BRPI0917887A2 - vacina contra síndrome reprodutiva e respiratória suína altamente patogênica (hp pprs) - Google Patents
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Abstract
vacina contra síndrome reprodutiva e respiratória suína altamente patogênica (hp prrs) a presente invenção refere-se a métodos e composições virais atenuadas para uso na prevenção e tratamento de uma forma de doença de febre alta associada à síndrome reprodutiva e respiratória suína (prrs), tal como síndrome reprodutiva e respiratória suína altamente patogênica (highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome) (hp pr-rs), uma doença viral que afeta suínos.
Description
CONTRA SÍNDROME REPRODUTIVA E RESPIRATÓRIA SUÍNA ALTAMENTE PATOGÊNICA (HP PRRSf.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
Este pedido contém uma listagem de sequências em formato de papel e em formato legível por computador, cujos ensinamentos e conteúdo são, neste relatório, incorporados corno referência.
Antecedentes da Invenção
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a vacinas contra doenças infecciosas. Mais particularmente, refere-se a vacinas contra Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína Altamente Patogênica (HP PRRS), uma doença viral que afeta suínos.
Síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS) é reconhecida 15 corno uma doença grave suína e é caracterizada com deficiência reprodutiva em porcas gestantes, ou desconforto do trato respiratório partícularmente em leitões. .Essa doença viral foi primeira descoberta nos Estados Unidos em 1987, subsequentemente encontrada na Europa, e identificada na Ásia no inicio de 1990. Até esta data, PRRS se espalhou mundíalmente, com as ca20 racterístícas de endemia nesses países de suinocultura, causando perdas econômicas enormes a cada ano. O agente eftológico de PRRS é vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), o qual, juntamente com vírus da elevação de lactato desídrogenase de camundongos (LDEV), vírus da arterite equina (EAVj; e vírus da febre hemorrágica símiana (SHFV): P®r~ 25 tence à família Art&ríviridae dentro da ordem Nídovirãles.
PRRSV, um membro dos pequenos vírus envelopados, apresenta um genorna de RNA de sentido positivo de fita única (+ssRNA) de aproximadamente 15,1-15,5 kb, compreendendo pelo menos 8 quadros de lertura aberta (ORFs) que codificam aproximadamente 20 proteínas putativas. O 30 genoma também contém duas regiões não-traduzidas (UTR) em ambas as extremidades 5' e 3'. Detalhadamente, OREI (ORF1a e QRF1b) é localizado a jusante do 5'-UTR e ocupa mais de dois terços do genoma inteiro. OR Fia
2/35 é traduzido diretamente, visto que ORE 1b é traduzido por urn desfoca mento do quadra ribossômico, produzindo uma grande poliproteina ORFIab que é proteoliticamente olivada ern produtos relacionados com a transcrição de vírus e maquinaria de replícação, ORFs 2-7, localizado a montante do 3'~ UTR, codifica uma série de proteínas estruturais vírais associadas ao virion, tais como a proteína de envelope (E) e proteína do nucleocapsídeo (N). Essas proteínas são todas traduzidas a partir de um conjunto aninhado coterminai 3’ de mRNAs subgenômicos (sgmRNAs)
Análise filogenética de isolados de PRRSV de diferentes regiões geográficas mundiais claramente indica a existência de dois genótipos principais: Tipo I representando o protótipo Europeu (vírus Le/ystad, IV), e Tipo II representando a cepa Norte-Americana ATCC VR2332 (para a sequência genõmica de VR2332, videnúmero de acesso GenBank AY 150564) oomo um protótipo (Murtaugh e outros, Arch. Virol. 1995;140:1451-1460). Além disso, alguns estudos têm mostrado que ORF5 e o gene que codifica proteína nâo-estrutural 2 (NSP2) (nsp2) poderão representar as regiões mais geneticamente variáveis em genomas de PRRSV. Vide,número de acesso SvwssPror Q9WJB2 ou ID. SEQ. NO: 2 para a sequência de NSP2 de VR2332. É também bem documentado que cepas de PRRSV diferem grandemente de suas patogenícidades.
Em 2006, ocorreu um surto incomparável de grande escala de uma doença originalmente desconhecida, rnas denominada “febre alta com sintomas de PRRS, o qual se espalhou para mais de 10 províncias e afetou mais de 2.000.000 porcos com aproximadamente 400.000 casos fatais Diferente da PRRS típica, numerosas porcas adultas foram também infectadas pela doença de “febre alta”. Essa pandemia de PRRS atípica foi inicialmente identificada como uma doença semelhante ã peste suína clássica manifestando sintomas neurológicos (por exemplo, tremores), febre alta (40--42X), erupção eritematosa de branqueamento, etc. Autópsias combinadas com análises imunológicas claramente mostraram que órgãos múltiplos foram infectados por PRRSVs altamente patogênicos com alterações patológicas graves observadas (Tian e outros, PLoS ONE. 2007; 2(6): e526). Análise de
3/35 genoma total dos vírus isolados revelou que esses isolados de PRRSV são agrupados no Tipo H e altamente homólogos a HB-1, uma cepa chinesa de PRRSV (96,5% de identidade de nucleotídeos), e JX143 (Yuan e outros, 2007 Simpósio Internacional de PRRS, Chicago). Em relação à sequência genômica de JX143, ver ID, SEQ. NO: 1, ou EMBL/No. de acesso GenBank EU708726, Observou-se, além disso, que esses isolates vírais compreendem uma característica molecular única, a saber, uma deleção descontínua de 30 aminoácídos na proteína não-estruíural 2 (NSP2) (Tían e outros, PLoS ONE. 2007: 2(6): e526). A forma doença de febre alta de PRRS é agora 10 também referida ccmo PRRS altamente patogênica, ou PRRS HP.
Isolamento de vírus da PRRS (PRRSV) e produção de vacinas contra PRRS, cada um compreendendo PRRSV (atenuado) ou inatívado vivo modificado, têm sido descritos em várias publicações (WO 92/21375, WO 93/06211, W093/03760, WO 93/07898 e WO 96/36356). Em particular, 15 WO 93/03760 descreve métodos de isolamento de vírus da PRRS, cultivação, atenuação, bem como produção de respectivas vacinas, e em particular o isolado ATCC VR-2332, protótipo Tipo lí de PRRS. WO 96/36356 descreve um descendente atenuado particularmente útil do isolado acima mencionado, obtido por passagem seriada em células simianas, o qual foi depositado 20 sob o número de acesso ATCC VR-2495. Um produto de vacina vivo modificado respectivo (MLV) é comercíalmente disponível de Boefwnger Ingelheim sob a marca registrada /nge/vac® PRRS MLV. Uma outra vacina de MLV com base no isolado Tipo II é comercíalmente disponível sob a marca registrada /nge/vac® PRRS A TP.
Uma estratégia apropriada na prevenção de PRRS é vacinação.
Contudo, é ate agora desconhecido, se vacinação seria eficaz contra HP PRRS, e qual tipo de vacina podería ser utilizada.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Os inventores fizeram a descoberta surpreendente que cepas 30 atenuadas de vírus da PRRS Tipo II poderão ser usadas para vacinar e proteger suínos dos efeitos de formas de doença de febre alta associadas à síndrome reprodutiva e respiratória suína. A identificação de características
4/35 profíláticas de cepas atenuadas de virus da PRRS Tipo I! poderá permitir o tratamento de porcos sob alto risco, por exemplo, de PRRS HP. Tal programa de vacinação ou tratamento poderá ajudar a reduzir a probabilidade ou impacto de outros surtos (outbreaks) de PRRS HP similares àqueles que 5 devastaram a indústria suína na China em 2006 e resultaram no descarte de cerca de 20 milhões de suínos.
Um aspecto da presente invenção proporcionado neste relatório inclui um método de profilatioamente proteger suínos dos efeitos de uma doença de febre alta, método este que compreende administrar a um suíno 10 em necessidade do mesmo, uma composição imunogênica que compreende uma quantidade eficaz de um vírus de PRRS Tipo II. preferencíalmente, um vírus atenuado de PRRS Tipo II. A composição poderá adicíonalmente compreender um veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição poderá ainda adicionalmente compreender um adjuvante. O método poderá ser u15 sado oomo uma medida de prevenção ou tratamento. Além disso, a administração de uma quantidade eficaz de tal composição imunogênica resulta em uma redução da incidência de, ou gravidade de sinais clínicos de formas de doença de febre alta de PRRS.
Também proporcionado neste relatório é um método de vacina20 ção suína contra uma doença de febre alta, método este que compreende administrar a um suíno uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade eficaz de um vírus de PRRS Tipo II, preferencialmente, um vírus atenuado de PRRS Tipo II. A composição poderá adicíonalmente compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição poderá ainda 25 adicíonalmente compreender um adjuvante. Tal vacinação com uma quantidade eficaz da composição imunogênica, preferencíalmente, resultará em uma redução da incidência de, ou gravidade de sinais clínicos de formas da doença de febre alta de PRRS.
