BRPI0921992B1

BRPI0921992B1 - Compostos moduladores de tgr5, composição e seus usos

Info

Publication number: BRPI0921992B1
Application number: BRPI0921992-7A
Authority: BR
Inventors: Roberto Pellicciari
Original assignee: Intercept Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2008-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2021-12-14
Also published as: IL212970A; AU2009316484B2; CN106380502A; EP2373673B1; ES2774368T3; US8999964B2; ES2592452T3; CA2744135C; WO2010059859A1; CA2744135A1; EP3150620B1; IL212970A0; EP2373673A1; US20110263555A1; JP2012509349A; CN102282157A; JP5639073B2; BRPI0921992A2; EP3150620A1; AU2009316484A1

Abstract

moduladores tgr5 e métodos de uso destes. a invenção refere-se a compostos da fórmula a: (a) ou um sal, solvato, hifrato, ou conjugado de aminoácidos destes. os compostos da fórmula a são moduladores de tgr5 úteis para a prevenção e tratamento da doença.

Description

Relacionados Aplicação

[001] Este pedido de reivindicações prioritárias para Pedido Europeu No.08169460.6, depositado em 19 de novembro, 2008, os teores que são incorporados aqui.

Campo da Invenção

[002] Esta invenção relaciona-se aos compostos que modulam TGR5 e composições contendo tais compostos úteis em métodos para o tratamento e prevenção da doença. Especificamente, os compostos da invenção são análogos de ácido quenodesoxicólico tendo um subs- tituinte na posição C-16.

Antecedentes da Invenção

[003] Receptor TGR5 é um receptor acoplado à proteína G que tem sido identificado como um receptor na superfície celular que é sensível aos ácidos biliares (BAs). A estrutura primária de TGR5 e sua sensibilidade aos ácidos biliares têm sido encontradas a ser altamente conservado em TGR5 entre humanos, coelho, bovino, rato, e camundongo, e, desse modo, sugere que TGR5 tem funções fisiológicas importantes. TGR5 foi descoberto ser amplamente distribuído não somente em tecidos linfóides, porém também em outros tecidos. Elevados níveis de mRNA TGR5 foram detectados na placenta, baço e mo- nócitos/macrófagos. Os ácidos biliares têm sido mostrados para induzir a internalização da proteína de fusão TGR5 da membrana celular para o citoplasma. Kawamata e outros, 2003, J. Bio. Chem., 278, 9435. TGR5 foi encontrado para ser idêntico ao hGPCR19 relatado por Takeda e outros, 2002, FEBS Lett. 520, 97-101.

[004] TGR5 está associada com a acumulação intracelular de AMPc, que é amplamente expressa em diversos tipos celulares. Ao mesmo tempo em que a ativação deste receptor de membrana em ma- crófagos diminuindo a produção de citocinas pró-inflamatórias (Kawama- ta, Y.; Fujii, R.; Hosoya, M.; Harada, M.; Yoshida, H.; Miwa, M.; Fukusu- mi, S.; Habata, Y.; Itoh, T.; Shintani, Y.; Hinuma, S.; Fujisawa, Y.; Fujino, M., receptor sensível acoplado à proteína AG aos ácidos biliares. J. Biol Chem 2003, 278, 9435-9440) a estimulação de TGR5 por Bas em adipó- citos e miócitos aumenta o gasto energético (Watanabe, M.; Houten, S. M; Mataki, C.; Christoffolete, M. A.; Kim, B. W.; Sato, H.; Messaddeq, N .; Harney, J. W; Ezaki, 0.;. Kodama, T.; Schoonjans, K.; Bianco, A. C; ácidos Auwerx, J., ácidos Biliares induzir o gasto energético, promovendose a ativação de hormônio da tiróide intracelular. Nature. 2006, 439, 484489). Este último efeito envolve a indução dependente de AMPc da desi- odase de iodotironina tipo 2 (D2), que por, localmente converter T4 em T3, dá origem a atividade hormonal da tireóide aumentada. Consistente com o papel de TGR5 no controle do metabolismo energético, camundongos de nocaute TGR5 feminino TGR5 mostrar um acúmulo significativo de gordura com ganho de peso corporal quando desafiados com uma dieta rica em gordura elevada, indicando que a falta de TGR5 diminui o gasto de energia e provoca obesidade (Maruyama, T.; Tanaka, K.; Suzuki, J.; Miyoshi, H.; Harada, N.; Nakamura, T.; Miyamoto, Y.; Kanata- ni, A.; Tamai, Y., ruptura alvejada de receptor 1 de ácido bilar acopladas a proteína G (Gpbarl / MBar) em camundongos. J. Endocrinol. 2006, 191, 197-205). Além disso, e em conformidade com o envolvimento de TGR5 na homeostasia de energia, a ativação do ácido biliar do receptor de membrana também foi relatada para promover a produção de peptídeo 1 glucagon-símile (GLP-1) em linhagens celulares enteroendócrinas de murinos (Katsuma, S. ; Hirasawa, A.; Tsujimoto, G., ácidos biliares promover secreção de peptídeo 1 glucagon-símile através de TGR5 em uma linhagem celular enteroendócrinas de murino STC-1 Biochem Biophys Res Commun 2005, 329, 386-390). Com base na observação acima, TGR5 é um alvo atraente para o tratamento de doenças metabólicas, por exemplo, obesidade, diabetes (tipo I e tipo II), dislipidemia, esteatohepati- te não alcoólica (NASH), e a síndrome metabólica.

[005] Poucos exemplos de agonistas TGR5 têm sido até agora descritos na literatura. Recentemente, 23-alquila substituídas e 6,23- alquila dissubstituídas derivados de ácido quenodesoxicólico, tal como o ácido 6α-etil-23 (S)-metil-quenodesoxicólico mostrado abaixo, têm sido relatados como agonista potente e seletivo de TGR5 ( Pellicciari, R.; Sato, H.; Gioiello, A.; Costantino, G.; Macchiarulo, A.; Sadeghpour, B. M; Giorgi, G.; Schoonjans, K.; Auwerx, J., as ações não genômicas dos ácidos biliares. Síntese e caracterização preliminar de 23 e 6,23- alquil substituídas por ácidos biliares derivados como moduladores seletivos para o receptor TGR5 acoplado à proteína g. J. Med. Chem.

[006] Em particular, metilação na posição C23-(S) de BAs natural confere uma seletividade marcada para TGR5 sobre FXR (receptor X farnesóide) de ativação, enquanto que os aumentos de substituição de 6α-alquil a potência em ambos os receptores. Outros agonistas TGR5 incluem 6-metil-2-oxo-4-tiofen-2-il-1,2,3,4-tetraidro-pirimidina-5- carboxílico éster benzil de ácido (WO004067008, Takeda Chemical Industries LTD, Japão, 2004) e ácido oleanóico (Sato, H.; Genet, C.; Strehle, A.; Thomas, C.; Lobstein, A.; Wagner, A.; Mioskowski, C.; Au- werx, J.; Saladino, R., atividade Anti-hiperglicêmica de um agonista TGR5 isoladas de Olea europaea. Biochem e Biophys Res Commun 2007, 362, 793-798; Ito, F.; Hinuma, K.; Kanzaki, N.; Miki, T.; Kawama- ta , Y.; 0i, S.; Tawaeaishi, T.; Ishichi, Y.; Hirohashi, M. Preparação de anel aromático fundido por compostos cíclicos como agonistas do receptor TGR5. PN: W02004067008, 2004. Mais recentemente, a primeira síntese ácido quenodesoxicólico enantiomérica (CDCA) e ácido lito- cólico (LCA), foi permitido para avaliar a especificidade da interação de BAs natural para TGR5 (Katona, B. W, Cummins, C. L; Ferguson, A. D; Li, T.; Schmidt, D. R; Mangelsdorf, D. J ; Covey, D. F, Synthesis, Characterization, e Receptor Interaction Profiles de Enantiomeric Bile Acids J. Med. Chem. 2007, 50, 6048-6058).

[007] Ao mesmo tempo em que essas ferramentas químicos desde que pela primeira vez uma diferenciação farmacológicos de efeitos genômicos versus não genômicas dos BAs, alguns deles também permitido para traçar um primeiro estudo de relação de atividade de estrutura onde a presença de uma bolsa de ligação adicional em TGR5 desempenha um papel fundamental em determinar a seletividade do ligante (Pellicciari, R.; Sato, H.; Gioiello, A.; Costantino, G.; Mac- chiarulo, A.; Sadeghpour, B. M; Giorgi, G.; Schoonjans, K.; Auwerx, J., ações não-genômicas de ácidos biliares. Síntese e caracterização preliminar de 23 e 6,23-alquil substituídas derivados de ácidos biliares como moduladores seletivos para o receptor TGR5 acoplado à proteí-na G. J. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268). Neste contexto, a disponibilidade de mais potente e moduladores TGR5 seletivos é necessário para identificar recursos adicionais afetam a ativação do receptor e caracterizar as ações fisiológicas e farmacológicas desse receptor.

[008] Uma necessidade para o desenvolvimento de moduladores TGR5 para o tratamento e prevenção da doença. A presente invenção tem compostos identificados que são análogos de ácido quenodesoxi- cólico que têm um substituinte na Posição C-16, bem como métodos de uso destes compostos para tratar a doença.

Sumário da Invenção

[009] A presente invenção refere-se a compostos e seu uso para tratar e prevenir doenças que envolvem modulação do receptor TGR5, tais como doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças do fígado, doença auto-imune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doenças gastrointestinais. Especificamente, os compostos da invenção são análogos de ácido quenodesoxicólico que são substituídos na po- sição C-16 do anel D, como mostrado abaixo.

[010] Em um aspecto, a invenção inclui um composto tendo a fórmula A: sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos, onde: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio;

[011] R2 é hidrogênio ou hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substitu ída ou não substituída, ou halogênio;

[012] R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi;

[013] R11 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-, OC6H8O6-, ou hidrogênio;

[014] R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-, OC6H8O6-, hidrogênio, ou considerado juntamente R11 e R12 forma uma carbonila; e

[015] R16 é hidroxila, alcóxi, e halogênio, desde que quando R2, R4, R7 e R12 são hidrogênio, R1 e R11 são OH, em seguida R16 não é OH alfa.

[016] Em outro aspecto, a invenção inclui um composto tendo a fórmula B:

(B) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R1, R2, R4, R7, R11, R12, e R16 são como descritos aqui.

[017] Em outro aspecto, a invenção inclui um composto tendo a

(C) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2, R4 e R16 são como descritos aqui.

[018] Em outro aspecto, a invenção inclui um composto tendo a

(D) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2, R4 e R16 são como descritos aqui.

[019] Em outro aspecto, a invenção inclui um composto tendo a fórmula E:

(E) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 e R16 são como descritos aqui.

[020] Em outro aspecto, a invenção inclui um composto tendo a fórmula F:

(F) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 e R16 são como descritos na reivindicação 1.

[021] A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R1 é OH. A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou ami- noácidos destes, onde R7 é H. A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato ou aminoácidos destes, onde R2 é H. A invenção inclui um composto ou um ou um conjugado de sal, sol- vato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 é OH alfa. A invenção inclui um composto ou um ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 é OH beta. A invenção inclui um composto ou um ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R4 é alquila não substituída. A invenção inclui um composto ou um ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R4 é etil. A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R11 é hidroxi- la. A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R12 é hidrogênio. A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou amino- ácidos destes, onde R16 é hidroxila alfa. A invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R16 é hidroxila beta.

[022] A invenção inclui um composto, onde o composto é Composto 10:

(10) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes. A invenção inclui um composto, onde o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.

[023] A invenção inclui uma composição compreendendo um composto da invenção e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. A invenção inclui um composto ou composição para uso em um método de tratar ou prevenir uma doença, o método compreendendo administrar o composto da invenção. A invenção inclui o uso de um composto da invenção na fabricação de um medicamento para um método de tratar ou prevenir doenças.

[024] A invenção inclui o uso de um composto tendo a fórmula A:

sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio;

[025] R2 é hidrogênio ou hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio;

[026] R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi; R11 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-, OC6H8O6-, ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-, OC6H8O6-, ou hidrogênio, ou considerado juntamente R11 e R12 forma uma carbonila e R16 é hidroxila, alcóxi, e halogênio, desde que quando R2, R4, R7 e R12 são hidrogênio, R1 e R11 são OH, em seguida R16 não é OH alfa na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças. A invenção inclui um método de tratamento da doença através da administração a um paciente um composto tendo a fórmula A, ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoáci- dos destes.

[027] A invenção inclui o uso, onde a doença é selecionada de doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças do fígado, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doenças gastrointestinais. A invenção inclui o uso, onde o composto ou compo-sição é administrado ao paciente oralmente, parentalmente, intravenosa, ou topicamente. A invenção inclui o uso, onde o paciente é um ser humano.

[028] A descrição acima apresenta de preferência ampla das ca-racterísticas mais importantes da presente invenção, de modo que a descrição detalhada destes, que segue pode ser entendido, e para que as presentes contribuições para a técnica pode ser melhor apreciado. Outros objetos e características da presente invenção se tornarão evi-dente da seguinte descrição detalhada considerada em conjunção com os exemplos.

Descrição das Figuras

[029] Figura 1 é uma série de 2 gráficos (A-B), que mostra os resultados de ensaio FRET, empregando o composto 10 (Figura 1A) e LCA (Fig. 1B) nas células HEK293T transfectadas transitoriamente com vetores (V) ou vetores TGR5 expresso (TGR5).

