BRPI0919919B1 - Composições compreendendo adipócitos e um copolímero tribloco não iônico para uso em transplante de adipócitos, na prevenção da reabsorção de um enxerto de gordura, para selar as membranas celulares de adipócitos, e para aumentar a viabilidade de adipócitos - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES PARA USO EM TRANSPLANTE DE CÉLULAS DERIVADAS DE GORDURA E NA PREVENÇÃO DA REABSORÇÃO DE UM ENXERTO DE GORDURA, MÉTODO PARA SELAR AS MEMBRANAS CELULARES DE CÉLULAS DERIVADAS DE GORDURA, COMPOSIÇÃO, E MÉTODO PARA AUMENTAR A VIABILIDADE DAS CÉLULAS DERIVADAS DE GORDURA. A presente invenção refere-se a polímeros para uso na prevenção de danos às membranas das células em enxertos de gordura. Pensa-se que a mistura de um copolímero tribloco, tal como poloxímero P188 com os adipócitos ou o tecido adiposo a ser transplantado em um paciente estabilize as membranas das células levando a um transplante de gordura mais bem sucedido para a reconstrução ou aumento de tecido macio. Tais métodos também podem ser usados no transplante de células-tronco adultas ou outras células derivadas do tecido adiposo. Outros agentes, tais como ácido lipóico também podem ser acrescentados às composições de polímero/célula para o transplante celular.

Description

Pedidos Relacionados

[001] O presente Pedido afirma a prioridade sob a 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido de Patente Provisório U.S., USSN 61/107.023, arquivado em 21 de outubro de 2008, que é incorporado aqui pela referência.

Antecedentes da Invenção

[002] Os danos ao tecido macio e as malformações secundáriasaos traumas, defeitos congênitos, infecções e ressecções oncológicas são uma fonte de morbidez significativa em pacientes. Atualmente a reconstrução via presilha livre autóloga ou o avanço local de presilhas são o trabalho mais laborioso das modalidades reconstrutoras de tecido macio significante e de defeitos ósseos. Enquanto as presilhas pediculadas e as reconstruções de presilha livre oferecem instrumentos potentes da reconstrução, eles não são ausentes de efeitos colaterais potencialmente sérios e de morbidez de sítio doador.

[003] O transplante de gordura autóloga foi usado na reconstruçãode tecido macio, mas é imprevisível. A vantagem de usar a gordura lipoaspirada é dupla: 1) mínima morbidez de sítio doador que fornece uma fonte segura e prontamente acessível de células autólogas, e 2) estes procedimentos podem ser executados relativamente facilmente sem a preocupação de complicações isquêmicas e falhas precoces de enxertos associados com presilhas livres vascularizadas. Contudo, os enxertos de gordura livre até agora foram infeccionados com altos níveis imprevisíveis de reabsorção e irregularidade resultante. Os fracassos de enxerto de gordura livre e a redução de volume parecem estar relacionados ao estresse mecânico que resulta em dano de membrana durante a colheita, modificações isquêmicas precoces, e privação nutriente e fornecimento vascular insuficiente ao enxerto. Estes efeitos estressantes levam a apoptose e à morte celular. Posteriormente, a reabsorção de enxerto resulta da remoção do resíduo celular morto depois da revascularização. Isto leva a resultados inconsistentes e indesejáveis para a restauração de tecido macio. Desde que o transplante de gordura foi primeiro descrito por Neuber em 1893, pouco foi atingido para melhorar os resultados de enxertos de gordura livre. Até aqui, os esforços para atenuar as células degradantes isquêmicas iniciais até que a vascularidade suficiente possa ser estabelecida foram brindados com resultados modestos. Assim, somente melhorar o fornecimento vascular do transplante de gordura pode não ser suficiente para melhorar muito os resultados do transplante de gordura. Evitar os danos das células durante a aquisição, o manejo, e/ou o transplante do enxerto de gordura é também importante.

[004] Permanece uma necessidade para um transplante mais bemsucedido de tecido adiposo ou de células derivadas do tecido adiposo (por exemplo, adipócitos, células-tronco ) na cirurgia cosmética e reconstrutiva. A capacidade de transferir um grande volume do tecido adiposo autólogo para reconstrução de tecido macio forneceria uma nova opção reconstrutora de potencialmente milhões de pacientes, sem as morbidezes associadas aos sítios doadores. Adicionalmente, forneceria um ferramental potente para pacientes que têm pobres opções de sítio doador, e pacientes com a incapacidade de tolerar os tempos cirúrgicos extensos necessários em reconstruções de presilhas.

Sumário da Invenção

[005] A presente invenção se origina da necessidade do transplante previsível, bem sucedido de tecido adiposo e adipócitos. A invenção pelo menos em parte se origina da descoberta de que as células danificadas em enxertos de gordura ficam apoptóticas e eventualmente são reabsorvidas pelo corpo do receptor. Evitar o dano às células de tais enxertos, em particular as membranas celulares, leva em conta um transplante de gordura mais bem sucedido e previzível. Para evitar o dano às células do enxerto, na presente invenção a membrana celular é protegida contra danos durante a aquisição do enxerto, o manejo do enxerto (por exemplo, lavagem, armazenamento), e/ou finalmente o procedimento de transplante. Vários agentes de estabilização de membrana foram estudados para identificar agentes que reduzem a morte celular em enxertos de gordura com o tempo. Os copolímeros triblocos com uma porção hidrofóbica ladeada de duas porções hidrofílicas(por exemplo, Poloxâmero P188, mostrado na figura 1) foram avaliados como estabilizantes de membranas celulares e redutores da morte celular em enxertos de gordura com o tempo. Tal polímero misturado com tecido adiposo ou adipócitos a serem transplantados leva ao transplante de gordura previsível e permanente. Outros polímeros, tal como copolímeros diblocos, copolímeros tetrablocos, e polietileno glicol, foram testados e avaliados não proteger células contra danos ou lise das células. Por isso, a presente invenção fornece composições, métodos, e kits para usar copolímeros triblocos, particularmente P188, no transplante de gordura para reconstrução ou aumento de tecido macio.

[006] As membranas celulares incluem fosfolipídios que têmdomínios hidrofóbicos e hidrofílicos. Estes fosfolipídios formam uma bicamada de lipídio contínua que rodeia a célula. A integridade desta bicamada é importante na prevenção ao dano celular. A presente invenção fornece composições de copolímeros triblocos que selam e/ou estabilizam a membrana celular e impedem que as células sejam danificadas. Tipicamente tal polímero interage com a bicamada de fosfolipídio de uma célula e fecha orifícios na membrana celular lesionada. Adicionalmente, mostrou-se que tal polímero reduz a viscosidade da membrana. Uma viscosidade celular reduzida permite que as células traumatizadas se tornem mais solúveis, o que reduz a tensão nas membranas lesionadas. A invenção também fornece métodos de usar tais composições no transplante de tecido adiposo e adipócitos, ou outros tecidos e células (por exemplo, células-tronco ).

[007] Em um aspecto, a invenção fornece copolímeros triblocosque ajudam na vedação e/ou estabilização das membranas das células. Preferivelmente, o polímero utilizado na presente invenção é biocompatível e/ou biodegradável. O polímero não deve ocasionar a lise das células. Em determinadas modalidades, o polímero é um polímero não iônico. Em determinadas modalidades, o polímero é um poliéter. Em determinadas modalidades, o polímero é um éter polialquílico. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero de um éter polialquílico e outro polímero (por exemplo, um éter polialquílico). Particularmente, os poloxímeros (também conhecidos como poloxâmeros) foram avaliados como úteis em vedação e estabilização de membranas celulares. Como mostrado na estrutura química abaixo, os poloxímeros são copolímeros triblocos não iônicos compostos de uma cadeia hidrofóbica central do polioxipropileno (POP) (também conhecido como polipropileno glicol) flanqueado de duas cadeias hidrofílicas do polioxitileno (POE) (também conhecido como polietileno glicol (PEG)). Em determinadas modalidades, os copolímeros triblocos com um núcleo hidrofóbico flanqueado por duas caudas hidrofílicas são preferidos no transplante de gordura.

[008] Em determinadas modalidades, o poloxímero P188 é usadopara selar e/ou estabilizar as membranas de células de um enxerto de gordura. Encontrou-se que o poloxímero P188 é particularmente eficaz no reparo das membranas danificadas dos adipócitos e melhora a viabilidade e a probabilidade da sobrevivência de adipócitos danificados. Sem desejar estar ligado a uma determinada teoria, um mecanismo proposto para o reparo de membranas celulares com P188 é ilustrado na figura 2. Uma membrana celular danificada expõe em seu meio uma porção da camada de lipídio central (isto é, a porção hidrofóbica da membrana). A porção hidrofóbica central do P188 interage com esta camada hidrofóbica da membrana, e as extremidades hidrofílicas laterais do P188 se posicionam ao longo da superfície hidrofílica exterior da membrana celular. Este processo de vedação/reparo é análogo a um reparo convencional do tipo tampão para conserto de pneumáticos de automóveis, em que o centro de um tampão de borracha flexível é empurrado por um pequeno furo em um pneumático para vedá-lo com a extremidade do tampão estando localizada ao longo do exterior da banda de rolagem. Mais de uma molécula P188 pode ser necessária para selar um orifício em uma membrana danificada. Em determinadas modalidades, o poloxímero P188 evita os danos das células de um enxerto de gordura. Os poloxâmeros são vendidos pela BASF sob o nome comercial PLURONIC®. Particularmente, o poloxâmero 188 (P188) é o PLURONIC® F68. Como os comprimentos dos blocos que compõem o polímero podem ser construídos conforme a necessidade, existem muitos poloxâmeros diferentes com propriedades diferentes. Estes copolímeros são comumente denominados com uma letra que determina do estado físico do poloxâmero na temperatura ambiente ("P" para pó, "L" para líquido, "F" para floco) seguida de três dígitos. Os dois primeiros dígitos x100 dão o peso molecular aproximado do núcleo de polioxipropileno hidrofóbico, e o último dígito x10 dá a percentagem do teor de polioxitileno. O poloxâmero 188 é um poloxímero com um polioxipropileno com massa molecular de 1800 g/mol e um teor de polioxitileno de 80 %, e o poloxâmero 188 tem um peso molecular médio de 7680-9510 g/mol. Para converter o nome "de Pxxy" para o nome comercial "Fzz", o xx de "Pxxy" é multiplicado por aproximadamente 3, isto é, P188 é F68. Outros poloxímeros que podem ser úteis na presente invenção incluem poloxâmeros P108 (PLURONIC® F38), P184(PLURONIC® L64), P401, P402, P407 (PLURONIC® F127), e P408 (PLURONIC® F108). Outros poloxâmeros com um peso molecular inferior e teor de PEG aproximadamente igual ou inferior podem ser úteis na presente invenção. O polímero é tipicamente acrescentado às células assim que as células são removidas do doador para evitar e/ou reparar os danos das membranas assim que for possível. O polímero é acrescentado às células do enxerto para transplante em uma concentração variando de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg do polímero por ml de células. Em determinadas modalidades, uma concentração millimolar do polímero é usada na composição de polímero/célula para transplante. Tipicamente é usada a concentração mais baixa de polímero que produza a estabilização de membrana desejada. Como seria apreciado por uma pessoa com habilidade na técnica, a concentração do polímero na composição dependerá do polímero que é usado para estabilizar as células que são transplantadas.

[009] As células ou o tecido a ser transplantado são misturadoscom o polímero na concentração apropriada e então são transplantados no receptor (por exemplo, um ser humano) no sítio de transplante desejado (por exemplo, face, lábios, peito). Qualquer célula ou tecido pode ser transplantado usando a tecnologia da invenção. Em determinadas modalidades, o tecido é o tecido adiposo. Em determinadas modalidades, as células são derivadas do tecido adiposo. Em determinadas modalidades, as células são parte de um enxerto de gordura (isto é, tecido adiposo) que contém diferentes tipos de células incluindo, mas não limitado a, adipócitos, células estromais, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos, e células sanguíneas. Em determinadas modalidades, as células são adipócitos. Em determinadas modalidades, as células são fibroblastos. Em determinadas modalidades, as células são células estromais. Em determinadas modalidades, as células são células endoteliais. Em determinadas modalidades, as células são células-tronco. Em determinadas modalidades, as células são derivadas de células-tronco do tecido adiposo. As células podem ser misturadas com o polímero no momento da colheita. Em determinadas modalidades, o sítio de onde o tecido adiposo deve ser removido é injetado com uma composição incluindo o polímero antes que o tecido seja removido do doador. Em outras modalidades, o polímero é acrescentado às células depois delas terem sido removidas do doador. O polímero também pode ser acrescentado às células no momento do processamento ou do armazenamento, ou as células podem ser misturadas com o polímero momentos antes do transplante. As células ou o tecido podem ser lavados ou de outro modo processados com uma composição incluindo o polímero. Em determinadas modalidades, o polímero é lavado do enxerto antes da implantação.

[0010] A composição célula/polímero também pode incluir outrosreagentes. Por exemplo, a composição pode incluir reagentes que também protegem ou estabilizam as células a serem transplantadas, ou o agente pode proteger o polímero. Em determinadas modalidades, a composição inclui vitaminas, minerais, antioxidantes, protetores osmóticos, intensificadores de viscosidade, coenzimas, agentes de estabilização de membrana, lipídios, carboidratos, hormônios, fatores de crescimento, agentes anti-inflamatórios, polinucleotídeos, proteínas, peptídeos, alcoóis, ácidos orgânicos, moléculas pequenas orgânicas, etc. Uma combinação particularmente útil no transplante de gordura é o P188 e ácido lipoico (mostrado abaixo nas suas formas reduzida e oxidada). Em determinadas modalidades, a forma reduzida de ácido lipoico é usada. Em outras modalidades, a forma oxidada de ácido lipoico é usada. Em ainda outras modalidades, uma mistura das duas formas é usada.

[0011] A presente invenção fornece composições de adipócitos eum polímero (por exemplo, P188) para uso para o transplante de gordura. Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece composições de células-tronco e um polímero (por exemplo, P188). As células-tronco podem ser células-tronco adultas derivadas do tecido adiposo. Outras células derivadas do tecido adiposo (por exemplo, células-tronco, fibroblastos, células endoteliais, células estromais) também podem ser usadas na invenção. As composições célula/polímero da invenção podem incluir outros reagentes que minimizam a rompimento da membrana e/ou a formação de radicais livres (por exemplo, antioxidantes, vitaminas, lipídios, proteínas, peptídeos, hormônios, fatores de crescimento, carboidratos, reagentes farmacêuticos) tal como aqui discutido.

[0012] Em outro aspecto, a invenção fornece kits úteis para otransplante de gordura usando as composições e os métodos da invenção. O kit pode incluir todos ou um subconjunto de todos os componentes necessários para o transplante de gordura ou de células derivadas da gordura em um paciente. Os kits podem incluir, por exemplo, o polímero (por exemplo, P188), solução tamponada para lavagem de células, dispositivo para lavar células, células, seringa, agulha, copinhos, reservatórios, cotonetes de álcool, anestésicos, antibióticos, antioxidantes, vitaminas, lipídios, carboidratos, hormônios, fatores de crescimento, etc. Em determinadas modalidades, um reservatório ou a seringa usados no momento da colheita das células podem ter o polímero internamente (por exemplo, P188) para que as células colhidas sejam imediatamente contatadas com o agente de estabilização de membrana. Em determinadas modalidades, as células são adquiridas do paciente que vai receber as células (isto é, um enxerto autólogo). Em determinadas modalidades, os componentes do kit são armazenados em embalagem estéril para o uso conveniente pelo cirurgião ou outro profissional da saúde. O kit também pode incluir instruções para uso do polímero (por exemplo, P188) e outros agentes no procedimento durante a colheita/transplante. O kit pode fornecer os componentes necessários de um uso único. O kit também pode incluir a embalagem e a informação exigida por uma agência reguladora governamental que regule produtos farmacêuticos e/ou dispositivos médicos.

