BRPI0919766B1

BRPI0919766B1 - Oligopeptídeo, seu uso, agente farmacêutico ou composição para o tratamento e/ou profilaxia de câncer, e/ou prevenção de recorrência pósoperatória do mesmo, métodos in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno e para induzir um ctl

Info

Publication number: BRPI0919766B1
Application number: BRPI0919766-4A
Authority: BR
Inventors: Yasuharu Nishimura; Katsunori Imai; Yusuke Nakamura; Takuya Tsunoda
Original assignee: Oncotherapy Science, Inc.
Priority date: 2008-10-22
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2021-12-28
Also published as: US20150017193A1; AU2009305847B2; EP2362906B1; US9132176B2; JP2012506235A; US8883966B2; SG195571A1; MX2011004176A; CN102264897B; KR101705150B1; TW201019953A; CA2741399C; KR20110074919A; CO6362049A2; US20110262471A1; WO2010047062A1; RU2011120447A; IL212046A; RU2532105C2; AU2009305847A1

Abstract

olígopeptídeo, agente farmacêutico ou composição, exossoma, métodos in vitro para induzir uma célula de apresentação de antígeno e para induzir um ctl, ctl, célula de apresentação de antígeno, uso de pelo menos um ingrediente ativo, polinucleotídeo, e uso do oligopeptídeo. a presente invenção fornece oligopeptídeos compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em seq id nos: 3, 4 e 5. a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica contendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em seq id nos: 3, 4 e 5 formulada para o tratamento ou prevenção de câncer em um sujeito. além disso, a presente invenção fornece um método de induzir resposta imune usando tais oligopeptídeos e agentes farmacêuticos.

Description

CAMPO TÉCNICO PRIORIDADE

[0001] O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pe dido Provisório US 61/197.106, depositado em 22 de outubro de 2008, os conteúdos inteiros deste são aqui incorporados por referência.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente invenção refere-se ao campo de ciência biológi ca, mais especificamente ao campo de terapia de câncer. Em particular, a presente invenção diz respeito aos novos oligopeptídeos e uso dos mesmos.

ANTECEDENTE DA TÉCNICA

[0003] Foi demonstrado que CTLs CD8-positivos reconhecem pep- tídeos de epítopo derivados dos antígenos associados ao tumor (TAAs) encontrados na molécula da classe I do complexo de histo- compatibilidade principal (MHC), e depois matam as células tumorais. Desde a descoberta da família de antígeno de melanoma (MAGE) como o primeiro exemplo de TAAs, muitos outros TAAs foram descobertos, primariamente através de abordagens imunológicas (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 8 de maio de 1993, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T &van der Bruggen P, J Exp Med 1° de março de 1996, 183(3): 725-9). Alguns dos TAAs estão agora correntemente passando por desenvol-vimento clínico como alvos imunoterapêuticos.

[0004] Identificação de TAAs novos capazes de induzir respostas imunes antitumorais potentes e específicas, garante mais desenvolvi- mento e aplicação clínica das estratégias de vacinação de peptídeo para vários tipos de câncer (NPL 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 16 de outubro de 1996, 88(20): 1442-55; NPL 4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1° de julho de 1999, 59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1° de novembro de 1999, 59(21): 5554-9; NPL 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1° de maio de 1996, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F et al., Cancer Res 15 de outubro de 1997, 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T et al., Int J Cancer 18 de janeiro de 1999, 80(2): 169-72; NPL 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 5 de maio de 1999, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M et al., Int J Cancer 5 de maio de 1999, 81(3): 387-94). Até agora, houve vários relatórios de experimentações clínicas usando estes peptídeos derivados de antígeno associado ao tumor. Infelizmente, apenas uma taxa de resposta objetiva baixa foi observada nestas experimentações de vacina de câncer até agora (NPL 11: Belli F et al., J Clin Oncol 15 de outubro de 2002, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG et al., Immunol Revestimento outubro de 2002, 188: 33-42; NPL 13: Rosenberg AS et al., Nat Med setembro de 2004, 10(9): 909-15).

[0005] Recentemente, a sequência de peptídeo de ligação da classe I de HLA pode ser esperada usar algoritmos (NPL14: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, págs.181-190, NPL 15: J. Immunol., (1994), Vol. 152, págs. 163-175, NPL 16: Protein Science, (2000), Vol. 9, págs. 1838-1846). Porém, é duro dizer que o peptídeo de epítopo esperado possa ser processado naturalmente nas células alvos e expressado na superfície das células alvos com molécula de HLA. Além disso, o algoritmo, por exemplo BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ke- n_parker_comboform) (NPL 17: Parker KC, et al., (1994) J Immu- nol.;152(1):163-75.; NPL 18: Kuzushima K, et al., (2001) Blo- od.;98(6):1872-81.)) pode sugerir o peptídeo de ligação da molécula de HLA, mas o peptídeo sugerido não é tão rigoroso (NPL 19: Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 22 de março de 2005;5:6.). Desse modo, triagem de TAA ainda continua com muitos desafios e dificuldades.

[0006] Câncer pancreático tem um prognóstico ruim, com uma ta xa de sobrevivência geral de 5 anos de cerca de 5% (1). Uma resseção cirúrgica continua a única opção para uma sobrevivência a longo prazo, mas pacientes com câncer pancreático ressecivo encontra-se na minoria (9-22%). (NPL 20: Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1999;189:1-7., NPL 21: Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006;192:322- 9., NPL 22: Goonetilleke K S,et al. Int J Surg 2007;5:147-51.). Porém, até mesmo nestes pacientes, a taxa de sobrevivência de 5 anos permanece aproximadamente 20% apesar de cirurgia com uma intenção curativa (NPL 23: Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103., NPL 24: Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721- 31.). Até 80% dos pacientes apresentam doença localmente avançada ou metastática, e sua sobrevivência média varia de 6 a 9 meses (NPL 25: Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54.). Consequentemente, o desenvolvimento de modalidades terapêuticas novas é um assunto de grande importância, e imunoterapia pode ser um tratamento potencial para câncer pancreático.

[0007] RAB6KIFL (KIF20A) foi primeiro identificado representar um papel na dinâmica do aparelho de Golgi através da interação direta com GTPase pequena de Rab6 (NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5.). RAB6KIFL pertence à superfamília das proteínas motoras cinesina que têm funções críticas no tráfego de moléculas e organelas (NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5., NPL 27: Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73., NPL 28: Allan VJ, e Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82.). Recentemente, Taniuchi K et al. relatou que RAB6KIFL foi supraexpressada em tecidos de câncer pancreático (NPL 29: Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12.). Eles descobriram evidência para um papel crítico de RAB6KIFL na carcinogênese pancreática.

[0008] Através da análise do perfil da expressão gênica usando um microarranjo de cDNA de genoma amplo contendo 23.040 genes, RAB6KIFL (KIF20A) foi recentemente mostrado ser suprarregulado em vários cânceres tais como câncer de bexiga (PTL 1: WO2006/085684), câncer pulmonar de células pequenas (SCLC) (PTL 2: WO2007/013- 665) e câncer de próstata refratário a hormônios (HRPC) (PTL 3: WO2008/102906), as revelações destes são aqui incorporadas por referência. Ainda, alguns peptídeos de epítopo dos produtos gênicos de KIF20A foram também identificados (PTL 4: WO2008/102557). LISTA DE CITAÇÃO LITERATURA DE PATENTE [PTL 1] WO2006/085684 [PTL 2] WO2007/013665 [PTL 3] WO2008/102906 [PTL 4] WO2008/102557 LITERATURA DE NÃO-PATENTE [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 8 de maiô de 1993, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T &van der Bruggen P, J Exp Med 1° de março de 1996, 183(3): 725-9 [NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 16 de outubro de 1996, 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1° de julho de 1999, 59(13): 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1° de novembro de 1999, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1° de maio de 1996, 156(9): 3308-14 [NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 15 de outubro de 1997, 57(20): 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 18 de janeiro de 1999, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 5 de maio de 1999, 81(3): 459-66 [NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 5 de maio de 1999, 81(3): 387-94 [NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 15 de outubro de 2002, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev outubro de 2002, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med setembro de 2004, 10(9): 909-15 [NPL 14] Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, págs.181-190 [NPL 15] J. Immunol., (1994), Vol. 152, págs. 163-175 [NPL 16] Protein Science, (2000), Vol. 9, págs. 1838-1846 [NPL 17] Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75. [NPL 18] Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81. [NPL 19] Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 22 de março de 2005;5:6. [NPL 20] Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1999;189:1-7. [NPL 21] Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006;192:322-9. [NPL 22] Goonetilleke K S, et al. Int J Surg 2007;5:147-51. [NPL 23] Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103. [NPL 24] Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31. [NPL 25] Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54. [NPL 26] Echard A, et al. Science 1998;279:580-5. [NPL 27] Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73. [NPL 28] Allan VJ, e Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82. [NPL 29] Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção é em parte com base na descoberta de alvos novos de imunoterapia. Porque TAAs frequentemente não têm nenhuma imunogenicidade, a descoberta de alvos apropriados é de importância extrema. Em particular, a invenção visa RAB6KIFL (SEQ ID NO: 2) codificado pelo gene de Acesso do GenBank No. AF153329 ou CR598555, também indicado por NM_005733 (SEQ ID NO: 1)), uma vez que RAB6KIFL foi identificado como suprarregulado em vários cânceres tais como câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer pulmonar de célulasnão pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC). A presente invenção fornece produtos gênicos de RAB6KIFL contendo os peptídeos de epítopo que suscitam a resposta de CTL surpreendentemente forte que é específica para as moléculas correspondentes. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) obtidas de um doador saudável foram estimuladas usando os peptídeos da presente invenção. A presente invenção ainda fornece CTLs estabelecidos que especificamente reconhecem células alvos positivas de HLA-A2 (A*0201) pulsadas com os respectivos peptídeos, e peptídeos de epí- topo restringidos por HLA-A2 (A*0201) que podem induzir respostas imunes potentes e específicas contra RAB6KIFL expressa no tumor. Estes resultados demonstram que RAB6KIFL é fortemente imunogêni- co e os epítopos dos mesmos são alvos efetivos para imunoterapia do tumor.

[00010] Consequentemente, é um objetivo da presente invenção fornecer oligopeptídeos tendo inductilidade de CTL como também uma sequência de aminoácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 3, 4 e 5. Além disso, em outra modalidade da presente invenção, um, dois ou vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, desde que os oligopeptídeos modificados resultantes retenham a inductilidade de CTL dos peptídeos originais.

[00011] Quando administrados a um sujeito, os oligopeptídeos presentessão apresentados na superfície das células de expressão de antígeno e depois induzem CTLs visando os respectivos peptídeos. Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer células de apresentação de antígeno e exossomas que apresentam quaisquer dos peptídeos presentes, como também métodos para induzir células de apresentação de antígeno.

[00012] Uma resposta imune antitumoral é induzida pela administração dos presentes oligopeptídeo ou polipeptídeos de RAB6KIFL que codificam os oligopeptídeos, como também exossomas e células de apresentação de antígeno que apresentam os oligopeptídeos de RAB6KIFL. Portanto, é ainda outro objetivo da presente invenção fornecer agentes farmacêuticos ou composição farmacêutica contendo os oligopeptídeos ou polinucleotídeos codificando os mesmos, como também as exossomas e células de apresentação de antígeno como seus ingredientes ativos. Os agentes farmacêuticos ou composições farmacêuticas da presente invenção encontram uso como vacinas.

[00013] Além disso, é um outro objetivo da presente invenção fornecermétodos para o tratamento e/ou profilaxia de (isto é, prevenção) cânceres (tumores), e/ou prevenção de recorrência pós-operatória dos mesmos, como também métodos para induzir CTLs, métodos para induzir imunidade antitumoral, tais métodos incluindo a etapa de administrar os oligopeptídeos de RAB6KIFL, polinucleotídeos codificando os oligopeptídeos de RAB6KIFL, exossomas ou as células de apresentação de antígeno apresentando polipeptídeos de RAB6KIFL ou os agentes farmacêuticos da presente invenção. Além disso, os CTLs da presente invenção também encontram uso como vacinas contra cân-cer. Exemplos de cânceres alvos incluem, mas não são limitados a câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer de pulmão de células pequenas (SCLC).