[030] A Figura 2 é uma série de 2 gráficos (A-B) que mostra ensaio de transativação (CRE-Luc repórter) resultados para compostos 10 e LCA (controle positivo), empregando células HEK293T expressam TGR5.

[031] A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra os resultados de ensaio de expressão de gene alvo TGR5 para compostos 10 empregando células NC1-H716 intestinal e LCA como um controle positivo.

[032] Figura 4 é uma série de 3 gráficos (A-C), que mostra os resultados para composto 10 de teste de citotoxicidade in vitro de medição ATP de libertação após 4 horas de estimulação empregando (NCI- H716) intestinal humano. LCA é um controlo positivo.

[033] Figura 5 é uma série de 3 gráficos (A-C), que mostra os resultados para compostos 10 de testes de citotoxicidade in vitro de medição ATP de libertação após 4 horas de estimulação empregando linhagens de células hepáticas (HepG2). LCA é um controlo positivo.

[034] Figura 6 é um gráfico que mostra a tensão superficial plota- do contra o logaritmo da concentração do composto 10 (mM) em NaCl 0,15M.

[035] Figura 7 é um fluxograma biliar para um experimento infusão duodenal realizado empregando composto 10.

[036] Figura 8 é um fluxograma biliar para um experimento infusão femoral realizado empregando composto 10.

[037] Figura 9 é um gráfico que mostra as taxas de secreção versus tempo em experimento infusão femoral e duodenal realizada empregando compostos 10.

[038] Figura 10 é uma série de gráficos que mostra compostos 10 e metabólito principal identificado em biliar empregando espectrome- tria de massa em um experimento iv. Os dados são reportados como valores de área absoluta.

Descrição da Invenção

[039] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados na descrição acompanhada abaixo. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes por aqueles descritos aqui pode ser empregado na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiais são descritos agora. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes da descrição. Na especificação, as formas singulares também incluem o plural, a menos que o contexto claramente imponha de outra forma. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos empregados aqui têm o mesmo significado como geralmente compreendido por alguém de ordinária versatilidade na técnica à qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação irá controlar.

[040] Em um aspecto, a invenção inclui um composto da fórmula A:

solvato, hidrato, ou aminoácidos, onde, R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio;

[041] R2 é hidrogênio ou hidroxila; R4 é hidrogênio, alquila substitu ída ou não substituída, ou halogênio; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidroxila; R11 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-, OC6H8O6-, ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-, OC6H8O6-, ou hidrogênio, ou considerado juntamente R11 e R12 forma uma carbonila e R16 é hidroxila, alcóxi, e halogênio. Em um aspecto, a invenção não inclui um composto onde R2, R4, R7 e R12 são hidrogênio, R1 e R11 são OH e R16 é OH alfa. Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula A, ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos, desde que quando R2, R4, R7 e R12 são hidrogênio e R1 e R11 são OH, em seguida R16 não é OH alfa. Em outro aspecto, a invenção não inclui

o composto: Em um

[042] Em um aspecto, a invenção inclui um composto tendo a fórmula B:

(B) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R1, R2, R4, R7, R11, R12, e R16 e são como acima.

[043] Em um aspecto, a invenção inclui um composto tendo a

(C) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2, R4 e R16 são como descrito acima.

[044] Em um aspecto, a invenção inclui um composto tendo a

(D) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2, R4 e R16 são como descrito acima.

[045] Em um aspecto, fórmula E:

(E) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 e R16 são como des- crito acima.

[046] Em um aspecto, fórmula F:

(F) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 e R16 são como des- crito acima.

[047] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R1 é OH. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde a R7 é H. Em um aspecto, a invenção inclui um composto de um conjugado de sal, sol- vato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R1 é OH e R7 é H.

[048] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 é H. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 é OH alfa. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R2 é OH beta.

[049] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R4 é alquila não substituída. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R4 é etil.

[050] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R11 é hi- droxila. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes, onde R12 é hidrogênio.

[051] Em um aspecto, a invenção inclui os compostos 10:

(10) ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácidos destes.

[052] Em um aspecto, a invenção inclui um composto, onde o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.

[053] Em um aspecto, a invenção inclui uma composição compreendendo um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácido destes e pelo menos um excipiente. Em um aspecto, a in- venção inclui uma composição compreendendo um composto ou um conjugado de sal, solvato, hidrato, ou aminoácido destes e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[054] Em um aspecto, a invenção inclui o uso de um composto ou uma composição da invenção, na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir a doença em um paciente. Em outro aspecto, a invenção inclui um método de tratar ou prevenir doenças em um paciente através da administração de um composto ou uma composição da invenção. Em um aspecto, a invenção inclui uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um composto ou composição da invenção é administrado ao paciente. Em um aspecto, a invenção inclui uma quantidade profilaticamente eficaz de um composto ou composição da invenção é administrada.

[055] Em um aspecto, a invenção inclui o uso do composto ou composição da invenção, na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença em um paciente que envolve a modulação do receptor TGR5. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença que envolve a modulação do receptor TGR5 em um paciente com a administração de um composto ou composição da invenção.

[056] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é selecionada de doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças do fígado, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doenças gastrointestinais. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença selecionada de doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças do fígado, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doenças gastrointestinais.

[057] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é uma doença metabólica selecionada de obesidade, diabetes, síndrome metabólica, resistência à insulina, hipertensão e dislipidemia. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença metabólica se- lecionada de obesidade, diabetes, diabesidade, síndrome metabólica, resistência à insulina, resistência à insulina pré-diabética, hipertensão e dislipidemia.

[058] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é uma doença inflamatória selecionada de alergia, osteoartrite, apendicite, asma brônquica, pancreatite, erupção alérgica e psoríase. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença inflamatória selecionada de alergia, osteoartrite, apendicite, asma brônquica, pancreatite, erupção alérgica e psoríase.

[059] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é uma doença auto-imune selecionada de artrite reumatóide, esclerose múltipla, e diabetes tipo I. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença auto-imune selecionada de artrite reumatóide, esclerose múltipla e diabetes tipo I.

[060] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é uma doença gastrointestinal selecionada de doenças inflamatórias intestinais (doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome do intestino curto (colite pós-radiação), colite microscópica, síndrome do intestino irritável (má absorção), e super-desenvolvimento bacteriano. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença gastrointestinal selecionada de doenças inflamatórias intestinais (doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome do intestino curto (colite pós-radiação), colite microscópica, síndrome do intestino irritável (má absorção), e de super-desenvolvimento bacteriano.

[061] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é doença renal selecionada de nefropatia diabética, insuficiência renal crônica, nefroesclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, glome- rulopatia do transplante crônica, nefrite intersticial crônica, doença renal policístico. A invenção inclui um método de trata ou prevenir a doença renal selecionada de nefropatia diabética, insuficiência renal crô- nica, nefroesclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, glomerulo- patia do transplante crônica, nefrite intersticial crônica, doença renal policístico.

[062] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é câncer selecionado de câncer colorretal, câncer de fígado, carcinoma heptacelular, carcinoma colangio, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, e insulanoma. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir de câncer selecionado de câncer colorre- tal, câncer de fígado, carcinoma heptacelular, colangio carcinoma, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, e insulanoma.

[063] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença é uma doença hepática selecionada de esteatoepatite não alcoólica, doença hepática gordurosa não alcoólica, hepatite viral crônica, doença hepática alcoólica, hepatite induzida por drogas, hemocromatose, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hipertensão porta, dessaturação biliar, doença de Gaucher, doença de Wilson, deficiência de αl-antitripsina, nutrição parenteral total (TPN), colelitíase, colestase associada com TPN e sepse. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença do fígado selecionado de esteatoepatite não al-coólica, doença hepática gordurosa não alcoólica, hepatite viral crônica, doença hepática alcoólica, hepatite induzida por drogas, hemocro- matose, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hiper-tensão porta, dessaturação biliar, doença de Gaucher, doença de Wilson, deficiência de α1-antitripsina, nutrição parenteral total (TPN), co- lelitíase, colestase associada com TPN e sepse.

[064] Em um aspecto, a invenção inclui o uso, onde a doença cardíaca é selecionada de insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, aterosclerose, angina de peito, arteriosclerose e doença cerebrovascular (hemorragia, infarto, acidente cerebrovascular ). A in- venção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença cardíaca selecionada de insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, aterosclerose, angina de peito, arteriosclerose e doença cerebrovascular (hemorragia, infarto, acidente cerebrovascular).

[065] Em um aspecto, a invenção inclui uma doença envolve modulação do receptor TGR5. Em um aspecto, a invenção inclui um composto que é um agonista TGR5. Em um aspecto, o composto é um agonista de TGR5 seletivo sobre ativador FXR.

[066] Em um aspecto, o composto ou composição da invenção é administrado ao paciente oralmente, parentalmente, intravenosa ou topicamente. Em um aspecto, o paciente é um ser humano. Definições

[067] Por conveniência, certos termos empregados na especificação, exemplos e reivindicações anexadas são coletados aqui.

[068] O termo "tratar", como empregado aqui, significa alívio, diminuição, redução, eliminação, modulação, ou melhorar, isto é, causando a regressão do estado de doença ou condição.

[069] O termo "prevenção", como empregado aqui significa, com-pletamente ou quase completamente parar um estado de doença ou condição, de ocorre em um paciente ou individuo, especialmente quando o paciente ou individuo está predisposto para tal ou em risco de contrair um estado de doença ou condição. Prevenção também pode incluir inibição, isto é, interrompendo o desenvolvimento, de um estado de doença ou condição, e aliviar ou melhorar, isto é, causando a regressão do estado de doença ou condição, por exemplo, quando o estado de doença ou condição pode anteriormente está presente.

[070] Como empregado aqui, o termo “conjugados de aminoáci- do” refere-se a conjugados dos compostos das fórmulas da invenção com qualquer aminoácido adequado. Tais conjugados de aminoácidos adequado dos compostos das fórmulas da invenção terão a vantagem adicionada de integridade realçada em fluidos biliar ou intestinal. Ami- noácidos adequados incluem, porém não são limitadas a glicina e taurina. Desse modo, a presente invenção compreende os conjugados de glicina e taurina de qualquer dos compostos da invenção.

[071] Como empregado aqui, "BA" significa ácido biliar e derivados de ácidos biliares. Os ácidos biliares são ésteróides de ácidos carboxílicos derivados do colesterol. Os ácidos biliares primários são os ácidos cólicos e quenodesoxicólico. No corpo, estes ácidos são conjugadas com glicina ou taurinas antes que são secretados na bile.

[072] “Alquila” incluir grupos alifáticos, incluindo grupos de alquila de cadeia ramificada (por exemplo, metil, etil, propil, butil, pentil, hexil, heptil, octil, nonil, decil), grupos alquil de cadeia ramificada (por exemplo, isopropil, terc-butil, isobutil), cicloaquil (por exemplo, aliciclico) grupos (por exemplo, ciclopropil, ciclopentil, cicloexil, cicloeptil, ciclooc- til), grupos cicloalquila substituído por alquila, e grupos alquila substituída por cicloalquila. Em certas modalidades, uma alquila de cadeia ra-mificada ou cadeia ramificada tem seis ou alguns átomos de carbono no esqueleto (por exemplo, C1-C6 para cadeia ramificada, C3-C6 para cadeia ramificada). Em alguns exemplos, uma alquila de cadeia ramificada ou cadeia ramificada tem quatro ou alguns átomos de carbono no esqueleto. Além disso, cicloalquilas tem de três a oito átomos de carbono na estrutura de anel.

[073] O termo “alquil substituída” refere-se a uma porção de alquila tendo substituinte substituir um ou mais átomos de hidrogênio em pelo menos um ou mais carbonos do esqueleto de hidrocarboneto. Tais substituintes podem incluir, por exemplo, alquil, alquenila, alquini- la, halogênio, hidróxil, alquilacarbonilóxi, arilacarbonilóxi, alcoxicarboni- lóxi, ariloxicarbonilóxi, carboxilato, alquilacarbonil, arilacarbonil, alcoxi- carbonil, aminocarbonil, alquil aminocarbonil, dialquilaminocarbonil, alquilatiocabonil, alcóxil, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (in- cluindo alquilamino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, e alquilarilamino), acilamino (incluindo alquilacarbonilamino, arilacar- bonilamino, carbamóila e ureído), amidino, imino, sulfidrila, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilassulfinila, sulfonato, sulfamoíla, sulfonamido, nitro, trifluorometila, ciano, azido, heterociclila, alquilaril, ou uma porção aromática ou heteroaromático.

