BRPI0921864B1 - Combinações antitumor contendo anticorpos que reconhecem especificamente cd38 e melfalano e usos do anticorpo que reconhece especificamente cd38 - Google Patents

Abstract

COMBINAÇÕES ANTITUMOR CONTENDO ANTICORPOS QUE RECONHECEM ESPECIFICAMENTE CD38 E MELFALANO E USOS DO ANTICORPO QUE RECONHECE ESPECIFICAMENTE CD38. A presente invenção refere-se uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo que reconhece especificamente CD38 e melfalano.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a combinações de anticorpos monoclonais direcionados contra CD38 e melfalano, que são terapeuticamente úteis no tratamento de doenças neoplásicas.

[0002] CD38 é uma glicoproteína transmembrana tipo II de 45 kD com um longo domínio extracelular C-terminal e um curto domínio citoplásmico N-terminal. A proteína CD38 é uma ectoenzima bifuncional que pode catalisar a conversão de NAD+ em ADP-ribose cíclica (cADPR) e também hidrolisa cADPR em ADP-ribose. CD38 é induzido e está envolvido em muitas malignidades hematopoiéticas.

[0003] Os anticorpos monoclonais 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 e 38SB39, que reconhecem especificamente CD38, são descritos no pedido PCT WO 2008/047242. Os ditos anticorpos antiCD38 são capazes de matar células CD38+ por três mecanismos citotóxicos diferentes, indução de apoptose, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em adição, esses anticorpos são capazes de induzir diretamente a apoptose de células CD38+, mesmo sem a presença de células estromais ou citocinas derivadas do estroma. O melfalano é um agente alquilante usado em quimioterapia. No entanto, há ainda uma necessidade por novos medicamentos eficazes para tratar o câncer.

[0004] Concluiu-se, e para esta invenção, que a eficácia dos anticorpos anti-CD38 humanizados pode ser consideravelmente melhorada quando eles são administrados em combinação com ao menos uma substância que é terapeuticamente útil em tratamentos anticâncer e tem um mecanismo idêntico ou diferente dos anticorpos anti-CD38 humanizados e que está limitada na presente invenção a melfalano.

[0005] O termo "anticorpo" é usado aqui no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total) de qualquer isótopo tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos quiméricos e fragmentos de anticorpos. Um anticorpo IgG típico é compreendido de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas que são ligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável. Cada região variável contém três segmentos chamados "regiões determinantes de complementariedade" ("CDRs") ou "regiões hipervariáveis", que são principalmente responsáveis por ligar um epítopo de um antígeno. Elas são geralmente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do N-terminal. As porções mais altamente conservadas das regiões variáveis fora das CDRs são chamadas as "regiões de estrutura".

[0006] Como usado aqui, "VH" ou VH" refere-se à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo a cadeia pesada de um fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', ou F(ab')2. Referência a "VL" ou "VL" refere-se à região variável da cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo a cadeia leve de um fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', ou F(ab')2.

[0007] O anticorpo 38SB13 compreende ao menos uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 50 e ao menos uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 38, a dita cadeia pesada compreendendo três CDRs sequenciais tendo sequências de aminoácido que consistem em SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, e a dita cadeia leve compreendendo três CDRs sequenciais que têm sequências de aminoácido consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.

[0008] O anticorpo 38SB18 compreende ao menos uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 52 e ao menos uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 40, a dita cadeia pesada compreendendo três CDRs sequenciais tendo sequências de aminoácido que consistem em SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, e a dita cadeia leve compreendendo três CDRs sequenciais que têm sequências de aminoácido consistindo em SEQ ID NOs: 10, 11 e 12.

[0009] O anticorpo 38SB19 compreende ao menos uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 54 e ao menos uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 42, a dita cadeia pesada compreendendo três CDRs sequenciais tendo sequências de aminoácido que consistem em SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, e a dita cadeia leve compreendendo três CDRs sequenciais que têm sequências de aminoácido consistindo em SEQ ID NOs: 16, 17 e 18.

[00010] O anticorpo 38SB30 compreende ao menos uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 56 e ao menos uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 44, a dita cadeia pesada compreendendo três CDRs sequenciais tendo sequências de aminoácido que consistem em SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, e a dita cadeia leve compreendendo três CDRs sequenciais que têm sequências de aminoácido consistindo em SEQ ID NOs: 22, 23 e 24.