A doença de febre alta poderá ser uma forma que é associada à 30 sindrome reprodutiva e respiratória suína. Sindrome reprodutiva e respiratória suína poderá ser altamente patogênica (PRRS HP). PRRS HP ou uma forma de doença de febre alta poderá ser detectada em suínos que mostram
5/35 sinais clinicas de um ou mass dos seguintes: rubefação, pontos sanguíneos, petéquia, erupções eritematosas de branqueamento, e espinhas cutâneas (pimp/es), frequentemente observadas em orelhas, boca, nariz, lombo, e interior da coxa. Outros sintomas comuns poderão incluir febre alta (maior que 5 40ζΌ), depressão, anorexia, tosse, asma, claudicação, tremores, distúrbio no trato respiratório, e diarréia, A PRRS HP é causada por um vírus da PRRS HP,
Um outro aspecto da presente invenção proporcionado neste relatório incluí um método de profiiaticamente proteger suínos de infecção com IO PRRS HP, método este que compreende administrar a um suíno com necessidade do mesmo, uma composição imunogènica que compreende uma quantidade eficaz de um vírus da PRRS Tipo il, preferencíalrnente, um vírus atenuado PRRS Tipo II.
Viras da PRRS HP que se tornou evidente em 2002 na China como membro do genótípo PRRS tipo 2 è correlacionado com a doença denominada febre alta. Vírus de PRRS HP, por conseguinte, tornou-se dominante em diversas províncias Chinesas indicando uma vantagem seletiva no espaihamento dentro de populações suínas afetadas, comparados com outros virus da PRRS.
O termo ’’virus da PRRS HP significa, mas não deve se limitar a uma cepa de virus da PRRS que apresenta uma sequência de nucleotídeos substancial mente idêntica a ID SEQ NO: 1. Preferencialmente, um virus da PRRS HP é cepa de vírus da PRRS que apresenta uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica a ID SEQ NO: 1. Substancial idêntica a
ID SEQ NO: 1 deve significar que a sequência de nucleotídeos da cepa viral de PRRS preferencialmente, compreende uma sequência entre 85% e 100% idêntica a ID SEQ NO: 1, preferencíalrnente, sob a condição de que o vírus HP não é um vírus da PRRS Tipo II conforme definido neste relatório, por exemplo, essa homologia de nucleotídeo é menor que 91%, preferencial30 mente, menor que 92%. 93%, 94%, 95%, 90%, 97%, 98% ou 99% de homoiogia ern ORF 5 a VR2332 como isolado do virus de referência. A sequência de nucleotídeos de cepa de vírus da PRRS HP è preferencíalrnente, maior
6/35 que 80%, 81%. 82%, 83%, 84%. 85%. 86%, 87%, 88%, ou 89% idêntica a ID
SEQ NO: 1, também, preferencíalmente. sob a condição de que o virus de PRRS HP não è um vírus da PRRS Tipo íí conforme definido neste relatório, por exemplo, essa homologia de nucleotideo ê menor que 91%, preferences' almente, menor que 92%, 93%, 94%. 95%. 96%, 97%. 98% ou 99% de homologia em ORF 5 a VR2332 como isolado do vírus de referência. Ainda mais preferencíalmente, a sequência de nucleotídeos de cepa de virus de
PRRS é maior que 90%, 91%, 92%. 93%. 94%, 96%, 96%, 97%, 98% ou maior que 9934 idêntica a ID SEQ NO: 1, preferencíalmenie. sob a condição 10 de que o vírus de PRRS HP não é um vírus de PRRS Tipo II conforme definido neste relatório, por exemplo, essa homología de nucleotideo é menor que 91%, preferencíalmenie, menor que hornología a 92%. 9334. 9434. 95%, 96%. 97%, 98% ou 99% em ORF 5 a VR2332 corno isolado do virus de referência.
O termo vírus da PRRS HP também significa quaisquer cepas de vírus da PRRS, que apresentam uma modificação definida da proteína
NSP2. De acordo corn essa definição, uma cepa de vírus de PRRS HP é uma cepa de vírus da PRRS que codifica uma proteína NSP2. em que o aminoácido correspondente a Ieucína sob posição de amínoácido 482 de ID 20 SEQ NO: 2 é deletado e que causa o sínai clínico de febre alta. Alternativamente, ou alèm da leuoina deietada sob posição de aminoáoido de ID SEQ
NO: 2; aminoácidos correspondentes a aminoácidos 534 a 562 de ID SEQ
NO: 2 poderão ser deletados da proteína NSP2 que codifica vírus da PRRS.
Neste contexto, ID SEQ NO: 2 se deve também entender de uma maneira 25 exemplar, e o termo proteína NSP2 não deve se limitar a uma proteína
NSP2 de ID SEQ NO: 2. Com base no ensinamento acima, aquele versado no estado da técnica, pode facilmente identificar qualquer modificação correspondente em cepas de virus de PRRS. apresentando uma sequência de proteína NSP2 que é diferente da sequência de ID SEQ NO: 2, mas mos30 trando a mesma modificação, a quaí significa uma deleção da Ieucína que corresponde à leucsna na posição 482 de ID SEQ NO' 2 e/ou uma deleção dos aminoácidos que correspondem a aminoácidos 534 a 562 de ID SEQ
7/35
NO. 2
Além disso, o termo ví ms da PRRS HP poderá também significar uma cepa de vírus da PRRS que apresenta uma sequência de nucleotideo substanciaímente idêntica a ID SEQ NO: 1 (conforme definida acima) e que 5 codifica uma proteins NSP2, em que o aminoácido correspondente a leucina sob posição de aminoácido 482 de ID SEQ NO: 2 e/ou os aminoàcidos correspondentes a aminoàcidos 534 a 562 de ID SEQ NO: 2 são deletados da proteína NSP2 que codificou vírus da PRRS.
Além disso, o termo vírus de PRRS HP refere-se a vírus da PR10 RS HP que é uma cepa de vírus da PRRS que apresenta uma sequência de nucteotídeos substancia imente idêntica a ID SEQ NO: 1; sob a condição de que o vírus da PRRS HP não è um vírus da PRRS Tipo II, conforme definido neste relatório, por exemplo, essa homologia de nucleotideo è menor que 91%, preferenciaímente, menor que 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% 15 ou 99% de homologia em ORF 5 com VR2332 como isolado do vírus de referência (conforme definido acima) e codifica umc< proteína NSP2. em que o aminoácido correspondente a leucína sob posição de aminoácido 482 de ID SEQ NO: 2 e/ou os aminoàcidos correspondentes a aminoàcidos 534 a 562 de ID SEQ NO: 2 são deletados da proteína NSP2 que codificou vírus da 20 PRRS.
Além disso, o termo vírus da PRRS HP refere-se a um virus da
PRRS HP que é uma cepa do vírus da PRRS apresentando uma sequência de nucleotídeos substanciaímente idêntica a ID SEQ NO: 1; preferencialmente, sob a condição de que o vírus da PRRS HP nâo é urn vírus da PRRS 25 Tipo 2, conforme definido neste relatório, por exernplo, essa homologia de nucleotideo ê menor que 91%, preferenciaímente, menos de 92%, 93%, 94%, 95%, 96%. 977b. 98% ou 99% de homologia em ORF 5 com VR2332 corno isolado do virus de referência (conforme definido acima) e codifica uma proteína NSP2. em que anticorpos com reatividade para peptídeos cor30 respondestes às posições 535-550 ou 546-560 ou 476-490 mostram nenhuma reatividade.
Além disso, os isolados de vírus da PRRS seguintes são sabidos
8/35 ser cepas de vírus da PRRS HP. Consequentemente, o termo cepa de virus da PRRS HP, conforme usado neste relatório deve incluir qualquer dessas cepas vírais, bem como qualquer descendente destas: oepa de vírus da PRRS HP AH-1; AHCFSH; ÂHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; CX07; CZ07;
FY060915; FY080108; GC-2; GCH-3; GD1; GD2; GD2007; GD3; GD4; GDSD1; GDY1-2007; GDY2-20Ô7; GDYF1; GS2008; GXHZ12; GXHZ13; GXHZ14; GXHZ16; GXHZ19; GXHZ2; GXHZ21; GXHZ4; GXLZ5; GXLZ7; GY, GZCJ; GZDJ; GZHW1; GZHW2; GZHX; GZ3S; GZKB; GZKY; GZLJ1;
GZWB; GZWM; GZZB; Hainan-1; Hainan-2; HBT, HB2; HB3; HB-Tsh1: HB10 Xt1; HEN46; HeN-KF; HeN-LH; HeN-LY; HL3DF; HLJMZ1; HLJMZ2:
HLJMZ3; HLJZY; HM-1; HN2; HN2007: HN3; HNId; HNIy; HNL.Y01; HNNX01; HNP301; HNsp; HNXT1; HN.yy; HNyz; HQ-5; HQ-6; HUB; HuN; HUN1; HUN11; HUN15; HUN16; HUN17; HUN2; HUN3; HUN4; HUN5; HUN6; HUN7; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3, HUNH2; HUNH4; HuNhl;
HUNL1; HUNX4; HZ061226; HZ070105; Jiangsu-1; Jiangsu-2, Jiangsu-3;
Jiangxí-2; Jiangxi-4; 3LYS; JN; 3X1; 3X143; 3X2; JX-2; JX2006; 3X3; 3X4; JX5; JXA1; KS06: LC07; L3; LS06; LS-4; L.Y07; NB070319; SC07; SD; SD14; SDWF2; SH02; ST-7; SX.2007; SY0608; TJDMJ; TJZHJ2; TJZHJ3;
TQ; TQ07; TWO7; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG;
YNWS; YNYS; YNYX1; YNYX3; ZJ06; ZJCJ; Z3WL; ZX07; ZS070921. Meios descendentes, rnas nao se deve limitar aos mesmos, um isolado de vírus que se origina de qualquer um dos vírus de origem listados acima e que apresenta uma identidade de sequência de nucleotídeos de mais de 86%. 87%, 88%, 89%, 90%, 91%. 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% com a cepa de vírus de origem correspondente.
