias leves dos anticorpos identificados du- lO rante o panning e a seleção. Desta forma, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado que se liga ao inibidor da via do fator teci- dual humano, em que o anticorpo compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 259-301. Em modalidades adicionais, o anticorpo compreende, adi-

W ' 15 cionalmente, (a) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 173-215, (b) uma C- " DR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 216-258, ou (C) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ 20 ID NOS: 173-215 e uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoá- cido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 216-258. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma CDR3 de uma cadeia pesada e uma CDR3 de uma cadeia leve dos anticorpos identifi- cados a partir da seleção e panning. Desta forma, é fornecido um anticorpo 25 que se Iiga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 388-430 e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 259-301. Em uma outra modalidade, o anticorpo 30 compreende, adicionalmente, (a) uma CDRI que compreende uma sequên- cia de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 302- 344, (b) uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecio-

nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 345-387, (C) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que con- - siste nas SEQ ID NOs: 173-215, e/ou (d) uma CDR2 que compreende uma b sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID 5 NOS: 216-258. Em outras modalidades específicas, o anticorpo compreende re- giões variáveis das cadeias pesada e Ieve que compreendem: (a) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 173, 216 e 10 259, e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 302, 345 e 388; (b) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 174, 217 e 260, e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên-

W ' 15 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 303, 346 e 389; (' (C) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 175, 218 e f 261 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 304, 347 e 390; 20 (d) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 176, 219 e 262, e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 305, 348 e 391; (e) uma região variável da cadeia leve que compreende 25 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 177, 220 e 263 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 306, 349 e 392; (f) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 178, 221 e 30 264 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 307, 350 e 393; (g) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 179, 222 e 265 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- - cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 308, 351 e 394; (h) uma região variável da cadeia leve que compreende - 5 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 180, 223 e 266 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 309, 352 e 395; (i) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 181, 224 e 10 267 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 310, 353 e 396; (j) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 182, 225 e 268 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- .' 15 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 311, 354 e 397; (k) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 183, 226 e

W 269 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 312, 355 e 398; 20 (I) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 184, 227 e 270 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 313, 356 e 399; (m) uma região variável da cadeia Ieve que compreende 25 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 185, 228 e 271 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 314, 357 e 400; (n) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 186, 229 e 30 272 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 315, 358 e 401; (o) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 187, 230 e 273 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên-

- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 316, 359 e 402; (p) uma região variável da cadeia leve que compreende - 5 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 188, 231 e 274 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 317, 360 e 403; (q) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 189, 232 e 10 275 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 318, 361 e 404; (r) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 190, 233 e 276 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 15 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 319, 362 e 405; 4 (s) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 191, 234 e -

277 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 320, 363 e 406; 20 (t) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 192, 235 e 278 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 321, 364 e 407; (u) uma região variável da cadeia leve que compreende 25 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 193, 236 e 279 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 322, 365 e 408; (v) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 194, 237 e 30 280 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 323, 366 e 409; (W) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 195, 238 e 281 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 324, 367 e 410;

+ (X) uma região variável da cadeia leve que compreende 5 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 196, 239 e 282 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 325, 368 e 411; (y) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 197, 240 e 10 283 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 326, 369 e 412; (z) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 198, 241 e 284 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- ' 15 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 327, 370 e 413; - m (aa) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 199, 242 e 6

285 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 328, 371 e 414; 20 (bb) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 200, 243 e 286 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 329, 372 e 415; (CC) uma região variável da cadeia Ieve que compreende 25 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 201, 244 e 287 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 330, 373 e; (dd) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 202, 245 e 30 288 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 331, 374 e 417; (ee) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 203, 246 e 289 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- - cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 332, 375 e 418; 6 (ff) uma região variável da cadeia leve que compreende 5 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 204, 247 e 290 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 333, 376 e 419; (gg) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 205, 248 e 10 291 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 334, 377 e 420; (hh) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 206, 249 e 292 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- ' 15 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 335, 378 e 421; ~

W (ii) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 207, 250 e b 293 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 336, 379 e 422; 20 (jj) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 208, 251 e 294 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 337, 380 e 423; (kk) uma região variável da cadeia leve que compreende 25 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 209, 252 e 295 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 338, 381 e 424; (ll) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 210, 253 e 30 296 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 339, 382 e 425; (mm) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 211, 254 e 297 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên-

· cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 340, 383 e 426; 6 (nn) uma região variável da cadeia leve que compreende 5 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 212, 255 e 298 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 341, 384 e 427; (OO) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 213, 256 e 10 299 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 342, 385 e 428; (pp) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 214, 257 e 300 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- ." 15 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 343, 386 e 429;

- (qq) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 215, 258 e b

301 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 344, 387 e 430; ou 20 (rr) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 194, 237 e 280 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 335, 378 e 421. Em outra modalidade, a invenção refere-se a anticorpos que 25 compreendem: (a) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 4; (b) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência 30 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 6 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 8; (C) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 10 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

- (d) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 14 e uma região variável da cadeia pesada - 5 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 16; (e) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 20; (f) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 10 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 22 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 24; (g) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 26 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 28; ." 15 (h) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência

" de polipeptídeo da SEQ ID NO: 30 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 32; (i) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 34 e uma região variável da cadeia pesada 20 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 36: Ü) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 38 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 40; (k) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 25 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 42 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 44; (I) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 46 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 48; 30 (m) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 50 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 52;

(n) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 54 e uma região variável da cadeia pesada

· que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 56; (O) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência - 5 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 58 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 60; (p) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 62 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 64; 10 (q) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 66 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 68; (r) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 70 e uma região variável da cadeia pesada ." 15 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 72; (s) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência " de polipeptídeo da SEQ ID NO: 74 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 76; (t) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 20 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 78 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 80; (u) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 82 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 84; 25 (v) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 88; (w) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 90 e uma região variável da cadeia pesada 30 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 92; (X) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 94 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 96; (y) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência - de polipeptídeo da SEQ ID NO: 98 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 100; . 5 (Z) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 102 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 104; (aa) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 106 e uma região variável da cadeia pesada 10 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 108; (bb) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 110 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 112; (CC) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência '

NÓ 15 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia pesada " que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 116; - (dd) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 118 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 120; 20 (ee) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 122 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 124; (ff) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 126 e uma região variável da cadeia pesada 25 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 128; (gg) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 130 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 132; (hh) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 30 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 134 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 136; (ii) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 138 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 140;

- (jj) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 142 e uma região variável da cadeia pesada - 5 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 144; (kk) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 146 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 148; (ll) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 10 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 150 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 152; (mm) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 154 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 156; ' bé 15 (nn) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência

" de polipeptídeo da SEQ ID NO: 158 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 160; e

(OO) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 162 e uma região variável da cadeia pesada 20 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 164; (pp) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 166 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 168; (qq) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 25 de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 170 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 172; or (rr) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 136. 30 Também é fornecido um anticorpo monoclonal isolado que se li- ga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compre- ende uma região variável da cadeia pesada humana que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade a uma sequência

- de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas sequências de ami- noácido descritas nas SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID - 5 NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:lOO, SEQ ID NO:104, SEQ ID 10 NO:108, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:168, e SEQ ID NO:172. Também é fornecido um anticorpo monoclonal isolado que se li- ' 15 ga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compre- . ende uma região variável da cadeia leve humana que compreende uma se- . quência de aminoácido que tem pelo menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% de identidade a uma sequência de aminoácido selecio- nada do grupo que consiste nas sequências de aminoácido descritas nas 20 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:lO, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:90, SEQ ID 25 NO:94, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:11O, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:166, e SEQ ID NO:170. 30 Além de se basear nas descrições de anticorpo com o uso dos identificadores de sequência discutidos acima, algumas modalidades podem, também, ser descritas com relação aos clones de Fab isolados nos experi-

mentos aqui descritos.

Em algumas modalidades, os anticorpos recombinan- tes compreendem as CDR3 de cadeia pesada e/ou leve dos seguintes clo-

- nes: TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1O, TP-2B1, TP-2B3, TP- 2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, . 5 TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP- 3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, ou TP-4H8. Em algumas modalidades, os anticorpos po- dem compreender, adicionalmente, as CDR2 destes anticorpos e ainda 10 compreender, adicionalmente, as CDRI destes anticorpos.

Em outras moda- lidades, os anticorpos podem compreender, adicionalmente, qualquer com- binação das CDRS.

Consequentemente, em outra modalidade, são fornecidos anti- corpos anti-TFPl que compreendem: (1) regiões estruturais de cadeia pesa- ." 15 da humana, uma região CDRI de cadeia pesada humana, uma região CDR2 de cadeia pesada humana, e uma região CDR3 de cadeia pesada humana, - em que a região CDR3 de cadeia pesada humana é a CDR3 da cadeia pe- sada de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1O, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP- 20 2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP- 3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP- 4B7, TP-4E8, TP-4G8, ou TP-4H8; e (2) regiões estruturais de cadeia leve humana, uma região CDRI de cadeia leve humana, uma região CDR2 de 25 cadeia leve humana, e uma região CDR3 de cadeia leve humana, em que a região CDR3 de cadeia leve humana é a CDR3 de cadeia leve de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1O, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP- 2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP-3A3, TP- 30 3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP- 4G8, ou TP-4H8, em que o anticorpo se liga a TFPI.

O anticorpo pode com-

preender, ainda, a CDR2 da cadeia pesada e/ou a CDR2 da cadeia leve de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1O, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4,

- TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP- 2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP- . 5 3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP- 4E8, TP-4G8, ou TP-4H8. O anticorpo pode compreender, ainda, a CDRI da cadeia pesada e/ou a CDRI da cadeia leve de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1 0, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP- lO 2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP- 3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, ou TP-4H8. As regiões CDRI, 2, e/ou 3 dos anticorpos manipulados descri- ' 15 tos acima podem compreender a(s) sequência(s) de aminoácido exata(s) de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1 0, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, " TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP- 2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP- 3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, 20 TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP- 4E8, TP-4G8, ou TP-4H8 aqui apresentados.

Entretanto, os versados na técnica observarão que algum desvio das sequências de CDR exatas de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP- 2A1O, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, 25 TP-2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP- 2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP-3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP- 4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, ou TP-4H8 pode ser possÍvel en- quanto ainda se mantém a capacidade do anticorpo se ligar a TFPI de forma 30 eficaz.