Breve Descrição dos Desenhos

[0013] Figura 1. A. Polioxitileno (POE) subunidade hidrofílica depolímero P188. B. Estrutura P188 tribloco com polioxipropileno hidrofóbico (POP) subunidade se espalhando com duas caudas POE hidrofílicas.

[0014] Figura 2. Inserção de membrana putativa do P188. Pensa-se que as regiões hidrofóbicas do P188 entram nos poros de membranas danificadas com as longas caudas hidrofílicas hidratadas que se estendem para além da membrana diminuindo a viscosidade celular e estabilizando o vazamento iônico da membrana.

[0015] Figura 3. A. Microscopia por varredura de elétrons (EM) de um adipócito intacto único que demonstra uma bicamada de lipídio intacta. B. Visão aumentada por EM de uma bicamada celular de adipócito com poros de membrana e tamanhos observados em nanômetros ao longo da superfície da membrana (setas).

[0016] Figura 4. Reabsorção de um implante de 1 mL de umacomposição de células/poloxímero P188, células/dextrano, ou células/solução salina após 6 semanas.

[0017] Figura 5. Reabsorção de um implante de 0,6 mL de umacomposição de células/poloxímero P188, células/dextrano, ou células/solução salina após 6 semanas.

[0018] Figura 6. Microscopia confocal no dia 6 da solução salinacontra Enxertos de gordura tratados com P188 (1,0 cc, 1,0 g). As células foram marcadas usando tintura específica de imunoquímica para apoptose ativada por FLIVO-red policaspase. Os controles tratados de solução salina são mostrados (topo), mostram grandes quantidades de vesículas apoptóticas marcadas de vermelho. De modo inverso, as amostras tratadas com P188 no dia 6 demonstram quantidades relativamente baixas de vacúolos apoptóticos marcados de vermelho (a citoplasma verde é o resultado da autofluorescência normal).

[0019] Figura 7. Eventos de apoptose durante a primeira enxertia.Níveis de apoptose em enxertos de gordura durante a primeira enxertia. O P188 demonstra reduções estatisticamente significativas de eventos apoptóticos no dia 6 quando comparado com os controles tratados com a solução salina normal.

[0020] Figura 8. Eventos de apoptose aumentados no período deperitransplante com vários agentes em comparação com P188. Vários polímeros e os agentes adicionais foram comparados com P188. As séries acima demonstram quatro experimentos separados de dez dias onde os agentes desempenharam pior do que o P188. Os agentes que aumentam a apoptose durante o primeiro período de enxertia são tóxicos a adipócitos e não são convenientes para a melhora do enxerto. (Nota: O experimento de PEG 8000, T1107 (abaixo a esquerda) usou marcadores de apoptose MitoPT enquanto que outros experimentos usaram o ensaio de apoptose de Promega’s Apo-One. Os ensaios de apoptose Apo-One geram em média um sinal 10 vezes mais altos de modo que os sinais de Mito-Pt são menos brilhantes pelo nosso método de ensaio. Isto é puramente uma diferença de ensaio e não representa uma diferença na magnitude de apoptose).

[0021] Figura 9. O ácido lipoico tem um efeito adicional na reduçãoda primeira apoptose. Os enxertos de gordura tratados com ácido lipólico demonstraram a apoptose reduzida durante o período de enxertia quando comparado com os controles tratados com solução salina. Estas melhoras na apoptose levam ao desempenho de enxerto de longo prazo melhorado em seis semanas.

[0022] Figura 10. A pesagem como uma função do tempo do pós-tratamento e do implante. Durante os primeiros dez dias depois da implantação, os enxertos de gordura foram pesados diariamente. Após o primeiro dia, onde o enxerto desidrata em ~25 %, os pesos durante o período avascular foram estáveis entre todos os grupos; apesar de uma diferença significativa na atividade apoptótica durante o mesmo período. As barras de erro representam o desvio padrão que no período inicial foi de ~0,05 g; o desvio padrão total no estudo de pesagem foi de ~0,10 g. O dextrano foi usado como um primeiro controle já que tem um peso molecular semelhante ao P188 e ao PEG8000. Após nenhuma diferença ter sido demonstrada com o dextrano, a solução salina foi usada como o único grupo de controle em experimentos adicionais.

[0023] Figura 11. Pesos cumulativos de seis semanas (P188 versussolução salina normal). Os enxertos de gordura tratados com P188 demonstram aumentos estatisticamente significativos nas pesagens em seis semanas quando comparado com controles tratados pela solução salina.

[0024] Figura 12. Reabsorção em peso em seis semanas. Otratamento com P188 dos enxertos de gordura resulta em uma redução de 50 % da reabsorção do enxerto observada em seis semanas quando comparado com controles tratados pela solução salina.

[0025] Figura 13. Reabsorção em seis semanas versus váriospolímeros. P188 foi medido contra uma faixa de variação de diferentes plurônicos classificados bem como vários tamanhos e misturas do PEGs. As quantidades em peso do P188 estiveram entre os melhores desempenhos do polímero embora as diferenças de P188 somente entre as pesagens e alguns de outros plurônicos fossem pequenas. Os espécimes histológicos destes lóbulos demonstram infiltrações inflamatórias pesadas em algumas amostras e fibrose pesada em outras amostras. Assim, a pesagem sozinha não é um indicador claro do desempenho melhorado do enxerto de gordura.

[0026] Figura 14. O sinal da célula viva usando vários polímeros 6semanas após o tratamento e a implantação (1,0 cc/1,0 g). O P188 demonstra o sinal da célula viva superior em comparação com outros plurônicos em seis semanas com o ensaio de viabilidade de Cell-Titer Blue. F127 e L64 demonstraram níveis de viabilidade na ou acima da solução salina normal sem atingir uma significância estatística.

[0027] Figura 15. Sinal da célula viva pós-implantação de doismeses e tratamento. P188 demonstra a viabilidade celular superior quando comparado com PEGs através de vários tamanhos e na combinação após pós-tratamento de dois meses e do implante. De nota, PEGs demonstrou níveis inferiores da viabilidade celular quando comparado com controles tratados pela solução salina.

[0028] Figura 16. Teor de DNA no momento de pós-implantação etratamento de seis semanas (1,0 cc/1,0 g). o teor de DNA em seis semanas foi medido e comparado. O alto teor de DNA associa-se com altas contagens de células e mais adipócitos. P188 em seis semanas demonstrou os mais altos níveis de DNA quando comparado com outros plurônicos. Apesar de pequenas diferenças em alguns dos pesos vistos no P188 da semana 6 em relação ao teor de DNA superou todo outro polímero testado.

[0029] Figura 17. Histologia de seis semanas de controle tratadopela solução salina e enxertos de gordura tratados com P188.

[0030] Figura 18. Marcação de histologia em seis semanas decontrole de solução salina, P188, e outros plurônicos. As amostras foram marcadas de um modo cego por quatro examinadores quanto à presença de gordura normal, infiltrado inflamatório, e fibrose. À esquerda, P188 é comparado com controles normais de solução salina. Um aumento estatisticamente significativo no teor de gordura normal foi demonstrado bem como uma redução na fibrose. Quando comparado com outro polímero, L64 e F127 marcado de mesmo modo sem diferenças estatisticamente significativas, e o restante variou de algumas melhoras em relação à toxicidade evidente da solução salina.

[0031] Figura 19. Reabsorção percentual em peso pós-tratamentode 6 semanas.

Definições

[0032] O "tecido adiposo," tal como aqui utilizado, se refere aotecido que é composto de adipócitos. O tecido adiposo é o tecido conetivo tipicamente solto composto de adipócitos. O papel principal no corpo é guardar a energia na forma da gordura; contudo, o tecido adiposo também isola e protege o corpo bem como atuando como um órgão endócrino. O tecido adiposo pode ser tecido adiposo branco ou tecido adiposo marrom. O termo "tecido adiposo" é usado de modo trocável com o "tecido gorduroso".

[0033] O "agente anti-inflamatório," tal como aqui utilizado, se referea qualquer substância que inibe um ou mais sinais ou os sintomas da inflamação.

[0034] O termo "aproximadamente" em referência a um númerogeralmente inclui números que estão incluídos em um faixa de variação de 5 % na direção do número (maior do que ou menor do que o número) a menos que de outra maneira seja afirmado ou de outra maneira seja evidente do contexto (exceto onde tal número excedesse 100 % de um valor possível).

[0035] O termo "biocompatível" se refere a um material que ésubstancialmente não tóxico a células de um receptor nas quantidades e na posição usada, e também não elicia ou causa um efeito deletério ou desfavorável significante sobre o corpo do receptor na posição usada, por exemplo, uma reação imunológica ou inflamatória inaceitável, formação de tecido de cicatriz inaceitável, etc.

[0036] O termo "biodegradável" significa que um material é capazde ser avariado fisicamente e/ou quimicamente dentro de células ou dentro do corpo de um paciente, por exemplo, pela hidrólise sob condições fisiológicas e/ou por processos biológicos naturais, tais como a ação de enzimas presentes dentro das células ou dentro do corpo, e/ou por processos, tais como dissolução, dispersão, etc., espécies químicas para formas menores que podem ser tipicamente metabolizadas e, opcionalmente, usadas pelo corpo, e/ou excretadas ou de outra maneira desfeitas. Com objetivos da presente invenção, um polímero ou hidrogel cujo peso molecular reduz com o tempo in vivo devido a uma redução no número de monômeros considera-se biodegradável.

[0037] Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico", ou"oligonucleotídeo" referem-se a um polímero de nucelotídeos. Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico", e "oligonucleotídeo", podem ser usadas de modo trocável. Tipicamente, um polinucleotídeo compreende pelo menos dois nucelotídeos. DNAs e RNAs são polinucleotídeos. O polímero pode incluir nucleosídeos naturais (isto é, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, e desoxicitidina), análogos de nucleosídeo (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrol-pirimidina, 3-metil adenosina, C5-propinilcitidina, C5- propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5- metilcitidina, 7-deasazoadenosina, 7-deasazoguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O-(6)-metilguanina, e 2-tiocitidina), bases quimicamente modificadas, bases biologicamente modificadas (por exemplo, bases metiladas), bases intercaladas, açúcar modificado (por exemplo, 2’-fluororribose, 2’-metoxirribose, 2’-aminorribose, ribose, 2’-desoxirribose, arabinose, e hexose), ou grupos de fosfato modificados (por exemplo, ligações de fosforotioatos e 5'-N- fosforamidita). Os enanciômeros de nucleosídeos naturais ou modificados também podem ser usados. Os ácidos nucleicos também incluem reagentes terapêuticos baseados no ácido nucleico, por exemplo, ligantes de ácido nucleico, siRNA, grampo curto, oligonucleotídeos de antisentido, ribozimas, adaptâmeros, e SPIEGELMERS®, ligantes de oligonucleotídeo descritos em Wlotzka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99 (13):8898, os teores inteiros dos quais são incorporados aqui pela referência.

[0038] Um "polipeptídeo", "peptídeo", ou "proteína" compreendemuma série de pelo menos três aminoácidos ligados em conjunto por ligações de peptídeo. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína", podem ser usados de modo trocável. O peptídeo pode se referir a um peptídeo individual ou uma coleta de peptídeos. Da invenção os peptídeos preferivelmente contêm aminoácidos só naturais, embora os aminoácidos não naturais (isto é, compostos que não ocorrem na natureza, mas isto pode ser incorporado em uma cadeia de polipeptídeo) e/ou os análogos de aminoácido como são conhecidos na técnica possam ser alternativamente empregados. Também, um ou mais dos aminoácidos em um peptídeo pode ser modificado, por exemplo, pela adição de uma entidade química, tais como um grupo de carboidrato, um grupo de fosfato, um grupo de farnesil, um grupo de isofarnesil, um grupo de ácido graxo, um ligante de conjugação, funcionalização, ou outra modificação, etc. Em uma modalidade, as modificações do peptídeo levam a um peptídeo mais estável (por exemplo, maior meia-vida in vivo). Estas modificações podem incluir a ciclização do peptídeo, a incorporação de D-aminoácidos, ou outras modificações. Nenhuma das modificações deve interferir substancialmente com na atividade biológica desejada do peptídeo.

[0039] Os termos "polissacarídeo" e "carboidrato" podem serusados de modo trocável. A maior parte dos carboidratos são aldeídos ou cetonas com muitos grupos de hidroxila, normalmente um em cada átomo de carbono da molécula. Os carboidratos geralmente têm a fórmula molecular CnH2nOn. Um carboidrato pode ser um monossacarídio, um dissacarídio, trissacarídeo, oligossacarídeo, ou polissacarídeo. O carboidrato mais básico é um monossacarídio, tal como glicose, sacarose, galactose, manose, ribose, arabinose, xilose, e frutose. Os dissacarídios são dois monossacarídios unidos. Exemplos dos dissacarídios incluem a sacarose, a maltose, o celobiose, e a lactose. Tipicamente, um oligossacarídeo inclui entre três e seis unidades de monossacarídio (por exemplo, rafinose, estaquiose), e o polissacarídeo incluem seis ou mais unidades de monossacarídio. Exemplos de polissacarídeos incluem o amido, o glicogênio, e a celulose. Os carboidratos podem conter unidades de sacarídeo modificadas, tais como 2’-desoxirribose em que um grupo de hidroxila é removido, 2’-fluororribose em que um grupo de hidroxila é substituído com um flúor, ou N-acetilglicosamina, uma forma que contém o nitrogênio de glicose. (por exemplo, 2’-fluororribose, desoxirribose, e hexose). Os carboidratos podem existir em muitas formas diferentes, por exemplo, conformeros, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoisômeros, tautômeros, anômeros, e isômeros.

[0040] O termo "molécula pequena" se refere a compostosorgânicos, quer sejam de ocorrência natural ou artificialmente criados (por exemplo, via a síntese química) que têm o peso molecular relativamente baixo e que não são proteínas, polipeptídeos, ou ácidos nucleicos. As moléculas pequenas são tipicamente não polímero com unidades que se repetem. Em determinadas modalidades, uma pequena molécula tem um peso molecular de menos do que aproximadamente 1500 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular do polímero é menor do que aproximadamente 1000 g/mol. Também, as moléculas pequenas tipicamente têm múltiplas ligações de carbono a carbono e podem ter múltiplos estereocentros e grupos funcionais.

[0041] O "paciente", tal como aqui utilizado, se refere a um indivíduoao qual um agente deve ser liberado, por exemplo, com objetivos experimentais, diagnósticos, e/ou terapêuticos. Os pacientes preferenciais são mamíferos, mamíferos particularmente domesticados (por exemplo, cães, gatos, etc), primatas, ou seres humanos. Em determinadas modalidades, o paciente é um ser humano. Em determinadas modalidades, o paciente é um animal experimental, tal como um rato ou camundongo. Um paciente aos cuidados de um médico ou outro profissional da saúde pode ser referido como um "paciente".