[00011] O anticorpo 38SB31 compreende ao menos uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 58 e ao menos uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 46, a dita cadeia pesada compreendendo três CDRs sequenciais tendo sequências de aminoácido que consistem em SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, e a dita cadeia leve compreendendo três CDRs sequenciais que têm sequências de aminoácido consistindo em SEQ ID NOs: 28, 29 e 30.

[00012] O anticorpo 38SB39 compreende ao menos uma cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 60 e ao menos uma cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID NO: 48, a dita cadeia pesada compreendendo três CDRs sequenciais tendo sequências de aminoácido que consistem em SEQ ID NOs: 31, 32 e 33, e a dita cadeia leve compreendendo três CDRs sequenciais que têm sequências de aminoácido consistindo em SEQ ID NOs: 34, 35 e 36.

[00013] As linhagens de células hibridoma que produzem os anticorpos anti-CD38 murinos 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31, e 38SB39 foram depositadas na American Type Culture Collections (10801 University Bld, Manassas, VA, 20110-2209, USA), em 21 de junho de 2006, sob os números de depósito PTA-7667, PTA- 7669, PTA-7670, PTA-7666, PTA-7668, e PTA-7671, respectivamente (como descrito em WO 2008/047242).

[00014] O termo "anticorpo humanizado", como usado aqui, refere- se a um anticorpo quimérico que contém sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. O objetivo da humanização é uma redução na imunogenicidade de um anticorpo xenogênico, tal como um anticorpo murino, para introdução em um humano, enquanto mantendo a afinidade de ligação ao antígeno completa e a especificidade do anticorpo. Os anticorpos humanizados, ou anticorpos adaptados para a não rejeição por outros mamíferos, podem ser produzidos usando várias tecnologias tal como recapeamento e humanização por transplante de CDR. Como usado aqui, a tecnologia de recapeamento usa uma combinação de modelagem molecular, análise estatística e mutagênese para alterar as superfícies não CDR de regiões variáveis de anticorpo para relembrar as superfícies de anticorpos conhecidos do hospedeiro alvo. A tecnologia de humanização por transplante de CDR envolve substituir as regiões determinantes de complementariedade, por exemplo, de um anticorpo de camundongo, em um domínio de estrutura humana, por exemplo, ver WO 92/22653. Os anticorpos quiméricos humanizados preferencialmente têm regiões constantes e regiões variáveis além das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) derivadas substancial ou exclusivamente das regiões de anticorpo humano correspondentes e CDRs derivadas substancial ou exclusivamente de um mamífero além de um humano.

[00015] Estratégias e métodos para o recapeamento de anticorpos, e outros métodos para reduzir a imunogenicidade de anticorpos dentro de um hospedeiro diferente, são descritos na Patente U.S. 5.639.641, que é aqui incorporada em sua totalidade a título de referência. Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de outras técnicas incluindo humanização por transplante de CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patentes U.S. Nos. 5.530.101 e 5.585.089), revestimento ou recapeamento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489 a 498; Studnicka G. M. e outros, 1994, Protein Engineering, 7(6): 805 a 814; Roguska M. A. e outros, 1994, PNAS, 91: 969 a 973), embaralhamento de cadeia (Patente U.S. No. 5.565.332), e a identificação de resíduos flexíveis (PCT/US2008/074381). Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de exibição de fagos. Ver também Patente U.S. Nos. 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806, e 5.814.318; e publicação de pedido de patente internacional números WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741 (as ditas referências incorporadas a título de referência em suas totalidades).

[00016] Os anticorpos anti-CD38 da combinação farmacêutica da presente invenção são anticorpos humanizados que reconhecem CD38 e matam células CD38+ por apoptose, ADCC e CDC. Em uma modalidade adicional, os anticorpos humanizados da invenção são capazes de matar as ditas células CD38+ por apoptose mesmo na ausência de células estromais ou citocinas derivadas do estroma.

[00017] Uma modalidade preferencial de tal anticorpo humanizado é um anticorpo humanizado 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31, ou 38SB39, ou um fragmento de ligação ao epítopo desse.