Consequentemente, em outra modalidade, o anticorpo manipulado pode ser composto de uma ou mais CDRS que são, por exemplo, pelo me- nos 90%, 91°/o, 92%, 93%, 94°6, 95%, 96%, 97%, 98°/o, 99% ou 99,5% idên-

ticas a uma ou mais CDRS de TP-2A2, TP-2A5.1, TP-2A6, TP-2A8, TP-2A1O, TP-2B1, TP-2B3, TP-2B4, TP-2B8, TP-2B9, TP-2C1, TP-2C7, TP-2D7, TP-

- 2E3, TP-2E5, TP-2F9, TP-2G2, TP-2G4, TP-2G5, TP-2G6, TP-2G7, TP-2G9, TP-2H1O, TP-3A2, TP-3A3, TP-3A4, TP-3B3, TP-3B4, TP-3C1, TP-3C2, TP- . 5 3C3, TP-3D3, TP-3E1, TP-3F1, TP-3F2, TP-3G1, TP-3G3, TP-3H2, TP-4A7, TP-4A9, TP-4B7, TP-4E8, TP-4G8, ou TP-4H8. O anticorpo pode ser de qualquer uma das várias cIasses de an- ticorpos, como sem limitação um anticorpo de lgGl, lgG2, lgG3, lgG4, lgM, lgA1, lgA2, lgA secretória, lgO, e lgE. 10 Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo monoclonal com- pIetamente humano isolado para o inibidor da via do fator tecidual humano.

Em outra modalidade, é fornecido um anticorpo monoclonal completamente humano isolado para domínio Kunitz 2 do inibidor da via do fator tecidual humano. 15 Ácidos nucleicos Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico isoladas . que codificam qualquer um dos anticorpos monoclonais descritos acima.

Métodos para preparar anticorpos para TFPI O anticorpo monoclonal pode ser produzido de forma recombi- 20 nante pela expressão de uma sequência de nucleotídeo que codifica as re- giões variáveis do anticorpo monoclonal de acordo com as modalidades da invenção em uma célula hospedeira.

Com o auxílio de um vetor de expres- são, um ácido nucleico contendo a sequência de nucleotídeo pode ser trans- fectado e expresso em uma célula hospedeira adequada para a produção. 25 Consequentemente, também é fornecido um método para produzir um anti- corpo monoclonal que se liga a TFPI humano, que compreende: (a) transfectar uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal da invenção em uma célula hospedeira, (b) cultivar a célula hospedeira de modo a expressar o anti- 30 corpo monoclonal na célula hospedeira, e opcionalmente, (C) isolar e purificar o anticorpo monoclonal produzido, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo monoclonal da presente invenção. Em um exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, DNAS codificando cadeias pesada e leve parciais ou de extensão completa obtidos por técnicas de biologia molecular padrão - 5 são inseridos em vetores de expressão, de modo que os genes sejam opera- tivamente Iigados a sequências de controle transcricional e traducional. Nes- te contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo que as sequências de controle transcricional e traducional dentro do vetor cumpram sua função pretendida 10 de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. Os vetores de ex- pressão e as sequências de controle de expressão são escolhidas para se- rem compatíveis com a célula hospedeira usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no .' 15 mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de " expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sÍtios de restrição

W complementares no fragmento do gene do anticorpo e no vetor, ou ligação de extremidade cega caso nenhum sÍtio de restrição esteja presente). As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos anticorpos aqui descritos 20 podem ser usadas para criar genes de anticorpo de extensão completa de qualquer isotipo de anticorpo através da inserção das mesmas em vetores de expressão que já codificam as regiões constante da cadeia pesada e constante da cadeia leve do isotipo desejado de modo que o segmento Vh seja operativamente ligado ao(s) segmentos Ch dentro do vetor e o segmen- 25 to Vl seja operativamente ligado ao segmento Cl dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo de sinal seja ligado in-frame à terminação a- 30 mino do gene da cadeia do anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um pep- tídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não-imunoglobulina).

Além dos genes que codificam a cadeia do anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção transportam sequências regulató- - rias que controlam a expressão dos genes de cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência regulatória" pretende incluir promoto- 5 res, intensificadores e outros elementos de controle de expressão ( por e- xemplo, sinais de poIiadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia do anticorpo. Estas sequências regulatórias são descri- tas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será entendido 10 pelos versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias pode depender de fatores como a esco- lha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de prote- ína desejado, etc. Exemplos de sequências regulatórias para expressão em célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam al- " 15 tos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como pro- . - motores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Simian

W Virus 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, sequências regulatórias não virais podem ser usadas, tal como o promotor de ubiquitina ou f3-globina. 20 Além dos genes da cadeia do anticorpo e das sequências regu- latórias, os vetores de expressão recombinantes podem transportar sequên- cias adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcado- res selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção das célu- 25 las hospedeiras dentro das quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, Patentes US Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todos por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato, a uma célula hospedei- ra na qual o vetor foi introduzido. Exemplos de genes marcadores selecioná- 30 veis incluem o gene de diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação por metotrexato) e o gene neo (para seleção por G418).

Para a expressão das cadeias pesadas e leves, O(S) vetor(es) de expressão(s) que codifica(m) as cadeias pesada e Ieve é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padrão.

As várias formas do termo "transfecção" pretendem abranger uma ampla variedade de técnicas comu- 5 mente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano, e similares.

Embora seja teoricamente possÍvel expressar os anticorpos da invenção em células hos- pedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão dos anticorpos em célu- lO las eucarióticas e, com a máxima preferência, células hospedeiras de mamí- fero, é da máxima preferência, porque estas células eucarióticas, e, em par- ticular, células de mamífero, tem maior probabilidade do que as células pro- carióticas de se agregar e secretar um anticorpo adequadamente enovelado e imunologicamente ativo. " 15 Exemplos de células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem células de ovário de " hamster chinês (células CHO) (inclusive células dhfr-CHO, descritas em Ur- laub e Chasin, (1980) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. 20 J.

Kaufman e P.

A.

Sharp (1982) Mol.

Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS, células HKB11 e células SP2. Quando os vetores de ex- pressão recombinantes que codificam os genes de anticorpo são introduzi- dos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos pelo cultivo das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para 25 permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultiva- das.

Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura com o uso de métodos de purificação de proteína padrão, como ultrafiltração, cromatogra- fia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica e centrifugação. 30 Uso de sequências de anticorpo parciais para expressar an- ticorpos intactos Os anticorpos interagem com os antígenos alvo predominante-

mente através dos resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis CDRs das cadeias pesada e leve.

Por esta razão, as sequências de aminoá-

- cidos dentro das CDRS são mais diversas entre os anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRS.

Vide, por exemplo, as figuras 6 e 7, nas - 5 quais as regiões CDR nas cadeias variáveis leve e pesada, respectivamente, do anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção são identifica- das.

Pelo fato das sequências da CDR serem responsáveis pela maioria das interações antígeno-anticorpo, é possÍvel expressar anticorpos recombinan- tes que imitam as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência na- lO tural pela construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo específico de ocorrência natural enxertado em sequências da estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; e Queen, C. et al., 1989, Proc.

Natl.

Acad.

Sci. 15 U.S.A. 86:10029-10033). Estas sequências da estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados públicas de DNA que incluem sequências de genes " de anticorpos de linhagem germinativa.

Estas sequências de linhagem ger- minativa serão diferentes das sequências gênicas maduras de anticorpos porque elas não incluirão genes variáveis completamente agrupados, que 20 são formados pela união V(D)J durante a maturação das células B.

Não é necessário obter a sequência de DNA completa de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto que tem propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original (vide WO 99/45962). A sequência parcial das cadeias pesada e leve abrangendo as regiões CDR é 25 tipicamente suficiente para este propósito.

A sequência parcial é usada para determinar quais segmentos de genes de união e variáveis da linhagem germinativa contribuíram para os genes variáveis do anticorpo recombinado.

A sequência da linhagem germinativa é, então, usada para completar as porções ausentes das regiões variáveis.

As sequências líder de cadeia pe- 30 sada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final.

Por esse motivo, é necessário usar a sequência líder de linhagem germinativa correspondente para os constru-

tos de expressão.

Para adicionar sequências ausentes, as sequências de CDNA clonadas podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos por ligação ou por amplificação por PCR.

Alternativamente, a região variável completa pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleotídeos curtos 5 e sobrepostos e combinados por amplificação por PCR para criar um clone da região variável inteiramente sintético.

Este processo tem certas vanta- gens, tais como eliminação ou inclusão de sítios de restrição particulares, ou otimização de códons particulares.

As sequências de nucleotídeo dos transcritos de cadeia pesada 10 e leve são usadas para desenhar um conjunto sobreposto de oligonucleotí- deos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codi- ficação de aminoácidos idênticas às sequências naturais.

As sequências sintéticas das cadeias pesada e kappa podem diferir das sequências natu- rais de três formas: séries de bases de nucleotídeos repetidas são interrom- 15 pidas para facilitar a sÍntese de oligonucleotÍdeo e amplificação por PCR; sítios de início de tradução ótimos são incorporados de acordo com as re- - gras de Kozak (Kozak, 1991, J.

Biol.

Chem. 266:19867-19870); e sÍtios de Hindlll são manipulados à montante dos sÍtios de início de tradução.

Para ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e Ieve, as 20 sequências das fitas otimizadas codificante e não-codificante corresponden- te são decompostas em seções de 30 a 50 nucleotídeos, aproximadamente, no ponto médio do oligonucleotídeo não-codificante correspondente.

Desta forma, para cada cadeia, os oIigonucleotÍdeos podem ser agrupados em conjuntos de fitas duplas sobrepostas que abrangem segmentos de 150 a 25 400 nucleotídeos.

Os grupos são, então, usados como moldes para produzir produtos de amplificação por PCR de 150 a 400 nucleotídeos.

Tipicamente, um único conjunto de oligonucleotídeos da região variável será decomposto em dois conjuntos que são amplificados separadamente para gerar dois pro- dutos de PCR sobrepostos.

Estes produtos sobrepostos são, então, combi- 30 nados por amplificação por PCR para formar a região variável completa.

Po- de também ser desejável incluir um fragmento sobreposto da região cons- tante da cadeia pesada ou Ieve na amplificação por PCR para gerar frag-

mentos que pode ser facilmente clonados nos construtos do vetor de ex- pressão.

As regiões variáveis das cadeias pesada e leve são, então, . combinadas com sequências cIonadas de promotor, início de tradução, regi- - 5 ão constante, 3' não traduzida, poliadenilação, e término de transcrição, para formar os construtos do vetor de expressão.

Os construtos de expressão das cadeias pesada e leve podem ser combinados em um único vetor, cotrans- fectados, transfectados seriadamente, ou transfectados separadamente em células hospedeiras que são, então, fundidas para formar uma célula hospe- lO deira que expressa ambas as cadeias.

Desta forma, em um outro aspecto, as características estruturais de um anticorpo anti-TFPl humano, por exemplo, TP2A8, TP2G6, TP2G7, TP4B7, etc., são usadas para criar anticorpos anti-TFPl humanos estrutu- ralmente relacionados que retêm a função de ligação a TFPI.