[0042] O termo "agente farmacêutico," também referido como um"fármaco", é usado aqui para se referir a um agente que é administrado a um paciente para tratar uma doença, distúrbio, ou outra condição clinicamente reconhecida como sendo perigosa para o paciente, ou com objetivos profiláticos, e tem um efeito clinicamente significativo sobre o corpo para tratar ou evitar uma doença, distúrbio, ou condição. Os agentes terapêuticos incluem, sem restrição, os agentes listados na Farmacopéia dos Estados Unidos (USP), Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10o edição, McGraw Hill, 2001; Katzung, B. (editor). Basic and Clinical Pharmacology, McGraw- Hill/Appleton & Lange; 8a edição (21 de setembro de 2000); Physician’s Desk Reference (Thomson Publishing), e/ou The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17o edição (1999), ou o 18o edição (2006) depois da sua publicação, Mark H. Beers e Robert Berkow (editores)., Merck Publishing Group, ou, no caso de animais, The Merck Veterinary Manual, 9o edição, Kahn, C.A. (editor)., Merck Publishing Group, 2005.

Descrição Detalhada de Certas Modalidades da Invenção

[0043] A presente invenção se origina do reconhecimento que otransplante de tecido adiposo ou adipócitos na cirurgia cosmética e reconstrutora pode ser melhorado pela adição de um polímero que estabiliza as membranas das células no enxerto. Sem desejar estar ligado a uma determinada teoria, pensa-se que o polímero interage com as membranas celulares e sela ou evita defeitos na membrana, por meio disso impedindo ou minimizando contra danos à célula (por exemplo, vazamento de íon). Evitar dano às células reduz o ponto de apoptose e morte celular no enxerto e subsídios na melhoria do êxito e a coerência de transplantes graxos em restauração de tecido macio, reconstrução, ou aumento. A presente invenção fornece polímero, composições, métodos, e kits para melhorar o transplante de gordura em um paciente (por exemplo, ser humano).

Polímeros

[0044] A presente invenção está baseada na descoberta de certospolímeros que estabilizam as membranas celulares de células em transplantes de gordura ou células derivadas do tecido adiposo (por exemplo, células-tronco, células estromais, fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais). O polímero é misto com as células em uma concentração suficiente para estabilizar e proteger as membranas das células contra danos e/ou selar membranas já danificadas. Tal polímero pode ser usado em conjunto com outros métodos de melhorar o êxito de incluindo de transplante de gordura, por exemplo, melhoria do fornecimento vascular do enxerto ou soma de outros agentes que ajudam a evitar o dano às células que estão sendo transplantadas (por exemplo, ácido lipoico).

[0045] Qualquer polímero que interage e estabiliza membranascelulares pode ser acrescentadas a células usadas em um transplante de gordura; contudo, encontrou-se que copolímeros triblocos com uma porção central hidrofóbica ladeada de duas caudas hidrofílicas são particularmente úteis em melhorar enxertos de gordura. Em determinadas modalidades, o polímero é um polímero sintético (isto é, um polímero não produzido na natureza). Em outras modalidades, o polímero é um polímero natural (por exemplo, uma proteína, polissacarídeo, borracha). Em determinadas modalidades, o polímero é um polímero ativo superficial. Em determinadas modalidades, o polímero é um polímero não iônico. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero de bloco não iônico.

[0046] Em determinadas modalidades, o polímero inclui uma porçãode poliéter. Em determinadas modalidades, o polímero inclui uma porção de éter polialquílico. Em determinadas modalidades, o polímero inclui caudas de polietileno glicol. Em determinadas modalidades, o polímero inclui uma porção central do polipropileno glicol. Em determinadas modalidades, o polímero inclui o polibutileno glicol como a porção central. Em determinadas modalidades, o polímero inclui o polipentileno glicol como a porção central. Em determinadas modalidades, o polímero inclui o poliexileno glicol como a porção central. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco de um do polímero descrito aqui.

[0047] Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímerotribloco de um éter polialquílico (por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol) e outro polímero. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco de um éter polialquílico e outro éter polialquílico. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco do polietileno glicol e outro éter polialquílico. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco do polipropileno glicol e outro éter polialquílico. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco com pelo menos uma unidade do éter polialquílico. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco de dois éteres polialquílicos diferentes. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco incluindo uma unidade de polietileno glicol. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco incluindo uma unidade de polipropileno glicol. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco de uma unidade mais hidrofóbica ladeada de mais duas unidades hidrofílicas. Em determinadas modalidades, as unidades hidrofílicas são o mesmo tipo do polímero. Em determinadas modalidades, o polímero inclui uma unidade de polipropileno glicol ladeada de mais duas unidades hidrofílicas. Em determinadas modalidades, o polímero inclui duas unidades de polietileno glicol que flanqueiam uma unidade mais hidrofóbica. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero tribloco com uma unidade de polipropileno glicol ladeada de duas unidades de polietileno glicol. Em determinadas modalidades, o polímero é da fórmula:

[0048] em que o n é um número inteiro entre 2 e 200,inclusivamente; e o m é um número inteiro entre 2 e 200, inclusivamente. Em determinadas modalidades, o n é um número inteiro entre 10 e 100, inclusivamente. Em determinadas modalidades, o m é um número inteiro entre 5 e 50 inclusivamente. Em determinadas modalidades, o n é aproximadamente 2 vezes m. Em determinadas modalidades, o n é aproximadamente 70, e o m é aproximadamente 35. Em determinadas modalidades, o n é aproximadamente 50, e o m é aproximadamente 30. Em determinadas modalidades, o polímero é poloxâmero P188, que é vendido pela BASF sob o nome comercial PLURONIC® F68. Outro polímero de PLURONIC® que podem ser úteis na presente invenção inclui, mas não é limitado a, PLURONIC® F108, PLURONIC® F127, PLURONIC® F38, PLURONIC® F68, PLURONIC® F77, PLURONIC® F87, PLURONIC® F88, PLURONIC® F98,PLURONIC® L10, PLURONIC® L101, PLURONIC® L121, PLURONIC® L31, PLURONIC® L35, PLURONIC® L43, PLURONIC® L44,PLURONIC® L61, PLURONIC® L62, PLURONIC® L64, PLURONIC® L81, PLURONIC® L92, PLURONIC® N3, PLURONIC® P103,PLURONIC® P104, PLURONIC® P105, PLURONIC® P123,PLURONIC® P65, PLURONIC® P84, e PLURONIC® P85. Ospoloxâmeros são geralmente sintetizados pela adição sequencial de primeiro óxido de propileno e depois óxido de etileno ao propileno glicol.

[0049] Como demonstrado nos Exemplos abaixo, os copolímerostriblocos têm a capacidade de se introduzir em membranas de adipócito traumatizadas, levando em conta a estabilização da membrana (ver a figura 2). Além disso, conhece-se que tal polímero reduz a viscosidade da membrana com os seus caudas de polietileno glicol altamente hidratados. Reduzindo viscosidade celular eles permitem que as células traumatizadas se tornem mais solúveis, assim reduzindo a tensão na membrana prejudicar. Particularmente, mostrou-se que P188, copolímero tribloco comercialmente disponível, é particularmente eficaz para consertar membranas danificadas e melhora a viabilidade e a probabilidade da sobrevivência de adipócitos danificados. A eficácia do P188 no resgate de adipócitos danificados no período de peritransplante (tempo desde a colheita até a enxertia estável) é demonstrada nos Exemplos em baixo que olhada na histologia, o peso do enxerto de gordura com o tempo, eventos de apoptose, viabilidade celular, e teor de DNA bruto. Mostra-se que P188 é mais eficaz do que qualquer um outro polímero testado mesmo copolímeros triblocos menores e maiores com a mesma ordem de blocos não executa também. Os copolímeros diblocos e tetrablocos até parecem ser tóxicos a enxertos.

[0050] Mostrou-se que P188 é pobremente solúvel no tecidoadiposo, e não é absorto bem para membranas intactas, incólumes. P188 permite adipócitos que sofreram o dano absoluto mecânico do processo durante a colheita para manter a sua mecânica de membrana normal. Uma vez que estas células são capazes de consertar as suas membranas aumentando a quantidade de fosfolipídios na bicamada, P188 é mecanicamente expulso [Agarwal, J., A. Walsh, e R.C. Lee, Multimodal strategies for resuscitating injured cells. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1066:295-309; incorporado aqui por referência]. A extrusão do P188 é causada pelo aumento na pressão de superfície de transmembrana. Uma vez expulso das células transplantadas, P188 é excretado essencialmente inalterado pelos rins, com uma pouca quantidade excretada através do sistema entérico biliar [Singh-Joy, S.D. e V.C. McLain, Safety assessment of poloxamers de 101 anos, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics. Int J Toxicol, 2008. 27 Suppl 2:93-128; incorporado aqui por referência]. Não há nenhuma evidência de efeitos adversos ou preocupações de segurança com P188 nas concentrações úteis para o transplante de gordura.

[0051] O peso molecular do polímero utilizado na presente invençãopode variar de aproximadamente 500 g/mol até aproximadamente 50.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 1.000 g/mol a aproximadamente 30.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 2.000 g/mol a aproximadamente 15.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 2.000 g/mol a aproximadamente 12.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 1.000 g/mol a aproximadamente 5.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular do polímero varia de aproximadamente 5.000 g/mol a aproximadamente 10.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 7.500 g/mol a aproximadamente 10.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 10.000 g/mol a aproximadamente 15.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero varia de aproximadamente 15.000 g/mol a aproximadamente 20.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular dopolímero é de aproximadamente 20.000 g/mol a aproximadamente 25.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular médio do polímero é aproximadamente 5.000 g/mol, aproximadamente 5.500 g/mol, aproximadamente 6.000 g/mol, 6.500 g/mol, 7.000 g/mol,aproximadamente 7.500 g/mol, aproximadamente 8.000 g/mol,aproximadamente 8.500 g/mol, aproximadamente 9.000 g/mol,aproximadamente 9.500 g/mol, ou aproximadamente 10.000 g/mol. Em determinadas modalidades, o peso molecular médio do P188 é aproximadamente 8.400 g/mol. O peso molecular médio de outros poloxâmeros comercialmente disponíveis é conhecido na técnica.

[0052] A composição do polímero usado na presente invenção é omaterial de grau tipicamente farmacêutico para uso em seres humanos e/ou outros animais. Em determinadas modalidades, o polímero é aprovado para uso em seres humanos e para o uso veterinário. Em algumas modalidades, o polímero é aprovado pela United States Food and Drug Administration. Em algumas modalidades, o polímero é o material de grau farmacêutico. Em algumas modalidades, o polímero encontra os padrões da Farmacopéia dos Estados Unidos (USP), a Farmacopéia européia (EP), a Farmacopéia britânica, e/ou a Farmacopéia Internacional. Em determinadas modalidades, o polímero é pelo menos 90 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero é pelo menos 95 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero épelo menos 98 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero épelo menos 99 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero épelo menos 99,5 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero épelo menos 99,9 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero épelo menos 99,99 % puro. Em determinadas modalidades, o polímero ésem materiais de não biocompatível ou tóxico.

[0053] O polímero útil na presente invenção tipicamente degrada invivo em produtos de degradação não tóxicos ou é seguramente excretado pelo corpo. O polímero é preferivelmente biocompatível e não resulta em nenhum efeito de lado não desejado substancial. A meia- vida do polímero in vivo pode variar de aproximadamente 1 dia a aproximadamente 1 mês. Em determinadas modalidades, a meia-vida do polímero in vivo varia de aproximadamente 1 dia a aproximadamente 1 semana. Em determinadas modalidades, a meia-vida do polímero in vivo varia de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 semanas. Em determinadas modalidades, a meia-vida do polímero in vivo varia de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas.

[0054] O polímero pode ser testado para uso no transplante degordura misturando um polímero de teste com células de gordura a ser transplantadas e transplantando a composição resultante em um rato ou outro roedor para determinar com o tempo o êxito do implante graxo (como descrito nos Exemplos abaixo). O implante de gordura pode ser avaliado por várias medições bioquímicas e patológicas, por exemplo, o peso do implante, volume do implante, histologia, avaliando os marcadores da apoptose e/ou morte celular, medindo o número de células vivas, avaliando níveis de ATP mitocondriais, avaliando níveis de DNA, ou PCR em tempo real para determinar níveis da leptina, PPARY2, ou outros marcadores. Em determinadas modalidades, a prova é executada em ratos pelados. O polímero também pode ser avaliado in vivo misturando células com um polímero de teste e analisando as células de marcadores de apoptose ou morte celular, analisando as células da toxicidade, etc. Em determinadas modalidades, os resultados que usam um polímero de teste são comparados com as consequências de um controle. Em determinadas modalidades, o polímero de controle é P188. Em determinadas modalidades, o polímero de controle é o dextrano. Em determinadas modalidades, o transplante de gordura de controle é tratado com a solução salina normal.

[0055] O polímero pode ser combinado com outros agentesbiologicamente ativos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para formar uma composição útil para acrescentar às células a serem transplantadas. Tais agentes biologicamente ativos também podem trabalhar para evitar a morte celular em um enxerto de gordura. Excipientes podem ser usados para ajudar na mistura do polímero com as células a serem transplantadas ou no manejo e armazenamento da composição de polímero/célula resultante.

[0056] Os agentes biologicamente ativos que podem seradicionados junto com um polímero às células a serem transplantadas incluem, mas não são limitados a, antioxidantes, vitaminas, estabilizadores de membrana, minerais, protetores osmóticos, coenzimas, intensificadores de viscosidade, hormônios, e fatores de crescimento. Mecanismos numerosos foram implicados na causa da morte celular em células transplantadas, por exemplo, rompimento da membrana e formação radical livre. Os antioxidantes podem ser usados no transplante de gordura para reduzir a formação radical livre. Os antioxidantes limpam radicais livres e evitam o dano causado por espécies de oxigênio reativas. Em determinadas modalidades, uma composição de polímero/célula também compreende um antioxidante. Pensa-se que o polímero e o antioxidante melhorem a proteção das células e por meio disso melhorem os resultados de enxerto de gordura. Os antioxidantes podem ser enzimáticos ou antioxidantes não enzimáticos. Os antioxidantes enzimáticos incluem, por exemplo, dismutase de superóxido, peroxidase de glutationa, e catalase. Exemplos dos antioxidantes de não enzimático incluem tocoferol alfa (a vitamina E), vitamina A, glutationa, carotenoides (por exemplo, licopeno, luteína, polifenóis, β-caroteno), flavonoides, flavonas, flavonóis,glutationa, cisteína de N-acetil, cisteína, ácido lipoico, ubiquinal(coenzima Q), ubiquinona (coenzima Q10), melatonina, licopeno, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado (BHT), benzoatos, metil parabeno, propil parabeno, proantocianidinas, manitol, e ácido etilenodiamina tetracético (EDTA). Em determinadas modalidades, o antioxidante é um antioxidante metálico. Em determinadas modalidades, o antioxidante é selênio. Em determinadas modalidades, o antioxidante é zinco. Em determinadas modalidades, o antioxidante é o cobre. Em determinadas modalidades, o antioxidante é o germânio.

[0057] Em determinadas modalidades, uma composição de polímero/célula também compreende uma vitamina. A vitamina pode ser um antioxidante. Em determinadas modalidades, a vitamina é tocoferol alfa (a vitamina E). Em determinadas modalidades, a vitamina é coenzima Q10. Em determinadas modalidades, a vitamina é beta caroteno. Outras vitaminas que podem ser acrescentadas à composição de polímero/célula da invenção incluem a vitamina A, a vitamina B1 (tiamina), a vitamina B2 (riboflavina), a vitamina B3 (niacina), a vitamina B4 (adenina), a vitamina B5 (ácido pantotênico), a vitamina B6 (piridoxina), a vitamina B7 (biotina), a vitamina B9 (ácido fólico), a vitamina B12 (cianocobalamina), a vitamina D (ergocalciferol), e a vitamina K.