[00014] É para ser entendido que tanto o sumário anterior da pre sente invenção como a descrição detalhada seguinte são das modalidades exemplificadas, e não restritivos da invenção ou de outras modalidades alternativas da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00015] Vários aspectos e aplicações da presente invenção ficarão evidentes ao artesão versado em consideração da breve descrição das figuras e a descrição detalhada da presente invenção e suas modalidades preferidas que seguem: [Fig. 1]

[00016] Figura 1 descreve expressão marcante e frequentemente intensificada de mRNA de RAB6KIFL em tecidos de câncer pancreáti- co como com base em uma análise de microarranjo de cDNA. A descreve uma lista de genes suprarregulados em células de câncer pan- creático. Estes gentes foram supraexpressados em células de câncer em comparação com suas contrapartes normais. A expressão de mRNA de RAB6KIFL em células de câncer pancreático foi intensificada notadamente em todos dos 6 pacientes de câncer pancreático. B descreve a razão da expressão relativa do gene de RAB6KIFL em tecidos normais com base em uma análise de microarranjo de cDNA. Gene de RAB6KIFL foi expressado fracamente apenas nos testículos e timo. C descreve que o nível de expressão do gene de RAB6KIFL foi também intensificado em muitos cânceres de pulmão e bexiga como também câncer pancreático com base na análise de microarranjo de cDNA anterior. [Fig. 2]

[00017] Figura 2 descreve as análises de mRNA de RAB6KIFL expressas em tecidos normais humanos, linhagens celulares de câncer, e tecidos de câncer. A descreve a expressão de mRNA de RAB6KIFL foi investigada em vários tecidos normais usando análise de RT-PCR. mRNA de RAB6KIFL foi expressado fracamente apenas nos testícu- los. B descreve a análise de RT-PCR da expressão de RAB6KIFL em várias linhagens celulares de câncer. C descreve a análise de RT-PCR da expressão de RAB6KIFL em tecidos de tumor pancreático (T), e suas contrapartes normais (N). A expressão do gene de RAB6KIFL foi detectada em 5 dos 8 tecidos de câncer pancreático. Em contraste, pequena expressão foi detectada em suas contrapartes normais. [Fig. 3]

[00018] Figura 3 descreve supraexpressão de câncer pancreático específico para proteína de RAB6KIFL detectada pelas análises de western blot. A descreve que a proteína de RAB6KIFL não foi detectada em oito tecidos normais, enquanto que os testículos deram uma banda tênue que tinha uma mobilidade similar à observada em lisado de células de PANC1. B descreve que, em dois pacientes de câncer pancreático, a proteína de RAB6KIFL foi detectada em tecidos de câncer (T) mas não em tecidos normais adjacentes (N). Tingimento anti- beta-actina foi também executado para monitorar a carga de proteína igual. [Fig. 4]

[00019] Figura 4 descreve análises imunoistoquímicas da proteína de RAB6KIFL em câncer pancreático (A) e vários tecidos normais (B). A descreve que tingimento forte de RAB6KIFL foi principalmente observado no citoplasma e núcleos das células cancerosas em 6 dos 9 casos, enquanto que tingimento muito fraco foi observado em células acinosas e epitélio ductal normal de seus tecidos pancreáticos adjacentes normais. Tingimento forte similar foi observado nos focos me- tastáticos do peritôneo. Pequeno tingimento foi detectado na pancreatite de formação do tumor. B descreve que RAB6KIFL não foi tingido no cérebro normal, pulmão, fígado, rim, estômago, intestino delgado, cólon, baço, músculo esquelético, pele, e timo. Um possível tingimento tênue foi observado nos testículos. Sinais de tingimento positivos es- tão mostrados em cor marrom. As barras de escala representam 100 micrômetros. [Fig. 5]

[00020] Figura 5 descreve identificação de epítopos de CTL de ca-mundongorestringido por HLA-A2 de RAB6KIFL humano usando Tgm de HLA-A2.1 (HHD). A descreve que Tgm de HLA-A2.1 (HHD) foram imunizados com 5 x 105 BM-DCs singênicas pulsadas com os doze conjuntos da mistura de três tipos de peptídeos selecionados de 36 peptídeos candidatos in vivo no dia 7 e 14. No dia 21, as células do baço de CD4 isoladas de camundongos imunizados foram estimuladas com BM-DCs pulsadas com cada peptídeo durante 6 dias. O IFN- gama produzido de CTL foi detectado por um ensaio de ELISPOT. Peptídeos de RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9- 809 (SEQ ID NO: 4), e RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5) foram mostrados induzir CTLs reativos com peptídeos. Estes ensaios foram feitos duas vezes com resultados similares. B descreve tingimento imunoistoquímico com mAb anti-CD4 ou anti-CD8 em espécimes de tecido de Tgm de HLA-A2 (HHD) imunizado com o peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-809. Após vacinação de dois tempos, estes espécimes foram ressecados e analisados. [Fig. 6A-B]

[00021] Figura 6 descreve indução de CTL humano de RAB6KIFL específico das PBMCs de doadores saudáveis HLA-A2-positivos. A descreve que os CTLs reativos com peptídeo de RAB6KIFL foram gerados das PBMCs de doadores saudáveis HLA-A2-positivos. Após três estimulações com DCs derivadas de monócitos autólogas pulsadas com o peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2- 9-809 (SEQ ID NO: 4), e RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5), a cito- toxicidade dos CTLs contra células T2 (HLA-A2+, deficientes em TAP), pulsadas com cada peptídeo ou células T2 não pulsadas com peptí- deo, foi detectada por ensaio de liberação padrão de a51Cr. Estes CTLs exibiram citotoxicidade para as células T2 pulsadas com peptí- deo de RAB6KIFL-A2-9-12 (esquerda), RAB6KIFL-A2-9-809 (meio), e RAB6KIFL-A2-10-284 (direita), mas não para peptídeo de HIV irrelevante e células T2 não pulsadas com peptídeo. B descreve que estes CTLs exibiram citotoxicidade para a linhagem celular de câncer pan- creático humana PANC1 de RAB6KIFL+ HLA-A2 (A*0201)+ e linhagem celular de câncer de cólon CaCo-2, mas não para linhagem celular de câncer pancreático humana PK8 de RAB6KIFL+ HLA-A2 (A*0201)-. [Fig. 6C-D]

[00022] C descreve a citotoxicidade destes CTLs foi RAB6KIFL- específica. Estes CTLs mataram SKHep1/RAB6KIFL, uma linhagem celular de câncer hepático humana SKHep1 de RAB6KIFLbaixo HLA- A2+ transfeccionado com gene de RAB6KIFL humano, mas não mataram SKHep1/Mock. D descreve a inibição da citotoxicidade através de mAb anti-HLA da classe I. Após as células alvos PANC1 serem incubadas com mAb anti-HLA da classe I (W6/32, IgG2a) ou mAb anti- HLA-Dr (H-DR-1, IgG2a) respectivamente por 1 hora, os CTLs gerados das PBMCs de doador saudável por estimulação com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-12 (superior), RAB6KIFL-A2-9-809 (meio), e RAB6KIFL-A2-10-284 (inferior) foram adicionados. Produções de IFN- gama foram inibidas notadamente por W6/32, mas não por H-DR-1.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[00023] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem das modalidades da presente invenção, os métodos, dispositivos, e materiais preferidos são agora descritos. Porém, antes dos materiais e métodos presentes serem descritos, é para ser entendido que a presente invenção não é limitada aos tamanhos, formas, dimensões, materiais, metodologias, protocolos particulares, etc. descritos aqui, visto que es- tes podem variar de acordo com a experimentação rotineira e otimização. É também para ser entendido que a terminologia usada na descrição é para o propósito de descrever as versões ou modalidades particulares apenas, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

[00024] A descrição de cada publicação, patente ou pedido de patente mencionados neste relatório descritivo é especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade. Porém, nada aqui é para ser interpretado como uma admissão que a invenção não é intitulada para antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior.

[00025] No caso de conflito, a especificação presente, incluindo definições, prevalecerá.

[00026] Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não intencionados ser limitativos.

I. DEFINIÇÕES

[00027] As palavras "um", "uma", e "o/a" como aqui usadas significam "pelo menos um" a menos que do contrário especificamente indicado.

[00028] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados alternadamente aqui para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um resíduo modificado, ou um resíduo de ocorrência não natural, tal como um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, como também aos polímeros de aminoácido de ocorrência natural.

[00029] O termo "oligopeptídeo" às vezes usado no relatório descritivo presente é usado para referir-se aos peptídeos da presente invenção que são 20 resíduos ou menos, tipicamente 15 resíduos ou menos em comprimento e usualmente consistem entre cerca de 8 e cerca de 11 resíduos, frequentemente 9 ou 10 resíduos.

[00030] O termo "aminoácido" como aqui usado refere-se aos ami- noácidos de ocorrência natural e sintéticos, como também análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que similarmente funcionam para os aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, como também aqueles modificados após tradução nas células (por exemplo, hidroxi- prolina, gama-carboxiglutamato, e O-fosfosserina). A frase "análogo de aminoácido"refere-se aos compostos que têm a mesma estrutura química básica (um carbono alfa ligado a um hidrogênio, um grupo carbóxi, um grupo amino, e um grupo R) que um aminoácido de ocorrência natural mas têm um grupo R modificado ou cadeias principais modificadas (por exemplo, homosserina, norleucina, metionina, sulfó- xido, sulfônio de metila de metionina). A frase "mimético de aminoáci- do" refere-se aos compostos químicos que têm estruturas diferentes, mas funcionam similares aos aminoácidos gerais.

[00031] Aminoácidos podem ser referidos aqui por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou os símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.

[00032] Os termos "gene", "polinucleotídeos", "nucleotídeos"e "ácidos nucleicos"são usados alternadamente aqui, a menos que do contrário especificamente indicado, e são similarmente aos aminoácidos referidos por seus códigos de uma letra comumente aceitos.

[00033] A menos que do contrário definido, o termos "câncer" refere-se aos cânceres que supraexpressam o gene de RAB6KIFL. Exemplos dos cânceres supraexpressando RAB6KIFL incluem, mas não são limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangioce- lular, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC).

[00034] A menos que do contrário definido, os termos "linfócito T citotóxico", "célula T citotóxica"e "CTL"são usados alternadamente aqui e, a menos que do contrário especificamente indicado, referem-se a um subgrupo de linfócitos T que são capazes de reconhecer células não autossuficientes (por exemplo, células tumorais, células infetadas por vírus) e induzir a morte de tais células.

[00035] A menos que do contrário definido, todos termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém de habilidade usual na técnica à qual esta invenção refere-se.

II. PEPTÍDEOS

[00036] Para demonstrar que os peptídeos derivados da função de RAB6KIFL como um antígeno reconhecido por linfócitos T citotóxicos (CTLs), os peptídeos derivados de RAB6KIFL (SEQ ID NO.: 2) foram analisados para determinar se eles eram epítopos de antígeno restringidos por HLA-A2 (A*0201) que são alelos de HLA comumente encontrados (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 391324, 1994). Candidatos de peptídeos de ligação de HLA-A2 derivados de RAB6KIFL foram identificados usando a informação sobre suas afinidades de ligação à HLA-A2.. Após estimulação in vitro das células T através de células dendríticas (DCs) carregadas com estes peptídeos, CTLs foram de forma bem sucedida estabelecidos usando cada um dos peptídeos, particularmente os peptídeos a seguir: RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4), e RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5).

[00037] Estes CTLs estabelecidos mostram atividade de CTL específica potente contra células alvo pulsadas com os respectivos peptí- deos. Os resultados aqui demonstram que RAB6KIFL é um antígeno reconhecido pelo CTL e que os peptídeos podem ser peptídeos de epítopo de RAB6KIFL restringido por HLA-A2 (A*0201).

[00038] Uma vez que o gene de RAB6KIFL é supraexpressado na maioria dos tecidos cancerosos, tais como câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC), é um alvo bom para imunoterapia. Desse modo, a presente invenção fornece oligopeptídeos tais como nonapeptídeos (peptídeos que consistem em nove resíduos de aminoácido) e decapeptídeos (peptídeos que consistem em dez resíduos de aminoácido) correspondendo aos epítopos reconhecidos por CTL de RAB6KIFL. Exemplos particularmente preferidos de oligopeptídeos da presente invenção incluem aqueles peptídeos tendo uma sequência de aminoácido selecionada de entre as SEQ ID NOs: 3, 4 e 5.

[00039] Em geral, programas de software agora disponíveis na Internet, tais como aqueles descritos em Parker KC et al., J Immunol 1° de janeiro de 1994, 152(1): 163-75, podem ser usados para calcular as afinidades de ligação entre os vários peptídeos e antígenos de HLA in silico. Afinidade de ligação com antígenos de HLA pode ser medida como descrito, por exemplo, em Parker KC et al., J Immunol 1° de janeiro de 1994, 152(1): 163-75; e Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Os métodos para determinar a afinidade de ligação são descritos, por exemplo, em; Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Desse modo, a presente invenção abrange peptídeos de RAB6KIFL que são determinados para ligar com os antígenos de HLA por tais programas conhecidos.

[00040] Além disso, estes peptídeos da presente invenção podem ser flanqueados com resíduos de aminoácidos adicionais contanto que o peptídeo retenha sua inductilidade de CTL. Tais peptídeos com in- ductilidade de CTL são, por exemplo, menos que cerca de 40 aminoá- cidos, frequentemente menos que cerca de 20 aminoácidos, usualmente menos que cerca de 15 aminoácidos. A sequência de aminoá- cido flanqueando os peptídeos que consistem na sequência de amino- ácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 não são limitados e podem ser compostos de qualquer tipo de aminoácidos contanto que não prejudique a inductilidade de CTL do peptídeo original. Desse modo, a presente invenção também fornece peptídeos tendo inductilidade de CTL compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 3, 4 e 5.

[00041] Em geral, modificação de um, dois, ou vários aminoácidos em uma proteína não influenciará a função da proteína, ou em alguns casos intensifica até mesmo a função desejada da proteína original. De fato, peptídeos modificados (isto é, peptídeos compostos de uma sequência de aminoácido em que um, dois ou vários resíduos de ami- noácido foram modificados (isto é, substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos) quando comparados a uma sequência de referência original foram conhecidos reter a atividade biológica do peptídeo original (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller e Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Desse modo, em uma modalidade, os oligopeptídeos da presente invenção podem ter induc- tilidade de CTL e uma sequência de aminoácido selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 em que um, dois ou vários aminoácidos são adicionados, inseridos, deletados e/ou substituídos.

[00042] Aqueles de habilidade na técnica reconhecem que adições ou substituições individuais em uma sequência de aminoácido que altera um aminoácido simples ou uma porcentagem pequena de aminoá- cidos tendem a resultar na conservação das propriedades da cadeia lateral de aminoácido original. Como tal, eles são convencionalmente referidos como "substituições conservadoras" ou "modificações con- servadoras", em que a alteração de uma proteína resulta em uma proteína modificada tendo propriedades e funções análogas à proteína original. Tabelas de substituição conservadoras que fornecem aminoá- cidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Exemplos das características da cadeia lateral de aminoácido que são desejáveis conservar incluem, por exemplo, aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), e cadeias laterais tendo os seguintes grupos funcionais ou características em comum: uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I, P); uma cadeia lateral contendo grupo hidroxila (S, T, Y); uma cadeia lateral contendo átomo de enxofre (C, M); uma cadeia lateral contendo ácido carboxílico e amida (D, N, E, Q); uma cadeia lateral contendo base (R, K, H); e uma cadeia lateral aromática (H, F, Y, W). Além disso, os seguintes oito grupos cada um contém aminoácidos que são aceitos na técnica como substituições conservadoras um pelo outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Aspargina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins 1984).