O termo vírus da PRRS Tipo II” significa, mas não deve se limitar a uma cepa de vírus da PRRS que é substanciaimente idêntica ao isolado de vírus depositado como ATCC-VR2332 ou qualquer descendente do isolado de vírus depositado como ATCC-VR2332. Substancialmente ídêníi30 ca. conforme usado neste relatório significa que a codificação de sequência de nucleotídeo para a proteína ORF5 situa-se entre 85% e 100% idêntica à sequência de nucleotídeo de isolado de vírus depositado como ATCC9/35
VR2332 e conforme definida na ID SEQ NO: 3, A sequência de nucleotídeo ORF5 é preferenciaImente maior que 86%, 87%, 88%, ou 89% idêntica a ID SEQ NO: 3. Ainda mais preferencialmente, a sequência de nucleotídeo ORF5 é maior que 90%. 91%, 92%, 93%. 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 5 maior que 99% idêntica a ID SEQ NO: 3. Preferencialmente, um vírus da
PRRS Tipo II conforme usado neste relatório é uma cepa de virus da PRRS que è substancialmente idêntica ao isolado do vírus depositado como ATCCVR2332 ou qualquer descendente do isolado de virus depositado como ATCC-VR2332 (conforme definido acima), mas não apresenta uma deleção 10 no gene NSP2 dos aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 534 a
562 de ID SEQ NO: 2. A sequência completa de vírus da PRRS ATCCVR2332 pode ser encontrada sob No, de acesso Gen&ank U87392,
O termo vírus da PRRS Tipo II deve também incluir qualquer vírus atenuado que se origina de qualquer uma das cepas de virus da PRRS 15 Tipo II acima mencionado. Por exemplo, o termo vírus da PRRS Tipo II deve também incluir vírus atenuado da PRRS Tipo II depositado como ATCCVR2495. Além disso, um vírus atenuado da PRRS Tipo II poderá ser qualquer descendente atenuado do isolado do vírus depositado como ATCCVR2332, Em algumas formas preferidas, o virus da PRRS Tipo II e um vei20 culo farmaceuticamente aceitável poderá ser vacina /nge/vac® PRRS MI..V (No. de série JA-A64A-149) de Boehringer Ingelheim Vetmedica, inc. (St Joseph. MO). O termo virus da PRRS Tipo II poderá também incluir os isolados conhecidos como HB-1; BJ-4; CH-1a; CH-1R; CH-1RQ1: HB-2; HN1; HT06; HZ07; LS05; LY03; NH04; PL97-1; S1; SH061130; SX071226; TW0725 1; WF03: XX03; ZJJ04; ZJJ05; ZJJ07, os quais são cepas da PRRS não-HP de Origem Chinesa.
Um outro aspecto da presente invenção proporcionado neste relatório, inclui um método de profilaxia de suíno de infecção com PRRS HP, método este que compreende administrar a um suíno com necessidade des30 te, uma composição imunogênica que compreende uma quantidade eficaz de um vírus da PRRS Tipo II, preferencíalmente, um vírus atenuado de PRRS Tipo II, em que o vírus de PRRS tipo II é uma cepa de vírus da PRRS
10/35 que é substancialmente idêntica ao isolado de vírus depositado cerno ATCCVR2332 ou qualquer descendente do isolado de virus depositado cerno ATCC-VR2332. Preferencialmente, esse vírus da PRRS tipo II nãe apresen ta uma deleçao no gene NSP2 dos aminoácidcs que corresponde aos ami5 uoácidos 534 a 562 de ID SEQ NO: 2, Ainda mais preferido que vírus da PRRS tipo II é vírus atenuado da PRRS Tipo II depositado como ATCC-VR2495, Além disso, o vírus da PRRS tipo II é aquele de vacina /nge/vac® PRRS MLV (No, de série JA-A64A-149).
Uma quantidade eficaz do vírus da PRRS Tipo II poderá ser uma quantidade do vírus que extrai ou é capaz de induzir uma resposta imune em um animal, para que a dose eficaz do vírus seja administrada, A quantidade que é eficaz poderá depender dos ingredientes da vacina e o programa de administração. Se um vírus ínativado ou uma preparação de vírus vivo modificado è utilizado, uma quantidade da vacina contendo aproximadamente 15 1O2:0 a aproximadamente 10*° TCIDSo (ponto final, 50% de dose infectante de cultura de tecido), mais preferencialmenfe, 10í 0 a aproximadamente 104 ° TCID^o, e, ainda mais preferencialrnente, de aproximadamente 104Λ< a aproximadamente 108OTCIDk por dose poderá ser recomendada.
O vírus da PRRS Tipo II neste relatório descrito poderá ser usa 20 do como um vírus morto total inatívado ou em uma forma atenuada de um virus da PRRS Tipo II para a profílaxia de suíno dos efeitos de uma doença de febre alta conforme descrita neste relatório. Além de subunidades, incluindo fragmentos imunogênicos ou frações do vírus da PRRS Tipo II, poderão também ser usados para a profílaxia de suínos dos efeitos de uma doença 25 de febre alta,
O vírus atenuado da PRRS Tipo II neste relatório descrito poderá ser uma vacina viva geneticamente modificada (modified live vaccine (MLV)) compreendendo uma ou mais das cepas notadas acima vivas em um veiculo farmaceuticamente aceitável. Além disso, ou alternativamente, vírus 30 inativados poderão ser usados para preparar vacina ínativada (vírus morto) (killed vaccine) (KV) conforme descrita acima. MLV poderá ser formulada para permitir administração de, entre 101 a 107 partículas viraís, rnaís prefe
11/35 rencíalmente, d© 10' a 10;> partículas vírais, e ainda, mais preferenaaimente, de 104 a 105 partículas víraís por dose. KV poderá ser formulada com base em um título de prè-inativação de, entre IO3 a 10k·, 104 a 109, 105 a 108, ou 10Q a 10f partículas víraís por dose.
O vírus da PRRS Tipo II. preferenciaimente, o vírus atenuado da
PRRS Tipo II poderá ser administrado a um porco antes da exposição do suíno a uma cepa do vírus da PRRS que causa PRRS HP, como um profiiático concomitante, com a exposição do suíno a uma cepa do vírus da PRRS que causa PRRS HP. ou como um tratamento, em seguida um suíno-alvo é 10 exposta a uma cepa do vírus da PRRS que causa PRRS HP. O suíno-aívo poderá exibir um ou rnaís sinais clínicos ou sintomas comuns de HP PRRS ou uma forma de doença de febre alta conforme descrita acima. Um suíno·· alvo poderá ser partícularmente soscetivel a uma doença de febre alta associada á PRRS HP. Um suino-alvo poderá ser partícularmente suscetível a 15 PRRS HP. O suíno-alvo poderá ser suscetível a PRRS HP devido a uma imunodeficiência. O suíno-alvo poderá ser suscetível a PRRS HP devido á granja onde o porco é criado. Um porco suscetível poderá ser criado em granja na China. O porco suscetível poderá ser criado em granja em uma província da China tal como a Província de Jiangxi, a Província de Hebei, ou .20 cidade de Shanghai. Ver Tian e outros, PloS ONE. 2007; 2(6):e526< cujo conteúdo são incorporados neste relatório corno referência. O virus atenuado da PRRS Tipo II poderá ser administrado via injeção, via inalação, ou via um implante, com injeção sendo partioularmente preferida. Dependendo da duração desejada e eficácia da vacinação ou tratamento, o Virus da PRRS 25 Tipo II, preferencialmente, o vírus atenuado da PRRS Tipo II, poderá ser administrado uma vez ou diversas vezes, também ínterrnitentemente. por exemplo, em uma base diária por vários dias, semanas ou meses e, em diferentes dosagens Dessas, uma administração de dose única é preferida. Injeção poderá ser perifericamente, ou sob uma veia central em uma quanti30 dade desejada, ou alternativa e continuamente infundida. O vírus da PRRS
Tipo II, preferencialmente, o vírus atenuado da PRRS Tipo lí. poderá ser administrado oral, parenteral, subcutânea, intramuscular, intradérmica, sub12/35 lingual, transdérmica. retal, transmucosamente, topicamente via inalação, administração via bucal, ou combinações destas. O vírus da PRRS Tipo íl, preferencialmente, o vírus atenuado da PRRS Tipo IL poderá também ser administrado na forma de um implante, o qual poderá permitir liberação lenta 5 do vírus atenuado. Para injeção intramuscular; urn volume de, entre 0,5 ml e ml.., mais preferencíalmente, entre 1 rnL e 2,5 mL, ainda mais preferencíalmente, entre 1,5 ml e 2 mL poderá ser aplicado. Uma injeção intramuscular de 2 mL é mais preferida. Para injeção intradérmica, um volume de. entre 0,05 mL e 1 mL, mais preferencialmente, entre 0.1 mL e 0,8 mL, ainda mais 10 preferencialmente, entre 0,1 e 0,5 mL, ainda, mais preferencialmente, entre
0.2 e 0,4 mL è administrado. Mais preferencialmente, uma injeção intradérmica de 0,2 mL poderá ser aplicada. Volumes de vírus da PRRS Tipo II de, entre 0,5 ml e 5 mL, mais preferencíalmente, entre 1 mL e 4 mL, ainda mais preferencíalmente, entre 2 mL e 3 mL poderão ser intranasaímente aplica15 dos. Mais preferencíalmente, um volume de 3 mL poderá ser intranasalmente aplicado.
