BRPI0917716A2

BRPI0917716A2 - produção de esqualeno a partir de leveduras hiperprodutoras

Info

Publication number: BRPI0917716A2
Application number: BRPI0917716A
Authority: BR
Inventors: Broeker Michael
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2019-09-03
Also published as: KR20110049887A; ES2761697T3; JP2012500648A; US20220177928A1; JP4938911B2; EP2268823A2; PT2268823E; EA201170381A1; US20110243969A1; WO2010023551A2; JP2012139225A; EP2369003B1; IL211435A0; IL211435A; MX2011002279A; CN102257149B; NZ591876A; JP5930766B2; ES2366941T3; DK2268823T3

Abstract

produção de esqualeno a partir de leveduras hiperprodutoras é revelado um método para o preparo de uma levedura purificada, onde a fonte de esqualeno é uma levedura hiperprodutora de esqualeno. o esqualeno é útil para fins farmacêuticos. por exemplo, ele pode ser utilizado para a preparação de urna emulsão óleo-em-água, e a emulsão é, particularmente, imunológico.

Description

PRODUÇÃO DE ESQUALENO A PARTIR DE LEVEDURAS DE HIPERPRODUÇÃO

O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório norte americano 61/190,486, cujo conteúdo completo encontra-se incorporado, por meio do presente, por referência.

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção pertence ao campo da produção de esqualeno, por exemplo, para o uso em emulsões óleo-em-água.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

O óleo de fígado de tubarão contém um terpenóide ramificado e insaturado chamado esqualeno, 2,6,10,15,19,23hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexeno. O esqualeno é conhecido pelo uso em emulsões óleo-em-água em vacinas humanas, por exemplo, a emulsão MF59, que é utilizada para o auxílio às vacinas contra a gripe. O esqualeno também é utilizado em outros produtos farmacêuticos (por exemplo, pomadas, supositórios) e em cosméticos.

As atuais fontes de esqualeno são, principalmente, os óleos de peixe, e, em particular, os óleos de fígado de tubarão. Pode haver problemas associados ao uso do esqualeno extraído do óleo de fígado de tubarão, particularmente, se padrões de fabricação rigorosos (por exemplo, o adotado durante a produção do MF59) não forem mantidos. Por exemplo, os tubarões podem ser infectados por patógenos, que são igualmente infecciosos para os humanos, ou que produzem substâncias nocivas aos humanos, ou pode haver a existência de TSE ou agentes de tubarão do tipo TSE [por exemplo, referências 1-3] . Ademais, os tubarões podem conter toxinas humanas, por exemplo, a carchatoxina. Assim, as fontes baratas, de baixa qualidade, do esqualeno, não são apropriadas para o uso farmacêutico em humanos. O risco de danos a um

2/20 receptor humano pode ser intensificado em situações em que o esqualeno seja parte de um adjuvante imunológico, pois, por definição, o adjuvante pode induzir uma forte resposta imune indesejada contra a impureza.

Ao invés do uso de fontes baratas, e de baixa qualidade, de esqualeno derivado de tubarões, os usos farmacêuticos de esqualeno (por exemplo, conforme o uso na produção de MF5 9) utilizam, assim, um grau mais alto de material; entretanto, esses esqualenos de alta qualidade são caros e de disponibilidade limitada. Tais fontes dispendiosas não são úteis, por exemplo, para o uso em um mundo em desenvolvimento.

Seria útil a descoberta de uma fonte de esqualeno que atendesse aos altos padrões farmacêuticos e não fosse tão dispendiosa. Portanto, é desejável uma alternativa viável de fonte de esqualeno, particularmente, quando o esqualeno é destinado ao uso parental em humanos e/ou ao uso em um adjuvante imunológico. Uma fonte mais barata de esqualeno de grau farmacêutico seria de uso particular em países em desenvolvimento que não possuem acesso imediato a tubarões, ou que não podem custear, facilmente, um dispendioso material de grau farmacêutico atualmente utilizado, por exemplo, pela

Novartis.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a métodos de preparo de esqualeno a partir de leveduras hiperprodutoras de esqualeno. As leveduras são organismos GRAS (Geralmente Reconhecido como Seguro) e, portanto, são uma fonte útil de esqualeno para uso farmacêutico. Ademais, o esqualeno pode ser preparado livre de contaminação por patógenos, príons e toxinas ambientais, por exemplo, as leveduras são, a priori, livres de mercúrio. No

3/20 campo da vacina, as leveduras já sao utilizadas (por exemplo, para a expressão recombinante do antígeno de superfície do vírus da hepatite B) e, por isso, não apresentam quaisquer preocupações regulamentares em particular, isto é, o esqualeno derivado de leveduras é particularmente adequado ao uso na preparação de adjuvantes imunológicos. Finalmente, as técnicas de cultura de leveduras são amplamente difundidas e prontamente passíveis de transferência de tecnologia.