[00043] Tais peptídeos de modo conservador modificados são também considerados ser peptídeos da presente invenção. Porém, peptí- deos da presente invenção não são restringidos a estes e podem incluirmodificações não conservadoras, contanto que o peptídeo modificado retenha a inductilidade de CTL do peptídeo original. Além disso, peptídeos modificados não deveriam excluir peptídeos induzíveis por CTL de variantes polimórficas, homólogos de interespécies, e alelos de RAB6KIFL.

[00044] Para reter a inductilidade de CTL requerida pode-se modificar (adicionar ou substituir) um número pequeno (por exemplo, 1, 2 ou vários) ou uma porcentagem pequena de aminoácidos. Aqui, o termo "vários"significa 5 ou menos aminoácidos, por exemplo, 3 ou menos. A porcentagem de aminoácidos a serem modificados pode ser 20% ou menos, por exemplo, 15% de menos, por exemplo 10% ou 1 a 5%.

[00045] Quando usados no contexto de imunoterapia, os peptídeos da presente invenção deveriam ser apresentados na superfície de uma célula ou exossoma, preferivelmente como um complexo com um antí- geno de HLA. Portanto, é preferível selecionar peptídeos que não só induzem CTLs mas também que possuem afinidade de ligação alta ao antígeno de HLA. Para esse fim, os peptídeos podem ser modificados por substituição, inserção, deleção e/ou adição dos resíduos de ami- noácido para render um peptídeo modificado tendo afinidade de ligação melhorada. Além dos peptídeos que são exibidos naturalmente, uma vez que a regularidade das sequências de peptídeos exibidas ligando aos antígenos de HLA já é conhecida (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), modificações com base em tal regularidade podem ser introduzidas nos peptídeos imunogênicos da invenção. Por exemplo, peptídeos que possuem afinidade de ligação de HLA-A2 (A*0201) alta têm seu segundo aminoácido do término N substituído com leucina ou metionina, e os peptídeos cujo aminoácido no término C são substituídos com valina ou leucina. Desse modo, os peptídeos tendo as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 3, 4 ou 5 em que o segundo aminoácido do término N é substituído com leucina ou metionina e/ou em que o término C é substituído com valina ou leucina, são abrangidos pela presente invenção. Substituições podem ser introduzidas não apenas nos aminoácidos terminais mas também na posição de reconhecimento de TCR potencial dos peptídeos. Vários estudos demonstraram que substituições de aminoácido em um peptídeo podem ser iguais ou melhores que o original, por exemplo CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) ou gp100 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) 1° de fevereiro;168(3):1338-47, S. O. Dionne et al. Cancer Immunol. Immunother (2003) 52: 199-206 e S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

[00046] A presente invenção também contempla a adição de ami- noácidos às sequências reveladas aqui. Por exemplo, um, dois ou vários aminoácidos podem ser adicionados ao término N e/ou C dos peptí- deos presentes. Tais peptídeos modificados tendo afinidade de ligação de antígeno de HLA alta e inductilidade de CTL retida são também incluídos na presente invenção.

[00047] Porém, quando a sequência de peptídeo for idêntica a uma porção da sequência de aminoácido de uma proteína endógena ou exógena tendo uma função diferente, efeitos colaterais tais como distúrbios autoimunes e/ou sintomas alérgicos podem ser induzidos contra substâncias específicas. Portanto, é preferível primeiro executar pesquisas de homologia usando as bases de dados disponíveis para evitar situações em que a sequência do peptídeo corresponda à sequência de aminoácido de outra proteína. Quando ficar claro das pesquisas de homologia que nenhum peptídeo existe com menos que 1 ou 2 aminoácidos quando comparado ao peptídeo em questão, o pep- tídeo em questão pode ser modificado para aumentar sua afinidade de ligação aos antígenos de HLA, e/ou aumentar sua inductilidade de CTL sem qualquer perigo de tais efeitos colaterais.

[00048] Embora os peptídeos tendo afinidade de ligação alta ao an- tígeno de HLA como descrito acima sejam esperados ser altamente efetivos, os peptídeos candidatos que são selecionados de acordo com a presença de afinidade de ligação alta como um indicador, são ainda examinados para a presença de inductilidade de CTL. Aqui, a frase "inductilidade de CTL" indica a habilidade do peptídeo para induzirlinfócitos citotóxicos (CTLs) quando presentes nas células de apresentação de antígeno. Também, "inductilidade de CTL" inclui a habilidade do peptídeo para induzir ativação de CTL, proliferação de CTL, promover lise de CTL de células alvo, e aumentar a produção de IFN- gama de CTL.

[00049] Confirmação de inductilidade de CTL é realizada induzindo células de apresentação de antígeno carregando antígenos de MHC humanos (por exemplo, linfócitos B, macrófagos, e células dendríticas (DCs)), ou mais especificamente DCs derivadas de leucócitos mono- nucleares de sangue periférico humano, e após estimulação com os peptídeos, misturar com células CD8-positivas, e depois medir o IFN- gama produzido e liberado por CTL contra as células alvo. Como o sistema de reação, animais transgênicos que foram produzidos para expressar um antígeno de HLA humano (por exemplo, aqueles descritos em BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol agosto de 2000, 61(8): 764-79, Artigos Relacionados, Livros, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Por exemplo, as células alvo podem ser radiomarcadas com 51Cr e assim por diante, e a atividade citotóxica pode ser calculada da radioatividade liberada das células alvo. Alternativamente, inductilidade de CTL pode ser avaliada medindo IFN-gama produzido e liberado por CTL na presença das células de apresentação de antígeno (APCs) que carregam peptídeos imobilizados, e visualizando a zona de inibição nos meios usando anticorpos monoclonais anti-IFN-gama.

[00050] Como resultado da examinação da inductilidade de CTL dos peptídeos como descrito acima, foi descoberto que aqueles peptí- deos tendo afinidade de ligação alta a um antígeno de HLA não necessariamente tiveram inductilidade de CTL alta. Porém, daqueles peptídeos identificados e avaliados, os nonapeptídeos ou decapeptí- deos selecionados dos peptídeos tendo umas sequências de aminoá- cido indicadas pelas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 foram observados apresentar inductilidade de CTL particularmente alta como também afinidade de ligação alta para um antígeno de HLA. Desse modo, estes peptí- deos são exemplificados como modalidades preferidas da presente invenção.

[00051] Além das modificações acima descritas, os peptídeos da presente invenção podem também ser ligados a outras substâncias, contanto que o peptídeo ligado resultantes retenha a inductilidade de CTL requerida do peptídeo original. Exemplos de substâncias adequadas incluem, mas não limitadas a: peptídeos, lipídios, açúcar e cadeias de açúcar, grupos acetila, polímeros naturais e sintéticos, etc. Os pep- tídeos podem conter modificações tais como glicosilação, oxidação de cadeia lateral, ou fosforilação, etc., contanto que as modificações não destruam a atividade biológica do peptídeo original. Estes tipos de modificações podem ser executadas para conferir funções adicionais (por exemplo, função de visamento, e função de liberação) ou para estabilizar o polipeptídeo.

[00052] Por exemplo, para aumentar a estabilidade in vivo de um po- lipeptídeo, é conhecido na técnica introduzir D-aminoácidos, miméticos de aminoácido ou aminoácidos antinaturais; este conceito pode também ser adaptado aos polipeptídeos presentes. A estabilidade de um polipeptídeo pode ser ensaiada de vários modos. Por exemplo, peptidases e vários meios biológicos, tais como plasma humano e soro, podem ser usados para testar a estabilidade (vide, por exemplo, Ve- rhoef et al., Eur J Fármaco Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

[00053] Ainda, os peptídeos da presente invenção podem ser ligados a outros peptídeos por meio de espaçadores ou ligadores. Exemplos de outros peptídeos incluem, mas não são limitados a, peptídeos induzíveis por CTL derivados de outros TAAs. Alternativamente, dois ou mais peptídeos da presente invenção podem ser ligados por meio de espaçadores ou ligadores. Os peptídeos ligados por meio de espa- çadores ou ligadores podem ser os mesmos ou diferentes uns dos outros.Espaçadores ou ligadores não são especificamente limitados, mas são preferivelmente peptídeos, mais preferivelmente peptídeos tendo um ou mais sítios de clivagem que são capazes de ser clivados por enzimas tais como peptidases, proteases e proteassomas. Exemplos de ligadores ou espaçadores incluem, mas não são limitados a: AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) ou, um a vá-riosresíduos de lisina (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K., S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Os peptídeos da presente invenção abrangem aqueles peptídeos ligados a outros pep- tídeos por meio de espaçadores ou ligadores.

[00054] Aqui, os peptídeos da presente invenção podem também ser descritos como "peptídeo(s) de RAB6KIFL", "polipeptídeo(s) de RAB6KIFL" ou "oligopeptídeos de RAB6KIFL".

III. PREPARAÇÃO DOS PEPTÍDEOS DE RAB6KIFL

[00055] Os peptídeos da presente invenção podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, os peptídeos podem ser sinteticamente preparados, usando tecnologia de DNA recombi- nante ou síntese química. Os peptídeos da presente invenção podem ser sintetizados individualmente ou como polipeptídeos mais longos compostos de dois ou mais peptídeos. Os peptídeos podem depois ser isolados, isto é, purificados ou isolados, para ficarem substancialmente livres de outras proteínas de célula hospedeira de ocorrência natural e fragmentos das mesmas, ou qualquer outra substância química.

[00056] Um peptídeo da presente invenção pode ser obtido através de síntese química com base na sequência de aminoácido selecionada. Exemplos de métodos convencionais de síntese de peptídeo que podem ser adaptados à síntese incluem, mas não limitados a: (i) Peptide Synthesis, Interscience, Nova Iorque, 1966; (ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, Nova Iorque, 1976; (iii) Peptide Synthesis (em japonês), Maruzen Co., 1975; (iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (em japonês), Maruzen Co., 1985; (v) Development of Pharmaceuticals (segundo volume) (em japonês), Vol. 14 (síntese de pepitídeo), Hirokawa, 1991; (vi) WO99/67288; e (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, Nova Iorque, 1980, 100118.

[00057] Alternativamente, os peptídeos presentes podem ser obtidos adaptando quaisquer métodos de engenharia genética conhecidos para produzir peptídeos (por exemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Por exemplo, primeiro, um vetor adequado abrigando um polinucleotídeo que codifica o peptídeo em questão em uma forma capaz de ser expressado (por exemplo, a jusante de uma sequência reguladora que corresponde a uma sequência de promotor) é preparado e transformado em uma célula hospedeira adequada. A célula hospedeira é depois cultivada para produzir o peptídeo de interesse. O peptídeo pode também ser produzido in vitro adotando um sistema de tradução in vitro.

IV. POLINUCLEOTÍDEOS

[00058] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos peptídeos acima mencionados da presente invenção. Estes incluem polinucleotídeos derivados do gene de RAB6KIFL/KIF20A de ocorrência natural (Acesso do GenBank No. NM_005733 (SEQ ID NO: 1)) como também aqueles tendo uma sequência de nucleotídeo de modo conservador modificada dos mesmos. Aqui, a frase "sequência de nucleotídeo de modo conservador modificada" refere-se às sequências que codificam sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um número grande de ácidos nucleicos fun-cionalmente idênticos codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG, e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em cada posição onde uma alanina for especificada por um códon, o códon pode ser alterado para quaisquer dos có- dons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que é uma espécie de variações de modo conservador modificadas. Toda sequência de ácido nucleico aqui que codifica um peptídeo também descreve toda possível variação silenciosa do ácido nucleico. Alguém versado reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG que ordinariamente é o único códon para triptofano) pode ser modificado para render uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um pep- tídeo é descrita implicitamente em cada sequência descrita.

[00059] O polinucleotídeo da presente invenção pode ser composto de DNA, RNA, e derivados dos mesmos. Um DNA é adequadamente composto de bases tais como A, T, C, e G, e T é substituído por U em um RNA.

[00060] O polinucleotídeo da presente invenção pode codificar pep- tídeos múltiplos da presente invenção, com ou sem sequências de ami- noácido intervenientes entre as mesmas. Por exemplo, a sequência de aminoácido interveniente pode fornecer um sítio de clivagem (por exemplo, sequência de reconhecimento de enzima) do polinucleotídeo ou dos peptídeos transladados. Além disso, o polinucleotídeo pode incluir qualquer sequência adicional à sequência de codificação que codifica o peptídeo da presente invenção. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo recombinante que inclui sequências reguladoras requeridas para a expressão do peptídeo ou pode ser um vetor de expressão (plasmídeo) com genes marcadores e tais. Em geral, tais polinucleotídeos recombinantes podem ser preparados pela manipulação de polinucleotídeos através de técnicas recombinantes convencionais usando, por exemplo, polimerases e endonucleases.

[00061] Técnicas de síntese recombinante e química podem ser usadas para produzir os polinucleotídeos da presente invenção. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser produzido através de inserção em um vetor apropriado que pode ser expressado quando transfeccionado em uma célula competente. Alternativamente, um polinucleotídeo pode ser amplificado usando técnicas de PCR ou expressão em hospedeiros adequados (vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1989). Alternativamente, um polinucleotídeo pode ser sintetizado usando as técnicas de fase sólida, como descritas em Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

[00062] Vetores contendo o polinucleotídeo da presente invenção e células hospedeiras abrigando os vetores são também inclusos na presente invenção.