O veiculo farmaceuticamente aceitável poderá incluir qualquer um. e todos os soiventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes estabilizantes. diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos. 20 agentes isotônicos, agentes retardadores de adsorção, e similares.
Adjuvantes conforme usados neste relatório podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo. Qu/7 A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GP1-0100 (Gatenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL·}, emulsão água-em-óleo. emulsão óleo25 em-àgua, emulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser baseada, em particular, em óleo de parafina líquida leve (Tipo Farmacopéia Européia); óleo ísoprenóide tal corno óleo de esqualano ou esqualeno resultante da oligomerização de alquenos. em particular, de isobutene ou deceno; ésteres de ácidas ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais partíoularmente, 30 óleos vegetais, oleato de etila. dí-(caprilato/caprato) propileno glicol, tri~ (caprilato/caprato) de glícenta ou dioleato de propileno gliool; ésteres de ácidos graxos ou álcoois ramificados, ern particular, ésteres de ácido isosteárí13/35 co, Utiliza-se o óleo em combinação com emulsificantes para formar a emulsão. 0$ emulsificantes são preferencíalmente tensoativos não-iônicos, em particular, ésteres de sorbitano, do manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácida oleíca, isos5 teárico, ricinoíeico ou hidroxiesteárico, os quais são apcionalmente, etoxilados, e copolímeros em blocos de polioxipropileno-polioxietíleno. em particular, os produtos Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter e outros, The Theory and Practical Application of Adjuvants (A Teoria e Aplicação Pratica de Adjuvantes) (Ed, Stewart-Tull, D. E. S.) John Wiley and Sons, Nl, pp. 5110 94 (1995) e Todd e outros, Vaccine 15: 564-570 (1997).
Por exemplo, é possível utilizar a emulsão SPT descrita na página 147 de Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach editada por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 desse mesmo livro.
Um exemplo adicional de urn adjuvante é um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico ou metacrílíco e os copolimeros de anidrido mateico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são os polímeros de ácido acrílico ou metacrilico que são reticulados, especialmente, com éteres poliaíquenílicos de açúcares ou poliálcoois. Esses com20 postos são conhecidos peio termo oarbômero (Phameuropa Vol. 8, No. 2;
Junho de 1996). Aqueles versados no estado da técnica podem também se referir a Patente dos Estados Unidos No. 2.909.462, a qual descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hídroxilado que apresenta pelo menos 3 grupos hidroxila, preferencíalmente, não mais de 8, os 25 átomos de hidrogênio, de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados que apresentam pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinílas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados poderão ss próprios conter outros substituintes, tai 30 como metíla. Os produtos vendidos sob o nome de Carbopof (BE Goodrich,
Ohio, USA) são partícula rmente apropriados. São reticulados com uma sacarose de alila ou com pentaeritrítol de alíla. Entre estes, poderão ser mencio
14/35 nados Carbapol 974P, 934P e 971P. Mais preferido é o uso de Carbopo/ 971P. Entre os copolímeros de anidrido maleico e derivado de alquenila, os copolímeros EMA (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maleíco e etileno. A dissolução desses polímeros em água leva a uma solução ácida que será neutralizada, preferencialmente, com pH fisiológico, a fim de fornecer a solução adjuvante para que a composição imunogènica, ímunolôgica ou vacina, si própria seja incorporada.
Adjuvantes adicionais adequados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, acetato de a-tocoferol, o sistema adjuvante RI BI (Ribi Inc.), 10 copoiimero em blocos (Cyffòc Atlanta GA\ SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lipideo A, adjuvante lipídeo-amina Avridine, enterotoxins termolábil de E coli (recombinante ou de outro modo), toxina dã cólera, IMS 1314 ou muramil dipeptídeo, entre muitas outras.
Preferencíalrnente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade 15 de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 10 mg por dose. Ainda mais preferencíalrnente, o adjuvante è adicionado em uma quantidade de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 10 mg por dose, Ainda mais preferencíalrnente. o adjuvante è adicionado em uma quantidade de aproximadamente 500 pg aproximadamente 5 mg por dose. Ainda mais preferen20 cíalmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de aproximadamente 750 pg a aproximadamente 2,5 mg por dose. Mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de aproximadamente 1 mg por dose.
Também proporcionado neste relatório é um método de produ25 ção de um vírus atenuado da PRRS Tipo II que é capaz de tratar ou imunizar um suino-alvo contra PRRS HP. O método poderá compreender uma ou mais das seguintes etapas: (a) passar ATCC-VR2332 ou qualquer PRRS Tipo II substancialmente idêntica a ATCC-VR2332, conforme descrito abaixo. para modificar e tornar o vírus avirulento e capaz de imunizar o suino30 alvo contra PRRS HP, (b) colher as células de vírus de produção ou cultura celular, (c) adicionar um agente estabiíizante à cultura de vírus de produção; e/ou (d) liofilizar a cultura de vírus de produção. Passagem do virus poderá
15/35 abranger técnicas de propagação clássica e seleção; por exemplo, propagação continuada em células hospedeiras adequadas para prolongar o fenótipo atenuado. Passagem poderá resultar em uma cepa viral que apresenta mutações adquiridas, muitas das quais não alterarão propriedades da cepa de 5 origem, significativamente. O vírus atenuado da PRRS Tipo II poderá ser o resultado de ATCC-VR2332 ou qualquer PRRS Tipo II substancialmente idéntico a ATCC-VR2332 tendo sido passado pelo menos 60, 65, 70, 75. 80, ou mais vezes em uma célula hospedeira. O vírus atenuado PRRS Tipo II poderá ser o resultado de ATCC-VR2332 ou qualquer PRRS Tipo II subs10 tancialmente idêntico a ATCC-VR2332 tendo sido passado entre 50 e 100 vezes, entre 60 e 90 vezes, entre 70 e 80 vezes, ou entre 65 e 75 vezes em uma célula hospedeira. O vírus atenuado PRRS Tipo II poderá ser o resultado de ATCC-VR2332 ou qualquer PRRS Tipo II substancíalmente idêntico a ATCC-VR2332 tendo sido passado 70 ou 75 vezes em uma célula hospedei15 ra. Uma célula hospedeira adequada poderá incluir uma linhagem celular simiana, células Vero, ou macrõfagos alveolares de suínos. Uma linhagem celular simiana preferida é MA-104. A célula hospedeira poderá ser uma cultura celular. A linhagem celular poderá ser infectada com o vírus que deve ser passado. Cada passagem poderá exigir sncubação da linhagem celular 20 ou cultura celular infectada por vírus resultante sob urna temperatura entre
34*0 e 4ü'C, mais preferencialmente, entre 35°G e 39*0, ainda mais preferencialmente, entre 36X e 38X, e, ainda mais preferencialmente, entre 35eC e 37*0. Mais preferencíalmente, cada passagem poderá exigir incubação da linhagem celular ou cultura celular infectada por vírus resultante sob 25 uma temperatura de 37Í?C. A etapa de colheita poderá inciuír congelamento da cultura celular infectada por virus. Liofilização poderá incluir sublimação de umidade de uma amostra congelada da cultura celular infectada por vírus
Modificação do vírus poderá também ser usada para produzir 30 um virus atenuado da PRRS Tipo II e poderá ser obtida por mutação direcionada da sequência de ácido nucleico da cepa de vírus por meio de técnicas de engenharia genética adequadas. Tais técnicas poderão empregar
16/35 construção de uma cópia completa de ácido nuclerco complementar do genome viral que poderá ser modificado por métodos de recombinação e manipulação de ácido nucieico Tais métodos poderão empregar mutagênese direcionada a sitio. Sítios antígênicos ou propriedades enzímáticas de prote5 ínas virais em seguida, portanto, são modificados.