[0058] Em determinadas modalidades, uma composição depolímero/célula também compreende um hormônio ou fator de crescimento. Em determinadas modalidades, o hormônio ou fator de crescimento é insulina, glitazonas, colesterol, VEGF, FGF, EGF, PDGF, etc. Em determinadas modalidades, a composição de polímero/célula também compreende um ácido orgânico (por exemplo, ácido lipoico). Em determinadas modalidades, a composição de polímero/célula também compreende uma concentração de tiol ou molécula que contém o dissulfeto (por exemplo, ácido lipoico, glutationa). Em determinadas modalidades, a composição de polímero/célula também compreende uma pequena molécula orgânica (por exemplo, antrocianinas, capsaicinas).

[0059] Em determinadas modalidades, as células de gordura sãocombinadas com P188 e glutationa para transplante em um paciente. Em determinadas modalidades, as células de gordura são combinadas com P188 e ácido lipoico para transplante em um paciente. Em determinadas modalidades, as células de gordura são combinadas com P188 e a vitamina E para transplante em um paciente.

[0060] As formulações do polímero descritas aqui podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou depois desenvolvido na técnica de produtos farmacêuticos. Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de colocar o polímero em associação com um ou mais excipientes e/ou um ou mais outros agentes biologicamente ativos. As quantidades relativas do polímero, o excipiente farmaceuticamente aceitável, e/ou qualquer agente adicional em uma composição da invenção variará, dependendo da identidade do polímero, do tamanho do polímero, do sítio do implante, e/ou do paciente. Como forma de exemplo, a composição a ser misturada com células a serem transplantadas pode compreender entre 1 % e 99 % (p/p) do polímero.

[0061] As formulações do polímero podem compreender umexcipiente farmaceuticamente aceitável, que, tal como aqui utilizado, inclui um ou todos os solventes, meios de dispersão, diluentes, ou outros veículos líquidos, auxiliares de suspensão ou dispersão, agentes ativos superficiais, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes, ligantes sólidos, lubrificantes e similares, como ajustado à determinada formulação desejada. O Remington’s The Science and practice of pharmacy, 21a Edição, A. R. Gennaro,(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland, 2006; incorporado aqui por referência) divulga vários excipientes usados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas da preparação do mesmo. Exceto na medida que qualquer excipiente convencional seja incompatível com uma substância ou os seus derivados, tal como produzindo qualquer efeito biológico indesejável ou de outra maneira interagindo em uma maneira deletéria com qualquer outro componente da composição farmacêutica, o seu uso é contemplado como estando dentro dos limites desta invenção.

[0062] Em algumas modalidades, o excipiente farmaceuticamenteaceitável é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% puro. Em algumas modalidades, o excipiente é aprovado para uso em seres humanos e para o uso veterinário. Em algumas modalidades, o excipiente é aprovado pelo United States Food and Drug Administration. Em algumas modalidades, o excipiente é o grau farmacêutico. Em algumas modalidades, o excipiente encontra os padrões da Farmacopéia dos Estados Unidos (USP), a Farmacopéia Européia (EP), a Farmacopéia Britânica (BF), e/ou a Farmacopéia Internacional (IF).

[0063] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados nafabricação das composições de polímero incluem, mas não são limitados a, diluentes inertes, agentes dispersantes, agentes suavizantes ativos e/ou emulsificantes, agentes desintegrantes, conservantes, agentes tamponadores, reagentes lubrificantes, e/ou óleos. Tais excipientes podem ser opcionalmente incluídos nas formulações da invenção. Os excipientes, tais como agentes corantes podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.

[0064] Exemplos dos diluentes incluem, mas não são limitados a,carbonato de cálcio, carbonato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de cálcio,, fosfato hidrogenado de cálcio, lactose de fosfato de sódio, sacarose, celulose, celulose microcristalina, caulim, manitol, sorbitol, inositol, cloreto de sódio, amido seco, amido de milho, açúcar em pó, etc., e combinações do mesmo.

[0065] Os exemplos de agentes dispersantes incluem, mas não sãolimitados a, amido de batatas, amido de milho, amido de tapioca, glicolato de amido de sódio, argilas, ácido algínico, goma guar, polpa de cítricos, ágar-ágar, bentonita, celulose e produtos de madeira, esponja natural, resinas de troca catiônica, carbonato de cálcio, silicato, carbonato de sódio, poli (vinil pirrolidona) reticulado (crospovidona), amido de carboximetil de sódio (glicolato de amido de sódio), carboximetil celulose, carboximetil celulose de sódio reticulada (croscarmelose), metilcelulose, amido pré-gelatinizado (amido 1500), amido microcristalino, amido insolúvel de água, carboximetil celulose de cálcio, silicato de alumínio de magnésio (Veegum), lauril sulfato de sódio, compostos de amônio quaternário, etc., e combinações dos mesmos.

[0066] Exemplos dos conservantes podem incluir antioxidantes,reagentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes alcoólicos, conservantes ácidos, e outros conservantes. Exemplos dos antioxidantes incluem, mas não são limitados a, tocoferol alfa, ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabissulfito de potássio, ácido propiônico, galato de propila, ascorbato de sódio, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, e sulfeto de sódio. Os agentes exemplos de quelantes incluem o ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), mono-hidrato de ácido cítrico, edeteato dissódico, edeteato de dipotássico, ácido edetoico, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edeteato de sódio, ácido tratárico, e edeteato de trissódico. Exemplos dos conservantes antimicrobianos incluem, mas não são limitados a, cloreto benzalcônio, cloreto benzetônio, álcool benzílico, bronopol, cetrimida, cloreto de cetilpiridina, clorexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, álcool etílico, glicerina, hexetidina, imiduréia, fenol, fenoxietanol, álcool feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propileno glicol, e timerosal. Exemplos dos conservantes antifúngicos incluem, mas não são limitados a, butil parabeno, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potássio, sorbato de potássio, benzoato de sódio, propionato de sódio, e ácido sórbico. Exemplos dos conservantes álcool incluem, mas não são limitados a, etanol, polietileno glicol, fenol, compostos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato, e álcool feniletílico. Os conservantes exemplos de ácidos incluem, mas não são limitados a, vitamina A, a vitamina C, a vitamina E, beta caroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido desidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico, e ácido fítico. Outros conservantes incluem, mas não são limitados a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), etilenodiamina, lauril sulfato de sódio (SLS), éter de lauril sulfato de sódio (SLES), bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfeto de potássio, metabissulfito de potássio, Glydant Plus®, Phenonip®, metilparabeno, Germall 115, Germaben II, Neolone™, Kathon™, e Euxyl®. Em determinadas modalidades, o conservante é um antioxidante. Em outras modalidades, o conservante é um agente quelante.

[0067] Os exemplos de agentes tamponadores incluem, mas nãosão limitados a, soluções de tampão de citrato, soluções tampão acetato, soluções tampão fosfato, cloreto de amônio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gliceptato de cálcio, gluconato de cálcio, ácido D-glucônico, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio, ácido propanoico, levulinato de cálcio, ácido pentanoico, fosfato de cálcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de cálcio tribásico, fosfato de hidróxido de cálcio, acetato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, misturas de potássio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de potássio monobásico, misturas de fosfato de potássio, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, lactato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, misturas de fosfato de sódio, trometamina, hidróxido de magnésio, hidróxido de alumínio, ácido algínico, água livre de pirogênio, solução salina isotônica, solução de Ringer, álcool etílico, etc., e combinações do mesmo.

[0068] O polímero da invenção além de ser combinado com ascélulas a serem transplantadas pode ser combinado com um ou mais agentes biologicamente ativos. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um antioxidante. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com uma vitamina. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um lipídio. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um estabilizador de membrana. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um agente farmacêutico. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um agente anti-inflamatório. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um antibiótico. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com uma proteína ou peptídeo. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um hormônio. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um fator de crescimento. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um carboidrato. Em determinadas modalidades, o polímero é combinado com um excipiente líquido para administrar a composição de polímero/célula. Em determinadas modalidades, o excipiente é uma solução aquosa. Em determinadas modalidades, o excipiente é uma solução aquosa tamponada. Em determinadas modalidades, o excipiente é a solução salina tamponada pelo fosfato. Em determinadas modalidades, o excipiente é isotônico com o fluido extracelular.

Usos

[0069] A invenção fornece métodos de associar o polímero oucomposição de polímero com células a serem transplantadas antes do transplante. O sistema da invenção é particularmente útil na melhoria do êxito de transplante de gordura ou melhoria do êxito do transplante de tecido adiposo ou de células derivadas do tecido adiposo. As células a serem transplantadas são misturadas com um polímero em uma concentração suficiente para as membranas das células serem estabilizadas e evitarem o dano das células durante o transplante. Pensa-se que o polímero restaure ou evite o dano às membranas celulares associando-se com a membrana. As células ou uma composição de células são misturadas com o polímero ou uma composição compreendendo o polímero antes do transplante em um paciente. O polímero pode ser misturado com as células na coleta das células, durante o armazenamento ou o manejo das células, ou exatamente antes da implantação das células em um paciente.

[0070] O polímero pode ser misturado com o tecido ou células aserem transplantadas em qualquer tempo durante a aquisição, o manejo, o processamento, ou a implantação do enxerto. Em determinadas modalidades, o sítio onde as células ou o tecido devem ser tomados é injetado com uma composição do polímero antes que as células ou o tecido sejam colhidos do sítio doador. Por exemplo, o polímero pode incluir a solução de injeção tumescente (isto é, fluido que é injetado no sítio doador antes da lipoaspiração) durante a colheita da gordura. Em determinadas modalidades, as células ou o tecido a ser transplantado são contatados com o polímero logo que eles sejam colhidos para protegê-los do dano. Por exemplo, após o tecido adiposo ser colhido de um doador (por exemplo, pela lipoaspiração ou por uma aspirada de agulha), ele pode ser imediatamente conectado com o polímero. Em determinadas modalidades, o polímero está incluído no reservatório de coleta do lipoaspirado. Em determinadas modalidades, as células a serem transplantadas são colhidas da mesma pessoa que os recebe (isto é, uma doação autóloga). Em determinadas modalidades, as células são colhidas do estômago, coxa, ou nádegas do doador. Em determinadas modalidades, o tecido adiposo é colhido em uma seringa ou outro reservatório que já inclui o polímero ou uma composição do polímero. Em outras modalidades, o tecido adiposo é colhido e imediatamente acrescentado a uma composição do polímero, ou uma composição do polímero é acrescentada ao tecido adiposo. A composição de polímero/célula resultante pode ser também processada antes do implante em um paciente. Por exemplo, as células podem ser lavadas, purificadas, extraídas, ou de outra maneira tratadas antes da implantação em um paciente. Em determinadas modalidades, as células ou o tecido são guardados em contato com um excesso do polímero durante o processamento das células para transplante. Em determinadas modalidades, o excesso de polímero ou de solução de polímero é removido do tecido ou das células a serem transplantadas, por exemplo, pela centrifugação. Em determinadas modalidades, o polímero é lavado do enxerto antes da implantação.

[0071] Em determinadas modalidades, as células a seremtransplantadas são contatadas com o polímero imediatamente antes do transplante. Por exemplo, as células podem ser misturadas com o polímero na sala de cirurgia ou clínica exatamente antes da implantação em um paciente. O polímero estéril ou a composição do mesmo são misturados com as células a serem transplantadas.

[0072] As células são tipicamente misturadas com o polímero emuma concentração variando de aproximadamente 1-20 mg do polímero por mL de células. Como pode ser apreciado por uma pessoa versada na técnica, a concentração do polímero necessária para estabilizar suficientemente as membranas das células a serem transplantadas pode variar dependendo do polímero usado, o paciente, o sítio da implantação, etc. Em determinadas modalidades, a concentração varia de aproximadamente 1-10 mg do polímero por mL de células. Em determinadas modalidades, a concentração varia de aproximadamente 1-5 mg do polímero por mL de células. Em determinadas modalidades, a concentração varia de aproximadamente 5-10 mg do polímero por mL de células. Em determinadas modalidades, a concentração varia de aproximadamente 10-15 mg do polímero por mL de células. Em determinadas modalidades, a concentração varia de aproximadamente 15-20 mg do polímero por mL de células. Em determinadas modalidades, a concentração é aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 mg do polímero por mL de células. Em determinadas modalidades, quando poloxímero P188 é usado, a concentração é aproximadamente 10 mg do polímero por mL de células.

[0073] Após as células serem contatadas com o polímero, acomposição célula/polímero é administrada a ou implantada em um paciente. Em determinadas modalidades, as células são transplantadas no receptor dentro de 0,5 a 6 horas da colheita. Em determinadas modalidades, o paciente é ser humano. Em determinadas modalidades, o paciente é um mamífero. Em determinadas modalidades, o paciente é um animal de teste, tal como um rato, camundongo, coelho, ou cão. A composição célula/polímero é tipicamente administrada a um paciente que esteja necessitando de um transplante de gordura. O paciente pode estar submetendo-se a cirurgia reconstrutora ou cosmética. Em determinadas modalidades, o transplante de gordura é usado na remoção de rugas. Em determinadas modalidades, o transplante de gordura é usado em substituição ou aumento de tecido macio. Em determinadas modalidades, o transplante de gordura é usado no aumento dos lábios, bochechas, peitos, rosto, nádegas, panturrilhas, peitorais, e pênis. Tipicamente, as células de gordura autólogas são transplantadas de volta ao doador em um sítio diferente do qual as células foram tomadas. As células ou tecidos usados podem ser implantados ou administrados por qualquer método ou técnica (por exemplo, injeção, implantação cirúrgica).

[0074] Além de adipócitos, encontrou-se que o tecido adiposo éuma fonte de células-tronco (Gimble et al., "Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine" Circulation Research 100:1249-1260, 2007; incorporado aqui pela referência). Por isso, o sistema da invenção pode ser útil para a estabilização e prevenção de danos a células-tronco ou outras células derivadas do tecido adiposo. Em determinadas modalidades, o sistema da invenção é útil no transplante de células- tronco adultas. Em determinadas modalidades, da invenção o sistema é útil no transplante de fibroblastos. Outras células encontradas no tecido adiposo incluem, mas não são limitadas a, células estromais, células da musculatura lisa, células sanguíneas (por exemplo, macrófagos), células epiteliais, e células endoteliais. A invenção provê o transplante de quaisquer de tais células.

Kits

[0075] A invenção também fornece embalagens ou kits,compreendendo um ou mais polímeros ou componentes de polímero como descrito aqui em um reservatório. Por exemplo, o reservatório pode incluir um polímero ou a composição de um polímero pronto para uso para o transplante de gordura. A embalagem também pode incluir um aviso associado com o reservatório, tipicamente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regula a produção, o uso, ou a venda de dispositivos médicos e/ou produtos farmacêuticos, pelo qual o aviso é uma comprovação da aprovação do uso das composições, para a administração humana ou veterinária no transplante de tecido. As instruções para uso do polímero também podem estar incluídas. Tais instruções podem incluir a informação relacionada com a administração do polímero ou uma composição de polímero/célula a um paciente. Particularmente, as instruções podem incluir a informação quanto a contatar do polímero com células ou tecido e administração da composição célula/polímero a um paciente. A embalagem também pode incluir um ou mais reservatórios que contêm o agente biologicamente ativo para ser incluído na composição de polímero/célula antes da administração.