[00018] As CDRs dos anticorpos 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31, e 38SB39 são identificadas por modelagem e suas estruturas moleculares foram preditas. Assim, em uma modalidade, essa invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmento de ligação ao epítopo desses compreendendo uma ou mais CDRs tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 81. Em uma modalidade preferencial, uma versão humanizada de 38SB13 é fornecida, a qual compreende ao menos uma cadeia pesada e uma leve, onde a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, e onde a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. Em outra modalidade preferencial, uma versão humanizada de 38SB18 é fornecida, a qual compreende ao menos uma cadeia pesada e ao menos uma cadeia leve, onde a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, e onde a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 10, 11 e 12. Em outra modalidade preferencial, uma versão humanizada de 38SB19 é fornecida, a qual compreende ao menos uma cadeia pesada e ao menos uma cadeia leve, onde a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 13, 81 e 15, e onde a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 16, 17 e 18. Em outra modalidade preferencial, uma versão humanizada de 38SB30 é fornecida, a qual compreende ao menos uma cadeia pesada e ao menos uma cadeia leve, onde a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, e onde a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 22, 23 e 24. Em outra modalidade preferencial, uma versão humanizada de 38SB31 é fornecida, a qual compreende ao menos uma cadeia pesada e ao menos uma cadeia leve, onde a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 25, 26 e 27, e onde a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 28, 29 e 30. Em outra modalidade preferencial, uma versão humanizada de 38SB39 é fornecida, a qual compreende ao menos uma cadeia pesada e ao menos uma cadeia leve, onde a dita cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 31, 32 e 33, e onde a dita cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementariedade sequenciais tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 34, 35 e 36.

[00019] Em uma modalidade, esta invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos desses que compreendem um VH tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 66 e 72. Em uma modalidade preferencial, um anticorpo 38SB19 humanizado é fornecido, o qual compreende um VH tendo uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 66. Em outra modalidade preferencial, um anticorpo 38SB31 humanizado é fornecido, o qual compreende um VH tendo uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 72.

[00020] Em outra modalidade, esta invenção compreende anticorpos humanizados ou fragmentos desses que compreendem um VL tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 62, 64, 68 e 70. Em uma modalidade preferencial, um anticorpo humanizado 38SB19 é fornecido, o qual compreende um VL tendo uma sequência de aminoácido escolhida a partir do grupo de SEQ ID NOs: 62 e 64. Em outra modalidade preferencial, um anticorpo 38SB31 humanizado é fornecido, o qual compreende um VL tendo uma sequência de aminoácido escolhida a partir do grupo de SEQ ID NOs: 68 e 70.

[00021] Cada uma das versões humanizadas dos anticorpos 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31, e 38SB39 mostrou ser particularmente vantajosa como um agente anticâncer. A preparação, propriedades físicas e propriedades farmacológicas benéficas dessas são descritas em WO 2008/047242, que é incorporado a título de referência em sua totalidade. Geralmente, as doses usadas para tratar seres humanos, que dependem de fatores próprios ao sujeito a ser tratado, estão entre 1 e 150 mg/kg administrados oralmente ou entre 1 e 150 mg/kg administrados de forma intravenosa.

[00022] Melfalano (marca Alkeran®) é um fármaco quimioterápico pertencente à classe de agentes alquilantes tipo mostarda nitrogenada. Conhecidos de outra forma como Mostarda de L- Fenilalanina, ou L-PAM, o melfalano é um derivado de fenilalanina de mecloretamina e é um agente alquilante bifuncional. A formação de intermediários de carbônio de cada um dos dois grupos bis-2-cloroetila possibilita a alquilação através da ligação covalente com o 7-nitrogênio de guanina em DNA, reticulação de dois filamentos de DNA e desse modo impedindo a replicação celular. O melfalano é usado principalmente para tratar mieloma múltiplo e câncer ovariano, e ocasionalmente melanoma maligno. Ele é usualmente administrado de forma oral ou intravenosa.

[00023] Um aspecto da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD38 em combinação com ao menos melfalano. Como a atividade dos produtos depende das doses usadas, é assim possível usar doses menores e aumentar a atividade enquanto diminuindo o fenômeno de toxicidade. A eficácia melhorada de uma combinação de acordo com a invenção pode ser demonstrada pela determinação da sinergia terapêutica. Uma combinação manifesta sinergia terapêutica se é terapeuticamente superior ao melhor agente do estudo usado sozinho em sua dose máxima tolerada ou em sua dose mais alta testada quando a toxicidade não pode ser alcançada na espécie animal.