V. EXOSSOMAS

[00063] A presente invenção ainda fornece vesículas intracelulares denominadas exossomas, que apresentam complexos formados entre os peptídeos desta invenção e os antígenos de HLA em sua superfície. Exossomas podem ser preparadas, por exemplo usando os métodos detalhados nas Publicações de Kohyo do Pedido de Patente japonês Nos. Hei 11-510507 e WO99/03499, e podem ser preparadas usando APCs obtidas de pacientes que estão sujeitos ao tratamento e/ou à prevenção. As exossomas desta invenção podem ser inoculadas como vacinas, em uma maneira similar aos peptídeos desta invenção.

[00064] O tipo de antígenos de HLA compreendidos nos complexos tem que emparelhar ao do sujeito requerendo tratamento e/ou prevenção. O uso do tipo de HLA-A2 que é altamente expresso entre japoneses e caucasianos é favorável para obter resultados efetivos, e subtipos tais como HLA-A2 (A*0201) e HLA-A2 (A*0206) encontram uso. Tipicamente, na clínica, é investigado com antecedência o tipo de antígeno de HLA do paciente que requer tratamento, que permite seleção apropriada de peptídeos tendo níveis altos de afinidade de ligação a este antí- geno, ou tendo inductilidade de CTL através de apresentação de antí- geno. Além disso para se obter peptídeos que mostram afinidade de ligação alta e inductilidade de CTL, substituição ou adição de 1, 2, ou vários aminoácidos pode ser executada com base na sequência de aminoácido do peptídeo parcial de RAB6KIFL de ocorrência natural.

[00065] Quando usar antígeno de HLA-A2 (A*0201) para o exos- soma da presente invenção, um peptídeo tendo o peptídeo da sequência selecionada de SEQ ID NO: 3, 4 e 5 encontra uso.

VI. CÉLULAS DE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO (APCs)

[00066] A presente invenção também fornece APCs isoladas que apresentam complexos formados entre os antígenos de HLA e os peptí- deos desta invenção em sua superfície. As APCs que são obtidas contatando os peptídeos desta invenção, ou introduzindo os polinucleotí- deos codificando os peptídeos desta invenção em uma forma capaz de serem expressados, podem ser derivadas de pacientes que estão sujeito ao tratamento e/ou prevenção, e podem ser administradas como vacinas sozinhas ou em combinação com outros fármacos incluindo os peptídeos desta invenção, exossomas, ou células T citotóxicas.

[00067] As APCs não são limitadas a um tipo particular de células e incluem células dendríticas (DCs), células de Langerhans, macrófagos, células B, e células T ativadas que são conhecidas apresentar antíge- nos proteináceos em sua superfície celular para serem reconhecidas pelos linfócitos. Considerando que a DC é uma APC representativa tendo o CTL mais forte que induz ação entre as APCs, APCs, DCs encontram uso como as APCs da presente invenção.

[00068] Por exemplo, uma APC pode ser obtida induzindo DCs de monócitos de sangue periférico e depois contatando (estimulando) as mesmas com os peptídeos desta invenção in vitro, ex vivo ou in vivo. Quando os peptídeos desta invenção forem administrados aos sujeitos, as APCs que apresentam os peptídeos desta invenção são induzidas no corpo do sujeito. A frase "induzindo APC" inclui contatando (estimulando) uma célula com os peptídeos desta invenção, ou nucleotídeos codificando os peptídeos desta invenção para apresentar complexos formados entre os antígenos de HLA e os peptídeos desta invenção na superfície da célula. Alternativamente após introduzir os peptídeos desta invenção às APCs para permitir as APCs apresentar os peptídeos, as APCs podem ser administradas ao sujeito como uma vacina. Por exemplo, a administração ex vivo pode incluir as etapas de: a: coletar as APCs de um primeiro sujeito; b: contatar as APCs da etapa a com o peptídeo e c: administrar as APCs carregadas de peptídeo e um segundo sujeito.

[00069] O primeiro sujeito e o segundo sujeito podem ser o mesmo indivíduo, ou pode ser indivíduos diferentes. Alternativamente, de acordo com a presente invenção, uso dos peptídeos desta invenção para fabricação de uma composição farmacêutica induzindo células de apresentação de antígeno é fornecido. Além disso, a presente invenção fornece um método ou processo para fabricação de uma composição farmacêutica para induzir células de apresentação de antígeno, em que o método inclui a etapa de misturar ou formular o peptídeo da presente invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, a presente invenção fornece um método ou processo para fabricação de uma composição farmacêutica para tratar cânceres incluindo câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelu- lar, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC), em que o método inclui a etapa de misturar ou formular o peptídeo da presente invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável. Também, a presente invenção também fornece os peptídeos da presente invenção para induzir células de apresentação de antígeno. As APCs obtidas pela etapa (b) podem ser administradas ao sujeito como uma vacina.

[00070] Alternativamente, a presente invenção provê peptídeos para tratar cânceres incluindo câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC).

[00071] De acordo com um aspecto da presente invenção, as APCs da presente invenção têm um nível alto de inductilidade de CTL. No termo de "nível alto de inductilidade de CTL", o nível alto é com relação ao nível daquelas por APC contatando com nenhum peptídeo ou peptí- deos que não podem induzir o CTL. Tais APCs tendo um nível alto de inductilidade de CTL podem ser preparadas por um método que inclui a etapa de transferir genes contendo polinucleotídeos codificando os pep- tídeos desta invenção para APCs in vitro. Os genes introduzidos podem ser na forma de DNAs ou RNAs. Exemplos de métodos para introdução incluem, sem limitações particulares, vários métodos convencionalmente executados neste campo, tais como lipofecção, eletroporação, e método de fosfato de cálcio podem ser usados. Mais especificamente, pode ser executado como descrito em Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Tradução japonesa Publicada da Publicação Internacional No. 2000-509281. Transferindo o gene para as APCs, o gene sofre transcrição, tradução, e assim por diante na célula, e depois a proteína obtida é processada através de MHC da Classe I ou Classe II, e prossegue através de uma via de apresentação para apresentar peptídeos.

[00072] Em uma modalidade preferida, as APCs da presente invenção apresentam em sua superfície um complexo de um antígeno de HLA e um oligopeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID NO: 3, 4 e 5. Preferivelmente, as APCs da presente invenção carregam antígeno de HLA-A2, em particular HLA-A2 (A*0201) em sua superfície. Alternativamente, oligopeptídeo para formar complexo com um antígeno de HLA pode ser um oligopeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID NO: 3, 4, e 5, em que um, dois ou vários aminoácidos são substituídos, inseridos, deletados e/ou adicionados, por exemplo, o segundo aminoácido do término N pode ser substituído com leucina ou metionina, e/ou o ami- noácido C-terminal pode ser substituído com valina ou leucina.

VII. CÉLULAS T CITOTÓXICAS (CTL)

[00073] Uma célula T citotóxica induzida contra quaisquer dos pep- tídeos da presente invenção fortalece a resposta imune que visa endo- télios associados ao tumor in vivo e desse modo podem ser usados como vacinas, em uma maneira similar aos peptídeos per se. Desse modo, a presente invenção também fornece células T citotóxicas iso- ladas que são especificamente induzidas ou ativadas por quaisquer dos peptídeos presentes.

[00074] Tais células T citotóxicas podem ser obtidas (1) administrando a um sujeito e depois coletando as células T citotóxicas do sujeito, ou (2) contatando (estimulando) APCs derivadas do sujeito, e células CD8-positivas, ou leucócitos mononucleares de sangue periférico in vitro com os peptídeos da presente invenção e depois isolando as células T citotóxicas.

[00075] As células T citotóxicas, que foram induzidas por estimulação das APCs que apresentam os peptídeos desta invenção, podem ser derivadas de pacientes que estão sujeitos ao tratamento e/ou à prevenção, e podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros fármacos incluindo os peptídeos desta invenção ou exos- somas para o propósito de regular os efeitos. As células T citotóxicas obtidas atuam especificamente contra células alvo que apresentam os peptídeos desta invenção, ou por exemplo, os mesmos peptídeos usados para indução. Em outras palavras, as células T citotóxicas podem reconhecer (isto é, ligar) um complexo formado entre um antígeno de HLA e o peptídeo da presente invenção em uma superfície de célula alva com o receptor das células T e depois atacar a célula alvo para induzir a morte da célula alvo. As células alvo podem ser células que endogenamente expressam RAB6KIFL, ou células que são transfecci- onadas com o gene de RAB6KIFL; e células que apresentam um pep- tídeo desta invenção na superfície da célula devido à estimulação pelo peptídeo podem também servir como alvos de ataque de CTL ativado. Na modalidade preferida, as células alvo carregam antígeno de HLA- A2, em particular HLA-A2 (A*020) em sua superfície.

VIII. RECEPTOR DE CÉLULA T (TCR)

[00076] A presente invenção também fornece uma composição composta de uma sequência de ácido nucleico codificando os polipeptí- deos que são capazes de formar uma subunidade de um receptor de célula T (TCR), e métodos de usar o mesmo. O TCR alfa e beta tem a habilidade para formar TCR que confere especificidade às células T contra células tumorais expressando RAB6KIFL. Usando os métodos conhecidos na técnica, as sequências de ácidos nucleicos das cadeias de TCR alfa e beta do TCR expressado na CTL induzida com um ou mais peptídeos desta invenção podem ser isoladas e usadas para construir vetores adequados que podem mediar a transferência de gene com eficiência alta para linfócitos humanos primários (WO2007/032255 e Morgan RA et al., J Immunol, 171, 3287 (2003)). Por exemplo, estes vetores são vetores retrovirais. Vantajosamente, a invenção provê uma composição pronta para usar que permite modificação rápida das própriascélulas T de um paciente (ou aquelas de outro mamífero) para rápida e facilmente produzir células T modificadas tendo excelentes propriedades de destruição de células cancerosas.

[00077] Também, a presente invenção fornece CTLs que são preparadas através de transdução com os aminoácidos codificando os polipeptídeos das subunidades de TCR que ligam ao peptídeo de RAB6KIFL, por exemplo, SEQ ID NOs.: 3, 4 e 5 no contexto de HLA- A2 (A*0201). Os CTLs transduzidos são capazes de voltar para células de câncer in vivo, e podem ser expandidos por métodos de cultivo bem conhecidos in vitro (por exemplo, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). As células T da invenção podem ser usadas para formar uma composição imunogênica útil no tratamento ou prevenção de câncer em um paciente em necessidade de terapia ou proteção (WO2006/031221).

IX. AGENTES OU COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICOS

[00078] Os termos "prevenção" e "profilaxia" são alternadamente usados aqui para referir a qualquer atividade que reduza o fardo de mortalidade ou morbidez da doença. Prevenção e profilaxia podem ocorrer "em níveis de prevenção primários, secundários e terciários". Enquanto prevenção e profilaxia primárias evitam o desenvolvimento de uma doença, níveis secundários e terciários de prevenção e profilaxia abrangem atividades visadas para a prevenção e profilaxia da progressão de uma doença e o aparecimento de sintomas como também reduzindo o impacto negativo de uma doença já estabelecida restabelecendo a função e reduzindo complicações relacionadas à doença. Alternativamente, prevenção e profilaxia podem incluir uma gama extensiva de terapias profilácticasvisadas para aliviar a severidade do distúrbio particular, por exemplo, reduzindo a proliferação e metástase de tumores.

[00079] O tratamento e/ou profilaxia de câncer e/ou a prevenção de recorrência pós-operatória do mesmo incluem quaisquer das etapas seguintes, tais como a remoção cirúrgica das células cancerosas, a inibição do crescimento das células cancerosas, a involução ou regressão de um tumor, a indução de remissão e a supressão da ocorrência de câncer, a regressão do tumor, e a redução ou inibição da metástase. Efetivamente tratar e/ou a profilaxia de câncer diminuem a mortalidade e melhoram o prognóstico de indivíduos que têm câncer, diminuem os níveis de marcadores do tumor no sangue, e aliviam os sintomas detectáveis que acompanham o câncer. Por exemplo, redução ou melhoria dos sintomas constitui efetivamente tratar e/ou profilaxia inclui 10%, 20%, 30% ou mais de redução, ou doença estável.

[00080] Uma vez que a expressão de RAB6KIFL é suprarregulada em vários cânceres quando comparados com tecido normal, os peptí- deos desta invenção ou polinucleotídeos codificando tais peptídeos podem ser usados para o tratamento e/ou para a profilaxia de câncer, e/ou prevenção de recorrência pós-operatória do mesmo. Desse modo, a presente invenção provê um agente ou composição farmacêuticos para tratamento e/ou prevenção de câncer, e/ou prevenção da recorrência pós-operatória do mesmo, que inclui um ou mais dos peptídeos da pre sente invenção, ou polinucleotídeos codificando os peptídeos, como um ingrediente ativo. Alternativamente, os peptídeos presentes podem ser expressados na superfície de quaisquer das exossomas ou células anteriores, tais como APCs para o uso como agentes ou composição farmacêuticos. Além disso, as células T citotóxicas acima mencionadas que visam quaisquer dos peptídeos da presente invenção podem também ser usadas como o ingrediente ativo dos agentes ou composição farmacêuticos presentes. No contexto da presente invenção, a frase "visando um peptídeo"refere-se em reconhecer (isto é, ligar) um complexo formado entre um antígeno de HLA e um peptídeo em uma superfície de célula alvo com o receptor das células T, e depois atacar a célula alvo para induzir a morte da célula alvo.

[00081] Em outra modalidade, a presente invenção também fornece o uso de um ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção, (b) um ácido nucleico que codifica um tal peptídeo como descrito aqui em uma forma capaz de ser expressado, (c) uma APC da presente invenção, e (d) umas células T citotóxicas da presente invenção na fabricação de uma composição ou agente farmacêuticos para tratar câncer.

[00082] Alternativamente, a presente invenção também fornece um ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção, (b) um ácido nucleico que codifica um tal peptídeo como descrito aqui em uma forma capaz de ser expressado, (c) uma APC da presente invenção, e (d) umas células T citotóxicas da presente invenção para o uso no tratamento de câncer.

