BRPI0917571A2

BRPI0917571A2 - formulação farmacêutica, e, uso da mesma, e de hgf ou igf-1

Info

Publication number: BRPI0917571A2
Application number: BRPI0917571-7A
Authority: BR
Inventors: Bernardo Nadal GINARD
Original assignee: Coretherapix Slu
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-05
Publication date: 2020-08-11
Also published as: US20120195939A1; MX2011001261A; CA2732785C; WO2010015665A3; ES2677005T3; WO2010015665A2; AU2009279086A1; US8846099B2; CL2011000244A1; US20130189321A1; GB0814302D0; AU2009279086B2; KR101639827B1; EP2323626A2; KR20110051212A; CA2732785A1; BRPI0917571B1; EP2323626B1; JP5623400B2; JP2011529946A

Abstract

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DA MESMA, E DE HGF OU IGF-1 A presente invenção diz respeito a formulações farmacêuticas adequadas para alvejar tecido e/ou órgão(s) particular com um ingrediente ativo formulado, por exemplo, quando administrado a montante do órgão ou tecido alvo, e ao uso das mesmas no tratamento, métodos de tratamento que administram as mesmas e métodos de preparar as formulações. As formulações farmacêuticas da invenção são para administração parenteral a um tecido alvo e compreendem partículas contendo um ingrediente ativo e um excipiente biodegradável, em que 90 % ou mais das partículas têm um diâmetro entre 10 e 20 mícrons e a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior que 50 mícrons e menor que 5 mícrons, de maneira tal que onde a formulação é administrada a montante do tecido alvo a capacidade do ativo de passar através do tecido alvo e passar na circulação sanguínea é restrita.

Description

- “FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DA MESMA, E DE HGF OU IGF-1” Campo Da Invenção A presente descrição diz respeito a formulações farmacêuticas — adequadas para alvejar tecido e/ou órgão(s) particular com um ingrediente ativo formulado, por exemplo, quando administrada a montante do órgão ou tecido alvo. A descrição também diz respeito ao uso das mesmas no tratamento, métodos de tratamento que administram as mesmas e métodos de preparar as formulações.

Em particular, diferentes fatores de crescimento e citocinas são empregados para estimular a capacidade regenerativa intrínseca de tecidos sólidos ativando sua população de célula tronco residente usando um dispositivo, tal como um catéter para a distribuição localizada dos compostos ativos ao tecido alvo.

15" Fundamentos Da Invenção À maioria dos medicamentos/produtos farmacêuticos é administrada sistemicamente, por exemplo, oral, intravenosamente, por vacina, intramuscularmente ou similares. Exceções notáveis são stents revestidos com ingredientes ativos, certas formulações respiratórias distribuídas diretamente nos pulmões, certas radioterapias que são direcionadas às áreas alvo e certos tratamentos dermatológicos, oftalmológicos e otológicos que são administrados topicamente.

Contudo, quando apropriado, pode ser vantajoso ser capaz de distribuir o produto farmacêutico principalmente a um tecido ou órgão doente, em virtude disto reduzir a dose requerida e também minimizar efeitos colaterais. Uma abordagem como esta pode ser particularmente vantajosa para duas áreas principais da medicina: a) a administração de fatores de crescimento e citocinas capazes de ativar o crescimento e diferenciação de células tronco residentes em um tecido particular. Em virtude da potente atividade biológica destas moléculas, pode ser desejável limitar sua ação no tecido pretendido, com transmissão mínima ou nenhuma ao resto do corpo; b) - a distribuição de agentes quimioterapêuticos de câncer pelo fato de se o tecido canceroso puder ser alvejado especificamente então ele pode permitir a administração de doses maiores às células alvejadas, minimizando ao mesmo tempo os terríveis efeitos colaterais tóxicos dos mesmos, pelo menos a um ponto significativo. Em situações mais agudas, tais como em ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais melhores tratamentos podem ser possíveis, particularmente os direcionados a regenerar o tecido danificado, se os órgãos afetados puderem ser especificamente alvejados. Em situações crônicas, tais como mal de Parkinson, diabetes, ou fibrose pulmonar, administração local de agentes capazes de reconstituir o tipo(s) de célula deficiente têm o potencial de melhorar a prognose da doença.

Entretanto, a distribuição reprodutível de ingredientes ativos ao tecido alvo ou um órgão alvo de uma maneira terapeuticamente eficaz é muito influenciada pelos componentes (incluindo excipientes) empregados, suas características físicas, a dose e o modo de distribuição.

Breve Descrição Dos Desenhos Figura 1 mostra distribuição e caracterização de células cardíacas c-kit** no coração de porco adulto. Figura 2 mostra imagens de microscopia de luz que mostram várias células cardíacas de porco expandidas Figura 3 mostra manchamento H&E de corações de porco tratados com GF Figura 4 mostra evidência da ativação de CSCs endógeno Figura 5 mostra bandas de regeneração de células pequenas, recém formadas Figura 6 mostra várias imagens de tecido recém formado |

Figura 7 mostram uma imagem de microscópio óptico de partículas PLGA com IGF-I preparado como para o exemplo 1.

- Figura 8 mostra uma micrografia eletrônica de partículas PLGA com IGF-I preparado como para o exemplo 1. Figura 9 mostra seções de coração de porco.

Figura 10 mostra seções de miocárdio de porco depois da administração de microesferas de poliestireno ou PLGA e microesferas de fator de crescimento.

Figura 11 mostra seções de coração de porco em que células tronco cardíacas endógenas são salientadas.

Figura 12 mostra imagens histológicas de músculo quadríceps de controle e danificado.

Figura 13A compara o efeito no número de miócitos cardíacos regenerados em porcos pós-AMI tratados com uma combinação de dois tipos demicroesferas Figura 13B mostra a fração de ejeção do ventrículo esquerdo antes, imediatamente depois e 4 semanas pós-AMI conforme determinado pela ecocardiografia dos portos tratados com diferentes combinações de microesferas.

A presente descrição fornece uma formulação farmacêutica para administração parenteral, especialmente intra-arterial, a um tecido alvo compreendendo partículas contendo um ingrediente ativo e um excipiente de polímero biodegradável, em que 30 % ou mais das partículas têm um diâmetro de 25 mícrons ou menos e a formulação é substancialmente livre de — partículas com um diâmetro maior que 50 mícrons, de maneira tal que onde a formulação é administrada a montante do tecido alvo a capacidade do ingrediente ativo de passar através do tecido alvo e passar na circulação sanguínea é restrita. Isto é, o ingrediente ativo é retido no tecido alvo, enquanto que sua capacidade de passar através do tecido alvo e passar na | circulação sanguínea é severamente restrita ou abolida. Assim, em um aspecto particular da invenção uma formulação farmacêutica para administração “ parenteral a um tecido cardíaco é fornecida, a dita composição farmacêutica compreendendo partículas contendo um ingrediente ativo e um excipiente ' 5 — biodegradável, em que 90 % ou mais das partículas têm um diâmetro entre 10 e 20 mícrons e a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior que 50 mícrons e menor que 5 mícrons, de maneira tal que onde a formulação é administrada a montante do tecido alvo a capacidade do : ativo de passar através do tecido alvo e passar na circulação sanguínea é restrita. Em uma modalidade pelo menos 90 %, das partículas da invenção farmacêutica têm um diâmetro que é entre 15 e 20 mícrons.

Em um aspecto da invenção uma formulação farmacêutica para administração parenteral, por exemplo, intra-arterial a um tecido cardíaco é fornecida, a dita composição farmacêutica compreendendo partículas contendo um ingrediente ativo, selecionadas do grupo que consiste em HGF e IGF-I, e um excipiente biodegradável, em que 90 % ou mais das partículas têm um diâmetro entre 10 e 20 mícrons e a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior que 50 mícrons e menor que 5 mícrons, de maneira tal que onde a formulação é administrada a —montante do tecido cardíaco a capacidade do ativo de passar através do tecido cardíaco e passar na circulação sanguínea é restrita.

Embora não se pretenda ficar preso à teoria acredita-se que formulações da presente descrição, quando administradas no sangue arterial a montante do tecido alvo ou órgão, são realizada n o tecido alvo ou órgão pela — circulação e devido ao tamanho da partícula e disposição da distribuição, em outras palavras são aprisionadas ou capturadas nos capilares no tecido ou órgão, que têm cerca de 5-10 um de diâmetro. Partículas que se alojam nos capilares e que bloqueiam o fluxo sanguíneo geralmente não são desejáveis, mas o número de capilares afetados pela formulação da descrição é | relativamente pequeno, particularmente, uma vez que a formulação permite que doses terapêuticas muito baixas sejam empregadas. Além disso, o - excipiente biodegradável funde, dissolve, degrada ou de alguma maneira dissocia-se do ativo e assim, finalmente, o “bloqueio” é removido. Assim o 5 — movimento da partícula é restrito/retardado alojando em capilares, um processo reversível que volta os capilares à condição natural depois de um curto período. Retardar o movimento da partícula por um curto período permite que o ativo seja mantido na vicinidade do alvo por uma quantidade apropriada de tempo para facilitar a ação local ou absorção do ativo no espaço —extravascular do tecido.

A formulação é designada, de maneira tal que a maioria, se não todo, o ativo seja liberado da partícula, embora imobilizado no leito do tecido alvo vascular. Uma vez que a carga do ativo é liberada a partícula é designada para ser degradada e seus materiais constituintes liberados na circulação geral a ser tanto metabolizada quanto eliminada por meio do fígado e/ou rim.

A presente descrição fornece uma formulação farmacêutica para administração parenteral a um tecido alvo compreendendo partículas contendo um ingrediente ativo e um excipiente biodegradável, em que 30 % ou mais das partículas têm um diâmetro de 25 mícrons ou menos é a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior que 50 mícrons, de maneira tal que onde a formulação é administrada a montante do tecido alvo o ativo é retida no tecido alvo ou órgão por um período terapeuticamente eficaz.

Em particular, as formulações da presente descrição permitem que menores quantidades de ingredientes ativos sejam empregadas em virtude de a maioria do ativo ser retido no tecido alvo em vez de ser tomado na circulação sanguínea. Isto parece aumentar a janela terapêutica do ativo. Isto é, a faixa de dosagem sobre a qual o ingrediente é terapeuticamente ativo é | aumentada —permitinto que menores quantidades absolutas sejam administradas. A administração local de uma dose menor significa que efeitos - colaterais são prováveis de ser minimizados. Doses adequadas são, por exemplo, na faixa de 0,05 ug/Kg a cerca de 10 ug/Kg, tais como 0,1 ne/Kg a —cercade0,5 ug/Kg, em particular 0,15, 0,2, 0,25, 0,35, 0,4 ou 0,45pg/Keg.

A administração de doses inferiores localmente para efeito terapêutico é particularmente importante para moléculas potentes, por exemplo, fatores de crescimento, que são conhecidos por ter potencial para estimular oncogênese. Estes efeitos colaterais potencialmente nocivos limitam a utilidade de tais moléculas mesmo que nas circunstâncias certas elas produzam efeitos terapeuticamente benéficos.

As formulações da presente descrição não empregam microesferas compreendendo uma conta de poliestireno, sílica ou outras contas não biodegradáveis com ingrediente ativo anexado a elas, em virtude 15º do endurecimento de materiais elásticos isto é, materiais não biodegradáveis, tais como poliestireno e sílica podem causar dano aos capilares locais, e podem agir como corpos estranhos e produzir reações inflamatórias locais. Além do mais, tais contas não biodegradáveis devem eventualmente ganhar acesso à circulação sanguínea e podem então, por exemplo, acumular em tecido distante, tais como os pulmões e fígado, todos os quais são indesejáveis.

No geral, cada partícula compreenderá ativo e excipiente. Não pretende-se que a descrição da formulação refira-se às partículas discretas do ativo e partículas separadas do polímero biodegradável em simples mistura.

Substancialmente livre de partículas acima de 50 mícrons conforme empregado anteriormente se destina a referir às formulações que atendem aos critérios a ser administrados como uma formulação parenteral apresentada na US pharmacopeia e/ou European pharmacopeia.

Em uma modalidade substancialmente sem pode incluir |

: 7 - contendo menos que 5 % das ditas partículas, particularmente menos que 1 %, por exemplo, menos que 0,5 %, tais como menor que 0,1 %.

Em uma modalidade pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo —menos590%, pelomenos 95%, pelo menos 98 % tais como pelo menos 99 % das partículas têm um diâmetro de 25 mícrons ou menos.

Em uma modalidade o tamanho da partícula é na faixa de 6 a 25 mícrons, tais como 10 a 20 mícrons, particularmente 15 ou 20 mícrons, por exemplo, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % tais como pelo menos 99 % das partículas têm o tamanho relevante ou na dita faixa. | Assim, em uma modalidade da invenção pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % das partículas da composição | 15 farmacêutica têm um diâmetro entre 10 e 20 mícrons.

Em uma outra modalidade pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % das partículas da composição farmacêutica têm um diâmetro entre 15 e 20 mícrons.

Em uma modalidade a formulação não contém partículas — menores que ll mícron de diâmetro.

Em uma modalidade a formulação não contém partículas menores que 5 mícrons de diâmetro.

Em uma modalidade pelo menos 30 % das partículas com o ativo são retidas no tecido alvo depois da administração, por exemplo, pelo —menos 40%, pelomenos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, tais como pelo menos 80 % ou mais das partículas ativas são retidas.

Em uma modalidade a partícula ativa é retida no tecido alvo ou órgão por um período na faixa de 5 minutos a 24 horas, por exemplo, 30 minutos a 5 horas, tais como 1, 2, 3 ou 4 horas. O período que a formulação é retida no tecido ou órgão relevante depende principalmente do excipiente ou da combinação de excipientes empregados.

Assim, as propriedades requeridas % do excipiente in vivo são que: * ele é biocompatível (isto é, no geral não tóxico e adequado —paraadministraçãoa humanos e/ou animais), * em um tempo apropriado depois da administração ele contribui para manter a integridade da partícula suficientemente para que o movimento da partícula seja retardado, por exemplo, alojando em um capilar ou arteríola no tecido alvo ou órgão, e * ele é biodegradável (isto é, ele é capaz de ser processado ou metabolizado) pelo corpo para liberar o ativo e depois que o ativo foi liberado.

Assim, um excipiente de polímero biodegradável adequado para uso na presente descrição é um polímero ou copolímero que não tem um tempo de residência longo in vivo, isto é, não pode incluir entidades, tal como um poliestireno, polipropileno, polieteno de alta densidade e material com propriedades similares.

Polímeros biodegradáveis devem ser não tóxicos e decompostos em subunidades não tóxicas preferivelmente localmente, de maneira tal que a quantidade de fragmentos/restos circulantes do excipiente sejaminimizada.

Excipientes adequados podem ser encontrados na United States Pharmacopeia (USP) e incluem polímeros inorgânicos, bem como orgânicos, natural e feitos pelo homem.

Exemplos podem incluir polímeros, tais como ácido polilático, poliglicolídeo ou uma combinaçãos mesmos, a — saber ácido polilático co-glicólico, policaprolactona (que tem uma menor taxa de biodegradação que ácido polilático co-glicolítico), poliidroxibutirato ou combinações — destes. — Poliuretanos, —polissacarídeos, proteínas e poliaminoácidos, carboidratos, quitosana, heparina, ácido poli-hialurônico, etc também podem ser adequados.

O excipiente é, no geral, na forma de uma | partícula, uma esfera aproximada (microesfera) à qual o ativo pode ser anexado ou com a qual o ativo é associado ou incorporado. - Lipossomas são excipientes de polímeros não biodegradáveis no significado da presente descrição. Lipossomas são vesículas de uma —bicamada de fosfolipídeo no geral compreendendo colesterol. Para doenças, tal como infarto do miocárdio induzido por arterioesclerose. Níveis de colesterol são monitorados como um dos fatores de risco para a doença e assim pode ser aconselhável evitar administrar formulações contendo colesterol a tais pacientes. Além disso, pacientes com cirrose hepática podem ter lipídeos que metabilizam com mais dificuldade e gorduras dietéticas, assim a administração de lipossomas a tais pacientes pode não ser aconselhável.

Em uma modalidade o excipiente biodegradável não é um hidrogel (uma fase contínua de uma fase dispersa coloidal correspondente).

Assim, tanto a taxa de “liberação” do ativo quanto a taxa de “dissolução” da partícula pode ser alterada alterando o excipiente ou/e o método de ligação do ativo ao excipiente, por exemplo, o emprego de policaprolactona pode fornecer uma partícula que demora mais para dissolver ou desintegrar que uma partícula correspondente que emprega ácido polilático —co-glicolítico. Se o ativo for embebido no excipiente ele liberará mais lentamente que se ele estiver na superfície da partícula. Se na superfície e ligado por carga eletrostática ele será liberado mais rápido que se covalentemente ligado. Em uma modalidade o excipiente compreende ácido polilático co-glicolítico.

Em uma modalidade substancialmente todas as partículas, por exemplo, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % das partículas compreendem ácido polilático co-glicolítico.

Em uma modalidade o ácido polilático co-glicolítico é na razão 75:25 respectivamente. |

Em uma modalidade o excipiente compreende dois ou mais polímeros distintos, o termo polímero inclui copolímeros.

Em uma modalidade o excipiente pode incluir um polímero de acrilato, por exemplo, um polímero de metacrilato. 5 Em uma modalidade a partícula compreende alginato.

Em uma modalidade o excipiente compreende uma forma biodegradável de poliuretano.

Em uma modalidade o excipiente é na forma de uma microesfera.

Em uma modalidade a descrição emprega uma formulação de microesfera de álcool polivinílico.

Em uma modalidade as microesferas não são albumina.

Em uma modalidade o ativo(s) empregado é encapsulado em um revestimento biodegradável, por exemplo, selecionado da faixa de Eudragit.

Em uma modalidade uma ou mais moléculas ativas são embebidas na partícula.

Para os compostos ativos funcionarem, da forma descrita na presente descrição, eles precisam ser administrados na circulação como uma — micropartícula que por causa do seu tamanho, morfologia e composição viajará com o fluxo sanguíneo par alcançar seu tecido alvo.

No alvo, a partícula deve liberar sua carga ativa de uma maneira controlável.

Para atingir esta meta, uma vez que não carregada, a partícula deve ser degradada e seus constituintes tanto metabolizados quanto distribuídos na circulação sanguínea — paraser eliminados pelos sistemas de excreção normal do corpo.

Para atingir estas metas as micropartículas devem preencher as seguintes características: As micropartículas devem ser de tamanho e morfologia uniformes de maneira a garantir que elas alcancem e fiquem alojadas no nível | desejado do sistema circulatório. À uniformidade de tamanho e forma é mais bem controlada quando as partículas são esféricas. - À maioria dos leitos capilares permite livre passagem das partículas com um diâmetro de < 6 mícrons de diâmetro, as microesferas — destadescrição devem ter um diâmetro > 6 mícrons, e preferivelmente de —15 mícrons, Partículas na faixa de 20 mícrons de diâmetro ou maior alojam-se - nas arteríolas pré-capilares ou arteríolas e bloqueiam o fluxo sanguíneo de vários capilares de uma vez. Além do mais, elas podem criar infartos microscópicos. Assim, para a distribuição de terapias regenerativas o diâmetro mais adequado das microesferas é na faixa de 15 mícrons. Além do mais, entretanto, partículas tendo diâmetros de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25 são contemplados para uso de acordo com a presente invenção.

O tempo requerido para liberar o composto ativo uma vez que eles alcançaram seu alvo pode variar de minutos a dias e ainda semanas, dependendo do tipo de microesfera e do objetivo terapêutico. As microesferas devem ser feitas com um composto biodegradável e não tóxico.

A estabilidade da partícula e seu tempo de degradação dependerão da composição e tipo da microesfera. Pode ser designado distribuir sua carga antes que ele comece a degradar; alternativamente pode ser designado de maneira tal que a distribuição da sua carga ocorra a medida em que a partícula desintegra. À natureza do polímero usado como excipiente, seu tamanho, labilidade das ligações entre os monômeros e grau de reticulação, se presente, afetarão a taxa de liberação do ativo, bem como a estabilidade e degradabilidade da partícula.

Em todas as modalidades, as microesferas devem ser estáveis suficientemente em solução para que elas não quebrem substancialmente ou degradem durante sua administração na circulação e o tempo requerido para que elas alcancem o leito vascular alvo.