Também proporcionado neste relatório é um kit para realização de qualquer um dos métodos precedentes descritos. O kit poderá compreender um recipiente, uma composição ímunogênica, preferencialmente, compreendendo vírus atenuado da PRRS Tipo II, um veiculo farmacêutica10 mente aceitável um adjuvarrte, e instruções de administração da composição ímunogênica a um animai com necessidade deste, a fim de reduzir a incidência de, ou gravidade de sinais clínicos ou efeitos de infecção por PRRS, e preferencialmente, formas da doença de febre alta de PRRS ou PRRS- HP, O kit poderá adíoionalrnente compreender um meio de injeção e/ou 15 um meio de outra forma de administração. O kit poderá ainda adicionalmente compreender um solvente, A vacina atenuada poderá ser seca por congelação e poderá ser reconstituída com o solvente, resultando em uma solução para injeção e/ou inalação. O solvente poderá ser água, solução salina fisiológica, tampão, ou um solvente de adjuvante. O kit poderá compreender re20 cipientes separados para conter o vírus atenuado, solvente, e/ou veículo farmaceuticamente aceitável. As instruções poderão conter um folheto e/ou um rótulo afixado a um ou mais dos recipientes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 é uma representação de como pulmões foram classifi25 cados e avaliados em relação á porcentagem de área afetada por pneumonia visível:
A figura 2 é um gráfico comparando a temperatura retal de suínos em grupos vacinados e não-vaoinados;
A figura 3 é um gráfico ilustrando uma comparação da razão 30 média S/P de suínos em grupos vacinados e não-vaoinados, em que a razão média de grupo ELISA S/P foi utilizada para medir uma resposta sorológica do grupo respectivo a PRRSV;
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A figura 4 é um gráfico ilustrando uma comparação de escores clínicos médios de grupo de suínos em grupos vacinados e não-vacinados, em que escores de doença respiratória de grupos vacinados e nãovacinados de suínos foram registrados;
A figura 5 é um gráfico comparando o ganho de peso diário médio (ADG) de suínos em grupas vacinados e não-vacinados; e<
A figura 6 é um gráfico ilustrando um resuma da porcentagem de soros positivos de PRRSV de TR-RCP em suínos vacinados com MLV e suínos de desafio não-vacinados,
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
DEFINIÇÕES
A terminologia usada neste relatório é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não pretende ser limitative. Conforme usadas no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas 15 singulares um”, ”uma”, e e u, ’’a” incluem referências em plural, a não ser que o contexto claramente dite de outra maneira,
Para a recitação de faixas numéricas neste relatório, cada número intervenente aqui, entre com o mesmo grau de precisão é explicítamente considerado. Por exemplo, para a faixa de 6-9. os números 7 e 8 são consi20 derados, além de 6 e 9, e para a faixa de 6.0-7,0, os números 6,0. 6,1, 6.2,
6,3. 6,4. 6,5, 6,6, 6.7, 6,8. 6.9 e 7,0 são explicítamente considerados.
’’Virus atenuada” conforme usado neste relatório poderá significar um vírus avirulento que não causa sinais clínicos de doença da PRRS, mas é capaz de induzir uma resposta imune no mamífero-alvo, mas poderá 25 também significar que os sinais clínicos são reduzidos em incidência ou severidade em animais infectados com o virus atenuado em comparação com um ’’grupo de controle'' de animais infectados com virus não-atenuado de PRRS e não recebendo o vírus atenuado. Neste contexto, o termo reduzir/reduzido” significa uma redução de pelo menos 10%, preferencialmente 30 25%, ainda mais preferencíalmente 50%, mais preferencialmente, de mais de 100% quando comparado com o grupo de controle conforme definido acima.
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Fragmento imunogênico” conforme usado neste relatório poderá significar uma porção de sequência de peptídeo ou polípeptideo ou ácido nucleico de vírus da PRRS Tipo II que pode induzir uma resposta imune no hospedeiro, incluindo uma resposta imune celular e/ou mediada por anticor5 pos para PRRSV.
Idêntica ou identidade conforme usada neste relatório no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeos ou nucleotídeos, poderá significar que as sequências apresentam uma porcentagem especificada de resíduos ou nucleotídeos que são os mesmos sobre uma região especifica10 da. A porcentagem poderá ser calculada alinhando, otimamente, as duas sequências; comparando as duas sequências sobre a região especificada, determinando o numero de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas às sequências para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posi15 çôes na região especificada e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade da sequência. Em casos, em que as duas sequências são de diferentes comprimentos ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades alternadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma sequência única, os resíduos de sequência única são incluídas 20 no denominador, mas não no numerador do cálculo.
Isolado de ATCC VR-2332 de PRRS foi depositado com a American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, de acordo com o Tratado de Budapeste ern 7 de julho de 1992. e fornecido o No. de acesso ATCC VR-2332.
isolado de VR-2495 de PRRS foi depositado com a American
Type Culture Collection in Rockville, Maryland, de acordo com ο Tratado de Budapeste em 28 de janeiro de 1995, e fornecido o No. de acesso ATCC VR-2495.
Composição imunogênica ou vacina conforme usada neste 30 relatório, significa uma composição que compreende vírus da PRRS Tipo II (MLV ou vírus morto ou qualquer fragmento imunogênico ou fração deste, preferencíalmente, vírus atenuado da PRRS Tipo II, tal como Ingelvac PRRS
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MLV ou Ingefvac PRRS ATP, o qual induz uma resposta imunológica no hospedeiro do uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos para PRRSV. Preferenciaímente. essa composição imunogênica é capaz de conferir imunidade protetora contra infecção por PRRSV e os sinais clínicos as5 sociados a este.
'‘Para induzir uma resposta imunológica ou resposta imune conforme usada neste relatório entende-se qualquer resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos para uma composição imunogênica ou vacina administrada a um animal que recebe a composição imunogênica ou vacina. U10 sualmente, uma ’’resposta imune inclui, mas sem se limitar a mesma, um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxícas e/ou células T yd, direcionadas específicamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferencialmente, o hospe15 deiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protetora, tal que resistência a nova infecção será acentuada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida em comparação com controles que não receberam uma administração da composição imunogênica ou vacina. Tal proteção será demonstrada por uma redução na incidência de, ou gravidade de até e, incluindo uma falta 20 dos sintomas associados a infecções hospedeiras conforme descritas acima.
Imunidade protetora conforme usada neste relatório entendese que a resistência em um grupo de animais a uma infecção com PRRS, preferencialmente, PRRS HP será acentuada em comparação com um grupo de controle de animais infectados com PRRS HP, mas nâo recebendo 25 uma PRRS preferenciaímente, PRRS tipo II contendo uma composição imunogênica ou vacina. O termo resistência acentuada conforme usada neste relatório significa que menos de 10%, preferenciaímente, menos de 20%, ainda mais preferenciaímente, menos de 30%, ainda mais preferencíalmente, menos de 40%, ainda mais preferenciaímente, menos de 50%, ainda 30 mais preferenciaímente, menos de 75%, ainda mais preferenciaímente, menos de 100% dos animais que receberam a composição imunogênica ou vacina da invenção desenvolvem um ou mais sintomas clínicos associados à
20/35 febre alta, preferencíalmente, causada por PRRS HP conforme descrita nes te relatório, quando comparados com um grupo de animais infectados corn PRRS, mas não recebendo a composição imunogênica ou vacina.
’‘Substancialmente complementar conforme usado neste relato5 rio poderá significar que uma primeira sequência è de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleotídeos, ou que as duas se10 quências híbridizam sob condições de hibridização rigorosas.
’‘Substancialmente idêntica conforme usado neste relatório poderá significar que uma primeira e segunda sequências sâo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticas sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. 15, 16. 17, 18, 19. 20, 21, 22, 15 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleotídeos ou amínoácidos, ou com relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência é substancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.
Suíno”, ’’porco e leitão conforme usados neste relatório pode20 ráo ser usados íntercambiavelmente.
Vacinar” refere-se à administração da composição imunogênica ou vacina descrita neste relatório, antes de exposição às formas de doença de febre alta de PRRS ou PRRS-HP.
Proteger ou proteção refere-se à redução na severidade de, ou incidência de sinais clínicos de infecção por PRRS-HP ou formas de doença de febre alta de PRRS como um resultado de recepção de uma administração da composição imunogênica da presente invenção. A redução na severidade de, ou incidência de, è em comparação a um animal ou grupo de animais não recebendo a composição imunogênica da presente invenção.
MODALIDADES PREFERIDAS
Os exemplas seguintes apresentam materiais e procedimentos preferidos, de acordo com a presente invenção. Embora quaisquer materiais
21/35 e métodos similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos preferidos, dispositivos, e materiais são agora descritos. Deve-se entender, contudo, que esses exemplos são proporcionados por meio de ilustração ape5 nas, e nada a este respeito deve ser considerado uma limitação sob o escopo total da invenção.
EXEMPLOS
Os exemplos identificados abaixo ilustram a natureza altameníe virulenta de isolado JX143 de PRRSV. Porcos vacinados com MLV Ingel10 vac® de PRRS apresentam 100% de sobrevivência e: significatívamente, maior resposta a anticorpos, menor proporção de PRRS clinica e viremia, lesão pulmonar menos grave, sinais clínicos mais raros, leves e mais breves, e um período menor de temperatura retaí alta quando comparado com porcos não-vacinados após desafio com uma cepa do PRRSV attamente virulenta.
1, Materiais e métodos
1.1 Vacinas e vírus
Vacina MLV /nge/vac<8> PRRS (No. de Série JA-A64A-149) foi de Boehringer Ingelheim Vetmedioa. Isolado JX143 de PRRSV aítamente virulento foi isolado por Shanghai Veterinary Research Institute. Gaitara de tecí20 do de JX143 PRRSV (105.2TCID50/ml) foi diluída cinco vezes com DMEM para inoculaçâo de porcos.
1.2 Iniciadores e reagentes
Polimerase de transcrição reversa e marcadores de DNA (DNA ladder”) foram adquiridos de Companhia de Biotecnologia Tiangen. Mistura 25 2xRCP foi de Companhia Dongsheng. Trizel® e iniciadores foram de Companhia Invitrogen.