[00083] Alternativamente, a presente invenção também fornece um método ou processo para fabricação de uma composição ou agente farmacêutico para tratar câncer, em que o método ou processo inclui a etapa de formular um veículo farmacêutica ou fisiologicamente aceitável com um ingrediente ativo selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção, (b) um ácido nucleico que codifica um tal peptídeo como descrito aqui em uma forma capaz de ser expressado, (c) uma APC da presente invenção, e (d) umas células T citotóxicas da presente invenção como ingredientes ativos.

[00084] Em outra modalidade, a presente invenção também fornece um método ou processo para fabricação de uma composição ou agen-tefarmacêuticos para tratar câncer, em que o método ou processo inclui a etapa de misturar um ingrediente ativo com um veículo farmacêutica ou fisiologicamente aceitável, em que o ingrediente ativo é selecionado dentre: (a) um peptídeo da presente invenção, (b) um ácido nucleico que codifica um tal peptídeo como descrito aqui em uma forma capaz de ser expressado, (c) uma APC da presente invenção, e (d) umas células T citotóxicas da presente invenção.

[00085] Alternativamente, a composição ou agente farmacêuticos da presente invenção podem ser usados para qualquer um ou tanto a profilaxia de câncer como a prevenção de recorrência pós-operatória do mesmo.

[00086] Os agentes ou composições farmacêuticos presentes encontram uso como uma vacina. No contexto da presente invenção, a frase "vacina"(também referida como uma "composição imunogênica") refere-se a uma substância que tem a função para induzir imunidade antitumoral sob inoculação em animais.

[00087] Os agentes ou composições farmacêuticos da presente in- venção podem ser usados para tratar e/ou prevenir cânceres, e/ou prevenção de recorrência pós-operatória dos mesmos em sujeitos ou pacientes incluindo o homem e qualquer outro mamífero incluindo, mas não limitado a, camundongo, rato, cobaia, coelho, gato, cachorro, ovelha, cabra, porco, boi, cavalo, macaco, babuíno, e chimpanzé, particularmente um animal comercialmente importante ou um animal domesticado.

[00088] De acordo com a presente invenção, oligopeptídeos tendo uma sequência de aminoácido selecionada dentre SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 foram observados ser peptídeos de epítopo restringidos por HLA-A2 (A*0201), que podem induzir resposta imune potente e específica. Portanto, os agentes ou composições farmacêuticos presentes que incluem qualquer um destes oligopeptídeos com as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 são particularmente adequados para a administração em sujeitos cujo antígeno de HLA é HLA-A2 (A*0201)^O mesmo se aplica aos agentes ou composições farmacêuticos que incluem polinucleotídeos codificando qualquer um destes oligopeptídeos.

[00089] Cânceres a serem tratados pelos agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção não são limitados e incluem todos os tipos de cânceres em que RAB6KIFL está envolvido, incluindo, por exemplo, câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelu- lar, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC). Em particular, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção são preferivelmente aplicados em câncer pancreático.

[00090] Os agentes ou composições farmacêuticos presentes podem conter além dos ingredientes ativos acima mencionados, outros peptí- deos que têm a habilidade para induzir CTLs contra células cancerosas, outros polinucleotídeos codificando os outros peptídeos, outras células que apresentam os outros peptídeos, e assim por diante. Aqui, os ou- tros peptídeos que têm a habilidade para induzir CTLs contra células cancerosas são exemplificados por antígenos específicos ao câncer (por exemplo, TAAs identificados), mas não são limitados a estes.

[00091] Se necessário, os agentes ou composições farmacêuticos da presente invenção podem opcionalmente incluir outras substâncias terapêuticas como um ingrediente ativo, contanto que a substância não iniba o efeito antitumoral do ingrediente ativo, por exemplo, quaisquer dos peptídeos presentes. Por exemplo, as formulações podem incluir agentes ou composições anti-inflamatórios, eliminadores de dor, quimioterapêuticos, e similar . Além de incluir outras substâncias terapêuticas no próprio medicamento, os medicamentos da presente invenção podem também ser administrados sequencial ou simultaneamente com o um ou mais outros agentes ou composições farmacológicos. As quantidades de medicamento e agente ou composições farmacológicosdependem, por exemplo, de que tipo de agente(s) ou composição(ões) farmacológica(o)(s) é usado, da doença sendo tratada, e da programação e rotas de administração.

[00092] Deveria ser entendido que, além dos ingredientes particularmente mencionados aqui, os agentes ou composições farmacêuticos desta invenção podem incluir outros agentes ou composições convencionais na técnica tendo consideração ao tipo de formulação em questão.

[00093] Em uma modalidade da presente invenção, os agentes ou composições farmacêuticos presentes podem ser incluídos em artigos de fabricação e kits contendo materiais úteis para tratar as condições patológicas da doença a ser tratada, por exemplo, câncer. O artigo de fabricação pode incluir um recipiente de quaisquer dos agentes ou composições farmacêuticos presentes com uma etiqueta. Recipientes adequados incluem garrafas, frascos, e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. A etiqueta no recipiente deve indicar o agente ou composi- ções são usados para tratar ou prevenir uma ou mais condições da doença. A etiqueta pode também indicar direções para administração e assim por diante.

[00094] Além do recipiente descrito acima, um kit incluindo um agente ou composições farmacêuticos da presente invenção podem opcionalmente também incluir um segundo recipiente alojando um di- luente farmaceuticamente aceitável. Pode também incluir outros materiaisdesejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.

[00095] As composições farmacêuticos podem, se desejado, ser apresentadas em um pacote ou dispositivo dispensador que podem conter uma ou mais formas de dosagem de unidade contendo o ingrediente ativo. O pacote pode, por exemplo, incluir folha metálica ou plástica, tal como um pacote de bolha. O pacote ou dispositivo dispen- sador podem ser acompanhados por instruções para administração.

(1) Agentes ou composições farmacêuticos contendo os peptídeos como o ingrediente ativo

[00096] Os peptídeos desta invenção podem ser administrados diretamente como um agente ou composições farmacêuticos ou, se necessário, que foram formulados por métodos de formulação convencionais. No último caso, além dos peptídeos desta invenção, veículos, excipientes, e assim por diante que são normalmente usados para fármacos podem ser incluídos conforme apropriado sem limitações particulares. Exemplos de tais veículos são água esterilizada, solução salina fisiológica, tampão de fosfato, fluido de cultura e assim por diante. Além disso, os agentes ou composições farmacêuticos podem conter conforme necessário, estabilizantes, suspensões, conservantes, tensoativos e assim por diante. Os agentes ou composições farmacêuticos desta invenção podem ser usados para propósitos anticâncer.

[00097] Os peptídeos desta invenção podem ser preparados como uma combinação, composta de dois ou mais de peptídeos da invenção, para induzir CTL in vivo. A combinação de peptídeo pode levar à forma de um coquetel ou pode ser conjugado um com o outro usando técnicas padrões. Por exemplo, os peptídeos podem ser quimicamente ligados ou podem ser expressados como uma sequência de polipeptí- deo de fusão simples. Os peptídeos na combinação podem ser os mesmos ou diferentes. Administrando os peptídeos desta invenção, os peptídeos são apresentados em uma densidade alta pelos antígenos de HLA nas APCs, depois CTLs que especificamente reagem com o complexo formado entre o peptídeo exibido e o antígeno de HLA são induzidos. Alternativamente, APCs que apresentam quaisquer dos peptídeos desta invenção em sua superfície celular são obtidas removendo as APCs (por exemplo, DCs) dos sujeitos que são estimulados pelos peptídeos desta invenção, CTL é induzido nos sujeitos readmi- nistrando estas APCs (por exemplo, DCs) aos sujeitos, e como um resultado, agressividade para com as células cancerosas, tais como câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncerpancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC), pode ser aumentada.

[00098] Os agentes ou composições farmacêuticos para o tratamento e/ou prevenção de câncer, que incluem um peptídeo desta invenção como o ingrediente ativo, podem também incluir um adjuvante conhecido para efetivamente estabelecer imunidade celular. Alternativamente, eles podem ser administrados com outros ingredientes ativos, e eles podem ser administrados através de formulação em grânulos. Um adjuvante refere-se a um composto que intensifica a resposta imune contra a proteína quando administrado junto (ou sucessivamente) com a proteína tendo atividade imunológica. Adjuvantes contemplados aqui incluem aqueles descritos na literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Exemplos de adjuvantes adequados incluem, mas não são limitados a, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, alume, toxina de cólera, toxina de salmone- la, e assim por diante, mas não são limitados a estes.

[00099] Além disso, formulações de lipossoma, formulações granulares em que o peptídeo está ligado às contas de diâmetro de poucos micrômetros, e formulações em que um lipídio está ligado ao peptídeo podem ser convenientemente usadas.

[000100] Em algumas modalidades, os agentes ou composições far-macêuticos da invenção podem também incluir um componente que prepara a CTL. Os lipídios foram identificados como agentes ou composições capazes de preparar a CTL in vivo contra antígenos virais. Por exemplo, os resíduos de ácido palmítico podem ser prendidos aos grupos epsilo ou alfa-amino de um resíduo de lisina e depois ligados a um peptídeo da invenção. O peptídeo lipidado pode ser depois administrado ou diretamente em uma micela ou partícula, incorporado em um liposso- ma, ou emulsificado em um adjuvante. Como outro exemplo de preparação lipídica das respostas da CTL, lipoproteínas de E. coli, tais como tri- palmitoil-S-glicerilcisteinliseril- serina (P3CSS) podem ser usadas para preparar CTL quando covalentemente ligado a um peptídeo apropriado (vide, por exemplo, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

[000101] O método de administração pode ser injeção oral, intradér- mica, subcutânea, intravenosa, e assim por diante, e administração sistêmica ou administração local para as imediações dos sítios visados. A administração pode ser executada por administração simples ou reforçada por administrações múltiplas. A dose dos peptídeos desta invenção pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença a ser tratada, idade do paciente, peso, método de administração, e assim por diante, e usualmente é 0,001 mg a 1000 mg, por exemplo, 0,001 mg a 1000 mg, por exemplo, 0,1 mg a 10 mg, e pode ser admi- nistrada uma vez em poucos dias a poucos meses. Alguém versado na técnica pode apropriadamente selecionar uma dose adequada.

(2) Agentes ou composições farmacêuticos contendo poli- nucleotídeos como o ingrediente ativo

[000102] Os agentes ou composições farmacêuticos da invenção podem também conter ácidos nucleicos codificando os peptídeos descritos aqui em uma forma capaz de ser expressada. Aqui, a frase "em uma forma capaz de ser expressada" significa que o polinucleotídeo, quando introduzido em uma célula, será expressado in vivo como um polipeptídeo que induz imunidade antitumoral. Em uma modalidade exemplificada, a sequência de ácido nucleico do polinucleotídeo de interesse inclui elementos reguladores necessários para expressão do polinucleotídeo. O(s) polinucleotídeo(s) pode(m) ser equipado(s) assim para alcançar inserção estável no genoma da célula alvo (vide, por exemplo, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 para uma descrição de vetores de cassete de recombinação homólogos). Vide, por exemplo, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; Patentes U. S. 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; e WO 98/04720. Exemplos de tecnologias de liberação com base em DNA incluem "DNA descoberto", liberação facilitada (bupivacaína, polímeros, mediada por peptídeo), complexos de lipídios catiônicos, e liberação mediada por partícula ("pistola de gene") ou mediada por pressão (vide, por exemplo, Patente U. S. 5.922.687).

[000103] Os peptídeos da presente invenção podem também ser ex-pressadosatravés de vetores virais ou bacterianos. Exemplos de vetores de expressão incluem hospedeiros virais atenuados, tais como va- cínia ou varíola aviária. Esta abordagem envolve o uso de vírus de va- cínia, por exemplo, como um vetor para expressar sequências de nu- cleotídeo codificando o peptídeo. Sob introdução em um hospedeiro, o vírus de vacínia recombinante expressa o peptídeo imunogênico, e assim suscita uma resposta imune. Vetores de vacínia e métodos úteis em protocolos de imunização são descrito, por exemplo, na Patente U.S. 4.722.848. Exemplos de outro vetor incluem BCG (Bacille Calmette Guerin). Vetores de BCG são descritos em Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Uma ampla variedade de outros vetores úteis para administração terapêutica ou imunização por exemplo, vetores virais adeno e adeno-associados, vetores retrovirais, vetores de tifos de Salmonela, vetores de toxina de antraz desintoxicado, e outros, serão evidentes. Vide, por exemplo, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6:6671; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In vivo 2000, 14: 571-85.

[000104] Liberação de um polinucleotídeo em um sujeito ou pode ser direta, em cujo caso que o sujeito é exposto diretamente a um vetor por-tandopolinucleotídeo, ou indireta, em cujo caso, as células são transformadas primeiro com o polinucleotídeo de interesse in vitro, depois as célulassão transplantadas para o sujeito. Estas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapias de gene in vivo e ex vivo.

[000105] Para revisões gerais dos métodos de terapia de gene, vide Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu e Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem também ser usados para a presente invenção são descrito em eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; e Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

[000106] O método de administração pode ser injeção oral, intradér- mica, subcutânea, intravenosa, e assim por diante, e administração sistêmica ou administração local nas imediações dos sítios visados encontram uso. A administração pode ser executada por administração simples ou reforçada por administrações múltiplas. A dose do poli- nucleotídeo no veículo adequado ou células transformadas com o poli- nucleotídeo codificando os peptídeos desta invenção pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença a ser tratada, idade do paciente, peso, método de administração, e assim por diante, e é usualmente 0,001 mg a 1000 mg, por exemplo, 0,001 mg a 1000 mg, por exemplo, 0,1 mg a 10 mg, e pode ser administrado uma vez a cada poucos dias a uma vez a cada poucos meses. Alguém versado na técnica pode apropriadamente selecionar a dose adequada.