[074] “Aril” incluir grupos com aromaticidade, incluindo 5- e 6- membros “não conjugado”, ou anel único, grupos aromáticos que podem incluir de zero a quatro heteroátomos, bem como “conjugado”, ou multicíclico, sistemas com pelo menos um anel aromático. Exemplos de grupos aril incluem benzeno, fenil, pirrol, furano, tiofeno, tiazol, iso- tiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isooxazol, piridina, pi- razina, piridazina, e pirimidina, e outros. Além disso, o termo “aril” incluir os grupos aril multicíclico, por exemplo, triciclo, biciclo, por exemplo, naftaleno, benzoxazol, benzodioxazol, benzotiazol, benzoimidazol, benzotiofeno, metilenodioxifenil, quinolina, isoquinolina, nafridina, in- dol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina, ou indolizina. Esses grupos aril tendo heteroátomos na estrutura de anel também pode ser referido a “heterociclos aril”, “heterociclos,” “heteroarilas” ou “hete- roaromáticos”. O anel aromático pode ser substituído pelo menos uma posição de anel com tais substituintes como descritos acima, como por exemplo, halogênio, hidróxi, alcóxi, alquilcarbonilóxi, arilcarbonilóxi, alcoxicarbonilóxi, ariloxicarbonilóxi, carboxilato, alquilcarbonila, alqui- laminocarbonila, aralquilaminocarbonila, alquenilaminocarbonila, alqui- lcarbonila, arilcarbonila, aralquilcarbonila, alquenilcarbonila, alcoxicar- bonila, aminocarbonila, alquiltiocarbonila, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilami- no, e alquilarilamino), acilamino (incluindo alquilcarbonilamino, arilcar- bonilamino, carbamoíla e ureído), amidino, imino, sulfidrila, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilassulfinila, sulfonato, sulfamoíla, sulfonamido, nitro, trifluorometila, ciano, azido, heterociclila, alquilaril, ou uma porção aromática ou heteroaromático. Grupos aril também podem ser fundidos ou ponte com aneis aliciclo ou heterociclo, que não são aromáticos para formar um sistema multicíclico (por exemplo, tetralina, metilenodioxifenil).

[075] A menos que o número de carbonos é especificado de outra forma, “alquila inferior” incluir um grupo alquila, como definido acima, porém tendo de um a dez, por exemplo, de um a seis, átomos de carbono na estrutura do esqueleto.

[076] O termo “éster” incluir compostos e porções que contem um carbono ou uma ligação heteroátomo para átomos de oxigênio que é ligado ao carbono de um grupo carbonila. O termo “éster” inclui grupos alcoxicarboxílico tal como metoxicarbonila, etoxicarbonila, propoxicar- bonila, butoxicarbonila, pentoxicarbonila, etc. os grupos alquil, alqueni- la, ou alquinila são como definidos acima.

[077] O termo “hidróxi” or “hidróxil” incluir grupos com um -OH ou -O-.

[078] O termo “halogênio” incluir flúor, bromo, cloro, iodo, etc. O termo “per-halogenado” geralmente refere-se a uma porção onde todos hidrogênios são substituídos por átomos de halogênio.

[079] Um “grupo aniônico,” como empregado aqui, refere-se a grupo que é negativamente carregado em pH fisiológico. Grupos aniô- nicos incluir carboxilato, sulfato, sulfonato, sulfinato, sulfamato, tetrazolila, fosfato, fosfonato, fosfinato, ou fosforotioato ou equivalentes funcionais destes. “Equivalentes funcionais” de grupos aniônicos são pretendidos a incluir bioisósteres, por exemplo, bioisósteres de um grupo carboxilato. Bioisósteres abrangem ambos equivalentes bioisos- térico clássicos e equivalentes bioisostérico não clássicos. Bioisóste- res clássicos e não clássicos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Silverman, R. B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1992, pp.19-23). Outros grupos aniônicos é um carboxilato.

[080] O termo “funcionalidade instável” refere-se a uma substituição padrão que contem uma ligação instável, por exemplo, uma funci-onalidade ou liga que é suscetível a hidrólise ou clivagem sob condições fisiológicas (por exemplo, soluções aquosas na taxa de pH neutral). Exemplos de funcionalidades instável incluem acetais e cetais.

[081] Adicionalmente, os compostos da presente invenção, por exemplo, os sais dos compostos podem existir em qualquer forma hidratada ou não hidratada (o anidroso) ou como solvatos com outras moléculas de solventes. Os exemplos não limitados a hidratos incluem monohidratos, dihidratos, etc. Os exemplos não limitados a solvatos incluem solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.

[082] "Solvatos" significa formas de adição de solvente que contem ou quantidade de estequiométrico ou não estequiométrico de solvente. Alguns compostos têm uma tendência para assumir uma relação molar fixa de moléculas de solvente no estado solido cristalino, desse modo formando um solvato. Se o solvente é agua o solvato formado é um hidrato, quando o solvente é álcool, o solvato formado é um alcoolato. Hidratos são formados pela combinação de uma ou mais moléculas de água com uma das substancias em que a água mantém seu estado molecular como H2O, tal combinação sendo capaz para formar um ou mais hidrato.

[083] Deve ser observado que a estrutura de alguns dos compostos da invenção incluir átomos de carbono assimétrico. Deve ser entendido consequentemente que os isômeros que se origina de tal assimetria (por exemplo, todos enantiômeros e diastereômeros) são incluídos dentro do escopo da invenção, a menos que indicado de outra forma. Tais isômeros podem ser obtidos em forma substancialmente pura pela técnica de separação clássica e pela síntese controlada es- tereoquimicamente. Enantiômeros (configurações de R- e S-) são no-meados de acordo com o sistema desenvolvido por R.S. Cahn, C. Ingold, e V. Prelog.

[084] Além disso, as estruturas e outros compostos discutidos na aplicação incluindo todos isômeros atrópicos destes. Isômeros atrópi- cos são tipos de estereoisômero em que os átomos de dois isômeros são dispostos diferentemente no espaço. Isômeros atrópico deve sua existência a uma rotação restrita causada por impedimento da rotação dos grupos grandes cerca de uma ligação central. Tais isômeros atró- pico tipicamente existem como uma mistura, entretanto como um re-sultado de avanços recente em técnicas de cromatografia, tem sido possível a misturas separadas de dois isômeros atrópico em casos selecionado.

[085] “Composto estável” e “estrutura estável” são pretendidos para indicar um composto que é suficientemente saudável para sobreviver isoladamente para um grau útil de pureza de uma mistura de reação, e formulação de um agente terapêutico eficaz.

[086] Como empregado aqui, o termo "analógico" se refere a um composto químico que é estruturalmente similar a outro, porém é um pouco diferente na composição (como na substituição de um átomo por átomo de um elemento diferente, ou na presença de um grupo funcional particular, ou a substituição de um grupo funcional por outro grupo funcional). Desse modo, um analógico é um composto que é similar a ou comparável na função e aparência para o composto de referência.

[087] Tal como definido aqui, o termo "derivados", por exemplo, no termo "derivados dos ácidos biliares", refere-se a compostos que têm um núcleo comum estrutura do anel de 4 membros, e são substituídas com vários grupos, como descrito aqui.

[088] O termo "bioisosteres" refere-se a um composto resultante da permuta de um átomo ou de um grupo de átomos com outro, am-plamente similar, átomo ou grupo de átomos. A substituição bioisosté- rico pode ser baseado fisicoquimicamente ou topologicamente. Exemplos de bioisosteres de ácido carboxílico incluem sulfonimidas acila, sulfonatos tetrazóis, e fosfatos. Veja, por exemplo, Patani e LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176 (1996).

[089] "Terapia de combinação" (ou "co-terapia") inclui a administração de um composto da invenção e pelo menos um segundo agente, como parte de um regime de tratamento específicos pretendido a fornecer o efeito benéfico da co-ação destes agentes terapêuticos (isto é, os compostos da invenção e pelo menos um segundo agente). O efeito benéfico da combinação inclui, porém não são limitados a, coação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração desses agentes terapêuticos em combinação tipicamente é realizada durante um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada). "A terapia de combinação" pode, porém geralmente não é, pretendido para abranger a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos, como parte de regimes de monoterapia separado que resulta incidentalmente e arbitrariamente nas combinações da presente invenção. "A terapia de combinação" é pretendida a abranger administração desses agentes terapêuticos de uma forma sequencial, ou seja, onde cada agente terapêutico é administrado em um diferente momento, assim como a administração destes agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, em uma forma substancialmente simultânea. Administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, pela administração ao paciente uma única cápsula, tendo uma taxa fixa de cada agente terapêutico ou em cápsulas única, várias para cada um dos agentes terapêuticos. Administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer apropriada, incluindo rotina, porém não limitado a, rotina oral, rotina intravenosa, rotina intramuscular, e absorção direta através dos tecidos das membranas mucosas. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma rotina ou por rotinas diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção intravenosa ao mesmo tempo em que os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados oralmente. Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados oralmente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção intravenosa. A sequência em que os agentes terapêuticos são administrados não é estreitamente crítica.

[090] "Terapia de combinação" também abrange a administração dos agentes terapêuticos, como descrito acima, em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos e terapias não me-dicamentosas (por exemplo, tratamento cirúrgico ou mecânico). Quando a terapia de combinação também compreende um tratamento não medicamentoso, o tratamento não medicamentoso pode ser realizado a qualquer momento adequado, enquanto um efeito benéfico da coação da combinação dos agentes terapêuticos e de tratamento não medicamentoso é alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico ainda é alcançado quando o tratamento não medica-mentoso é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.

[091] Os termos "administração parenterais" e "administrados pa- renteralmente", como empregado aqui se refere a formas de adminis-tração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção e inclui, sem limitação, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperi toneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsu- lar, subaracnóideo, intraespinhal e injeção intrasternal e infusão.

[092] A "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto da invenção, ou uma combinação de compostos é uma quantidade (quan-tidade ou concentração) de composto ou compostos. Em uma modali-dade, quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto é administrada a um paciente em necessidade de tratamento dos sintomas originando-se da doença são melhorados imediatamente ou após a administração do composto um ou mais vezes. A quantidade do composto a ser administrada a um paciente dependerá do distúrbio particular, o modo de administração, compostos co- administrados, se houver, e as características do paciente, tal como a saúde geral, outras doenças, idade, sexo, genótipo, peso corporal e tolerância às drogas. O versado artesão será capaz de determinar a dosagem adequada dependendo desses e outros fatores.

[093] O termo "quantidade profilaticamente eficaz" significa uma quantidade (quantidade ou concentração) de um composto da presente invenção, ou uma combinação dos compostos, que é administrado para prevenir ou reduzir o risco de uma doença - em outras palavras, uma quantidade necessária para fornecer um efeito preventivo ou profiláctico. A quantidade do composto presente para ser administrado a um paciente dependerá do distúrbio particular, o modo de administração, os compostos co-administrados, se houver, e as características do paciente, tal como saúde geral, outras doenças, idade, sexo, genó- tipo, peso corporal e tolerância às drogas.

[094] O termo "redução do risco de", como empregado aqui, significa reduzir a probabilidade de uma doença do sistema nervoso central, doenças inflamatórias e/ou doença metabólica ocorrendo em um paciente, especialmente quando o paciente ou individuo é predisposto a tal ocorrência.

[095] O "sal" de um composto da invenção é um produto do composto que contém uma ligação iônica e produzido tipicamente pela reação do composto com um ácido ou uma base.

[096] O "sal farmaceuticamente aceitável" é um sal adequado para administração a um paciente.

[097] A "composição" é uma formulação contendo um composto da invenção em uma forma adequada para administração a um paciente. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é em forma de dosagem unitária ou volume. A forma de dosagem unitária é qualquer de uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, uma cápsula, uma bolsa IV, um comprimido, uma única bomba em um inalador em aerossol, ou um frasco. A quantidade de ingrediente ativo (por exemplo, uma formulação de um composto da invenção ou sais destes), em dose unitária da composição é uma quantidade eficaz e é variado de acordo com o tratamento envolvido particular. Alguém versado na técnica observará que às vezes é necessário fazer rotina de variações para a dosagem, dependendo da idade e da condição do paciente. A dose também dependerá da rotina de administração. Uma variedade de rotinas são consideradas, incluindo oral, pulmonar, retal, parenteral, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, e outros. As formas de dosagens para administração tópica ou transdérmica de um composto desta invenção incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalan- tes. Em outra modalidade, o composto ativo é misturado em condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável, e com conservantes, tampões, ou propulsores que são requeridos.

[098] O termo "dose flash" refere-se a formulações de compostos que são rapidamente dispersando nas formas de dosagens.

[099] O termo "libertação imediata" é definido como uma liberação de compostos de uma forma de dosagem em um período relati- vamente breve de tempo, geralmente até cerca de 60 minutos. O termo "libertação modificada" é definido para incluir liberação atrasada, liberação prolongada e liberação pulsada. O termo "libertação pulsada" é definido como uma série de liberação de drogas de uma forma de dosagem. O termo "liberação sustentada", ou "liberação prolongada" é definido como a liberação contínua de um composto de uma forma de dosagem durante um período prolongado.

[0100] Um "paciente" inclui mamíferos, por exemplo, seres humanos, animais de companhia (cães, gatos, pássaros, e outros), animais de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos, aves, e outros) e animais de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, cobaias, aves e outros). Tipicamente o paciente é humano.