Mais especifi- 15 camente, uma ou mais CDRS das regiões de cadeia pesada e leve especifi- camente identificadas dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser - combinadas de forma recombinante com regiões estruturais humanas co- nhecidas e CDRs para criar anticorpos anti-TFPl humanos manipulados de forma recombinante adicionais da invenção. 20 Consequentemente, em outra modalidade, é fornecido um méto- do para preparar um anticorpo anti-TFPl que compreende: preparar um anti- corpo que compreende (1) regiões estruturais de cadeia pesada humana e CDRS da cadeia pesada humana, em que a CDR3 da cadeia pesada huma- na compreende uma sequência de aminoácido selecionadas a partir das se- 25 quências de aminoácido das SEQ ID NOs: 388-430 e/ou (2) regiões estrutu- rais de cadeia leve humana e CDRS da cadeia leve humana, em que a C- DR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido seleciona- das a partir das sequências de aminoácido das SEQ ID NOS: 259-301; em que o anticorpo retém a capacidade de se ligar a TFPI.

Em outras modalida- 30 des, o método é praticado com o uso de outras CDRS da invenção.

Composições farmacêuticas Também são fornecidas composições farmacêuticas que com-

preendem quantidades terapeuticamente eficazes do anticorpo monoclonal anti-TFPl e um veículo farmaceuticamente aceitável. "Veículo farmaceutica-

- mente aceitável" é uma substância que pode ser adicionada ao ingrediente ativo para ajudar a formular ou estabilizar a preparação e não causa efeitos 5 toxicológicos adversos significativos ao paciente.

Exemplos destes veículos são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem água, açúcares co- mo maltose ou sacarose, albumina, sais como cloreto de sódio, etc.

Outros veículos são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Scien- ces por E.

W.

Martin.

Estas composições irão conter uma quantidade tera- lO peuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo monoclonal anti-TFPl.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soIuções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis.

O uso destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

A com- 15 posição é formulada, de preferência, para injeção parenteral.

A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra . estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco.

O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líqui- 20 do, e similares), e misturas adequadas dos mesmos.

Em alguns casos, ele incluirá agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol, e cloreto de sódio na composição.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorpo- ração do composto ativo na quantidade necessária em um solvente adequa- 25 do com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, con- forme necessário, seguido de esterilização por microfiltração.

Geralmente, dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veí- culo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredien- tes necessários a partir dos citados acima.

No caso de pós estéreis para a 30 preparação de soluções injetáveis estéreis, alguns métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produ- zem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional deseja-

do a partir de uma soIução anteriormente esterilizada por filtração do mesmo.

Usos farmacêuticos O anticorpo monoclonal pode ser usado com propósitos terapêu- ticos para o tratamento de deficiências ou defeitos genéticos e adquiridos na - 5 coagulação.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais nas modalidades des- critas acima podem ser usados para bloquear a interação de TFPI com FXa, ou para evitar a inibição dependente de TFPI da atividade de TF/FVlla.

Adi- cionalmente, o anticorpo monoclonal pode, também, ser usado para restau- rar a geração direcionada por TF/FVIla de FXa para contornar a insuficiência 10 de amplificação do FXa dependente de FVlll ou de FlX.

Os anticorpos monoclonais possuem uso terapêutico no trata- mento de transtornos da hemostase, como trombocitopenia, transtornos de plaquetas e transtornos de sangramento (por exemplo, hemofilia A e hemofi- Iia B). Estes transtornos podem ser tratados pela administração de uma 15 quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal anti-TFPI a um paciente que precisa do mesmo.

Os anticorpos monoclonais também possu- . em uso terapêutico no tratamento de sangramentos descontrolados em indi- cações como trauma e derrame hemorrágico.

Desta forma, também é forne- cido um método para encurtar o tempo de sangramento, que compreende 20 administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo mono- clonal anti-TFPl da invenção a um paciente que precisa do mesmo.

Os anticorpos podem ser usados como monoterapia ou em combinação com outras terapias para atingir um transtorno hemostático.

Por exemplo, acredita-se que a coadministração de um ou mais dos anticorpos 25 da invenção com um fator da coagulação, como fator Vlla, fator Vlll ou fator lX, seja útil para o tratamento de hemofilia.

Em uma modalidade, é fornecido um método para tratar deficiências ou defeitos genéticos e adquiridos na coagulação, que compreende administrar (a) uma primeira quantidade de um anticorpo monoclonal que se liga ao inibidor da via do fator tecidual hu- 30 mano e (b) uma segunda quantidade de fator VIII ou fator lX, em que as di- tas primeira e segunda quantidades juntas são eficazes para tratar as ditas deficiências ou defeitos.

Em outra modalidade, é fornecido um método para tratar deficiências ou defeitos genéticos e adquiridos na coagulação, que compreende administrar (a) uma primeira quantidade de um anticorpo mo- . noclonal que se Iiga ao inibidor da via do fator tecidual humano e (b) uma segunda quantidade de fator Vlll ou fator lX, em que as ditas primeira e se- - 5 gunda quantidades juntas são eficazes para tratar as ditas deficiências ou defeitos e em que, adicionalmente, o fator Vll não é coadministrado. A in- venção inclui, também, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação de um anticorpo mono- clonal da invenção e fator VIll ou fator lX, em que a composição não contém 10 fator Vll. "Fator Vll" incluem fator VIl e fator Vlla. Estas terapias de combina- ção provavelmente reduzirão a frequência de infusão necessária do fator de coagulação. Por coadministração ou terapia de combinação entende-se a administração de dois fármacos terapêuticos, cada um formulado separada- mente ou formulados juntos em uma composição e, quando formulados se- "

W 15 paradamente, administrados aproximadamente no mesmo horário ou em um horário diferente, mas ao longo do mesmo período terapêutico. - As composições farmacêuticas podem ser administradas paren- teralmente aos indivíduos que possuem hemofilia A ou B a uma dosagem e frequência que pode variar de acordo com a severidade do episódio de san- 20 gramento ou, no caso de terapia profilática, pode variar de acordo com a severidade da deficiência de coagulação do paciente. As composições podem ser administradas aos pacientes em ne- cessidade como um bolus ou por infusão contínua. Por exemplo, uma admi- nistração em bolus de um anticorpo da invenção presente como um frag- 25 mento Fab pode ser em uma quantidade de 0,0025 a 100 mg/kg de peso corporal, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg ou 0,10 a 0,50 mg/kg. Para infusão contínua, um anticorpo da invenção presente como um fragmento Fab pode ser administrado a 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min, 0,010 a 0,75 mg/kg/min, 0,010 a 1,0 mg/kg/min, ou 30 0,10 a 0,50 mg/kg/min, durante um período de 1 a 24 horas, 1 a 12 horas, 2 a 12 horas, 6 a 12 horas, 2 a 8 horas, ou 1 a 2 horas. Para administração de um anticorpo da invenção presente como um anticorpo de extensão comple-

ta (com regiões constantes completas), as quantidades de dosagem podem ser de cerca de 1 a 10 mg/kg de peso corporal, 2 a 8 mg/kg, ou 5 a 6 mg/kg.

. Estes anticorpos de extensão completa seriam administrados, tipicamente, , por infusão durante um período de trinta minutos a três horas. A frequência 5 da administração dependeria da severidade da condição. A frequência pode- ria variar de três vezes por semana a uma vez a cada duas ou três semanas. Adicionalmente, as composições podem ser administradas aos pacientes através de injeção subcutânea. Por exemplo, uma dose de 10 a 100 mg de anticorpo anti-TFPl pode ser administrada aos pacientes através 10 de injeção subcutânea semanalmente, a cada duas semanas ou mensal- mente. Para uso na presente invenção, "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um anticorpo monoclonal anti-TFPl ou de uma combinação deste anticorpo com o fator Vlll ou o fator IX que é ne- " 15 cessária para aumentar de modo eficaz o tempo de coagulação in vivo ou - causar de outro modo um benefício mensurável in vivo a um paciente em - necessidade. A quantidade exata dependerá de inúmeros fatores, incluindo, mas não se limitando aos componentes e características físicas da composi- ção terapêutica, população de pacientes pretendida, considerações do paci- 20 ente individual, e similares, e pode ser facilmente determinada por um ver- sado na técnica. Exempfos Materiais e métodos gerais Exemplo 1. Panning e seleção de biblioteca de anticorpo 25 humano contra TFPI humano Panning de biblioteca de anticorpo humano contra TFPI Os anticorpos anti-TFPl foram selecionados por panning de uma biblioteca combinatória de anticorpo humano apresentada em fago HuCal Gold (Rothe et al., J. Mol. Biol., 2008, 376: 1182-1200) contra TFPI humano 30 (American Diagnostica). Resumidamente, 200 ml de TFPI (5 mg/ml) foram revestidos em pIacas de 96 poços Maxisorp de um dia para o outro a 4°C e as placas foram, então, bloqueadas com um tampão PBS contendo 5%de leite.

Após as placas serem lavadas com PBS contendo 0,01% de Tween-20 (PBST), uma alíquota da biblioteca combinatória de anticorpo humano foi

. adicionada aos poços revestidos com TFPI e as placas foram incubadas du- rante 2 horas.

O fago não ligado foi lavado com PBST, e o fago ligado ao - 5 antígeno foi eluído com ditiotreitol, infectado e amplificado na cepa TGl de E. coli.

O fago foi recuperado por fago auxiliar para o próximo ciclo de panning.

No total, três ciclos de panning foram conduzidos e os clones dos últimos dois ciclos foram selecionados contra TFPI humano em um ensaio ELISA.

Seleção de clones de anticorpo por ligação ao antlgeno em 10 ELISA Para selecionar os clones de anticorpo que se ligam ao TFPI humano, genes de Fab dos clones dos fagos do segundo e terceiro ciclos de panning foram subclonados em um vetor de expressão bacteriano e expres- sos na cepa TGl de E. coli.

O Iisado bacteriano foi adicionado aos poços " 15 das placas Maxisorp revestidas com TFPI humano.

Após a lavagem, anti- - corpo de cabra anti-Fab humano conjugado a HRP foi usado como um anti- - corpo de detecção e as placas foram reveladas pela adição de AmplexRed (lnvitrogen) com peróxido de hidrogênio.

Um sinal pelo menos cinco vezes maior que o fundo foi considerado positivo.

A reatividade cruzada dos anti- 20 corpos anti-TFPl humano a TFPI de camundongo foi determinada por um ELISA de ligação a TFPI de camundongo similar.

As placas foram revestidas com TFPI de camundongo (R&D System), BSA e lisozima.

Os últimos dois antígenos foram usados como controles negativos.

Um conjunto representa- tivo dos dados é mostrado na figura 1. 25 Sequências de anticorpos antkTFPl humano Após panning e seleção da biblioteca de anticorpo humano Hu- Cal Gold contra TFPI, foi feito o sequenciamento de DNA nos clones positi- vos para o anticorpo, resultando em 44 sequências de anticorpo únicas (Ta- bela 2). Dentre estas sequências de anticorpo, 29 eram cadeias leves lamb- 30 da e 15 foram cadeias leves kappa.