X. MÉTODOS USANDO OS PEPTÍDEOS, EXOSSOMAS, APCS E CTLS

[000107] Os peptídeos da presente invenção e polinucleotídeos codificando tais peptídeos podem ser usados para induzir APCs e CTLs. As exossomas e APCs da presente invenção podem ser também usados para induzir CTLs. Os peptídeos, polinucleotídeos, exossomas e APCs podem ser usados em combinação com qualquer outro composto, contanto que os compostos não inibam sua inductilidade de CTL. Desse modo, quaisquer dos agentes ou composições farmacêuticos acima mencionados da presente invenção podem ser usados para induzir CTLs, e além disso destes, aqueles incluindo os peptídeos e po- linucleotídeos podem também ser usados para induzir APCs como debatido abaixo.

(1) Método de induzir células de apresentação de antígeno (APCs)

[000108] A presente invenção fornece métodos de induzir APCs usando os peptídeos desta invenção ou polinucleotídeos codificando os peptídeos. A indução de APCs pode ser executada como descrita acima na seção "VI. Células de Apresentação de Antígeno". Esta invenção também provê um método para induzir APCs tendo um nível alto de inductilidade de CTL, a indução destas foi também mencionada sob o item "VI. Células de Apresentação de Antígeno", supra.

[000109] Preferivelmente, os métodos para induzir APCs incluem pelo menos uma etapa selecionada dentre: a: contatar APCs com os peptídeos da presente invenção, e b: introduzir os polipeptídeos da presente invenção em uma forma capaz de serem expressada em APCs.

[000110] Tais métodos para induzir APCs são preferivelmente executadosin vitro ou ex vivo. Quando os métodos executados in vitro ou ex vivo, as APCs a ser induzidas podem ser obtidas de um sujeito a ser tratado ou outros cujos antígenos de HLA são os mesmos que o sujeito. Na modalidade preferida, as APCs induzidas pelos métodos presentes carregam antígeno de HLA-A2, em particular HLA-A2 (A*0201) em sua superfície.

(2) Método de induzir CTLs

[000111] Além disso, a presente invenção provê métodos para induzir CTLs usando os peptídeos desta invenção, polinucleotídeos codificando os peptídeos, ou exossomas ou APCs que apresentam os peptídeos.

[000112] A presente invenção também provê métodos para induzir CTLs usando um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo que é capaz de formar uma subunidade do receptor de células T (TCR) que reconhece (isto é, liga) um complexo dos peptídeos da presente invenção e antígenos de HLA em uma superfície da célula. Preferivelmente, os métodos para induzir CTLs incluem pelo menos uma etapa selecionada dentre: a: contatar uma célula T CD8-positiva com uma célula de apresentação de antígeno e/ou uma exossoma que apresenta em sua superfície um complexo de um antígeno de HLA e um peptídeo da presente invenção, e b: introduzir um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo que é capaz de formar uma subunidade de TCR que reconhece um complexo de um peptídeo da presente invenção e um antígeno de HLA em uma célula T CD8 positiva.

[000113] Quando os peptídeos desta invenção forem administrados a um sujeito, CTL é induzida no corpo do sujeito, e a resistência da resposta imune que visa os endotélios associados ao tumor é intensificada. Alternativamente, os peptídeos e polinucleotídeos codificando os peptídeos podem ser usados para um método terapêutico ex vivo, em que APCs derivados do sujeito e células CD8-positivas, ou leucócitos mononucleares de sangue periférico, são contatados (estimulados) com os peptídeos desta invenção in vitro, e após induzir a CTL, as células de CTL ativadas são devolvidas ao sujeito. Por exemplo, o método pode incluir as etapas de: a: coletar APCs do sujeito; b: contatar as APCs da etapa a com o peptídeo; c: misturar as APCs da etapa b com as células T de CD8+, e cocultivar para induzir CTLs; e d: coletar as células T de CD8+ da cocultura da etapa c.

[000114] Alternativamente, de acordo com a presente invenção, uso dos peptídeos desta invenção para fabricação de uma composição farmacêutica induzindo CTLs é fornecido. Além disso, a presente invenção fornece um método ou processo para fabricar um agente ou composição farmacêuticos induzindo CTLs, em que o método compreende a etapa de misturar ou formular o peptídeo da presente invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável. Também, a presente invenção também provê o peptídeo da presente invenção para induzir CTLs.

[000115] As células T de CD8+ tendo atividade citotóxica obtidas pela etapa d podem ser administradas ao sujeito como uma vacina. As APCs a serem misturadas com as células T de CD8+ na etapa c acima podem também ser preparadas transferindo genes codificando para os peptídeos presentes nas APCs como detalhado acima na seção "VI. Células de Apresentação de Antígeno"; mas não limitados a estes e qualquer APC ou exossoma que efetivamente apresenta os peptídeos presentes às células T podem ser usados para o método presente.

[000116] Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporados por referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não intencionados ser limitativos.

[000117] Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar a presente invenção e ajudar alguém versado fazer e usar a mesma. Os exemplos não são de forma alguma, do contrário, intencionados a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS ANÁLISE DO MICROARRANJO DE cDNA

[000118] Um perfilamento da expressão gênica por uma análise de microarranjo de cDNA foi feito como previamente descrito (Nakamura T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400). As amostras de tecido de cânceres pancreáticos e tecidos pancreáticos normais não cancerosos adjacentes foram obtidos de espécimes cirúrgicos, e todos os pacientes forneceram seu consentimento por escrito informado para participar neste estudo. Nas Figs. 1C, a razão de expressão relativa foi calculada dividindo o valor da expressão de mRNA de RAB6KIFL em células de câncer por aquele na contraparte normal. Nas Figs. 1B, a razão de expressão relativa dos tecidos normais foi calculada dividindo o valor da expressão de mRNA de RAB6KIFL em cada tecido normal pelo valor da expressão de mRNA de RAB6KIFL no RNA de controle que era uma mistura de quantidade igual das amostras de RNA de 40 tecidos normais indicados nas Figs. 1B.

CAMUNDONGOS

[000119] Camundongos geneticamente modificados em dobro de Tgm de HLA-A2.1 (HHD); de H-2Db-/- beta 2m-/- introduzidos com um gene de construção de monocadeia de beta 2m-HLA-A2.1 humano (alfa 1, alfa 2)-h-2Db (citoplásmico de transmembrana alfa 3; HHD) foram gerados no Department SIDA-Retrovirus, Unite d' Immunite Cellulaire Antivirale, Institute Pasteur, França (Pascolo S, et al. J Exp Med 1997;185:2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999;29:3112-21) e gentilmente fornecido pelo Dr. F. A. Lemonnier. Os camundongos foram mantidos no Center for Animal Resources and Development of Kumamoto University e eles foram manipulados de acordo com as diretrizes de cuidado de animais da Universidade de Kumamoto.

LINHAGENS CELULARES E EXPRESSÃO DE HLA-A

[000120] Linhagem celular de câncer pancreático humana PANC1, linhagem celular de câncer de cólon humano CaCo-2, e uma linhagem celular deficiente de TAP e HLA-A2 (linhagem celular A*0201)-positiva foram compradas de Riken Cell Bank (Tsukuba, Japão). A linhagem celular de câncer pancreático humana PK8 foi gentilmente fornecida pelo Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University (Sendai, Japão). A linhagem celular de câncer hepático humana SKHep1 foi gentilmente fornecida pelo Dr. Kyogo Ito, Kurume University (Kurume, Japão). A expressão de HLA-A2 foi examinada usando citometria de fluxo com um anticorpo monoclonal anti- HLA-A2 (mAb), BB7.2 (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA) para se-lecionar os doadores de sangue HLA-A2-positivos e linhagens celulares alvo para os ensaios de citotoxicidade. Estes células foram mantidasin vitro em meio RPMI 1640 ou DMEM para suplementar com 10% de FCS em uma atmosfera de 5% de CO2 a 37 graus C.

PACIENTES, AMOSTRAS DE SANGUE, E TECIDOS TUMORAIS.

[000121] A investigação clínica usando PBMCs dos doadores foi aprovada pela Institutional Review Board of Kumamoto University, Kumamoto, Japão. As amostras de sangue e o câncer e os tecidos não cancerosos adjacentes foram obtidas durante os procedimentos de diagnósticos rotineiros após obter consentimentos informados escritos formais pelos pacientes no Kumamoto University Hospital. Amostras de sangue foram também obtidas de doadores saudáveis após receber seu consentimento informado por escrito. Todas as amostras eram anônimas, numeradas aleatoriamente, e armazenadas a -80 graus C até o uso. Todos os pacientes e doadores saudáveis eram de nacionalidade japonesa.

ANÁLISE DE PCR DE TRANSCRIÇÃO REVERSA E DE NORTHERN BLOT.

[000122] Análise de PCR de transcrição reversa (RT-PCR) de tecidos normais e cancerosas e linhagens celulares foi feita para avaliar a expressão de RAB6KIFL no nível de mRNA. As sequências do iniciador eram como segue: RAB6KIFL, sentido 5’- CTACAAGCAC- CCAAGGACTCT -3' (SEQ ID NO: 6) e antissentido 5’- AGATGGA- GAAGCGAATGTTT -3’ (SEQ ID NO: 7) e beta-actina, sentido 5’- CA- TCCACGAAACTACCTTCAACT -3’ (SEQ ID NO: 8) e antissentido 5’- TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG -3’ (SEQ ID NO: 9), e reações de RT-PCR usadas que consistem em desnaturação inicial a 94 graus C durante 5 minutos e 32-35 ciclos de amplificação a uma temperatura de cozimento de 58 graus C. Após normalização através de mRNA de beta-actina como um controle, a expressão de mRNA de RAB6KIFL foi comparada em tecidos e linhagens celulares.

ANÁLISE DE WESTERN BLOT E EXAME IMUNOISTOQUÍMICO.

[000123] Western blot e tingimento imunoistoquímico foram executa- dos de proteína de RAB6KIFL como previamente descrito (Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44. Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48.). Para as análises de western blot de tecidos normais humanos, um tingimento de tecido normal adulto humano pré-feito (Biochain, Hayward, CA) foi usado. Os anticorposprimários aqui usados, anticorpo policlonal anti-RAB6KIFL, e anticorpo monoclonal anti-b-actina, foram comprados de Bethyl Labo- ratorues, Inc. (Montgomery, TX, EUA) e Sigma (Steinheim, Alemanha), respectivamente. Tingimento imunoistoquímico de CD4 ou CD8 em espécimes de tecido de Tgm de HLA-A2.1 (HHD) imunizado com o peptídeo de RAB6KIFL-A2-10-284 foi feito como previamente descrito (Matsuyoshi H, et al. 2004;172:776-86).

TRANSFERÊNCIA DE GENE LENTIVIRAL

[000124] Uma transferência de gene lentiviral mediada por vetor foi executada como previamente descrito (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002; 30:117). Brevemente, 17 micro-g de vetores autoinativados com CSII-CMV- RfA e CSIIEF-RfA (Miyoshi H, et al. J Virol 1998; 72: 8150-7) carregando cDNAs de RAB6KIFL e 10 micro-g de pCMV-VSV-g-RSV-rev e pCAG-HIVgp foram transfeccionados para as células 293T crescidas em um prato de cultura de 10 cm usando reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA). Após 60 h de transfec- ção, o meio restabeleceu-se e as partículas virais foram empelotadas através de ultracentrifugação (50.000 x g, 2 h). A pelota foi suspensa em 50 micro-L de meio de RPMI 1640 e 10 micro-L de suspensão viral foram acrescentados às 5 x 104células de SKHep1, por poço em uma placa de 96 poços de fundo chato. A expressão do gene de RAB6KIFL transfeccionado foi confirmada por uma análise de western blot.

INDUÇÃO DE CTLS DE CAMUNDONGO REATIVO COM RAB6KIFL E ENSAIO DE IMUNOTINGMENTO LIGADO À ENZIMA DE IFN-GAMA.

[000125] Peptídeos derivados de RAB6KIFL humanos (pureza > 95%), carregando motivos de ligação para moléculas codificadas com HLA-A2 (A*0201), foram selecionados usando o programa de software BIMAS (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for Information Technology, NIH, Bethesda, MD) e 36 peptídeos foram sintetizados (American Peptide Company, CA, EUA). Peptídeo de HIV restringido com HLA- A2 (SLYNTYATL) (SEQ ID NO: 10) foi usado como um peptídeo irrelevante. A imunização dos camundongos com peptídeos foi feita como previamente descrito (Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2003; 306:16-25). A frequência de células produzindo IFN-gama/1 x 105células do baço de CD4- sob estimulação com BM-DC singeneico (1 x 104/poço) pulsadas com ou sem cada peptídeo foi analisada por um ensaio de imu- notingimento ligado à enzima (ELISPOT) como previamente descrito (Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-97).