[0076] A embalagem pode incluir um dispositivo ou recipiente parapreparação da composição de polímero/célula. O dispositivo pode ser, por exemplo, dispositivo de medição ou mistura.

[0077] A embalagem também pode incluir opcionalmente umdispositivo para administrar uma composição de polímero/célula da invenção. Exemplos dos dispositivos incluem seringas, agulhas, e cateteres especializados que são compatíveis com vários desenhos de laringoscópios.

[0078] Os componentes do kit pode ser fornecidos em umreservatório único maior, por exemplo, uma caixa plástica ou de isopor, em confinamento relativamente fechado. Tipicamente, o kit é convenientemente empacotado para uso por um profissional da saúde. Em determinadas modalidades, os componentes do kit são armazenados em embalagem estéril para uso em um ambiente estéril, tal como a clínica do médico ou uma sala de cirurgia.

Exemplos. Exemplo 1: Proteção Melhorada da Gordura e Sobrevivência em transplante de Gordura via Tratamento com Poloxâmero P188. Introdução.

[0079] O transplante de gordura autólogo é um ferramentalessencial na reconstrução de tecido macio. As células danificadas e apoptóticas, contudo, são eventualmente reabsorvidas pelo corpo e fornecem resultados inconsistentes e indesejáveis da restauração de tecido macio. Poloxâmero P188 é um agente que interage com membranas celulares danificadas e se insere em monocamadas de lipídio. Este tensoativo não iônico efetivamente sela a membrana de células danificadas e foi mostrado proteger contra dano e apoptose. A capacidade de poloxâmeros de interagir com membranas de lipídio levou a supor que selando as porções das células de gordura danificadas durante a colheita de gordura, pode-se restaurar e proteger a integridade estrutural de células danificadas e assim melhorar a sobrevivência celular. Este Exemplo investiga a capacidade do P188 de restaurar efetivamente e proteger tecidos danificados, melhorar a sobrevivência celular, e melhorar resultados de transplante.

Métodos.

[0080] A gordura foi obtida para lipoaspiração aspirada etransplantou-se em ratos pelados dentro de uma hora da colheita da sala de cirurgia. Um volume de 0.6 mL da gordura foi colocado subcutaneamente no dorso direito de cada rato. O estudo incluiu três grupos: (1) a gordura tratada com P188 em uma concentração de 10 mg/mL; (2) a gordura tratada com o dextrano em uma concentração de 10 mg/mL; e (3) a gordura tratada com a solução salina normal. Após um período de 6 semanas, os ratos foram eutanaziados, e os implantes de gordura foram colhidos. Os implantes de gordura foram avaliados antes do implante, e depois, usando a pesagem, volume, ensaio vivo/morto, níveis de ATP mitocondriais, e PCR em tempo real para a leptina e níveis PPARY2.

Resultados.

[0081] A gordura transplantada desenvolveu em um nódulo bemcircunscrito, nódulo demarcado em cada animal após um período de seis semanas. Os controles de solução salina expuseram a reabsorção de até 30 % baseada em peso e volume. Os enxertos de gordura tratados pelo dextrano expuseram uma taxa de reabsorção semelhante. Os enxertos de gordura tratados com P188 demonstraram uma redução de 67 % na reabsorção. Ver a figura 5. Isto é uma reduçãoestatisticamente significativa (p <0.001). As diferenças também foram vistas ao nível molecular e histologicamente com aumentos notáveis na proporção de células de gordura e diminuição de áreas vacuolares ou formação de fibrose.

Conclusão.

[0082] Neste Exemplo, a eficácia e a sobrevivência de enxertos degordura humanos foram estudadas usando um modelo de rato pelado para transplante. O poloxâmero P188, um tensoativo não iônico, significativamente reduziu a reabsorção de enxertos de gordura e melhorou a sobrevivência celular. Ao contrário o tratamento com o dextrano, com controle de peso molecular comparável, deu resultados semelhantes à solução salina. O uso do P188 restaura e protege enxertos de gordura, melhora a sobrevivência celular, e reduz a reabsorção de enxerto de gordura.

Exemplo 2: Comparação de P188 com Outros Agentes para Transplante de Gordura Introdução

[0083] Os danos de tecido macio e as malformações secundárias atraumas, defeitos congênitos, infecções, e resseções oncológicas são uma fonte de morbidez significativa em pacientes. Atualmente a reconstrução por presilhas livres autólogas ou por avanço local de presilhas são os maiores esforços das modalidades reconstrutoras significativas de tecido macio e de defeitos ósseos. Enquanto, as presilhas pediculadas e as reconstruções de presilha livre oferecem instrumentos potentes para a reconstrução, eles não são ausentes de efeitos colaterais potencialmente sérios e morbidez do sítio doador. A capacidade de transferir um grande volume do tecido adiposo autólogo da reconstrução destes defeitos forneceria uma nova opção reconstrutora para potencialmente milhões de pacientes, sem a morbidez associada dos sítios doadores. Adicionalmente, forneceria um ferramental potente para pacientes que possuem pobres opções de sítios doadores, e pacientes com a incapacidade de tolerar os extensos tempos cirúrgicos necessários em reconstrução com presilhas.

[0084] A vantagem de usar a gordura lipoaspirada é dupla: 1) amínima morbidez de sítio doador que fornece uma fonte segura e prontamente acessível de células autólogas, e 2) estes procedimentos pode ser realizados relativamente facilmente sem a preocupação de complicações isquêmicas, e fracassos precoces do enxerto associados com presilhas livres vascularizadas. Contudo, os enxertos de gordura livres até agora foram contemplados com altos níveis imprevisíveis resultantes de reabsorção e irregularidades. Os fracassos de enxerto de gordura livre e a redução de volume parecem estar relacionados a estresse mecânico durante a colheita, modificações isquêmicas precoces, e privação de nutrientes. Estes efeitos estressantes levam a apoptose. Subsequente, a reabsorção de enxerto resulta da remoção do resíduo celular morto depois da revascularização.

[0085] Até aqui, os esforços em atenuar o ataque isquêmico iniciale proteger células até a vascularidade suficiente foram estabelecidos foram avaliados como com resultados modestos. A reabsorção apresenta um impedimento significativo à sobrevivência de longo prazo do enxerto de gordura, e o maior tecido macio fere esforços reconstrutivos. Para essa finalidade foi estudado extensivamente os agentes de estabilização de membrana incluindo polímeros. Alguns desses polímeros foram avaliados em laboratório como reduzindo a morte celular apoptótica o que resulta em maiores volumes de enxertos de gordura com o tempo. As misturas deste polímero podem fornecer uma solução de ressuscitação celular que levará a transplantes de gordura livre predizíveis e permanentes.

[0086] P188 é um polímero tribloco com um polioxipropileno naregião hidrofóbica central (unidade POP, ver a figura 1A) estendendo duas longas caudas hidrofílicas de polioxietileno (unidades POE, ver a figura 1B). Acredita-se que os traumas mecânicos e estresse isquêmico resultam em um esgotamento da membrana celular do adipócito normal. Este esgotamento é primeiro manifestado como um aumento na porosidade e resulta na perda do gradiente iônico da membrana normal. A perda da integridade elétrica de membrana é um ativador potente conhecido da cascata apoptótica. As células que então sofrem a morte celular programada e permanecem no enxerto como uma coleta de gotículas de lipídio então são depois reabsortas conduzindo para enxertar a perda de volume. Assim, P188 tem a capacidade de inserir em membranas de adipócito traumatizadas, levando em conta a estabilização da membrana (ver a figura 2). Adicionalmente, conhece- se que P188 reduz a viscosidade da membrana com os suas caudas de POE altamente hidratadas. Reduzindo viscosidade celular eles permitem as células traumatizadas se tornem mais solúveis, assim reduzindo a tensão na membrana ferida.

[0087] Demonstrou-se que o poloxâmero P188 é particularmenteeficaz para consertar membranas danificadas e melhorar a viabilidade e a probabilidade da sobrevivência de adipócitos danificados. Uma configuração provável deste mecanismo de reparo é ilustrada na figura 2. Uma membrana celular danificada pode expor uma porção da camada de lipídio central ao meio. A porção hidrofóbica central de uma cadeia P188 próxima pode interagir com esta camada de lipídio hidrofóbica, e a cadeia P188 pode "dobrar-se" de tal modo que as extremidades hidrofílicas da cadeia são localizadas ao longo da superfície hidrofílica exterior da membrana celular. Este processo de vedação/reparo é análogo a um reparo de tampão de pneumático automóvel convencional, onde o centro de um tampão de borracha flexível é empurrado em um pequeno furo em um pneumático a selá-lo, com os fins do tampão que é localizado ao longo do passo exterior. Uma pluralidade de cadeias P188 pode coletar-se para ajudar a selar membranas danificadas os tamanhos possuindo diferentes das regiões danificadas.

[0088] Os estudos demonstraram que esta membrana celular salvao processo em ambos os modelos de eletroporação [Lee et al., Surfactant-induced sealing of electropermeabilized skeletal muscle membranes in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89 (10):4524-8; incorporado aqui por referência] e em modelos de radiação ionizante [Hannig et al., Surfactant sealing of membranes permeabilized by ionizing radiation. Radiat Res, 2000. 154 (2):171-7; incorporado aqui por referência], à parte do nosso próprio modelo de apoptose de lipoaspiração. Adicionalmente, os novos estudos que investigam dano neuronial após traumas bruscas mostraram que a proteção de membrana com P188 ressuscita células cedo no dano absoluto fornecendo estabilização de membrana mecânica [Marcas et al., Amphiphilic, tri-block copolymers provide potent membrane-targeted neuroprotection. FASEB J, 2001. 15 (6):1107-9; Serbest, G., J. Horwitz, e K. Barbee, The effect of poloxamer-188 on neuronal cell recovery from mechanical injury. J Neurotrauma, 2005. 22 (1):119-32; Serbest et al., Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma. FASEB J, 2006. 20 (2):308-10; cada um dos quais é incorporado aqui pela referência].Este estudo, muito parecido com o da invenção, mostra reduções nas apoptoses e aumentos da viabilidade celular após o trauma. De maneira interessante, aqui novamente, as células tratadas eram mais parecidas com as células sãs, isto é, neurônios originais, comparando com células danificadas não tratadas.

[0089] Neste Exemplo, é a presentada a eficácia do P188 noresgate de adipócitos danificados no período de peritransplante (tempo desde a colheita até a enxertia estável). Adicionalmente, é demonstrado que o polímero estreitamente relacionado a P188 em tamanho e estruturas tem efeitos semelhantes embora não tão eficazes quanto o P188.

Métodos Identificação da Apoptose.

[0090] Marcadores imunoquímicos fluorescentes específicos para aapoptose FLIVO® e MT Mito® foram usados para identificar a apoptose em adipócitos. Os enxertos de gordura foram explantados, tratados com Blendzyme (Roche Applied Science Liberase Blendzyme 3) em 38°C durante 20 minutos, e passados em um filtro celular de 100 microns (para remover elementos estromais extracelulares deixados para trás após digestão). Estas células então foram incubadas durante uma hora em 38°C, e lavadas uma vez depois da marcação. Posteriormente estas células foram colocadas em placas pretas de 96 poços, e lidas em um leitor de placas (Molecular Devices, SpectraMax M2) nas suas emissões específicas para os corantes e os comprimentos de onda de excitação (FLIVO-red exc. 565/emis. > 590, MITO-PT exc. 488/emis. Verde 530, vermelho 590).

PICO green.

[0091] Kit de Ensaio de dsDNA Quant-iT PicoGreen® da Invitrogenfoi usado para a quantificação de DNA como uma representação de contagem celular. Cada lóbulo explantado foi digerido em 1,0 cc de Blendzyme em 38°C durante 30 minutos. Depois, a reação de Blendzyme foi parada com 1,0 cc de FBS que contém meio de cultura de células. Para a quantificação 75 microlitros da gordura digerida foram removidos e processados usando de um kit de isolamento de coluna giratória Qiagen Mini-prep. As amostras de DNA extraídas então foram incubadas com reagentes A (fluoróforo de PicoGreen®), B (tampão de Tris), e para padrões com o componente C (padrões de lambda dsDNA, concentração de 100 μg/ml), de acordo com o protocolo do kit. Estas amostras então foram lidas em um leitor de placa, usando uma placa de 96 poços preta.

Processamento da Gordura.

[0092] O lipoaspirado foi tomado diretamente da sala de cirurgia.Foi separado em alíquotas de 30 cc, e lavou-se uma vez com um volume igual da solução salina normal para remover o sangue e o resíduo celular. Posteriormente, os tubos foram centrifugados em 200G e a camada meia foi separada e tratada com vários agentes. Estes agentes foram tratados em 30 cc lavavagens, com 30 centímetros cúbicos de gordura durante 30 minutos em 37°C. Esta incubação foi escolhida para minimizar o tempo isquêmico levando em conta mistura suficiente com agentes de tratamento. Após a incubação e lavagem, a gordura foi novamente centrifugada em 200G. A camada semigordurosa foi novamente separada e colocada em alíquotas de 1,0 cc, 1,0 g para injeção nos flancos de ratos pelados. Isto foi executado sob aprovação de IRB para o uso do tecido descartado de identificado. De nota, as cânulas durante a colheita e a colheita de pressões variaram com cada caso e com cada cirurgião. A gordura foi enxertada em animais dentro de duas horas da coleta na sala de cirurgia para minimizar o tempo de isquemia aquecida.

Modelo Experimental.

[0093] Os ratos pelados foram implantados com 1,0 cc/1,0 g (+/-0,01g) de enxertos de gordura em um único lóbulo. Estes ratos foram injetados com um angiocateter de 14 G para simular uma injeção de 1 cc clinicamente relevante. Dois lóbulos foram implantados em flancos bilaterais de cada rato pelado usado no estudo. O angiocateter de 14 G foi escolhido para minimizar traumas de enxerto de gordura durante a injeção. Muitos clínicos usam cateteres de 14 e 16 G atualmente para enxerto de gordura, assim este tamanho de cateter foi usado para aproximar da prática clínica.

[0094] Inicialmente, os lóbulos foram explantados diariamente emedidos para peso e atividade apoptótica. Após primeiras curvas serem geradas, os lóbulos foram explantados nos dias 3, 6, e 9, para a medição primária de níveis de apoptose. Adicionalmente estas amostras foram pesadas, mandadas buscar histologia, e medidas para o teor de DNA. O ponto final durante dez primeiros dias foi comparado com o ponto final em seis semanas para determinar se o desempenho de enxerto pode ser exatamente predito para a primeira apoptose e morte celular.

[0095] Cada experimento consistiu em um primeiro grupo e umgrupo de ratos recém-falecidos. Cada grupo foi injetado com a mesma gordura de um paciente único em um dia único. Já que o primeiro tempo aponta que dois animais foram eutanaziados em cada dia de amostragem de cada grupo (n=4 lóbulos por cada primeiro ponto de tempo). Adicionalmente, os animais destes mesmos grupos foram então eutanaziados em seis semanas do exame do último ponto final (8 animais que geram 16 lóbulos foram usados para cada grupo dos últimos pontos de tempo). Uma vez que um animal foi eutanaziado, ambos os lóbulos foram coletados analisados, e o animal foi removido do estudo.

Agentes Testados.