[0101] Compostos da invenção também incluem pró-drogas ou derivados fisiologicamente equivalentes. A "pró-droga" ou "derivados fisiologicamente equivalentes” incluem uma forma precursora da droga que é metabolicamente convertido in vivo para produzir a droga ativa. A invenção adicional contemplar o uso de pró-droga que são convertidos in vivo para os compostos de modulação TGR5 empregados nos métodos da invenção (veja, por exemplo, R. B. Silverman, 1992, "The Organic Chemistry Of drug Design and Drug Action", Academic Press, Chp. 8). Tais Pró-drogas podem ser empregadas para alterar a biodis- tribuição (por exemplo, para permitir os compostos tipicamente não atravessa a barreira hematoencefálica para atravessar a barreira he- matoencefálica) ou a farmacocinética do composto de modulação TGR5. Por exemplo, um grupo aniônico, por exemplo, um carboxilato, sulfato ou sulfonato, pode ser esterificado, por exemplo, com um grupo alquila (por exemplo, um grupo metila) ou um grupo fenila, para produzir um éster. Quando o éster é administrado a um paciente, o éster é clivado, enzimaticamente ou não enzimaticamente, redutivamente ou hidroliticamente, para revelar os grupos aniônicos. Tal um éster pode ser cíclico, por exemplo, um sulfato cíclico ou sulfona, ou duas ou mais porções aniônicas podem ser esterificados através de um grupo de ligação. Um grupo aniônico pode ser esterificado com porções (por exemplo, ésteres aciloximetil), que são clivadas para revelar um com-posto de modulação TGR5 intermediária que decompõe subsequen-temente para produzir o composto de modulação TGR5 ativo. Em uma modalidade, a pró-droga é uma forma reduzida de um carboxilato, sulfato ou sulfonato, por exemplo, um álcool ou tiol, que é oxidado in vivo para o composto de modulação TGR5. Além disso, uma porção aniô- nica pode ser esterificada a um grupo que é transportado ativamente in vivo, ou que é seletivamente absorvido pelos órgãos alvo.

[0102] O termo "modulador TGR5", significar qualquer composto que interage com o receptor TGR5. A interação não é limitada a um composto que atua como um antagonista, agonista, agonista parcial ou agonista inverso dos receptores TGR5. Em um aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um antagonista do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um agonista do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da pre-sente invenção atuam como um agonista parcial do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um agonista inverso dos receptores TGR5. O perfil de um ligante, tradicio-nalmente, endógena ou sintética, é caracterizado por sua eficácia intrín-seca ‘e’ originalmente descrito por Furchgott, em 1966. Empregado para expressar o grau em que os ligantes diferentes produzem respostas bio-lógicas variando ao mesmo tempo em que ocupando o mesmo número de receptores. Geralmente, o termo "agonista" significar um composto que aumenta a atividade de outra molécula ou sítio de receptor. Um agonista, por definição clássica, se um ortostérico, alostérico, inverso, ou um co-agonista tem uma propriedade de se ligar ao receptor, alterar seu estado receptor e resultar em uma ação biológica. Por conseguinte, agonismo é definida como uma propriedade de um agonista ou um li- gante para produzir uma ação biológica. Em contraste com isso, um "antagonista" é essencialmente um agonista com alta afinidade ao mesmo receptor macromolécula, porém com muito menos ou eficácia intrínseca insignificante, e desse modo estericamente impede a ação biológica de um agonista. Como uma propriedade, o antagonismo pode ser funcional ou fisiológico, onde um agonista tem uma competição direta para o sítio de receptor em efeitos opostos e precedente através de um sistema mensageiro-receptor diferente no último. Mais especificamente, um agonista TGR5 é um ligante do receptor ou composto que liga o TGR5 e aumenta a concentração de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em pelo menos 20% em células expressas o receptor. "Por consequente, um antagonista TGR5 será um composto que antagoniza ou bloqueia a atividade de um agonista, desse modo, efetuar uma redu-ção na concentração de AMPc.

[0103] A presente invenção refere-se a compostos tendo atividade de modulação de receptor TGR5 e seu uso para tratar e prevenir doenças metabólicas tal como obesidade e sensibilidade à insulina.

[0104] Um composto da invenção é mostrado abaixo.

[0105] Todas as publicações e documentos de patentes citados aqui são incorporados aqui por referência como cada publicação ou documento foi indicado especificamente e individualmente para ser incorporados aqui por referência. A citação de publicações e documentos de patentes não é pretendido como uma admissão que qualquer é técnica pertinente, nem constitui qualquer admissão quanto ao teor ou dados do mesmo. A invenção tendo sido descrita por meio de uma descrição escrita, aqueles versados na técnica reconhecer que a in- venção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição anterior e exemplos abaixo são para propósitos de ilustração e não limitação das reivindicações que segue. EXEMPLO 1: Síntese dos Moduladores TGR5

[0106] Os compostos da invenção e derivados relacionados podem ser sintetizados por métodos conhecidos por alguém versados na técnica. Síntese de sal de sódio ácido 3α, 7α, 16β-triidr0xi-6α-etil-5β- cholano-24-óico (10)

Reagente e condições: a) MeOH, pTSA, ultrassom, 30°C, 2h, 93%. b) Ac2O, NaHCO3, THF, refluxo, 12h, 99%. c) 1.3-I-ácido benzóico, (COCl)2, CH2CI2, rt, 1h. 2. CaH2, BnEfeN+CF, tolueno, refluxo, 48h, 80%. d) PhICl2, tBuOH, CH2CI2, hv, 0°C, 1h, 91%. e) Piridina, refluxo, 12h, 64%. f) 1. BH3THF, rt, 2h. 2. H2O2, NaOHacq, de 0°C a rt, 3h. 3. KOH, MeOH, tolueno, refluxo, 12h. 47%. g) 1. Reagente Jones, acetona, de 0°C a rt, 2h. 2. pTSA, MeOH, ultrassom, 30°C, 2h. 55%. h) tBuNH2BH3, CH2Cl2, rt, 24h, 40%. i) NaOH, MeOH, rt, 3h, 82%. Produção global: 3.6%. Metil 3α, 7α-diidr0xi-6α-etil-5β-cholano-24-oato (2)

[0107] Para uma solução de 1 (4,1 g, 9,76 mmol) em metanol (120 ml) pTSA (0,41 g, 2,15 mmol) foi adicionado e a mistura foi sonicado a 30°C durante 2 h. O solvente foi evaporado sob a pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em CHCl3 (150 ml), lavado com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2x100 ml), água (100 ml) e salmoura (100 ml). A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura para permitir o éster 2 metil (3,95 g, 9,1 mmol, 93% l) como sólido branco que foi empregado para a etapa seguinte, sem purificação adicional. Metil-3a-acet0xi-7a-hidr0xi-6a-etil-5β-cholano-24-oato (3)

[0108] Para uma solução de 2 (3,9 g, 8,98 mmol) em THF recentemente destilado (100 ml) de anidrido acético (15,29 ml, 161,75 mmol) e NaHCO3 (15,09 g, 179,72 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi refluxada durante a noite. A mistura foi resfriada em temperatura ambiente, diluído em água (120 ml) e extraída com EtOAc (3x80 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2x100 ml), salmoura (100 ml), seca sobre sulfato de sódio ani- droso e evaporada à secura sob pressão reduzida para obter o composto 3 acetilada desejado (4,25 g, 8,92mmol, 99%) como sólido branco que foi empregado para a próxima etapa sem purificação adicional. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,65 (3H, s, 18-CH3), 0,84-0,93 (9H, m, 19-CH3 + 21-CH3-21, 26-CH3), 1,11-1,91 (26H, m), 2,00 (3H, s, 3- CHOC(O)CH3), 2,28-2,36 (2H, m), 3,65 (3H, s, COOCH3), 3,70 (1H, bs, 7-CH), 4,48-4,59 (1H, m, 3-CH). Metil 3α-acetoxi-6α-etil-7α-(3'-iodobenzoil) oxi-5β-cholano-24-oato (4)

[0109] Ácido 3-Iodobenzóico (3,93 g, 15. mmol) foi suspensa em CH2Cl2 (30ml) e tratado com cloreto de oxalila (3,21 ml, 36,1 mmol) na presença de 2 gotas de DMF em temperatura ambiente até a mistura tornar-se dissolvida (cerca de 1 h). Voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o cloreto acilco desse modo obtido foi dissolvido em 150 ml de tolueno e foi adicionada a uma solução agitada de 3 (4,2 g, 8,82mmol) em tolueno (150 ml). Para a solução acima, CaH2 (2,66 g, 63,5 mmol) e BnEt3N+Cl-(0,5 g, 2,2 mmol) foram adicionados, e a mistura foi refluxada durante 48 h. A mistura de reação foi então resfriada em temperatura ambiente, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi suspenso em CHCl3 (200 ml) e filtrado. O filtrado orgânico foi lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (2x100 ml), água (100 ml), salmoura (100 ml), seca com sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura. O resíduo foi purificado por cro- matografia flash empregando 5 a 10% de EtOAc em éter de petróleo para produzir 3,54 g (5,01 mmol, 57%) de 4 e 1,23g (2,58 mmol) de material não reagido iniciados (produção de conversão de 80%). 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,67 (3H, s, 18-CH3), 0,88-0,92 (6H, m, 21-CH3, 26-CH3), 1,13-1,32 (15H, m), 1,7-1,74 (5H, m), 1,89-1,91 (5H, m), 2,05 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 2,18-2,30 (2H, m), 3,63 (3H, s, CO- OCH3), 4,60-4,62 (1H, m, 3-CH), 5,41 (1H, bs, 7-CH), 7,23 (1H, dd, J1 = 6,5Hz, J2= 6,7 Hz, 5’-H ), 7,94 (1H, d, J= 6,7 Hz, 4’-H), 8,04 (1H, d, J= 6,5 Hz, 6’-H); 8,37 (1H, s, 2’-H). 13C-NMR (CDCl3) δ: 11,6, 11,7, 18,2, 20,7, 21,7, 22,2, 23,1, 23,9, 26,8, 27,9, 29,6, 30,8 (x2), 34,4, 35,1 (2x), 35,5, 39,2, 39,3, 41,3, 42,9, 44,6, 50,6, 51,4, 55,3, 74,2, 74,5, 93,9, 128,9, 130,1, 132,4, 138,6, 141,6, 164,5, 170,3, 174,6. Metil 3α-acetoxi-6α-etil-7α-(3'-iodobenzoil)oxi-17a-cloro-5β-cholano- 24-oato (5)

[0110] Para uma solução de 4 (3,5 g, 4,95 mmol) em CH2Cl2 (280 ml) contendo 0,3 M tBuOH (8,2 ml), dicloroiodobenzeno (3,38 g, 12,4 mmol) foi adicionado. A mistura foi desoxigenada durante 3 min por borbulhamento seco N2. Então a mistura foi fotolizada a 0°C empregando uma lâmpada de tungstênio (200 W) durante 1 h. O solvente foi então evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi rapidamente purificado por cromatografia flash eluição com éter de petróleo/EtOAc (8:2, v/v) para produzir 3,35 g (4,52 mmol, 92%) dos derivado 5 17- cloro como sólido branco. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,81 (3H, s, 18-CH3), 0,91 (3H, d, J= 7,3 Hz, 21-CH3), 1,0 (6H, m, 19- CH3 + 26-CH3), 1,12-1,93 (24H,m), 2,03 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 2,18-2,25 (2H, m), 3,65 (3H, s, COOCH3), 4,57-4,62 (1H, m, 3-CH), 5,40 (1H, bs, 7-CH), 7,22 (1H, t, J = 7,79 Hz, 5’- H), 7,91 (1H, d, J = 7,76 Hz, 4’-H), 8,02 (1H, d, J = 7,7 Hz, 6’-H), 8,38 (1H, s, 2’-H). 13C-NMR (CDCl3) δ: 11,6, 14,4, 14,5, 20,7, 21,6, 22,2, 23,1 (x2), 26,7, 28,6, 29,4, 31,7, 34,2 (x2), 35,1, 35,4, 39,6, 40,4, 41,1, 41,3, 44,6, 45,2, 49,9, 51,5, 74,1, 74,4, 92,9, 93,9, 128,8, 130,1, 132,3, 138,6, 141,7, 164,9, 170,7, 174,1. Metil A16 3α-acet0xi-6α-etil-7α-(3'-iodobenzoil) oxi-5β-cholano-24-oato (6)

[0111] O derivado 5 17-cloro (3,3g, 4,46mmol), foi dissolvido em piridina seca (130 ml) e refluxo durante a noite. O solvente foi então evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por croma- tografia flash eluição com éter de petróleo/EtOAc 8:2 para produzir 2,24 g (3,18 mmol, 72%) da olefina desejada como sólido branco. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,75 (3H, s, 18-CH3), 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz, 21-CH3), 0,98 (3H, t, J = 6,5 Hz, 26-CH3), 1,03 (H, s, 19-CH3), 1,11-2,02 (22H,m), 2,05 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 2,22- 2,30 (2H, m), 3,65 (3H, s, COOCH3), 4,58-4,62 (1H, m, 3-CH), 5,20 (1H, bs, 7-CH), 5,51 (1H, s, 16-CH), 7,21 (1H, t, J = 7,9 Hz, 5’-H), 7,90 (1H, dt, J1 = 7,9 Hz, J2 = 1,1 Hz, 4’-H), 8,02 (1H, dt, J1 = 7,9 Hz, J2 = 1,1 Hz, 6’-H), 8,37 (1H, t, J = 1,3 Hz, 2’-H). 13C-NMR (CDCl3) δ: 11,6, 15,9, 20,6, 21,7, 21,8, 22,1, 23,1, 26,7, 29,6, 30,9, 31,1, 31,7, 32,2, 34,5, 34,9, 35,0, 35,7, 37,9, 41,3, 44,8, 47,5, 51,4, 51,7, 74,1, 74,7, 93,9, 121,4, 128,9, 130,1, 132,3, 138,6, 141,7, 158,5, 164,6, 170,7, 174,4. 3α, 7α, 16α, 24-tetraidr0xi-6α-etil-5β-cholano (7)

[0112] As olefinas 6 (0,3 g, 0,42 mmol) foi dissolvidas em BH3-THF (10,6 ml 1M em THF) a 0°C e então agitada em temperatura ambiente durante 2 h. Após este tempo, a reação foi resfriada a 0°C e uma mistura de 4M aquosa NaOH (20 ml) e H2O2 (20 ml) foi adicionado gota a gota, e a mistura resultante foi agitada a essa temperatura durante 3 h. A reação foi acidificada com 1N HCl e extraída com CH2Cl2 (3x60 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas com sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi dissolvida em tolueno (52 ml), 5% KOH em MeOH (7 ml) foi adicionado e a mistura resultante foi refluxo durante a noite. O solvente foi removido sob a reduzir a pressão, o resíduo foi dissolvido em água (25 ml) e extraída com EtOAc (3x30 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas com sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash eluição com EtOAc/EtOH (95:5, v/v) para produzir 0,085 g (0,2 mmol, 47%) dos tetrol desejado como sólido branco. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,64 (3H, s, 18-CH3), 0,85-0,91 (6H, m, 19-CH3 + 26-CH3), 0,92 (3H, d, J = 6,4 Hz, 21-CH3), 1,21-1,91 (21H,m), 3,33-3,35 (1H, m, 3-CH), 3,54-3,61 (3H, m, 7-CH + 24-CH2), 3,94 (1H, bs, 16-CH). 13C-NMR (CDCl3) δ: 11,7, 13,1, 14,1, 18,8, 20,4, 21,9, 22,4, 23,1, 28,7, 30,4, 31,8, 33,1, 33,5, 34,0, 35,4 (x2), 35,5, 35,8, 39,5, 39,9, 41,3, 43,9, 45,3, 47,4, 62,6, 66,1, 70,6, 72,0. Metil-3,7,16-trioxo-6α-etil-5β-cholano-24-oato (8)

[0113] O reagente de Jones (2 ml) foi adicionado gota a gota a uma solução agitada do tetrol 7 (0,19 g, 0,45 mmol) em acetona (25 ml) a 0°C e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. Metanol (8 ml) foi então adicionada e o produto oxidado foi extraída com EtOAc (2x50ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas com sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura sob pressão re-duzida. O resíduo foi dissolvido em MeOH (80 ml), pTSA foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O solvente foi evaporado sob a pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em CHCl3 (50 ml), lavado com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2x50 ml), água (50 ml) e de salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash empregando de 20 a 30% EtOAc em éter de petróleo para permitir o éster metil 8 (0,115 g, 0,26 mmol, 58% l) como sólido branco. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,82 (3H, s, 18-CH3); 0,85 (3H, m, 26- CH3); 1,0 (3H, d, J= 6,5 Hz, 21- CH3); 1,37 (3H, s, 19-CH3); 1,55-2,35 (23H,m); 2,63-2,87 (2H, m). Metil 3α, 7α, 16β-tridr0xii-6α-etil-5β-cholano-24-oato (9)

[0114] Para uma solução do éster triceto 8 (0,1 g, 0,22 mmol) em CH2Cl2 (8 ml) complexo de terc-butilamina-borano (0,1 g, 1,12 mmol) foi adicionado e a reação foi refluxada durante a noite. A reação foi resfriada em temperatura ambiente 3N HCl foi adicionado e a mistura resultante foi agitada durante 30 min. A camada orgânica foi separada, lavada com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (10 ml), água (10 ml), foi seca com sulfato de sódio anidroso e evaporada à secura. O resíduo, em que o 7-cetona não foi reduzida, foi dissolvido em uma mistura de 1:4 v/v de H2O/THF (5 ml) e NaBH4 foi adicionado a 0°C. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 min, então a água (5ml) e 3N HCl (5 ml) foram adicionados. A mistura foi extraída com EtOAc (4x30 ml), as camadas orgânicas combinadas foram secas com sulfato de sódio anidro e evaporada à secura sob pressão reduzida. O resíduo, que consiste de pelo menos 2 componentes, foi purificado por cromatografia flash, empregando de 1 a 4% MeOH em CHCl3 para produzir 0,036g (0,08 mmol, 36%) do composto 9 desejado. 1H-NMR (Acetona-d6) δ: 0,87-0,90 (6H, m, 18-CH3 + 26- CH3), 0,92 (3H, s, 19-CH3), 0,98 (3H, d, , J = 6,4 Hz, 21-CH3), 1,19-1,58 (10H, m), 1,75-2,05 (7H, m), 2,34-2,41 (2H, m) 3,28-3,30 (1H, m, 3-CH), 3,62 (3H, s, COOCH3), 3,64 (1H, bs, 7-CH), 4,37 (1H, bs, 16-CH). 13C-NMR (Acetona-d6) δ: 11,1, 12,5, 17,4, 20,4, 22,3, 22,8, 30,1, 30,4, 30,5, 30,6, 33,1, 33,7, 35,4, 35,6 (x2), 39,7, 40,0, 41,6, 42,2, 45,7, 48,3, 50,8, 61,7, 69,5, 71,3, 71,4, 174,8. Sal de sódio de ácido 3α, 7α, 16β-triidr0xi-6α-etil-5β-cholano-24-0ico (10)

[0115] O éster 9 (35 mg, 0,08 mmol) foi dissolvido em 8 ml de Na- OH de 5% em NaOH e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, o sólido resultante foi em uma mistura de H2O/CH3OH (1:1) e purificado por cromatografia em fase reversa (coluna RP-18 lobar A) empregando uma mistura de CH3OH/H2O (de 5:5 de 7:3) como fase móvel, para permitir o sal 10 de sódio desejado (15 mg, 0,03 mmol, 43%). 1H-NMR (CD3OD) δ: 0,86 (3H, s, 18-CH3), 0,88-0,93 (6H, m, 19-CH3 + 26-CH3), 0,99 (3H, d, J = 6,4 Hz, 21-CH3), 1,06-1,41 (9H, m), 1,46-1,9 (11H, m), 1,97-2,04 (2H, m), 2,23-2,25 (2H, m), 2,30-2,35 (1H, m), 3,28-3,35 (1H, m, 3-CH), 3,67 (1H, bs, 7-CH), 4,49-4,52 (1H, m, 16- CH). 13C-NMR (CD3OD) δ: 12,0, 13,3, 18,7, 21,6, 23,5, 23,7, 29,5, 31,2, 31,3, 33,4, 34,4, 34,5, 35,3, 35,5, 36,6, 36,7, 41,2, 43,1, 43,4, 46,7, 63,8, 71,1, 73,2, 73,4. Exemplo 2: TGR5 In Vitro e Atividade FXR EXEMPLO2A: Ligação de Receptor TGR5 e FXR

[0116] A potência e eficácia dos compostos da invenção de receptores TGR5 é avaliada empregando ensaios in vitro. A Tabela 1 resu me a potência e eficácia de um composto da invenção em Receptores FXR e TGR5 Tabela 1.

[0117] Ensaio FRET (Detecção de níveis de AMPc intracelular).

[0118] O ensaio de ligação do receptor foi realizado através da medição do nível de AMP cíclico (cAMP) empregando ensaio FRET. Linhagens de células intestinais humanas (NCI-H716) foram semeadas em placas de 96 cavidades revestidos com 0,75 mg/ml Matrigel (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante antes do uso, com uma densidade de 12x103celulas/cavidades em DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS, 100units/ml de penicilina e sulfato de estreptomicina 100 μg/ml e cultivados durante 24 h, que permitir a adesão celular para o fundo da placa. As células foram lavadas duas vezes com PBS e meio foi pernutado por meio de ensaio cAMP [OP- TIMEM contendo 0,1% (w/v), BSA e 1 mM de 3-isobutil1-1-metilxantina (IBMX)]. Após a incubação durante 60 minutos a 37°C, as células foram tratadas com concentrações aumentada de composto 10 em tampão estimulação (5 mM HEPES, o, 1% BSA em HBSS pH 7,4) contendo o quelato de európio - Estreptavidina e o Flúor ALEXA 647 - anticorpo anti-AMPc conjugado (PerkinElmer) durante 1 hora em temperatura ambiente. O nível de AMPc intracelular foi determinada com kit de Lance (PerkinElmer). Ácido litocólico foi empregado como ligante de controle. Fator Z’ foi empregado para validar os ensaios. Curvas de regressão não linear, sem restrições, foram realizadas empregando quatro equações de parâmetro e GraphPad Prism Software (GraphPad Inc.), para obter os valores de EC50. Ensaio de peneira alfa

[0119] Atividade em FXR foi analisada empregando a tecnologia de peneira alfa em um ensaio de recrutamento de co-ativador. A peneira alfa é um ensaio químico com base em conta empregado para estudar as interações biomoleculares. A ligação de moléculas capturadas nas contas leva a uma transferência de energia de uma conta ao outro, ultimamente produzindo um sinal luminoso. Quando os parceiros de interação, a energia química é transferida de Doadores para Contas de Receptor e um sinal é produzido. Após a estimulação de ácidos biliares o GST-FXR-LBD interage com o peptídeo Src-1. Contas de receptor revestido de anti-GST foram empregados para capturar o GST- fusão FXR-LBD considerando que o peptídeo SRC-1 biotinilado foi capturado pelas contas doadoras de estreptavidina. Após a iluminação em 680 nm, a energia química é transferida de contas Doadoras para Receptor através do streptavidin-Donor/Src-1-Biotin/GSTFXR- LBD/Anti-GST-Receptor complexo e um sinal é produzido. O ensaio foi realizado em branco, de baixo volume, de 384 cavidades Optiplates (PerkinElmer), empregando um volume final de 25 μl contendo concentrações finais de 10 nM de purificação de proteínas GST alvo FXR- LBD, 30 nM biotinilado Src-1 peptídeo, 20 μg/ml contas de receptor anti-GST contas de receptor e 10 μg/ ml de contas de doadores es- treptavidina (PerkinElmer). O tampão de ensaio contendo 50 mM Tris (pH 7,4), 50 mM KCl, 0,1% BSA e 1 mM DTT. Os tempos de estimulação com um 1μl de ligantes (solubilizada em 100% DMSO) foram fixados em 30’ em temperatura ambiente. A concentração de DMSO em cada foi mantida em uma concentração final de 4%. Após a adição da mistura de detecção (receptor e contas doadoras), as placas foram incubadas no escuro durante 4 h em temperatura ambiente e, em se-guida, foram lidas com um analisador de microplaca Envision (Perki- nElmer). Curvas de resposta de dose foram realizadas em triplicata e fator Z’ foi empregado para validar os ensaios. Curvas de regressão não linear, sem restrições, foram realizadas empregando quatro equações de parâmetro e GraphPad Prism Software (GraphPad Inc.), para obter os valores de EC50. Cultura de Células, Transfecção e Ensaio de luciferase

[0120] Células HepG2 e HEK293T foram cultivadas em E-MEM e DMEM, respectivamente, ambos suplementados com 1% de penicili- na/estreptomicina, 1% de L-glutamina e 10% de soro fetal bovino. (gli-cose elevada) (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram cultivadas a 37°C em 5% de CO2. Todos os transfecções foram feitas empregando 5:02 Fugene HD reagente Transfecção (L) ao DNA (μg), respectivamente (Roche). Vinte e quatro horas antes da transfecção de células HEK293T ou HepG2 foram semeadas em uma placa de 96 cavidades em uma densidade de 10,000 ou 15,000 células/cavidades, respectivamente. Transfecções transientes foram realizadas com 100 ng de vetor repórter pGL4.29 [luc2P/CRE/Hygro] (Promega), 40ng de pGL4.74 (Renilla), como controle interno para eficiência de transfecção e 10 ng de plasmídeo de expressão pCMV-SPORT6-hTGR5. O NIH Mammlian Gene Collection clone MGC: 40.597 (Invitrogen). O vetor pGEM foi adicionado para normalizar a quantidade de DNA transfecta- do em cada ensaio (2 μg). Vinte e quatro horas pós-transfecção as células foram estimuladas com concentrações crescentes do composto de 10 durante 18 h. Culturas controle receberam veículo (0,1% DMSO) sozinho. As células foram então lisadas pela adição de 75 μl do reagente Luciferase Dual-Glo (Promega) e 75 μl de meio contendo célu- las/cavidades. A atividade luciferase de renilla foi medida pela adição de volume: volume de reagente Dual-Glo Stop & Glo e meio de cultura original. As atividades luciferase foram expressas como razão entre unidade luciferase e a unidade luciferase renilla. Cada ponto representa é a média dos ensaios em triplicado. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. 50% de concentração eficaz (CE50) e determinação da eficácia

[0121] A eficácia foi determinada pela porcentagem calculada de valor 10 μM LCA para estudo agonistas TGR5 e valor 10 μM CDCA para estudo agonista FXR, respectivamente. Após subtrair o valor médio do basal (tratados com veículo) condição, os valores foram aplicados a EC50 e/ou determinações eficácia. Cálculo do EC50 médio e comparação do EC50 entre diferentes compostos foram feitas após a transformação para logaritmos. EXEMPLO 2B: Ensaio de Expressão gênica TGR5 Alvo do Composto 10