Nossa análise da região variável das cadeias pesadas revela 28 de VH3, 14 de VH6, 1 de VHl e 1 de VH5. Tabela 2. Sequência de peptídeo da região variável de 44 anticorpos anti-

TFPI.

Cbne VL VH TP-2A2 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIR- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF T\/YVHVVYQQKPGQAPVW1YGDSKRPSGI- SNNAMN\MRQAPGKGLEWVSTI- pERFsgsNsgNTAnTlsgTQAEDa- sYDgsNTYYADsvKgRFT|sRDNsKNnYL DYYCQSYDSEADSEVFGGGTKLTVLGQ QMNSLRAEDTAVYYCARQAGGWTY- (SEQ ID NO: 2) SYTD\/VVGQGTLVNSS (SEQ ID NO: 4) TP-2A5.1 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIPE- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF KYVHVVYQQKPGQAPVLMHGDNNRPSGI- ssYgsmupgKgLEmsMsgsgssw PERFSGSNSGNTÂTLTISGTQAEDEA- YADsvKgRFT|sRDNsKNnYLQMNsLRAE DYYCQSFDAGSYFVFGGGTKLTVLGQ DTA\/YYCAR\/NISTHFD\/V\/GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 8) TP-2A6 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDK1G& QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF KY\/YWYQQKPGQAPVLVIYDSNRPSGI- SRYAMSV\MRQAPGKGLEWVSSIISSSSE- PERFSGSNSGNTA11-TISGTQAEDEADYY- TYYADsvKgRFT|sRDNsKNnYLQMNsLR CASYDSIYSYVWFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID AEDTA\/YYCARLMGYGHYYPF- NO:lO) DYV\/GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12) TP-2A8 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF RISCSGDNLRNYYAH- RSYGMSWVRQAPGKGLEWVSSIRGSSSST VVYQQKF'GQAPVWIYYDNNRPSGI- YYADS\/KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA PERFSGSNSGNTÂTLTISGTQAEDEA- EDTAVYYCARKYRYV\/FDYV\/GQGTLVTVSS DYYCQS\/\/DDGVPWGGGTKLWLGQ (SEQ (SEQ ID NO: 16)

W I ID NO: 14)

W TP-2A1O DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLWSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDKLGKKYVH- TSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAI- VWQQKPGQAPVLVNGDDKRPSGI- SYTGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL pERFsgsNsgNTAnTlsgTQAEDEA- QMNSLRAEDTAVYYCARAFLGYKESYF- DYYCCb'W\K3SISRFVFGGGTKLTVLGQ DIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 18) TP-2B1 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQL\/ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDNLGNKYAH- SSYSMS\MRQASGKGLEWVSS1KGSGSNT VVYQQKPGQAPVLVNYDNKRPSGI- YYADS\/KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA pERFsgsNsgNTAnT|sgTQAEDEA- EDTA\/YYcARNggL]D~QgnvTvss DYYCQSWTPGSNTMVFGGGTRLWLGQ (SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 22) TP-2B3 DM-TQspAnsLspgERAnscRAsQ- QvQLQQsgpgLvKpsQnsLTcA|sgDsvs NIGSNYLAWYQQKPGQAPRLLÍYGA- SNSAAWG- sTMTgwNFNgsgsgmmT|ssLE- V\/1RQSPGRGLEV\LGMIYYRSKWYN- PEDFAVYYCQQLNSIPVTFGQGTKVEIKRT SYAVSVKSRI- (SEQ ID NO: 26) TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- CARTMSKYGGPGMD\/\/\/GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 28) TP-2B4 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDALG- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF 1YYmvYQQKpgQApvLmgDMNRpsgl- SNYSQAPGKGLEVWSGI- PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- sYNgsNTYYADsvKgRFT|sRDNsKNnYL DYYCQSYDAGVKPAVFGGGTKLTVLGQ QMNSLRAEDTAVYYCA- (SEQ ID NO: 30) R|YYMNLLAgv\K3QgnvTvss (SEQ ID NO:

Clone VL VH

TP-2B8 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVQSGAEVKKPGASVWSCKA& R1SCSGDNLRGYYA& GYTFTGNSMHVWRQAPGQGLEWMGTIF- WYQQKPGQAPVLVWEDNNRPSGI- PYDGTTKYAQKFQGRVMTRDTSISTAY- PERFSGSNSGNTA11-TISGTQAEDEA- MELSSLRSEDTAVYYCARGVHSYF- DYYCQSV\DSPY\/H\/FGGGTKLWLGQ DY\/\K3QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 34)

TP-2B9 D|QMTQspssLsAsvgDRwrTcRAsQs]R- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS SYLAVVYQQKPGKAPKLLIY- SNSAAWG KAsNLQsg\/psRFsgsgsgTDFn11ssLQ WIRQSPGRGLEWLGMIYHRSKWYN- PEDFAVYYCHQYSDSPVTFGQGTKVEIKRT DYAVSVKSRI- (SEQ ID NO: 38) TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCA- RYSSIGHMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:40)

TP-2C1 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIG- QVQL\ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SYYAHWYQQKPGQAPVLVIYYDSKRPSGI- SPY\/MSV\NRQAPGKGLEJNVSSISSSSSNT pERFsgsNsgNTAnT|sgTQAEDEA- YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA DYYCQAYTGQSISRVFGGGTKLTVLGQ EDTA\/YYCARGDSYMYD\/VVGQGTLVNSS (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 44)

TP-2C7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS DIRNNLA- SNSAAWGWIRQSPGRGLEWL- WYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSG GIIYYRSKWYNHYAVSVKSRI- SGSGTDFTLTISSLQPEDFA- TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- VYYCQQRNGFPLTFGQGTKVEIKRT (SEQ cARsNv\/sgYFDYwgQgnvTvss (SEQ ID ID NO:46) NO:48)

TP-2D7 DIVMTQSPLSLPVTPGEPA- QvQLQQsgpgLvKpsQnsLTcA|sgDsvs -

SISCRSSQSLLHSNGYTYLS- SNSAAWG- WYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGWDRFS V\/IRQSPGRGLEV\LGLIWRSKWYN- GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGWYCQQYD- DYAVSVKSRI- NAPITFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 50) TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- cARFgDTNRNgTD\/v\K3QgnvTvss (SEQ ID NO: 52)

TP-2E3 D^TQpAsvsgspgQsmscTgTssD|g- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS GYNY\/SVVYQQHPGKAPKLMIYGV- SNSAAWG- NYRPSGVSNRFSGSKSGNTASL- WIRQSPGRGLEWLGMIYYRSKWYN- TISGLQAEDEADYYCS- DYAVSVKSRI- SADKFTMSMFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYY- NO: 54) cAR\/NQYTssDYv\K;QgnvTvss (SEQ ID NO:56)

TP-2E5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS PIYNSLSWYQQKPGKAPKLLIYGVSNLQSG SNSAAV\/S\N1RQSPGRGLEWLGMI- vpsRFsgsgsgTDFTLmssLQpEDFA- FYRSKWNNDYAVSVKSRF VYYCLQ\/DNLPTFGQGTWEIKRT (SEQ ID TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- NO:58) cARvNANgYYAY\/DLmQgnvTvss (SEQ ID NO: 60)

TP-2F9 DM-TQSPATLSLSPGE- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF RATLSCRASQSVSSQYLA- YKYAMHVWRQAPGKGLEVWSGIQYDGSY- WYQQKPGQAPRLL1YAA& SY- sRATgwARFsgsgsgTDFnT|ssLEpED- 1YYADsvKgRFnsRDNsKNnYLQMNsLR FAVYYCQQDSNLPATFGQG~[KRT AEDTAVYYCA- (SEQ ID NO: 62) RYYcKc\/DLv\gQgnvTvss (SEQ ID NO:

Clone VL VH

TP-2G2 DIELTQPPSVSVAPGQTARlSCSGDNIRK- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF FYVHWYQQKPGQAPVLVYGTNKRPSGI- SSYAMNVWRQAPGKGLEVW- PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- sAlLsDgssTsYADsvKgRFT|sRDNsKNn DYYCQSYDSKFNTWGGGTKLTVLGQ YLQMNSLRAEDTAVYYCA- (SEQ ID NO: 66) RYPDWGWYTD\N\K3QGTLVTVSS (SEQ ID NO:68)

TP-2G4 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDALRKHYVY- SSYAMT\MRCN'GKGLEWVSNI- \NYQQKPGQAPVLVNGDNNRPSGI- SYSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL PERFSGSNSGNTAT1J1SGTQAEDEA- QMNSLRAEDTAVYYCARVGYYYGF- DYYcQsYDKpYp|LwgggTKLmgQ DYWGQGTLVNSS (SEQ ID NO: 72) (SEQ ID NO: 70)

TP-2G5 DMJQSPATLSLSPGE- QvQLQQsgpgLvKpsQnsLTcA|sgDsvs RAnscRAsQNvssNYLA- SNSAAWS- WYQQKPGQAPRLLIYDA- \MRQSPGRGLMGFIYYRSKWYN- sNMTgwARFsgsgsgTDmTlssLE- DYAVSVKSRI- PEDFAVYYCQQFYDSPQTFGQGTKVEIKRT TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- (SEQ ID NO: 74) CARHNPDLGFDYV\K3QGTLVNSS (SEQ ID NO: 76)

TP-2G6 DM-TQspAnsLspgERAnscRAs- QvQLQQsgpgLvKpsQnsLTcA|sgDsvs QYVTSSYLA- SSSAAV\/S\MRQSPGRGLEWL- VVYQQKPGQAPRLLÍYGSSRATGWARFSG GINYRSKJ/VYNDYAVSVKSRI- SGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQ- TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYY- QYSSSPITFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 78) cARHsMvgFD\/wgQgnvTvss (SEQ ID NO:80) ~

TP-2G7 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLWSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDNLG- NSYAMS~QAPGKGLEVWSN|SSNSSNT V\NQQKPGQAPVLVWGDNNRPSGI- YYADs\/KgRFT|sRDNsKNnYLQMNsLRA PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- EDTA\NY- DYYCQTYDSNNESMFGGGTKLTVLGQ CARKGGGEHGFFPSDI%QGTLVNSS (SEQ ID NO: 82) (SEQ ID NO: 84)

TP-2G9 DIALTQPASVSGSPGQSI- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF TISCTGTSSDLGGFNTVSWYQQHPGKAPKL NsYAMT\M/RQApgKgLEm- MIYSVSSRPSGVSNRFSGSKSGNTASL- sAlKsDgsN1YYADsvKgRFT|sRDNsKNn TISGLQAEDEADYYCQ- YLQMNSLRAEDTAVYY SYDLNNLWGGGTKLWLGQ (SEQ ID NO: CARNDSGV\FD\/V\/GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:88)

TP-2H1O DM-TQspAnsLspgE- QvQLQQsgpgLvKpsQnsLTcA|sgDsvs RAnscRAsQsvssFYLA- SNGAAWG- WYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGVPARFS VVIRQSPGRGLEWLGFIYRRSKJNYN- GSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQ- SYAVSVKSRI- QYDSTPSTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- 90) cARQDgMggMDs%QgnvTvss (SEQ ID NO: 92)

TP-3A2 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIG- QVQLWSGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF SRYAYWYQQKPGQAPUYDDSDRPSGL sNYYLsv\NRQApgKgLEmsg|- PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYY- sYNgssTNYADs\/KgRFTlsRDNsKNnn cAAYTFYAFúvFgggTKLTvLgQ (SEQ ID QMNSLRAEDTA\/YYCARMV\RYSL- NO:94) GADSWGQGTLVNSS (SEQ ID NO: 96)

Clone VL W TP-3A3 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGS- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF KY\/HWYQQKPGQAPWVNEDSDRPSGI- NNNAIS\/WRQAPGKGLEM/- PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- sA|NsssssTsYADsvKgRFT|sRDNsKNn DYYCQSV\/DKSEGYVFGGGTKLTVLGQ YLQMNSLRAEDTAVYY- (SEQ ID NO: 98) CARGHHRGHSWASFIDYV\/GQGTLVNSS (SEQ ID NO: 100)

TP-3A4 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF RISCSGDNLRDKYA& SSYV\MH\/\NRQAPGKGLEVNSSI- WYQQKPGQAPVLVNSKSERPSGI- SYDSSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL pERFsgsNsgNTAnT|sgTQAEDEA- QMNSLRAEDTAVYYCA- DYYCSSYTLNPNLNWFGGGTKLTVLGQ RYggMDYwgQgnvNss (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 102) 104) TP-3B3 DIELTQPASVSVAPGQTA- QvQLvEsgggLvQpggsLRLscAAsgnF RISCSGDNLRSKYAH- SSYGMH\M/RQAPGKGLEVWSN1- WYQQKPGQAPVLVNGDNNRPSGI- sYMgsNTNYADsvKgRFT|sRDNsKNnYL PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- QMNSLRAEDTAVYYCARGLFPGYF- DYYCSAYAMGSSPVFGGGTKLTVLGQ DYVVGQGTLVNSS (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 106)

TP-3B4 D1QMTQSPSSLSASVGDRWITCMSQNI& QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS NYLN- SNGAAWG- V\/YQQKPGKAPKLLIYGTSSLQSGVPSRFSG V\/1RQSPGRGLEVVLGHIYYRSKWYN- SGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQ- SYAVSVKSRI- QYGNNPTTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYY- 110) cARv\K3g|HDgD|YFDYvvgQgnvTvss (SEQID NO: 112)

TP-3C1 DIALTQPASVSGSPGQSI- QVQL\/ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF TISCTGTSSDLGGFNTVSVVYQQHPGKAPKL SSYSMHVWRQAPGKGLEVWSGI- MIYSVSSRPSGVSNRFSGSKSGNTASL- SYSSSFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ TISGLQAEDEADYYCQ- MNSLRAEDTAVYYCA- SYDLNNLWGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: RALggg\/DYwgQgnvTvss (SEQ ID NO: 136)

TP-3C2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSK- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS NYLN- SSSAAN WYQQKPGKAPKLLIYDVSNLQSGVPSRFSG VVIRQSPGRGLEWLGMIYYRSKWYN- SGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQY& HYAVSVKSRP GYPLTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 114) TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWY- cARggsg\MD~QgnvTvss (SEQ ÍD NO:116)

TP-3C3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIN- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS PYLN- SNSAAWG- WYQQKPGKAPKLLIYMSNLQSGVPSRFSG V\/1RQSPGRGLEJNLGVN"YRSKV\NN- SGSGTDFTLTISSLQPEDFA- DYAVSVKSRL \/YYCQQLDNRSWGQGTKVEIKRT (SEQ ID TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWYCA- NO:118) RARAKKsggFDNQgnvNss (SEQ ID NO: 120)

TP-3D3 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQL\/ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDSLGSKFAH- SSYAS\/WRQAPGKGLEVWSGISGDGSNTH V\/YQQKPGQAPVLVÍYDDSNRPSGI- YADs\/KgRFnsRDNsKNTLYLQMNsLRAE PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- DTAVYYCARYDNFYFD\/V\/GQGTLVNSS DYYCSTYTSRSHSYWGGGTKLWLGQ (SEQ ID NO: 124) (SEQ ID NO: 122)

Cbne VL VH TP-3E1 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIG- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF SYYMWYQQKPGQAPVLMYDDSNRPSGP SNYAMT\M/RQAPGKGLEWVSVISSVGSNT pERFsgsNsgNTAnTlsgTQAEDEA- YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA DYYCQSYDSTGLLVFGGGTKLWLGQ (SEQ EDTAVYY- ID NO: 126) CARPTKAGRT\MN\NGPYMD\/VVGQGTLW VSS (SEQ ID NO: 128) TP-3F1 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSY- QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCK- FASWYQQKPGQAPVLVIYDDSNRPSGI- GSGYSFTDYV\/!GVWRQMPGKGLE\NM- pERFsgsNsgNTAnTlsgTQAEDEADYY- GIIQPSDSDTNYSPSFQGQWSADKS1& CEGSNVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: TAYLQV\/SSLKASDTAMYY- 130) CARFMVW\/GKYDSGFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 132) TP-3F2 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLWSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDNLPSKSW- SSYSMHV\NRQAPGKGLE\NVSG1- WYQQKPGQAPVLVNGDNNRPSGI- SYSSSFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ PERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEA- MNSLRAEDTAVYYCA- DYYcQswrsRpMvvFgggTKLTvLgQ RALggg\/DYwgQgnvNss (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 134) 136) TP-3G1 D1QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGI& QvQLQQsgpgLvKpsQnsLTcA|sgDsvs SYLHWYQQKPGKAPKLLIY- SNSGGVVGWIRQSPGRGLEWLGLIYYRSK gAsnQsgvpsRFsgsgsgTDFnT|ssLQ V\/YNAYAVSVKSRI- PEDFÂTYYCQQQNGYPFTFGQGTKVEIKRT TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAWYCA- m (SEQ ID NO: 138) RYLGSNFYVYSD\N\/GQGTLVNSS (SEQ

W ID NO: 140) TP-3G3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMSQ- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF

V NIHSHLNVWQQKPGKAPKLLIY- SSYSMSV\NRQAPGKGLE\/'NSSISSSSSNT DASSLQSGWSRFSGSGSGTDHLTISSLQ YYgDsvKgRmsRDNsKNnYLQMNsLRA PEDFA\/YYCQQYYDYPLTFGQGTKVEIKRT EDTAVYYCARMHYKGMDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 142) (SEQ ID NO: 144) TP-3H2 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RISCSGDKLGKYYAY- NSYYMSVWRQAPGKGLEVWSNISSSGSNT WYQQKPGQAPWVTYGDSKRPSGI- NYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA PERFSGSNSGNTÂTLTISGTQAEDEA- EDTAVYYCARVHYGFDFWGQGTLVNSS DYYCSSMFGSTVFGGGTKLTWGQ (SEQ (SEQ ID NO: 148) ID NO: 146) TP-4A7 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF RÍSCSGDALGSKFAH- RNYAMNVV\/RQAPGKGLEJ/VVSVISGSSSY- WYQQKPGQAPVLVIYDDSERPSGI- TYYADsvKgRmsRDNsKNnYLQMNsLR PERFSGSNSGNTATLTlSGTQAEDEA- AEDTAVYYCARADL- DYYCQAYDSGLLWFGGGTKLTVLGQ (SEQ pYMvFDYvvgQgnvTvss (SEQ ID NO: IDNO:150) 152) TP-4A9 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDALG- QVQL\/ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF KYYAsmQQKpgQApvLvNgDNKRpsgp SSYGMSVWRQAPGKGLEVWSLISGVSSST PERFSGSNSGNTÂ1LTISGTQAEDEA- YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA DYYCQSYTTRSLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ EDTAvYYcARsYLgYFD\/v\/gQgnvNss ID NO: 154) (SEQ ID NO: 156)

Clone VL VH

TP-4B7 DI%QSPLSLPVTPGEPA- QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS SISCRSSQSLVFSDGNTYLN- SNSAAJNSWIRQSPGRGLEWL- WYLQKPGQSPQLLIYKGSNRASGVPDRFS GIIYKRSKWYNDYAVSVKSRI- gsgsgTDFmK|sRvEAEDvgwYcQQm TINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYY- SYPLTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 158) cARwF|sDKHv\K3FDYv\K3QgnvTvss (SEQ ID NO: 160)

TP-4E8 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF RISCSGDALGSKYV& NDYAMSMRQAPGKGLEVWSLIESVSSST VVYQQKPGQAPVLVWGDNKRPSGI- YYADsvKgRFT|sRDNsKNnYLQMNsLRA PERFSGSNSGNTÂTLTISGTQAEDEA- EDTAVYYCAR- DYYcQsYTYsLNQvFgggTawLgQ TIG\/LVVDD\/V\/GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 162)

TP-4G8 DIELTQPPSVSVAPGQTA- QvQLvEsgggLvQpggsLRLscAAsgnF RISCSGDKLGSKSVHV\/YQQKPGQAPVLMY STYAMHVWRQAPGKGLEVWSTI& RDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATL- GYGSFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ TISGTQAEDEADYYCQTY- MNSLRAEDTAVYY- DYILNVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 166) CARNGRKYGQMDNVVGQGTLVNSS (SEQ ID NO: 168) TP-4H8 DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGK- QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFTF KY\/HVWQQKPGQAPWVIYGDNNRPSGI- sDHAMHmRQApgKgLEvNsv|EYsgsKT PERFSGSNSGNTA11-TISGTQAEDEA- NYADS\/KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA DYYCSTADSVITYKNVFGGGTKLWLGQ EDTAVYYCARGDYYPYLV- (SEQ ID NO: 170) FAmQgnvTvss (SEQ ID NO: 172)

r Reatividade cruzada a TFPI de camundongo -

Os 44 clones de ligação ao TFPI humano acima também foram testados quanto à ligação a TFPI de camundongo em ELISA.

Dezenove an- ticorpos foram observados com reatividade cruzada a TFPI de camundongo. 5 Para facilitar o estudo com o uso de modelo de hemofilia de camundongo, nós caracterizamos ainda estes 19 anticorpos, assim como cinco anticorpos que eram específicos para TFPI humano.

Um conjunto representativo dos dados é mostrado na figura 1. Nenhum destes anticorpos se ligou a BSA ou Iisozima no ELISA. 10 Exemplo 2. Expressão e purificação de anticorpos anti-TFPI Os anticorpos anti-TFPl (como fragmentos Fab) foram expressos e purificados a partir da cepa bacteriana TGl.

Resumidamente, uma única coIônia da cepa bacteriana TGl contendo o pIasmídio de expressão do anti- corpo foi selecionada e cultivada de um dia para o outro em 8 ml de meio 15 2xYT na presença de 34 mg/ml de cloranfenicol e 1°/0 de glicose.