Dessa maneira, a invenção apresenta um processo de preparo de esqualeno puro, que compreende as etapas de: (a) crescimento de uma levedura que produza um alto rendimento de esqualeno durante a cultura; (b) purificação de esqualeno a partir da levedura desenvolvida na etapa (a) . O esqualeno purificado pode ser utilizado como um componente no preparo de produtos farmacêuticos, alimentos, aditivos alimentares, cosméticos, etc.

A invenção também apresenta um processo de preparo de um produto que contém esqualeno, que compreende as etapas de: (a) obtenção do esqualeno purificado a partir da levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura; e (b) combinação do esqualeno da etapa (a) com um componente, que não seja o esqualeno, para a formação de um produto que contenha esqualeno.

A invenção também apresenta um processo para o uso de uma levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura, para a produção de esqualeno purificado.

A invenção também apresenta um processo de preparo de esqualeno purificado, que compreende as etapas de: (a) crescimento de uma cultura de levedura em condições tais, que a levedura produz um alto rendimento de esqualeno; (b)

4/20 purificação de esqualeno a partir da levedura cultivada, de forma que o esqualeno possua uma pureza de > 97%, em peso.

A invenção apresenta, ainda, um processo de preparo de uma emulsão óleo-em-água, que compreende as etapas de: (a) purificação de esqualeno a partir de uma levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura; e (b) combinação do esqualeno da etapa (a) com um componente aquoso, para a formação de uma emulsão óleo-em-água.

Assim, a invenção apresenta um processo de preparo de uma emulsão óleo-em-água, que compreende as etapas de: (a) obtenção do esqualeno purificado a partir da levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura; e (b) combinação do esqualeno da etapa (a) com um componente aquoso, para a formação de uma emulsão óleo-em-água.

A invenção também apresenta um processo de preparo de uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) que compreende o preparo de uma emulsão óleo-em-água, conforme descrição acima, e a mistura da emulsão com um imunógeno.

A invenção também apresenta um processo de preparação de um kit para o preparo de uma composição imunogênica dessa maneira, que compreende o preparo de uma emulsão óleo-em-água, conforme descrita acima, o acondicionamento da emulsão em um primeiro recipiente, e a combinação do primeiro recipiente, na forma de kit, com um segundo recipiente, onde o segundo recipiente contém um imunógeno. O imunógeno pode ser na forma seca ou aquosa.

A invenção também apresenta um processo para o aumento da resposta imune em um animal (por exemplo, em um mamífero) que compreende a administração de uma composição imunogênica preparada, dessa maneira, para o animal.

5/20

A invenção apresenta, ainda, o esqualeno para o uso na produção de um medicamente para o aumento da resposta imune em um mamífero, onde o esqualeno é (i) purificado a partir da levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura, e (ii) combinado com um componente aquoso para a formação de uma emulsão óleo-em-água, para fins de inclusão no medicamento.

A invenção apresenta um processo de preparo de uma emulsão óleo-em-água, que compreende as etapas de: (a) crescimento de uma cultura de levedura em condições tais, que a levedura produz um alto rendimento de esqualeno; (b) purificação de esqualeno a partir da levedura cultivada; e (c) combinação do esqualeno purificado na etapa (b) e de um componente aquoso, para a formação de uma emulsão óleo-em-água.

Ά invenção também apresenta, em um processo que utiliza o esqualeno, o aperfeiçoamento que consiste no uso de esqualeno purificado a partir de uma levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura.