[0122] O nível da expressão gênica ACC e AMPK em células NCI- H716 intestinais foi medido empregando compostos 10 e LCA como controle positivo. O nível de expressão de mRNA de TGR-5 genesalvo foi medido pelo Real-Time Polymerase Chain Reaction (Q- RTPCR). RNA total foi isolado (Aurum Total RNA Mini Kit BioRad) de NCI-H716 estimulada com 5 μM do composto 10 durante 18 horas. O RNA foi aleatoriamente reverso transcrito com ISCRIPT cDNA SYNTHESIS KIT (BioRad) em volume de 20 μl de reação. Dez modelos ng foi empregado em 20 μl da reação do volume final do Real-Time PCR contendo 0,3 μM de cada iniciador e 10 μL de 2X SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad). Todas as reações foram realizadas em tri- plicata e as condições de ciclagem térmica foram: 3 minutos a 95°C, seguido por 45 ciclos de 95°C durante 10 segundos e 60°C durante 30 segundos no instrumento iCycler iQ5 (BioRad, Hercules, CA). O valor médio das repetições de cada amostra foi calculado e expresso como ciclo limite (CT: número de ciclo em que cada reação de PCR alcança uma fluorescência pré-determinada limiar, dentro da taxa linear de todas as reações). A quantidade da expressão do gene foi então calculada como a diferença (ΔCT) entre o valor do CT da amostra para o gene alvo e o valor médio de CT que a amostra para o controle endógeno β2-Microglobulina. A expressão relativa foi calculada como a diferença (ΔΔCT) entre os valores ΔCT da amostra teste e da amostra controle (WT) para cada gene alvo. O valor de quantificação relativa foi expressa e mostra que 2-ΔΔCT. Todos os iniciadores foram designados abranger íntron empregando o software Beacon Designer em dados de sequência publicados do banco de dados do NCBI. Os resultados são mostrados na Figura 3. EXEMPLO 2C: Citotoxicidade In Vitro de Compostos 10 no Intestinal Humano e Linhagem de Células Hepáticas

[0123] A viabilidade celular foi medida empregando PerkinElmer ATP-Lite 1 STEP. ATP é um marcador de viabilidade celular porque está presente em todas as células metabolicamente ativas e a concentração diminui muito rapidamente quando as células sofrem necrose ou apoptose. As células humanas NCI-H716 ou HepG2 (1x104) foram semeadas em placa de 96 cavidades e estimulados com diluições de 10 vezes de 1 nM a 300 μM dos compostos 10 durante 4h a 37°C. As placas foram equilibradas em temperatura ambiente durante 10 minutos e 100 μl de ATP-Lite 1 STEP. Reagente foi adicionado a 100 μl de meio de cultura contendo células. Luminescência foi lida com Victor Light (PerkinElmer). O sinal experimental foi subtraído do fundo. O ta- moxifeno foi empregado como um controle positivo de citotoxicidade celular, ao mesmo tempo em que as células não tratadas como controle negativo. Os resultados são mostrados nas Figuras 4 e 5. EXEMPLO 3: Atividades Metabólicas de Compostos da Invenção em uma dieta-induzida em modelo de camundongo em obesidade

[0124] O objetivo do estudo é para definir os agonistas TGR5 (ácido oleanólico (OA) ou composto da invenção (por exemplo, um "composto de teste")) corrigir o desenvolvimento da obesidade e resistência à insuli-na associada in vivo. Para testar esta possibilidade, a OA/composto de teste é administrada via administração de alimentos, durante 16 semanas a camundongos machos C57BL6J que foram anteriormente submetidos durante 10 semanas a uma dieta rica em gordura. II- Protocolo

[0125] Em um estudo anterior, a OA foi observada como um ago- nista TGR5 seletivo que não causam aversão alimentar. Os animais tratados com uma dose de 100 mg / kg / dia de OA mostrado, entretanto, alguns sinais de toxicidade, enquanto uma dose mais baixa foi bem tolerada. Portanto, a OA é administrado na dose de 50 mg / kg / d no estudo.

[0126] Os estudos in vitro têm identificado os compostos da invenção como ligantes TGR5 potentes e seletivos. Não há problemas com a toxicidade são esperados com os compostos da invenção, que são administrados na concentração menor de ~50 vezes.

[0127] Para este estudo, 48 camundongos machos C57BL6J (5 semanas de idade) são divididos em dois grupos: um grupo de 24 (grupo 1, 2 e 3) os animais recebem dieta de comida que o outro grupo de 24 recebe uma dieta rica em gordura durante um período de 10 semanas (grupo 4,5 e 6). Os animais são então analisados durante um período de 16 semanas. Cinco grupos de 10 animais são designados como segue: 1: dieta de comida 2: dieta de comida + OA 50 mg / kg / dia: 3: dieta de comida + composto de teste por exemplo, 30 mg / kg / dia 4: dieta rica em gordura 5: dieta rica em gorduras + OA 50 mg / kg / dia 6: dieta rica em gordura + composto de teste por exemplo, 30 mg / kg / dia

[0128] Durante todo o estudo, o peso corporal e ingestão alimentar são monitorados duas vezes por semana.

[0129] Semana-2: A composição corporal é analisada, para todos os grupos, pela absorciometria de raios X de energia dual (dexascan).

[0130] Semana-1: Os níveis de soro de transaminase, glicose, tri- glicérides, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina são medidas em todos os grupos após um período de jejum de 12 horas e os camundongos são então colocados sobre as dietas indicadas (Dia 0).

[0131] Semana 2: Os níveis de soro de transaminase, glicose, tri- glicérides, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina são medidas em todos os grupos após um período de jejum de 12 h (dia 14).

[0132] Semana 4: tolerância à glicose é determinada submetendo todos os animais a um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT). Os animais são submetidos a jejum durante 12 horas antes deste teste. Gasto de energia noturna dos grupos 1, 4, 5 e 6 (dieta de comida, dieta rica em gordura e dieta rica em gordura OA / composto de teste são medidos por calorimetria indireta.

[0133] Semana 8: composição do peso corporal é novamente analisado por dexascan para todos os grupos. Os níveis de soro de transaminase, glicose, triglicérides, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina são medidas em todos os grupos após um período de jejum de 12 h (dia 56).

[0134] Semana 9: A atividade circadiana dos grupos 4, 5 e 6 (ca-mundongos alimentados com dieta rica em gordura) é estudada durante um período de 30 h.

[0135] Semana 10: Medição de pressão arterial e freqüência cardíaca é realizada em grupos de 4, 5 e 6.

[0136] Semana 11: A temperatura retal de todos os animais é me- dido em temperatura ambiente às 10:00 am.

[0137] Medida da atividade circadiana é realizada em grupos 1, 2, 3 e 4.

[0138] Semana 12: tolerância à glicose é analisada através da realização de um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) nos grupos 4, 5 e 6. Durante o IPGTT, o sangue também é coletado para analisar os níveis de insulina. Os animais estão em jejum 12 horas antes de estes testes.

[0139] As fezes são coletadas em todos os grupos durante um período de 24 horas e teor de lipídios fecais é medido.

[0140] Semana 16: Testes resfriados é realizado em todos os animais através da medição da temperatura corporal dos animais expostos a 4°C.

[0141] Três dias depois, os animais são sacrificados. No sacrifício, o sangue é coletado e analisado para: lipídios plasmáticos (TC, TG, HDL-C, FFAs); funções hepáticas (ALAT, ASAT, Pase alcalina, Y—GT), glicose e insulina; perfis de lipoproteínas de grupos selecionados de plasma (cromatografia de exclusão de tamanho).

[0142] Fígado, intestino delgado, tecidos adiposos (WAT e BAT), pâncreas, coração e músculos são coletados, pesados e mantidos por outras análises, incluindo: histologia padrão (coloração HE, coloração succinato desidrogenase, coloração óleo-vermelho-O e coloração das células morfologia); teor de lipídios tecido; microscopia eletrônica em BAT e músculo para analisar mitocôndrias; RNA de isolamento para estudos de expressão de genes selecionados envolvidos no metabolismo e homeostase energética por RT-PCR quantitativo; extração de proteínas para o estudo de modificações pós-translationnal tal como acetilação de proteínas de interesse (por exemplo, PGC-1α). III- Os procedimentos detalhados A- Procedimento e dietas de animal Alojamento e manipulação de animais

[0143] Os camundongos são alojados em grupo (5 animais / gaiola), em condições específicas livres de patógenos, com um 12 h: 12 h (em 7:00), ciclo claro-escuro, em uma temperatura (20-22°C) e umidade controlada por viveiro, de acordo com as especificações da Comunidade Europeia. Animais são permitidos o acesso livre à água e alimentos. Água potável

[0144] A composição química da água da torneira é regularmente analisada para verificar a ausência de substâncias potencialmente tó-xicas no Instituto d'Hidrológicos, ULP, Estrasburgo. Água potável é tra-tada com HCl e HClO4 para manter o pH entre 5 e 5,5 e concentração clorina entre 5 e 6 ppm. Dieta

[0145] A dieta de comida para roedores padrões é obtida de UAR e a dieta rica em gordura é obtida de investigação da dieta. Os camundongos são alimentados, tanto com dieta de comida (16% de proteína, 3% de gordura, 5% de fibra, 5% de cinza) ou com dieta rica em gordura (20% de proteína, 20% de carboidrato, 60% de gordura). Ácido oleanólico e composto de teste foram misturados com dieta de comida em pó ou dieta rica em gordura em pó, nas seguintes proporções: 0,5 g de OA / kg de alimento para o tratamento de 50mg/kg/dia e 0,08 g de composto de teste /kg de alimentos para o tratamento de 10 mg / kg / dia. Os péletes são então reconstituídos. Os grupos de controle receber péletes do alimento sem composto de teste ou OA. Devido à consistência da dieta rica em gordura, a água não é adicionada à mistura com OA. No caso da dieta de comida, que é mais resistente para reconstituir, uma quantidade mínima de água é adicionada ao pó para reconstituir péletes, que são então secas ao ar. Novas bateladas de alimentos são preparadas semanalmente. Coleta de sangue

[0146] O sangue é coletado do seio retro-orbital, sob anestesia ou da veia da cauda. Anestesia

[0147] Para o experimento de varredura dexa, os animais são anestesiados com uma mistura de cetamina (200 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) administrado por injeção intra-peritoneal.

[0148] Para a venipunção, os animais são anestesiados por inalação de uma mistura de isoflurano-O2. B-Bioquímica

[0149] Os testes são realizados com uma estação de trabalho de laboratório automatizado Olympus AU-400, empregando reagentes comerciais (Olympus). Análise dos lípideos e lipoproteínas

[0150] Triglicérides de soro, total e colesterol HDL são determinadas por ensaios enzimáticos. Teor do colesterol HDL de soro são determinados após precipitação de lipoproteínas contendo apo B com ácido fosfotúngstico /Mg (por exemplo, a Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Nível de ácidos graxos livres é determinado com um kit de Wako (por exemplo, Neuss, Alemanha), como especificado pelo provedor. Metabólicos e exploração endócrinos

[0151] A concentração de glicose sanguínea é medida por um analisador QID Precision (por exemplo, sistema Medisense), empregando eletrodos Medisense Precis (por exemplo, Abbot Laboratories, Medisense products, Bedford, USA). Este método é validado, comparando os valores de precisão do analisador Q.I.D com medições de glicose clássica. A precisão do método Q.I.D, foi selecionado uma vez que requer uma quantidade mínima de sangue e pode, portanto, ser empregada para medições múltiplas, tais como durante uma IPGTT. Insulina plasmática (por exemplo, Mercodia, Uppsala, Suécia) é determinada por ELISA de acordo com as especificações do fabricante. Teste C-Metabólicas Perfis de lipoproteína

[0152] Perfis de lipoproteínas são obtidos por cromatografia líquida de proteína rápida, permitindo a separação das três classes principais de lipoproteínas VLDL, LDL e HDL. Teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) - teste de tolerância oral à glicose

[0153] IPGTT é realizado em camundongo que estão em jejum durante a noite (12 h). Camundongos são ou intraperitoneal injetado (IPGTT) com uma solução de 20% de glicose em solução salina estéril (0,9% NaCl) em uma dose de 2g de glicose / kg de peso corporal. O sangue é coletado da veia da cauda, para monitora a glicose e insulina, antes de 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 min após a administração da solução de glicose. A área incremental da curva de glicose é calculada como uma medida da sensibilidade à insulina, enquanto os níveis de insulina correspondentes indicam reservas de secreção de insulina. O gasto energético

[0154] O gasto energético é avaliado através da calorimetria indireta pela medida do consumo de oxigênio com o aparelho Oxymax (por exemplo, Columbus Instruments, Columbus, OH) durante 12 h. Este sistema consiste em um circuito aberto com o ar entrando e saindo das gaiolas de plástico (um rato por gaiola). Animais são permitidos o acesso livre à comida e água. Uma medida de sensor CO2 e O2 muito precisam a diferença nas concentrações de CO2, em ambos os volumes de ar, que fornece a quantidade de oxigênio consumido em um período de tempo, dado que o fluxo de ar do ar de entrada na gaiola é constante. Os dados que sai do aparelho são processados em um computador conectado, analisados e mostrados em um arquivo do Excel exportáveis. Os valores são expressos em ml.kg-1.h-1, que é comumente conhecido como o VO2. Determinação do teor de gordura corporal por varredura de Dexa

[0155] As análises de Dexa são realizadas pela resolução de ultra elevada PIXIMUS Série Densitometer (0,18 x 0,18 milímetros pixels, GE Medical Systems, Madison, WI, USA). A densidade mineral óssea (BMD em g/cm2) e a composição corporal são determinadas empregando o software PIXIMUS (versão 1.4x, GE Medical Systems). D- Medição de pressão arterial e pulso não invasivos