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Em uma modalidade adequada da descrição, cada partícula carregará um único tipo de composto ativo. Quando acredita-se que uma - mistura de compostos é benéfica para propósitos terapêuticos, uma mistura de micropartículas, cada uma carregada com um único tipo de composto, pode ' 5 ser administrada. Este projeto simplifica a produção dos compostos terapêuticos e oferece maior flexibilidade terapêutica, assim que : medicamentos individualizados sejam preparados rapidamente para atender as necessidades específicas individuais do paciente. Em uma modalidade uma partícula(s) empregada tem/têm somente um tipo de ativo molécula ligada a ela/elas.

Em uma modalidade uma partícula(s) empregada tem uma mistura, tais como duas, três ou quatro moléculas ativas ligadas a ela.

O composto ativo deve ser carregado na partícula na hora da sua formação e, por exemplo, ser disperso em toda a partícula.

O composto ativo pode ser encapsulado dentro da partícula onde o excipiente forma a concha da microesfera.

Em uma modalidade ativo(s) são ligados a uma partícula(s) por ligações covalentes, por exemplo, um polipeptídeo ou proteína é ligado a uma microesfera por meio de reticulação por tratamento com um aldeído, tais como formaldeído ou glutaldeído, por exemplo, emulsificando a microesfera (ou ingrediente das microesferas) na presença do ativo(s), um aldeído adequado e homogeneizando a mistura em condições adequadas para formar partículas do tamanho requerido. Alternativamente, o ativo pode ser ligado a um grupo carboxilato localizado na microesfera excipiente.

Em uma modalidade os ativos são ligados a uma partícula(s) por forças eletrostáticas (carga).

Em uma modalidade os ativos são ligados a uma partícula(s) por meio de um polieletrólito, tais como, por exemplo, compreendendo íons sódio, potássio, magnésio e ou cálcio com íons contadores de cloreto em | solução aquosa. Em uma modalidade os ativos são ligados à uma partícula(s) . entre camadas de polieletrólitos. O composto ativo pode ser carregado na superfície da partícula tanto por carga (forças eletrostáticas) quanto — covalentemente ligado. Em uma modalidade o ativo(s) é/são ligado à partícula por - carga eletrostática.

Em uma modalidade o ativo(s) é/são ligado à partícula por polieletrólitos, por exemplo, por meio de uma casca de polieletrólito que —cobrea partícula na qual o ativo anexa por carga.

O composto ativo pode formar uma única camada na superfície da partícula ou deve ser depositada em múltiplas camadas tanto contígua quanto separadas por camadas de polieletrólito.

O composto ativo pode ser ligado à partícula por meio de “ligantes” que, por um lado, ligam-se à matriz do excipiente e, por outro lado, ao composto ativo. Estas ligações devem ser tanto eletrostáticas quanto covalentes.

As micropartículas podem, por exemplo, ser estabilizadas por liofilização. Micropartícula também podem ser estáveis quando congeladas.

Em uma modalidade o excipiente é degradado rapidamente na faixa de minutos a horas, ou por um período maior, tais como semanas a meses.

Em uma modalidade a formulação é tal que uma vez na circulação um ou mais ativos é/são rapidamente liberado, por exemplo, no —períodona faixadela30 minutos a cerca de 1 a 12 horas.

Em uma modalidade a descrição diz respeito a uma população mista de partículas, isto é, partículas com diferentes taxas de “dissolução”, que podem ser usadas para fornecer uma formulação com liberação controlada ou pulsada.

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Assim, formulações da descrição podem compreender partículas com diferentes cinéticas de liberação e taxas de degradação.

. Em uma modalidade o ativo é liberado por um período de 1 a 24 horas.

Em uma modalidade o ativo é liberado por um período de 1 dia a 7 dias.

: Assim, em uma ou mais modalidades toda a formulação da descrição é metabolizada em 7 dias e administração.

Em uma modalidade, uma vez na circulação do indivíduo, o —ativo(s)é/são liberado muito lentamente, por um período de semanas a meses, por exemplo, 1 semana a 1, 2, ou 3 meses.

Em uma modalidade a população de partículas é bem caracterizada e, por exemplo, tem as mesmas características. Isto é, as propriedades físicas e/ou químicas de cada partícula caem em uma faixa definida estreita. | Em uma modalidade o tamanho das microesferas é monodisperso.

Assim, em uma modalidade as partículas da formulação têm tamanho da partícula médio com um pequeno desvio padrão, por exemplo, pelomenos 68% das partículas têm um tamanho +/-1 mícron da média, tais como 99 % das partículas têm um tamanho da partícula +/-1 mícron da média (por exemplo, 15 +/-1 mícrons). Além do mais, composições em que as partículas têm pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo —menos97%,oupelomenos 98 % das partículas em +/-1 mícron da média são contempladas pela presente invenção.

Em uma modalidade a formulação compreende uma população de partículas caracterizada em que as populações contêm pelo menos dois tipos distintos de partícula, por exemplo, as partículas distintas podem ter | diferentes ativos, revestimentos, tamanho da partícula ou uma combinação dos mesmos. : Em uma modalidade a descrição diz respeito a uma população de partículas mista compreendendo partículas de ativo em mistura com — partículas de um ou mais ativos distintos adicionais.

Parece que o tamanho da partícula e distribuição da . formulação influencia no perfil in vivo da formulação incluindo como a formulação é distribuída no tecido.

Parece que é insuficiente simplesmente ter um tamanho da partícula médio na faixa de 10 a 20 mícrons, em virtude disto permitir que algumas partículas tenham um tamanho da partícula muito maior e também um tamanho da partícula muito menor.

Esta variação pode causar problemas in vivo, por exemplo, em virtude de as partículas pequenas não serem retidas com o tecido relevante e as partículas maiores poderem danificar o tecido.

A quantidade de ativo:excipiente empregada pode ser na razão 1 %:99 % em peso, 5 %:95 % em peso, 10 %:90 % em peso, 20 %:80 % em peso, 30 %:70 % em peso, 40 %:60 % em peso, 50 %:50 % em peso, 60 %:40 % em peso, 70 %:30 % em peso, 80 %:20 % em peso ou 90 %: 10 % em peso, dependendo de qual perfil de liberação é requerido.

Se o ativo for requerido para ser liberado rapidamente ou imediatamente in vivo, uma maior razão de ativo para excipiente pode ser escolhida.

Em uma modalidade a microesfera empregada tem uma meia- vida de cerca de 16 horas.

Em uma modalidade a formulação é liofilizada.

Em uma outra modalidade a formulação é congelada.

As partículas da descrição não são magnéticas em um ponto apreciável.

O ingrediente ativo pode ser qualquer medicamento ou produto farmacêutico que pode ser administrado na forma de uma partícula de | acordo com a descrição.

Em uma modalidade 15 x 10º partículas (microesferas) são : administradas, tais como 14 x 106, 13 x 106, 12 x 106, 11 x 105, 10 x 106, 9 x 106, 8 x 106, 7 x 106, 6x 10º, 5 x 106, 4 x 106, 3 x 10º, 2 x 10º ou 1 x 10º — partículassão administradas.

Uma partícula conforme a aqui empregada pode compreender, . por exemplo, medicamento micronizado, entidades semi-sólidas ou hidratadas, tais como proteínas ou ativos biologicamente derivados formulados como partículas discretas desde que a partícula mantenha sua estrutura por um período suficiente para realizar a função requerida.

A descrição também se estende a partículas com um núcleo líquido desde que a integridade externa da partícula seja tal que possa exercer sua função in vivo.

A descrição não se estende a partículas com um núcleo de gás.

Microesferas podem ser fabricadas emulsificando uma solução de polímero, seguido por evaporação de solvente.

Em outros exemplos, monômeros são emulsificados seguido por polimerização térmica ou por UV.

Alternativamente, um polímero fundido é emulsificado e sucessivamente resfriado para solidificar as gotículas.

Uma redução do tamanho da emulsão pode ser obtida homogeneizando ou sonicando a massa.

As microesferas podem ser coletadas filtrando e/ou centrifugando a mistura de reação.

Microesferas e microcápsulas biodegradáveis de biopolímeros para a liberação controlada e distribuição alvejada de diferentes compostos farmacêuticos e macromoléculas terapêuticas são conhecidas há muito tempo de inúmeras formas, particularmente as de diâmetros relativamente grandes — descritas na presente descrição (ver D.

D.

Lewis “Biodegradables polymer and drug delivery systems” M.

Chasin e R.

Langer, editors (Marcel Dekker, New York, 1990); J.P.

McGee et al, J.

Control.

Release 34:77, 1995). Microesferas e microcápsulas são rotineiramente produzidas por métodos mecânicos-físicos, tais como aspersão constituem monômeros | em microgotículas do tamanho seguido tanto por uma etapa de secagem quanto de polimerização. Tais micropartículas também podem ser formadas - por meio de emulsificação seguido por remoção do solvente emulsificante (B. Miksa et al., Colloid Polim. Sci. 273: 47, 1995; G. Crotts et al., J. Control. —Release35:91, 1995). O desafio principal destes métodos é a produção de uma população de partículas monodispersa na forma e tamanho. Isto, por ' exemplo, pode ser alcançado empregando uma técnica de fluxo que foca em que um nebulizador capilar é usado para formar microgotículas do tamanho apropriado. No processo dos “componentes são submergidos em uma —solução/solvente de coleta que serve para dissolver/suspender os componentes da micropartícula, seguido por evaporação do solvente para fornecer micropartículas solidificadas.

Este processo pode requerer que todos os componentes da micropartícula sejam combinados em uma única mistura (o composto focado) — da qual são geradas as microgotículas que formarão as micropartículas. Uma vez que muitos dos polímeros usados para distribuição do medicamento são hidrofóbicos, embora a maioria das macromoléculas terapêuticas, e particularmente proteínas, sejam hidrofílicos, a mistura requer emulsificação para garantir que uma composição homogênea seja obtida antes que as —micropartículas sejam formadas. Alternativamente, partículas podem ser preparadas, por exemplo, aspirando uma solução de ativo em microesferas em uma corrente de convecção, de um bico com uma carga elétrica de rede para uma placa ou entidade com uma contra-carga, em um arranjo tipo anodo/catodo.

Em uma modalidade partículas empregadas têm uma carga elétrica de rede, por exemplo, uma carga positiva ou carga negativa. Isto pode, por exemplo, ajudar para que o movimento da partícula seja retardado no tecido ou órgão alvo. Esta carga de rede pode ser equilibrada na formulação para administração por esferas de contra-íon (por exemplo, sem | ativo) de uma pequena dimensão, por exemplo, menor que 5 mícrons, que não são retidas no tecido alvo depois da administração.

+ Em uma modalidade o ingrediente ativo é uma molécula biológica ou derivado desta, por exemplo, uma proteína, tais como um anticorpo ou um fator de crescimento, uma citocina ou combinação de entidades.

' Em particular as formulações da descrição são particularmente usadas para alvejar/ativar células tronco residentes encontradas no tecido relevante.

Em uma modalidade preferida a descrição é usada para ativar as células tronco residentes, progenitoras e/ou precursoras de um tecido ou órgão particular para estimular a regeneração do dito tecido ou órgão.

Em uma modalidade a descrição diz respeito a administração localizada de ligantes para os receptores expressos pelas células tronco presentes no tecido pós-natal para iniciação da regeneração do mesmo. O ligante pode, por exemplo, ser um hormônio de crescimento da forma aqui descrita, Em uma modalidade os ligantes são administrados para ativar os receptores presentes na maioria das células tronco não diferenciadas presentes em cada tecido alvo. Estas células expressam os então chamados “genes de multipotência”, tais como Oct 4, Sox2, Nanog, etc. e eles têm uma potente capacidade regenerativa (daqui em diante referido como células tronco que expressam Oct4).

Em uma modalidade o ligante é administrado ao coração para minimizar e/ou regenerar o dano ao tecido, por exemplo, causado por infarto do miocárdio.

Quando uma artéria é obstruída o efeito principal é uma perda do tecido à jusante da obstrução. A consequência específica da obstrução de uma artéria coronária é um infarto do miocárdio (MI) que resulta na perda | irreversível de uma porção do músculo cardíaco, Esta perda resulta em uma diminuição da capacidade contrátil do miocárdio e a capacidade de bombear . do coração que, quando significativamente suficiente, limita sua capacidade de fornecer o resultado cardíaco apropriado e produz uma limitação séria e — progressiva da capacidade da pessoa (revisado em Nadal-Ginard et al., Cire.

Res. 2003; 92:139). Nos USA e na EU somente mais de 1,5 milhões de MIs º são tratados a cada ano e existem mais de 11 milhões de sobreviventes de MI (American Heart Association, 2007; British Heart Association, 2007). Destes, mais de 30 % isto é, durante o primeiro ano pós infarto.

A sobrevivência pós- MI mede o tamanho do infarto (% de massa muscular perdida) devido ao evento isquêmico.

Quando a perda afeta 40-45 % da massa ventricular esquerda ela produz um choque cardiogênico irreversível que é uniformemente letal (Page et al., 1971. N.

Engl.

J.

Med. 285; 133). Esta perda miocardial segmentar produz uma reorganização do miocárdio de memória com maior morte celular por apoptose, hipertrofia dos miócitos sobreviventes, maior fibrose do tecido e dilatação da câmara ventricular (Pfeffer, M.A. & Braunwald, E,., 1990, Circulation 81:1161). Esta reorganização, conhecida como “remodelamento”, em virtude de seus efeitos negativos na contratilidade, frequentemente envolve em falência cardíaca (CF). Depois do primeiro episódio de CF pós-MI, a sobrevivência média é < 5 anos com uma mortalidade anual de —18 % (American Heart Association, 2000). A maioria ou todas as terapias para tratar perda de tecido parenquimal, devido à isquemia ou a outras causas são direcionadas a conservar ou melhorar a função do tecido sobrevivente.

No caso de um MI, —todasas terapias atualmente em uso para tratar as consequências da perda do músculo contrátil cardíaco são direcionadas a conservar ou melhorar a função contrátil do tecido sobrevivente e reduzir a perda continuada destes células musculares por apoptose ou por necrose (ver Anversa & Nadal-Ginard, 2002. Nature 415:240; Nadal-Ginard et al. 2003. Circ.

Res. 92: 139). Atualmente

| não há uma única terapia aprovada designada para regenerar ou substituir a perda dos miócitos no MI e, desta maneira, restaurar a função contrátil do . coração. Além do mais, todas as abordagens experimentais descritas até agora são direcionadas para melhorar o fluxo sanguíneo para área isquêmica/necróptica estimulando o aumento na rede capilar, mais frequentemente distribuindo direta ou indiretamente para os fatores de ' crescimento da área afetada, tal como fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tanto na forma de proteína quanto na forma de cDNA. Nem uma única terapia é direcionada às células tronco residentes no tecido para —estimulá-las a se multiplicar e diferenciar de maneira a regenerar junto a perda do parênquima e microcirculação por acidente vascular.

O objetivo das abordagens terapêuticas para o MI agudo é restaurar o fluxo sanguíneo do músculo danificado o mais rápido possível para prevenir ainda a perda do músculo. Estas terapias de reperfusão incluem ouso de agentes trombilíticos, angioplastia de balão ou cirurgia de desvio. Nos USA em 1998 > 500.000 angioplastias e um número similar de cirurgias de desvio foram realizadas. Estas terapias frequentemente têm êxito na restauração do fluxo sanguíneo para o músculo isquêmico, mas nenhuma delas é capaz de substituir uma única célula muscular já perdida na hora da intervenção. Se esta perda for substancial, a consequência a longo prazo é uma incapacidade de gerar o rendimento cardíaco requerido que inexoravelmente envolverá falência cardíaca terminal.

Até agora a única opção para eficazmente tratar falência cardíaca terminal é transplante cardíaco com todos os problemas médicos (terapia imunossupressora), logísticos e econômicos que ele implicara. Mesmo se estes problemas forem circunventados, a falta de doadores torna esta terapia disponível para >1 % dos pacientes em falência cardíaca.

As formulações da presente descrição permitem a administração das moléculas terapeuticamente ativas a ser administradas em | uma forma onde o tecido ou órgão, tal como o coração pode ser alvejado especificamente para regenerar tecido, por exemplo, danificado pela obstrução e uma artéria, estimulando as células tronco já presentes no tecido para regenerar.

Terapia de célula tronco para regeneração de tecido.

Recentemente algumas abordagens experimentais foram ' desenvolvidas como alternativas para o transplante de órgão que são alvejados para substituir algumas das células perdidas pelo órgão ou tecido de interesse.

Estes procedimentos foram modelados no sucesso de transplantes de medula óssea realizados por mais de meio século.

A capacidade de uma pequena população de células na medula óssea de gerar todos os tipos de célula sanguínea, quando transplantadas em um indivíduo imunologicamente competente, provado convincentemente que tecidos adultos continham “células tronco” capazes de gerar e regenerar um tecido ou um órgão todo.

Este avanço conceitual levou a desenvolvimentos de abordagens experimentais para reparar tecidos danificados usando diferentes tipos de células tronco isoladas do indivíduo a ser tratado (terapia de célula autóloga) ou isoladas de um indivíduo diferente do que vai recebê-las (terapia de célula heteróloga). Estas células são tanto isoladas em massa quanto primeiramente expandidas na cultura antes de ser transplantadas para produzir o reparo desejado do tecido afetado.

Estas abordagens de terapia celular têm vantagem das propriedades regenerativas naturais das células tronco para regeneração do tecido.

O termo “célula tronco” é usado aqui para identificar uma célula quetem as propriedades de auto-renovação (gerar mais células como elas mesmas), é clonogênica (pode ser expandida começando de uma única célula) e é pluripotente; isto é, pode produzir uma progênie que diferenciará em diferentes tipos de célula, frequentemente presente no tecido onde elas residem.

Isto é, as células originadas de uma célula tronco adquirirão | especializações celulares particulares características do tecido ou órgão do qual a célula tronco originada ou em que é transplantada (Stem cell: A Primer. . 2000, National Institutes of Health USA). O termo “pluripotente” refere-se a células que são capazes de i 5 — diferenciar em inúmeros tipos de célula diferentes. No contexto deste pedido i de patente o termo “tretrapotente” refere-se a uma célula que embora possa ' não ser totipotente (capaz de gerar um indivíduo todo), é capaz de gerar quatro tipos diferentes de célula, por exemplo, cardiomiócitos, células endotelial vascular e do músculo liso e fibroblastos do tecido conectivo.

O termo “célula progenitora” refere-se a um descendente de uma célula tronco que já foram cometidas a um caminho de diferenciação particular e, além do mais, tem um potencial de diferenciação mais restrito que a célula tronco. A célula progenitora tem uma maior capacidade de amplificação e, embora ela ainda não expresse marcadores de diferenciação, elatem a capacidade de criar uma progênie que é mais diferenciada que ela mesma. Por exemplo, o termo pode ser referir a uma célula não diferenciada ou a uma célula que foi diferenciada a uma extensão pequena de sua diferenciação final. Esta célula é capaz de proliferação e dar origem a mais células progenitoras, além de ter a capacidade de gerar um grande número de células mãe que podem, por sua vez, dar origem a células filha diferenciadas ou diferenciáveis. Em particular, o termo célula progenitora refere-se a uma célula mãe generalizada cujos descendentes (progênie) especializam, frequentemente em diferentes direções, por exemplo, adquirindo caracteres completamente individuais, como ocorre na diversificação progressiva de células e tecidos embriônicos. Uma célula progenitora é mais diferenciada que uma célula tronco verdadeira em virtude de alguma da multipotência já ter sido restrita da célula tronco da qual ela originou.

Da forma aqui usada, a menos que o contexto indique o contrário, célula tronco refere-se a células tronco, células progenitoras e/ou | células precursoras.

Diferenciação celular é um processo complexo tipicamente . ocorrendo por meio de muitas divisões celulares.

Uma célula diferenciada pode derivar de uma célula multipotente que em si é derivada de uma célula —multipotente, e assim em diante.

Embora cada uma destas células multipotentes possam ser consideradas células tronco, a faixa dos tipos de : célula uma pode dar origem para poder variar consideravelmente.

Algumas células diferenciadas também têm a capacidade de dar origem a células de maior potencial de desenvolvimento.

Tal capacidade pode ser natural ou pode ser induzida artificialmente mediante o tratamento com vários fatores, uma vez que recentemente foi demonstrado com os iESCs (células tronco embriônicas induzidas) (Takahashi et al., 2007.Cell 131:1-12). Uma “célula precursora” é um descendente da célula progenitora que diminuiu ainda o caminho de diferenciação e se diferenciou em um único tipo de célula mesmo que ainda não possa expressar nenhum marcador identificável para este tipo de célula.