Tabela 1. Iniciadores usados para amplificação de TR-RCP
I Nome do 1 Sequência iniciador j
J (intciader/I | SFCTGATC^CCTCAAAAGAGTTOTGC^G -3’ (ID SEQ NO: 4)| [ SRI5497 T'5^ CAATTAA^^ SEQ NO: 5)| j Qsf ~ P- gaSs^asSdcgag^^aanTrTn'T't'lUTlT· -3' (ID SEQ NO: 6) j
1.3 Fonte e agrupamento de animal
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Cinquenta (50) porcos, 29 dias de idade foram adquiridos para o ensaio de granja de suínos reprodutores Henan Muyuan. Foram confirmados negativos para PRRSV e PCV2 por meio de TR-RCP (de PRRSV & PCV 2) e ELISA (um kit anti-PRRSV, IDEXX Laboratory, ínc.) processando cada um 5 dos três testes em amostras de soro coletadas na chegada. Os porcos foram pesados e aleatoriamente designados a grupos 1,2, ou 3, cada um contendo 22, 14 e 14 porcos, respectívamente. Os porcos foram em seguida alojados em salas separadas de acordo com seu grupo.
1.4 Vacinação e desafio viral
Os 22 porcos no grupo 1 (V/C) foram vacinados em 0 dia com uma única dose de 2 mt. de vacina ML V Ingelvac® PRRS íntramuscularmente. Os 14 porcos no grupo 2 (não-V/C) foram injetados com 2 mL de PfôS em 0 dia. Desafio de porcos do grupo 1 e grupo 2 ocorreu em .28 dias com a administração intranasal de 3 ml de JX143 PRRSV diluído. Os porcos no grupo 3 (não-V/nâo-C) não foram vacinados e não desafiados oomo controle negativo rigoroso e foram injetados com 3 mL de DMEM em 28 dias. Dois porcos por grupo foram submetidos à necropsia em 14 e 42 dias, respectsvamente, para observação. O restante dos porcos foi submetido à necropsia em 49 dias.
1.5 Temperatura retal
Temperatura retal foi registrada ao mesmo tempo todos os dias de 0 dia a 49 dias (21 dias pós-desafio).
1.6 Sorología
Soros foram coletados em dias 0, 7, 14, 21, 28, 32, 42, e 49 de todos os porcos e testados para anticorpo anti-PRRSV usando um kit ELISA IDEXX PRRSV.
1.7 Avaliação clinica
Qs porcas foram monitorados diariamente a partir de 0 dia a 49 dias e classificados em relação à gravidade de alterações comportamentais 30 e sinais clínicos respiratórios, incluindo respiração e tosse. O sistema de classificação de sinais clínicos é mostrado na tabela 2.
Tabela 2. Sistema de classificação de sinais clínicos.
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| Severidade de sinais clínicos | Aspecto de classificação | ||
| Respiração* | Comportamento* | Tosse* | |
| Normal | ””...........Ί.....’.................... | 1 | 1 |
| Ligeiro | 2 | 2 | 2 |
| Grave | 3 | 3 | 3 |
| Morte | 4 ......................... | 4 | 4 |
‘Respiração: Escore 2 (Ligeiro) corresponde à respiração superficial. descarga nasal, respiração abdominal palpitante quando estimulada. Escore 3 (Grave) corresponde à respiração rápida e superficial, descarga nasal, respiração bucal, respiração abdominal palpitante.
*Comportamento. 1. Pele da boca, nariz, orelhas e parte interna das patas ficam vermelhas, congestão, pontos vermelhos, pápula 2. Deprimente, pêlos arrepiados. 3, Anorexia 4. Claudicação, tremor, convulsão 5. Emaciado. Escore 2 corresponde a um ou dois itens de sintomas conforme descritos acima. Escore 3 corresponde a três itens ou sintomas acima con10 forme descritos acima, *Tosse: Escore 2 corresponde à tosse não-produtiva. Escore 3 corresponde à tosse produtiva.
1.8 Avaiiação de produtividade
Peso de todos os porcos foi registrado em 0 dia (antes de vaci15 nação), 28 dias (antes de desafio), 49 dias (21 dias pós-desafio),
1.9 Eficácia de MLV tngeívac® P.RAS foi analisada por avaliação dos sinais clínicos, escores de lesão pulmonar e temperatura retal seguindo desafio em porcos vacinadas quando comparado com o controlei de desafio e grupos de controle negativo. Os porcos foram considerados ser clinicamente afetados por PRRS quando: 1) temperatura retal alta (4ΓΟ) por mais de 3 dias, 2) depressão, anorexia, conjuntivite, tosse, doença respiratória, e 3) pneumonia foram evidentes.
1.10 Lesões pulmonares
Necropsia foi realizada em 49 dias (21 dias após desafia de PR25 RSV). Para cada porco, os pulmões foram avaliados por porcentagem de área (0 a 100%) afetada por pneumonia excessivamente visível (edema, congestão, hemorragia, estrutura fibrosa carnosa e firme) em uma forma
24/35 cega.
1.11 Detecção e quantificação de RNA do PRRSV
Soros forarn coletados de porcos no grupo 1 (V/C) ern dias 0, 7, 14, 21, 28, 32, 35, 42 e de porcos no grupo 2 (não-V/C) em dias 28, 32, 35 e 5 42. Extração de RNA de 140 pl de amostras séricas individuais foi realizada usando um mini A/t RNA viraí QfAarnp (Q/AGEM). TR-RCP foi em seguida realizada usando combinações príme-sonda (Invítrogeri) (Tabela 1) específicas para a região conservada de RNA de PRRSV(GenbanA).
Cada reação de TR consistiu ern 12,5 pL do template de RNA, 4 10 pL de dNTP, 2 pL de 10 x tampão, 0,5 pL de iniciador Qst e 1 pL de transcriptase reversa Quant A mistura foi incubada em banho de água a 37C por hora e armazenada sob -20cC, RCP foi em seguida realizada usando 1 pL da reação de TR, 1 pL de cada um de íniciadores SF14413 e SR1549. 2 pL de 10 x tampão, 2 pL de dNTP, 5 unidades de polirnerase rTaq e àgua a um volume total de 20 pL A píaca de reação foi processada em um sistema de detecção de sequência sob condições específicas (944’C por 5 minutos; em seguida 40 ciclos de 94t!C/30 seg., 65nC/30 seg... 72*C/75 seg., 40 ciclos; finalmente 72°C por 10 minutos). O fragmento amplificado de RCP foi separado por meio de gel de agarose e detectado sob luz ultravioleta.
1.12 Imunoistoquímica para detecção de antígeno de PRRSV.
Realizou-se imunoistoquímica para defecção de antígeno específico a PRRSV em seções de tecido pulmonar fixado em formalína e embebido em parafina produzido dentro de 48 horas após necropsia usando anticorpo monoclonal anti-N-proteína de PRRSV (SR30 ou SDOW17) e antícor25 po conjugado secundário.
Resultados
2.1 Alteração na temperatura retal pòs-desafio.
Seguindo inoculação com o PRRSV JX143 altamente virulento. temperatura retal em porcos de ambos os grupos vacinados e o grupo não30 vacinado rapidamente aumentou. A temperatura de pico fui de 4ΓΟ e 75% dos porcos estavam febris imediatamente após inoculação do vírus de desafio. Temperaturas retaís declinaram a níveis pré-desafio dentro de 10 dias
25/35 nos porcos vacinadas enquanto porcos no grupo não-V/C apresentavam um período febril mais longo e temperaturas retais elevadas estavam presente sígnificativamente por mais tempo (figura 2).
2.2 Resposta sorológíca.
A reação ELISA S/P de grupo médio foi usada para medir uma resposta sorológíca do grupo respectivo para PRRSV (figura 3). Os porcos de controle negativo permaneceram negativos para anticorpos PRRSV em todo o estudo. No grupo V/C, o anticorpo foi prímeiramente detectado em 1014 dias pós-vacínação, e razão S/P > 0,4 ocorreu em 14 dias pós-ínoculaçao 10 (p.i.) com 8 de 20 porcos positivos, e em 21 dias p.i., 13 de 20 porcos foram positivos no grupo V/C. A razão mais alta S/P no grupo V/C foi observada apôs desafio e permaneceu alta até o fim do estudo (ELISA S/P =» 2). Gs porcos não-V/C soroconverteram rapidamente após desafio; em 7 dias p.i. 9 dos 12 porcos foram positivos com razão S/P > 0,4.
2.3 Sinais clínicos.
Os escores de doença respiratória do grupo V/C e do grupo nãoV/C foram registrados (figura 4). Seguindo desafio, 5 dos 20 porcos no grupo V/C exibiram sinais respiratórios e tosse, e 2 porcos exibiram respiração abdominal “palpitante. Oito dos 12 porcos no grupo não-V/C morreram antes 20 de 21 dias p.i., e os porcos restantes ao grupo não-V/C mostraram sinais respiratórios graves e tosse com respiração abdominal palpitante. Os porcos nâo-V/C classificados acima de 6, consecutivamente, por 10 dias e o escore mais alto atingiu 7. Os porcos V/C não apresentam sinais clínicos signíficaíivos e seu escore médio alto foi na faixa de 4-5 por 7 dias consecu25 fives. Como controles negativos rigorosos, os porcos não-V/não-C mostraram nenhum sinal clinico e seu escore médio foi de 3 (normal).