[0156] O Visitech BP-2000 Blood Pressure Analysis System é um sistema cauda automatizada por computador que é empregado para realizar medições múltiplas em 4 camundongos acordados si-multaneamente sem intervenção do operador. Os camundongos são contidos em câmaras escuras individuais em uma plataforma aquecida com suas caudas introduzidas através de uma cauda. O sistema mede a pressão arterial através da determinação da pressão da cauda em que o fluxo sanguíneo para a cauda é eliminado. Um sensor fotoelétrico detectar o pulso do espécime. O sistema gera resultados que têm sido mostrados para corresponder estreitamente com a média da pressão intra-arterial medida simultaneamente na artéria carótida. Isso permite que os valores reprodutíveis de pressão arterial sistólica e taxa do batimento cardíaco a ser obtida. Isto requer treinamento dos animais para uma semana no sistema. E- Atividade de Circadiano

[0157] Atividade locomotora espontânea é medida empregando caixas individuais, cada composto com um piso deslizante, uma gaiola destacável, e equipado com captores de infra-vermelho permitindo a medição da atividade locomotora ambulatorial e traseiras. As caixas são ligadas a um computador empregando uma interface ele-trônica (por exemplo, Imetronic, Pessac, França). Camundongos são testados durante 32 horas para medir a habituação ao aparelho, como atividades noturnas e diurnas. A quantidade de água consumida é medida durante o período de teste empregando um lickome- ter automatizado. EXEMPLO 4: Propriedades Físico-Químicas Solubilidade em Água

[0158] Sólido BAs foram suspensas em 5 ml de 0,1 M HCl. As soluções saturadas, após a incubação e misturação suave durante uma semana, foram filtradas em um filtro Millipore (0,22 μpm) e a concentração de BA foi medido por HPLC-ESI-MS/MS empregando coluna C18 (150mm x 2mm i.d, 4μm) e fases móveis de água contendo 15mM de ácido acético pH 5 e acetonitrila. A taxa de fluxo foi de 150 μl / min. A aquisição de espectrometria de massa foi realizada no monitoramento de reação múltipla empregando a fonte ESI em ionização negativo. Solubilidade em água foi expressa em μmol / litro.

[0159] A solubilidade em água foi medida para as espécies protonadas insolúveis de ácidos biliares carboxilado em um pH 1. A solubilidade em água do composto 10 foi de 120 μM (veja Tabela 2).

[0160] A posição diferente de uma hidroxila (posições 16), nos compostos 10 reduzido ligeiramente a solubilidade em relação ao ácido cólico do ácido biliar triidróxi 3,7,12 convencional. A solubilidade em água aumenta com a elevação do pH e pH 7 do composto 10 foi altamente solúvel em água. Os dados da Tabela 2 mostra que o composto 10 análogo carboxilado, quando administrado na forma ácida permanece insolúvel no conteúdo gástrico em um pH baixo e entra em solução para formar o sal (aniônica), uma vez eliminada no duodeno, devido ao pH maior dos fluidos pancreáticos e duodenais. Na bile, o composto permanece em solução, eventualmente, formar micelas em concentrações elevadas. Tabela 2.

a WS: solubilidade em água refere-se a BA como a espécie protonada e, portanto, não avaliados para TCDCA e TUDCA que são altamente solúveis (hs). b CMC: Concentração Micelar Crítica determinado em solução em água 0,15 M NaCl. c ST CMC: Tensão superficial em CMC em solução em água 0,15 M de NaCl. d LogPA: 1-octanol-água coeficiente de partição dos ácidos biliares estudados como espécies ionizadas. *: Valores da literatura. Concentração micelar crítica (CMC)

[0161] A detergência isto é, a tendência para formar micelas foi avaliada para todas as moléculas carregadas, que são solúveis em água, sal de sódio (2 unidade até o pKa). A concentração micelar crítica (CMC) foi determinada pela tensão superficial (ST) medições empregando um método de pressão máxima da bolha que dá valores de tensão superficial ligeiramente afetada por impurezas potencial similar aos métodos estáticos. O tensiômetro foi um Sensadyne 6000 (Chem- Dyne Research Corp, Milwaukee, WI), equipado com duas sondas de vidro de 0,5 e 4,0 mm de diâmetro conectado a uma fonte de nitrogênio. A freqüência da bolha foi 1 bolha / segundo em água destilada a 26°C (P = 2,7 atm) e a calibração foi feita com água duplamente destilada e metanol. A tensão superficial de soluções de sais de sódio BA em NaCl 0,15 M foi medido em várias concentrações variando da taxa 0,10-50 mM. Os valores da tensão superficial foram plotados contra o logaritmo da concentração de sais biliares; as linhas de regressão correspondentes às duas partes da curva (fases monoméricas e micelar) foram calculadas empregando o método dos mínimos quadrados, e a intersecção das linhas foi tomado como o valor da CMC. As curvas de concentração vs ST o valor da tensão superficial na CMC (equilíbrio entre monômeros e espécies multímeros) também foi calculado, dando informações sobre o poder de detergência que está relacionado com o tamanho das micelas com capacidade de associar redução da tensão superficial.

[0162] O CMC foi avaliado por medições de tensão superficial em condições de equilíbrio não isto é, em condições que as impurezas afetam ligeiramente os resultados da tensão superficial (Figura 6). A Tabela 2 mostra os resultados. Composto 10 apresenta um CMC elevado com uma baixa tensão superficial diminuindo a capacidade que indica que este composto é um detergente moderado e as micelas têm um número muito baixo de agregação. A presença de um grupo hidro- xila na posição C-16 beta reduz a área hidrofóbica responsável por voltar para interação, que é para formar micelas e, portanto, as mice- las são detergentes pequenos e fracos. Esta propriedade confere à molécula uma baixa toxicidade, quando acumulado em um determinado fluído biológico ou órgão. Coeficiente de partição octanol / água

[0163] O coeficiente de partição octanol / água foi medida para moléculas em forma ionizada e, portanto, os análogos carboxi foram estudados em um pH relativamente elevado (8 a 9) para garantir a io-nização completa do grupo carboxila. O coeficiente de partição 1- Octanol/agua (log P) foi avaliado empregando um processo frasco agi-tado convencional. Os experimentos foram realizados em tamponado de solução de sal biliar 0,1 mM em pH 8 com tampão de fosfato 0,1 M para garantir a ionização completa do BA, os valores de log P refere- se ao BA, na forma ionizada, não para as espécies protonadas, e a concentração inicial de cada BA foi abaixo do seu valor próprio CMC. O tampão aquoso foi previamente pré-saturado com 1-octanol, 5 ml de 1-octanol pré-saturado com água foi então adicionada e as amostras foram deixadas para equilibra durante 2 semanas sob agitação contínua em temperatura ambiente. Após a centrifugação das duas fases foram cuidadosamente separados. A concentração de BA na fase de água foi medida por HPLC-ESI - MS / MS empregando uma coluna C18 (150mm x 2mm i.d, 4μm) e com água contendo 15 mM de ácido acético pH 5 e acetonitrila na fase móvel. A taxa de fluxo foi de 150 μal / min e a coluna foi mantida a 45°C. A aquisição de espectrometria de massa foi realizada no monitoramento de reação múltipla empregando a fonte ESI em ionização negativo.

[0164] A Tabela 2 mostra os resultados. O composto 10 carboxila- do com três grupos hidroxila nas posições 3α, 7α e 16β apresenta uma lipofilicidade ligeiramente superior em relação ao analógico CA, natural devido à presença de etil na posição C-6. A diferença é provavelmente devido à posição incomum do grupo hidróxi 16-beta, considerando que a posição 12-alfa não parece desempenhar um papel importante nas propriedades de detergência. Ligação à albumina

[0165] A extensão da ligação da albumina foi avaliada por diálise de equilíbrio em uma relação albumina BA fixa. Cada BA foi dissolvido em uma concentração de 100 μM em solução salina de soro albumina bovina salina 5% (pH 7,2) e deixados em repouso durante 24 horas a 25°C. Dois mililitros desta solução foi dialisada em sacos de celulose tendo um peso molecular de corte de 12,000-14,000 Dalton contra 25 ml de solução salina. O sistema foi equilibrado por agitação suavemente durante 72 horas a 25°C. As concentrações BA da solução dia- lisada (correspondente à fração de não ligação livre) e da solução de partida foram determinados com HPLC-ESI-MS/MS nas mesmas condições da análise anterior.

[0166] A porcentagem de ligação da albumina foi calculada da concentração BA inicial e da concentração de não ligação na fração dialisada. Os dados são reportados na Tabela 2.

[0167] A porcentagem de ligação do composto 10 é maior do que CA, como um resultado do grupo metil na cadeia lateral. Composto 10 apresenta uma ligação de albumina compatível com uma capturação hepática relativamente rápida, similar a ocorrência BA natural. EXEMPLO 5: Estabilidade metabólica in vitro em cultura de fezes humanas Estabilidade para as Bactérias Intestinais. 7a-desidroxilação.

[0168] Fezes humanas fresca Homogeneizada (500 mg) foram transferidas para frascos estéreis, para 5 mL de meio glicose de carne picada esterilizado (Scott Lab., Fiskville, RI) foi adicionado. BAs foram então adicionados em uma concentração final de 0,05 mM. Os frascos foram incubados a 37°C, em seguida, a 0, 1, 2, 4, 8 e 24 h após a adição do BA, a reação foi interrompida com 150 μL de KOH 30%. As amostras foram centrifugadas a 3500 rpm durante 10 min, do sobre- nadante da BA foram isoladas por extração em fase sólida C-18 e analisadas por TLC e HPLC-ES-MS/MS.

[0169] Cromatografia em camada delgada (TLC), utilizando sílica gel 0,25 mm de espessura placas (Merck, Darmstat, Alemanha), foi empregada como o primeiro teste de análise. O sistema de solvente empregado para a separação de BA conjugado foi composta de ácido propiônico / acetato de isoamila / água / N-propanol (3:4:1:2, v/v/v/v; solvente I), e que da BA não conjugada foi ácido acético / tetracloreto de carbono/ éter isopropílico / acetato de isoamila / água / N-propanol / benzeno (1:4:6:8:2:2, v/v/v/v/v/v; solvente II). Separados BA foram re-veladas com 5% de solução de etanol de ácido fosfomolíbdico.

[0170] Composto 10 foi muito estável quando incubados em culturas de fezes humanas e, mesmo após de 24 horas, mais de 85% do composto foi recuperado não modificado. Ao contrário a referência, quenode- soxicólico análogo natural (CDCA) apresenta um tempo de meia-vida de quase uma hora e após 8 horas de incubação foi quase metabolizado completamente (7-dehidroxilado) para formar o ácido litocólico. Além dis-so, após um longo tempo de incubação, a desidroxilação 7 e a formação intermediária de um oxo 7 derivado foi praticamente abolido. Estabilidade da cadeia lateral

[0171] De acordo com o primeiro resultados, a cadeia lateral não foi modificada pelas atividades enzimáticas da bactéria intestinal. Estes dados sugerem que a presença do grupo etil na posição C-6 protege o grupo 7-hidroxila para a oxidação ou remoção, por impedimento estérico. Alem disso, o composto 10 também é muito estável para o metabolismo da cadeia lateral. EXEMPLO 6: Secreção biliar e metabolismo do composto 10 em camundongos com fístula biliar após duodeno (id) e femoral (iv) administração Objetivo e Fundamento lógico

[0172] A modificação estrutural dos novos análogos BA pode afetar a captação hepática, transportes hepáticos e secreção e absorção intestinal. Portanto, o conhecimento da secreção biliar após uma ad-ministração iv e id juntos com seu metabolismo é um ponto chave na seleção de candidatos para estudos adicionais.

[0173] Para avaliar o modo e a eficiência da absorção intestinal, compostos 10 foi administrada por via intravenosa (infusão femoral) e oral (infusão duodenal) na mesma dose e sua taxa de secreção biliar foi avaliada em modelo de fístula biliar em camundongos. O efeito co- lerético em produção de bile também foi avaliado. As diferenças na área sob a curva (AUC) da secreção biliar vs tempo entre iv e id de conta de administração de sua absorção intestinal e dar informações sobre a sua biodisponibilidade. Além disso, o metabolismo hepático e intestinal também pode ser bastante diferente e, portanto, a secreção biliar do composto 10 e seus principais (intestinal) e metabólitos hepático foram determinados. Efeito colerético - Infusão duodenal

[0174] O modelo de camundongos de fístula biliar foi desenvolvido na Universidade de Bolonha instalações do laboratório. Os compostos foram administrados na dose de 1 μmol / kg / min (1 hora de infusão) para um grupo de camundongos através da infusão duodenal (id). Os camundongos têm uma fístula biliar para coletar amostras biliares em diferentes momentos, antes e durante a infusão. Para o experimento de infusão duodenal, 6 camundongos (250 ± 10 g) foram tratados. As amostras biliares foram coletadas a cada 15 minutos durante quatro horas. Além disso, três camundongos de controle foram tratados com solução salina nas mesmas condições de tempo e de amostragem (camundongos de controle duodenal).

