BRPI0921147B1 - métodos para a detecção de espécies de rna alvo pouco abundante em uma amostra biológica, e para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra biológica - Google Patents

Abstract

métodos para a detecção de espécies de rna alvo pouco abundante em uma amostra biológica, e para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra biológica, e, kit a presente invenção refere-se a um método e um kit para a detecção de espécie de rna pouco abundante em uma amostra biológica e a um método e um kit para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra biológica.

Description

“MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE ESPÉCIES DE RNA ALVO POUCO ABUNDANTE EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, E PARA A DETECÇÃO DE UMA CONTAMINAÇÃO COM MICOPLASMA EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método e um kit para a detecção de espécies de RNA pouco abundante em uma amostra biológica e a um método e um kit para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra biológica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Entre os métodos mais difundidos e bem sucedidos para a detecção e análise de moléculas de RNA estão as assim chamadas RT/PCR (transcrição reversa/reação em cadeia da polimerase). Neste método, as moléculas de RNA são transcritas em moléculas de cDNA por uma transcriptase reversa (RT) e então são detectadas e/ou analisadas por métodos baseados em PCR.

Os primeiros investigadores neste campo têm usado tanto RT de vírus de mieloblastose aviária ou RT de vírus da leucemia de murinos Moloney para a transcrição reversa. No entanto, um problema significante no uso de RNA como um gabarito para a síntese de cDNA foi a incapacidade destes RTs virais mesofílicos para sintetizar cDNA através de estruturas secundárias do RNA estável. Para contornar esse problema, a transcrição reversa pode ser realizada em temperaturas de reação aumentadas que podem resolver estruturas do RNA secundárias e, adicionalmente, aumentar a especificidade de extensão do iniciador. Isso requer o uso de enzimas termoestáveis para a transcrição reversa, como a DNA polimerase de Thermus thermophilus (Tth pol), que é ativa a uma temperatura ótima de 70oC.

No entanto, o uso de enzimas termoestáveis para a transcrição reversa também gera novos problemas. Em particular, ao tentar detectar e/ou analisar espécies de RNA pouco abundante de em uma amostra biológica, a enzima termoestável para a transcrição reversa pode catalisar a geração de produtos de reação não específicos durante as etapas subsequentes de RT/PCR. Este é especialmente o caso em amostras que têm um fundo grande de RNA total, e resulta em um aumento substancial do limite de detecção do RNA alvo para níveis muito acima do que pode ser necessário, por exemplo, no controle de qualidade de produtos biofarmacêuticos. Para contornar esse problema, todas as etapas de manipulação e de RT/PCR subsequentes à transcrição reversa devem ser realizadas em temperaturas elevadas e em condições de partida a quente HotStart. Isto, no entanto, é muitas vezes impraticável e desvantajoso, especialmente quando se trabalha em escalas industriais.

Uma aplicação na qual a detecção sensível de espécies de RNA pouco abundante, com frequência em um grande fundo de RNA total, é de particular relevância é a detecção de uma contaminação por micoplasma em uma amostra biológica.

Os micoplasmas são microrganismos bacterianos com um dos menores genomas conhecidos capazes de se auto-replicar. Enquanto a maioria dos micoplasmas são comensais naturalmente inofensivos, alguns deles são capazes de infectar seus hospedeiros naturais e causar doenças de gravidade variável. Micoplasmas, particularmente espécies dos gêneros Mycoplasma e Acholeplasma, também são causas frequentes de contaminação de linhagens celulares primárias e contínuas e representam um sério problema para a pesquisa e laboratórios industriais envolvidos no desenvolvimento e produção de células derivadas de produtos biológicos e farmacêuticos. Assim, apesar de todas as medidas preventivas normalmente utilizadas durante o processo de propagação da linhagem celular e manipulação, a contaminação por micoplasma continua a ser um problema de ocorrência frequente.