A célula precursora é normalmente a que se submete a última volta de amplificação antes da aparência do tipo de feno diferenciado identificável.

Células tronco estão presentes na massa de célula interna do — blastócito, os sulcos genitais do embrião precoce, a placenta e na maioria dos tecidos dos animais adultos, incluindo o humano.

Ao contrário da célula tronco derivada da massa de célula interna do blastócito, no geral, as células tronco isolada de tecidos adultos são uma mistura de células tronco verdadeiras, progenitoras e precursoras junto com células no estágio mais — precoce de sua diferenciação final.

Células tronco adultas foram identificadas em praticamente todos os tecidos originados de cada uma destas três camadas de célula embriônica (endoderma, mesoderma e ectoderma), variando da medula óssea, sistema nervoso central e periférico, todos os tecidos conectivos, pele, intestino, fígado, coração, ouvido interno, etc. |

Parece que estas células tronco adultas têm capacidade regenerativa.

Surpreendentemente, a despeito da alta prevalência, severidade e altos custos econômicos da cardiopatia isquêmica em todos os países desenvolvidos, até recentemente não há nenhuma pesquisa de procedimentos i 5 — alvejados para a regeneração do miocárdio adulto.

Uma das razões para isto anormalmente foi que até muito recentemente o coração foi considerado um ' órgão terminalmente diferenciado sem nenhuma capacidade regenerativa intrínseca de suas células contráteis (MacLellan, W.

R. & Schneider, M.D. 2000, Annu Rev.

Physiol. 62:289; Reinlib.

L. e Field, L. 2000, Circulation 101: 182; Pasumarthi, K.R.S. e Field, LJ. 2002. Circ.

Res. 90:1044; MacLellan, W.R. 2001. J.

Mol.

Célula Cardiol. 34:87; Perin, E.C. et al 2003. Ciculation 107:935; ver Anversa, P. e Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415:240; Nadal-Ginard, B. et al 2003 Circ.

Res. 92:139). Este conceito foi baseado no fato experimentalmente bem documento que no coração adulto a vasta maioria dos cardiomiócitos são terminalmente diferenciados e sua capacidade de reintroduzir no ciclo da célula foi irreversivelmente bloqueada.

Assim, não há dúvida de que estes miócitos não são capazes de reproduzir para gerar novos miócitos.

Uma consequência do conceito que prevalece do miocárdio como um tecido sem potencial regenerativo foi que todas as então chamadas “terapias regenerativas” experimentais implementadas até agora foram baseadas na introdução no coração danificado de diferentes tipos de célula que são tanto miócitos fetais quanto acredita-se que têm algum potencial de diferenciar neste tipo de célula ou em capilares e microarteríolas de maneira a substituir para as células perdidas durante o infarto.

Desta maneira experimentos com animais foram realizados transplantando células precursoras do músculo esquelético fetal e adulto, miócitos cardíacos fetais e células tronco embriônicas tanto no seu estado não diferenciado quanto depois de seu compromisso com o caminho do cardiomiócito (Kocher et al., 2001.

Nature Med. 7: 430).

Com a exceção do precursor do músculo esquelético (que é . incapaz de converter a cardiócitos e é incapaz de se tornar eletricamente acoplado às células do miocárdio) (Menasche et al., 2001. Lancet 357: 279; C Guocetal 2007.5J Thoracic e Cardiovasc Surgery 134:1332) que pode ser autólogo, todos os outros tipos de célula listados são por necessidade de ' origem heteróloga e, além do mais, têm tanto que ser acompanhadas por terapia imunossupressora quanto o transplante é rapidamente eliminado pelo sistema imune. O fato é que nenhuma destas abordagens mostrou ser muito eficaz nos ensaios pré-clínicos e todas têm muitas armadilhas. Uma das características mais intrigantes de algumas das células tronco adulta é sua “plasticidade”. Esta propriedade refere-se ao fato de que quando certas células tronco são colocadas em um tecido diferente do que eles originam, eles podem adaptar a este novo ambiente e diferenciar nos tipos de célula característicos do tecido hospedeiro em vez do tecido doador. Embora a extensão e a natureza desta plasticidade para muitos tipos de célula ainda permaneça controverso (Wagers & Weissman, 2004.CeIll 116:636-648; Balsam et al., 2004 Nature 428, 668-673; Murray et al, 2004. Nature 428, 664-668; Chien, 2004. Nature 428, 607-608), foram gerados incontáveis — protocolos pré-clínicos e experimentos clínicos.

Entre as células tronco adultas descritas até agora, as da medula óssea foram as mais estudadas e as que mostraram um maior grau de “plasticidade” (Kocher et al, 2001. Nature Med. 7: 430). Também amplamente usadas foram as então chamadas “células tronco mesenquimais” — derivadas do tecido adiposo (Rangappa, S. et al 2003. Ann. Thorac Surg 75:7175).

A capacidade das células derivadas da medula óssea e tecido adiposo de repopular áreas danificadas de diferentes tecidos e órgãos, a facilidade relativa de seu isolamento, junto com o trabalho recente de Asahara et al (1999; Circ. Res.85: 221-228), mostrou ser vantajosa para os objetivos de terapia de célula para regenerar o músculo cardíaco em animais - experimentais (Orlic et al, 2001. Nature 410:701; Orlic et al, 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10344; Nadal-Ginard et al, 2003. Circ. Res. 92:139;) e no i 5 — humano (Tse et al., 2003. Lancet 361:47; Perin et al., 2003. Circulação 107:2294). Embora tenha sido questionado por alguns, (Balsam,L.B. et al. ' 2004. Nature 428: 668; Murry,C.E. et al. 2004. Nature 428: 664), é claro que as células tronco derivadas da medula óssea em certas condições são capazes de gerar cardiomiócitos, capilares e microarteríolas, particularmente quando —transplantadas na área limite de um infarto do miocárdio experimental. (Quaini, F., et al., 2002. New Engl. J. Med. 346:5; Bayes-Geis, A. et al., 2003. Cardiovasc. Res.56:404;; Bayes-Genis, A. et al., 2004. Eur. J. Heart Fail. 6:399; Thiele, H. et al., 2004. Transplantation 77:1902). Nenhuma informação similar é disponível dos inúmeros experimentos clínicos de terapia celular tanto com células tronco derivadas da medula óssea quanto de tecido adiposo em virtude de nenhum dado histopatológico ser disponível para avaliação. Uma desvantagem principal das técnicas usadas para terapia celular miocardial é a complexidade e ineficiência do procedimento de transplante de célula em si. Quando as células são transplantadas através da árvore arterial coronária, somente 3-5 % permanece no miocárdio, enquanto que o restante é espalhado em todo o corpo. Se as células forem injetadas diretamente no miocárdio, requer-se tanto uma toracotomia quanto o uso de instrumentação complexa e que consome tempo (Noga-type systems) de maneira a identificar a área alvo. Esta técnica requer operadores — especializados e somente é disponível em centros médicos especializados. Além do mais, as injeções intramiocardiais, tanto por via transendocardial (Noga) quanto transepicardial (cirúrgica) ainda distribui < 50 % das células ao tecido.

Sem exceção, todas as abordagens de terapia celular usadas até o presente momento para produzir regeneração miocardial pós-infarto do miocárdio tanto em animais experimentais quanto no humano foram s desenvolvidas ignorando completamente o fato de que o miocárdio tem uma capacidade regenerativa intrínseca representada por suas células tronco i 5 — residentes (Nadal-Ginard, B., at al., 2003. J.

Clin.

Invest. 111:1457; Beltrami et al, 2003. Célula 114:763-776; Torella, D., et al, 2004. Circ.

Res. 94:514; : Mendez-Ferrer, S. et al.,2006. Nature Clin.

Prac.

Cardiovasc.

Med. 3 Suppl 1:883; Torella et al, 2007. Célula.

Mol.

Life Sci. 64:661). Conforme indicado anteriormente, até recentemente o paradigma aceito considerou o coração de mamífero adulto como um órgão pós-mitóptico sem capacidade regenerativa.

Embora nos últimos anos recentes este conceito tenha começado a se desenvolver, todas as abordagens experimentais e clínicas para regeneração do miocárdio continuaram a ser baseadas no dogma antigo.

Por esta razão todos os protocolos cardíacos de regeneração foram baseados no transplante de célula de maneira a fomecer o miocárdio com células com potencial regenerativo.

Parece agora que quando formulações da presente descrição são administradas em condições apropriadas que a capacidade regenerativa intrínseca das “células tronco” residentes no tecido ou órgão (tais como o coração) podem ser estimuladas ou ativadas para regenerar o tecido ou órgão.

Assim, em um aspecto a descrição fornece um método para a regeneração de tecidos sólidos em mamíferos vivos, incluindo humanos, que inclui a distribuição local de ligantes para os receptores expressos pelas células tronco presentes no tecido pós-natal a ser regenerado.

Estas são células que quando estimuladas fisiológica ou farmacologicamente se multiplicam in situ e se diferenciam nas células parenquimais características do tecido ou órgão que as abrigam.

A formação de novo cardiomiócito foi detectada tanto no coração normal quanto em condições patológicas, tais como MI e falência cardíaca (Beltrami, A. P. et al., 2001. New Engl. J. Med. 344:1750; Urbanek, K.. et al, 2003. Proc. Netl. Acad. Sci, USA, 100: 10440; Nadal-Ginard, B. et - al., 2003. J. Clin. Invest. 111:1457; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139). Interessantemente, estes novos miócitos são significativamente mais — abundantes na zona limite de MIs onde eles são uma ordem de magnitude i mais abundante que no miocárdio de idade atendida por indivíduos saudáveis. S Estas observações sugerem que o miocárdio humano adulto tem a capacidade de responder a aumentos agudo e crônico na morte celular com um processo regenerativo abortivo que tenta substituir os miócitos mortos (Anversa, P. & —Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415: 240; Anvrsa, P. e Nadal-Ginard, B. 2002. New Engl. J. Med. 346:1410; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ, Res.

92:139).

Células tronco cardíacas adultas (CSCs) foram primeiramente descritas em 2003 (Beltrami et al. 2003. Cell 114:763-776) e confirmada por vários autores na mesma espécie e outras (ver Torella, D., et al., 2004. Circ. Res. 94:514; Mendez-Ferrer, S. et al., 2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1:883; Torella et al., 2007. Cell. Mol. Life Sci. 64:661). Estes CSCs são auto-renováveis, clonogênicos e multipotentes em virtude de eles darem origem a cardiomiócitos, células endoteliais e vasculares do músculo liso, bem como a fibroblastos do tecido conectivo. Eles foram identificados pela expressão dos marcadores de membrana associado a células tronco, tais como c-kit, o receptor para SCF, Sea I, MDR- e IsI-I. Agora é evidente que os novos miócitos formados no coração adulto são derivados do CSCs residentes no miocárdio. Estes CSCs, quando injetados na borda de um infarto, têm a capacidade de regenerar as células contráteis e a micro vasculatura perdida como uma consequência de um MI massivo (Beltrami, et al, 2003. Cell: 114:763-776; Laugwitz, et al. 2005; Mendez-Ferrer et al., Torella et al., 2006; Torella et al., 2007). No coração de um indivíduo saudável, quase todos os CSCs estão em um estado de repouso (Go) ou giram muito lentamente durante a expectativa de vida do organismo. Em qualquer dado momento, somente uma . fração muito pequena destas células é ativa, se submetendo a replicação e diferenciação suficiente para substituir as células que por desgaste e — dilaceração. Ao contrário, uma grande fração dos CSCs —algumas vezes a maioria — é ativada em resposta a um estresse fisiológico ou patológico. No : geral, há uma correlação direta entre a magnitude do estresse e o número de CSCs que ficam ativos em resposta. Este número de CSCs ativadas também está, por sua vez, diretamente correlacionado ao número de novas células —miocardiais geradas. Esta resposta, que ocorre de camundongo para humano (Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92:139), revela a existência de um caminho bioquímico acionado pelo estresse que resulta na ativação do CSCs. A comunicação entre as células tronco residentes e seu ambiente, pelo menos no miocárdio, é regulada por uma volta de realimentação entre os cardiomiócitos, que percebe as mudanças na tensão da parede produzidas por maior demanda fisiológica ou patológica no rendimento cardíaco, e as células tronco responsáveis por produzir um aumento na massa muscular por meio da geração de novas células contráteis e microcirculação para nutri-las. Os miócitos têm uma resposta estereotípica ao estresse independentemente se ele é fisiológico ou patológico (Ellison et al.,

2007. J. Biol. Chem. 282: 11397-11409). Esta resposta consiste em rapidamente ativar a expressão e secreção de uma grande bateria de fatores de crescimento e citocinas, tais como HGF (fator de crescimento de hepatócito), IGF-I (fator de crescimento tipo insulina 1), PDGF-B (fator de crescimento derivado de plaqueta à), uma família de FGFs (fator de crescimento de fibroblasto), SDF-I (fator derivado de célula estromal 1), VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), eritropoietina (EPO), fator de crescimento epidérmico (EGF), ativina A e TGF B (fator de crescimento de transformação B); WINT3A e neurogeulina entre outros. Esta resposta secretória, além de estimular a hipertrofia dos miócitos em si por meio de uma volta auto/parácrina, também dispara a ativação de CSCs na sua vicinidade em . virtude de estas células expressarem receptores para estes fatores secretados por miócito e respondem a eles.

Esta resposta ativa caminhos genéticos à — jusantedo receptor que são responsáveis para a sobrevivência, multiplicação e ] diferenciação da célula.

Além do mais, a ativação destes receptores também , ativa uma volta de realimentação nos CSCs em si que estimula a produção do respectivo ligante pelos CSCs, colocando assim no lugar uma resposta auto- prolongada que, em resposta a um único estímulo, pode permanecer ativa por várias semanas ou até que a maior massa produzida restaure a tensão da parede do miocárdio a níveis normais.

Além do mais, o CSCs responde a um estímulo parácrino com uma resposta auto/parácrina que permite a manutenção de uma resposta prolongada a um estímulo de vida curta.

Assim, a homeostase celular cardíaca normal é mantida por meio de uma retroalimentação contínua entre miócitos e CSCs para produzir e manter amassa muscular contrátil apropriada requerida para gerar o rendimento cardíaco sanguíneo necessário.

Os miócitos, que são incapazes de se dividir, dependem dos CSCs para manter ou aumentar seu número de célula e a densidade capilar para garantir seu abastecimento de oxigênio e nutriente.

Os CSCs, por outro lado, dependem e respondem aos sinais bioquímicos produzidos por seus miócitos circundantes para regular seu estado de repouso em função do ativado.

Além das células tronco específicas do tecido descritas anteriormente, recentemente observou-se que o miocárdio de mamíferos, incluindo o humano, bem como a maioria dos outros tecidos, contém uma pequena população de células não muito diferenciadas que têm muitas similaridades com as células tronco embriônicas (ESCs) que há muito tempo sabe-se que são multipotentes; isto é, uma única célula é capaz, quando colocada no ambiente apropriado, de gerar um organismo inteiro idêntico ao que ele originou. A principal característica destas células é sua expressão de uma bateria de então chamados “genes de multipotência”, tais como Oct4, s Sox2, Nanog, etc (ver pedido de patente provisório US número de série 61/127.067) que confere multipotência a estas células, de maneira tal que, —independentemente do seu tecido de origem eles parecem ser capazes de dar origem à maioria, se não todos, os tipos de célula do corpo. Em particular, ' células que expressam Oct4 isoladas do coração adulto são capazes de dar origem a músculo esquelético, neurônios, coração, fígado, etc. Sua capacidade regenerativa parece mais robusta e mais ampla que a das células tronco — específicas do tecido.

Acredita-se que as células que expressam Oct4 são a origem da maioria, se não de todas, as células tronco específicas do tecido de todo órgão e que seu estímulo é a fonte principal da capacidade regenerativa de todo tecido individual. Além do mais, o estímulo destas células é um alvo primário para as abordagens terapêuticas aqui descritas.

Independentemente de sua capacidade e/ou eficiência para gerar células do miocárdio, quando um grande número de células tronco é introduzido em um tecido, independente de seu tecido de origem, elas têm um efeito parácrino importante quando transplantadas no miocárdio e outros tecidos, conforme mostrado experimentalmente. A mistura complexa de fatores de crescimento e citocinas produzidos pelas células transplantadas tem um potente efeito antiapoptóptico sobre os cardiomiócitos e outras células na área de risco e também na ativação das células tronco endógenas que se multiplicam e diferenciam em células musculares e da micro vasculatura. Este efeito parácrino começa logo depois do transplante da célula e pode ser documentado in vitro.

A partir do trabalho realizado nos exemplos aqui parece que estimular as células tronco residentes de um tecido (incluindo o células que expressam Oct4), neste caso o miocárdio, os fatores de crescimento e citocinas produzidos pelos miócitos estressados e ao qual os CSCs respondam podem ser tão eficazes quanto ou mais que o transplante de célula para . acionar uma resposta regenerativa. Uma combinação de fator de crescimento tipo insulina 1 e fator de crescimento de hepatócito pode ser particularmente eficaz Em uma modalidade células tronco residentes são ativadas, por : exemplo, para estimular regeneração do tecido, aumentar a densidade muscular e/ou função celular de células alvo. Se as células alvo forem músculo cardíaco, então a maior função pode, por exemplo, ser melhor/maior função contrátil.

Se as células alvo forem células renais, em um paciente com rim em falência renal, então a maior função pode ser maior capacidade de gerar EPO.

Se as células alvo forem células pancreáticas, então a maior função pode ser maior capacidade de gerar insulina.

Parece que formulações da descrição são capazes de estimular/ativar células tronco residentes no “tecido maduro” evitando assim a necessidade de administrar terapia de “célula tronco” ao paciente, uma vez que as células tronco residentes são estimuladas a se submeter a mitose e crescimento.

O estímulo de células tronco residentes é distinto da angiogênese. Angiogênese é o processo de estimular o crescimento de capilares (que pode ser no tecido ou tumores) (ver Husnain, K.H. et al. 2004. J. Mol. Med. 82:539; Folkman, J., e D'Amore, PA. 1996. Cell 87:1153). Ao contrário, quando formulações da presente descrição que empregam ligantes apropriados são administradas a uma células tronco residente no tecido, tais como células pluripotentes, células progenitoras e/ou um células precursoras são ativadas para gerar células de tecido novas/adicionais, tais como células musculares.

Todas as abordagens regenerativas descritas até agora têm limitações severas tanto em virtude da natureza de seu alvo biológico, quanto . o agente regenerativo usado e/ou a via e modo de administração.

A vasta maioria das então chamadas terapias regenerativas foi direcionada para i 5 rTegenerara rede capilar do miocárdio isquêmico usando uma variedade de fatores biológicos, tais como fator de crescimento endotelial vascular : (VEGF), cuja regra principal é estimular o crescimento das células endoteliais sobreviventes no tecido danificado de maneira a expandir a rede capilar e melhorar o abastecimento de sangue (Isner, JM. e Losordo, D.W. 1999, Nature Medicine 5:491; Yamaguchi, J., et al, 2003. Circulation 107:1322; Henry, T.D., et al, 2003. Circulation 2003. 107:1359). Estas terapias nem tentam nem realizam a regeneração das células parenquimais que desenvolvem a função característica do tecido ou órgão; por exemplo, cardiomiócitos contráteis no coração, hepatócitos no fígado, células B que 15º produzem insulina no pâncreas, etc.

Na melhor das hipóteses, estas terapias tiveram efeitos modestos e nenhuma delas se tornou parte da prática médica padrão.

Por outro lado, todas as terapias regenerativas designadas para substituir as células do tecido ou órgão funcionais até agora foram baseadas no transplante de células que acredita-se serem capazes de impor as características das células que faltam no tecido alvo.

Estas abordagens ainda estão em experimentos clínicos.

Uma desvantagem principal para todas as abordagens regenerativas usadas são para distribuir o agente regenerativo ao tecido danificado e limitar seu espalhamento em todo o resto do corpo.

Isto é um problema sério mesmo quando os agentes regenerativos são administrados por meio da árvore arterial coronária do tecido a ser tratado.

Nos casos de terapia celular miocardial por administração coronária, somente uma fração muito pequena das células administradas é retida no coração, enquanto que a maioria (> 95 %) rapidamente entra na circulação sanguínea e é distribuída em todo o corpo.