Produção de esqualeno em uma levedura

A invenção utiliza esqualeno purificado a partir de uma levedura. As leveduras podem ser de ocorrência natural ou cepas mutantes, selecionadas para um alto rendimento de esqualeno; entretanto, elas serão, geralmente, cepas geneticamente modificadas que foram manipuladas para a produção de esqualeno em altos rendimentos. Outra possibilidade é a cultura de cepas de leveduras modificadas, mutantes ou naturais, na presença de fatores que resultem no aumento de rendimento do esqualeno.

rendimento de esqualeno pode ser representado como um

6/20 percentual de peso seco (ps) , em uma levedura particular. Uma cepa selvagem de Yarrowia lipolytica de uma levedura normal pode produzir, tipicamente, cerca de 0,5% ps de esqualeno, enquanto que uma levedura de cerveja Saccharomyces uvarum normal pode produzir cerca de 1,4% ps de esqualeno [4] . Uma levedura que produz um alto rendimento de esqualeno é aquela em que pelo menos 2% ps é de esqualeno, e.g., 23%, >4%, ξ>5%, >6%, 27%, a8%, >9%, 210%, 211%, 212%, 213%, 214%, 215%, ou mais, de ps.

O rendimento de esqualeno pode ser representado, também, como um percentual de lipídio total, em uma levedura particular. Uma levedura de cerveja S.uvarum normal pode produzir esqualeno com 33% de lipídios totais [4]. Uma levedura que produz um alto rendimento de esqualeno pode produzir esqualeno com 240% de lipídios totais, por exemplo,

250%, 260%, etc.

O esqualeno é vantajoso ao menos 95% em sua configuração trans (isoforma natural), por exemplo, >96%, >97%, >98%, >99% ou 100%.

As cepas de leveduras mutantes, de ocorrência natural, que apresentam um alto rendimento de esqualeno, são conhecidas na arte, como, por exemplo, a cepa Torulasopra delbrueckii, descrita na referência 5. As mutantes podem ser obtidas por métodos bem conhecidos de indução de mutações (randômica ou mutagênese dirigida), como, por exemplo, aquelas descritas nas referências 6 e 7, seguidos pelo rastreamento de células mutagenizadas por aquelas que possuam um rendimento alto e adequado de esqualeno. A referência 8 descreve cepas de leveduras mutantes, com mutações de 4-a-carboxiesterol-C3desidrogenase (ERG26) sensíveis à temperatura, que resultam em

7/20 acúmulo de esqualeno, quando esse é cultivado a uma temperatura adequada.

Todavia, a invenção utilizará, normalmente, leveduras geneticamente modificadas. Vários métodos podem ser utilizados, para fins de aumento do rendimento de esqualeno de uma cepa de partida. 0 metabolismo dos esteróis pode ser manipulado, a fim de aumentar os rendimentos de esqualeno, por exemplo, por meio do aumento do anabolismo do esqualeno e/ou por redução do catabolism© do esqualeno (incluindo sua quebra e/ou conversão natural em um ergosterol). Os genes envolvidos na biossíntese do esqualeno incluem mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, pirofosfomevalonato descarboxilase, isopentenil pirofosfato isomerase, HMGR (3-hidróxi-3metilglutaril-CoA redutase), e esqualeno sintase. Os genes envolvidos na conversão do esqualeno em ergosterol incluem esqualeno epoxidase (ERG1), lanosterol sintase, C14dimetilase, dl4-redutase, C4-metiloxidase, C4-descarboxilase (ERG26), 3-cetoredutase, C24-metiltransferase, 08-isomerase, C5-desaturase, d22-desaturase e d24-redutase. Outras enzimas catabólicas incluem LEU2 (p-isopropilmalato desidrogenase), oxidoesqualeno ciclase, zimosterol-24-metiltransferase e ergosta-5,7,24(28)-trienol-22-desidrogenase. Tais manipulações são reveladas, por exemplo, na referência 9.

Os níveis de atividade para as enzimas relevantes podem ser aumentados ou reduzidos de qualquer maneira adequada; comumente, por meio de modificação genética. A levedura pode ser geneticamente modificada por meio de métodos padronizados, inclusive aqueles descritos nas referências 7 e 10. Os genes podem ser introduzidos em leveduras de várias maneiras, por exemplo, em um plasmídeo, ou por integração cromossômica. As

8/20 técnicas de nocaute dos genes também sao bem estabelecidas para as leveduras.

As formas de aumento da atividade enzimática incluem, entre outras: o aumento do número de cópia de uma enzima que já esteja presente em uma cepa, por exemplo, por meio de adição de um ou mais genes, usualmente, em um plasmídeo; o aumento dos níveis de expressão (hiperexpressão) de uma enzima que já se encontra presente, e.g., por fornecer-lhe um promotor forte; a adição de uma enzima heteróloga, isto ê, uma que ainda não se encontre presente na cepa; a redução ou a prevenção da expressão de um fator inibitório ou supressor; por meio da modificação da sequência de uma enzima que já se encontre presente na cepa, por exemplo, a fim de aumentar a estabilidade para a remoção de resíduos de aminoácidos que realizam a inibição, para a mudança de tráfego da proteína, ou da localização celular; etc. Por exemplo, sabe-se que o truncamento de uma sequência de enzima pode modifica-la de uma proteína de membrana a uma proteína citosólica, de modo que ocorra a acumulação de esqualeno.