Os protocolos analíticos recomendados para testes com micoplasma de linhagens celulares e produtos biológicos derivados de células incluem o uso de caldo de cultura/ágar e testes indicadores de linhagens celulares. O método de cultura caldo/ágar visa a detecção de agentes micoplasmais cultiváveis , enquanto a linhagem de células indicadora é usada para detectar espécies de micoplasmas não cultiváveis meticulosas. Embora a combinação destes dois métodos permita a detecção eficiente de micoplasmas, os procedimentos de teste geral são caros, trabalhosos e demorados (no mínimo 28 dias). Além disso, existe um número de espécies de micoplasmas não cultiváveis que não são favoráveis a esta abordagem.

Novos métodos de testes de micoplasmas baseados na amplificação de ácidos nucleicos, em particular do RNA ribossômico derivado do micoplasma foram recentemente desenvolvidos. Estes métodos têm algumas vantagens em relação aos custos, sensibilidade analítica, simplicidade e tempo. No entanto, o limite de detecção de métodos atualmente disponíveis ainda está acima do que é necessário no controle de qualidade dos produtos biofarmacêuticos, especialmente quando se trabalha com amostras que têm um grande fundo de RNA total ou outras macromoléculas Portanto, existe uma necessidade no campo para melhorar os métodos de RT/PCR de modo a permitir limites de detecção melhorada de espécies de RNA pouco abundante em amostras biológicas. A solução do problema acima é alcançada pelas formas de realização caracterizadas nas reivindicações.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO E um objeto da presente invenção prover um método melhorado para a detecção de espécies de RNA pouco abundante em uma amostra biológica. Em particular, a presente invenção refere-se ao referido método e a um kit para a detecção de espécies de RNA pouco abundante em uma amostra biológica. Além disso, é outro objeto da presente invenção prover um método e um kit melhorados para a detecção de uma contaminação por micoplasma em uma amostra.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a detecção de espécies de RNA alvo pouco abundante em uma amostra biológica, compreendendo as etapas de: (a) transcrição reversa de RNA em cDNA usando uma transcriptase reversa (RT); (b) inativação do RT; e (c) detecção do cDNA alvo por reação em cadeia da polimerase (PCR). O termo "amostra biológica", como usado aqui, refere-se a qualquer amostra que contenha ou seja suspeita de conter macromoléculas biologicamente relevantes, como por exemplo, amostras provenientes de diferentes estágios do processo de produção de produtos biofarmacêuticos, por exemplo, vacinas ou proteínas recombinantes, sobrenadantes de cultura de células, lisados celulares, extratos de células, amostras de alimentos ou do meio ambiente, amostras provenientes do corpo humano ou animal, como sangue, soro, plasma, urina, líquidos ou esfregaços, ou quaisquer outras amostras de origem biológica e qualquer outra composição que contém ou seja suspeita de conter o RNA.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a amostra biológica tem um grande fundo de componentes celulares. O termo "componentes celulares" como usado aqui se refere a organelas celulares, proteínas, peptídeos, membranas, lipídeos, ácidos nucleicos, em particular espécies de RNA não alvo, e combinações ou fragmentos dos mesmos.

Em outra forma de realização preferida da presente invenção, a amostra biológica tem um fundo grande de RNA total. O termo "fundo grande de RNA total" como usado aqui se refere a uma situação em que o RNA alvo está presente como menos de uma molécula em 104 total de moléculas de RNA, preferivelmente como menos de uma molécula em 106 total de moléculas de RNA, mais preferivelmente como o menos de uma molécula em 10 total de moléculas de RNA, e o mais preferivelmente como menos de uma molécula em IO10 total de moléculas de RNA.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o RNA alvo está presente em uma quantidade de menos que 10000 cópias por ml de amostra, preferivelmente menos do que 1000 cópias por ml de amostra, mais preferivelmente menos do que 100 cópias por ml de amostra, e o mais preferivelmente menos do que 10 cópias por ml de amostra.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a transcrição reversa de RNA em cDNA usando um RT de acordo com o método da presente invenção realizado sob condições de partida a quente. O termo "condições de partida a quente" como usado aqui se refere a quaisquer condições em que a mistura de reação é aquecida em ou acima da temperatura de fusão do complexo iniciador/ácido nucleico antes da adição da enzima que é responsável pelo alongamento do iniciador, ou em que a e enzima que é responsável pelo alongamento do iniciador é inativa em temperatura ambiente e é ativada por etapa de ativação em temperatura que é realizada em ou acima da temperatura de fusão do complexo iniciador/ácido nucleico.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o método da presente invenção ainda compreende após a transcrição reversa de RNA em cDNA usar em RT uma etapa de amplificação do cDNA alvo usando o mesmo RT. Esta outra etapa é chamada "PCR inicial" e é preferivelmente realizada durante 5 a 15 ciclos em condições de partida a quente, mais preferivelmente durante 5 a 11 ciclos em condições de partida a quente, e o mais preferivelmente por cinco a dez ciclos em condições de partida a quente.