[00024] Essa eficácia pode ser quantificada, por exemplo, pelo modelo logarítmico de morte de células (log10), que é determinado de acordo com a seguinte fórmula: log10 morte celular = T - C (dias)/3,32 x Td no qual T - C representa o atraso no crescimento do tumor, que é o tempo médio em dias para que os tumores do grupos tratado (T) e os tumores do grupo de controle (C) alcancem um valor predeterminado (1 g, por exemplo), e Td representa o tempo em dias necessários para que o volume do tumor dobre nos animais de controle [T. H. Corbett e outros, Cancer, 40: 2660 a 2680 (1977); F. M. Schabel e outros, Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17: 3 a 51, Nova Iorque, Academic Press Inc. (1979)]. Um produto é considerado como sendo ativo se o modelo logarítmico de morte de células (log10) for maior ou igual a 0,7. Um produto é considerado como sendo muito ativo se o modelo logarítmico de morte de células (log10) for maior do que 2,8.

[00025] A combinação manifestará sinergia terapêutica quando o modelo logarítmico de morte de células (log10) for maior do que o valor do modelo logarítmico de morte de células (log10) do melhor constituinte quando ele é administrado sozinho e usado em sua máxima dose tolerada ou em sua dose mais alta testada.

[00026] A eficácia das combinações em tumores sólidos pode ser determinada experimentalmente da seguinte maneira:

[00027] Os animais submetidos ao experimento, geralmente camundongos, são enxertados subcutaneamente bilateralmente com 30 a 60 mg de um fragmento de tumor no dia 0. Os animais portantes de tumores são randomizados com base em seu tamanho de tumor antes de serem submetidos aos vários tratamentos e controles. A quimioterapia começa quando os tumores alcançaram um tamanho predeterminado após o enxerto, dependendo do tipo de tumor, e os animais são observados cada dia. Os diferentes grupos animais são pesados diariamente durante o tratamento até que a máxima perda de peso é alcançada e a subsequente recuperação de peso total tenha ocorrido. Os grupos são então pesados uma ou duas vezes por semana até o fim do experimento.

[00028] Os tumores são medidos 1 a 5 vezes por semana, dependendo do tempo de dobra tumoral, até que o tumor alcance aproximadamente 2 g, ou até que o animal morra (se isso ocorre antes do tumor alcançar 2 g). Os animais são necropsiados imediatamente após a eutanásia ou morte.

[00029] A atividade antitumor é determinada de acordo com os diferentes parâmetros registrados.

[00030] Os resultados obtidos com combinações de hu38SB19 e melfalano usados em suas doses ótimas são indicados a seguir como exemplos.

[00031] A presente invenção também se refere, então, a composições farmacêuticas contendo as combinações de acordo com a invenção.

[00032] Os constituintes dos quais a combinação é composta podem ser administrados simultaneamente, semissimultaneamente, separadamente, ou espaçados por um período de tempo para obter a eficácia máxima da combinação; sendo possível para cada administração variar em sua duração de uma rápida administração para uma perfusão contínua.

[00033] Como um resultado, para os propósitos da presente invenção, as combinações não são exclusivamente limitadas às que são obtidas por associação física das constituintes, mas também às que permitem uma administração separada, que pode ser simultânea ou espaçada por um período de tempo.

[00034] As composições de acordo com a invenção são preferencialmente composições que podem ser administradas parentalmente. Entretanto, essas composições podem ser administradas de forma oral, subcutânea ou intraperitoneal no caso de terapias regionais localizadas.

[00035] As composições para administração parental são geralmente farmaceuticamente aceitáveis, soluções ou suspensões estéreis que podem opcionalmente ser preparadas quando exigido no tempo de uso. Para a preparação de soluções ou suspensões não aquosas, óleos vegetais naturais, tal como óleo de oliva, óleo de gergelim ou petróleo líquido ou ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila, podem ser usados. As soluções aquosas estéreis podem consistir em uma solução do produto em água. As soluções aquosas são adequadas para administração intravenosa já que o pH é ajustado apropriadamente e a solução é feita isotônica, por exemplo, com uma quantidade suficiente de cloreto de sódio ou glicose. A esterilização pode ser executada por aquecimento ou por qualquer outro meio que não afete adversamente a composição. As combinações podem também tomar a forma de lipossomos ou a forma de uma associação com veículos como ciclodextrinas ou polietileno glicóis.