As formas de redução da atividade enzimática incluem, entre outras: a eliminação de uma enzima que já esteja presente em uma cepa; a redução dos níveis de expressão de uma enzima que já esteja presente, por exemplo, ao fornecer-lhe um promotor mais fraco; o aumento da expressão de um fator inibitório ou supressor, por meio da modificação da sequência de uma enzima que já esteja presente na cepa, por exemplo, a fim de diminuir a estabilidade, para a modificação dos resíduos de aminoácidos que mediam a atividade enzimática, para a eliminação dos domínios funcionais, para a modificação do tráfego da proteína ou da localização celular, etc.

9/20

Os níveis de subexpressão e sobre-expressão e da atividade aumentada ou reduzida são expressos em relação à cepa selvagem correspondente, que carece da modificação relevante.

Já existem diversos relatórios a respeito de adequadas manipulações genéticas em leveduras. Por exemplo, a referencia 11 revela leveduras que possuem acumulação aumentada de esqualeno, devido à hiperexpressão do HMGR, com a expressão reduzida de zimoesterol-24-metiltransferase e/ou ergosta5,7,24(28)-trienol-22-desidrogenase. A referência 12 revela leveduras que expressam uma HMGR (a isoenzima HMG1) truncada, que carece de sua região ligada à membrana, apresentando, assim, uma enzima citosólica, e exibe uma acumulação de esqualeno. A ruptura da esqualeno epoxidase provocou uma acumulação de esqualeno [13]. A referência 14 revela a modificação de Yarrowia lipolytica para a inibição de acetilCoA carboxilase, e para a hiperexpressão de HMGR, de modo que as cepas produziram 2% ps de esqualeno, utilizando fontes de carbono de baixo custo, tais como o soro de queijo ou a cana de açúcar. A mutação da oxidoesqualeno ciclase (ERG7) também pode causar a acumulação de esqualeno [8]. Descobriu-se que um ergosterol auxotrofo, que não permite o crescimento em 3cetoesteróis sem a adiçao de colesterol, acumulou esqualeno [15] . As cepas das leveduras com a síntese do heme prejudicada podem causar o acúmulo de esqualeno [16].

Uma combinação dessas abordagens pode ser utilizada, por exemplo, a expressão da HMGR citosólica truncada combinada com o nocaute da esqualeno epoxidase.

São preferidas as cepas de S.cerevisiae que expressam a HMGR truncada, tais como aquelas descritas na referência 12. A expressão de uma forma solúvel de HMG1, que não é ligada à

10/20 membrana, preferencialmente, sob o controle de um promotor constitutivo (e.gr. , um promotor de ADH1) , conduz a um alto nível de acumulação de esqualeno (40x do tipo selvagem) . A proteína truncada pode conter parte de uma região espaçadora e do domínio catalítico do terminal C da HMGlp, mas não apresenta a região que abrange a membrana do terminal N. Uma cepa pode expressar uma ou mais cópias do gene.

A levedura (natural, mutante ou modificada) pode ser cultivada na presença de fatores que aumentam o rendimento de esqualeno. Por exemplo, os antimicóticos alilamina (por exemplo, terbinafina, naftifina) podem inibir a esqualeno epoxidase, resultando em uma deficiência de ergosterol e em uma acumulação de esqualeno intracelular [17] . Caso haja a inclusão de inibidores de esqualeno epoxidase em um nível subletal, ou caso eles sejam utilizados com cepas resistentes, etc. , o rendimento do esqualeno de uma cultura pode ser aumentado. Um aumento do rendimento de esqualeno, de aproximadamente 100 vezes, foi observado na referência 18, na presença de terbinafina. As esqualeno epoxidases em diferentes espécies de Candida diferem na sensibilidade à terbinafina por um fator de cerca de 10, e, então, a concentração de um fator pode ter de ser otimizada para qualquer levedura de interesse. Outros antimicóticos que podem causar o acúmulo de esqualeno incluem, entre outros, voriconazol [19], 6-amino-2-npentiltiobenzotiazol [20], e antimicóticos tiocarbamatos (por exemplo, tolnaftato e tolciclato) [21] . O crescimento na presença de tiamina também pode aumentar o rendimento de esqualeno [22] .