Assim, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a detecção de espécies de RNA pouco abundante em uma amostra biológica, compreendendo as etapas de: (a) transcrição reversa de RNA em cDNA usando uma transcriptase reversa (RT); (b) amplificação de cDNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o RT de etapa (a); (c) inativação do RT; e (d) detecção do cDNA alvo por PCR.

Enzimas que possuem ambas as atividades de RT (isto é DNA polimerase dependente de RNA) e DNA polimerase (isto é DNA polimerase dependente de DNA) são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo DNA polimerase de Thermus thermophilus (Tth pol). As condições em que uma determinada enzima apresenta uma certa atividade também são bem conhecidas na arte. No caso de Tth pol, a atividade da transcriptase reversa é promovida por íons Mn e atividade da DNA polimerase por íons Mg2+.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o RT usado no método da presente invenção é DNA polimerase de Thermus thermophilus (Tth pol). Em uma outra forma de realização preferida, o Tth pol é produzido recombinantemente (rT/A-pol).

Em outra forma de realização preferida da presente invenção, o RT é inativado no método da presente invenção, preferivelmente por a método selecionado dentre o grupo, consistindo de tratamento térmico, tratamento com fenol, tratamento com proteinase K, e tratamento com a agente caotrópico.

Tratamento térmico de acordo com a presente invenção compreende aquecer a mistura de reação contendo o RT a 80 a 100°C, preferivelmente a 90 a 100°C, mais preferivelmente a 95°C. Duração do tratamento térmico é 15 a 90 minutos, preferivelmente 30 a 75 minutos, mais preferivelmente 60 minutos. Em uma forma de realização especialmente preferida, o tratamento térmico compreende aquecer a mistura de reação contendo o RT a 95 °C durante 60 minutos.

Tratamento com proteinase K de acordo com a presente invenção compreende a adição de 1 a 10 unidades de proteinase K à mistura de reação, mais preferivelmente 2 a 5 unidades de proteinase K, ou o mais preferivelmente 5 unidades de proteinase K. Duração do tratamento com proteinase K é 30 a 90 minutos, preferivelmente 45 a 75 minutos, ou o mais preferivelmente 60 minutos. Em uma forma de realização especialmente preferida, tratamento com proteinase K compreende a adição de 5 unidades de proteinase K durante 60 minutos.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o RT é inativado no método da presente invenção por tratamento com um agente caotrópico. Tratamento com um agente caotrópico de acordo com a presente invenção compreende a adição de um agente caotrópico à mistura de reação contendo o RT em uma quantidade e durante um tempo que é suficiente para inativar o RT. As quantidades e tempos de um agente caotrópico particular são bem conhecidos na arte. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o agente caotrópico é selecionado dentre o grupo, consistindo de uréia, perclorato de lítio e um sal guanidínio. Em uma forma de realização a mais preferida, o agente caotrópico é um sal guanidínio.

Em uma outra forma de realização preferida da presente invenção, o método da presente invenção ainda compreende a inativação posterior do RT usando um agente caotrópico em uma etapa de remover o agente caotrópico da mistura de reação. Métodos para remover o agente caotrópico da mistura de reação são bem conhecidos na arte e incluem por exemplo a purificação dos ácidos nucleicos contidos na mistura de reação usando colunas giratórias de ligação de DNA. A detecção do cDNA alvo por PCR é também chamada “PCR de impulso". Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a reação em cadeia da polimerase (PCR) no método da presente invenção é uma PCR em tempo real. O termo "PCR em tempo real" como usado aqui se refere a qualquer método que é baseado na reação em cadeia da polimerase (PCR) e permite amplificar e simultaneamente quantificar uma molécula de DNA alvo.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o RNA alvo é derivado de um micoplasma. O termo "micoplasma" como usado aqui se refere a qualquer membro da classe Mollicutes que inclui os gêneros Mycoplasma, Ureaplasma, Mesoplasma, Entomoplasma, Spiroplasma, Acholeplasma, Asteroleplasma, e Thermoplasma. Em uma forma de realização mais preferida da presente invenção, o micoplasma é selecionado dentre o grupo, consistindo de Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma synoviae, e Mycoplasma orale.