INDUÇÃO DE CTLS HUMANOS REATIVOS COM RAB6KIFL

[000126] Peptídeos derivados de RAB6KIFL humanos (pureza > 95%), carregando motivos de ligação para moléculas codificadas com HLA-A2 (A*0201) foram selecionados usando o programa de software BIMAS (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for Information Technology, NIH, Bethesda, MD) e 36 peptídeos foram sintetizados (American Peptide Company, CA, EUA) (Tabelas 1A e B). DCs derivadas de monócitos são usados como células de apresentação de antígeno para induzir respostas de CTL contra peptídeos apresentados no contexto de HLA. DCs foram geradas em cultura in vitro como previamente descrito (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; in press, Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press). Brevemente, PBMCs isoladas de um voluntário normal positivo para HLA-A2 usando solução de placa Ficoll (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, RU) foram classificadas para população de CD8+ e população de CD14+ com microcon- tas (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Para gerar as DCs, a população de CD14+ foi cultivada na presença de 100 ng/mL de fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF; PeproTec Inc., NJ, EUA) e 10 ng/mL de interleucina (IL)-4 (PeproTec) em AIM-V (Invitrogen) contendo 2% de plasma autólogo inativado com calor. Após 5 dias de cultura, OK-432 foi adicionado ao prato para fazer as DCs amadurecerem. Em sete dias após começo do cultivo das DCs geradas com citocina, elas foram pulsadas com 20 ng/mL de pep- tídeos de ligação de HLA-A2 na presença de 4 micro-g/ml de beta 2- microglobulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) por 2h a 37 graus C em AIM-V. Estas DCs pulsadas com peptídeos foram depois irradiadas (40 Gy) e misturadas em uma razão de 1:50 com células T de CD8+ autólogas obtidas por seleção positiva de PBMCs com micro- contas anti-CD8 (Miltenyi Biotec). Estas culturas foram fixadas em placas de 24 poços, cada poço continha 1 X 105 DCs pulsadas com pep- tídeo, 2 X 106células T de CD8+ e 5 ng/mL de IL-7 humana recombi- nante (Wako, Osaka, Japão) em 2 ml de AIM-V com 2% de plasma autólogo. Após 2 dias, estas culturas foram suplementadas com IL-2 humano recombinante (PeproTec Inc.) para uma concentração final de 20 IU/mL. Duas estimulações semanais adicionais com DCs autólogas carregadas com peptídeo usando o mesmo procedimento foram realizadas no dia 7 e 14. Seis dias após a última estimulação, as respostas antígeno-específicas dos CTLs induzidos foram investigadas por ensaio de liberação de 51Cr e ensaio de ELISPOT de IFN-gama.

RESPOSTAS DE CTL CONTRA LINHAGENS CELULARES DE CÂNCER.

[000127] Os CTLs foram cocultivados com cada uma das células de câncer, ou das células T2 pulsadas com peptídeo, como uma célula alvo (5 X 103/poço) na razão de efetor/alvo indicada e um ensaio de liberação de 51Cr padrão foi feito como previamente descrito (Yoshi- take Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48. Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press). Brevemente, as células alvo foram marcadas com 3,7 de KBq Na2 51Cr4 (Perkin Elmer Life Science) por 1 h a 37 graus C em uma incubadora de CO2. As células alvo marcadas foram enxaguadas três vezes, e as células alvo pulsadas com peptídeo foram preparadas incubando as células com 20 micro g/ml de peptídeo por 3 h a 37 graus C. As células alvo foram misturadas com as células efetoras em volume final de 200 micro L em placas de microtitulação de fundo redondo e incubadas. Após 6h de incubação, 50 micro L do sobrenadante foram colhidos de cada poço e a radioatividade foi quan-tificada usando contador gama. A citotoxicidade específica foi avaliada calculando a porcentagem de liberação de 51Cr específica.

[000128] O bloqueio de classe I de HLA, ou HLA-DR, foi feito como previamente descrito (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48., Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; in press). Em resumo, antes da cocultura dos CTLs com uma linhagem celular de câncer no ensaio de liberação de 51Cr ou ensaio de ELISPOT, as células de câncer alvo foram incubadas por 1 hora com 10 micro g/ml de anti-mAb classe I, W6/32, ou 10 micro g/ml de mAb anti-HLA-Dr, H- DR-1, e depois os efeitos dos mAbs ou na atividade citotóxica ou na produção de IFN-gama pelos CTLs foram examinados.

ANÁLISE ESTATÍSTICA.

[000129] O teste t-Student bicaudal foi usado para avaliar a significação estatística das diferenças nos dados obtidos pelo ensaio de ELISPOT e no tamanho de tumor entre os grupos de tratamento. Um valor de P < 0,05 foi considerado ser significativo. A análise estatística foi executada usando um pacote de software estatístico comercial (SPSS para Windows, versão 11.0, Chicago, IL, EUA).

RESULTADOS IDENTIFICAÇÃO Do GENE DE RAB6KIFL SUPRARREGULADO EM CÂNCER PANCREÁTICO E VÁRIAS MALIGNIDADES COM BASE EM UM MICROARRANJO DE cDNA.

[000130] Usando um microarranjo de cDNA de genoma amplo contendo 27.648 genes, os perfis de expressão gênica de 6 tecidos de câncer pancreático e suas que contrapartes normais adjacentes tinham sido previamente examinadas. Após a análise, 6 genes foram escolhidos. Porque a razão de expressão relativa destes genes era mais de cinco vezes mais alta em tecidos de câncer pancreático em comparação com suas contrapartes normais (Fig. 1A) (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95). A expressão destes genes foi analisada usando uma análise de microarranjo de cDNA em 29 tipos de tecidos normais incluindo 4 tecidos embrionários (Fig. 1B). Por con-seguinte, RAB6KIFL/KIF20A foi focalizado como um TAA novo de câncer pancreático. A expressão do gene de RAB6KIFL em tecidos de câncer pancreático foi intensificada notadamente em todos os 6 pacientes testados (a média da razão de expressão relativa: 32.000, faixa: 15-72.000). Além disso, o gene de RAB6KIFL foi expressado fracamente apenas nos testículos e timo (Fig. 1B). O nível de expressão do gene de RAB6KIFL foi também intensificado em cânceres de pulmão e bexiga com base na análise do microarranjo de cDNA anterior (Fig. 1C) (Nakamura T, et al. Oncogene 2004; 23:2385-400, Kitahara O, et al. Cancer Res 2001; 61: 3544-9, Hasegawa S, et al. Cancer Res 2002; 62: 7012-7, Kikuchi T, et al. Oncogene 2003; 22: 2192-205, Obama K, et al. Hepatology 2005; 41: 1339-48).

EXPRESSÃO DE mRNA E PROTEÍNA DE RAB6KIFL EM ÓRGÃOS NORMAIS, LINHAGENS CELULARES DE CÂNCER, E TECIDOS DE CÂNCER PANCREÁTICO.

[000131] A expressão do gene de RAB6KIFL em tecidos normais no nível de mRNA foi analisada usando análise de RT-PCR. Uma análise de RT-PCR semiquantitativa de RAB6KIFL nos tecidos normais reve- lados foi expressada apenas nos testículos (Fig. 2A). A expressão do gene de RAB6KIFL foi detectada em quase todas linhagens celulares de câncer pancreático HLA-A2-positivas e outras usando uma análise de RT-PCR (Fig. 2B).

[000132] Subsequentemente, a expressão do gene de RAB6KIFL foi analisada usando uma análise de RT-PCR nos tecidos de câncer pan- creático e suas contrapartes normais adjacentes que foram ressecadas cirurgicamente. A expressão do gene de RAB6KIFL foi detectada em 5 dos 8 tecidos de câncer pancreático, mas pequena expressão foi detectada em suas contrapartes normais (Fig. 2C). Além disso, sua expressão foi detectada nos focos metastáticos da pele e peritôneo.

[000133] A expressão da proteína de RAB6KIFL em tecidos normais cancerosos e vários seja também examinou por western blot (Figs. 3A, B). Proteína de RAB6KIFL não pôde ser detectada em oito tecidos normais e testículos deu uma banda muito lânguida com a que teve mobilidade similar aquele observou em um lisado de células de PANC1 (Fig. 3A). Por outro lado, proteína de RAB6KIFL foi detectada em tecidos de câncer pancreático de dois pacientes examinados mas não nos tecidos normais adjacentes (Fig. 3B).

[000134] Para confirmar a supraexpressão associada ao tumor da proteína de RAB6KIFL, muitos espécimes de tecido de câncer pan- creático foram embebidos em parafina depois examinados por análisesimunoistoquímicas. Tingimento forte de RAB6KIFL foi principalmente observado no citoplasma de células de câncer em câncer pancreático, enquanto que tingimento muito fraco foi observado em células acinosas e epitélio ductal normal de seus tecidos pancreáti- cos adjacentes normais (Fig. 4A). Além disso, tingimento forte simi-lar foi observado nos focos metastáticos do peritôneo (Fig. 4A). Nenhum tingimento foi detectado nos espécimes de tecido de pancreatite de formação de tumor (Fig. 4A). RAB6KIFL não foi tingido no cé- rebro normal, pulmão, fígado, rim, estômago, intestino delgado, cólon,baço, músculo esquelético, pele, timo e testículos (Fig. 4B).

PREDIÇÃO DOS PEPTÍDEOS DE LIGAÇÃO DE HLA-A2 (A*0201) DERIVADOS DE RAB6KIFL

[000135] Tabela 1A e B mostram peptídeos de ligação de HLA-A2 (A*0201) da proteína de RAB6KIFL na ordem de contagem da afinidade de ligação de predição alta. No total, 36 peptídeos foram selecionados com atividade de ligação de HLA-A2 potencial. TABELA 1 A TABELA 1A - PEPTÍDEOS DE 9mer DE LIGAÇÃO DE HLA-A2 (A*0201) DERIVADOS DE RAB6KIFL

[000136] Posição inicial indica o número de aminoácido do término N de RAB6KIFL. Contagem de ligação é derivada nos Materiais e Métodos. TABELA 1B TABELA 1B - PEPTÍDEOS DE 10mer DE LIGAÇÃO DE HLA-A2 (A*0201) DERIVADOS DE RAB6KIFL

[000137] Posição inicial indica o número de aminoácido do término N de RAB6KIFL. Contagem de ligação é derivada nos Materiais e Métodos.

IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS DE CTL DE CAMUNDONGO DERIVADO DE RAB6KIFL E RESTRINGIDO COM HLA-A2 USANDO CA-MUNDONGOS TRANSGÊNICOS DE HLA-A2.1 (HHD)

[000138] Para identificar os epítopos de CTL derivados de RAB6KIFL e restringidos com HLA-A2, 36 peptídeos candidatos diferentes foram selecionados. Cada consistiu em 9 ou 10 aminoácidos que têm contagem de ligação preditiva alta para HLA-A2 (A*0201), o produto alélico de HLA mais comum mundial, com base no algarismo de predição de ligação de peptídeo de HLA fornecido pelo NIH BIMAS (Tabelas 1A, B). Para determinar o que poderia induzir CTLs reativos com peptídeo, células do baço de CD4- isoladas de Tgm de HLA-A2.1 (HHD), i.p., imunizadas duas vezes com BM-DCs pulsadas com os doze conjuntos da mistura de três tipos de peptídeos selecionados destes 36 peptí- deos, foram novamente estimuladas in vitro com BM-DCs pulsadas com cada peptídeo. Os resultados mostraram que as células do baço de CD4-, estimuladas com RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809, e peptídeo de RAB6KIFL-A2-10-284, produziram uma quantidade significativa de IFN-gama de uma maneira peptídeo-específica em um ensaio de ELISPOT (Fig. 5A). Estas células do baço de CD4- (2 x 104) mostraram 149.0 mais/menos 22,2 contagem de mancha/poço em resposta às BM-DCs pulsadas com o peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-12, enquanto que elas mostraram 32,6 mais/menos 9,9 contagens de mancha/poço na presença do BM-DCs sem carga de peptídeo (P < 0,01). Igualmente, as células do baço de CD4- estimuladas com BM- DCs pulsadas com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-809 mostraram 117,2 mais/menos 23,4 contagens de mancha/poço, enquanto que elas mostraram 51,4 mais/menos 7,8 contagens de mancha/poço na presença de BM-DCs sem carga de peptídeo (P < 0,01). Além disso, as células do baço de CD4- estimuladas com BM-DCs pulsadas com peptídeo de RAB6KIFL-A2-10-284 também mostraram 141,2 mais/menos 5,5 contagens de mancha/poço, enquanto que elas mostraram 19,2 mais/menos 5,2 contagens de mancha/poço na presença de BM-DCs sem carga de peptídeo (P < 0,01). Nenhuma resposta peptídeo- específica significativa foi observada com os outros peptídeos. Estes resultados sugerem que os peptídeos de RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809 e RAB6KIFL-A2-10-284 poderiam ser os peptí- deos de epítopo de CTL restringido com HLA-A2 no Tgm de HLA-A2.1 (HHD), e aqueles peptídeos foram esperados ser epítopos para CTLs humanos.

NENHUM FENÔMENO AUTOIMUNE INDUZIDO PELA IMUNIZAÇÃO COM PEPTÍDEO DE EPÍTOPO, RAB6KIFL-A2-9-809, EM Tgm DE HLA-A2.1 (HHD)

[000139] É muito importante investigar se a imunização com peptí- deo de RAB6KIFL induz uma reação autoimune ou não. Nós desse modo executamos a análise imunoistoquímica de vários órgãos vitais com mAb anti-CD4 e anti-CD8 em Tgm de HLA-A2 (HHD) após vacinação de dois tempos com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-809, dos quais as sequências de aminoácido ficaram completamente conservadas entre o RAB6KIFL humano e de camundongo. Como resultado, nenhuma alteração patológica, tal como infiltração de linfócitos ou destruição de tecidos sugerindo autoimunidade foi observada (Fig. 5B). As anormalidades frequentemente observadas em camundongos afetados com doenças autoimunes tais como cabelo e pele anormais, diarréia e perda de peso também não foi observado nestes camundongos. Estes resultados indicam que linfócitos estimulados com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-809 não atacam os tecidos normais pelo menos em Tgm de HLA-A2.

INDUÇÃO DE CTLS REATIVAS COM RAB6KIFL DAS PBMCS DE DOADORES SAUDÁVEIS HLA-A2 (A*0201)-POSITIVOS

[000140] A geração de CTLs RAB6KIFL-específicas foi tentada das PBMCs de doadores saudáveis positivo para HLA-A2 (A*0201) pela estimulação com os peptídeos de RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) e RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5). PBMCs foram isoladas de doadores saudáveis HLA-A2- positivos, e as células T de CD8+ classificadas das PBMCs foram incubadas com as DCs derivadas de monócito autólogas pulsadas com cada peptídeo. Após estimulações de três vezes, a atividade citotóxica contra as células T2 pulsadas com peptídeo foi examinada por um ensaio de liberação de 51Cr (Fig. 6A) e um ensaio de ELISPOT de IFN- gama (dados não mostrados). Os CTLs induzidos das PBMCs de dois doadores saudáveis exibiram atividade citotóxica para as células T2 pulsadas com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) ou RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5), mas não para as células T2 pulsadas com peptídeo de HIV restringido com HLA-A2 e irrelevante, ou sem carga de peptídeo. Respostas similares foram observadas em outros doadores (dados não mostrados). Estes resultados indicam que estes CTLs tiveram uma citoto- xicidade peptídeo-específica.