Um volume de 7 ml de cultura foi transferido para 250 ml de meio 2XYT contendo 34 mg/ml de cloranfenicol e 0,1% de glicose.

Após 3 horas de incubação, 0,5 mM de IPTG foi adicionado para induzir expressão de Fab. A cultura foi con- tinuada de um dia para o outro a 25 °C. A cultura foi centrifugada para pele- tizar as células bacterianas. O pélete foi, então, ressuspenso em um tampão de Iise Bug Buster (Novagen). Após a centrifugação, o sobrenadante da lise - 5 bacteriana foi filtrado. Os fragmentos Fab foram purificados por afinidade através de uma coluna N1-NTA (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Exemplo 3. Determinação da EC50 e afinidade de ligação dos anticorpos anti-TFPl 10 Os anticorpos de Fab purificados foram usados para determinar a EC50 dos anticorpos anti-TFPI contra TFPI humano ou de camundongo. A EC50 foi avaliada em um ELISA, de modo similar ao descrito acima. Os resul- tados foram analisados com o uso de SoftMax. A afinidade de ligação dos anticorpos anti-TFPl foi determinada em um ensaio Biacore. Resumidamente, " 15 o antígeno, TFPI humano ou de camundongo, foi imobilizado nos chips CM5

F com o uso do kit de acoplamento de amina (GE HealthCare) de acordo com - as instruções do fabricante. A quantidade de TFPI imobilizado foi ajustada para a massa do antígeno para fornecer aproximadamente 300 RU. Os Fabs do anticorpo foram analisados em fase móvel e pelo menos cinco concentra- 20 ções diferentes (0,1, 0,4, 1,6, 6,4 e 25 nM) dos anticorpos purificados foram usadas no ensaio Biacore. A cinética e a afinidade de ligação foram calcula- das com o uso do programa de avaliação Biacore TIOO. Conforme mostrado na Tabela 3, os 24 Fabs anti-TFPl mostra- ram várias EC50 para TFPI humano (0,09 a 792 nM) e TFPI de camundongo 25 (0,06 a 1035 nM), e a afinidade determinada por Biacore variou de acordo para TFPI humano (1,25 a 1140 nM). No estudo Biacore dos Fabs para TFPI de camundongo, a variação da afinidade foi menor (3,08 a 51,8 nM). Tabela 3. A atividade de ligação de 24 anticorpos contra TFPI humano ou de camundongo como determinado por ELISA e Biacore (hTFPI: TFPI humano; 30 mTFPl: TFPI de camundongo; Neg: sinal foi menor que duas vezes o fundo; ND, não realizado).

EC50 da ligação (nM) Afinidade (nM Clones de anti hTFPl I mTFPl hTFPl mTFPl TP-2A2 0,62 I 1035,88 6,57 29,8 TP-2A5 28,64 i 14,54 35,4 19,6 TP-2A8 0,09 I 0,06 1,25 3,08 TP-2B11 11,52 l 0,52 21,5 16,3 TP-2B3 0,84 I 20,18 7,40 27,0 TP-2C1 0,40 : Neg 2,64 N TP-2C7 0,60 I 0,60 2,01 9,33 TP-2E5 791,60 I 202,28 115 25,2 TP-2G5 342,52 l 871,34 42,1 16,1 TP-2G6 0,48 I 5,18 5,06 46,1 TP-2G7 23,48 I Neg 26,9 TP-2G9 10,80 I 194,42 48,5 35,7 TP-2H1O 2,18 I 32,40 10,2 11,5 - TP-3A4 42,84 l 326,58 21,6 23,7 TP-3B4 35,76 I 34,62 14,1 20,4 TP-3C1 32,80 l 108,40 21,6 33,6 TP-3C2 59,00 I 956,68 17,1 28,5 TP-3G1 74,40 l 8,68 1140 49,1 TP-3G3 33,60 I 47,06 16,0 25,7 TP-4A9 0,17 | 117,68 7,60 TP-4B7 0,74 2,64 15,8 51,8 TP-4E8 36,94 Neg 35,9 ND TP-4G8 846,92 Neg 25,2 ND TP-4H8 72,50 Neg 32,2 ND Exemplo 4. Conversão de Fab anti-TFPI em IgG Todos os anticorpos anti-TFPI identificados eram Fabs comple- tamente humanos que podem ser convertidos, de forma viável, em IgG hu- mana como agente terapêutico.

Neste exemplo, entretanto, os Fabs selecio- 5 nados foram convertidos em um anticorpo quimérico contendo uma região constante de lgG de camundongo, de modo a serem mais adequados para teste em um modelo de camundongo.

A região variável dos anticorpos sele- cionados foi enxertada em um vetor de expressão de mamífero contendo as regiões constantes de camundongo.

A molécula de lgG completamente montada foi, então, transfectada e expressa em células HKB11 (Mei et al., - 5 Mol.

Biotechnol., 2006, 34: 165-178). O sobrenadante da cultura foi coletado e concentrado.

As moléculas de lgG anti-TFPl foram purificadas por afinida- de através de uma coluna de proteína G Hitrap (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 5. Seleção de anticorpos neutralizantes anti-TFPl 10 Os anticorpos neutralizantes anti-TFPl foram selecionados com base na sua inibição da atividade de TFPI sob três condições experimentais.

A atividade de TFPI foi medida com o uso do teste de atividade de TFPI AC- T|CHROME® (American Diagnostica lnc., Stamford, CT), um ensaio cromo-

gênico em três estágios para medir a capacidade de TFPI inibir a atividade " 15 catalítica do complexo TF/FVlla para ativar o fator X em fator Xa.

A atividade £ neutralizante do anticorpo anti-TFPl é proporcional à quantidade de geração r de FXa restaurado.

Na primeira condição, os anticorpos anti-TFPl purifica- dos foram incubados com TFPI recombinante humano ou de camundongo (R&D System) nas concentrações indicadas.

Após a incubação, as amostras 20 foram misturadas com TF/FVlla e FX, e a atividade residual do complexo TF/FVlla foi, então, medida com o uso de FXa SPECTROZYME®, um subs- trato cromogênico de fXa altamente específico.

Este substrato foi clivado apenas pelo FXa gerado no ensaio, liberando um cromóforo de p-nitroanilina (pNA), que foi medido a 405 nm.

A atividade de TFPI presente na amostra 25 foi interpolada a partir de uma cuNa padrão construída com o uso de níveis conhecidos de atividade de TFPI.

O ensaio foi realizado no modo "end-point". Nas duas outras condições, os anticorpos anti-TFPl foram reforçados em plasma humano normal ou plasma hemofílico A, e a geração de FXa restau- rado foi medida. 30 Exemplo 6. Os anticorpos anti-TFPl encurtam o tempo de coagulação em um teste de tempo de protrombina diluída (dPT) O teste de dPT foi executado essencialmente conforme descrito em Welsch et al., Thrombosis Res., 1991, 64(2): 213-222. Resumidamente, plasma humano normal (FACT, George King Biomedical), plasma esgotado em TFPI humano (American Diagnostica) ou pIasma hemofílico A (George + King Biomedical) foram preparados pela mistura de plasma com 0,1 volume 5 de tampão de controle ou anticorpos anti-TFPl. Após incubação durante 30 min a 25 °C, as amostras de plasma (100 ml) foram combinadas com 200 ml de Simplastina (Biometieux) apropriadamente diluída (diluição de 1:500) co- mo uma fonte de tromboplastina e o tempo de coagulação foi determinado com o uso de um fibrômetro STA4 (Stago). A tromboplastina foi diluída com 10 PBS ou tampão à base de Tris 0,05 M (pH 7,5) contendo 0,1 M de cloreto de sódio, O,i°/o de albumina sérica bovina e 20 mM de cloreto de cálcio. Exemplo 7. Os anticorpos anti-TFPI, sozinhos ou em combi- nação com fator VIII ou fator IX recombinante, encurtam o tempo de co- agulação do sangue em um teste ROTEM " 15 O sistema ROTEM (Pentapharm GmbH) incluiu um instrumento

A de quatro canais, um computador, padrões de plasma, ativadores e recipien- - tes e pinos descartáveis. Os parâmetros trombelastográficos dos sistemas de hemostase ROTEM incluíram: tempo de coagulação (CT), que reflete o tempo da reação (o tempo necessário para se obter amplitude de 2 mm após 20 o início da coleta de dados) para iniciar a coagulação do sangue; tempo de formação de coágulo (CFT) e o ângulo alfa para refletir a propagação da co- agulação, e a amplitude máxima e o módulo elástico máximo para refletir a firmeza do coágulo. No teste ROTEM, 300 ml de sangue total ou plasma fresco citratado foram avaliados. Todos os constituintes foram reconstituídos 25 e misturados de acordo com as instruções do fabricante, com coleta de da- dos durante o período de tempo necessário para cada sistema. Resumida- mente, as amostras foram misturadas por remoção/dispensação de 300 ml de sangue ou plasma com uma pipeta automática em recipientes ROTEM com 20 ml de CaC|2 (200 mmols) adicionado, seguido imediatamente pela 30 mistura da amostra e início da coleta de dados. Os dados foram coletados durante 2 horas com o uso de um sistema ROTEM controlado por computa- dor (versão do programa 2.96).

Um resultado exemplificador do teste ROTEM na detecção do efeito de anticorpos anti-TFPl em encurtar o tempo de coagulação do san- gue é mostrado nas figuras 3 e 5. A figura 3 mostra que TP-2A8-Fab encur- tou o tempo de coagulação em plasma hemofílico A humano ou sangue total . 5 hemofílico A de camundongo, sozinho ou em combinação com FVIII recom- binante, quando o sistema ROTEM foi iniciado com NATEM.

A figura 5 mos- tra que os anticorpos anti-TFPl no formato lgG (TP-2A8, TP-3G1, e TP-3C2) encurtaram os tempos de coagulação em comparação a um anticorpo lgG camundongo de controle negativo.

Com base nestes resultados e no conhe- lO cimento da técnica, o versado na técnica esperaria que estes anticorpos an- ti-TFPl também encurtassem o tempo de coagulação em combinação com FlX recombinante em comparação a estes anticorpos sozinhos.

Exemplo 8. Atividade funcional in vitro de anticorpos anti- TFPI Para investigar os anticorpos TFPI no bloqueio da função de " 15 TFPI, o teste cromogênico ACTICHROME e tempo de protrombina diluída e

(dPT) foram usados para testar a atividade funcional dos anticorpos obtidos - a partir de panning e seleção.

Em ambos os testes, um anticorpo monoclonal de rato anti-TFPl (R&D System) foi usado como controle positivo e Fab poli- clonal humano foi usado como controle negativo.

No teste cromogênico, oito 20 dos anticorpos inibiram mais de 50% da atividade de TFPI em comparação ao anticorpo monoclonal de rato (Tabela 4). No teste de dPT, todos estes oito Fabs anti-TFPl mostraram um efeito altamente inibitório, encurtando o tempo de coagulação abaixo de 80 segundos, e quatro dos oito Fabs encur- taram o dPT abaixo de 70 segundos.

A dependência da dose de quatro dos 25 clones representativos em encurtar o dPT é mostrada na figura 2. Entretanto, outros Fabs humanos anti-TFPl com baixa ou nenhuma atividade inibitória de TFPI também encurtaram o tempo de coagulação em dPT.

Por exemplo, TP-3B4 e TP-2C7, embora mostrando menos que 25% de atividade inibitória, foram capazes encurtar o dPT para menos que 70 segundos.

Uma análise 30 de regressão Iinear simples da atividade inibitória e do dPT sugere uma cor- relação significativa (p=O,0095), mas grande variância (R quadrado = 0,258). Tabela 4. A atividade funcional in vitro dos anticorpos anti-TFPl como de-

terminado por sua atividade de inibição no teste de TFPI humano e no teste de dPT. °/) de inibição da atividade dPT em plasma com hemoA Clone de hTFPl (seg) anti-TFPl 100°6 63,5 TP-2B3 1OO°/o 74,0 TP-4B7 1OO°/o 53,9 TP-3G1 93% 75,1 TP-3C2 92% 68,9 TP-2G6 86% 62,8 TP-2A8 100% 57,9 TP-2H1O 63% 79,5 TP-2G7 55% 72,2 TP-4G8 39% 73,9 TP-2G5 36% 73,2 - TP-2A5 3Õ°/o 70,8

W TP-4E8 29% 71,9 TP-4H8 28% 76,5 TP-3B4 25% 69,1 TP-2A2 23% 70,9 TP-2C1 21% 70,9 TP-3G3 15% 70,7 TP-2E5 0q/o 79,0 TP-3A4 QO/j 72,3 TP-3C1 Oq/o 72,3 TP-2B11 Oq/o 82,6 TP-2C7 Oq/o 62,5 TP-2G9 0q/o 82,7 não tratado Oq/o 92,9 Um dos Fabs anti-TFPI, Fab-2A8, também foi testado no teste ROTEM no qual plasma humano com hemofilia A com um baixo teor de fator

Vlll ou sangue total de camundongo com hemofilia A foi usado. Conforme mostrado na figura 3, em comparação a um anticorpo policlonal de coelho anti-TFPI, o Fab-2A8 mostrou atividade similar em plasma humano com he- . mofilia A, reduzindo o tempo de coagulação (CT) de 2200 segundos para 5 aproximadamente 1700 segundos. Quando o sangue total de camundongo com hemofilia A foi usado, o anticorpo de controle, anti-TFPl de coelho, en- curtou o CT de 2700 segundos para 1000 segundos, enquanto que o Fab- 2A8 encurtou o CT de 2650 segundos para 1700 segundos. Estes resultados indicam que o Fab-2A8 pode encurtar significativamente o tempo de coagu- lO lação em plasma humano e em sangue de camundongo (p = 0,03). Exemplo 9. Função dos anticorpos anti-TFPI após conver- são em lgG quimérica Testes in vitro de geração de fator Xa e de tempo de protrombi- na diluída indicam que pelo menos seis dos 24 Fabs anti-TFPl, TP-2A8, TP- " 15 2B3, TP-2G6, TP-3C2, TP-3G1 e TP-4B7, podiam bloquear a função de TF- . Pl. Para facilitar o estudo in vivo com o uso de camundongos com hemofilia

W A, nós convertemos estes seis Fabs humanos anti-TFPl em lgG quimérica, com o uso do isotipo lgGl murino. O vetor de expressão de lgG foi transfec- tado em células HKB11, e o anticorpo expresso foi coletado no sobrenadan- 20 te da cultura e purificado em coluna de proteína G. Quando um clone repre- sentativo, 2G6-Fab, foi convertido em lgG, o 2G6-lgG mostrou um aumento de duas vezes da EC50 de ligação a TFPI humano (de 0,48 nM para 0,22 nM) e um aumento de 10 vezes para TFPI de camundongo (de 5,18 nM para 0,51 nM). Os resultados da ligação de lgG-2G6 a TFPI humano e de camun- 25 dongo são mostrados na figura 4. Exemplo 10. Efeito sobre a taxa de sobrevida em modelo de transecção da veia da cauda de camundongo com hemofilia A (HemA) Um modelo de transecção da veia da cauda de camundongo foi estabelecido para avaliação farmacológica. Este modelo simula a ampla ga- 30 ma de fenótipos de sangramento observados entre indivíduos normais e hemofílicos graves. Para estes estudos, foram usados camundongos ma- chos com hemofilia A (8 semanas de idade e com 20 a 26 gramas). Os ca-

mundongos foram administrados através de infusão na veia da cauda com anticorpo monoclonal anti-TFPl (40 µg/camundongo), sozinho ou junto com um fator da coagulação como FVlll (0,1 1U/camundongo) antes da lesão. 24 6 horas após a dosagem, a veia esquerda da cauda foi cortada a 2,7 mm da 5 ponta (no diâmetro). A sobrevida foi observada ao longo de 24 horas após a transecção. Foi demonstrado que a taxa de sobrevida era dependente da dose com administração de FVIII recombinante (dados não mostrados). Os dados mostrados na figura 8 foram de dois estudos separados (n = 15 e n = 10, respectivamente). Os resultados mostraram que a TP-2A8-lgG prolongou 10 significativamente a sobrevida de camundongos com hemofilia A em compa- ração à lgG do camundongo de controle; e, em combinação com FVlll re- combinante, apresentaram uma taxa de sobrevida melhor do que qualquer agente sozinho. Exemplo 11. A combinação do anticorpo anti-TFPI com fator " 15 VIla recombinante encurtou ainda mais o tempo de coagulação e o e tempo para formação de coágulo

W O efeito combinado do anticorpo anti-TFPl e do FVlla recombi- nante (Novo Nordisk) foi avaiiado em um sistema ROTEM com o uso de EX- TEM (diluição de 1:1000) e sangue total de camundongo com hemofilia A. 20 As quantidades indicadas de anticorpo anti-TFPl, TP-2A8-IgG ("2A8"), e FVl- la recombinante ("FVlla"), foram adicionadas em 300 µ1 de sangue total citra- tado de camundongo com hemofilia A, e a coagulação do sangue foi iniciada com o uso do sistema EXTEM. A figura 9 mostra que a adição de TP-2A8- IgG ou FVlla recombinante em sangue total de camundongo com hemofilia A 25 encurtou o tempo de coagulação e o tempo para formação de coágulo, res- pectivamente. A combinação de TP-2A8-lgG e FVlla recombinante ("2A8 + FVlla") encurtou ainda mais o tempo de coagulação e o tempo para forma- ção de coágulo, indicando que a combinação de anticorpo anti-TFPl com FVlla recombinante é útil no tratamento de pacientes com hemofilia com ou 30 sem inibidores. Exemplo 12. Os anticorpos anti-TFPj encurtaram o tempo de coagulação em sangue hemofílico humano induzido com inibidor de

FVlll. Os anticorpos anti-TFPl selecionados, 2A8 e 4B7, também foram testados em um teste ROTEM teste com o uso de anticorpos neutralizantes de FVlll para induzir hemofilia no sangue total extraído de pacientes não- - 5 hemofílicos. A figura 10 mostra que o sangue humano normal tem um tempo de coagulação de aproximadamente 1000 segundos. Na presença de anti- corpos neutralizantes de FVlll (PAH, 100 micrograma/mL), o tempo de coa- gulação foi prolongado para aproximadamente 5200 segundos. O tempo de coagulação prolongado foi significativamente encurtado pela adição de um 10 anticorpo anti-TFPl, 2A8 ou 4B7, indicando que o anticorpo anti-TFPl é útil no tratamento de pacientes hemofílicos com inibidores. Exemplo 13. Os anticorpos anti-TFPl inibitórios se Iigam ao domínio Kunitz 2 de TFPI humano Western blots e ELISA foram usados para determinar qual(is) " 15 O(S) domínio(s) de TFPI os anticorpos inibitórios se ligam. TFPI humano de

H extensão completa recombinante ou domínios de TFPI foram usados para « estes estudos. O ELISA foi similar ao Exemplo 3. No Western Blot, TFPI humano ou os domínios foram corridos em um SDS PAGE 4 a 12% de Bis- Tris com tampão de corrida MES (Invitrogen, Carlsbad, CA) e, então, trans- 20 feridos para uma membrana de celulose. Após incubação com anticorpos inibitórios durante 10 minutos, a membrana foi lavada três vezes com o uso do sistema SNAPid (Millipore, Billerica, MA). Um anticorpo de jumento anti- camundongo conjugado a HRP (Pierce, Rockford, IL) a uma diluição de 1 para 10.000 foi incubado com a membrana durante 10 minutos. Após uma 25 etapa de Iavagem similar, a membrana foi revelada com o uso do substrato SuperSignal (Pierce, Rockford, IL ). Enquanto o anticorpo antidomínio Kunitz 1 de controle se Iiga ao TFPI de extensão completa, TFPI truncado e domí- nios, os anticorpos anti-TFPl inibitórios se ligam apenas ao TFPI contendo o domínio Kunitz 2. lsto indica que a ligação ao domínio Kunitz 2 é necessária 30 para a função inibitória do anticorpo.

Tabela 5. Os domínios ligados pelos anticorpos, como determinado por Western blots e ELISA Anti- TP- TP- TP- TP- TP- I TP- I Kl mlaG 2A8 2B3 2G6 3C2 3G1|4B7| Extensão + + + + + + + completa K1+K2+K3 + + + + + + +

K1+K2 + + + + + + +

Kl + Embora a presente invenção tenha sido descrita com relação às modalidades específicas e exemplos, deve-se compreender que várias mo- 5 dificações e alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituí- dos sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção.

O relatório descritivo e os exemplos devem, consequentemente, ser considerados em %

sentido ilustrativo e não restritivo.

Além disso, todos os artigos, Iivros, pedi- . dos de patente e patentes aqui referidos estão incorporados a título de refe- " 10 rência em suas totalidades.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal isolado que se Iiga ao inibidor da via do fator tecidual humano, que compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID . 5 NOs: 388-430.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, que com- preende, adicionalmente, (a) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 302-344, (b) uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada 10 do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 345-387, ou (c) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOS: 302-344 e uma CDR2 que compreende uma sequên- cia de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 345-

387. ' 15 3. Anticorpo monoclonal isolado que se liga ao inibidor da via do - fator tecidual humano, que compreende uma CDR3 que compreende uma - sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 259-301.

4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 3, que com- 20 preende, adicionalmente, (a) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 173-215, (b) uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 216-258, ou (C) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que con- 25 siste nas SEQ ID NOs: 173-215 e uma CDR2 que compreende uma sequên- cia de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 216-

258.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, que compreende, adicionalmente, uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido 30 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 259-301.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, que compreende, adicionalmente, (a) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoá-

cido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 302-344, (b) uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 345-387, (C) uma CDRI que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ . 5 ID NOs: 173-215, e (d) uma CDR2 que compreende uma sequência de ami- noácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 216-258.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, que compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve que compreendem: (a) uma região variável da cadeia leve que compreende 10 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 173, 216 e 259, e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 302, 345 e 388; (b) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 174, 217 e " 15 260, e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- . - cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 303, 346 e 389; - (c) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 175, 218 e 261 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 20 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 304, 347 e 390; (d) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 176, 219 e 262, e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 305, 348 e 391; 25 (e) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 177, 220 e 263 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 306, 349 e 392; (f) uma região variável da cadeia leve que compreende 30 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 178, 221 e 264 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 307, 350 e 393;

(g) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 179, 222 e 265 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 308, 351 e 394; ^ 5 (h) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 180, 223 e 266 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 309, 352 e 395; (i) uma região variável da cadeia leve que compreende 10 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 181, 224 e 267 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 310, 353 e 396; (j) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 182, 225 e " 15 268 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- . + + cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 311, 354 e 397; (k) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 183, 226 e 269 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 20 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 312, 355 e 398; (I) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 184, 227 e 270 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ÍD NOs: 313, 356 e 399; 25 (m) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 185, 228 e 271 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 314, 357 e 400; (n) uma região variável da cadeia leve que compreende 30 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 186, 229 e 272 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 315, 358 e 401;

(O) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 187, 230 e 273 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 316, 359 e 402; ^ 5 (p) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 188, 231 e 274 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 317, 360 e 403; (q) uma região variável da cadeia leve que compreende 10 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 189, 232 e 275 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 318, 361 e 404; (r) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 190, 233 e " 15 276 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 319, 362 e 405;

W (S) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 191, 234 e 277 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 20 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 320, 363 e 406; (t) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 192, 235 e 278 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 321, 364 e 407; 25 (u) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 193, 236 e 279 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 322, 365 e 408; (V) uma região variável da cadeia leve que compreende 30 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 194, 237 e 280 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 323, 366 e 409;

(w) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 195, 238 e 281 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 324, 367 e 410; 5 (X) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 196, 239 e 282 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 325, 368 e 411; (y) uma região variável da cadeia leve que compreende 10 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 197, 240 e 283 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 326, 369 e 412; (z) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 198, 241 e " 15 284 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- . - cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 327, 370 e 413; . (aa) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 199, 242 e 285 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 20 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 328, 371 e 414; (bb) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 200, 243 e 286 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 329, 372 e 415; 25 (CC) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 201, 244 e 287 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 330, 373 e; (dd) uma região variável da cadeia leve que compreende 30 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 202, 245 e 288 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 331, 374 e 417;

(ee) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 203, 246 e 289 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 332, 375 e 418; - 5 (ff) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 204, 247 e 290 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 333, 376 e 419; (gg) uma região variável da cadeia Ieve que compreende 10 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 205, 248 e 291 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 334, 377 e 420; (hh) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 206, 249 e " 15 292 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- . - cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 335, 378 e 421; - (ii) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 207, 250 e 293 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 20 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 336, 379 e 422; (jj) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 208, 251 e 294 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 337, 380 e 423; 25 (kk) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 209, 252 e 295 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 338, 381 e 424; (ll) uma região variável da cadeia leve que compreende 30 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 210, 253 e 296 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 339, 382 e 425;

(mm) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 211, 254 e 297 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên-

. cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 340, 383 e 426; 5 (nn) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 212, 255 e 298 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 341, 384 e 427; (OO) uma região variável da cadeia leve que compreende 10 uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 213, 256 e 299 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 342, 385 e 428; (pp) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 214, 257 e " 15 300 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 343, 386 e 429; - (qq) uma região variável da cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOs: 215, 258 e 301 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- 20 cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 344, 387 e 430; ou (rr) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 194, 237 e 280 e uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequên- cia de aminoácido que compreende as SEQ ID NOS: 335, 378 e 421. 25

8. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, que compreende: (a) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 4; 30 (b) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 6 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 8;

(C) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 10 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 12;

W (d) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 5 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 14 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 16; (e) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 18 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 20; 10 (f) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 22 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 24; (g) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 26 e uma região variável da cadeia pesada " 15 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 28; b - (h) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência - de polipeptídeo da SEQ ID NO: 30 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 32; (i) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 20 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 34 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 36; (j) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 38 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 40; 25 (k) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 42 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 44; (I) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 46 e uma região variável da cadeia pesada 30 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 48; (m) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 50 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 52; (n) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 54 e uma região variável da cadeia pesada

. que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 56; 5 (O) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 58 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 60; (p) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 62 e uma região variável da cadeia pesada 10 que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 64; (q) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 66 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 68; (r) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência " 15 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 70 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 72; . (S) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 74 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 76; 20 (t) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 78 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 80; (u) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 82 e uma região variável da cadeia pesada 25 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 84; (V) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 88; (w) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 30 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 90 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 92; (x) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência

# r de polipeptídeo da SEQ ID NO: 94 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 96; ", ' (y) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência

. de polipeptídeo da SEQ ID NO: 98 e uma região variável da cadeia pesada 5 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 100; (z) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 102 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 104; (aa) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 10 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 106 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 108; (bb) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 110 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 112; " 15 (CC) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência "- de polipeptídeo da SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia pesada . que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 116; (dd) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 118 e uma região variável da cadeia pesada 20 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 120; (ee) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 122 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 124; (ff) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 25 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 126 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 128; (gg) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 130 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 132; 30 (hh) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 134 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 136;

(ii) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência »· de polipeptídeo da SEQ ID NO: 138 e uma região variável da cadeia pesada " que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 140;

W (jj) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 5 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 142 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 144; (kk) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 146 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 148; 10 (ll) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 150 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 152; (mm) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 154 e uma região variável da cadeia pesada " 15 que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 156; (nn) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência . de polipeptídeo da SEQ ID NO: 158 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 160; (oo) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência 20 de polipeptídeo da SEQ ID NO: 162 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 164; (pp) uma região variável da cadeia Ieve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 166 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 168; 25 (qq) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 170 e uma região variável da cadeia pesada que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 172; or (rr) uma região variável da cadeia leve que tem a sequência de poIipeptídeo da SEQ ID NO: 86 e uma região variável da cadeia pesada 30 que tem a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 136.

9. Anticorpo monoclonal isolado que se liga ao inibidor da via do fator teciduai humano, em que o anticorpo compreende uma região variável

W da cadeia pesada humana que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 96% de identidade a uma sequência de aminoácido " selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácido descritas . nas SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID 5 NO:20, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:lOO, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:108, SEQ ID 10 NO:112, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:168, e SEQ ID NO:172.

10. Anticorpo monoclonal isolado que se liga ao inibidor da via " 15 do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma região variá- ^ vel da cadeia leve humana que compreende uma sequência de aminoácido - que tem pelo menos 97% de identidade a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácido descritas em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:lO, SEQ ID NO:14, SEQ ID 20 NO:18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:106, SEQ ID 25 NO:11O, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:166, e SEQ ID NO:170.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 30 9, ou 10, que é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de lgGl, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, lgA secretória, IgD, e lgE.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10 ou 11, em que o tempo de coagulação do sangue na presença do anti- - corpo é reduzido quando medido pelo tempo de protrombina diluída.

F

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia - 5 única.

14. Composição farmacêutica, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal como definido na reivindi- cação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, e um veículo farmaceutica- mente aceitável. 10

15. Método para tratar deficiências ou defeitos genéticos e ad- quiridos na coagulação, que compreende administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindi- cação 14, a um paciente.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, que trata hemofi- 15 liaAou B.

17. Método para reduzir o tempo de sangramento, que compre- ende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindicação 14, a um paciente.

18. Método para tratar deficiências genéticas e adquiridas na 20 coagulação, que compreende administrar (a) uma primeira quantidade de um anticorpo monoclonal que se liga ao inibidor da via do fator tecidual hu- mano e (b) uma segunda quantidade de fator Vlll ou fator lX, em que as ditas primeira e segunda quantidades juntas são eficazes para tratar as ditas deficiências ou defeitos e em que, adicionalmente, o fator Vll não é coadmi- 25 nistrado.

19. Composição farmacêutica, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação de (a) um anticorpo monoclonal co- mo definido na reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, e (b) fator Vlll ou fator lX; em que a composição é isenta de fator Vll. 30 20. Método para tratar deficiências ou defeitos genéticos e ad- quiridos na coagulação, que compreende administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindi-

m cação 19, a um paciente em necessidade.

21. Método para reduzir o tempo de sangramento, que compre- " ende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindicação 19, a um paciente. - 5

22. Anticorpo monoclonal completamente humano isolado para um inibidor da via do fator tecidual humano.

23. Composição farmacêutica, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal como definido na reivindi- cação 22 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 10

24. Método para tratar deficiências ou defeitos genéticos e ad- quiridos na coagulação, que compreende administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindi- cação 23, a um paciente.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, que compreende, " 15 adicionalmente, administrar fator VIII ou fator lX.

-

26. Molécula de ácido nucfeico isolada, que codifica um anticor- - po que se liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticor- po compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 388-430. 20

27. Molécula de ácido nucleico isolada, que codifica um anticor- po que se liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticor- po compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 259-301.

28. Método para produzir um anticorpo monoclonal completa- 25 mente humano que se liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, que compreende: (i) transfectar uma sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo monoclonal completamente humano em uma célula hospedeira, e (ii) cultivar a célula hospedeira de modo a expressar o anti- 30 corpo monoclonal.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que o anti- corpo monoclonal compreende uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de sequências que consiste nas - SEQ ID NOS: 388-430. ~

30. Método para produzir um anticorpo monoclonal que se Iiga ao inibidor da via do fator tecidual humano, que compreende: 5 (i) transfectar uma sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo monoclonal em uma célula hospedeira, e (ii) cultivar a célula hospedeira de modo a expressar o anti- corpo monoclonal, em que o anticorpo monoclonal compreende uma CDR3 que compreende 10 uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de sequências que consiste nas SEQ ID NOS: 259-301.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que o anti- corpo monoclonal compreende uma CDR3 de cadeia pesada que compre- ende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas " 15 SEQ ID NOS: 388-430 e uma CDR3 de cadeia Ieve que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo de sequências que consiste " nas SEQ ID NOs: 259-301.

32. Anticorpo monoclonal completamente humano isolado para o domínio Kunitz 2 do inibidor da via do fator tecidual humano. 20

33. Composição farmacêutica, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal como definido na reivindi- cação 32 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

34. Método para tratar deficiências ou defeitos genéticos e ad- quiridos na coagulação, que compreende administrar uma quantidade tera- 25 peuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindi- cação 33 a um paciente.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, que compreende, adicionalmente, administrar fator Vll, fator VIII ou fator lX.