[00036] As composições para administração oral, subcutânea ou intraperitoneal são preferencialmente suspensões ou soluções aquosas.

[00037] Nas combinações de acordo com a invenção, a aplicação dos constituintes das quais pode ser simultânea, separada ou espaçada por um período de tempo, é especialmente vantajoso que a quantidade de anticorpo anti-CD38 humanizado represente de 10 a 90% em peso da combinação, é possível que esse teor varie de acordo com a natureza da substância associada, a eficácia procurada e a natureza do câncer a ser tratado.

[00038] As combinações de acordo com a invenção são especialmente úteis no tratamento de vários tipos de cânceres incluindo (mas não limitados a) os seguintes: carcinomas e adenocarcinomas, incluindo os de bexiga, mama, cólon, cabeça e pescoço, próstata, rim, fígado, pulmão, pâncreas, estômago, colo do útero, tiroide e pele, e incluindo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, incluindo mieloma múltiplo, leucemia, leucemia linfocítica (ou linfoide) aguda ou crônica, leucemia linfoblástica aguda e crônica, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma não Hodgkin (por exemplo, linfoma de Burkitt); tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, incluindo leucemias mielógenas (mieloides ou mielocíticas) agudas e crônicas, e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrosarcoma, osteosarcoma e rabdomiosarcoma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; e outros tumores, incluindo melanoma, teratocarcinoma, xeroderma pigmentosum, queratocantoma e seminoma, e outros cânceres ainda a serem determinados nos quais CD38 é expresso. Eles são principalmente úteis para tratar leucemia, linfoma e cânceres resistentes aos agentes anticâncer geralmente usados como os anticorpos anti-CD38 da invenção que têm um mecanismo exclusivo de ação.

[00039] Assim, a invenção também abrange o uso das combinações acima para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

Exemplo:

[00040] Neste exemplo, a efetividade de uma combinação de um anticorpo anti-CD38/melfalano da invenção para a inibição de crescimento do tumor foi demonstrada in vivo.

[00041] O primeiro modelo de tumor selecionado foi uma linhagem de células de mieloma múltiplo humanas transplantáveis, RPMI-8226, implantadas em camundongos SCID. # 10

[00042] Hu38SB19 foi formulado em solução salina de tampão de fosfato sem Ca2+ e Mg2+, pH 7,4. Hu38SB19 foi administrado de forma intravenosa nos dias 16, 19, 22, 25 após a implantação do tumor.

[00043] O melfalano foi formulado em 5% de etanol, 5% de polisorbato 80, 90% de cloreto de sódio 0,9% em água. O melfalano foi administrado de forma intravenosa simultaneamente a hu38SB19 nos dias 16, 19, 22, 25 após a implantação do tumor (exceto pela mais alta dose da combinação para a qual o tratamento foi interrompido no dia 19 quando a toxicidade foi alcançada).

[00044] Os resultados do experimento são relatados na Tabela 1.

[00045] Tempo de dobra do tumor = 3,2 dias.

[00046] Os seguintes pontos finais foram usados: - A toxicidade foi declarada em dosagens > 20% da perda de peso corporal ou > 10% de morte causada por fármaco, - A eficácia antitumor foi determinada calculando-se o modelo logarítmico de morte de células = (T - C)/[3,32 x (tempo de dobra do tumor em dias)] (T significa o tempo médio que os camundongos tratados levam para alcançar 1000 mg e C o tempo médio (25,3 dias) que os camundongos de controle levam para alcançar o mesmo tamanho; sobreviventes livres de tumor são excluídos desses cálculos e são tabelados separadamente). Nenhuma atividade antitumor foi declarada para o modelo logarítmico de morte de células < 0,7, e o tratamento foi declarado altamente ativo para o modelo logarítmico de morte de células > 2,8.

[00047] - Sobreviventes livres de tumor (TFS): correspondem à regressão completa abaixo do limite de palpação (63 mg) pela duração inteira do estudo (> 100 dias após o último tratamento).