As leveduras adequadas incluem qualquer levedura que produza esqualeno, ou que seja capaz de manipulação para a

11/20 produção de esqualeno. Exemplos de leveduras adequadas incluem as espécies dos gêneros Arthroascus, Arxiozyma, Arxula,

Builera

Candida, Debaryomyces,

Dekkera

Dipodascopsis

Endomyces, Eremothecium, Geotrichum

Hanseniaspora, Hansenula

Hormoascus, Issatchenkia, Kloeckera

Kluyveromyces, Lipomyces

Lodderomyces, Metschnl'kowia

Pachysolen

Pachytichospora

Pi chia

Rhodosporidium

Rhodotorula

Saccharomyces

Saccharomycodes, Schizoblastosporion,

Schizosaccharomyces

Schwaniomyces, Sporobolomyces, Sterigmatomyces, Sympodiomyces

Taphrina

Torula, Torulaspora

Torulopsis, Trichosporon

Yarrowia

Zygohansenula

Zygosaccharomyces.

Os generos úteis à invenção são

Saccharomyces e Torulaspora.

Uma espécie preferida para uso com a invenção são

Torulaspora delbrueckii, e, mais preferivelmente, a

Saccharomyces cerevisiae.

A fermentação da levedura para a produção de esqualeno pode ser realizada em larga escala, fornecendo quantidades quase ilimitadas de esqualeno e reduzindo, assim, o custo unitário de esqualeno produzido. A levedura pode ser cultivada com a utilização de um sistema de cultura ou fermentação conhecido. Os sistemas adequados de fermentação de leveduras para o uso na invenção incluem sistema de lotes e sistema de fermentação contínua. Há a possibilidade do uso de um sistema de cultura de dois estágios.

A levedura pode ser cultivada sob condições aeróbicas, a fim de aumentar a biomassa, antes de sua alteração para uma (pelo menos parcialmente) fase anaeróbica, a fim de aumentar a produção de esqualeno.

Um sistema de cultura de dois estágios permite a acumulação de esqualeno, a ser separado da fase de crescimento. A cultura da levedura sob condições anaeróbicas pode ser utilizada para o

12/20 aumento de produção de esqualeno [23-15], e as fontes de carbono podem, também, exercer influência.

Devido ao fato de a levedura ser cultivada em um meio controlado, uma cultura pode, seguramente, estar livre de agentes causadores de doenças, toxinas ambientais e outros contaminantes. Os meios adequados para o crescimento da levedura dependerão das espécies de leveduras e do sistema de fermentação. Os meios adequados incluem meios ricos ou mínimos, com ou sem suplementos. Por exemplo, a levedura pode ser cultivada em MM, EMM, YPD, YPDS, YPG, YPGS, YT, YAPD, YEPD, YPL, YEP, YNBD e SD. Os meios livres de quaisquer produtos de origem animal (por exemplo, soro de leite) são ideais. Em caso de uso de materiais animais (e, particularmente, bovinos) durante a cultura das células, eles devem ser obtidos de fontes que estejam livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) e, em particular, livres de encefalopatias espongiformes bovinas (BSE).

Devido ao controle das condições de cultura, o esqualeno purificado a partir da levedura de acordo com a invenção é livre de contaminação por patógenos, produtos metabólicos de patógenos, toxinas e outras substâncias prejudiciais, e é, a priori, livre de agentes que causam a TSE (tais como agentes que não são encontrados em leveduras) . Os métodos de isolamento de esqualeno a partir da levedura são conhecidos na arte, e incluem métodos, tais como cromatografia, extração de solventes líquido-líquido, extração subcrítica de gás [26], e extração supercrítica de fluidos (opcionalmente precedida por liofilização), e.g., utilizando CO2, extração de solvente clorofórmio-metanol [5,23,27]. O ideal é que o esqualeno

13/20 purificado tenha uma pureza superior a 97% (em peso), mais preferivelmente, superior a 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, 99,99%, ou possua, ainda, pureza de 100%. O ideal é que o esqualeno purificado contenha menos de 6153 pg de PCB/dioxina, por grama de esqualeno, medidos como equivalentes tóxicos (TEQ). Os TEQs permitem a toxicidade de uma mistura de PCBs/dioxinas a ser representada como um único número. A toxicidade de cada PCB (bifenil policlorado é representada como uma fração (o fator de equivalência tóxica, TEF; WHO 2005) da toxicidade de 2,3,7,8-TCDD dioxina (que possui um valor de referência de 1) . A fim de calcular o TEQ total de uma mistura, a massa de cada PCB é multiplicada por seu TEF, e, então, o TEQ é a soma desses valores. Por exemplo, o esqualeno pode conter níveis de dioxina/PCB menores que 5000 pg/g, 4000 pg/g, 3000 pg/g, 2000 pg/g, 1000 pg/g, 500 pg/g, 100 pg/g, 50 pg/g (TEQ).