[0096] Para este estudo um espectro de vários agentes foramtestados. Especificamente vários polímeros foram selecionados para estudar o efeito de diferentes comprimentos de subunidades de cadeia e configurações de plurônicos.

Plurônicos.

[0097] Os plurônicos foram testados através de um faixa devariação de tamanhos, diferentes composições de PEG (hidrofilicidade), e configurações de bloco. Estes representam os poloxâmeros mais amplamente comercialmente disponíveis para uso não industrial. Eles foram todos testados uma dose de 50 μM em 25 cc da solução salina normal. Os agentes examinados foram P188 (~8,000 KDa/80% teor de PEG), F38 (4.700 KDa/80% teor de PEG), F108 (14.600 KDa/80% teor de PEG), F127 (12.600 KDa/70% teor de PEG), L64 (2,900KDa/40% teor de PEG), T1107 (PEG de 70%, maiores poloxâmeros tetrablocos), e P31R1 (3250 KDa, ordem de bloco invertida). Também foi testado o dibloco (PEG-block-poly-caprolactone-block).

Tensoativos Não Plurônicos Não iônico.

[0098] O polisorbato 80 (Tween 80) um polímero com uma caudahidrofóbica longa (ácido oleico) e uma cabeça hidrofílica (sorbitano de polietoxilado) foi testado na mesma concentração de molar que P188 (50 μM em 25 cc da solução salina normal). O colesterol também foi testado na mesma molaridade.

Catiônico e Aniônico.

[0099] O brometo de hexadeciltrimetilamônio (HCTA, catiônico) ecloreto de cetiltrimetilamônio (CTA, aniônico) tensoativos carregados não plurônicos foram testados a 50 μM em 25 cc da solução salina normal. Estas moléculas variam no tamanho ~360 KDa e têm uma cadeia hidrofóbica curta com uma cabeça de sal de amônio carregada.

Zwitteriônico.

[00100] Fosfatidilcolina (PC, 790 kDa) um tensoativo de zwitteriônico presente em algumas membranas celulares normais foi testado. Os tensoativos zwitteriônicos podem ter propriedades carregadas ou descarregadas dependendo do pH.

Polietileno Glicol (PEG).

[00101] PEG 8000 foi testado em 10 mg/ml já que ele tem o mesmo peso molecular que o P188. Adicionalmente PEG 600 e PEG 3350 foram testados separadamente e em combinação em 1,3 % e 1,5 % respectivamente como foi publicado na literatura quanto à proteção de membrana de condrócito em aplicações de criopreservação. O número depois do PEG representa o seu peso molecular. PEG é um componente de poloxâmeros e é inteiramente hidrofílico.

Aditivos.

[00102] Vários aditivos do P188 foram testados. A Vitamina C foi testada no momento de concentrações de 10% - 1%, o ácido lipoico foi testado em 500 mM em 100 mg/kg de gordura (dose usada em modelos de reaspersão da isquemia de rato), resveratrol (em 50 μM em 25 cc da solução salina normal), frutanos (moléculas orgânicas exibindo proteção a membranas de planta que sofrem amplas variações de temperatura). Também, a ciclosporina (CsA) foi examinada (uma medicação imunossupressora potente).

Estatística.

[00103] As amostras foram analisadas usando ANOVA ou um teste t de Student para a significância estatística entre grupos. A significância foi estabelecida em um intervalo de confiança de 95%, P <0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados. Microscopia de elétrons

[00104] Os adipócitos do lipoaspirado fresco foram fixados e estudos sob a microscopia de transmissão de elétron. Estas amostras foram examinadas para a presença contra danos de membrana como o resultado da colheita de lipoaspiração. Sob a microscopia de elétrons observou-se poros nas membranas de adipócitos intactos imediatamente depois da colheita. Olhando atentamente foram observados variando de 30-600nm (ver a figura 3). Também, estes poros foram observados estando na proximidade imediata com a mitocôndria do adipócito.

Apoptose Microscopia Confocal.

[00105] As amostras dos primeiros experimentos foram explantadas para a microscopia confocal. Estes lóbulos foram digeridos em Blendzyme e marcados com marcador específico para a apoptose FLIVO-red; após incubação, estas células foram fixadas no paraformaldeído de 4 % e examinadas sob microscopia confocal para avaliação qualitativa de níveis de apoptose. Quando os adipócitos foram visualizados usando o FLIVO-red SR (excitação 560nm e emissão 590nm), as diferenças significativas entre grupos tratados e não tratados foram observadas (ver a figura 6). As amostras tratadas pela solução salina demonstraram vesículas apoptóticas grandes, vermelhas em todas as partes da membrana celular. Em contraste, as amostras tratadas com P188, no dia seis, demonstraram relativamente poucas vesículas apoptóticas vermelhas.

Quantificação da Apoptose.

[00106] Inicialmente, os lóbulos foram explantados diariamente e medidos para os níveis da apoptose usando Mito-PT. Após prova diária, observou-se que os níveis máximos da apoptose ocorreram entre dias 5 e 7, e depois tenderam a diminuir. Estes valores caíram aproximadamente em uma curva em forma de sino. Uma vez que esta curva foi determinada, as amostras subsequentes foram testadas nos dias 0, 3, 6, e 9, para uma amostragem da primeira apoptose (ver a figura 7).

[00107] Quando P188 foi comparado com os controles tratados com solução salina que usam marcadores específicos para apoptose uma redução estatisticamente significativa de eventos apoptóticos foi observada no dia 6. Esta diferença usando um teste t de Student que não assume nenhuma diferença entre amostras e mostrou um valor p de 0,03. No Dia 6, a solução salina normal (NS) demonstrou 41.000 RFUs contra 24.000 RFUs do P188 (erro padrão da média +/-5.720 RFUs NS, 4485 RFUs P188). Isto representa uma redução de 40 % de eventos apoptóticos em média nos enxertos de gordura tratados com P188 quando comparado com controles tratados pela solução salina normal.

[00108] P188 foi também comparado com vários outros agentes detratamento no seu impacto aos níveis de apoptose (ver a figura 8). Quando P188 é comparado com polímero aniônico e catiônico representado por HCTA e CTA, ele demonstrou níveis significativamente inferiores de apoptose (Dia 6 HCTA 41.037 RFUs, CTA 35.338 RFUs, e P188 32.158 RFUs). Adicionalmente, HCTA e CTA demonstraram níveis mais altos de apoptose do que controles de solução salina normais em pontos de tempo mais adiantados (Dia 3: NS 25.987 RFUs contra HCTA 31.076 RFUs, CTA 35.338 RFUs). Estes resultados são compatíveis com morte celular precoce aumentada e toxicidade de enxerto de gordura total com polímero aniônico e catiônico.

[00109] Depois, P188 foi comparado com um copolímero tribloco invertido P31R1. Este polímero é aproximadamente o mesmo tamanho que P188; contudo, é composto de caudas hidrofóbicas e um núcleo hidrofílico (contrário do P188). Quando os níveis de apoptose na gordura P31R1-tratada foram comparados com p188-e controles tratados pela solução salina normail, também se encontrou que P31R1 aumentava eventos apoptóticos nos dias 3, 6, e 9 (Dia 3 34.000 RFUs, Dia 6 44.000 RFUs, e 47.000 RFUs contra NS: 8000 RFUs, 57.000 RFUs, e 11.000 RFUs e P188: 8.000 RFUs, 16.000 RFUs, e 10.000 RFUs, respectivamente). Neste mesmo experimento a fosfatidilcolina (um fosfolipídio tensoativo não iônico e o componente de muitas membranas celulares) foi avaliada para o seu efeito sobre o apoptose. A fosfatidilcolina também demonstrou níveis elevados de apoptose comparado com P188. A fosfatidilcolina não demonstrou aumentos na apoptose comparado com a solução salina normal (Dia PC 3: 52.000 RFUs, Dia 6: 2 9.000 RFUs, ver a figura 8, direito superior). Aciclosporina (CsA), imunossupressora, também foi testado para a atividade apoptótica. CsA também não conseguiu reduzir níveis de apoptose em enxertos de gordura. CsA demonstrou constantemente níveis mais altos da apoptose quando comparado com controles tratados pela solução salina normais nos dias 1 a 9. P31R1 e CsA parecem ser tóxicos aos enxertos de gordura, e o PC pode mostrar algumas reduções da apoptose quando comparado com a solução salina normal mas não quando comparado com P188.

[00110] P188 foi também comparado com o polietileno glicol 8000(PEG 8000) e o copolímero tetrabloco T1107. Nesta série de experimentos, um método mais antigo de ensaio de apoptose foi usado (MitoPt versus Apo-one). O método mais antigo de ensaio de MitoPT libera valores de RFU aproximadamente 10 vezes mais baixos do que Apo-one. P188 novamente demonstrou reduções da apoptose quando comparado com P188 (ver a figura 8, abaixo a esquerda). Quando P188 foi comparado com combinações do polímero de tamanho semelhante e configuração, estes também não conseguiram melhorar também níveis de apoptose. A combinação do P188, F127, e L64 demonstrou níveis mais altos de apoptose quando comparado com P188 sozinho e os controles tratados pela solução salina. Estes achados demonstram a primeira toxicidade com PEG 8000, T1107, e a combinação dopolímero-P188, F127, e L64.

[00111] Adicionalmente, P188 foi estudado com o ácido lipoico e com a vitamina C dos seus efeitos sobre o apoptose. P188 combinado com a vitamina C demonstrou a apoptose aumentado; contudo, a vitamina C sozinha também produziu altos níveis de apoptose (ver a figura 8, abaixo a esquerda). A combinação do P188 e a vitamina C demonstrou a apoptose reduzida quando comparado com a vitamina C sozinha. A combinação do P188 e ácido lipoico demonstrou a apoptose reduzida quando comparado com controles tratados com solução salina (estes experimentos também usaram um marcador de brilho inferior de Mito- PT, ver a figura 9).

Pesos Período Inicial.

[00112] Durante os dez primeiros dias do experimento, os lóbulos de gordura foram estudados para modificações no peso. Notável durante este período foi uma perda de 20 a 25 % no peso através de todos os grupos, imediatamente após implantação. Os estudos produziram uma reabsorção em peso de 23,6 % total durante 24 primeiras horas, com um peso médio de 0,75 g (+/-0,8 g). Depois desta perda no peso no dia 1, nenhuma diferença significativa pode ser identificada, e há pouca variação no peso entre grupos de tratamento durante dez primeiros dias (ver a figura 10).

P188.

[00113] O P188 quando comparado com a solução salina normal demonstrou uma melhora estatisticamente significativa no peso em seis semanas. Em seis semanas com 65 lóbulos analisados por grupo, o enxerto o tratado com P188 demonstrou um peso médio de 0,70 g comparado com enxertos tratados pela solução salina normais 0,64 g com desvios padrão de 0,08 g e 0,12 g, respectivamente (ver a figura 11). Também quando as percentagens de reabsorção foram comparadas com os pesos de enxerto desidratados no fim do primeiro período a mostra P188 demonstrou uma redução de 50% da reabsorção quando comparado com controles (ver a figura 12).

Outros Polímeros Plurônicos.

[00114] Quando comparado com outros plurônicos, os pesos em seis semanas foram como se segue: F127, 0,74 +/-0,07 g; L64, 0,68 +/-0,06 g; F38, 0,61 +/-0,22 g; F108, 0,76 +/-0,10 g; T1107, 0,62 +/-0,15 g; P31R1, 0,74 +/-0,05 g; Dibloco, 0,44 +/-0,16 g; Tween 80, 0,30 +/-0,12 g. As percentagens de reabsorção são mostradas na figura 13.

Polietileno Glicóis.

[00115] O P188 demonstrou melhoras estatisticamente significativas no peso quando comparado com PEG 600, PEG 3350, PEG 8000, e PEG 600+3350. Amostras tratadas com PEG 600 pesadas em seis semanas na média 0,64 +/-0,11 g (a solução salina normal foi 0,64 +/0,12 g), PEG 3350 pesaram 0,58 +/-0,21 g, PEG 8000 0,53 +/-0,06 g, e a mistura de PEG 600 + 3350 pesou 0,58 +/-0,22 g. As percentagens de reabsorção são mostradas na figura 13.

Ácido Lipoico.

[00116] Os pesos de dez dias médios neste estudo foram a solução salina normal 0,76g +/-0,09 g; P188 0,76g +/-0,09 g; e ácido lipoico 0,72g +/-0,09g (1,0g +/-0,10 g implante inicial). Os grupos de tratamento então foram reexaminados em 6 semanas; as diferenças aqui significantes foram observadas nos pesos. Os pesos médios por grupo em seis semanas foram a solução salina normal 0,58 +/-0,07 g; P188 0,71 +/-0,06 g; ácido lipoico 0,65 +/-0,09 g; e P188+LA 0,61 +/-0,16g. Na comparação inicial com as últimas modificações, as percentagens de reabsorção foram calculadas usando o peso desidratado das amostras sobre os dez primeiros dias, até ao peso final de seis semanas. P188 e o ácido lipoico demonstraram diferenças estatisticamente significativos na reabsorção (p-valor <0.05), comparando com a solução salina (ver a figura 19).

Aditivos Diversos.

[00117] Quando outros agentes foram testados para efeitos adicionais potenciais com P188, os pesos em seis semanas foram como se segue: resveratrol, 0,73 +/-0,03 g; colesterol, 0,73 +/-0,04 g; inulina, 0,47 +/-0,21 g; oligofrutossacarídeo, 0,72 +/-0,0 8g (neste grupo de experimentos, solução salina executada bem com um peso médio de 0,74 +/-0,04 g). Estes agentes não conseguiram executar melhor do que se encontrou com controles de solução salina no experimento e pela histologia (veja abaixo) eram na maior parte tóxicos.

Viabilidade Celular.

[00118] As amostras colhidas em seis semanas foram analisadas com Cell-Titer Blue, que é uma tintura azul que é concentrada e convertida em uma tintura que fluoresce em vermelho vivo, em células metabolicamente ativas. A conversão da tintura demonstra a atividade metabólica e relacionado ao número de células em uma amostra. Quando P188 foi comparado com outros plurônicos do comprimento de cadeia variado após seis semanas, ele demonstrou um aumento estatisticamente significativo no sinal (ver a figura 14). P188 manifestouse 12.971 +/-2785 RFUs, enquanto que os controles de solução salina normais se manifestaram 4727 +/-768 RFUs, O polímero restante foi como se segue: F127, 4301 +/-2785 RFUs; F108, 3529 +/-373 RFUs; F38, 3188 +/-346 RFUs; L64, 6137 +/-1933 RFUs; T1107, 5063 +/-1496 RFUs; Tween 80, 4346 +/-1231 RFUs. Um copolímero dibloco (éter metílico de policaprolactona bloco polietileno glicol) e tribloco plurônico invertido (P31R1) também foram analisados. Este polímero foi também inferior a P188: dibloco, 1.666 +/-1283 RFUs; P31R1, 1453 +/-703 RFUs.

[00119] P188 foi também comparado com vários polietileno glicóisclassificado (PEG), que foram mostrados proteger condrócitos em outros estudos, para a viabilidade celular no modelo. Em seis semanas, P188 novamente demonstrou a viabilidade celular superior (ver a figura 15). PEGs demonstrou os seguintes sinais de viabilidade celular: PEG 600, 2892 +/-1110 RFUs; PEG 3350, 1109 +/-301 RFUs; PEG600+3350, 1291 +/-289 RFUs (ver a figura 15).

Teor de DNA.

[00120] As amostras explantadas foram analisadas para o teor de DNA, como uma medida indireta da contagem celular. As amostras digeridas foram estudadas tanto nos primeiros como em últimos pontos de tempo. Como as medições de peso, não houve nenhuma diferença significativa no teor de DNA entre as amostras durante 10 primeiros dias.

P188 contra Controles de Solução Salina.

[00121] Quando P188 foi comparado com controles de solução salina do teor de DNA em seis semanas os resultados foram como se segue: controles de solução salina, 0,129 +/-0,052 μg DNA; P188, 0,320 +/-0,060 μg DNA. Estes resultados foram estatisticamente significativos com um teste t de Student P=0,03.

Plurônicos.

[00122] Quando P188 foi então comparado com outros plurônicos, uma diferença estatisticamente significativa entre P188 e outro polímero foi observada (análise de ANOVA p=0.0004, Fcritical=2.299). O teor de DNA foi como se segue: F127, 0.236 +/-0.043 μg DNA; F108, 0.082 +/0.033 μg DNA; F38, 0.025 +/-0.007 μg DNA; L64, 0.168 +/-0.062 mcg DNA; T1107, 0.124 +/-0.048 μg DNA; Tween 80, 0.134 +/-0.023 μg DNA.

PEGs.

[00123] Quando PEGs foi examinado sobre o teor de DNA, PEG 8000 manifestou-se 0.280 +/-0.024 μg DNA. PEG 600, PEG 3350, e PEG 600 + 3350 também foi examinado.

Histologia.

[00124] Os lóbulos de gordura explantados foram fixados e corados com H&E para marcar da arquitetura adiposa. Uma melhora estatisticamente significativa no teor de gordura normal foi observada em amostras P188-tratadas em comparação com controles tratados pela solução salina. P188 quando marcado para infiltração graxa, inflamatória normal, e fibrose marcou: gordura normal de 58%, infiltração de 30%, e fibrose de 13% em média (10 lóbulos, 2 lâminas por lóbulo). Os controles de solução salina normais marcaram: gordura normal de 41%, infiltração de 38%, e fibrose de 21% em média (10 lóbulos, 2 lâminas por lóbulo). P=0.04 quando um t-teste de estudantes foi executado.

Outros Plurônicos.

[00125] Outros poloxâmeros, L64 e F127 marcaram o melhor: L64, gordura normal de 65%, infiltração de 31%, e fibrose de 4%; F127, gordura normal de 52%, infiltração de 38%, e fibrose de 10%. Estas diferenças não conseguiram a significância estatística quando comparado com P188. Os poloxâmeros restantes marcados como se segue: F38, gordura normal de 45%, infiltração de 44%, fibrose de 11%; F108, gordura normal de 50%, infiltração de 42%, fibrose de 7%; T1107, gordura normal de 15%, infiltração de 41%, fibrose de 43%; Tween 80, gordura normal de 17%, infiltração de 67%, fibrose de 16% (ver a figura 18, direito).

Polietileno Glicóis.

[00126] Os enxertos de gordura tratados com PEG demonstraram altos níveis de infiltrações inflamatórias e interrompeu a arquitetura adiposa. PEG 8000 marcado: gordura normal de 42%, infiltração de 45%, fibrose de 14%.

Ácido Lipoico.

[00127] P188 mais o ácido lipoico (PLA) também foi examinado emarcado. PLA marcou: gordura normal de 90%, infiltração de 9%, fibrose de 1% (n=2).

Aditivos Diversos.

[00128] Todos os aditivos restantes examinaram a toxicidade demonstrada com fibrose pesada e infiltrações inflamatórias.

Discussão.

[00129] P188, copolímero tribloco com um polioxipropileno centralregião hidrofóbica (unidade de POP, vêem a figura 1) estendendo duas longas caudas hidrofílicas de polioxietileno (unidades de POE). Acredita-se que os traumas mecânicos e estresse isquêmico resultam em um esgotamento do adipócito normal membrana celular. Este esgotamento é primeiro manifestado como um aumento na porosidade e resulta na perda do gradiente iônico de membrana normal. A perda da integridade elétrica de membrana é um ativador potente conhecido da cascata apoptótica. As células que sofrem a morte celular programada permanecem no enxerto como uma coleta de gotículas de lipídio. Estas gotículas então são depois reabsortas conduzindo para enxertar a perda de volume. Os copolímeros triblocos têm a capacidade de se introduzir em membranas de adipócito traumatizadas, levando em conta a estabilização da membrana. Adicionalmente, conhece-se que copolímeros triblocos reduzem a viscosidade da membrana com os seus caudas de POE hidratados. Reduzindo viscosidade celular, eles permitem as células traumatizadas se tornem mais solúveis assim, reduzindo a tensão na membrana ferida.

[00130] Mostrou-se que P188 é pobremente solúvel na gordura animal e não é absorto bem para membranas intactas, incólumes. P188 permite adipócitos que sofreram o dano absoluto mecânico do processo durante a colheita para manter a sua mecânica de membrana normal. Uma vez que estas células são capazes de consertar as suas membranas, aumentando a quantidade de fosfolipídios na bicamada, P188 é mecanicamente expulso [Agarwal, J., A. Walsh, e R.C. Lee, Multimodal strategies for resuscitating injured cells. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1066:295-309]. A extrusão do P188 é causada pelo aumento na pressão de superfície de transmembrana. Também, deve observar-se que, parece que P188 então é excretado essencialmente inalterado pelos rins, com uma pouca quantidade excretada através do sistema entérico biliar. P188 nestas doses que acredita-se não há nenhuma evidência de um efeito adverso ou preocupações de segurança com ouso em seres humanos [Singh-Joy, S.D. e V.C. McLain, Safetyassessment of poloxamers de 101 anos, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282,284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics. Int. J. Toxicol., 2008. 27 Suppl 2:93-128].

[00131] Adicionalmente, em análises de toxicologia preformadas para avaliar a segurança P188, as doses de até 50 mg/kg foram administradas IV a cães e os seus órgãos foram analisados para P188 [Singh-Joy, S.D. e V.C. McLain, Safety assessment of poloxamers de 101 anos, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics. Int J Toxicol, 2008. 27 Suppl 2:93128]. Nestes experimentos, parece que P188 não é solúvel no tecido adiposo e quasenão marcado P188 foi observado no tecido adiposo. Isto adicionalmente suporta o mecanismo proposto da ação, pelo qual, P188 é absorto para a membrana de adipócito ferida sem entrar em adipócitos. Além disso, há estudos numerosos que demonstram que P188 é expulso de membranas celulares uma vez aqueles auto selo de membranas celulares e os aumentos de pressão superficiais [Wu et al., Interaction between lipid monolayers and poloxamer 188: an X-ray reflectivity and diffraction study. Biophys J, 2005. 89 (5):3159-73; Zhang, Z., M. al-Rubeai, e C.R. Thomas, Effect of Pluronic F-68 on the mechanical properties of mammalian cells. Enzyme Microb Technol, 1992. 14 (12):980-3; Maskarinec et al., Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J, 2002. 82 (3):1453-9; Agarwal, J., A. Walsh, e R.C. Lee, Multimodal strategies for resuscitating injured cells. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1066:295-309; cada um do qual é incorporado aqui pela referência].

[00132] Esta capacidade de evitar a perda de íon e impedir células danificadas de progredir com a apoptose permite que os adipócitos possam conservar a sua capacidade de atuar como um preenchedor de tecido macio. Sem a estabilização da membrana celular, estas células vazam íons e por fim morrem [Hannig et al., Surfactant sealing of membranes permeabilized by ionizing radiation. Radiat Res, 2000. 154 (2):171-7; Serbest et al., Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma. FASEB J, 2006. 20 (2):308- 10; Mina et al., Poloxamer 188 copolymer membrane sealant rescues toxicity of amyloid oligomers in vitro. J Mol Biol, 2009. 391 (3):577-85; cada um do qual é incorporado aqui pela referência]. Consequentemente, os enxertos de gordura são reabsorvidos por taxas imprevisíveis. Esta imprevisibilidade inerente ao enxerto de gordura livre reduz a utilidade de enxertos de gordura de reconstrução de tecido macio e aumento [Coleman, Structural fat grafts: the ideal filler? Clin Plast Surg, 2001. 28 (1):111-9; Gutowski, Current applications and safety of autologous fat grafts: a report of the ASPS fat graft task force. Plast Reconstr Surg, 2009. 124 (1):272-80; cada um do qual éincorporado aqui pela referência].

[00133] Os enxertos de gordura tratados com P188 aparecem como gordura não transplantada normal quando comparados com outros grupos de enxerto de gordura. Isto é mais bem evidenciado pela histologia em seis semanas onde o tecido adiposo P188-tratado parece gordura nativa mais parecida (além da demonstração de alta viabilidade celular por Cell-Titer Blue e tiazolil brometo de tetrazóleo azul (MTT)). O tecido adiposo tratado pela solução salina parece ferido como evidenciado por grandes quantidades da fibrose. PEGs (um componente do P188 e mostrado eficaz por outros para proteger certos tipos celular) e copolímeros tetrablocos (semelhante a P188 com uma cauda hidrofílica extra) levam a uma infiltração inflamatória com alto para moderar níveis da fibrose.

[00134] A capacidade de conservar mecanicamente células de gordura durante o período de peritransplante resulta em enxertos de gordura que parecem pela análise histológica e bioquímica como gordura normal. Gordura não tratada Controle enxerta,de outro lado, torna-se fibrótica e solta a sua arquitetura adiposa normal (ver a figura 17). Em estudos semelhantes executados com neurônios, demonstrouse que após as células são prejudicadas mecanicamente; as células P188-tratadas comportaram-se mais como neurônios incólumes [Marks et al., Amphiphilic, tri-block copolymers provide potent membrane- targeted neuroprotection. FASEB J, 2001. 15 (6):1107-9; Serbest, G., J. Horwitz, e K. Barbee, The effect of poloxamer-188 on neuronal cell recovery from mechanical injury. J Neurotrauma, 2005. 22 (1):119-32; cada um dos quais é incorporado aqui pela referência]. Essencialmente, a estabilização de membrana mecânica resultou na preservação da sinalização neuronial função axônio mas não resultaram em modificações fisiológicas à função normal da célula.

[00135] Como evidenciado pelos dados os enxertos de gordura tratados com P188 conservam mais do seu peso inicial, função celular (como avaliado por atividade metabólica, níveis de ATP, etc)., e arquitetura normal do que células lavadas da solução salina. Isto demonstra a preservação de células durante o transplante, permitindo- lhes funcionar como adipócitos normais em uma nova posição. Especificamente P188 quando comparado com controles tratados pela solução salina normais demonstra um aumento estatisticamente significativo no peso em seis semanas, que, está em correlação a uma redução de 50 % da reabsorção (n=170, P=0.03). Adicionalmente P188 demonstra uma redução estatisticamente significativa em eventos apoptóticos durante dez primeiros dias, um aumento significante na viabilidade celular em seis semanas, um aumento significante no teor de DNA em seis semanas, e aumentos estatisticamente significativos na gordura normal pela histologia em seis semanas.

[00136] Quando P188 é comparado com outros plurônicos, também demonstra resultados superiores. Dois outros polímeros investigados neste estudo desempenharam semelhantes ao P188, mas em geral permaneceram inferiores ao P188. Este polímero foi L64 e F127. L64 é um líquido na temperatura ambiente com um peso molecular de 2900 kDa que é PEG de 40% e POE de 60%. F127 é P407, de tal modo que F127 é 12600 kDa com o teor de PEG de 70%. Estes dois agentes demonstraram perfis de reabsorção similares a P188 (ver a figura 13), junto com a viabilidade celular melhorada (L64 contra a solução salina, vêem que a figura 14, F127 tendeu a solução salina mais alta mas em média foi semelhante para controlar) que não foi estatisticamente significativo quando comparado com a solução salina controla. Adicionalmente L64 e F127 demonstraram alguma melhora no teor de DNA quando comparado com controles de solução salina (se aproximou mas não significante pelo n-valor atual) mas permaneceu inferior a amostras tratadas do P188 (ver a figura 16). Estes agentes quando examinado histologicamente, marcados para a presença da gordura normal, fibrose, e infiltração, aproximaram o desempenho P188. Contudo, desde que a viabilidade celular inferior demonstrada e DNA inferior contentam estes enxertos permaneceu inferior a P188. Estes enxertos têm uma conta celular de adipócito inferior total embora eles sejam relativamente sãos pela histologia e tenham pesos semelhantes a P188.

[00137] Este polímero demonstra a faixa de variação de tamanho e o efeito de copolímeros triblocos diferentes em propriedades de vedação de membrana. L64 é menor (2900 kDa) e mais hidrofóbico; F127 é maior (~13,000 kDa) e mais hidrofílico. P188 está no meio destes dois agentes com um peso ~8000 kDa e teor de PEG de 80%. Assim ele tem caudas hidrofílicas mais longas do que F127 e uma região hidrofóbica ligeiramente mais curta. L64 é uma molécula mais leve com cadeias de PEG mais curtas. A região hidrofóbica é crítica para atividade de selante de membrana na região hidrofóbica exposta no poro de membrana. Contudo, é provável que uma vez que a molécula seja posicionada no poro exposto que as cadeias hidrofílicas fornecem a proteção adicional. Esta ajuda de cadeias na redução de tensão de membrana aumentando solubilidade superficial (ver a figura 2).

[00138] Quando P188 foi comparado com poloxâmeros F38 e F108 (P98 e P308) estes agentes demonstraram a maior reabsorção, a viabilidade celular reduzida, e reduziram o teor de DNA. Enquanto ambos estes agentes são PEG de 80%, os seus tamanhos são muito diferentes. F38 é metade do peso do P188 mantendo o mesmo teor de PEG. Isto mantém a razão da hidrofobicidade à hidrofilicidade, de tal modo que F38 é menor mas tem o mesmo PEG teor (hidrofílico) que P188. F108 é ~15,000 kDa e é, por isso, maior mas também tem a mesma composição hidrofílica. Assim ambas as alterações em membrana de efeito de comprimento de cadeia selante em adipócitos. Pela histologia tanto estes agentes induziram níveis mais altos contra danos do que P188 como controles de solução salina. O aumento no comprimento de cadeia pode levar à maior solubilização da membrana que enfim causa um efeito detergente (lise de membrana celular) com F108 enquanto F38 é provavelmente demasiado pequeno. Embora L64 seja até menor, o seu teor hidrofóbico aumentado provavelmente permite-o para agregar-se em poros abertos.

[00139] Este efeito de lise de membrana visto em poloxâmeroscontentes hidrofílicos mais altos traduz aos resultados vistos com enxertos de gordura tratados com PEGs puro. PEG 600, 3350, e 8000 foi testado. Estes PEGs representam um faixa de variação de pesos de PEG (por exemplo, PEG 600 = 600 polietileno glicol kDa). Em estudos prévios, mostrou-se que misturas de PEG 600 e 3350 conservavam condrócitos congelados. A Publicação do Pedido de Patente US 2009/0017438 de Nos estudos os adipócitos parecem mais suscetíveis de efeitos detergentes do que condrócitos. Todo o PEG - tratou grupos (e as combinações do PEGs) demonstrou resultados inferiores quando comparado com P188 e solução salina normal controla. PEG 3350 e PEG 8000 demonstraram a reabsorção mais alta do que os controles tratados com solução salina (ver a figura 13) e a viabilidade celular reduzida (ver a figura 15). Adicionalmente pela histologia esta amostra demonstrou infiltrações pesadas e interrompeu a arquitetura adiposa. PEG 600 foi o menos tóxico. Ele demonstrou a reabsorção semelhante em peso a controles de solução salina e a viabilidade celular semelhante (ver as figura s 13 e 15). Consequentemente PEG 600 é provavelmente demasiado pequeno para ter efeitos tóxicos nas doses descritas na proteção de condrócito. O maior PEG 3350 e PEG 8000 necessitam de uma região hidrofóbica como os copolímeros triblocos e provavelmente solubilizam célula membrana resultar em lise celular.

[00140] Quando outros copolímeros foram analisados, copolímeros diblocos, copolímeros triblocos invertidos (por exemplo, P31R1), e copolímeros tetrablocos (por exemplo, T1107), estes também demonstraram a toxicidade celular (dibloco, tribloco invertido) ou nenhum efeito (tetrabloco). O copolímero tribloco invertido P31R1 (3.300 kDa) tem um bloco hidrofílico central e duas caudas hidrofóbicos flanqueadas. Quando comparado com P188 e solução salina normal ele induz a apoptose em todas as partes da maior parte do período de peritransplante (ver a figura 8, direito superior). Adicionalmente, ele demonstrou o sinal mais baixo vivo (1454 RFUs contra 4.000 RFUs no controle de solução salina) e histologia inferior apesar de possuindo uma reabsorção relativamente baixa em peso (ver a figura 13). O peso elevado quando analisado pela histologia representou fibrose e infiltrações inflamatórias com um pouquinho da gordura normal. Assim a configuração do polímero é importante para as suas propriedades de selante de membrana. Os copolímeros diblocos têm a mesma configuração que sabões; cabeças hidrofílicas com caudas hidrofóbicos. Estes parecem atuar como detergentes e tinham entre os níveis de reabsorção mais altos em peso. O Tween 80 não plurônico não iônico também tinha resultados semelhantes (ver a figura 13). Tween 80 resultou nos mais altos níveis contra danos pela avaliação histológica e foi claramente tóxico a enxertos de gordura (ver a figura 18B). O copolímero tetrabloco T1107 tem quatro cadeias de PEG ligadas a quatro cadeias de POE de uma maneira radial (como os raios de uma roda). Este polímero não executou melhor do que controles de solução salina em peso, teor de DNA, e viabilidade celular. Contudo, quando T1107 é marcado pela histologia, há gordura normal mínima. Assim a viabilidade relativamente normal que aparece e o teor de DNA não refletem nada mais do que células inflamatórias que substituem gordura normal dentro do enxerto. A fosfatidilcolina de zwitteriônico foi usada clinicamente um agente de lise graxo na lipoaspiração. Na nossa análise de dez dias, na mesma concentração que P188, parece ter algum efeito protetor, mas não à mesma magnitude que P188 (ver a figura 8, direito superior).

[00141] Como L64 e F127 pareceram ter algum efeito protetor, eles foram misturados com P188 e analisados no primeiro modelo de apoptose. Pensou-se possivelmente que as combinações do polímero eficaz teriam um efeito de sinergístico sobre enxertos de gordura. Este não foi o caso, quando combinado esta mistura do polímero parece tóxica. Os altos níveis da apoptose foram observados em todas as partes do período de amostragem de dez dias (ver a figura 8, direito de fundo). Assim a mistura do polímero foi excluída do estudo adicional.

[00142] Os aditivos a P188 também foram investigados. Os frutanos são oligossacarídeos de derivado da planta que foram mostrados proteger membranas celulares de planta de grandes variações de temperatura. Nos estudos contudo estes agentes induziram grandes quantidades contra danos de adipócito (pela histologia) e os altos níveis da reabsorção em peso. A Vitamina C (ácido ascórbico) também demonstrou a toxicidade celular através de um espectro de doses. De maneira interessante, no modelo P188 de dez dias parece fornecer um pouco de proteção à vitamina C tratou células (ver o direito de fundo de figura 6). As reduções da apoptose entre a vitamina C trataram amostras e a vitamina C mais P188 são observados no dia 6.

[00143] O ácido lipoico por fim também foi testado como um aditivo a P188. Quando o ácido lipoico é acrescentado, parece haver um efeito de sinergístico sobre a redução da apoptose (ver a figura 7). A combinação resultou em menos eventos apoptóticos no dia 6 do que P188 sozinho. O ácido lipoico é um antioxidante potente, e tem efeitos protetores mitocondriais estresse sob oxidativo (dano de reaspersão da isquemia). Como observado pela microscopia por varredura de elétrons a mitocôndria de adipócito põe-se na proximidade imediata com poros de membrana de adipócito (ver a figura 3). Assim como a membrana é estabilizada por P188, o ácido lipoico fornece a proteção adicional à mitocôndria ferida. A mistura também resultada reabsorção significativamente melhorada em peso e teor de DNA melhorado em seis semanas.

Conclusão.

[00144] Neste Exemplo, examinaram-se os efeitos da proteção de membrana baseada no polímero no enxerto de gordura. Testou-se um faixa de variação de tamanhos de poloxâmero (~2500 kDa a ~14,000 kDa), um faixa de variação da hidrofobicidade (PEG de 40% a PEG de 80%), vários outros copolímeros (dibloco, tribloco, invertido tribloco, e tetrabloco), aniônico, catiônico, e polímero de zwitteriônico, mais PEGs sozinho, na combinação, e vários aditivos. Tanto no primeiro ponto final como em último ponto final, P188 demonstrou reduções superiores do apoptose, melhorou a reabsorção em peso, aumentou o teor de DNA, e melhorou a arquitetura celular quando comparado com todos outros grupos e controles tratados pela solução salina.

[00145] Parece que o tamanho do P188 é um fator importante; F38 (menor) e F108 (maior) não funcionam também. A hidrofobicidade aumentada ajuda poloxâmeros menores (L64) e em maior ligeiramente menos poloxâmeros hidrofílicos (F127); contudo, P188 ainda permanece superior. Também a estrutura e a ordem são críticas, inverteu o copolímero tribloco P31R1 e copolímero dibloco PEG - policaprolactona) são também tóxicos a enxertos. Adicionalmente, o copolímero tetrabloco T1107 parece resultar em toxicidade e infiltrações inflamatórias pesadas.

[00146] Quando o polímero é todo hidrofílico e grande (PEG 3350, PEG 8000) eles são tóxicos ao enxertos de gordura. PEG pequeno (PEG 600) não é melhor do que a solução salina. Tensoativos não em bloco não iônicos (Tween 80) também são tóxicos à gordura. A alta hidrofilicidade vista nos PEGs provavelmente causa a lise da membrana por um efeito detergente. Tween 80 tem uma cauda hidrofóbica longa e uma cabeça hidrofílica menor. Esta molécula também provavelmente atua como um detergente clássico e lisa a membrana celular.

[00147] Os diversos aditivos foram todos tóxicos ou não tinham nenhum efeito, exceto o ácido lipoico. Encontrou-se que frutanos, resveratrol, colesterol, e a vitamina C eram tóxicos neste estudo. De maneira interessante, P188 parece fornecer um pouco de proteção ao dano induzido pela vitamina C. Adicionalmente, o ácido lipoico parece fornecer um efeito sinergístico potencial quando usado em combinação com P188. Assim pareceria que proteção mitocondrial adicional quando podem ser úteis em enxertos de gordura tratados com P188.

[00148] Este estudo demonstra a eficácia do P188 na vedação de dano de membrana de adipócito. As moléculas que variam demasiado no tamanho não parecem trabalhar a menos que a sua hidrofobicidade seja aumentada; contudo, o tamanho continua sendo importante já que estas moléculas não trabalham bem com o P188, e na combinação são provavelmente tóxicas. O ácido lipoico, que trabalha sob um mecanismo completamente diferente, pode ter efeito de sinergístico quando combinado com P188.

Equivalentes e Alcance.

[00149] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de apurar usando a experimentação não mais do que regular, muitos dos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. O alcance da presente invenção não está destinado a ser limitado à descrição acima, mas sim tal como está enunciado nas reivindicações anexadas.

[00150] Os artigos das reivindicações, tais como "um", "uma," e "o" podem significar um ou mais de um a menos que seja indicado ao contrário ou de outra maneira evidente do contexto. As reivindicações ou as descrições que incluem o "ou" entre um ou mais membros de um grupo consideram-se satisfeitas se um, mais de um, ou todos dos membros de grupo estiver presente em, empregado em, ou de outra maneira relevante para um produto dado ou processo a menos que seja indicado ao contrário ou de outra maneira evidente do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente em, empregado em, ou de outra maneira relevante para um produto dado ou processo. A invenção também inclui modalidades nas quais mais de um, ou todos dos membros de grupo estão presente em, empregado em, ou de outra maneira relevante para um produto dado ou processo. Além disso, deve entender-se que a invenção abrange todas as variações, combinações, e permutações nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, os termos descritivos, etc., de uma ou mais das reivindicações ou de porções relevantes da descrição são introduzidos em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que é dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que é dependente da mesma reivindicação baseada. Além disso, onde as reivindicações recitam uma composição, deve entender-se que os métodos de usar a composição com algum dos objetivos divulgados aqui estão incluídos, e métodos de fazer a composição de acordo com qualquer dos métodos de fazer divulgado aqui ou outros métodos conhecidos na técnica estão incluídos, a menos que de outra maneira seja indicado ou a menos que fosse evidente para uma pessoa normalmente versada na técnica que uma contradição ou uma inconsistência surgiriam. Por exemplo, deve entender-se que alguma das composições da invenção podem ser usadas para reparo ou aumento de tecido macio. Também deve entender-se que alguma das composições feitas de acordo com os métodos para preparar composições aqui divulgadas podem ser usadas para reparo ou aumento de tecido macio. Além disso, a invenção abrange composições feitas de acordo com algum dos métodos para preparar composições aqui divulgadas.

[00151] Onde os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato de grupo Markush, deve entender-se que cada subgrupo dos elementos também é divulgado, e qualquer elemento pode ser removido do grupo. Também se observa que o termo "compreendendo" é destinado para estar aberto e permite a inclusão de elementos adicionais ou etapas. Deve entender-se que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, são mencionados compreendendo determinados elementos, as características, as etapas, etc., certas modalidades da invenção ou os aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em, tais elementos, características, etapas, etc. Com objetivos da simplicidade aquelas modalidades não foram in haec verba especificamente enunciadas aqui. Assim para cada modalidade da invenção compreendendo um ou mais elementos, características, etapas, etc., a invenção também fornece modalidades que consistem ou consistem essencialmente daqueles elementos, características, etapas, etc.

[00152] Onde as faixas de variação são dadas, o ponto final está incluído. Além disso, deve entender-se que a menos que de outra maneira seja indicado ou de outra maneira evidente do contexto e/ou a compreensão de um dos normalmente versados na técnica, os valores que são expressos como faixas de variação podem assumir qualquer valor específico dentro das faixas de variação determinadas em modalidades diferentes da invenção, a um décimo da unidade do limite inferior do faixa de variação, a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Também deve entender-se que a menos que de outra maneira seja indicado ou de outra maneira evidente do contexto e/ou a compreensão de um dos normalmente versados na técnica, os valores expressos como os faixas de variação podem assumir qualquer subfaixa de variação dentro do faixa de variação dada, em que o ponto final do subfaixa de variação é expresso no mesmo grau da exatidão que um décimo da unidade do limite inferior do faixa de variação.

[00153] Além disso, deve entender-se que qualquer determinada modalidade da presente invenção pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Qualquer modalidade, elemento, característica, aplicação, ou aspecto das composições e/ou métodos da invenção, pode ser excluído de qualquer uma ou mais reivindicações. Com objetivos da brevidade, todas das modalidades nas quais um ou mais elementos, características, objetivos, ou aspectos são excluídos não são enunciadas explicitamente aqui.

Claims (19)

1. Composição para uso em transplante de adipócitos, caracterizada pelo fato de que compreende adipócitos e um copolímero tribloco não iônico, em que o copolímero compreende um núcleo hidrofóbico central de polioxipropileno, ladeado por duas cadeias hidrofílicas de polietileno glicol em cada lado e uma quantidade de copolímero suficiente para proteger os adipócitos de danos e prevenir a morte do adipócito, em que o copolímero está presente em uma concentração de 10 mg a 20 mg de copolímero por 1 mL de adipócitos.

2. Composição para uso na prevenção da reabsorção de um enxerto de gordura de tecido adiposo em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que compreende adipócitos e um copolímero tribloco, em que o copolímero compreende um núcleo hidrofóbico central de polioxipropileno, ladeado por duas cadeias hidrofílicas de polietileno glicol em cada lado, e o copolímero está presente em uma concentração de 10 mg a 20 mg de copolímero por 1 mL de adipócitos.

3. Composição para uso para selar as membranas celulares de adipócitos, caracterizada pelo fato de que compreende os adipócitos e uma quantidade de copolímero tribloco suficiente para selar as membranas dos adipócitos, em que o copolímero compreende um núcleo hidrofóbico central de polioxipropileno, ladeado por duas cadeias hidrofílicas de polietileno glicol em cada lado, e o copolímero está presente em uma concentração de 10 mg a 20 mg de copolímero por 1 mL de adipócitos.

4. Composição para uso para aumentar a viabilidade de adipócitos, caracterizada pelo fato de que os adipócitos e o copolímero tribloco não iônico compreendem os adipócitos e uma quantidade eficaz de copolímero tribloco para aumentar a viabilidade dos adipócitos, em que o copolímero compreende um núcleo hidrofóbico central de polioxipropileno, ladeado por duas cadeias hidrofílicas de polietileno glicol em cada lado, e o copolímero está presente em uma concentração de 10 mg a 20 mg de copolímero por 1 mL de adipócitos.

5. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o copolímero sela as membranas dos adipócitos, e/ou estabiliza as membranas dos adipócitos.

6. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os adipócitos são parte do tecido adiposo.

7. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que os adipócitos são células autólogas.

8. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o copolímero é POLOXAMER P188, POLOXAMER P108, POLOXAMER P184, POLOXAMER P407, ou POLOXAMER P408.

9. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o peso molecular do copolímero varia de 1.000 g/mol a 10.000 g/mol.

10. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição de adipócitos e copolímero ainda compreende ácido lipóico.

11. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o copolímero é pelo menos 95% puro.

12. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o copolímero é POLOXAMER P188.

13. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o copolímero está presente em uma concentração de 5 mg a 15 mg de copolímero por mL de adipócitos.

14. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o copolímero é pelo menos 98% puro.

15. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um mamífero, opcionalmente um humano.

16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende adipócitos e um copolímero que compreende um núcleo hidrofóbico central de polioxipropileno, ladeado por duas cadeias hidrofílicas de polietileno glicol em cada lado, em que o copolímero está presente em uma concentração de 10 mg a 20 mg de copolímero por 1 mL de adipócitos.

17. Composição para uso, ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que o peso molecular do copolímero varia de 2.000 g/mol a 10.000 g/mol, ou de 3.000 g/mol a 10.000 g/mol, ou de 5.000 g/mol a 10.000 g/mol.

18. Composição para uso, ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a composição compreende de 15 mg a 20 mg de copolímero por mL de adipócitos, ou 10 mg a 15 mg de copolímero por mL de adipócitos, ou 15 mg de copolímero por mL de adipócitos, ou 10 mg de copolímero por mL de adipócitos.

19. Composição para uso, ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o copolímero é pelo menos 99% puro.