[00048] - Sinergismo Terapêutico: uma combinação tem sinergismo terapêutico se é mais ativa do que o melhor agente único do estudo (por ao menos modelo logarítmico de morte de células 1).

[00049] A toxicidade para melfalano sozinho foi observada em uma dose de 16,1 mg/kg/injeção, com 3 mortes relacionadas ao fármaco dos 5 camundongos, isto é, acima do limite de 10%. A mais alta dose não tóxica (HNTD) para melfalano foi 10 mg/kg/injeção (dose injetada total = 40 mg/kg). A dose de 10 mg/kg/injeção revelou-se ativa com um modelo logarítmico de morte de células de 1,9.

[00050] Considerando hu38SB19, o produto foi bem tolerado em uma dose de 40 mg/kg/injeção. Nenhuma toxicidade foi observada, o que pode ser explicado pela ausência de reatividade cruzada do anticorpo com CD38 murino. O modelo logarítmico de morte de células foi 0,5, indicando que hu38SB19 não estava ativo sob essas condições.

[00051] A combinação de melfalano em 16,1 mg/kg/injeção e hu38SB19 em 40 mg/kg/injeção foi tóxica, com 5 das 5 mortes relacionadas ao fármaco, isto é, muito similar a que foi observada com melfalano sozinho na mesma dose. A dose de 10 mg/kg/injeção de melfalano com 40 mg/kg/injeção de hu38SB19 foi considerada como sendo a HNTD. Nessa dose, o modelo logarítmico de morte de células foi 2,2, indicando que a combinação foi tão ativa quanto o melhor agente, isto é, melfalano.

[00052] Outro experimento foi executado com LP1, um modelo de mieloma múltiplo humano altamente sensível a melfalano em comparação a RPMI-8226. O modelo foi implantado em camundongos SCID.

[00053] Hu38SB19 foi formulado em glicose 5% em água. Hu38SB19 foi administrado de forma intravenosa nos dias 12, 15, 18, 21 após a implantação do tumor.

[00054] Melfalano foi formulado em 5% de etanol, 5% de polisorbato 80, 90% de cloreto de sódio 0,9% em água. Melfalano foi administrado de forma intravenosa simultaneamente a hu38SB19 nos dias 12, 15, 18, 21 após a implantação do tumor.

[00055] Os resultados do experimento são relatados na Tabela 2.

[00056] Tempo de dobra do tumor = 1,5 dias.

[00057] Os seguintes pontos finais foram usados: - A toxicidade foi declarada em dosagens incluindo > 20% da perda de peso corporal ou > 10% de morte por fármaco, - A eficácia antitumor foi determinada pelo cálculo do modelo logarítmico de morte de células = (T - C)/[3,32 x (tempo de dobra do tumor em dias)] (T significa o tempo médio que os camundongos tratados levam para alcançar 1000 mg e C o tempo médio (16,8 dias) que os camundongos de controle levam para alcançar o mesmo tamanho; sobreviventes livres de tumor são excluídos desses cálculos e são tabelados separadamente). Nenhuma atividade antitumor foi declarada para o modelo logarítmico de morte de células < 0,7, e o tratamento foi declarado altamente ativo para o modelo logarítmico de morte de células > 2,8.

[00058] - Sinergismo Terapêutico: uma combinação tem sinergismo terapêutico se é mais ativa do que o melhor agente único do estudo (por ao menos modelo logarítmico de morte de células 1).

[00059] A toxicidade para melfalano sozinho foi observada em uma dose de 16,1 mg/kg/injeção, com 33,6% de perda de peso corporal em nadir no dia 22, isto é, acima de 20% de limite e 4/5 mortes relacionadas ao fármaco. A mais alta dose não tóxica (HNTD) para melfalano foi 10 mg/kg/injeção (dose injetada total = 40 mg/kg). A dose de 10 mg/kg/injeção revelou-se altamente ativa com um modelo logarítmico de morte de células de 9,3.

[00060] Considerando hu38SB19, o produto foi bem tolerado em uma dose de 40 mg/kg/injeção. Nenhuma toxicidade foi observada, o que pode ser explicado pela ausência de reatividade cruzada do anticorpo com CD38 murino. O modelo logarítmico de morte de células foi 0,2, indicando que hu38SB19 não estava ativo sob essas condições.

[00061] A combinação de melfalano em 16,1 mg/kg/injeção e hu38SB19 em 40 mg/kg/injeção foi tóxica, com 34,2% de perda de peso corporal em nadir no dia 22 e 5/5 mortes relacionadas ao fármaco, isto é, muito similar a que foi observada com melfalano sozinho na mesma dose. A dose de 10 mg/kg/injeção de melfalano com 40 mg/kg/injeção de hu38SB19 foi considerada como sendo a mais alta dose não tóxica. Notadamente, essa dose exibiu uma alta eficácia antitumor de modelo logarítmico de morte de células 18,9 (e 1/5 TFS no dia 148) e demonstrou sinergismo terapêutico em comparação à HNTD do melfalano sozinho (modelo logarítmico de morte de células 9,3). O sinergismo foi mantido em níveis de dose menores da combinação em comparação às doses equitóxicas de melfalano sozinho. Tabela I: Combinação de hu38SB19 e melfalano contra RPMI-8226 de mieloma múltiplo humano implantado em camundongos fêmeas SCID.

[00062] Tempo de dobra do tumor = 3,2 dias. Taman ho do tumor mediano no início da terapia = 131 a 148 mg. Tempo para o tumor mediano alcançar 1000 mg = 25,3 dias. Formulação: hu38SB19 = solução salina de tampão de fosfato sem Ca2+ e Mg2+, pH 7,4; melfalano = 5% de etanol, 5% polisorbato 80, 90% de cloreto de sódio 0,9% em água. BWC = mudança de peso corporal, T - C = atraso no crescimento do tumor, HNTD = dose não tóxica mais alta, HDT = dose mais alta testada, IV = intravenosa. Tabela II: Combinação de hu38SB19 e melfalano contra LP1 de mieloma múltiplo humano avançado implantado em camundongos fêmeas SCID.

[00063] Tempo de dobra do tumor = 1,5 dias. Tamanho do tumor mediano no início da terapia = 111 a 127 mg. Tempo para o tumor mediano alcançar 1000 mg = 16,8 dias. Formulação: hu38SB19 = glicose 5% em água; melfalano = 5% de etanol, 5% polisorbato 80, 90% de cloreto de sódio 0,9% em água. BWC = mudança de peso corporal, T - C = atraso no crescimento do tumor, HNTD = dose não tóxica mais alta, HDT = dose mais alta testada, TFS = sobreviventes livres de tumor, NTBA = animais não portantes de tumor, IV = intravenoso. a Os tratamentos foram interrompidos no dia 18 quando a toxicidade foi alcançada.

Claims (6)

1. Combinação farmacêutica sinérgica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que reconhece especificamente CD38 e pelo menos melfalano, em que o dito anticorpo é capaz de matar uma célula CD38+ por apoptose, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), em que o referido anticorpo é uma versão humanizada do anticorpo murino 38SB19, em que a cadeia pesada do referido anticorpo murino 38SB19 compreende três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) sequenciais e em que as sequências de aminoácidos das três CDRs sequenciais na cadeia pesada do referido anticorpo murino 38SB19 são SEQ ID NOs: 13, 81 e SEQ ID NO: 15 e em que a referida cadeia leve do referido anticorpo murino 38SB19 compreende três CDRs sequenciais e em que as sequências de aminoácidos das três CDRs sequenciais na cadeia leve do referido anticorpo murino 38SB19 são SEQ ID NOs : 16, 17 e 18.

2. Combinação farmacêutica sinérgica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo hu38SB19 e pelo menos melfalano, na qual o anticorpo hu38SB19 apresenta uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID N°: 66 e uma cadeia leve escolhida a partir do grupo das SEQ ID Nos: 62 e 64.

3. Combinação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que reconhece especificamente CD38 e pelo menos melfalano, em que o referido anticorpo consiste em: - uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 62; e - uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.

4. Uso de um anticorpo que reconhece especificamente CD38, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma combinação farmacêutica, como definida na reivindicação 1.

5. Uso de uma combinação farmacêutica sinérgica, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, leucemia, leucemia linfocítica aguda e crônica, leucemia linfoblástica aguda e crônica, linfoma de células B, linfoma de células T, Linfoma de Hodgkin; leucemias mielógenas agudas e crônicas e leucemia promielocítica.