[000141] Subsequentemente, foi investigado se estes CTLs seriam capazes de matar linhagens celulares de câncer humanas que expressam RAB6KIFL e HLA-A2 (A*0201). Como mostrado nas Figs. 6B, os CTLs reativos com RAB6KIFL estimulados com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-12 (esquerda), RAB6KIFL-A2-9-809 (meio), ou RAB6KIFL-A2-10-284 (direita) exibiram citotoxicidade para PANC1 (RAB6KIFL+, HLA-A2+), CaCo-2 (RAB6KIFL+, HLA-A2+), mas não para PK8 (RAB6KIFL+, HLA-A2-) em doadores saudáveis.

[000142] Além disso, células de SKHep1/RAB6KIFL (RAB6KIFLalto, HLA-A2+), SKHep1 (RAB6KIFLbaixo, HLA-A2+) transfeccionadas com o gene de RAB6KIFL (Fig. 2B) foram usadas como células alvo para confirmar que estes peptídeos foram processados naturalmente da proteína de RAB6KIFL nas células cancerosas. Como mostrado na Fig. 6C, os CTLs induzidos por estimulação com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-12 (esquerda), RAB6KIFL-A2-9-809 (meio), e RAB6KIFL-A2-10-284 (direita) exibiram citotoxicidade contra SKHep1/RAB6KIFL, mas não contra SKHep1/Mock. Estes resultados sugerem que estes peptídeos poderiam ser naturalmente processados e poderiam ser expressados na superfície das células cancerosas no contexto das moléculas de HLA-A2.

[000143] Para confirmar que as CTLs induzidas reconheceram as células alvo em uma maneira restringida com classe I de HLA, um ensaio de bloqueio de classe I de HLA foi executado usando o mAb contra classe I de HLA (W6/32) foi usado para bloquear o reconhecimento das células de câncer pelos CTLs (Fig. 6D). Como resultado, o anticorpo anti-classe I de HLA poderia notadamente inibir a produção de IFN-gama estimulada com células de PANC1 em um ensaio de ELIS- POT dos CTLs gerados por estimulação com peptídeo de RAB6KIFL- A2-9-12 (esquerda), RAB6KIFL-A2-9-809 (meio), ou RAB6KIFL-A2-10- 284 (direita), com significação estatística (Fig. 6D, P < 0,01). Estes resultados claramente indicam que estes CTLs induzidos reconheceram as células alvo que expressam RAB6KIFL em uma maneira restringida com classe I de HLA.

DEBATE

[000144] De acordo com o exemplo, foi mostrado que RAB6KIFL é um TAA como um alvo promissor da imunoterapia anticâncer para câncer pancreático. Para estabelecer a imunoterapia anticâncer, é importante identificar os TAAs que são expressados fortemente em células tumorais mas não nas células normais. A análise do microarranjo de cDNA mostrou que mRNA de RAB6KIFL foi supraexpressado em células de câncer pancreático (Imai K, Hirata S, Irie A, Senju S, Ikuta Y, Yokomine K, Harao M, Inoue M, Tsunoda T, Nakatsuru S, Nakaga- wa H, Nakamura Y, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95) e ape-nas expressado em suas contrapartes normais e muitos tecidos adultos normais com exceção dos testículos e timo (Fig. 1B). Além disso, o gene de RAB6KIFL foi também supraexpressado em cânceres de pulmão e bexiga como também em câncer pancreático (Fig. 1C). Na análise de RT-PCR demonstrou-se que mRNA de RAB6KIFL foi frequentemente expresso em várias linhagens celulares de câncer e tecidos de câncer pancreático, mas não em tecidos normais adultos incluindo medula óssea com exceção dos testículos (Fig. 2). Similarmente, as análises de western blot e análises imunoistoquímicas revelaram que a proteína de RAB6KIFL foi detectada em células de câncer pan- creático, mas não em suas contrapartes normais e tecidos adultos normais incluindo timo com exceção dos testículos (Figs. 3, 4). Estas observações suportam uma característica de RAB6KIFL como um TAA semelhante ao câncer dos testículos em um nível de proteína.

[000145] Para a identificação dos TAAs como alvos úteis para imu- noterapia anticâncer, outro ponto chave é selecionar os antígenos que são indispensáveis para a proliferação, invasão, metástase, e sobrevivência das células cancerosas. Recentemente, Taniuchi et al. relatou que RAB6KIFL está envolvido em carcinogênese pancreática (Taniu- chi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12), além de seu papel previamente descrito no tráfego de membrana (Echard A, et al. Science 1998;279:580-5) e citocinese (Fontijn RD, et al. Mol Cell Biol 2001;21:2944-55, Hill E, Clarke M, Barr FA. EMBO J 2000; 19:5711-9). Eles mostraram que a infrarregulação de RAB6KIFL endógeno em células de câncer pancreático por RNA interferente pequeno resulta em uma atenuação drástica do crescimento das células cancerosas através da interação com homólogo 5 grande (DLG5) do disco, uma proteína de carga de RAB6KIFL (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12), sugerindo que RAB6KIFL desse modo pareça representar um papel crítico em carcinogênese pancreática e seria portanto um alvo potencialmente útil da imunoterapia anticâncer.

[000146] O potencial de RAB6KIFL como um alvo imunoterapêutico foi verificado aqui identificando os peptídeos de epítopo restringidos com HLA-A2 e avaliando sua imunogenicidade. O experimento usando Tgm de HLA-A2 (HHD) identificou três peptídeos de epítopo de RAB6KIFL restringido com HLA-A2 que poderiam estimular a geração de CTLs de camundongo restringido com HLA-A2 pela vacinação com os 36 peptídeos candidatos prognosticados para ter afinidade de liga- ção a HLA-A2 (A*0201) pelo algoritmo de BIMAS, sem causar fenômeno autoimune tal como infiltração de linfócitos ou destruição de tecidos (Fig. 5). Além disso, os CTLs reativo com RAB6KIFL poderiam ser gerados das PBMCs estimuladas com todos estes três peptídeos em três doadores saudáveis independentes (Fig. 6). Estes CTLs não só poderia matar as células T2 pulsadas com seu peptídeo cognato, mas também as linhagens celulares de câncer que expressam RAB6KIFL e HLA-A2. A especificidade de antígeno dos CTLs para estes peptídeos foi confirmada pelas descobertas que estes CTLs exibiram citotoxicidade para as células de SKHep1 transfeccionadas com gene de RAB6KIFL humano, mas não para o SKHep1 transfeccionado com controle negativo (mock). Estes dados sugerem que estes peptí- deos de RAB6KIFL (RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809, e RAB6KIFL-A2-10-284) sejam processados naturalmente da proteína de RAB6KIFL em células de câncer e apresentados sobre a superfície da célula junto com as moléculas de HLA-A2 a ser reconhecidas pelos CTLs. Além disso, seria possível que o peptídeo de RAB6KIFL-A2-9- 809 possa ser processado mais efetivamente da proteína de RAB6KIFL em comparação aos peptídeos de RAB6KIFL-A2-9-12 e RAB6KIFL-A2-10-284 em células cancerosas, porque os CTLs induzidos por peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-809 exibiram citotoxicidade mais forte direcionada contra as células cancerosas expressando RAB6KIFL e HLA-A2 em comparação à citotoxicidade mediada por CTLs induzidos por estimulação com os peptídeos de RAB6KIFL-A2-9- 12 ou de RAB6KIFL-A2-10-284.

[000147] Tgm de HLA-A2.1 (HHD) que estava desprovida da expressão das moléculas da classe I codificadas com H-2b de camundongo endógeno foi usada para identificar peptídeos de epítopo de CTL restringidos com HLA-A2 de RAB6KIFL. Tgm de HLA-A2.1 (HHD) foi relatado ser um modelo animal versátil para a avaliação pré-clínica de imunoterapia com base em peptídeo (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12:2689-97, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123: 2616-25, Pascolo S, et al. J Exp Med 1997; 185: 2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999; 29: 3112-21).

[000148] Para evitar os efeitos adversos induzidos por vacinação de TAAs, RAB6KIFL foi selecionado como um alvo que apenas foi expressado em tecidos normais adultos. Porém, foi muito importante determinar se a vacinação de RAB6KIFL poderia induzir doenças autoi- munes durante ou após imunoterapia anticâncer. Aqui, as sequências de aminoácido não são conservadas de dois dos três peptídeos de epítopo entre o humano e de camundongo (RAB6KIFL-A2-9-12, humano: LLSDDDVVV (SEQ ID NO: 3), camundongo: LLSDEDVVD (SEQ ID NO: 11); RAB6KIFL-A2-10-284, humano: AQPDTAPLPV (SEQ ID NO: 5), camundongo: AQPDTVPVSV) (SEQ ID NO: 12). Portanto, o fenômeno autoimune em Tgm de HLA-A2 foi investigado após vacinação de dois tempos com peptídeo de RAB6KIFL-A2-9-809 em que as sequências de aminoácido ficaram completamente conservadas entre a humana e de camundongo. Uma das vantagens de usar Tgm de HLA-A2 é que a possibilidade do fenômeno autoimune poderia ser investigada in vivo. Claro que, porque o número de tecidos normais investigados aqui é limitado, não é possível excluir a possível expressão de RAB6KIFL em alguns tecidos normais que não foram investigados aqui. Portanto, deve ter cuidado acerca da indução de doenças autoimunes ao utilizar peptídeos de RAB6KIFL para imunoterapia de câncer.

[000149] Em conclusão, os resultados atuais sugerem que RAB6KIFL é um TAA contendo peptídeos de epítopo que podem suscitar CTLs reativos para células cancerosas que expressam RAB6KIFL e HLA-A2. Considerando que RAB6KIFL é altamente expresso em uma gama extensiva de malignidades humanas, RAB6KIFL é portanto um alvo promissor para imunoterapia com base em peptídeo para o tratamento de um espectro vasto das malignidades, especialmente câncer pancreático. Mais investigação da capacidade para indução de CTLs RAB6KIFL-específicos em pacientes de câncer pancreático desse modo continua um assunto de grande importância para aplicação clínica.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[000150] A presente invenção descreve TAAs novos, particularmente aqueles derivados de RAB6KIFL que induzem respostas imunes anti- tumorais potentes e específicas e têm aplicabilidade para um amplo arranjo de tipos de câncer. Tais TAAs garantem mais desenvolvimento como vacinas de peptídeo contra doenças associadas a RAB6KIFL, por exemplo, cânceres tais como câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer gástrico, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), osteossarcoma, câncer pancreático, câncer renal e tumor de tecido macio.

[000151] Embora a presente invenção seja aqui descrita em detalhes e com referência às modalidades específicas da mesma, é para ser entendido que a descrição anterior é exemplar e explicativa em natureza e é intencionada a ilustrar a invenção e suas modalidades preferidas. Através de experimentação rotineira, alguém versado na técnica reconhecerá facilmente que várias alterações e modificações podem ser nela feitas sem abandono do espírito e escopo da invenção, as medições e confrontações da mesma são definidas pelas reivindicações em anexo.

Claims

1. Oligopeptídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5, em que 1 ou 2 aminoácidos são substituídos, em que o oligopeptídeo tem indutibilidade de linfócito T citotóxico (CTL), ainda em que o oligopeptídeo consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: (a) sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 4 em que o segundo aminoácido do terminal N é substituído com leucina ou meti- onina e o aminoácido C-terminal é substituído com leucina, (b) sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 3 em que o segundo aminoácido do terminal N é substituído com metionina e o aminoácido C-terminal é substituído com leucina, e (c) sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 5 em que o segundo aminoácido do terminal N é substituído com leucina ou meti- onina e o aminoácido C terminal é substituído com leucina.

2. Agente farmacêutico ou composição para o tratamento e/ou profilaxia de câncer, e/ou prevenção de recorrência pós- operatória do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável em combinação com um adjuvante, e um ingrediente selecionado de um ou mais oligopeptídeos como definidos na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5.

3. Agente farmacêutico ou composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é formulado para a ad-ministração a um sujeito cujo antígeno de HLA é HLA-A2.

4. Agente farmacêutico ou composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de bexiga, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer esofagiano, câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC), câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma renal e câncer pulmonar de células pequenas (SCLC).

5. Agente farmacêutico ou composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é uma vacina.

6. Método in vitro para induzir uma célula apresentora de antígeno, caracterizado pelo fato de que utiliza o oligopeptídeo usando o oligopeptídeo como definido na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5.

7. Método in vitro de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar uma célula apresentadora de antígeno com o oligopeptídeo como definido na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5.

8. Método in vitro para induzir um CTL, caracterizado pelo fato de que utiliza o oligopeptídeo como definido na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5.

9. Método in vitro de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar uma célula T CD8-positiva com uma célula apresentadora de antígeno e/ou um exossoma que apresenta o oligopeptídeo como definido na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5 em sua superfície.

10. Uso de um ou mais oligopeptídeos como definidos na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma vacina para induzir resposta imune contra câncer em um sujeito.

11. Uso de um ou mais oligopeptídeos como definidos na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica ou agente para o tratamento de câncer.

12. Uso do oligopeptídeo como definido na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica ou agente para induzir uma célula apresentora de antígeno.

13. Uso do oligopeptídeo como definido na reivindicação 1, ou um oligopeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 4, 3 e 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica ou agente para induzir um CTL.