Em uma outra forma de realização preferida da presente invenção, o RNA alvo é 16S RNA ribossômico (16S rRNA).

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a detecção de uma contaminação por micoplasma em uma amostra biológica, compreendendo as etapas de: (a) extração de RNA total da amostra; (b) transcrição reversa de RNA em cDNA usando uma transcriptase reversa (RT); (c) amplificação de cDNA derivado de 16S RNA ribossômico de micoplasma (16S rRNA) por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o RT de etapa (b); (d) inativação do RT por adição de um agente caotrópico; (e) remoção do agente caotrópico da mistura de reação; e (f) detecção do cDNA derivado do 16S rRNA de micoplasma por reação em cadeia da polimerase (PCR).

Meios para a extração de RNA total a partir de uma amostra são bem conhecidos na arte e incluem extração com fenol/clorofórmio e precipitação com isopropanol.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a contaminação com micoplasma a ser detectada é a contaminação de não mais do que cerca de 10 cfu/ml micoplasma na amostra.

Os iniciadores para a transcrição reversa de 16S rRNA de micoplasma, assim como iniciadores para a amplificação de cDNA derivado do 16S rRNA de micoplasma por PCR são bem conhecidos na arte.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a transcrição reversa de RNA em cDNA usando um RT do método para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra é realizada sob condições de partida a quente.

Em outra forma de realização preferida da presente invenção, o RT usado no método para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra é DNA polimerase de Thermus thermophilus (Tth pol). Em uma outra forma de realização preferida, o Tth pol é produzido recombinantemente (r27/z-pol).

Em uma outra forma de realização preferida da presente invenção, o agente caotrópico usado no método para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra é selecionado dentre o grupo, consistindo de uréia, perclorato de lítio e um sal guanidínio. Em uma forma de realização a mais preferida, o agente caotrópico é um sal guanidínio.

Em uma outra forma de realização preferida da presente invenção, o PCR no método para a detecção de contaminação com micoplasma em uma amostra é uma PCR em tempo real.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para a detecção de espécies de RNA alvo pouco abundante em uma amostra biológica, compreendendo pelo menos um RT e meios para a inativação do RT. Meios para a inativação do RT podem ser proteinase K ou um agente caotrópico. O kit pode ainda compreender, por exemplo, iniciadores para a transcrição reversa, iniciadores para a detecção de cDNAs específicos, RNAs veículos, RNA calibrador, DNA calibrador, enzimas, tampões, reagentes, recipientes de reação e descartáveis apropriados.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se um kit para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra biológica, compreendendo pelo menos uma DNA polimerase de Thermus thermophilus recombinante (r77/z-pol), iniciadores apropriados para a transcrição reversa de 16S rRNA de micoplasma, iniciadores apropriados para a amplificação de cDNA derivado do 16S rRNA de micoplasma, um agente caotrópico para a inativação do rTYA-pol, meios para remover o agente caotrópico da mistura de reação, e iniciadores para a detecção do cDNA derivado do 16S rRNA de micoplasma por PCR, por exemplo PCR em tempo real. Meios para remover o agente caotrópico podem ser colunas giratórias de ligação de DNA. O kit pode ainda compreender por exemplo meios para extrair RNA total de uma amostra, RNAs veículos, RNA calibrador, DNA calibrador, enzimas apropriadas, tampões, reagentes, recipientes de ração e/ou descartáveis. Os meios para extrair RNA total podem ser fenol, clorofórmio e isopropanol, ou tampões contendo os mesmos. A presente invenção será e ainda ilustrada nos seguintes exemplos sem qualquer limitação aos mesmos.

EXEMPLOS

Procedimento geral O método começa com a centrifugação de uma amostra biológica de interesse seguido pela extração de RNA total do grânulo de amostra. RNA é então transcrito de modo reverso em cDNA usando DNA polimerase de Thermus thermophilus recombinante (r7Y/z-pol) na presença de Mn em condições de partida a quente. Após quelação de Mn e adição de Mg , o rZ/A-pol realiza amplificação por PCR por 5 ciclos ou por 10 ciclos a condições de partida a quente (PCR inicial). A reação de PCR é então transferida para um tampão contendo guanidina para inativar o rTYA-pol. Purificação com um kit à base de coluna giratória resulta em produtos de PCR purificados da PCR inicial que são então co-amplificados com um padrão de DNA (DNA calibrador) em uma PCR em tempo real dupla (PCR de impulso). Altemativamente, um padrão de RNA (RNA calibrador) pode ser adicionado no começo de uma de extração de RNA para padronizar e controlar o procedimento desde o começo.

Procedimentos experimentais: Extração de RNA. Todas as etapas foram realizadas em tubos de reação de 2 ml. 2 ml da amostra foram centrifugados a 4°C por 10 min a 1000 rpm. O grânulo foi recolocado em suspensão em 1 ml RNA-Bee™ (Tel-Test Inc., TX), 5 μΐ de 1 mg/ml tRNA de levedura foram adicionados e a amostra incubada por 20 min em uma centrifuga a 70°C e 1000 rpm. Depois , 110 μΐ de clorofórmio foram adicionados e as fases separadas por centrifugação durante 5 min a 13000 rpm. RNA foi precipitado por adição de 500 μΐ isopropanol para a fase superior resultante e as amostras foram mantidas em gelo seco durante 5 min. O grânulo de RNA foi coletado por centrifugação durante 15 min a 13000 rpm, lavado com 500 μΐ 70% EtOH, e a amostra foi centrifugada durante 10 min a 13000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o grânulo de RNA foi dissolvido em 250 μΐ de H2O bi-destilada (bdH2O).

Transcrição reversa. 6 μΐ RT mix (1 μΐ lOx tampão transcrição reversa (Applied Biosystems, Áustria), 1 μΐ 10 mM MnCb, 0,5 μΐ 10 μΜ iniciador reverso, 0,8 μΐ 2,5 mM de cada dNTP, 2,2 μΐ (5,5 U) rTY/z-pol e 0,5 μΐ bdH2O) foram adicionados a 4 μΐ de extrato de RNA. Transcrição reversa foi realizada por 2 min a 80°C, 5 min a 62°C, 10 min a 70°C e 2 min a 80°C. PCR inicial. 40 μΐ de mistura de PCR (4 μΐ lOx tampão quelante (Applied Biosystems, Áustria), 5 μΐ 25 mM MgCI2, 2,5 μΐ 10 μΜ iniciador dianteiro, 2 μΐ 10 μΜ iniciador reverso e 26,5 μΐ bdH2O) que foram pré-aquecidos a 85°C ± 5°C foram adicionados à mistura de reação obtida a partir da transcrição reversa. PCR foi conduzida de acordo com o seguinte protocolo: 2 min a 80°C, 2 min a 95°C, 5x (10 segundos a 95°C, 30 segundos a 62°C, 30 segundos a 72°C).

Inativação de RT. Após a PCR inicial, 50 μΐ da mistura de reação ainda quente foram adicionados a 253 μΐ tampão de inativação (3 μΐ RNA veículo (1 pg/μΙ tRNA de levedura), 250 μΐ tampão PBI (Qiaquick PCR Purification Kit; Qiagen, Alemanha)) e misturados. As amostras foram aplicadas a uma mini-coluna giratória Qiaquick (Qiagen, Alemanha) em um tubo de coleta de 2 ml e centrifugadas durante 1 min a 13000 rpm. O tubo de coleta foi descartado, e a coluna giratória colocada em um tubo de coleta novo, 750 μΐ tampão PE (Qiaquick PCR Purification Kit; Qiagen, Alemanha) foram adicionados e a amostra centrifugada durante 1 min a 13000 rpm. Novamente o tubo de coleta foi descartado e a coluna centrifugada em um tubo de coleta novo durante 1 min a 13000 rpm. A coluna giratória foi então colocada em um tubo de reação novo de 1,5 ml, 50 μΐ 10 mM Tris (pH 8,0) foram adicionados e o DNA eluído por centrifugação durante 1 min a 13000 rpm. PCR de impulso. 10 pl do DNA eluído foram colocados em um tubo, e 5 μΐ de DNA calibrador como um controle e 35 μΐ mistura de TMPCR (lx tampão TaqMan A (Applied Biosystems, Áustria), 5 mM MgCl2, 200 nM de cada iniciador, 100 nM de cada sonda, 200 μΜ de cada dNTP, 9% glicerol (peso/volume), 0,05% gelatina (peso/volume), 0,01% Tween 20 (peso/volume), 2,5 U AmpliTaq Gold Polimerase (Applied Biosystems, z Áustria)) foram adicionados. PCR em tempo real foi realizada de acordo com o seguinte protocolo: 10 min a 95°C, 40x (15 segundos a 95°C, 1 min a 62°C).

Exemplo 1 : Detecção de Micoplasma synoviae em amostras se originando do processo de fabricação de uma vacina Amostras se originando do processo de fabricação de uma vacina foram salpicadas com quantidades variadas de Micoplasma synoviae e processadas de acordo com os procedimentos experimentais acima. Para demonstrar o efeito benéfico da inativação RT (amostras 1 a 6), amostras de controle foram incluídas em que RT não foi inativado (amostras 7 a 12), ou em que nenhum RT foi adicionado de todo (amostras 13 a 18). Após a extração de RNA, transcrição reversa, PCR inicial e inativação de RT, as amostras foram analisadas pela presença de cDNA por PCR em tempo real. Antes deste PCR de impulso, uma quantidade definida do DNA calibrador foi adicionada à mistura de reação. Este DNA calibrador foi amplificado junto com os ácidos nucleicos alvos usando um conjunto diferente de iniciadores. Sinais do DNA calibrador e alvo foram diferenciados usando diferentes sondas rotuladas. Os iniciadores por PCR inicial ou de impulso foram específicos para 16S rRNA de micoplasma. Os resultados resumidos na Tabela 1 mostram valores de Ct a partir do PCR em tempo real, isto é, o numero de ciclos necessários para detectar um produto de PCR específico. Os menores valores de Ct significam uma detecção mais rápida, enquanto que os valores Ct de 40 indicam que nenhum produto foi detectável sobre todo o ciclo do PCR em tempo real.

Tabela 1 : Detecção de Micoplasma synoviae em amostras se originando do processo de fabricação de uma vacina Os resultados da Tabela 1 mostram claramente que enquanto a presença de RT ativo (amostras 7 a 12) não permite a detecção de mesmo 100 cfu/ml de Micoplasma synoviae, inativação do RT permite a detecção de mesmo tão pouco como 10 cfu/ ml. O aumento dos valores de Ct para o DNA calibrador nas amostras sem inativação por RT mostra que, sem inativação, o IR é capaz de catalisar reações que levam a produtos de reação não específicos que interferem com a geração de produtos específicos de calibrador e DNA alvo durante PCR de impulso. Esta interpretação é corroborada pelo fato de que nas amostras onde não foi adicionado RT de todo (amostras 13 a 18), os valores de Ct para o DNA calibrador estão novamente no mesmo nível como nas amostras onde RT foi inativado (amostras 1 a 6).

Exemplo 2: Detecção de Micoplasma fermentans em amostras se originando do processo de fabricação de uma vacina As mesmas amostras como no Exemplo 1 foram salpicadas com quantidades variadas de Micoplasma fermentans e processadas de acordo com os procedimentos experimentais acima. Para demonstrar o efeito benéfico de inativação de RT (amostras 1 a 6), amostras de controle foram incluídas em que RT não foi inativado (amostras 7 a 12). Após a extração de RNA, transcrição reversa, PCR inicial e inativação de RT, amostras foram analisadas para a presença de cDNA por PCR em tempo real. Antes deste PCR de impulso, uma quantidade definida de DNA calibrador foi adicionada à mistura de reação. Os iniciadores por PCR inicial ou de impulso foram novamente específicos para 16S rRNA de micoplasma. Os resultados resumidos na Tabela 2 mostram os valores de Ct para o PCR em tempo real.

Tabela 2: Detecção de Mycoplasma fermentans em amostras se originando do processo de fabricação de uma vacina Os resultados na Tabela 2 confirmam que apesar da presença de RT ativo (amostras 7 a 12) ele não permite a detecção de mesmo 100 cfu/ml de Micoplasma fermentans, inativação do RT permite a detecção de mesmo tão pouco como 10 cfu/ml. O aumento nos valores de Ct pelo DNA calibrador nas amostras sem inativação RT novamente confirma que sem a inativação, o RT é capaz de catalisar reações que levam a produtos de reação não específicos que interferem com a geração de produtos específicos do DNA calibrador e alvo durante PCR de impulso.

Exemplo 3 Detecção de Micoplasma fermentans em amostras se originando do processo de fabricação de uma proteína Amostras se originando do processo de fabricação de uma proteína foram salpicadas com variadas quantidades de Mycoplasma fermentans e processadas de acordo com os procedimentos experimentais acima. O efeito benéfico de inativação de RT é mostrado na tabela 3, amostras 1 a 6. Do mesmo modo como as amostras derivadas do processo de fabricação de uma vacina, o procedimento também permite a detecção de tão pouco como 10 cfu/ml Micoplasma fermentans salpicado em uma suspensão de células usando a fabricação de uma proteína recombinante.

Tabela 3: Detecção de Micoplasma fermentans em amostras se originando do processo de fabricação de uma proteína REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Método para a detecção de espécies de RNA alvo pouco abundante, em que o RNA alvo está presente em uma quantidade menor que 10.000 cópias por ml de amostra, em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) transcrição reversa de RNA em cDNA usando uma transcriptase reversa (RT), o RT sendo uma DNA polimerase de Thermus thermophilus recombinante (rTth-pol), em que a etapa (a) é realizada sob condições de partida a quente; (b) inativação do RT; e (c) detecção do cDNA alvo por reação em cadeia da polimerase (PCR).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica tem um fundo de componentes celulares, tais como organelas celulares, proteínas, peptídeos, membranas, lipídios, ácidos nucleicos e/ou espécies de RNA não-alvo, e combinações e fragmentos dos mesmos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica tem um fundo de RNA total, em que o RNA alvo está presente como menos que uma (01) molécula em um total de 104 moléculas de |RNA.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender após a etapa (a) a etapa de amplificar o cDNA alvo usando o RT de etapa (a).

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RT é inativado na etapa (b) por um método selecionado dentre o grupo, consistindo de tratamento térmico, tratamento com fenol, tratamento com proteinase K, e tratamento com um agente caotrópico.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o RT é inativado por tratamento com um agente caotrópico.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ainda compreender após a etapa (b) a etapa de remover o agente caotrópico da mistura de reação.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é selecionado dentre o grupo consistindo de uréia, perclorato de lítio, e um sal guanidínio.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é um sal guanidínio.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a reação em cadeia da polimerase (PCR) de etapa (c) é uma PCR em tempo real.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA alvo é derivado de um micoplasma.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o micoplasma é selecionado dentre o grupo, consistindo de Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma synoviae, e Mycoplasma orale.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o RNA alvo é 16S RNA ribossômico.

14. Método para a detecção de uma contaminação com micoplasma em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) extração de RNA total da amostra biológica; (b) transcrição reversa de RNA em cDNA usando uma transcriptase reversa (RT), o RT sendo uma DNA polimerase de Thermus thermophilus recombinante (rTth-pol), em que a etapa (b) é realizada sob condições de partida a quente; (c) amplificação de cDNA derivado do 16S RNA ribossômico de micoplasma (16S rRNA) por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o RT de etapa (b); (d) inativação do RT por adição de um agente caotrópico; (e) remoção do agente caotrópico da mistura de reação; e (f) detecção de cDNA derivado do 16S rRNA de micoplasma por reação em cadeia da polimerase (PCR).

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é selecionado dentre o grupo consistindo de uréia, perclorato de lítio, e um sal guanidínio.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é um sal guanidínio.

17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a reação em cadeia da polimerase (PCR) de etapa (f) é uma PCR em tempo real.