2.4 Ganho de peso diário médio pré e pós-desafio
O ganho de peso diário médio (ADG) é resumido na figura 5. A partir de 0 dia a 28 dias, o ADG não foi sígnificativamente diferente entre os 30 porcos vacinados (0,3301 ± 0,0414 Kg) e porcos não-vacinados (0,3008 + 0,0653 Kg). A partir de 28 dias (dia antes de desafio) a 49 dias, os porcos vacinados apresentavam um ADG similar como os porcos de controle não
26/35
V/não-C (0,3373 ± 0,0800 kg vs. 0,3484 ± 0,0890 kg) enquanto os porcos não-V/C apresentavam bruscamente um ADG muito inferior (0,0392 ± 0,2398).
2.5 Eficácia de vacinação
Seguindo desafio, os porcos vacinados corn MLV exibiram sinais clínicos brevemente após desafio com um escore médio de sinal clinico de 5, e mais de 3 porcos apresentavam temperatura reta! alta (41 rC) e lesões pulmonares. Conforme definido peios critérios mencionados na seção de métodos, 254½ (5/20) dos porcos vacinados com MLV apresentavam PRRS e 10 75% (15/20) dos porcos foram protegidos. Em contraste, todos os porcos não-vacinados apresentavam PRRS após desafio e 8 porcos morreram antes de necropsia.
de vacxr^ção com Mby
Grupo
| | Porcos I desafiados | Porcos mortos | Porcos doentes | Resultado de desafio | |
| MLV-V | j 20 | 0 | 5(25%) | I 100% de sobrevivência |
| Não- | I 12 | 8 | 12(100%) | i 33% de sobrevivência |
| v/desafio | í | f ::: 7 |
2.6 Lesões Macroscópicas.
Sob necropsia, os quatro porcos sobreviventes no grupo nãoV/C apresentavam lesões macroscópicas, incluindo ínsuficiência/colapso pulmonar, cor parda mosqueada (mottled tari), congestão, linfonodos de virilha, papada, edema e congestão do mesentério, e necrose hepática em alguns. Alguns porcos no grupo V/C apresentavam lesões similares, porém 20 menos graves. Os porcos de controle não-V/não-C não apresentaram lesões macroscópicas.
2.7 Escores de lesões pulmonares macroscópicas
O escore de lesão pulmonar macroscópica de porcos vacinados com MLV foi significativa mente menor que aquele dos porcos não-V/C, su25 gerindo que MLV proporcionou boa proteção contra inoculação de PRRSV alta patogênica (tabela 4, na qual a faixa para a incidência de lesão pulmonar macroscópica é de 0 a 100%),
27/35
Tabela 4, Comparação de gravidade de lesão pulmonar macroscópica em porcos de diferentes grupos
| Dia pós-vacinação | Grupo | ||
| MLV-V/C | Não-V/C | Nâo-V/não-C | |
| 14 | 0,500 ± 2,00 | 0,30 ±2,30 | |
| 42 | 28,58 ± 16.15 | 75,25 ±7,27 | 0,25 ± 1,00 |
| 49 | 19,12. ±8,37 | 69,6 ± 12,97 | 0,30 ± 0,50 |
2.8 Detecção d e virem ia
A porcentagem de soros positivos de TR-RCP de PRRSV é re5 sumida na figura 6, Viremia foi detectada em 60% de porcos vacinados com
MLV, 7 dias pós-vacínação, a qual declinou a 20% antes de desafio, Pósdesafio, 70% dos porcos vacinados apresentavam viremia, a qual declinou a 60% em 7 dias p.l. e 20% foram virêmicos em 21 dias p.í. Em contraste, 100%? dos porcos nâo-V/C apresentavam viremia seguindo desafio, viremia 10 permaneceu alta seguindo desafio, e 70% dos porcos não-V/C foram virêmicos em 21 dias pós-desafio,
2.9 Detecção de antlgeno por imunoistoguímica.
Observou-se lesão pulmonar microscópica sob um microscópio.
Células infectadas por PRRSV foram observadas em todos os porcos άθεοι 5 fiados. Os porcos com MLV-V7C apresentavam menoscéfulas infectadas por
PRRSV. Os números de células totais e células infectadas por PRRSV foram registrados em diferentes areas. A razão de infecção celular diferiu significativamente entre os grupos: 23,34 ± 4,691 em relação a porcos nâo-V/C, 9,36 ± 8,069 em relação a porcos V/C e 0.24 ± 0,114 em relação a porcos não20 V/não-C (tabela 5).
Tabela 5 Células infectadas por PRRSV através de ímunoistoquimica de
| Razão de células infecta- | Grupos | ||
| das por PRRSV | MLV-V | Não-v/desafio Ϊ | Não-v/não-c ; |
| % | 9,36 ± 8,069 | 23,34 ±4,691 | | 0,24 ±0.114 | |
.28/35
Sequénctas
ID SEQ NO: 1 (Sequência de JX143, GenBank EU708726) i y<JÍ.Çft r.ÇÇC” Gt.ÃtÇGC3Cg
6.· «óXàíttsct ç,g<íg<^^Axi<:
ÇÔAtt-tçr.ât tgT.Oa'J Jà§C v^t^âGGat.íl· «íce.t e.c.t<jr r.r ôa^çjg^A
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29/35 y<
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30/35
31/35 $261 aatccggtg atgtgtttxa -gaggaggt cat^ttagca cagacgagtg
7.321 agaactggcg accctgtcga crrr.gar.cct gagacaggga ttcagtgtgg 7381 attgaagaca «ggt;:cacaa tgtotiCACv· rcceoatctg gEagcagat»: 7441 grcaarrccg .sgaaLagaag agccícagtgg gaagGoqcc'a agcí. t.1 <:;:«t. 1601 <’ttggcaxga tgaacgΐ.C\j« cggcgaacv-J acxçcq-aaeg aactgyagaa 7S61 ataattggca aacxccaggg cctg^ctaag gagcagtgtt taaactgcta
7621 gctKgacccg ctgtggicgc gqcggcttag ttgttsctga gacagcggta * l. aatttcacaa c<?ggaccttc accctaqgac ctgtgaact l aaaagtggoc 774': agetaa-saga cgcggrtgag cacaacGaaG a :.cGqqttgc cagaccggtf: 7351 l ^gtgctcct gcgctcrgca grtccttcgc- ttatagatgt cctgatctcc 7861 cãtctccraa gttactcgcc cqGoacaag- cgggaaacas tgggactgat 7321 gggattttga ggccqaggct. actsaaqaqq asgstgicaot aagtgcgeaa 7 331 etcgcgatat taggqgcggo gacgggggtg aaattggtct cccctataag 304 1 ttaggggcaa rcctgagcgg gtaaaaggag ttttacagaa t.acaôggtt.t. 83 01 cttãcsãsac ccccagtgac acrggaaqcG r.ggtgcacgc ggctgcctgc Siei a^gctactcc ggr.gactqat gggcgctccg rettcgctac aaecatgccc 8221 aq·: Eqratqt gccgaccsΓt ecaqcgtccg tccttgstta tcr.r.qatt;;t 8281 gccctaaaca gtfcaacagag cacgg?:r.qtq aqgatgctgc attaagaqac 8341 atgatttgtc cacccaaggc tttgttEEgc ctggaqttcE cgcctcgsg $401 r.gttcgccca cgtgggraag r.grccgcccg rtcsrcggcc ~rccacttsc 3481 ALLcLoLggc. rggaataãsst: gggascaggt ttccaaceaa ggacaÉfccag 8r.'.'.! a?.atcgacgt ícítg^gcgçr· <*«ggc7ggc gagaaazsçig gcaa«vf.gtt $$31 ccct.caagaa ací:gL<K'£gt gggaagacgA cgqoLaggac aara~t.t.ggc 3641 fccatcgcgí-t ggcccatcgg gcagcgttga gtggígLtac ccagggctte 87Q1 cgt-tcaactte. gcccatcgcc crcgggaaaa asaaat-taa ggagctraaaa $761 taggcaggtg ccrrgaagct gatcttgcgt cccgcgatcg arccacaccr ί>δ.·Λ gc.7ggí7\'gc qgqqas'.ciS c^latgaac tqgceLgígc tgaqgagq^t. 3831 «cgtgctgaa eígctgccãc gaet:i:.ac.'tgg ΐcacgcag·:c cggegeggtg 884'1 gtggcctgrc grcfcggcgac cegar.raccí' crgt.gt.caaa r.acc«t:rrac. $lílíl t.at.at.gcaca. geAcargglq d.cagt.LAd. rcaaaagí.gg iGaílcct.caL Ό061 tLctgcaaga ccagcts^ag sxtgaggaca tgcteaaggt tcaaoccctg 9121 cggacgaccr. -igtgctgCat. gccgaqt.cte cetccasgcc aaactaecae 3181 aacatctgad tcttatgctg ggtttecèga cgçacccaaa gaagacstacc $e/41 caircat.cat.t. c<?t.aggrrgc aggat.aaLaa aLqqgcgcca gcragt.cccL 3301 ggatcor.ogc ggcccLcgcc raocacatga aggcaagrsa tgt.tr.c^gaa 9361 cggcggctgc aatactcatg gacagcrg»: cttgtttaga gtatgatcst 34.71 aagagctcgt. ggtAgggaíç gcgcagigcg cccgcaagga cggatacagc 3131 caccgi;icct cttgt-ccaLg rgggaaaaac tcaggiccaa ccatqagggg 3541 gaatg-:gegg gtactgcggg gccecggcta cgtacgccac tgccrgtggt 3631 gtgtttacca cacccacttc caccagcatc qtcctgttaE aatctggtgt 30c 1 cgggtvCxgg tt.ct:t:qagt. gagcgcgaac ccccccxagg aaaaggcaca ggagtgcctt gcarafitacc ;: ttggtcccc g g '3 -',:ϊ« g
Avtgaaaaga gccgcgagcg aaaa e. agt- i>a a g tg agg 1.1. g gatggtggtg ggcgctgar.g ggcacgcttt ataatacagg i: »:gtacccvg ggagacatae ct.racgc.c.t.a Ectggctttg agqcctgac’: ctctccaagt cggaagracc actgctaaga a q oq'. :>j í.. ... L q avcccttgtã accaaL aact atgaaaaaag gcccaggtcc gea a f. Έ g r. cc ctaccgt-cgt acraagaagg aget : agtga gq;:xttcLgt atcgtgtatfc t.gq5.gqgt.t.q atcàcagact aaccgtgaca tactacgcct. gaatggfcttg v 11 cc:Lgg cc aagaagt cca· ctcgatgtct ggccacccgq agccctctaq
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34/35
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ID SEQ NO: 2 (NSP2 de VR2332, No. de acesso SwfSsProt Q9WJB2)
i. gAg/.FAPF.AF SUAaAa VAGK AIZsVREFRQA XEHEVAÍiAl-íX AEHAíKRYSFP AaG^UGWRCI
SA XAifFMViiS XIUXTLPEPV RPFCPWATDE. r.?l.\A4A.T.Ç'.'LB IPAAXsDRFcQA CT5AKYVLK*.