Isto também ocorre quando os agentes regenerativos são diretamente injetados no miocárdio tanto trans-epicardialmente quanto trans- endocardialmente, uma vez que repetidamente foi demonstrado com a - administração de uma suspensão de célula. Além do mais, a administração trans-epicardial requer a exposição do coração por meio de uma toracotomia, enquanto que a administração trans-endocardial requer um procedimento sofisticado, que consome tempo e caro para mapear o endocárdio para ' identificar as regiões adequadas para injeção (um instrumento tipo Noga), um procedimento disponível em um número muito limitado de centros e a participação de um manipulador experiente. Em ambos os casos, na melhor das hipóteses 50 % do composto administrado é retido no tecido danificado, enquanto que o restante é espalhado tanto em toda a cavidade torácica quanto na circulação sanguínea. As formulações da descrição podem ser usadas em combinação com a distribuição de células tronco a um tecido alvo ou órgão e aumentam o número que é retido localmente em comparação a outros mecanismos de distribuição.

Entretanto, esta descrição descreve um método inédito de regenerar as células parenquimais (isto é, funcional, células “nobres”) de um tecido ou órgão que não é baseada nem na célula transplante nem no estímulo de crescimento das células endoteliais sobreviventes de maneira a melhorar o — abastecimento de sangue ao tecido ou órgão de interesse. Ao contrário, os métodos descritos aqui são baseados no estímulo in situ, isto é, no tecido, das células tronco residentes de tal tecido por meio de distribuição local de fatores de crescimento e/ou citocinas específicos que são capazes de estimular sua ativação, replicação e diferenciação para gerar as células parenquimais — perdidas, bem como a microvasculatura necessária para seu crescimento, sobrevivência e função. Isto é possível em virtude de a maioria, se não todos, os tecidos mamíferos adultos, incluindo tecido humano, conterem células tronco residentes que são capazes, quando adequadamente estimulados, de regenerar os tipos de célula que são específicos ao tecido ou órgão, bem como as células de suporte vascular e mesenquimal que os acompanham.

Em virtude de alguns dos agentes regenerativos que estimulam - as células tronco serem muito ativos e deverem estimular o crescimento e translocação de uma variedade de células eles interagem, entre eles células i 5 — neoplásticas latentes, com a aplicação clínica potencial de muitos destes fatores irão requerer a administração das menores doses terapêuticas de uma : maneira muito localizada de maneira a limitar o máximo possível a exposição às células que devem ser regeneradas.

Assim, quanto mais localizada a administração, menor as doses requeridas e menor o risco de efeito colateral indesejado devido ao estímulo de células auxiliares no mesmo órgão ou outros.

Mais especificamente, a descrição descreve uma nova abordagem para o uso de doses terapêuticas de diferentes fatores de crescimento administradas e distribuídas localmente, em vez de sistemicamente ou em todo tecido para produzir a regeneração de áreas específicas de um tecido sólido.

Em virtude de a distribuição do composto ativo ser localizado no tecido danificado, a dose terapêutica requerida é uma fração de minuto da qual pode ser necessário com outros métodos de distribuição adequados.

A formulação da descrição é capaz, entre outras aplicações, de regenerar o músculo cardíaco e sua microvasculatura depois de um infarto do miocárdio e/ou na falência cardíaca crônica.

Em uma modalidade a formulação é administrada na borda do tecido danificado, por exemplo, na borda ou em uma zona isquêmica.

Ligantes adequados para células tronco incluem fatores de crescimento, tais como os listados na tabela 1 —TABELA !I: Exemplos de ligantes de célula tronco adequados da invenção VEGEF (fator de crescimento endotelial vascular), eritropoietina (EPO),

TGF B (fator de crescimento de transformação G-CSF (Fator que estimula colônia de granulócito), GM-CSF (Fator que estimula colônia de macrófago-granulócito), Proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs, BMP -2, BMP-4 : : Neurotrófico, por exemplo, NGF (Fator de crescimento do nervo), neuroregulina, BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT -4 (neurotrofina-4) e - (neurotrofina -1), que é estruturalmente não relacionado a NGF, BDNF, NT-3 e NT 4 TPO (Trombopoietina, GDF-8 (Miostatina), ou S GDF9 (fator de diferenciação de crescimento-9).

Em uma modalidade o fator de crescimento(s) empregado é humano.

Em uma modalidade o fator de crescimento empregado é selecionado de HGF, IGF (tais como IGF-I e/ou IGF -2) e FGF, em particular —HGFelGF-. Estes fatores parecem ser particularmente eficazes no estímulo de células tronco residentes.

Combinações de fatores de crescimento também podem ser empregadas e, por exemplo, podem ser selecionados da lista identificada anteriormente, tais como HGF e IGF-I e opcionalmente VEGF.

Em uma modalidade a formulação para regenerar/ativar células tronco não consiste em VEGF como o único ativo, mas, por exemplo, pode compreender uma combinação de ativos inclui VEGF.

Contudo, a formulação é adequada para distribuição localizada de VEGF como fator de angiogênese.

Em uma modalidade a formulação de fator de crescimento é empregada em combinação com um fator de angiogênese, por exemplo, administrado concomitante ou sequencialmente pela mesma via ou uma via diferente.

Em uma modalidade a formulação compreende uma citocina, por exemplo, selecionada de IL-I, IL-2, IL-6, IL-IO, IL-17, IL-18 e/ou interferon.

Em uma modalidade a formulação compreende combinações de ativos, por exemplo, um fator de crescimento e uma citocina. Em formulações de combinação então a dose de cada ativo : pode, por exemplo, ser a mesma dose empregada quando o ativo é administrado sozinho. ! Os componentes empregados nas formulações e/ou métodos da ] descrição, especialmente ativos tipo biológicos podem ser derivados de - origem natural.

Em uma modalidade um ativo tipo biológico empregado é preparado por tecnologia de DNA recombinante.

Em uma modalidade o ativo ou ativos administrados podem ser fragmentos de peptídeo de uma molécula biológica, com o efeito terapêutico desejado.

Em uma ou mais modalidades as moléculas empregadas são mutantes de uma molécula biológica (por exemplo, um ligante de um receptor) com o efeito terapêutico desejado tendo a mesma afinidade, maior ou menor para a molécula biológica correspondente.

Em uma modalidade a substância(s)/ativo empregada é um aptômero (uma molécula de RNA pequena que se liga a um receptor em vez do ligante natural).

Em uma modalidade a substância/ativo empregada é um anticorpo que reconhece e se liga a um receptor alvo e, em particular, tem uma especificidade e/ou avidez adequada para o mesmo. Desejavelmente o anticorpo tem a atividade requerida para sobre-regular o receptor ou sobre- regular tanto produzindo ativação quanto bloqueando a mesma, se apropriado.

Em uma modalidade o ativo é um diaquino, que é um a molécula de anticorpo artificial que reconhece e se liga a dois dos receptores de interesse resultando tanto na ativação quanto no bloqueio de um e/ou do outro.

Em uma modalidade a substância/ativo empregada é uma molécula pequena com um peso molecular < 5.000 Daltons. Em uma modalidade um ou mais ativos empregados podem ser - de origem sintética. Para a formulação aqui descrita alvejar o órgão ou tecido — desejado então a formulação deve ser administrada a montante do órgão ou tecido. Isto deve ser introduzido na circulação, de maneira tal que o fluxo " sanguíneo carregue a formulação no tecido/órgão desejado.

A formulação pode ser introduzida a montante de um órgão, tal como o coração empregando um dispositivo adequado, tal como um —catéter. Outros órgãos principais podem ser alcançados desta maneira. Similarmente, embora seja raro, também é possível usar cateteres para ganhar acesso ao fígado.

Em outros exemplos a formulação pode ser introduzida por injeção intra-arterial estratégica ou por injeção venosa retrógrada e/ou canular antesdotecido alvo.

A formulação também pode ser administrada por infusão ou um dispositivo de distribuição acionado por bomba, tal como uma bomba de seringa, por exemplo, do tipo empregado na administração de heparina ou morfina ou agentes de contraste durante a caracterização, Uma vazão — adequada pode, por exemplo, ser 0,5 mL/min.

A formulação também deve ser administrada por meio dos então chamados cateteres de perfusão que permitem a diminuição da vazão do fluxo sanguíneo à jusante do sítio de injeção com um balão intra-arterial, mantendo ao mesmo tempo perfusão do tecido por meio de um segundo láúmem do catéter, Em uma modalidade particularmente adequada a formulação é administrada em uma artéria a montante do tecido alvo ou órgão.

Em uma modalidade um catéter é usado para distribuir a formulação da descrição na artéria abastecendo o tecido alvo ou órgão. Em particular, a formulação pode ser distribuída exclusivamente (principalmente ou substancialmente) à artéria segmentar que abastece a área do tecido ou - órgão. Em uma modalidade o catéter empregado é um catéter de balão Em uma modalidade o catéter carrega uma malha de filtro na : sua extremidade distal com um tamanho de poro suficientemente pequeno para prevenir ou impedir a liberação de agregados de micropartícula > 50, 25 ou 20 um, conforme requerido.

Em uma modalidade as células alvo são as células tronco residentes cardíacas no coração pós-natal.

Em uma modalidade a regeneração obtida inclui junto ou separadamente a regeneração de cardiomiócitos e estruturas vasculares compostas de capilares (células endoteliais) e/ou arteríolas (células do endotélioedomúsculo liso vascular).

Em uma modalidade a regeneração é induzida em qualquer momento depois de um infarto do miocárdio (MI) ser agudo ou crônico, por exemplo, 0,5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10,5, 11 até 24 horas depois do infarto agudo.

Em uma modalidade a regeneração é induzida em um indivíduo com doença cardíaca isquêmica, com ou sem um infarto do miocárdio, Em uma modalidade a regeneração é induzida nos corações de indivíduos que desenvolveram falência cardíaca (CF) tanto aguda quanto crônica Em uma modalidade a regeneração é induzida em indivíduos com cardiomiopatia isquêmica, infecciosa, degenerativa ou idiopática.

Em uma modalidade as células alvo são as células tronco residentes no pâncreas endócrino (células tronco das ilhotas de Langerhans).

Em uma modalidade a regeneração é induzida em um indivíduo com diabetes.

. Em uma modalidade as células alvo são as células tronco neurais do sistema nervoso central (CNS).

Em uma modalidade as células alvo tronco são as células tronco neurais da medula espinhal.

. Em uma modalidade a regeneração é induzida em um indivíduo com uma lesão na medula espinhal.

Em uma modalidade as células alvo são as células tronco da — substância negra do cérebro, por exemplo, em um indivíduo com mal de Parkinson.

Em uma modalidade a regeneração é induzida em um indivíduo com um acidente vascular cerebral (derrame).

Embora não se pretenda ficar preso à teoria, acredita-se que os ligantes empregados nas formulações da descrição são capazes de cruzas a barreira sanguínea do cérebro para tratar acidentes vasculares cerebrais e similares. Além do mais, no acidente vascular cerebral acredita-se que a barreira sanguínea do cérebro fica prejudicada e entidades químicas podem passar mais rapidamente através da barreira.

Em uma modalidade as células alvo são as células tronco do fígado e, por exemplo, a regeneração é induzida em um indivíduo com dano hepático, tal como cirrose.

Em uma modalidade as células alvo tronco são as células tronco dos pulmões e, por exemplo, a regeneração é induzida em um paciente —comdano pulmonar, por exemplo, enfisema.

Em uma modalidade as células alvo são as células tronco do músculo esquelético e, por exemplo, a regeneração é induzida em um indivíduo com um déficit do músculo esquelético particular, tais como osteoporose ou doença de Paget.

Em uma modalidade as células alvo são as células tronco do epitélio.

. Em uma modalidade as células alvo tronco são as células tronco dos rins.

i 5 Células alvo conforme empregado aqui referem-se às células que são estimuladas e que têm o potencial de fornecer a regeneração desejada. ' A formulação da descrição fornece parâmetros e materiais otimizados para garantir a dosagem exata e/ou reprodutível do ativo relevante ao tecido alvo ou órgão.

Em uma modalidade alternativa as formulações da descrição podem ser empregadas para tratar tumores sólidos, permitindo distribuição local do antineoplástico ao tecido tumoral, por exemplo, por injeção intratumoral. Ativos adequados para o tratamento de tumores incluem etoposídeo, ciclofosfamida, genisteina, cisplatina, andriamicina, vindesina, —mitoguazona, fiuorouracila e paclitaxil.

Em uma modalidade a formulação não é para o tratamento de câncer.

Em uma modalidade a invenção não é para administração diretamente em um tumor ou tecido.

Os métodos de acordo com a descrição podem empregar combinações de ativos administradas separadamente, por exemplo, concomitante ou sequencialmente, ou formuladas como uma formulação (um pote).

Formulações da descrição podem ser administradas como —soluções/suspensão líquidas, por exemplo, em um carreador isotônico, por exemplo, como uma solução tamponada, tais como solução de tampão de fosfato, salina ou glicose.

Formulações da descrição opcionalmente podem compreender um ou mais excipientes adicionais. Os excipientes devem ser adequados para administração a humanos e/ou animais.

Em uma modalidade a formulação compreende albumina em . solução, que pode, por exemplo, estabilizar as pequenas quantidades de ativo nas formulações, por exemplo, de 1% a 20 % p/vol de albumina, tal como — albumina sérica humana, pode ser suficiente para alcançar a estabilização i requerida.

: A descrição também se estende ao uso como uma formulação da forma aqui definida para o tratamento, particularmente para o tratamento de infarto do miocárdio; doença cardíaca isquêmica; falência cardíaca; —cardiomiopatia isquêmica, infecciosa, degenerativa ou idiopática, esclerose, cirrose, enfisema, diabetes e similares.

Em uma modalidade a descrição diz respeito a uma formulação da forma aqui descrita para uso no tratamento, particularmente para o tratamento de uma doença descrita anteriormente.

A descrição também se estende aos métodos de tratamento compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz e uma formulação aqui descrita a um paciente em necessidade deste, particularmente para o tratamento de uma doença descrita anteriormente.

A descrição também se estende ao uso de um ligante, por exemplo, da forma aqui descrita, para estimular uma célula tronco residente in vivo para ativar a célula.

A descrição também inclui usos de um fator de crescimento adequado para a fabricação de um medicamento para estimular células tronco residentes in vivo.

A descrição será agora ilustrada pela referência aos exemplos.

EXEMPLOS Introdução Infartos do miocárdio anteriores foram produzidos em porcos fêmeas por oclusão de balão temporária da artéria coronária descendente anterior distal do primeiro ramo septal. Este procedimento resultou em infartos apicais anteriores de tamanho moderado reprodutível. O potencial de - regeneração do miocárdio do fator de crescimento 1 tipo insulina combinado e fator de crescimento de hepatócito foi testado administrando-se localmente os fatores em doses diferentes no miocárdio do porco infartado. Animais i controle foram tratados com placebo.

. A viabilidade de produzir efeitos terapêuticos com administração local de quantidades minutas de agentes terapêuticos foi testada primeiramente por administração direta de uma solução contendo uma mistura de IGF-I e HGF humano recombinante no pós-MI agudo produzido em um modelo experimental com peito fechado por dilatação de balão na artéria coronária esquerda descendente anterior logo abaixo da emergência da primeira artéria septal em 23 porcos que foram comparados com 6 controles de placebo identicamente tratados.

Materiais e Métodos Os corações foram analisados em diferentes pontos de tempo após o infarto do miocárdio, variando de poucos dias a 1 mês. Os resultados mostraram um aumento drástico no número de Células Tronco e Progenitoras ativado na área isquêmica e suas fronteiras de porcos tratados com IGF-1 e —HGF humano. Regeneração notável do músculo foi vista na área isquêmica, que também continha arteríolas e vasos recém formados. A resposta regenerativa pareceu ser proporcional às doses de fatores de crescimento administradas. A partir desses dados preliminares, ativação terapêutica in situ de CSCs pode produzir formação do tecido do miocárdio inédita extensiva e — melhorar significativamente a função ventricular esquerda em corações de animal que são similares em tamanho e anatomia aos corações de humano. Isolamento de Células Cardíacas de Porco c-kit”** Amostras cardíacas múltiplas (-2g cada) foram obtidas de diferentes regiões cardíacas (átrio direito e esquerdo, ventrículo direito e esquerdo e ápice) de porcos brancos Yorkshire fêmeas (23+4 kg; n=3). algumas das amostras foram fixadas e embutidas em parafina para análise . histoquímica. Os outros pedaços foram enzimaticamente digeridos e suspensões de célula cardíaca pobre em cardiomiócito foram preparadas da — maneira anteriormente descrita com modificações (Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114:763). Resumidamente, tecido cardíaco cortado em pedaços foi ' digerido com 0,1 % de colagenase (Worthington Biochemicals), 0,1 % de Tripsinas (Sigma), 0,1 % de DNAse I em tampão de solução de sal equilibrada por Hank (HBSS) a 37 ºC e a fração de célula cardíaca pequena coletada através de centrifugação. Células pequenas cardíacas foram incubadas com CD117(c-kit) anti-chumano Ab (Miltentyi Biotechnology) e classificadas por classificador de célula por classificação de célula ativada por fluorescência (FACS; MoFlo (Dako Cytomation)) ou microimunoestferas ativadas magnéticas (MACS). Iodeto de propídio (PI; 2 ug/mL) foi adicionado antes de FACS excluir as células mortas.

As células cardíacas de porco c-kit”** foram analisadas por marcadores de célula hematopoiética, mesenquimal e endotelial usando um citômetro de fluxo FacsCalibur (Becton Dickinson, BD). Anticorpos usados foram CDA45 anti-porco (Serotec, Clon: MCA1447), CD34 anti-humano (BD, —clon 8G12), CD90 anti-humano, (BD, Clon:5E10, reatividade cruzada de porco) e CD166 anti-humano (BD, Clon: 3A6, reatividade cruzada de porco), CDIOS anti-humano (Caltag Laboratories, Clon: SN6, reatividade cruzada de porco) e CD133 anti-humano (Miltenyi Biotec, clon AC 133, reatividade cruzada de porco). Anticorpos anti-humanos específicos para PECAM, E- —caderina, CDI Ib, CD1I3, CDI4, CD29, CD31, CD33, CD36, CD38, CD44, CD49, CD62, CD71, CD73, CD106, foram adquiridos pela BD Biosciences. Controles isótipos respectivos (Pharmingen) foram usados como controles negativos para todos os procedimentos de FACS. Dados foram analisados usando o software CellQuest.

Cultura de Célula Cardíaca de c-kit"* de Porco, Clonagem, e Potencial de Diferenciação - Células c-kit”** foram plaqueadas por 7-10 dias a 2 x 10 células/mL em meio modificado MEM de Dulbecco/Fl2 de Ham i 5 (DMEM/F1I2) contendo 10 % de FBS, bFGF (10 ng/ml), insulina- transferrina-selenita (ITS), e EPO (2,5U). Após recuperação, algumas as : células foram movidas para um meio de formação modificado de cardioesfera (MCSFM): razão 1: 1 de DMEM/F12, bFGF (10 ng/mL), EGF (20 ng/mL), ITS, 2-B-mercapetanol (0,1 mM) e Meio Neural Basal suplementado com suplementos B27 e N2 (Gibco), para a geração de cardioesferas. Para testar clonogenicidade, células c-kit”** únicas foram semeadas individualmente nos poços de placas Terasaki de 96 poços resvestidos com gelatina por citometria de fluxo ou diluição serial. Células c-kit”** individuais cresceram em meio modificado DMEM/F12 por 1-3 semanas quando os clones foram identificados e expandidos. A clonogenicidade das células ckit* foi determinada por contagem do número de clones gerados em cada placa de 96 poços e expressa como uma porcentagem. Um total de 10 placas por região cardíaca foi analisado. Células clonogênicas e as cardioesferas foram transferidas para um meio de diferenciação cardiogênica específica (modificado de 42) para especificação de miócito, músculo macio vascular e célula endotelial.

O ensaio de migração de célula foi realizado usando uma câmara Boyden modificada de acordo com as instruções do fabricante (Chemicon). 200 ng/mL HGF ou 200 ng/mL IGF-1 foram na câmara inferior —de uma placa de 24 poços por 24 horas. Para ensaio de proliferação, pCSCs 2,5 x 10 foram plaqueados em pratos de 24 x 35 mm e foram privados de soro por 36 horas em 0 % de meio DMEM sérico/base F 12. 6 pratos agiram como controle de linha de base e foram suplementados com BrdU (1 ug/mL) sendo antes fixados e manchados 1 hora mais tarde. Então meio DMEM/Base F 12 suplementado com 3 % de FBS e 200 ng/mL HGF (n=6 pratos) ou 200 ng/mL IGF-1 (n=6 pratos) foi adicionado aos 12 pratos remanescentes. 6 pratos agiram como controles, sem nenhum fator de crescimento adicionado ao meio.

BrdU foi adicionado, | pg/mL a cada 6 horas.

As células foram fixadas i 5 após24horase incorporação de BrdU foi avaliada usando o estojo de sistema de detecção BrdU (Roche). Os núcleos foram contramanchados com a corante : de ligação de DNA, 4, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) a 1 ug/mL.

As células foram avaliadas usando microscopia de fluorescência (Nikon E1000M). 10 campos aleatórios a ampliação x 20 foram contados para cada — prato, e números expressos como uma porcentagem de células positivas BrdU com relação ao número total de células contadas.

Imunocitoquímica As células foram cultivadas nas lâminas de câmara de vidro (BD Falcon) por 2 dias, fixadas com 4 % de PFA por 20 minutos, e então manchadas.

Para manchamento intracelular, as células foram permeabilizadas usando 0,1 % de Triton X-100. As células foram incubadas com o anticorpo primário por toda a noite a 4 ºC, lavadas três vezes e então incubadas com um anticorpo secundário FITC ou Texas Red-conjugado por 1 hora a 37 ºC.

Então as células foram lavadas três vezes, e os núcleos foram —contramanchados com DAPI.

Fluorescência foi visualizada e imagens adquiridas com microscopia confocal (Zeiss LSMS10). Os anticorpos seguintes foram usados para manchamento de célula: Oct3/4, Nanog, IsI-I, c- kit, FIK-I, e Nlo2,5 (R&D Systems); Bmi-1, c-met e IGF-lr (Santa Cruz Biotechnology), telomerase (Abeam). As cardioesferas foram manchados por —c-kitapós24 horas de cultura em uma lâmina de câmara de vidro.

Após 4-6 dias em cultura para permitir crescimento e diferenciação de células da esfera, elas foram manchadas com anticorpos contra actina do músculo macio, actina a-sarcomérica (Sigma) e fator von Willebrand (DAKO). Todos os anticorpos secundários foram adquiridos pela Jackson Immunoresearch.

Análise de Western Blot Imunoblots para detectar os receptores IGF-1 (IGF-1R) e HGF . (c-met) foram realizados da maneira anteriormente descrita (Ellison et al.

2007. J. Biol. Chem. 282: 11397) usando lisados de proteína obtidos de i 5 — pCSCs c-kitpos submetidos a meio de privação de soro por 24 horas seguido por suplementação com 200 ng/mL IGF-1 ou 200 ng/ml HGF por 10-20 ' minutos. Os anticorpos seguintes foram usados em diluições sugeridas pelos fabricantes: rabbit polyclonal Abs IGF-1R, phosphor-IGFIR, Akt, phosphor- Akt,c-met (Cell Signalling), phosphor-c-met (Abeam), FAK, e phosphor-FAK. (Upstate). Histologia Após excisão atrial os corações foram divididos em 5 fatias coronais do ápice até a base com cortes perpendiculares ao eixo longitudinal. Amostras de miocárdio infartado, peri-infartado e distal foram obtidas de cada nível de cada porco. As amostras foram lavadas com PBS, fixadas em 10 % de formalina e parafina embutidas. Seções de 5 um foram preparadas em um micrótomo (Sakura) e montadas em lâminas de microscópio. As seções foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com procedimentos padrões (Ellison et al. 2007. J. Biol. Chem. 282: 11397). O diâmetro do —miócitofoimedido através do núcleo nas seções H&E (3 lâminas por animal) da região peri-infarto dos níveis C e D, em um microscópio de luz (Nikon E1000M) usando software Lucia G. Um total de 200 miócitos por seção foi analisado para cada porco. Para determinar fibrose do miocárdio, seções do miocárdio — violado foram manchadas com Sirius red da maneira anteriormente descrita (Lee, CG. et al., 2001. J. Exp. Med. 194:809). Seções seriais foram fixadas em 10 % de formalina em PBS por 20 minutos. Após lavagem em água destilada por 5 minutos, as seções foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos em 0,1 % de Fast Blue RR em tampão de Borato de magnésio a pH 9 (Sigma). Então as seções foram lavadas em água destilada antes de incubação à temperatura ambiente por 10 minutos em 0,1 % de Sirius red em . ácido pícrico saturado (Sigma). As seções foram lavadas adicionalmente em água destilada antes de eles serem desidratadas, limpas e montadas.

Neste — protocolo, tecido conectivo (principalmente colágeno) mancha vermelho e músculo mancha amarelo/laranja.

Avaliação semi-quantitativa da quantidade : de tecido conectivo do miocárdio foi realizada usando análise de imagem Lucia G a ampliação x 40. Colágeno percentual (área percentual de manchamento positivo) foi determinado em toda a zona de.

Um total de 3 —Jâminas foi avaliado por animal para cada nível, e uma média obtida.

Imunoisoquímica e Microscopia confocal Para identificar CSCs, seções de coração de porco transversas foram manchadas com anticorpos contra o antígeno de célula tronco, c-kit (rabbit polyclonal, Dako). CSCs c-kit”** foram identificados como linhagem- negativa (Lin), por manchamento negativo para marcadores de linhagens hematopoiéticas, neurais e músculo esquelético (21). Para quantificação de distribuição do miocárdio CSC nas diferentes regiões cardíacas de porcos controles, o número de células c-kit”* (lin"*) e cardiomiócitos foi contado para um total de 5 seções a ampliação x 63. A área de cada seção transversal —foientãomedida, eo número de CSCs e cardiomiócitos por área unitária foi determinado.

Os dados para o átrio foram agrupados, em virtude de algumas diferenças encontradas entre o número de CSCs c-kit”** no átrio esquerdo e direito.

O número de CSCs foi expresso por miócitos 10º.

Células de ciclagem foram identificadas por manchamento de —BrdU(Roche)eKi67 (Vector labs). Células progenitoras manchadas positivas para c-kit e os fatores de transcrição, Nkx2,5 (R&D Systems), Ets-1 e GATA6 (Santa Cruz Biotechnology). Miócitos recém formados foram identificados com anticorpos contra BrdU, Ki67 e actina a-sarcomérica (Sigma), troponina I cardíaca (Santa Cruz Biotechnology) ou cadeia pesada de baixo miosina (cardíaco) (Sigma). Estruturas vasculares recém formadas foram detectadas por manchamento para BrdU e a -actina do músculo macio . (mouse monoclonal, Sigma) ou vWF (rabbit polyconal, Dako). Imagens foram adquiridas usando microscopia confocal (Zeiss 510 LSM). O número i 5 —de CSCs, células progenitoras de miócito (c-kitP/Nkx2,5P*), e miócitos recém formados (BrdU”º* e ki67”*) foram quantificado para as regiões de ' infarto, peri-infarto e distais em cada nível. Um total de 3.000 células (-20 campos) foi contado para cada região na ampliação x 63. 3 lâminas por animal foram avaliadas. Números foram expressos como uma porcentagem — com relação ao número total de células contadas. O tamanho de 50 miócitos BrdU?”” recém formados por animal nas regiões de infarto e peri-infarto foi medido usando software Lucia G. A densidade de capilares na região do infarto foi avaliada por manchamento com um anticorpo contra vWF (DAKO). O 2º Ab usado foi um burro anti-coelho, conjugado com HRP (Santa Cruz). Peroxidase endógena na seção foi bloqueada com 3 % de peróxido de hidrogênio em PBS por 15 minutos à temperatura ambiente. O cromogênio 3, 3-diaminobenzidina (DAB) (Sigma) foi usado para visualizar os vasos sanguíneos. As lâminas foram contramanchadas com hematoxilina para identificação de núcleos. O número de capilares (definidos como 1 ou 2 células endoteliais cobrindo a circunferência do vaso positivo VWF) foi determinado contando 10 campos/seção na zona de infarto em níveis C e D a ampliação 40 x. Um total de 3 lâminas/animal foi avaliado. O número de capilares foi expresso por 0,2 mm.

Para detectar apoptose celular, as seções foram manchadas com anticorpo primário caspase-3 ativado por coelho anti-humano (R&D Systems) e um 2ºAb conjugado com HRP de burro anti-coelho. O cromogênio DAB (Sigma) foi usado para visualizar os cardiomiócitos apoptópticos. As seções foram então contramanchadas com hematoxilina e permanentemente montadas antes de ser examinadas por microscopia óptica.

O número de miócitos positivos caspase-3 na zona de peri-infarto dos níveis . C e D foi determinante contando 20 campos aleatórios/seção a ampliação 40 x.

Um total de 3 lâminas/animal foi avaliado.

A quantidade de miócitos — positivos caspase-3 foi expressa como porcentagem com relação ao número total de miócitos contados. : Análise Estatística Dados são reportados como Média + SD.

Significância entre 2 grupos foi determinada por teste t de Student e em múltiplas comparações pela análise de variância (ANOVA). O método post hoc de Bonferroni foi usado para localizar as diferenças.

Significância foi estabelecida a P<0,05. Exemplo 1 Preparação de Microesferas PLGA Dois conjuntos de microesferas de PLGA e alginato foram preparados; um conjunto contendo uma mistura de albumina sérica humana (HSA) e fator 1 de crescimento tipo insulina (IGF-1), o outro conjunto contendo uma mistura de HSA e fator de crescimento de hepatócito (HGF). O HSA foi usado para fornecer volume o bastante para a emulsão dando as — quantidades muito pequenas dos fatores de crescimento necessários.

As condições usadas para formar as Microesferas PLGA são as seguintes: Um nebulizador Flow Focussing of Ingeniatrics (D=150 um, H=125) foi empregado em uma configuração líquido-líquido em que o líquido focado é a emulsão de PLGA+HSA-+fator de crescimento e o líquido em foco éágua A fase lipídio consistiu em: 5 % de PLGA em EtOAc (acetato de etila) A fase aquosa consistiu em: 5 % de HSA, 0,1 % de fator de crescimento, 0,45 % de NaCL, 0,25 % de Tween 20 em H20.

A mistura das duas fases foi sonicada por 30 minutos.

As microgotículas são produzidas em um banho de 2 % de - álcool polivinílico (PVA, Fluka Chemica). O tamanho das partículas é controlado pelo volume de fluxo — dos fluidos (Qd) focados e (Qt) em foco.

Para obter partículas de 15+1 mícrons, um Qd = 3,5 mL/h e um Q= 3 mL/h foram usados.

A eficiência de : encapsulamento da mistura HSA+IGF-1 foi de 37 %. O tamanho das partículas foi determinado por microscopia óptica e eletrônica (ver Figura 8). Os mesmos procedimentos com modificação menor foram — usados para preparar partículas PLGA contendo HGF, Exemplo 2 Otimização da produção de microesferas de PLGA monodispersas de 15 um de diâmetro Para otimizar a eficiência de encapsulamento a fim de reduzir o número de microesferas a ser administrado, as condições usadas foram otimizadas com modificação nos seguintes parâmetros: a.-Incorporação de emulsificadores na fase lipídio.

Observou- se que a combinação ideal foi uma mistura de Tween 80 e Span 60 que produziu emulsão estável por até 5 horas. b.-Otimização da concentração de proteína (Albumina sérica humana), HSA de 20 % em vez de 5 %. c-Otimização da concentração de NaCl na fase aquosa para 0,2 % em vez de 0,45 %. d.-Otimização da concentração de PLGA para 5,5 % em vez deS%emEtOAc. e.-A concentração de HGF-1 na mistura inicial foi 0,4 %. Além do mais, a fase aquosa consistiu em 20 % de HSA, 0,4 % de IGF-1; 0,2 de NaCl; 0,1 de Tween 20; 0,15 de Span 60. A fase orgânica consistiu em 5,5 % de PLGA em EtOAc (acetato de etila).

As micropartículas foram obtidas por fluxo simples em foco usando as condições descritas no Exemplo £1.

- O tamanho das partículas, como determinado por SEM foi de 14,36 um com um SD de 0,91 e uma eficiência de encapsulamento de 82,4 com S um aprisionamento de 13,1%. Determinações de proteína complementadas por ELISAs quantitativas documentou que cada microesferas 1 x 10º carregou 3 ug de ' IGF-1 e 348 ug de HSA. Ensaios in vitro biológicos do IGF-1 contidos nas microesferas testadas por sua capacidade de ligar e ativar o receptor IGF-1 de células vivas mostraram que após uma rodada de liofilização e ressuspensão o —TIGF-1 encapsulado manteve 82 % da atividade biológica original. Além do mais, cada um milhão de microesferas teve uma atividade biológica equivalente de 2,5 ug do IGF-1 nativo.

Protocolos similares foram usados para encapsular HGF, com um resultado final de 1,7 ug de HGF encapsulado por partículas 1 x 10º com 15º uma atividade biológica de 63 % do original. Assim, cada milhão de microesferas HGF pode distribuir o equivalente de 1 ug de HGF ativo.

O encapsulamento de SCF (Fator de Célula Tronco), o ligante para o receptor c-kit, produziu partículas contendo 2,3 ug de SCF por microesferas 1 x 10 com uma atividade 76 % da solução original como determinado por meio da ativação do receptor c-kit.

Conclusão: O procedimento focando fluxo único usado é muito eficiente no encapsulamento de uma mistura de HSA e diferentes fatores de crescimento. Mudando a razão inicial de HSA para fator de crescimento é possível atingir valores de carregamento de até 350 ug da — proteína farmacológica desejada por microesferas 1 x 10º de PLGA de 15 um de diâmetro com um coeficiente de variação de <6 %. Exemplo 3 Produção de microesfers de ALGINATO monodispersas e encapsulamento de IGF-1

Os reagentes e equipamentos usados para a produção das microesferas foram os seguintes: -Alginato: Protanal LF 10/60; FMCBioPolymer (G/M 21,5); Protanal LF10/60LS; FMCBioPolymer (G/M < 1). -HSA (albumina sérica humana, 97-99 %, A9511) pela Sigma- O Aldrich , -IGF-1 de PreProtect -CaCl;; citrato de sódio tribásico -Nebulizadores FF simples na configuração líquido-gás: L2 (D=100 um, H=100) e L3 (D= 100 um, H=100). -bomba Harvard 11 plus.

Após mais que 120 ensaios para estabelecer as condições apropriadas, torna-se evidente que uma mistura de alginatos dá melhores i resultados do que um alginato único.

Protanal LF 10/60: Protanal LF10/60LS À 15 a uma razão de 0,7 %:.3 % dá os resultados ideais.

Observou-se que a distância ideal para nebulização foi 10 cm.

A concentração ideal de TEM na mistura foi 14 % e IGF-1 0,3 %. Esta mistura é nebulizada usando o FF (D=100 um, H=100) na configuração líquido-gás (APt=300 mbar, Qa = 5 mL/h usando gás com o fluido em foco.

O nebulizador é colocado a 10 em de uma solução de 3 % de CaCl, em um banho agitado, coletado por centrifugação após 30 minutos e lavado para remover o CaCl,. A distribuição de tamanho das partículas é determinada por citometria de fluxo e SEM.

À eficiência de encapsulamento de HSA por quantificação de proteína e curvas padrões.

O encapsulamento de hrHGF-1 foi determinado por ELISA da —maneiradescritano Exemplo *2. O tamanho das partículas, de maneira determinada por SEM foi de 15,87 um com um SD de 1,83 e uma eficiência de encapsulamento de 71,4 com um aprisionamento de 11,6 %. As determinações de proteína complementadas por ELISAs quantitativas documentou que cada microesferas 1 x 10º carregou —-2 ug de IGF-1 e 269 ug de HSA.

Ensaios in vitro biológicos da IGF-1 contidos nas microesferas testados por sua . capacidade de ligar e ativar o receptor IGF-1 de células vivas mostraram que após uma rodada de liofilização e ressuspensão o IGF-1 encapsulado manteve 67% da atividade biológica original.

Além do mais, cada um milhão de microesferas teve uma atividade biológica equivalente de -1,5 ug do IGF-1 : nativo.

Este protocolo pode ser adaptado para ser usado com diferentes tipos de polímeros tais como copolímeros bloco segmentados —poliéter-poliéster de tereftalato de polibutileno (PBT) e óxido de polietileno (PEO) Poli Active& usando o nebulizador FF bem como outros métodos de aspersão.

Conclusão: Alginato é um polímero adequado para a produção de microesferas monodispersas com um diâmetro aproximado de 15 um e para encapsular grandes quantidades de proteínas.

Os protocolos usados podem ser modificados para aumentar a razão de IGF-1 para HSA até 60:40 que aumenta a carga de composto ativo por mais que duas ordens de magnitude.

A partir dos resultados obtidos, a faixa de tamanhos em torno do pico de 15 um é mais estreita quando se usa PLGA do que com a combinação de alginatos testados aqui.

Dado o grande número de diferentes preparações de alginato é provável que a homogeneidade das micropartículas encontradas aqui possa ser significativamente melhorada.

Exemplo 4 Para produzir microesferas onde o composto ativo é localizado na superfície da partícula é possível produzir as microesferas mostradas anteriormente usando um polieletrólito em vez de PLGA de carga de sinal oposto ao ativo a ser ligado.

Exemplos de tais polieletrólitos são goma arábica, pectinas, proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos, ácido hialurônico, heparina, carboximetilcelulose, quitosana, ácido algínico e uma multidão de polímeros sintéticos.

Quando o polieletrólito tem uma carga de sinal oposto ao composto ativo, é possível anexá-lo à micropartícula por - absorção de uma solução do ativo.

Exemplo 5 — Microesferas de 15 ug em diâmetro são ideais para aprisionamento capilar após administração intracoronária sem vazar para a circulação 7 sistêmica.

Porcos brancos Yorkshire fêmeas (n=2) (27 kg) foram sedados com telazol (100 mg, L.M.), intubados e raspados.

Um catéter intravenoso foi — colocado em uma veia do ouvido periférico.

Os animais foram levados para a sala de cirurgia, colocados em uma mesa suporte, e amarrados na mesa cirúrgica com membro amarrado.

Os animais foram mantidos anestesiados com isoflurano (2,5 % em Ox) e seu EKG monitorado continuamente por todo o procedimento.

Usando uma fonte radiológica portável (GE STENOSCOP, GE Medical Systems USA) para diretriz fluoroscópica, a artéria coronária principal esquerda foi intubada com um catéter guia 6F JR 3,5 de 40 cm em comprimento — especialmente projetado pelo protocolo (Cordynamic- Iberhospitex S.

A.

Barcelona, Espanha). Uma angiografia coronária de linha de base foi realizada.

Em ambos animais, um catéter guia coronário de 2 mm de diâmetro avançou em um arame guia (Hi-Torque Balance Middle-Weight 0,014") para a origem da artéria coronária esquerda.

Através desse catéter um microcatéter de 0,014" (0,3 mm) de diâmetro interno avançou e sua ponta se posicionou na porção próxima da artéria coronária anterior esquerda (LAD), logo abaixo da origem da primeira artéria perfuradora.

Esta é a mesma localização usada para produzir o infarto do miocárdio experimental e para a administração da solução de fatores de crescimento descrita anteriormente.

Um outro catéter foi colocado na sinus coronário para coletar amostras sangue venoso cardíaco durante o procedimento.

Antes de iniciar a administração uma amostra de sangue venoso e arterial, coronário, periférica foi coletada. No caso de extra-sístoles ventriculares ou fibrilação ventricular abundante, . Lidocaína de 1-3 mg/kg foi administrada intravenosamente. Medicação pré operatória foi administrada como clopidrogel 75 mg (Plavix) e aspirina 250 ' 5 mg um dia antes do procedimento cirúrgico. Medicação pós-operatória consistiu em clopidrogel 75 mg (Plavix) e aspirina 125 mg diariamente até o ' sacrifício.