[0175] Figura 7 mostra o fluxo biliar durante a amostra coletada (um animal). Inicio da infusão duodenal após 30 min de coleção biliar base e continua durante uma hora. Composto 10 não é colerético e o fluxo biliar é similar ao grupo controle. -Infusão intravenosa

[0176] Para os experimentos de infusão femoral, 6 camundongos (peso corporal, 250 ± 10 g) foram tratados com composto 10 em 1μmol / min / kg. Figura 8 mostra o fluxo biliar durante o estudo. A infusão femoral inicial após 75 minutos de estado estacionário e continua durante 60 min. As amostras biliares foram coletadas a cada 15 minutos durante quatro horas. Além disso, 3 camundongos foram tratados com solução salina nas mesmas condições de tempo e amostragem (camundongos de controle femoral).

[0177] O fluxo biliar durante a infusão iv de 3% BSA veículo salina (controle, n = 1) mantendo um valor variando de 40 a 80 μL / min / kg para o período total do experimento. Figura 8 relata o fluxo biliar após a infusão iv de CDCA como o composto de referência. Nenhuma diferença significativa com relação ao experimento de controle foi observada e a taxa de fluxo máximo foi ajustada ligeiramente maior do que caso controle (80 versus 70 μL/ min/ kg). Secreção biliar dos análogos administrados

[0178] As amostras biliares coletadas durante o iv e id experimentos foram analisados para determinar a secreção biliar de análogos de administração e seus metabólitos.

[0179] Análise de HPLC-ES-MS/MS. Pó cristalino puro de cada composto foi obtido do R. Pellicciari laboratory de Perugia. Soluções da matéria-prima em metanol a 1 mmol/ L (com a exceção do composto 10 a 350 mmol/ L) foi preparada e soluções de trabalho foram preparadas por diluição de volumes adequados da solução básica. Metanol e acetonitrila foi de pureza HPLC. A amônia foi de 30% e ácido acético foi de 99,8%. Todos os reagentes foram obtidos de Carlo Erba Reagents. Água HPLC foi preparada por um sistema Milli-Q. Preparação das amostras

[0180] Os camundongos de amostras biliares foram trazidas em temperatura ambiente, brevemente agitada, e diluído 1:100 v/v (amostras biliares ou infusão duodenal) e 1:100 ou 1:200 v/v (amostras biliares da infusão femoral) com 15 mM de tampão de acetato de amônio (pH = 5,0): acetonitrila = 70:30 (v/v). Solução Final foi transferida em frascos do auto amostrado, e 10 μL foi injetada na coluna cromatográfica. Métodos HPLC- ESI -MS/MS

[0181] Amostras de camundongos biliares foram analisadas por espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida (HPLC- MS/MS) empregando eletrovaporização (ESI) fonte em modo de ioni-zação negativa.

[0182] Para cromatografia líquida de um módulo de separação Waters Alliance 2695 juntamente com auto amostrado foi empregado. O auto amostrado foi mantido em 7°C. A separação foi realizada em coluna Synergi Hydro-RP C18 (150x2.0mm id, 4 μm de tamanho de partícula, protegido por uma SecurityGuard ODS 4x2,0mm id pré- coluna, ambos fornecidos de Phenomenex. Analisado foi eluída empregando 15 mM tampão de acetato de amônio (pH = 5,00) como fase móvel A e acetonitrila como fase móvel B. Fase móvel B foi aumentada de 30% a 64% em 10 min, então a 100% em 10 min, e mantida constante durante 10 min. Taxa de fluxo foi de 150 μL/ min e a coluna foi mantida a 45°C. O efluente da coluna foi introduzido em fonte ESI conectada a um espectrômetro de massa, triplos, quádruplos (Quattro LC, Micromass) operando em vários Monitoramento de Reação Multi- plo (MRM) modo de aquisição. Nitrogênio foi empregado como gás de nebulização de 90 L/h taxa de fluxo e como gás dessolvatação a 930 L / h. Bloqueio de fonte de íons e temperaturas e dessolvatação foram fixados, respectivamente, a 80°C e 180°C. voltagem capilar foi de 3,0 kV.

[0183] MassLynx versão do software 4.0 foi empregado para aquisição de dados e processamento. Além disso, empregando a espectro- metria de massa, ambos em MS único ou experimentos de configuração de tandem MS / MS foram realizadas para identificar metabólitos. Quantificação

[0184] Uma curva de calibração de 5 pontos foi preparada diariamente e injetadas em duplicata. Amostras de calibração foram obtidas no 0,1-25 μmol/L faixa de concentração preparado em fase móvel. Parâmetros da curva linear de calibração foram obtidos da plotagem da área do pico analisado versus concentração analisada empregando uma análise de regressão de mínimos quadrados (peso = 1/x2). Os coeficientes de correlação foram > 0,989. Farmacocinéticas (secreção biliar) dos análogos administrados: com-paração iv versus id

[0185] Os dados referem-se a taxa de secreção dos análogos re-cuperados em bile, como tal, após a infusão duodenal e femoral na dose de 1umol/Kg/min. Metabólitos menores ou principais são relatados mais tarde.

[0186] A Tabela 3 mostra os valores de concentração e secreção para o composto 10 obtido de uma coleta de amostra de camundongos biliares durante a infusão duodenal (1 h variando de 75 a 135 min). Tabela 3.

[0187] A Tabela 4 mostra valores de concentração e secreção para compostos 10 obtido de uma coleta de amostra de camundongos biliares durante a infusão femoral (1 h variando de 75 a 135 min). Tabela 4.

a_: não calculado b n.d.: não detectado

[0188] A secreção biliar do composto 10 após infusão iv não é eficiente e taxa máxima de secreção (Fig. 9). O composto é metabo- lizado para formar o conjugado de taurina e isso contribuírem para melhorar ligeiramente a sua recuperação. A secreção biliar após administração id é muito menor do que os experimentos iv sugerindo uma absorção intestinal fraco da molécula. Metabolismo hepático

[0189] Composto 10 suporta um metabolismo hepático, como ocorrência natural BA. Após a administração iv é secretado na bile como tal e, principalmente, conjugado com os metabolitos menores de taurina, tal como lactona e um metabolitos monoglicuronídeo tem sido também encontrado. Após a administração id da molécula é recuperado como tal e principalmente metabolizada para formar conjugada taurina. Figura 10a: Composto 10 e seus principais metabóli- tos identificados em bile empregando espectrometria de massa usando no experimento iv. Os dados são reportados como valores de área absoluta. Figura 10b: Exibição em zoom de Figura 10a.

[0190] Figura 10c: Composto 10 e seus principais metabólitos identificados em bile empregando espectrometria de massa no expe-rimento di. Os dados são reportados como valores de área absoluta.

[0191] Composto 10 é moderadamente hidrofílico com uma de- tergência baixa. A captação hepática é eficiente e também a absorção intestinal. O composto é secretado na bile, como tal, e principalmente como conjugado de taurina e a recuperação quase completa na bile. EXEMPLO 7: Toxicidade in vitro em células HepG2

[0192] Compostos da invenção foram avaliados para toxicidade in vitro empregando um ensaio de células HepG2. Citotoxicidade de célula HepG2 foi determinada através da monitorização ATP diminuir e apotosis de células HepG2 foi determinada através da monitorização de ativação da caspase-3. Os resultados são mostradas na Tabela 5. Citotoxicidade

[0193] A viabilidade celular foi medida empregando PerkinElmer ATP-Lite 1 STEP. ATP é um marcador para viabilidade celular, pois está presente em todas as células metabolicamente ativas e a concentração diminui muito rapidamente quando as células sofrem necrose ou apoptose. As células NCI-H716 ou HepG2 humanas (1x104) foram semeadas em placa de 96 cavidades e estimulados com diluições de 10 vezes de 1 nM a 300 μM dos compostos 10 durante 4h a 37°C. As placas foram equilibradas a RT durante 10 minutos e 100 μl de reagente ATP-Lite 1 STEP foi adicionado a 100 μl de meio de cultura contendo células. Luminescência foi lida com Victor Light (PerkinElemr). O sinal experimental foi subtraído do fundo. O tamoxifeno foi empregado como controle positivo de citotoxicidade celular, ao mesmo tempo em que o controle negativo foi a células não tratadas. Apoptosis

[0194] Caspases participam do controle molecular do apoptose e substrato de TruPoint caspase-3 permite um ensaio sensível, robusto e homogêneo de fluorescência resolvida com o tempo da atividade da caspase-3.

[0195] As células humanas Hepatócitos (HepG2) foram semeadas (1x104) em placas de 96 cavidades com meio HepG2 sem piruvato de sódio. As células foram estimuladas 4h a 37°C, com diluições de série do composto de teste de 1nM a 300 μM, em triplicado. Estaurosporina foi empregado como controle positivo de células apoptóticas. Os controles negativos foram: 1. Células não estimulados, 2. Médias sozinho sem células, 3. Células incubadas sem o substrato caspase. Tampão de lise e substrato de Caspase-3 foram adicionados às células e 1 hora e 24 horas após a fluorescência foi medida com EnVision. Necrose

[0196] A necrose celular foi analisada através da medição da liberação de Lactato DeHydroxegenase (LDH), das células necróti- cas empregando Promega CyTotox ONE homogeneous Membrane Integrity Assay. As células humanas hepatócito (1x104) foram semeadas em uma placa de 96 cavidades. Após 18 horas de incubação médio fresca sem Piruvato de sódio e soro livre foi substituído e compostos 10 foram adicionados em dose resposta de 0,1 μM a 500 μM. Triton 1% foi empregado como controle de liberação máximo de LDH. O tamoxifeno foi empregado como indutor de necrose. As células plaqueadas foram colocadas de volta na incubadora durante um período adicional de 4 horas. O sobrenadante foi transferido em uma placa nova e o mesmo volume de reagente CyTotox-ONE foi adicionado à placa. Após 1 h de incubação a fluorescência foi lido com leitora da placa EnVision multilabel com um comprimento de onda de excitação de 560 nm e uma emissão de 590 nm. Tabela 5. Toxicidade In Vitro em Células Hep G2

n.d, não detectac o EXEMPLO 8 Ensaios de Seletividade NR:

[0197] A seletividade dos compostos da invenção foi avaliada em-pregando métodos de ensaio conhecido na técnica. Especificamente, os métodos de ensaio, foram empregados os seguintes: FXR e LXR: Recrutamento co-ativador (peneira alfa); TGR5: níveis AMPc nível de linhagem de células intestinais humanas (NCI-H716); PXR: ensaio Concorrência de Ligantes (Ensaio de Ligação) CAR: Recrutamento co-ativador (Lanthascreen) Tabela 6 mostra os resultados desses ensaios. Ensaio co-ativador TR-FRET

[0198] Ensaio lanthascreen (Invitrogen) foi empregado para ensaio de seletividade nulear dos receptores. O kit de uso um anticorpo antiGST rotulado com térbio, um peptídeo co-ativador rotulado com fluo- resceína, e um domínio de ligação de ligante NR que é alvo com gluta- tiona-S-transferase (GST) em um formato de ensaio de leitura e mistura homogênea. Os ensaios foram realizados em placas de 384 micro- cavidades (PerkinElmer). A 20 μl de reação de ensaio total incluído 5 nM GST alvo NRs, 125 nM de peptídeo co-regulator, 5 nM de anticorpos anti-TB-GST alvo (térbio-anti-glutationa S transferase alvo), 5 mM DTT e concentração variando de compostos 10 no tampão de ensaio fornecidos pela Invitrogen. O controle negativo foi destituído dos compostos 10, porém contendo tudo outro contido no agonista bem. Após 1 hora de incubação no escuro, medições TR-FRET foram feitas no Envision. A taxa de emissão 520/495 foi plotada contra a variação de concentrações do ligante. Os dados foram analisados empregando GraphPad Prism empregando a equação da curva sigmoidal com de- clividade variável para obter valores de EC50. Tabela 6. Ensaio de seletividade NR

Outras Modalidades

[0199] Ao mesmo tempo em que a invenção tem sido descrita em conjunto com a descrição detalhada dos mesmos, a descrição anterior é pretendida a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definida pelo escopo das reivindicações anexadas. Outros aspectos, as vanta-gens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir. Ele será compreendido por aqueles versados na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas nele, sem se afastar do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações anexadas.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula C:

(C) ou um sal ou conjugado de glicina e taurina destes, em que: R2 é hidrogênio ou hidroxila; R4 é C1-C6 alquila não substituída; e R16 é hidroxila ou halogênio.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável do composto de Fórmula C.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula D:

(D) ou um sal ou conjugado de glicina ou taurina destes.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável do composto de Fórmula D.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula E:

ou um sal ou conjugado de glicina ou taurina destes.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que apresenta a Fórmula F:

(F) ou um sal ou conjugado de glicina ou taurina destes.

7. Composto, caracterizado pelo fato de que é o composto 10:

(10) ou um sal ou conjugado de glicina ou taurina destes.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é

9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado do grupo consistindo em:

ou um sal ou conjugado de glicina ou taurina destes.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o composto é

ou um sal ou conjugado de glicina ou taurina destes.

11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1, 3, 5 a 7, 9 e 10, caracterizado pelo fato de que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Uso de uma composição compreendendo o composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ca racterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de uma doença em um indivíduo.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada de doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças do fígado, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, doenças gastrointestinais e câncer.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado a um indivíduo oralmente, parenteralmente, intravenosamente ou topicamente.

16. Uso, de acordo com a reivindicação de 13 ou 14, carac-terizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.