Assim que o esqualeno for purificado a partir da levedura, ele pode ser utilizado para o preparo de produtos a jusante, e.g., medicamentos, adjuvantes de emulsões óleo-em-água, etc.

Emulsões óleo-em-agua

Descobriu-se que as emulsões óleo-em-água sao particularmente adequadas para o uso em vacinas adjuvantes. As emulsões preparadas de acordo com a invenção incluem esqualeno e, pelo menos, um tensoativo, além de um componente aquoso. As emulsões podem conter óleos adicionais. O ideal é que o(s) óleo(s) e tensoativo(s) sejam biodegradáveis (metabolizáveis) e biocompatíveis.

As combinações de óleo de esqualeno e tocoferóis podem ser utilizadas. Onde a composição inclui um tocoferol, qualquer um de a, p, Y, δ, ε ou ξ, ou tocoferóis, podem ser utilizados,· entretanto, os α-tocoferóis são os preferidos. 0 tocoferol

14/20 pode tomar várias formas, por exemplo, diferentes sais e /ou isômeros. Os sais incluem sais orgânicos, tais como succinato, acetato, nicotinato, etc. D-α-tocoferol e DL-α-tocoferol podem ser ambos utilizados. Um α-tocoferol preferido é o DL-atocoferol.

Um conteúdo de óleo na faixa de 2-20% (em volume) é típico.

As gotículas de óleo na emulsão sao, geralmente, inferiores a 5pm em um diâmetro, e podem até possuir um diâmetro submícron, sendo que esses tamanhos pequenos sao atingidos, convenientemente, com um microfluidizador, para o fornecimento de emulsões estáveis. As gotículas com um tamanho inferior a 220nm sao preferidas, uma vez que podem ser submetidas à esterilização do filtro.

Os tensoativo podem ser classificados por seu HLB (balanço hidrófilo-lipófilo). Os tensoativo preferidos da invenção possuem um HLB de pelo menos 10, preferencialmente, pelo menos 15, e, mais preferivelmente, pelo menos 16. A invenção pode ser utilizada com tensoativos que incluem, entre outros: os tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comumente referidos como Tweens), especialmente o polissorbato 20 e o polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP), e/ou óxido de butileno (OB) , vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, tais como os copolímeros em blocos lineares OE/OP; octoxinóis, que podem variar no número de repetição dos grupos etóxi (oxi-1,2etanodiil) , sendo o octoxinol-9 (Triton X-100, ou toctilfenoxipolietoxíetanol) de interesse particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídeos tais como fosfatidilcolina (lecitina);

15/20 nonilfenol etoxilatos, tais como as séries Tergitol™ NP; éteres graxos de polioxietileno derivados de álcoois lauril, cetil, estearil e oleil (conhecidos como tensoativos Brij), tais como trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30) , ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como os SPANs), tais como o trioleato de sorbitano (SPAN 85) e monolaurato de sorbitano. Os tensoativos não iônicos são preferidos. O tensoativo mais preferido para incluir na emulsão é o polissorbato 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano; Tween 80).

As misturas de tensoativos podem ser utilizadas, e.g., as misturas Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano e um octoxinol também é adequada. Outra combinação útil compreende lauret-9 e um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.

As quantidades de tensoativos preferidas são (% em peso): de 0,01 a 2% de ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como Tween 80); de 0,001 a 0,1% de octil ou nonilfenoxi polioxietanóis (por exemplo, Triton X-100, ou outros detergentes da série Triton) ; de 0,1 a 20% de éteres de polioxietileno (por exemplo, lauret 9).

As emulsões de óleo-em-água contendo esqualeno que contêm o tensoativo polissorbato 80 são preferidas.

Os adjuvantes específicos de emulsões óleo-em-água que podem ser feitos com o uso de esqualeno purificado de acordo com a invenção incluem, entre outros:

• Uma emulsão submícron de esqualeno, polissorbato 80 e trioleato de sorbitano. A composição da emulsão, por volume, pode ser cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas razões tornam-se 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato

16/20 e 0,48% de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como MF59 [28-30], conforme descrito mais detalhadamente no Capítulo 10 da referência 31, e no capitulo 12 da referencia 32. Ά emulsão de MF59 inclui, vantajosamente, ions de citrato, por exemplo, tampão de citrato de sódio 10 mM.

• Uma emulsão submícron de esqualeno, um tocoferol e um polissorbato 80. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de polissorbato 80, e a relação de peso de esqualeno: tocoferol é, preferencialmente, <1 (por exemplo 0,90) , uma vez que essa pode proporcionar uma emulsão mais estável. O esqualeno e o polissorbato podem estar presentes em uma razão de volume de cerca de 5:2, ou em uma razão de peso de cerca de 11:5. Uma emulsão como essa pode ser feita pela dissolução de Tween 8 0 em PSB para fornecer uma solução de 2%; depois, pela mistura de 90ml dessa solução com uma mistura de (5g de DL-a-tocoferol e 5ml de esqualeno), e com posterior microfluidização da mistura. A emulsão resultante possui gotículas submícrons de óleo, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250nm, preferivelmente cerca de 180nm. A emulsão pode incluir, também, um lipídio A monofosforila 3-de-O-acilado (3d-MPL). Outra emulsão útil desse tipo pode compreender, por dose humana, 0,5-10 mg de esqualeno, 0,5-11 mg de tocoferol, e 0,14 mg de polissorbato 80 [33] .

• Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e um detergente Triton (e.g. Triton X-100). A emulsão pode incluir, também, um

3d-MPL	(veja abaixo)	. A	emulsão pode conter	um tampão de
fosfato
•	Uma emulsão	que	compreende esqualeno,	um solvente
aquoso.	um tensoativo	não	iônico hidrofílico de	polioxietileno

17/20 alquil éter (por exemplo polioxietileno (12) cetoestearil éter) e um tensoativo não iônico hidrofílico (por exemplo éster de sorbitano ou éster de manide, por exemplo, monoleato de sorbitano ou Span 80). A emulsão é, preferencialmente, termo reversível e/ou possui pelo menos 90% das gotículas de óleo (em volume) com um tamanho inferior a 200 nm [34] . A emulsão pode incluir, também, um ou mais de: alditol; um agente crioprotetor (por exemplo um açúcar, tal como dodecilmaltosídeo e/ou sacarose); e/ou um alquilpoliglicosídeo. A emulsão pode incluir um agonista de TRL4 [35]. Tais emulsões podem ser liofolizadas.

• Uma emulsão de esqualeno, poloxamer 105 e Abil-Care [36]. As concentrações finais (peso) desses componentes, em vacinas adjuvantes, são 5% de esqualeno, 4% de poloxamer 105 (pluronic poliol) e 2% de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicerídeo cáprico/caprílico).

As emulsões podem ser misturadas com um componente separado contendo um antígeno, extemporaneamente, no momento da entrega, ou durante a fabricação da vacina. No caso de esses dois componentes serem líquidos, então a razão de volume dos dois líquidos para a mistura pode variar (e.g., entre 5:1 e 1:5), mas, geralmente, é de cerca de 1:1.

Dessa maneira, o processo da invenção pode incluir uma outra etapa de combinação da emulsão com um imunógeno. O processo pode incluir uma etapa adicional de acondicionamento da emulsão ou da mistura emulsão/imunógeno. Uma emulsão produzida de acordo com a invenção pode ser acondicionada em um primeiro recipiente dentro de um kit, onde o kit inclui um segundo recipiente que inclui o imunógeno. Os conteúdos dos dois recipientes podem ser misturados e, posteriormente,

18/20 administrados a um sujeito (por exemplo, humano), ou podem ser coadministrados separadamente.

Generalidades

O termo compreende engloba inclui, bem como consiste, por exemplo, uma composição que compreende X pode consistir exclusivamente em X, ou pode incluir um adicional, por exemplo, X + Y.

termo cerca de, em relação ao valor numérico x, é opcional e significa, por exemplo, x±10%.

FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Diversas cepas de leveduras mutantes são preparadas por meio de técnicas de modificação genética. As cepas mutantes sobre-expressam ou subexpressam as enzimas envolvidas no metabolismo do esqualeno. Uma dessas leveduras é a cepa ATC1551 revelada na referência 11, que pode produzir até 16% ps de esqualeno em condições de crescimento apropriadas.

Após a cultura, as células cultivadas são coletadas e rompidas utilizando um moinho do grânulo de vidro. O esqualeno é purificado a partir do lisado, ou por extração do solvente clorofórmio-metanol (2:1), ou, a fim de melhorar o rendimento, pelo método revelado na referência 5, que utiliza a liofilização e, depois, a extração supercrítica de dióxido de carbono. O esqualeno resultante é altamente puro (>95%).

O esqualeno purificado é combinado com uma mistura de tensoativos Tween 80 e Span 85, e com um tampão de citrato, para o preparo de uma mistura que possui 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (em volume). Essa mistura é microfuidizada, a fim de preparar uma emulsão que contém um tamanho de gotícula médio inferior a 500nm. Essa emulsão, conhecida como MF59, pode ser utilizada como um adjuvante de

19/20 vacina.

Entende-se que a invenção foi descrita somente a título de exemplo, e modificações poderão ser feitas enquanto estiverem dentro do escopo e do espírito da invenção.

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[36] Suli et al. (2004) Vaccine 22(25-26):3464-9.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de preparo de um produto contendo esqualeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obtenção do esqualeno purificado a partir da levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura, e (b) combinação do esqualeno da etapa (a) com um componente, que não seja esqualeno, para a formação de um produto que contenha esqualeno.

2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a levedura é uma cepa modificada que, em relação à cepa parental não modificada, subexpressa a zimosterol-24-metiltransferase e/ou a ergosta-5,7,24(28)-trienol-22-desidrogenase.

2/4

2. Processo de preparo de uma emulsão óleo-em-água, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) purificação de esqualeno a partir de uma levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura; e (b) combinação do esqualeno da etapa (a) com um componente aquoso, para a formação de uma emulsão óleo-em-água.

3/4 caracterizado pelo fato de que a levedura é cultivada em um meio livre de produtos de origem animal.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o esqualeno possui uma pureza superior a 97% (em peso). 16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a emulsão óleo-em-água possui gotículas de óleo com um diâmetro submícron. 17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, í 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

ou 16, caracterizado pelo fato de que a emulsão óleo-em-água é uma emulsão microfluidizada.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a emulsão óleo-emágua compreende esqualeno e polissorbato 80.

19. Processo de preparo de uma composição imunogênica caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de preparo de uma emulsão óleo-em-água pelo processo, de qualquer uma das reivindicações 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, e de mistura da emulsão com um imunógeno.

20. Processo de preparo de um kit para a preparação de uma composição imunogênica caracterizado pelo fato de que compreende o preparo de uma emulsão óleo-em-água pelo processo, de qualquer uma das reivindicações 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, o acondicionamento da emulsão em um primeiro recipiente, e a combinação do primeiro recipiente na forma de kit com um ' * fc segundo recipiente, onde o segundo recipiente contém um imunógeno.

21. Processo de aumento da resposta imune em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao

3. Processo de preparo de uma emulsão óleo-em-água, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obtenção do esqualeno purificado a partir da levedura que produz um alto rendimento de esqualeno durante a cultura; e (b) combinação do esqualeno da etapa (a) com um componente aquoso, para a formação de uma emulsão óleo-em-água.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a levedura produz >5% de peso celular seco de esqualeno.

5 mamífero de uma composição imunogênica preparada pelo Processo, da reivindicação 19, ou pelo uso do kit da reivindicação 20.

22. Processo de preparo de esqualeno purificado caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a)

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a levedura é uma Saccharomyces, por exemplo, S.cerevisiae.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a levedura expressa uma enzima HMGR truncada que possui uma localização citosólica.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a levedura é uma cepa modificada que, em relação à cepa parental não modificada, hiperexpressa a HMGR.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 2 3, 4, 5, θ, ^{7 ou} θ' caracterizado pelo fato de que a levedura expressa uma oxidoesqualeno ciclase mutante.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a levedura possui uma esqualeno epoxidase rompida.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a levedura é cultivada na presença de um fator que aumenta o rendimento de esqualeno durante a cultura.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fator é alilamina, voriconazol, 6-amino^-2-n^_pentiltiobenzotiazol, tiamina, ou um tiocarbamato.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a levedura é cultivada em condições anaeróbicas parciais, ou completas, antes da purificação do esqualeno. 14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12 ou 13,

10 crescimento de uma cultura de levedura em condições tais, que a levedura produz um alto rendimento de esqualeno; (b) purificação de esqualeno a partir da levedura cultivada, de forma que o esqualeno possui uma pureza de > 97% em peso.