Para determinar o tamanho ideal das microesferas a serem completamente aprisionadas na rede capilar uma mistura de microesferas de poliestireno fluorescentes de diâmetros de 2 um, 4 um, 6 um, 10 um; 12 um e um, cada qual marcada com uma diferente corante (adquiridos pela Invitrogen of from Polysciences Inc., Cat % F8830, F8858; F8824; microesfera tingidas de 6,0 um Polybead Black, Megabead NIST 12,0 um e F8842) foram em misturadas em uma suspensão de 20 mL de PBS a uma

15. concentração de 1 x 10º microesferas de cada um dos 6 tamanhos por mL e vortexadas por 5 minutos para garantir um suspensão homogênea. Esta suspensão foi administrada na origem da artéria coronária esquerda de três porcos por meio do catéter de angiografia por uma bomba Harvard a uma taxa de 1 mL/min. Após a administração de cada ml. (1 milhão de microesferas) a injeção foi suspensa por 3 minutos em cujo tempo uma amostra de sangue do sinus coronário foi tirada. Imediatamente após obter as amostras de sangue, lâminas com esfregaço de sangue foram preparadas para checar a presença de micropartículas fluorescentes. Após a completa administração de 20 mL de suspensão de microesfera amostras de sangue do sinus coronário foram — coletadas por mais 3 horas a cada intervalos de 30 minutos. Na conclusão do experimento, os animais foram sacrificados e o coração excisado, fixado e as amostras foram tiradas para divisão seguido por exame histológico e microscopia fluorescente. Em virtude de as microesferas de diferentes tamanhos serem administradas em números iguais, suas razões no fluxo venoso do sinus coronário e no miocárdio devem ser imagens especulares uma das outras.

Aquelas partículas que passam através do leito capilar terão uma alta concentração no sangue do sinus coronário e baixa no miocárdio no final do experimento.

O reverso deve ser verdadeiro para as partículas que não passam através do leito capilar.

Conforme mostrado a seguir, apenas tamanhos > 10 , um são eficientemente retidos no miocárdio, mas mesmo microesferas de 10 e 12 um vazem até um ponto significante uma vez que entre 19 e 8 %, respectivamente dessas microesferas passaram na circulação sistêmica.

Por outro lado, >1% das partículas de 15 um passaram através do leito capilar e alcançaram o sinus coronário.

TABELA 2 Tamanho de microesfera | 2 | 4 12|/15 em um: j Fluxo de saída na coronária 95 [73 |53 [19 >1 Sinus (calculado) em % Retido no miocárdio 3 horas | <3 | 15 | 41 | 77 299 i após administração em % Para determinar se os resultados mostrados anteriormente foram específicos para o miocárdio ou podem ser estendidos para outros tecidos, o mesmo protocolo foi usado para administrar uma suspensão idêntica das microesferas através da artéria femoral da perna direita.

As amostras do sangue foram coletadas da veia femoral e amostras do músculo do quadríceps foram analisadas para determinar a permanência das diferentes microesferas no músculo esquelético.

Os resultados são sumarizados na Tabelai3. TABELA 3 Tamanho de microesfera em [2 ts nei] m: Fluxo de saída no retomo | 92 | 67 | 59 | 12 [1 |>1 venoso (calculado) em % Retido no músculo esquelético | <1 | 11 | 27 | 72 | 83 |>99 3 horas após em % Conclusão: O tamanho mínimo de microesferas que garante >

99 % de retenção no tecido de interesse é 15 um em diâmetro. Em virtude de ser importante usar o tamanho eficaz mínimo a fim de minimizar a produção - de micro focos de isquemia obstruindo arteríolas pré-capilares, este tamanho de diâmetro é o ideal para a distribuição local de substâncias para um tecido ' 5 — particular através de seu leito capilar. Exemplo 6 . Administração das microesferas na circulação coronária. Uma suspensão de 20 mL de microesferas de poliestireno fluorescentes de 15 um (microesferas de poliestireno Invitrogen, Cat % F8842, —FluoSferasM) a uma concentração de 1x10/mL em PBS foi preparada e vortexada por 5 minutos. Esta suspensão foi administrada através do catéter de angiografia por uma bomba Harvard a uma taxa de 1] mL/minuto na origem da artéria coronária esquerda principal. Após administração de cada mL (1 milhão de microesferas) a injeção foi suspensa por 3 minutos em cujo tempo 15º um EKG completo e uma amostra de sangue do sinus coronário foi tirada. Imediatamente após obter as amostras de sangue, lâminas com esfregaço de sangue foram preparadas para checar a presença de micropartículas fluorescentes. O resto da amostra foi salvo para determinações de enzima. O procedimento continuou até o eletrocardiograma mostrou alterações mínimas — consistentes com isquemia do miocárdio. O fluxo do sangue coronário (TIMI) foi medido no início do experimento e após a administração da suspensão da partícula. Os dois porcos foram deixados recuperar, re-examinados em 24 horas e sacrificados em seguida.

Resultados: Em animal %1l as primeiras alterações de EKG foram detectadas após a administração de 16 mL da suspensão (16 milhões de microesferas). No segundo animal as alterações de EKG não apareceram até após a administração de 18 mL (18 milhões de microesferas). Em ambos animais, o fluxo do sangue coronário foi TIMI 3 (normal) no final do procedimento.

Animal t1 foi sacrificado 24 horas após o término da infusão.

Um EKG completo e as amostras do sangue foram coletados antes do . sacrifício.

O coração foi processado para exame macroscópico e microscópico.

Animal 4 2 a 24 horas teve um EKG e fluxo do sangue i coronário (TIMI 3) normais.

Após obter um conjunto de amostras de sangue o ' animal foi sacrificado e o coração processado para exame macroscópico e microscópico.

Todos os esfregaços de sangue da amostras tiradas do sinus — coronário e da circulação sistêmica dos animais %1 e 42 foram examinados por microscopia fluorescente a baixa e alta ampliação.

Não foi detectada nenhuma microesfera fluorescente em nenhuma das amostras.

Isto indica que aprisionamento na rede capilar de microesferas 15um em diâmetro é muito eficiente.. Além do mais, se existir quaisquer desvios funcionais das artérias coronárias para o ventrículo direito, com este método de injeção através das veias Thebesius eles serão menores e não detectados pelos métodos empregados aqui.

As medições de enzima (Tabela 4) mostram que o animal 41 desenvolveu um pequeno infarto do miocárdio da maneira mostrada pelo - maior nível de troponina T específica cardíaca (TnT) no sangue (valores maiores que 0,01 ng/mL são anormais), enquanto os valores do animal 42 são normais e sugerem que este animal desenvolveu apenas isquemia transiente durante a administração das partículas e recuperou sem nenhum dano ao miocárdio permanente.

Esta interpretação foi confirmada pela patologia — conforme mostrado a seguir.

A seção macroscópica do coração do animal 41 mostra microfocos de necrose (áreas claras) enquanto a seção do animal t2 é normal.

Esta conclusão foi confirmada pela histopatologia (dados não mostrados).

- a Tabela 4 o | PA Meat 1ES > irei | rates res” Lean reszaa MMrINHRHRE MB 646 506 498 919 1231 . TrT 0.01 0.01 0.01 1.72 1.35 PIG2 CK 1120 1114 1099 1073 1834 1895 — PTE TT 0.02 0.01 0.04 0.01 0.01 0.01 . Conclusão: Administração de até 15x10 microesferas de 15 um em diâmetro na área irrigada pela artéria descendente anterior esquerda (LAD) em um coração é bem tolerada e não produz dano miocárdio.

Doses —acimade 15x10 microesferas têm um alto risco de produzir pequenas áreas isquêmicas que podem deixar cicatriz permanente.

Além do mais, com um carregamento na faixa média dos valores obtidos como o polímero de 1 mg de proteína por 1 x 10º microesferas de 15 um de diâmetro, é possível distribuir até 15 mg do agente terapêutico para o leito capilar do miocárdio irrigado pela artéria coronária esquerda.

Exemplo 7 Administração de microesferas de PLGA carregadas com fatores de crescimento Uma vez que a faixa de dose de segurança de 15 um —microesferas foi determinada, o mesmo protocolo foi usado para administrar 10x10 Microesferas PLGA (15um em diâmetro) na mesma região do miocárdio.

A suspensão de microesfera foi composta de 4x10 Microesferas PLGA carregadas com um total de 2 ug do fator 1 de crescimento tipo insulina recombinante humano (IGF-1); 4x10º Microesferas PLGA carregadas com um total de 1 ug do fator de crescimento de hepatócito recombinante humano (HGF). Esses dois tipos de microesferas foram também carregados com um corante verde fluorescente a fim de ornar mais fácil sua visualização no sangue e nas seções histológicas.

Além disso, a suspensão conteve 2x10 poliestireno fluorescente na faixa laranja da Invitrogen.

As esferas da Invitrogen foram incluídas para servir como controle para a estabilidade e distribuição das Microesferas PLGA. A suspensão em 10 mL . de PBS fisiológico, foi administrada nos porcos instrumentados da maneira descrita anteriormente. A administração da suspensão para os dois animais foi rotineira não houve nenhum sinal eletrocardiográfico de isquemia. O fluxo do ' sangue capilar foi normal durante e após o procedimento (TIMI 3). Um animal (porco t3) foi sacrificado 30 minutos após o procedimento e o outro (porco f4) em 24 horas após o procedimento. Ambos os corações foram — processados para análises macroscópicas e microscópicas.

Nem a amostra periférica nem a do sangue do sinus coronário desses dois animais mostrou a presença tanto microesferas de Invitrogen quanto PLGA nos múltiplos esfregaços de sangue. Análise preliminar das seções de pulmão, fígado e baço, esses dois animais também falharam para detectara presença de qualquer tipo de microesferas. - bela 5 EAF 589 692 432 657 ese

0.01 0.01 0.01 0.01 PIG4 CcK 467 468 441 442 1181 434 FE EE a TT 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 Legenda para as Tabelas 4 e 5. Marcadores: CK, creatina quinase; MB, o MB isoforma de creatina quinase que é cardíaca específica TiT, Troponina cardíaco T, que é o marcador mais específico e sensível para —danodo miocárdio. PRE INJ CS, amostra de sangue tirada do sinus coronário no início do procedimento; PRE INJ, amostra de sangue sistêmica tirada no início do procedimento; POST CS, amostra de sangue tirada do sinus coronário no final do procedimento; POST, amostra de sangue da circulação sistêmica tirada no final do procedimento; POST 14H, amostra de sangue sistêmica tirada a 14 horas após o procedimento; POST 24H, amostra de sangue sistêmica tirada 24 horas após o procedimento antes de sacrificar o - animal.

As seções macroscópicas desses dois animais foram — completamente normais (não mostradas). A análise da seção de porco 43 no microscópio fluorescente mostrou a distribuição das microesferas de PLGA i (verde) e das microesferas de poliestireno (vermelho/laranja) nos Vasos capilares na razão aproximada de 1:4 (Figura 10 a seguir), conforme seria esperado da composição da mistura administrada.

Não houve nenhuma — evidência de nenhum dano do tecido microscópico em nenhuma das regiões do coração examinadas.

No porco 4 o número de microesferas de PLGA (verde) já aumentou significativamente e a razão dessas microesferas para o poliestireno (vermelho/laranja) é próximo a 1: 1 (ver Figura 11), indicando que as microesferas de PLGA tornam-se degradadas com uma meia vida de —l6 horas.

Efetividade de IGF-1 e HGF administrados nas microesferas para estimular as células tronco cardíacas residentes.

Da maneira descrita anteriormente, a combinação de IGF-1 e HGF administrada através das artérias coronárias foi muito eficaz em estimular a ativação das células tronco cardíacas residentes.

Neste ensaio preliminar monitoramos a ativação das células tronco na região onde as microesferas foram distribuídas e comparadas com uma região do ventrículo esquerdo não irrigada pela artéria coronária esquerda.

Conforme pode ser visto nas imagens na Figura 11, a maioria das células tronco residentes no miocárdio não tratado é quiescente (realçada por setas/cabeças de setas) enquanto aquelas da região tratada entraram no ciclo celular, conforme demonstrado pela expressão do marcador do ciclo celular ki-67 (sinal amarelo no núcleo nas Figuras nos "pontos" claros nas áreas salientadas). Além do mais, a administração de fatores de crescimento em um substrato sólido que os distribui para os capilares e os mantém ali até que eles sejam descarregados no espaço intersticial adjacente, é um método eficaz de administração de fator . de crescimento para o estímulo da população de célula tronco endógena.

Conclusão: A distribuição local de IGF-1 e HGF para regiões | S — particulares do miocárdio por meio de microesferas biodegradáveis de um i diâmetro que não permite que elas cruzem os capilares e entrem na circulação ' sistêmica é eficaz no estímulo das células tronco residentes de regiões particulares do tecido sem afetar aquelas não alvejadas para a terapia.

Exemplo 8 Células Tronco e Progenitoras Cardíacas de c-kit”* de Porco São Multipotentes e Fenotipicamente Similares às de Outra Espécie Animal Seções histológicas de miocárdio de 3 porcos Yorkshire pesando 24+3 kg foram examinadas por microscopia confocal para a presença de células positivas para o marcador de célula tronco comum, c-kit, sabe-se queo receptor para fator de célula tronco (SCF), é expresso pela maioria de CSCs. Células pequenas positivas para c-kit (c-kit”*) foram distribuídas por todo o miocárdio atrial e ventricular (Figura 1 A-B) com uma maior densidade no átrio (nenhuma diferença entre o átrio esquerdo e o direito, dados não mostrados) e o ápice ventricular, comparados com outras regiões cardíacas (Figura 1C). Esta distribuição corresponde ao padrão da localização anatômica do CSCs c-kit”** nos corações de outra espécie animal, incluindo humanos. Consequentemente, a densidade das células c-kit”* no coração de porco é similar à do miocárdio humano e roedor; 1 célula por -1.000 miócitos ou -50.000 células c-kit”* por grama de tecido.

Amostras do tecido do miocárdio de diferentes regiões cardíacas de porco foram enzimaticamente digeridas para obter uma população de célula pobre de miócito. As células c-kit”* constituíram 10+3 %, 32 % e 73 % da população de célula pobre de miócito cardíaca de partida do átrio, ventrículo, e ápice, respectivamente (Figura ID).

As células c-kit”** foram separadas usando tecnologia MACS

(21) que rendeu uma preparação de célula altamente enriquecida constituída

- por >90 % de células c-kit”* (Figura 1E). Análise de FACS mostrou que as células cardíacas enriquecidas c-kit”** foram negativas para o marcador pan-

i 5 —leucócito CD45 e o marcador progenitor endotelial/ hematopoiético CD34

(Figura 1E). Uma fração alta (87 %) de células cardíacas de porco c-kit”º*

' expressou CD90, (um marcador mesenquimal não específicos comum) e

CDI166 (molécula de adesão) (Figura 1E). Apenas uma pequena fração foi positiva para os marcadores hematopoiéticos/progenitores endoteliais, CD105 eCD133 (Suppl Figura 1). As células cardíacas c-kit”* foram negativas quando analisadas para um painel de marcadores específicos CD para outras linhagens hematopoiéticas, mesenquimais e célula endoteliais, incluindo

CD13, CD14, CD31, CD38, CD44, CD33. A partir dessas análises pudemos concluir que o células cardíacas classificadas c-kit de porco são c-kit”,

15º CD90"”, CDI66P", CDIO0S"”, CDI33"" e CD45", CD34"*%, CD31"%, CD44"*,

Células cardíacas c-kit”* isoladas frescamente do átrio, ventrículos e ápice foram expandidas em cultura (4 passagens) e então depositadas como um células únicas em placas Terasaki de 96 poços para

— gerar clones de célula única (Figura 2A-B). A eficiência clonal das células de porco foi similar para todos os locais cardíacos e para a eficiência de clonagem previamente reportada do roedor CSCs (Figura 2C) (Beltrami et al.

Cell 2003). Escolhemos aleatoriamente 2 clones cada das células derivadas de átrio, ventrículo e ápice e os expandimos ainda mais.

Esses clones mostraram um tempo de duplicação — 30 horas foram propagados muito distante por mais que 65 passagens e subclonados serialmente a cada 10 passagens, sem atingir impedimento ou senescência de crescimento.

Esses clones de célula cardíaca c-kit”* têm mantido um cariótipo normal sem alterações cromossomais detectáveis.

Células cardíacas de porco c-kit”** clonadas foram analisadas para marcadores de comprometimento de linhagem sem tronco e cardíaca - usando imunocitoquímica. As células mostraram positividade para c-kit (90+8 %), FIk-1 (869 %), Oct3/4 (6211 %), Nanog (465 %), telomerase (81+10 %), Bmi-l (7014 %), Nlkx2,5 (52+8 %), Isl-1 (86 %) (Figura 2D). Em virtude dos clones originados das células únicas, a ampla expressão dos genes ' de multipotência em sua progênie sugeriu que o nível de expressão desses genes na população de célula parental é muito alto. Infelizmente, a população de células c-kit?* primária é uma mistura de CSCs, progenitores e precursores enóstivemos ainda marcadores específicos para o CSCs 'real'. Além do mais, é possível inferir apenas no fenótipo dessas células através da análise de seus descendentes. Quando células cardíacas de porco c-kit”* clonadas foram plaqueadas em meio de formação de cardioesfera modificada (mnCSFM) em placas bacteriológicas (Coming), elas cresceram em suspensão e geraram clones esféricos, chamados cardioesferas (Figura 2E) (Beltrami, A.P. et al.,

2003. Cell 114:763; Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD et al. Cardiac Progenitor Cells from adult myocardium: homing, diferenciation, and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(21): 12313-12318; MatsuuraK, Nagai T, Nishigaki N et al. Adult cardiac Sea-1 -positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. J Biol Chem 2004; 279(12):11384- 11391). Quando as cardioesferas foram colocadas em pratos plásticos revestidos com laminina com meio de diferenciação cardiogênica, elas se anexaram e as células se espalharam fora da esfera adquirindo a morfologia plana (Figura 2E). Quatro a cinco dias após o plaqueamento, essas células planas periféricas expressaram proteínas específicas para miócito (27+4 %), endotelial (10+6 %) e linhagens celulares do músculo macio (345 %) (Figura 2E). Esses resultados mostraram que células de porco c-kit* cardíacas têm características de célula tronco verdadeira, isto é, elas expressam marcadores de sem tronco, são clonogênicas, autorenovadas, e multipotentes. Assim, células tronco cardíacas c-kit”** de porco (daqui por - diante identificadas como pCSCs) têm um padrão de expressão genética e um fenótipo consistentes com CSCs c-kit”** isolados da outra espécie (Ellison et i 5 —al,2007.5J, Biol. Chem. 282: 11397). i CSCs de Porco Expressam Caminhos de Sinalização IGF-1, HGF e SCF ' Intactos que Modulam sua Ativação Os resultados mostraram a presença de pCSCs verdadeira no coração de porco.

CSCs expressa IGF-1 e receptores c-met in vivo e in vitro (Figura 2F). Quando crescem em cultura, pCSCs frescamente isolados respondem ao estímulo para hrIGF-1, hrHGF e hrSCF com proliferação celular (Figura 2G) e migração (Figura 2H). Mediante ligação ao ligante, caminhos efetores à jusante específicos foram ativados em pCSCs (Figura 15º 21). Resultados similares foram obtidos com células dos clones de célula única expandida (dados não mostrados). Além do mais, pCSCs têm acoplado funcionalmente os sistemas do receptor GF que podem ser explorados in vivo para protocolos de regeneração do miocárdio teste.

Exemplo 9 — Produção de Infarto do Miocárdio em Porcos, Monitoramento da Função Ventricular e Regeneração do miocárdio por Estímulo In situ de Células Tronco Cardíacas Residentes com Fatores de Crescimento Todos os estudos de animal foram aprovados por comitês adequados de Escuela Veterinaria y Hospital de León, León, Espanha. Porcos — Yorkshire brancos fêmeas (n=26) (27+3 kg) foram sedados com telazol (100 mg, L.M.), intubados e raspados. Um catéter intravenoso foi colocado em uma veia do ouvido periférico. Os animais foram levados para a sala de cirurgia, colocados em uma mesa de suporte, e presos na mesa cirúrgica com membros amarrados. Os animais foram mantidos anestesiados com isofurano (2,5 % em

O). Em Todos os 26 animais, um catéter de balão coronário avançou em um arame guia e posicionado na porção próxima da artéria coronária anterior . esquerda (LAD), abaixo da origem da primeira artéria perfuradora.

Foram dados aos porcos 125UI/kg de heparina antes do infarto ser induzido e em i 5 seguida infusão de heparina (10UI/kg/h) durante o procedimento de infarto.

Para induzir o infarto, a artéria coronária LAD foi oclusa por inflação de , balão (2,5 mm de diâmetro) por 75 minutos.

Para medicação anti-arrítmica, os porcos foram continuamente infundidos por todo o procedimento com Amiodarona (Trangorex) (5 mg/kg/h) começando 15 minutos antes do infarto.

No caso de extra-sístoles ventricular ou fibrilação ventricular abundante, Lidocaína de 1 — 3 mg/kg foi administrada intravenosamente.

A medicação pré-operatória foi administrada como 75 mg de clopidrogel (Plavix) e 250 mg de aspirina um dia antes do procedimento cirúrgico.

A medicação pós- operatória consistiu em 75 mg de clopidrogel (Plavix) e 125 mg de aspirina diariamente até o sacrifício.

IGF-1 recombinante humano e HGF (Peprotech) foram administrados em doses diferenciais (variando de 2 ug a 8 ug de IGF-1 e de 0,5 ug a 2 ug de HGF) em 17 porcos através de um catéter de balão de perfusão avançou imediatamente distal da origem da primeira artéria septal 30 — minutos após reperfusão coronária.

Os GFs foram administrados em 15 mL de PBS a uma taxa de 2,5 mL por minuto com uma reperfusão de 2 minutos após cada administração de 5 mL.

Salina sozinha foi injetada em outros 9 porcos com MI (grupo controle salina -placebo; CTRL) usando o mesmo protocolo.

Cinco (2 no grupo CTRL e 3 nos grupos GF) dos 26 animais morreram — durante infarto do miocárdio agudo (AMI) (mortalidade aguda de -30 %). Subsequentemente, 3 animais morreram no período pós-operatório: um animal no dia 1 (grupo CTRL), um animal no dia 13 (grupo CTRL) e um animal no dia 14 (GF grupo). Dos 18 porcos restantes completando o protocolo do estudo, 13 foram dos grupos tratados com GF e 5 do grupo

CTRL. Especialmente, dos 18 animais tratados com GF que sobreviveram, 4 receberam uma dose 1x dos GFs (2 ug IGF-1 e 0,5 ug HGF; GF-lx), 5 animais receberam uma dose 2x (4 ug IGF-1 e 1 ug HGF; GF-2x) e 4 animais receberam uma dose 4x (8 ug de IGF-1 e 2 ug de HGF GF-4x)). Diretamente após a administração de GFs ou salina sozinha, todos animais que | sobreviveram foram implantados com uma bomba osmóptica carregada com . 10 mL de uma solução de 0,5 M de BrdU para a duração do estudo. Os porcos foram sacrificados em 21 dias após administração de MI e fator de crescimento. O grupo ao qual cada porco pertencia foi mantido cego para investigadores realizarem a análise imunoistoquímica.

Medições de Função Cardíaca. Função cardíaca foi medida por ecocardiografia na linha de base, imediatamente após oclusão coronária e antes do sacrifício. Resumidamente, vista do eixo longo e pequeno ' paraesternal foi obtida tanto com o modo M quanto com imagens de eco bidimensionais. Dimensões LV (LVEDD e LVESD) foram medidas | perpendiculares ao eixo longitudinal do ventrículo no nível médiocordal. Fração da ejeção LV e cepa radial foram calculados. Injeção de IGF-1/HGF Intracoronária Local Preserva a Organização do Tecido Infartado e Aumenta a Sobrevivência do Cardiomiócito após InfartodoMiocárdio Agudo IGF-1 recombinante humano e HGF (daqui por diante abreviados como IGF-I/HGF ou GFs) foram administrados em doses diferenciais em porcos por injeção intracoronária 30 minutos após o infarto do miocárdio agudo. Mais porcos foram injetados com volume idêntico de salina — sozinha, constituindo o grupo controle (CTRL).

A dimensão do infarto, da maneira determinada por planimetria, como uma porcentagem da área circunferencial coronal não foi diferente entre o grupo tratado com GF e CTRL (28+5 %, 267 %, 295 % em GF-lx, -2x e -4x, respectivamente, vs. 27+4 % em CTRL).

As seções transversais manchadas com H&E e Sirius Red do tecido cardíaco na zona remota, limite e de infarto revelaram ilhas de tecido - do miocárdio que sobreviveram distribuídas entre o tecido de cicatriz fibróptica na zona de infarto. Essas ilhas do miocárdio que sobreviveram — foram muito mais abundantes na área infartada do miocárdio tratado com GF i do que nos animais tratados com CTRL (Figura 3A-B). Manchamento por ' imunofluorescência duplo para actina o-sarcomérica e BrdU das seções analisadas por microscopia confocal revelou que essas ilhas consistiram principalmente em actina a-sarcomérica grande positiva, cardiomiócitos negativo de BrdU, um fenótipo que confirmou sua sobrevivência como miocárdio pré-infarto e sua natureza madura, mesmo hipertrófica (Figura 3C). Além disso, os corações de porco tratados com GF tiveram significativamente menos tecido fibróptico na região do infarto, comparado com CTRL (Figura 3D-F). Mais interessantemente, esta diminuição exibiu um relacionamento linear positivo com a dose de GF administrada (Figura 3F).

O estudo não foi especialmente conduzido para monitorar o efeito da terapia GF na morte celular precoce. Entretanto, a partir dos resultados apresentados daqui por diante, fica claro que morte do miócito continua a ser muito alta na zona peri-infarto/limite um longo tempo após o evento de oclusão coronária/reperfusão. Isto é provável em virtude dos efeitos de remodelamento patológico, que é conhecido para estabelecer um círculo vicioso entre adaptação morfológica e morte celular continuada. Da maneira mostrada na Figura 3G-H, administração de IGF-I/HGF reduziu significativamente morte do miócito tardia em uma maneira dependente da — dose, da maneira mostrada por uma diminuição no número de miócitos positivos para caspase -3 ativada, comparado com CTRL. Consistente com a preservação da morfologia anatômica, a sobrevivência do miócito e remodelamento diminuído, os corações tratados com GF exibiram uma resposta hipertrópica de diminuição do miócito quando comparado com

CTRL (Figura 31). Juntas essas observações indicam que administração de IGF-1/HGF após MI agudo tem um efeito importante em preservar o número . de cardiomiócito e estrutura da parede do miocárdio, reduzindo a carga nos : miócitos que sobreviveram, que resulta em melhor remodelação do miocárdio e menor estímulo para morte do miócito e hipertrofia do miocárdio que i sobreviveu.

' Administração Intracoronária de IGF-1/HGF Após Infarto do Miocárdio Agudo Ativa o pCSCs Residente Nos corações pós-MI normais (não mostrados), -90 % de — pCSCs c-kitpos in situ expressam IGF-1 e receptores c-met (HGF) conforme detectado por imuno-histoquímica (Figura 4A-B). Consequentemente, os corações de porco infartados tratados com GF mostraram um aumento significante no número de pCSCs c-kitpos na região limite e mesmo maior na área infartada, 21 dias após MI (Figura 4C-D). Isto é, o aumento no pCSCs c- Kkitpos como o resultado da administração de GF é confirmado por sua correlação direta com a dose de GF administrada (Figura 4D). Na dose de GF mais alta, o número de pCSCs c-kitpos na área infartada é >6-vezes maior que nos corações CTRL (Figura 4D, SupplTable). Além do mais, o aumento linear entre as doses 1x e as 4x indica que nos não alcançamos uma dose de — saturação para produzir a resposta regenerativa máxima. Muitos dos pCSCs foram BrdU positivo, uma fixação que documenta sua origem após a produção do MI (Figura 4E). Sua natureza de ciclagem foi confirmada por manchamento de Ki-67, que marca células que são ou recentemente estão no ciclo celular (dados não mostrados). Muitas células c-kit”* expressaram os —fatoresde transcrição Nkx-2,5, Ets-1 ou Gata6 indicativo de sua diferenciação com respeito a linhagens cardíacas principais, isto é, miócito, células endoteliais e do músculo macio (Figura 4F-I). Análise quantitativa revelou que o número de células c-kit”**Nkx2,5P“ (miócito comprometido/precursores vasculares), aumentou significativamente nas regiões de infarto e limite nos corações de porco tratados com GF de uma maneira dependente da dose de GF (Figura 4G), alcançando níveis que foram > 10-vezes maiores que em . corações CTRL. : Tratamento de IGF-1/HGF Produz Regeneração Robusta do Miocárdio apósInfartodoMiocárdio Agudo i Os corações tratados com GF, tanto nas regiões de infarto : quanto peri-infarto/limite, abrigaram uma grande população de miócitos BrdU"”* recém formados muito pequenos, que não tinham ainda atingido o estado terminalmente diferenciado (Figura 5). Esses dados foram confirmados pela expressão de Ki67 nos miócitos recém formados pequenos (Figura 5C e F), alguns dos quais foram em mitose e citocinase, confirmando sua natureza imatura (Figura 51). Os miócitos BrdU”* recém formado estiveram também presentes na região peri-infarto/limite dos porcos CTRL injetados com salina não tratada. Entretanto, seu número foi — 1/10 dos corações tratados e eles foram praticamente ausentes na zona de infarto (Figura 5).

Como foi o caso para o pCSCs, existiu uma correlação direta entre o número de miócitos recém formados de BrdUP”*/Ki67""* pequenos com dose de GF, tanto nas regiões de infarto quanto limite (Figura 5SG-H). No miocárdio tratado com GF, o miócitos BrdUº”* pequenos foram organizados como agrupamentos de bandas de regeneração na zona de infarto. Essas bandas de regeneração foram mais organizadas na estrutura, e mais compactas e densas com maior dose de GF (Figura SA-B). Finalmente, nem o número nem a aparência de miócitos recém formados (o BrdU”** ou Ki67"*”) na região distal do infarto (o miocárdio excedente) não foi significativamente diferente entreanimaistratados com GF e CTRL (dados não mostrados).

Estruturas vasculares positivas BrdU recém formadas foram também evidentes no limite e miocárdio infartado (Figura 6 A-C). Os corações tratados com GF exibiram maior número de capilares e arteríolas na zona de infarto, comparado com CTRL tratado com salina e esta resposta foi dependente da dose (Figura 6D-F). Interessantemente, novos microvasos foram mais evidentes adjacentes às ilhas de miocárdio que sobreviveram na ú zona infartada mencionada anteriormente que também teve uma densidade . maior de miócitos BrdU”º” recém formados pequenos e bandas de regeneração —(Gandia, C. et al, 2008. Steam Cells 26:638). Esta organização sugere a i produção de fatores cardiopoiéticos (Behfar, A. et al., 2007. J.

Exp.

Med. ' 2007 204: 208) para miócitos excedentes adultos que agem nos pCSCs.

Os miócitos regenerados na zona de infarto em 21 dias após MI foram imaturos conforme demonstrado por seu tamanho médio, bem como pelo fato o muitos deles estarem ainda em ciclização conforme demonstrado pela expressão de Ki-67 (Figura 51 F). De acordo com o papel sugerido para o papel cardiopoiético dos miócitos maduros, miócitos recém formados em contato ou em proximidade imediata com os maduros (isto é, na zona de limite) são de tamanho significativamente maior do que aqueles no 15º meio durante a cicatriz com nenhuma proximidade do tecido excedente (Figura 5). É também evidente que tratamento com GF desempenha um papel na maturação de miócito da maneira mostrada pela média de aumento do tamanho do miócito com maior dose de GF.

Dado o tamanho do coração de porco e o volume da área —infartada, não é possível determinar com nenhuma exatidão tanto o número de miócitos perdidos quanto o número de miócitos regenerados pelo tratamento com GF.

No entanto, amostragem cuidadosa da zona infartada e a áreas peri- infarto/limite não deixa nenhuma dúvida de que em 28 dias o coração infartado tratado com GF teve a maioria dos miócitos perdidos regenerados, —senãotodos.

Exemplo 10 Administração GF Intracoronária Preserva e Pode Melhorar a Função Ventricular Formação de imagem ecocardiográfica mostrou que fração de ejeção ventricular esquerdo (LVEF) foi significativamente deprimida em | porcos tratado com CTRL e GF após oclusão coronária (Figura 6G). Entretanto, 28 dias após AMI, LVEF piorou ligeiramente em CTRL, enquanto ela foi significativamente preservada/melhorada pelo tratamento com GF, — quando comparado com CTRL (Figura 6G). A fim de ganhar compreensão i adicional na função cardíaca regional, ecocardiografia Doppler do tecido foi E empregada para medir cepa radial antero-septal que foi significativamente melhorada em porcos tratados com GF, comparados com CTRL (Figura 6H- TD). Função cardíaca preservação/melhoria correlacionou com aumento de dose deGF(Figura6).

Exemplo 11 A administração intracoronária de até 50 ug de IGF-1 encapsulado em microesferas PLGA 15 um de diâmetro não derramou na circulação ' sistêmica.

Conforme demonstrado pelo Exemplo 5, > 99 % das | microesferas de 15 um de diâmetro são aprisionados na rede capilar do tecido alvo, e especialmente no miocárdio. Esses dados, entretanto, não abordam o problema de se quando a molécula ativa é descarregada ela fica retida no tecido, ou se ela lixivia para fora da circulação capilar e do retorno venoso. — Para explorar esse problema, 5 x 10º microesferas carregadas com um total de 50 ug de rhIGF-1 foram administradas intracoronária na origem da artéria descendente anterior esquerda seguindo o mesmo protocolo de administração esboçado nos Exemplos 5-7. As principais diferenças foi que um catéter foi deixado no sinus coronário através da veia jugular. Durante a administração, três horas após o procedimento e em seguida a cada 12 horas para os próximos 3 dias as amostras do sangue foram coletadas do sinus coronário e o sangue venoso através de uma veia do ouvido. O soro foi preparado e as amostras congeladas em LN2 até o término da coleta. Todas as amostras foram analisadas por ELISA empregando estojo de detecção de IGF-1 humano (R&D, Minneapolis, Minnesota, USA) que não reage de forma cruzada com o IGF-1 de porco.

Nenhuma das amostras tanto do sinus . coronário quanto do retorno venoso sistêmico teve pontuação positiva.

Em : nossas mãos os limites detecção mínimos do ensaio foram 52,5 ng/mL para IGF-l.

Além do mais, embora fosse possível que tenha ocorrido algum l vazamento abaixo dos níveis de detecção do ELISA, é claro que a maioria do ' IGF-1 nunca deixou o miocárdio.

Exemplo 12 A administração local intra-arterial de IGF-I/HGF em músculo esquelético danificado induziu a ativação das células tronco do músculo e estimula a regeneração.

Para testar se o protocolo usado para tratar o miocárdio danificado foi eficaz no tratamento de outros tecidos, o mesmo protocolo foi usado para tratar o músculo esquelético pós-isquêmico da perna direita de 3 porcos em que dano isquêmico foi produzido por uma oclusão de balão completa de 45 minutos da artéria femoral.

Como no caso do miocárdio, após uma reperfusão de 30 minutos por deflação do balão, uma suspensão de 20 mL de PBS contendo microesferas IGF-1 e HGF de 15 um diâmetro, preparadas da maneira descrita no Exemplo t2 para uma total de doses de 8 umdeIGF-le2umde HGF.

Os animais foram sacrificados 3 semanas mais tarde e biópsia do músculo dos quadríceps analisada por imuno-histologia para determinar o grau de ativação das células tronco na lesão.

Da maneira descrita para o miocárdio, após a oclusão da artéria femoral, os animais foram implantados com uma bomba osmóptica para distribuir continuamente uma solução de BrdU conhecida para marcar eficientemente todas as células de replicação.

Desta maneira, Todas as células nascidas após o início da terapia são marcadas com BrdU, que permite uma comparação da reação regenerativa entre os animais controles e os tratados.

Em cada caso os quadríceps da perna esquerda serviu como controle não danificado.

Conforme mostrado na figura 12, e Tabela 6, a administração « local de IGF-1/HGF encapsulado em microesferas PLGA de 15 um em . diâmetro foi muito eficaz no estímulo da regeneração de tecido muscular na pernatratada, mas não no contralateral, comparado com o controles tratados isquêmicos, mas placebos. ' TABELA 6 Regeneração do Músculo Esquelético em Resposta a Administração Local de Fatores de Crescimento miofibra 1 Conclusão: À administração local de fatores de crescimento em tecido danificado sem ser o miocárdio, tem um efeito estimulante na reação regenerativa do tecido danificado que é localizado na área à jusante do local de administração das microesferas, uma vez que espera-se que um sistema de distribuição alveje a rede capilar do tecido/órgão danificado.

Exemplo13 Injeção intracoronária de IGF-1/HGE/SCF tem um efeito mais potente na ativação do CSCs e preservação da função ventricular do que IGF- 1/HFG sozinho.

Para testar se a adição de novos fatores ao protocolo descrito nos Exemplos anteriores melhoraria a reação regenerativa do miocárdio pós- infartado, um grupo de 3 animais foi administrado com doses mais altas de IGF-1 (8hg) e HGF (2ug) usadas no Exemplo 49 junto com 4 ug de SCF.

Cada desses fatores foi encapsulado em microesferas PLGA de 15 um diâmetro da maneira descrita no Exemplo %2. O protocolo para a produção do infarto, monitoramento e a administração das suspensões de microesfera foi da maneira descrita nos Exemplos t5-7. Os animais foram sacrificados em 4

. semanas após o tratamento.

Conforme mostrado na Figura 13A e figura 13B, a - regeneração produzida pelos três protocolos fatores é significativamente melhor tanto no o nível de regeneração bem como na maturação dos i 5 —miócitosregenerados do que pela combinação de IGF-1/HGF. É razoável extrapolar a partir desses dados que além da adição ou subtração de partículas com fatores particulares, outras variações podem envolver mudança na dose de um fator particular ou conjunto de fatores, o perfil de liberação/descarregamento para um fator particular, o grau de carregamento, etc.

Conclusão: A presente invenção permite que a formulação de um número quase infinito de combinação específica de compostos terapêuticos de partida de um conjunto limitado de blocos de construção em que cada fator pode ser usado em doses diferentes, diferentes padrões de liberação e combinado com um não limitado de outros fatores. Isto permite que uma administração única alveje um tecido particular com diferentes combinações de agentes terapêuticos cada um dos quais pode agir em um tempo diferente, em um alvo celular diferente, e exigir uma eficaz dose diferente. Essas possibilidades são particularmente vantajosas para tecidos de difícil acesso que pode não ser acessados repetidamente, tais como o miocárdio e a maioria dos órgãos internos.

Legendas da Figura Figura 1. Distribuição e caracterização de células cardíacas c-kit”* no coração de porco adulto.

(A-B) Imagens confocais representativas de células c-kit positivas (c-kit”*; branco) no átrio direito (A) e ventrículo esquerdo (B) do coração de porco normal. Cardiomiócitos manchados em vermelho (mostrados em cinza nas figuras) por actina a-sarcomérica (a-sarc act) e núcleos manchados com DAPI em azul. Células ce-kit”* (C) são distribuídas | é por todo o ventricular atrial e miocárdio com uma maior densidade no átrio e ápice, comparado com ventrículo direito e esquerdo (RV, LV). *p<0,05 - vs RV e LV. Análise FACS representativa (D) de células c-kit”* na população de célula cardíaca pobre de miócito para o átrio, ventrículo (RV), eápice. Células c-kit”** (E) obtidas usando MACS mostrou >90 % de enriquecimento. Análise FACS de células cardíacas de porco c-kit”* enriquecidas revelaram que elas são negativas para marcadores de linhagem celular hematopoiética CD45 e CD34. Também, uma fração alta de células cardíacas de porco c-kit”** expressa os marcadores de linhagem celular mesenquimais, CD90 e CD166. Figura 2. Células cardíacas de porco c-kit"”* expressam marcadores sem tronco, têm propriedades de célula tronco de clonogenicidade, auto-renovação, formação de cardioesfera e multipotência, e expressam sistemas de IGF-1/HGF de sinalização intacta que modula sua ativação.

(A) Uma imagem de microscopia óptica mostrando células cardíacas de porco c-kit”* expandidas na 4" passagem. (B) Uma imagem de microscopia óptica de um clone, após células cardíacas de porco c-kit”º* únicas serem depositadas nos poços das placas terasaki para gerar clones de célula única (CO) A clonogenicidade de células cardíacas de porco c-kit”* foi através de câmaras cardíacas similares, e comparada com CSCs de camundongo e roedor. (D) Manchamento imunofluorescente de células cardíacas de porco c-kit”** clonadas confirmou a expressão de c-kit (branco), e revelou a expressão de FIk-l1, Oct-4, Nanog, Tert, Bmi-1, Nkx2,5 e Isl1 — (todos mostrados em cinza), que indicam que elas são uma mistura de Células Tronco e Progenitoras Cardíacas. Imagens são 20x ampliação, com capturas de ampliação como inserção. (E) Células cardíacas de porco c-kit”* clonadas formaram cardioesferas (a). Quando cardioesferas c-kit”** (branco) (b) foram | colocadas em pratos revestidos com laminina em meio cardiogênico, as células de cardioesfera se espalharam para for a da esfera (c). Quatro a cinco . dias mais tarde, as células na periferia da esfera aumentou a expressão de . marcadores bioquímicos para cardiomiócitos (actina a-sarcomérica, a-Sarc Act d), músculo macio (Actina do músculo macio, SMA; e), e células i endoteliais (fator von Willebrand, vWF; £f) (todos mostrados em cinza ' fluorescência). (F) O manchamento imunofluorescente mostrou que CSCs de porco c-kit"”* têm receptores IGF-1 e HGF (cinza, IGF-IR e c-met, respectivamente). (G -H) Quando crescidas em cultura, células de porco c- kit” cardíacas frescamente isoladas respondem ao estímulo de IGF-1 e HGF, por proliferação celular (G; *p<0,05 vs. base, tp<0,05 vs. CTRL, tp<0,05 vs. HGF) e migração (H; Tp<0,05 vs. CTRL, tp<0,05 vs. IGF-1). (D) Análise Western blot revelou que mediante ligação do ligante específico os caminhos efetores à jusante são ativados em células cardíacas de porco c-kit”*, phos = fosforilada, FAK = quinase de adesão focal, Figura 3 Injeção Intracoronária de IGF-1 e HGF melhora a remodelação celular do miocárdio após AMI.

(a) O manchamento com H&E de corações de porco tratados com GF revelou ilhas de tecido do miocárdio que sobreviveram na zona de infarto (setas), dispostas entre as camadas de regeneração e fibróptica. (B) Essas ilhas do miocárdio foram não frequentes e menos definidas na estrutura nos corações de porco CTRL tratados com salina. (C) Essas ilhas do miocárdio foram compostas principalmente de cardiomiócitos negativo BrdU (troponina I cardíaca, cTnl; cinza com seus núcleos na forma de círculos —pretosno meio da célula), documentando seu fenótipo que sobreviveu e maduro. As células nascidas após o infarto são BrdU positivo e seus núcleos mostrados como pontos brancos. (D-E) Manchamento com Sirius vermelho identificou o tecido fibróptico (manchamento cinza) e músculo (manchamento amarelo) em seções transversais da zona de infarto, (D) em corações de porco

CTRL tratados com GF e tratados com salina (E). (FE) corações de porco tratados com GF (IGF-1/HGF) tiveram uma fração da área de menor - porcentagem de fibrose na zona de infarto, comparado com porcos CTRL : tratados com salina. *p<0,05 vs. CTRL. Tp<0,05 vs. IGF-1I/HGF 1x. (G) —Manchamento para caspase-3 ativada (marrom; cabeças de seta) revelou miócitos apoptópticos na zona peri-infarto/limite do coração de porco CTRL ' após AMI. (ED Injeção de IGF-1 e HGF resultou em menor números de miócitos apoptópticos, na zona peri-infarto/limite, comparado com CTRL tratados com salina. *p<0,05, vs. CTRL, Tp<0,05 vs. IGF-1/HGF 1x, tp<0,05 vs. IGF-I/HGF 2x. (1) Análise de diâmetro do miócito mostrou que porcos tratados com GF tiveram uma menor resposta hipertrópica do miócito após AMI, quando comparado com animais CTRL tratados com salina. Região normal = remota/distal da área infartada em corações CTRL. “p<0,05 vs. Normal, *p<0,05 vs. CTRL. tp<0,05 vs. IGF-1/HGF 1x.

Figura 4. Administração de IGF-1 e HGF após AMI ativa CSCs endógeno, conduz seu comprometimento com a linhagem cardíaca (A-B) A maioria dos CSCs ckit”* de porco (branco) expressa receptores Igf-1 (A, cinza) e c-met (B, cinza) in vivo. DAPI mancha os núcleos em azul. (C) Um agrupamento de CSCs ckit”* (branco) na área de infarto de um GF-4x tratados coração de porco. (D) O número de CSCs c- kit” aumentou significativamente no limite mas mais na região infartada de porcos tratados com GF, comparado com CTRL tratados com salina. *p<0,05, vs. CTRL, tTp<0,05 vs. IGF-L/HGF 1x, Í1p<0,05 vs. IGF-L/HGF 2x. (E) Muitos CSCs c-kit”** (branco) nos corações de porco tratados com GF foram — positivo para BrdU (cinza), indicativo de seu estado recém formado. (F) CSCs c-kitP** (branco) expressaram o fator transcrição cardíaca, Nkx2,5 (cinza), representando as células cardíacas progenitoras. Os núcleos foram manchados com DAPI (azul). (G) O número de células cardíacas progenitoras c- kit”"Nkx2,5""* aumentou nas zonas de infarto e limite em corações de porco tratados com GF, *p<0,05, vs. CTRL, Tp<0,05 vs. IGF-1/HGF 1x, $p<0,05 vs. IGF-L/HGF 2x. (H-D) Alguns CSCs c-kit”* (branco) expressaram os - fatores de transcrição, GAT A6 (H; cinza) e Ets-1 (I; cinza), indicativo de diferenciação de célula do músculo liso e endotelial, respectivamente.

Figura5 Administração de IGF-1/H GF intracoronária induz formação substancial de novo miócito após AMI.

' (A-B) Bandas de regeneração de miócitos BrdU”º pequenos, recém formados (branco) (cinza; actina a-sarcomérica, a-Sarc Act) nas regiões de infarto de GF-lx (A) e GF -4x (B) corações de porco tratados.

—Noteoaumento no tamanho da banda de regeneração após 4x a quantidade de administração de GF. Os miócitos também são mais densos, compactos e estruturados como miocárdio após 4x a quantidade de administração de GF. (C) Dentro dessas bandas de regeneração na zona de infarto estavam miócitos de proliferação Ki67"”* pequenos (branco) (cinza; a-Sarc Act). (D-E) Miócitos BrdU”” pequenos recém formados (branco núcleos) (cinza; a-Sarc Act cytoplasm) na zona limite após doses de GF-1x (D) e GF-4x (E). (F) Miócitos Ki67”* pequenos (branco) (cinza; a-Sarc Act) estavam também presentes na zona limite após injeção de GF. (G-H) A fração de miócitos BrdU"” e Ki67P* pequenos aumentou significativamente no limite mas mais na região do infarto após injeção de GF. *p<0,05, vs. CTRL, Tp<0,05 vs. IGF-1/HGF 1x, tÍp<0,05 vs. IGF-1/HGF 2x. (1) Um pequeno miócito mitóptico Ki67" na zona de infarto de um coração de porco tratado 4x com GF.

Figura 6. A administração do fator de crescimento aumentou a geração de novas estruturas vasculares e melhorou a função cardíaca em coração —deporcoinfartado.

(A) Estruturas arteriais recém formadas (BrdU, branco; a- actina do músculo macio, SMA, branco; Cadeia pesada de Miosina, MHC, cinza; DAPI, azul) foram evidentes na região infartada de corações de porco tratados com GF. (B-C) Capilares recém formados foram também evidentes nas regiões infartadas após injeção de IGF-1 e HGF (BrdU, branco; vWF, cinza; DAPI, cinza escuro). (D-F) O número de capilares em porcos tratados - com GF foi significativamente maior na zona de infarto, comparado com . CTRL tratados com salina (mancha cinza escuro). *p<0,05 vs.

CTRL, S —Tp<0,05 vs.

IGF-VVHGF 1x, 1p<0,05 vs.

IGF-1I/HGF 2x.

Imagens (20x l ampliação) mostraram manchamento com vWF (cinza escuro) em CTRL ' tratados com salina (D) e corações tratados com GF 4x (E). Capilares foram definidos como vasos compostos de 1 ou 2 células endoteliais. (G-H) Os corações tratados com GF mostraram melhor fração de ejeção ventricular esquerda (LV) (G) e cepa radial (H), comparado com CTRL tratados com salina. *p<0,05 vs.

Linha de base, tfp<0,05 vs.

AMI, Tp<0,05 vs.

CTRL, Íp<0,05 vs.

GF-lx. (D) investigação da cepa radial por Doppler de tecido representativo de porcos tratados com CTRL (a-c) e GF-4x (d-f). Os porcos tratados com CTRL (b) e GF-4x (e) tiveram dessincronização igual de contração antero-septal após 90 minutos de oclusão coronária (AMD). No sacrifício (Pós-MI), contração dessincronizada piorou em CTRL (c) enquanto ela melhorou em porcos tratados com GF (f). Os resultados mostrados anteriormente demonstram que doses de micrograma desses fatores de crescimento melhoram remodelação do miocárdio, promove a ativação dos CSCs residentes, que produzem nova formação extensiva do miocárdio, melhorando a função de LV de uma maneira dependente da dose em um coração animal de tamanho e anatomia similar ao humano usando um protocolo clinicamente implementável.

Assim, injeção de IGF-1/HGF produziu uma ampla variedade de efeitos benéficos na remodelação cardíaca e regeneração da célula autóloga que foram proporcionais à dose de GF administrada.

Figura 7 mostra imagem de microscópio óptico das partículas PLGA contendo IGF 1 obtidas com a receita descrita anteriormente Figura 8 mostra um micrográfico eletrônico do mesmo lote de partícula mostrado na figura anterior. Figura 9 mostra seções dos corações de porco 41 (imagem A esquerdo) e porco 42 (imagem direita). A parede anterior do ventrículo . esquerdo, irrigada pela artéria coronária esquerda, de porco 1 mostra inúmeros micro infartos (áreas apagadas), enquanto o miocárdio de porco f2 está normal da maneira mostrada pela coloração uniforme.

' Figura 10A. Seções do miocárdio de porco 43, sacrificado 30 minutos após a administração de uma mistura de microesferas de poliestireno (microesferas vermelhas — mostradas na figura como cinza, diâmetro maior, círculos lisos) e PLGA+fatores de crescimento (microesferas verdes — mostradas na figura como branco, diâmetro menor e forma mais irregular). À diferença na aparência em tamanho entre as partículas vermelhas e verdes é em virtude da maior fluorescência do vermelho Figuras 10B e 10C mostram seções do miocárdio de porco t4, sacrificado 24 horas após a administração de uma mistura de microesferas de poliestireno (vermelho-mostrada nas figuras como cinza, diâmetro maior, círculos lisos) e PLGA+fatores de crescimento (verde -mostrada na figura como branco, diâmetro menor e forma mais irregular). À razão de microesferas verdes para vermelho é significativamente menor neste animal em virtude da degradação das micropartículas de PLGA. No painel quatro da esquerda apenas microesferas vermelhas são detectadas, enquanto no da direita a razão é mais próxima de 1:1.

Figura 11 mostra Seções microscópicas de duas áreas de porco *4. Miócitos são em cinza. Núcleos em cinza mais escuro. As células — tronco cardíacas endógenas (CSCs) são identificadas por uma cabeça de seta (superior) e uma seta (inferior). Sua membrana é marcada em verde apagado. A figura superior, os núcleos são limpos em virtude de as células serem quiescentes. Na figura inferior todas as CSCs têm mancha cinza apagado nos núcleos que identificam a proteína Ki-67 um marcador de células que entrou no ciclo celular. Figura 12. Administração local de IGF-1 e HGF encapsulado em . microesferas PLGA de 15 um melhora a regeneração de músculo , esquelético danificado.

Imagens Histológicas de controle e músculo do quadríceps danificado. Painel A: Imagem histológica do músculo esquerdo (controle) ' cinco dias após produzir a lesão no músculo direito, Nenhum tratamento foi administrado nesta perna. Painel B: Seção histológica de um quadríceps direito cinco dias após produzir o dano sem nenhum tratamento (controle danificado). As cabeças de seta apontam para duas das diversas áreas extensivas de necrose celular onde uma concentração de núcleos parece iniciar uma reação regenerativa. Painel C: Biópsia direita de quadríceps direito 3 dias após a lesão tratada com uma mistura de microesferas carregadas com IGF-1 e microesferas carregadas com HGF com um total administrado equivalente de 16 ug IGF-1 e 4 ug HGF. As cabeças de seta apontam em direção microfibras novas nas áreas danificadas em um processo exatamente de regeneração. Painel D: Biópsia do mesmo músculo mostrado no Painel C dois dias mais tarde (5 dias após a lesão). As fibras escuras de menor tamanho são fibras regeneradas marcadas com um anticorpo contra — cadeia pesada de miosina embriônica, um marcador ou fibras regeneradas. À imagem deste painel é o equivalente ao do Painel B. A diferença espantosa entre as duas imagens mostra a efetividade da terapia. Figura 13. Maior capacidade regenerativa do miocárdio da combinação de IGF-I/HGF/SCF administrado intracoronária encapsulado em —microesferas PLGA de 15 um em diâmetro O gráfico de barra de figura 13A compara o efeito no número de miócitos cardíaco regenerados em porcos tratados pós-AMI com uma combinação de dois tipos de microesferas, barras branca (um carregado com IGF-1 e o outro com HGF) com o animais tratados com uma combinação de três tipos de microesferas (hrIGF-1, hrHGF, e hrSCF), barras pretas.

É obvio que nas três diferentes concentrações usadas a combinação de 3 tipos de . microesferas cada uma carregada com um fator diferente é superior na : combinação de apenas dois.

CTRL = animais controle tratados com placebo; — barras brancas: IX animais administrados com microesferas carregadas com o i equivalente de 2 ug IGF-1 e 0,5 ug de biologicamente ativo HGF; 2X = 4 ug 7 IGF-1 e 1 ug HGF e 4X dose = 8 ug de IGF-1 e 2 ug de HGF.

Barras pretas: mesmas quantidades de IGF-1 e HGF como para os animais representados pelas barras brancas mais microesferas carregadas com SCF equivalente a 2, 4 e8ugdehrSCF biologicamente ativo Figura 13B mostra a fração de ejeção do ventrículo esquerdo antes, imediatamente após e 4 semanas pós-AMI de maneira determinada por ecocardiografia dos porcos tratados com diferentes combinações de microesferas.

Linha de base = LV fração de ejeção imediatamente antes AMI; AMI =LV fração de ejeção após AMI; Pós-AMI = LV fração de ejeção 4 semanas após AMI e tratamento local com GF.

C = Animais controle tratados com placebo pós-AMI; O = animais tratados com 4X dose de IGF-1 + HGF em solução intracoronária; V= animais tratados com uma dose 4X de IGF-1 +HGF encapsulado em microesferas PLGA administradas imediatamente à — jusante do sítio de oclusão coronária; À = animais tratados com uma dose 4X de IGF-1H+HGF+SCF cada qual separadamente encapsulada em microesferas PLGA administradas imediatamente à jusante do sítio de oclusão coronária.

Por toda a especificação das reivindicações que seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra 'compreende', e variações tais como 'compreende' e 'ctompreendendo', serão entendidas para implicar a inclusão de um número inteiro estabelecido ou etapa ou grupo de números inteiros, mas não para a exclusão de qualquer número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

Modalidades da revelação estão por meio deste descritas compreendendo números inteiros. A revelação também estende-se a modalidades separadas consistindo em ou consistindo essencialmente nos - ditos números inteiros.

. Considera-se também especialmente que a revelação estende a — combinação de uma ou mais modalidades descritas aqui, onde tecnicamente l possível.

: Todas as patentes e pedidos de patente referidos aqui estão incorporadas pela referência na sua íntegra. O pedido do qual esta descrição e reivindicações forma parte pode ser usado como uma base para prioridade — com relação a qualquer pedido subsequente. As reivindicações de tal pedido subsequente podem ser direcionadas a qualquer recurso ou combinação de recursos aqui descritos. Elas podem tomar a forma de produto, composição, processo, ou usar as reivindicações e podem incluir, a título de exemplo e sem limitação, as reivindicações.

Claims

. REIVINDICAÇÕES

1. Formulação farmacêutica para administração intra-arterial a montante de um tecido alvo, caracterizada pelo fato de compreender partículas esféricas contendo um ingrediente ativo e um excipiente — biodegradável, em que 90% ou mais das partículas tem um diâmetro entre 10 e 20 mícrons e a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior do que 50 mícrons e menor do que 5 mícrons, de maneira tal que onde a formulação é administrada a montante do tecido alvo a capacidade do ativo de passar através do tecido alvo e passar na circulação sanguínea é — restrita através do aprisionamento das partículas nos capilares no tecido alvo.

2. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ingrediente ativo é um fator de crescimento selecionado a partir da lista que consiste de: HGF (fator de crescimento de hepatócito); IGF (fator de crescimento tipo insulina) tais como IGF-I; PDGF (fator de crescimento derivado de plaqueta) tais como PDGF-R, FGF (fator de crescimento de fibroblasto) tais como aFGF (FGF-I) ou bFGF (FGF-2) e FGF -4; SDF-I (fator derivado de célula estromal 1); EGF (fator de crescimento epidérmico); VEGF (fator de crescimento endotelial vascular); eritropoietina (EPO); TGF B (fator de crescimento de transformação 3); G-CSE (fator que estimula colônia de granulócito); GM-CSF (fator que estimula colônia de macrófago-granulócito), proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs, BMP-2, BMP -4); ÁAtivina A; IL-6; Neurotrofinas por exemplo, NGF (Fator de crescimento do nervo), BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT (neurotrofina4) e neurotrofin-l; TPO —(Trombopoietina); GDF-8 (Miostatina); GDF9 (Fator de diferenciação de crescimento-9) e Periostina.

3. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de compreender um ingrediente ativo selecionado do grupo que consiste de HGF, IGF-1 e a combinação desses.

. 2 : 4. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender partículas contendo SCF como ingrediente ativo, partículas contendo IGF-l como ingrediente ativo, e partículas contendo HGF como ingrediente ativo.

5. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a concentração do ingrediente ativo está na faixa de Ing por 1 x 10º partículas até 4mg por 1 x 10º microesferas.

6. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 5, caracterizada pelo fato de que o tamanho das partículas é monodispersa.

7. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 6, caracterizada pelo fato de que o tecido alvo é tecido cardíaco.

8. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na regeneração do tecido cardíaco pela estimulação de células tronco cardíacas.

9. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de infarto do miocárdio (MD) agudo ou crônico, doença cardíaca isquêmica, com ou sem um infarto do miocárdio.

10. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de ser para uso na regeneração de um tecido sólido em um mamífero.

11. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de o excipiente biodegradável ser selecionado a partir da lista que consiste de ácido polilático, poliglicolídeo, ácido — polilático co-glicólico, policaprolactona, poliidroxibutirato, poliuretanos, polissacarídeos, proteínas e poliaminoácidos,

. 3 : carboidratos, quitosana, heparina e ácido poli-hialurônico.

12. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o excipiente biodegradável ser selecionado a partir da lista que consiste de ácido polilático — co-glicólico(PLGA) e alginato.

13. Uso de HGF ou IGF-I como ingrediente ativo, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma formulação farmacêutica compreendendo partículas contendo um ingrediente ativo e um excipiente biodegradável, em que 90% ou mais das partículas tem um diâmetro entre 10 e20 mícrons e a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior do que 50 mícrons e menor do que 5 mícrons, para regeneração no tecido cardíaco pela estimulação de células tronco cardíacas residentes em tecido cardíaco maduro.

14. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender partículas contendo HGF ou IGF-1 como ingrediente ativo e um excipiente biodegradável, em que 90% ou mais das partículas tem um diâmetro entre 10 e 20 mícrons e a formulação é substancialmente livre de partículas com um diâmetro maior do que 50 mícrons e menor do que 5 mícrons. |

15. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14, caracterizada pelo fato de que pelo menos 90% das partículas tem um diâmetro que é entre 15 e 20 mícrons.

16. Uso de uma formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a —manufatura de um medicamento para regeneração do tecido cardíaco pela estimulação de células tronco cardíacas.

17. Uso de uma formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para o tratamento de infarto do miocárdio

. 4 . (MD) agudo ou crônico, doença cardíaca isquêmica, com ou sem um infarto do miocárdio.

18. Uso de uma formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a —manufaturadeum medicamento para regeneração de um tecido sólido em um mamífero.