121 EGEHWTVTVT PGMSPSLLPL SCVCGCCGHK GGLGSPSAVE 'ZSGFCPACLD RLAEYMHLPS
181 SAIPAALAEM SGDSDRSASP VPTVWTVSQF FAFHSGGNHP DQVPLGKTIS LCQVf EDCCC
241 SÇtíXrNSVTF EEVAAXÃOtY LRGAÂKLEEC LARLEKAHPP RVXDTSFDWO WLEGVEAAT
301 CTXHAPOVJÍQ CFÂLVPWiC XSLGNNSVPL TAFSLAKrVY RAQGD£VH«P EPLTAVLSKL
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35/35
ID SEQ NO: 3 ORF5 Sequência de PRRS VR2332 (No. de acesso GenSanR
U87392)
| 3 | atgttggaga | aatgcttgac | W*-'LV | r,gct€gcgAT | tgcttuGttt | grggtgtarc |
| gtgccgttct | gt tttgct.gr. | gctcçccaac | gaeagcaacg- | acagcagc te- | ccacctacag | |
| •21 | r.tgat.t.taca | ac·: t gacgct | argtgagctg | aaiggcacag | at tggc·: age | taacaaatt.1: |
| qattqqgcag | tggagagttt | cccgrcttga | etcacattgv | ctcctatggt | ||
| 241 | gcooeeacta | ctagccatet | ccttgaoaca | gti-gcrz. tag | tcactgtgtc | tacegeeggg |
| .331 | t. ttgttcacg | ggcggtatgt | cctaagtagc | atctacgcgg | tctgtgccct | ggctgcgttg |
| 361 | acttgct í;ç« | tcattaggtt | egcaaaqaai: | tgi?:at.g'.:<:c!: | ggcgctacgc | gtgtaccaga |
| 421 | rat.Ae?e?aact | trrttr.tgga | caj?;taagggn | agactcr.a·:^ | gtt.ggoggt.<.' | gcctgtcatc |
| 4&1 | atagagaaaa | ggggcaaagr | tçaggtcgaa | gçt.catctg« | tcgacctcaa | aagagttgtg |
| j 41 | cttgatggtt | ccgrggcaac | CGC.atÔ9CC | agagtttcag | eggaacaatg | gggtcgtcct |
| sai | tag |
1/3
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Método de vacinação de suínos contra os efeitos de uma forma de doença de febre afia de PRRS, método este que compreende administrar a um suíno uma composição imunogênica que compreende uma6 quantidade eficaz de um vírus da Síndrome Reprodutiva Respiratória Suína (PRRS) Tipo II.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a forma de doença de febre a!ta de PRRS é de uma PRRSV Chinesa que apresenta uma sequência de ácido nucieico que é pelo menos 95% homóloga à sell) quência de ácido nucieico de HB-1, ou JX143..
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a forma de doença de febre alta é causada por um vírus da Síndrome Reprodutiva Respiratória Suína Altamente Patogênica (PRRS HP).
- 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus PR15 RS tipo II é atenuado.
- 5 Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vírus PRRS tipo II é uma forma atenuada da cepa com o No. de acesso ATCC VR-2332, ou um descendente do mesmo.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo20 fato de que o vírus da PRRS tipo II é uma cepa com o No. de acesso ATCC VR-2495, ou um descendente do mesmo.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa de PRRSV Chinesa é selecionada do grupo que consiste em AH-1; AHCFSH; AHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; CX07: CZ07; FY060915; FY080108:25 GC-2; GCH-3; GD1; GD2; GD2007; GD3: GD4; GDSD1; GDY1-2007; GDY22007; GDYF1; GS2008; GXHZ12; GXHZ13; GXHZ14; GXHZ16; GXHZ19; GXHZ2; GXHZ2.1; GXHZ4; GXLZ5: GXLZ7; GY; GZCJ; GZDJ; GZHW1; GZHW2; GZHX; GZJS; GZKB; GZKY; GZLJ1: GZWB; GZWM; GZZB: Hainan-1; Hainan-2; HB1; HB2; HB3; HB-TshT, HB-XÍ1; HE.N46; HeN-KF; HeN30 LH; HeN-LY; HLJDF; HLJMZ1; HLJMZ2; HLJMZ3; HLJZY; HM-1; HN2;HN2007; HN3; HNId; HNIy; HNLY01; HNNX01; HNPJ01; HNsp; HNXT1; HNyy; HNyz; HO-5: HQ-6; HUB: HuN; HUN1; HUN11; HUN15; HUN16;2/3HUN 17; HUN2; HUN3; HUN4; HUN5: HUN6; HUN7; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3; HUNH2; HUNH4; HuNhl; HUNL1; HUNX4; HZ061226; HZ070105; Jiangsu~1; Jiangsu-2; Jiangsu-3; Jiangxi-2; Jiangxi-4; JLYS; JN; JX1; JX143; JX2; JX-2; JX2006; JX3; JX4; JX5; JXA1; KS06; LC07; LJ; LS06; LS-4;5 LY07; NB070319; SC07; SD; SD14; SDWF2; SH02: ST-7; SX2007; SY0608;TJDMJ; TJZHJ2; TJZHJ3; TQ; TQ07; TW07; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG; YNWS; YNYS: YNYX1; YNYX3; ZJ06; ZJCJ; ZJWL; ZX07; e ZS070921.
- 8. Método de acordo com qualquer urna das reivindicações 1 a10 7. em que a composição adicionalmente compreende um adjuvante.
- 9. Método de vacinação de suíno contra os efeitos de uma forma de doença de febre alta de vírus da PRRS JX143, método este que compreende administrar a um suíno uma composição imunogènica que compreende uma quantidade eficaz de um vírus da PRRS Tipo II.15 10. Método de redução da incidência de. ou gravidade de sinais clínicos de formas de doença de febre alta de PRRS, método este que compreende administrar a um suíno com necessidade do mesmo, uma composição imunogènica que compreende uma quantidade eficaz de um virus da PRRS Tipo II.20 11 Método de redução da incidência de, ou gravidade de sinais clínicos de formas da doença de febre alta de PRRS, método este que compreende administrar a um suíno com necessidade do mesmo, uma composição imunogènica que compreende uma quantidade eficaz de um vírus da PRRS Tipo II, no qual a forma da doença de febre alta de PRRS é de um25 Vírus da Síndrome Reprodutiva Respiratória Suína Chinesa (PRRSV) que apresenta uma sequência de ácidos nucleicos que é de pelo menos 95% homóloga à sequência de ácido nucleico de HB-1, ou JX143,12. Uso de um vírus da PRRS Tipo II para vacinação de suínos contra os efeitos de uma forma de doença de febre alta de PRRS, o quai30 compreende administrar a um suíno uma composição imunogènica que compreende uma quantidade eficaz de um vírus da PRRS Tipo II.13. Uso de acordo com a reivindicação 12, em que a forma de3/3 doença de febre alta de PRRS é de um Virus da Síndrome Reprodutiva Respiratória Suína Chinesa (PRRSV) que apresenta uma sequência de ácido nucleico que é de peio menos 95% homóloga à sequência de ácido nucleico de Ηδ-1, ou JX143.5 14. Uso de um vírus da PRRS Tipo II para a preparação de uma composição farmacêutica para vacinação de suínos contra os efeitos de uma forma de doença de febre alta de PRRS, o qual compreende administrar a um suíno uma composição imunogênica que compreende uma quantidade eficaz de um virus da PRRS Tipo II.
- 10 15. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que a forma de doença de febre alta de PRRS é de um Vírus da Síndrome Reprodutiva Respiratória Suína Chinesa (PRRSV) que apresenta uma sequência de ácido nucleico que ê de pelo menos 95% homóloga á sequência de ácido nucleico de HB-1, ou JX143.
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Free format text: REFERENTE AS 7A, 8A, 9A E 10A ANUIDADES. |
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| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |
Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2540 DE 10-09-2019 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |