BRPI0923530A2 - dispositivo de ensaio e método para realizar ensaios biológicos - Google Patents

Abstract

DISPOSIÇÃO DE ENSAIO E MÉTODO PARA REALIZAR ENSAIOS BIOLÓGICOS. A invenção refere-se a um dispositivo de ensaio multiplexado que compreende uma câmara de reação e vários conjuntos de microcarreadores codificados (2) em que a câmara de reação é um microcanal (1) e em que o movimento longitudinal dos microcarregadores (2) é restringido e em que os microcarreadores (2) possuem um formato em relação à geometria do multicanal (1) de modo que se tocarem e sem tocarem o perímetro do microcanal (1) sem se tocarem e sem tocarem o perímetro do microcanal (1) e são, de preferência, observáveis na câmara de reação. Ademais, a invenção proporciona um método para realizar um ensaio multiplexado baseado em microcarreadores que aprimora a transferência de massa, simplifica a preparação e a execução do ensaio e facilita a leitura de reações biológicas e a identidade de microcarreadores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVO : DE ENSAIO E MÉTODO PARA REALIZAR ENSAIOS BIOLÓGICOS". - Campo Técnico A presente invenção refere-se à tecnologia de ensaio na indús- triade ciências da vida e em particular à multiplexação aplicada em diagnós- ticos, pesquisa genômica e biologia molecular. A invenção utiliza técnicas e processos de tecnologia de microfabricação bem como de tecnologia de se- micondutores. Técnica Anterior Os ensaios biológicos permitem a detecção de moléculas-alvo em uma amostra biológica. Tipicamente, a detecção de moléculas-alvo é realizada utilizando superfícies sólidas (por exemplo, microarranjos ou fundo í de poços) ou estruturas nanocarreadoras ou microcarreadoras que são fun- a cionalizadas com as moléculas de detecção (ligantes) projetadas para se ligarem a alvos específicos.

Um desafio das técnicas de ensaio biológico é a aceleração da transferência de massa que ocorre durante um ensaio. O problema de trans- ferência de massa é adicionalmente exacerbado em ensaios multiplexados, onde múltiplas moléculas-alvo são exigidas simultaneamente em uma única amostra biológica visto que a densidade relativa de cada sonda é menor do que em um único ensaio.

Para superar as limitações de transferência de massa, configu- rações diferentes foram descritas para realizar os ensaios multiplexados em um microcanal, reduzindo assim a distância de difusão entre os alvos e as sondas. Por exemplo, J.K.-K. Ng et al (2007), Anal. Chem Acta 582, pp. 295- 303, descrevem um dispositivo microfluídico que compreende microesferas que são funcionalizadas com oligonucleotídeos através de ligação biotina- estreptavidina. O dispositivo microfluídico consiste em uma ampla câmara com um corte variado e com uma barreira para aprisionar as microesferas em uma disposição em monocamada. Diferentes conjuntos de microesferas são sequencialmente introduzidos separados por esferas espaçadoras não funcionalizadas. Como pode ser observado a partir da figura 5a no docu-

mento, as microesferas formam grupos grandes com limites não definidos ' devido à mistura de partícula com as partículas dos conjuntos espaçadores. - Visto que as esferas não possuem características que as distinguem, como tamanho, formato ou um código, os limites dos diferentes conjuntos são des- — conhecidos e são apenas revelados após o ensaio pela detecção da presen- ça do analito na amostra. Portanto, a configuração descrita por J.K.-K. Ng et al não é adequada para ensaios multiplexados, visto que não é possível de- terminar com segurança a presença ou ausência de vários alvos em uma amostra. Por exemplo, na ausência de vários analitos na amostra que cor- respondem a conjuntos consecutivos, nenhum sinal será registrado em uma porção total do microcanal. Desse modo, será difícil estabelecer a quantos conjuntos essa porção realmente corresponde (assim, não haverá indicação i de quantos analitos estão realmente ausentes). Também será difícil ou ainda " impossível estabelecer a identidade dos analitos subsequentes que reagem com os conjuntos consecutivos visto que a posição na sequência desses conjuntos não pode ser estabelecida com segurança.

EP1712282A2, WOO00/061198A1 e WODO4/025560A1 descrevem configurações que possuem elementos microcarreadores colocados dentro de microcanais à medida que seu movimento é restringido no microcanal. Os ensaios são realizados pelo fluxo de fluidos. Esse tipo de configuração é efi- caz para a transferência de massa visto que as distâncias de difusão são pequenas e o movimento da amostra relativo aos microcarreadores aproxi- ma as moléculas-alvo das moléculas receptoras. Esse tipo de configuração também reduz o risco de diminuir a quantidade de reagentes que são neces- sários.

Entretanto, em EP1712282A2 e WOO00/061198A1, a ordem dos microcarreadores no microcanal é muito importante visto que isso define a identidade dos microcarreadores. Em WO2004025560A1, os microcarreado- res são codificados de modo que sua ordem no microcanal não seja tão im- portante quanto em EP1712282A2 Ainda a descrição de WO2Z004025560A1 descreve apenas as configurações onde os microcarrea- dores são estritamente alinhados uns atrás dos outros para cumprir as exi-

D gências do mecanismo de decodificação proposto que exige um posiciona- mento específico dos códigos de microcarreadores para permitir sua identifi- - cação.

EP1712282A2, WOO0/061198A1 e WO04/025560A1 descrevem configurações que não são fáceis de preparar na prática, devido ao fato de essas exigirem uma introdução muito controlada de microcarreadores em um espaço confinado, para controlar sua ordem ou para alinhar os mesmos para o propósito de decodificação.

Para obter tais configurações, métodos especializados e configurações específicas que envolvem microscopia, mi- cromanipulação (uso de forças microscopicamente controladas) e/ou técni- cas de microfabricação são exigidos.

Na verdade, os microcarreadores precisam ser introduzidos no ] microcanal por algum processo que envolve intricar a micromanipulação de - microcarreadores individuais como descrito em WOO0061198A1 ou, quando a posição exata de cada microcarreador não precisar ser controlada, algum tipo de mecanismo de funil que orienta os mesmos a partir de um aumento em um pequeno microcanal como descrito em WOO04/025560A1. O meca- nismo de funil é mais de construir na prática, porém é sensível à obstrução pela formação de arcos na entrada do microcanal 1 (figuras 14 e 15). Além da abordagem de funil, WO0O4/025560A1 sugere a produção de bastões de ensaio por uma abordagem de sanduiche em que as esferas são colocadas em uma placa inferior que possui sulcos.

Subsequentemente, uma placa superior é situada e fixada à placa inferior.

Uma consequência prática do nível de sofisticação exigido para preparar as configurações descritas na técnica anterior é que essas reduzem a possibilidade de serem usadas para produzir uma configuração flexível de uso de pesquisa por uma técnica de laboratório.

Por exemplo, poderia ser muito difícil permitir a preparação de configurações personalizadas por um técnico de laboratório que poderia desejar utilizar seus próprios procedimen- tos de revestimento bioquímico em microcarreadores (por exemplo, para testar as sondas biológicas que estão em desenvolvimento) e então introdu- zir os mesmos na configuração para realizar os ensaios biológicos.

Portanto, há uma necessidade na técnica de dispositivos e mé- todos de ensaio de aprimorar a transferência de massa em ensaios de multi- + plexação biológica baseados em microcarreadores e simplificar o procedi- mento geral para preparar a configuração, executar o ensaio biológico e rea- lizarasleituras necessárias.

Descrição da Invenção Então, um objetivo geral da invenção é proporcionar um disposi- tivo e um método que permitam a transferência de massa aprimorada e a simplificação do procedimento de preparação e desempenho de ensaios multiplexados biológicos, em particular um dispositivo e método para realizar ensaios multiplexados. A presente invenção proporciona um microcanal como uma câ- [ mara de reação que compreende simultaneamente vários conjuntos de mi- : crocarreadores codificados (ou seja, micropartículas que possuem ligantes fixados à sua superfície) visto que o formato e o tamanho dos microcarrea- dores relativos ao corte transversal do microcanal permitem possuir, ao lon- go de todo o comprimento do microcanal, ao menos dois de quaisquer mi- crocarreadores dispostos lado a lado sem se tocarem e sem tocar o períme- tro do microcanal quando se movimentam na direção longitudinal do micro- canal, por exemplo, durante o preenchimento. De preferência, os microcar- readores podem ser observados dentro do microcanal. A configuração tam- bém compreende alguns meios para restringir o movimento longitudinal dos ditos microcarreadores no dito microcanal enquanto ainda permite que os fluidos fluam. A amostra biológica, tipicamente que compreende uma ou mais moléculas-alvo, flui através dos microcarreadores confinados ou imobi- lizados, de modo que os microcarreadores não acompanhem o fluxo da a- mostra biológica. O movimento da amostra relativo aos microcarreadores aproxima as moléculas-alvo das moléculas receptoras, aumentando as chances de ligação e, consequentemente, reduzindo o tempo de incubação necessário para realizar a transferência de massa. Para distinguir os vários conjuntos independentemente do desempenho de um ensaio e independen- temente de sua posição, os microcarreadores são codificados visto que o código é indicativo de sua função.

i Um aspecto importante da invenção reside no formato e tama- Ê nho relativos dos microcarreadores em relação ao corte transversal do mi- crocanal, para facilitar a preparação da configuração . A técnica existente descrita em EP1712282A2, WOO0/061198A1 e WO0O4/025560A1 exige um controle estrito da disposição dos microcarreadores no canal microfluídico que não é fácil de obter visto que a manipulação de objetos pequenos (ou seja, na faixa de mícron) não é trivial e exige métodos especializados e con- figurações específicas que envolvem técnicas de microscopia, micromanipu- lação (uso de forças microscopicamente controladas) e/ou microfabricação. Na presente invenção, os microcarreadores possuem uma liber- dade muito maior de movimento dentro do microcanal. O tamanho e o forma- ] to dos microcarreadores da invenção são tais que ao menos dois microcar- " readores podem ser colocados lado a lado sem se tocarem e sem tocarem o perímetro do microcanal, ao longo de todo o comprimento do microcanal que serve como uma câmara de reação e notavelmente em sua entrada. Isso significa que os microcarreadores que poderiam estar se movendo na dire- ção longitudinal do microcanal em velocidades diferentes poderiam ser ca- pazes de se encontrarem até o ponto onde seu movimento longitudinal é restrito. Essa característica é fundamental para facilitar a construção prática da configuração, que é particularmente importante quando a configuração for preparada em um ambiente de pesquisa pouco antes de realizar um ensaio, que permite a flexibilidade na preparação de misturas de conjuntos de mi- crocarreadores. O uso de um microcanal que é relativamente muito maior do —queotamanho dos microcarreadores possui os efeitos de reduzir a probabi- lidade de formação de arcos na entrada do microcanal, o que poderia obstru- ir a entrada. Isso permite ainda a utilização de uma entrada aumentada em vez de um funil estreito para carregar o microcanal. Uma segunda vantagem consiste em reduzir as chances de bloquear uma grande porção dos micro- carreadores se houver obstáculos dentro do microcanal. Os obstáculos po- deriam ser elementos indesejados como resíduos (pó) ou bolhas de ar no microcanal ou poderiam ser características construídas que podem ser ne-

cessárias para facilitar a microfabricação do canal microfluídico, por exem- plo, colunas para garantir a rigidez adequada de microcanais quando polí- meros macios como PDMS forem utilizados.

A invenção proporciona adicionalmente um método para realizar um ensaio baseado em microcarreadores e adequado para multiplexação que compreende as etapas de a) proporcionar um dispositivo de ensaio que compreende um microcanal como a câmara de reação e proporcionar ao menos dois conjun- tos de microcarreadores codificados, em que o código dos microcarreadores é indicativo da função e em que o formato e tamanho dos ditos microcarrea- dores relativos ao corte transversal do microcanal permitem possuir, ao lon- go de todo o comprimento do microcanal, ao menos dois dos microcarreado- Ú res que permanecem lado a lado sem se tocarem e sem tocarem o períme- « tro do microcanal; b) preencher ao menos parcialmente o dito microcanal com os ditos ao menos dois conjuntos de microcarreadores codificados; c) restringir o movimento dos ditos microcarreadores na direção longitudinal do dito microcanal enquanto ainda permite-se que os fluidos flu- am; d) permitir o fluxo de uma amostra que compreende potencial- mente uma ou mais moléculas-alvo através do dito microcanal que compre- ende os ditos microcarreadores; e) identificar os conjuntos de microcarreadores; e f) detectar uma reação entre o ligante e a molécula-alvo e corre- lacionar a presença ou ausência de uma reação com a identidade de um conjunto específico para deduzir a presença ou ausência de uma molécula- alvo na amostra.

Em soluções tradicionais, como utilizando múltiplos poços, a transferência de massa é aprimorada utilizando técnicas de agitação bási- cas,comissoa amostra e os elementos microcarreadores são agitados ale- atoriamente. Em microescalas, em que os fluxos são laminares, essa técnica apenas aumenta marginalmente o movimento relativo dos microcarreadores com relação à amostra, que é um elemento fundamental para garantir uma transferência de massa eficiente.

A presente invenção desacopla os movi- E mentos da amostra e dos microcarreadores.

Ademais, a configuração de câmara de reação alongada e o volume limitado em torno dos microcarrea- dores garantem que a amostra passe próxima por um número máximo de microcarreadores.

A vantagem obtida do ensaio e método descritos aqui é acelerar a transferência de massa ao reduzir a confiança da difusão para contatar as moléculas de interesse com receptores potenciais.

Outras vanta- gens incluem a simplicidade do mecanismo, que conta com as propriedades de microcanais e disposições geométricas para aprimorar a transferência de massa.

A configuração também permite manipulações fluídicas flexíveis com mínimas exigências para a manipulação dos microcarreadores, por exemplo, : se etapas adicionais forem exigidas para o desempenho de ensaios comple- . xos.

É necessária pouca adaptação da configuração se for desejado mover o fluido para trás e para frente, por exemplo, se a velocidade do fluido não pu- der ser controlada com segurança ou se a amostra for diluída, pode-se dizer que esse precisa entrar várias vezes em contato com os microcarreadores para garantir a captura adequada de moléculas de interesse.

A invenção é adequada para ensaios multiplexados visto que essa permite a associação de várias funções para vários conjuntos de mi- crocarreadores e a utilização desses simultaneamente em um ensaio en- quanto ainda é capaz de discriminar as várias reações desde que a reação gere um sinal que é colocalizado no microcarreador.

Isso é realizado ao tra- balhar com microcarreadores codificados que são identificáveis e, portanto, permitem determinar a função que esses transportam.

Ademais, a configuração microfluídica reduz a quantidade de amostra necessária para realizar o ensaio biológico.

Isso também facilita a execução de qualquer etapa de ensaio adicional necessária permitindo que reagentes adicionais ou soluções de lavagem fluam através do microcanal semter de realizar qualquer manipulação particular sobre os microcarreado- res.

A invenção também simplifica as manipulações gerais exigidas para obter os resultados do ensaio comparados com abordagens baseadas em microcarreadores tradicionais em que os microcarreadores precisam ser ? coletados da câmara de reação e movidos para um dispositivo de leitura. Na verdade, nessas modalidades onde o microcanal é ao menos parcialmente transparente, os microcarreadores podem ser observados diretamente den- tro do microcanal por meios ópticos para identificar os conjuntos e realizar a leitura biológica. Essa configuração também permite a possibilidade de in- formações cinéticas ao observar os microcarreadores à medida que a rea- ção ocorre.

Ademais, a invenção também simplifica a preparação do disposi- tivo de ensaio ao facilitar a manipulação e redução do nível de habilidade exigido para introduzir os microcarreadores no microcanal, permitindo assim i o uso de configurações personalizadas que são preparadas pouco antes do Er ensaio (por exemplo, em ambientes de pesquisa).

A invenção pode ser predominantemente usada na indústria de ciências da vida, e em particular em diagnóstico, pesquisa genômica e biolo- gia molecular.

Breve Descrição dos Desenhos A invenção será melhor entendida e os objetivos em vez daque- les apresentados acima tornar-se-ão óbvios considerando a seguinte descri- ção detalhada dessa. Tal descrição faz referência aos desenhos em anexo, nos quais: A figura 1 mostra uma modalidade exemplificativa de um micro- canal 1 como a câmara de reação (mostrada em negrito) com sua entrada 14 quese conecta a uma extremidade aumentada 6 e a um local de entrada 5, sua saída 16 que se conecta a um meio de bloqueio 4 (sob a forma de uma estrutura de filtro) e a um local de saída 15. A figura 1.1 mostra uma vista superior, enquanto a figura 1.2 mostra uma vista em corte transversal ao longo da linha A-A da figura 1.1.

A figura 2 mostra uma modalidade exemplificativa de um micro- canal que possui uma entrada 14 com uma extremidade aumentada 6 e dois locais de entrada 5 e 5'. A figura 2.1 mostra uma vista superior do microca-

| nal 1 com o corte aumentado 6 e dois locais de entrada 5 e 5', enquanto a figura 2.2 mostra uma vista em corte transversal ao longo da linha A-A da ' figura 2.1. A figura 3 mostra uma modalidade exemplificativa de um micro- canal que possui uma entrada 14 com uma extremidade aumentada 6 e um local de entrada 5. A figura também mostra fluxos laminares e um vórtice laminar 8 no poço 7. A figura 3.1 mostra uma vista superior do microcanal 1 e seu corte aumentado 6 em uma extremidade do microcanal 1. A figura 3.2 representa uma vista em corte transversal ao longo da linha A-A da figura 31emostrao local de entrada 5 e o poço 7 que proporciona acesso ao mi- crocanal 1 bem como o fluxo 9 que forma um vórtice 8.

A figura 4 mostra uma modalidade exemplificativa onde os mi- i crocarreadores 2 possuem um formato semelhante a disco (ou seja, um for- . mato sob a forma de um tablete com uma face frontal circular) e estão em um microcanal 1 com um corte transversal retangular. O microcanal 1 possui duas paredes laterais 101, uma base 102 e uma cobertura 103. O corte transversal do microcanal 1 é tal que os microcarreadores 2 formam uma disposição em monocamada e têm seus movimentos rotacionais restritos. À figura 4.1 mostra uma vista superior enquanto a figura 4.2 mostra uma vista em corte transversal ao longo da linha A-A da figura 4.1. A figura 4.3 mostra uma representação em 3-D. No caso ilustrado, a disposição em monocama- da não está estritamente em um plano (a posição vertical dos microcarrea- dores 2 pode variar ligeiramente como mostrado na figura 4.2), porém os microcarreadores 2 não podem se sobrepor. Padrões de preenchimento dife- rentes dos microcarreadores 2 ilustram conjuntos diferentes.

A figura 5 ilustra o uso de um sensor tipo matriz 10, por exemplo, um CCD ou um fotossensor C-MOS, para capturar uma ampla imagem de campo da disposição em monocamada de microcarreadores 2 dentro do ca- nal microfluídico 1.

A figura 6 mostra uma modalidade exemplificativa onde os mi- crocarreadores 2 possuem um formato semelhante a disco e estão em um microcanal 1 com um corte transversal retangular. Essa ilustra como os mi-

: crocarreadores podem ter um movimento relativamente livre (em um plano 2D nesse exemplo) até esses atingirem o ponto onde seu movimento longi- - tudinal é restrito. Isso permite que esses passem um pelo outro e reduz o risco de bloquear um grande número de microcarreadores no caso de pre- sença de um obstáculo. A figura 6.1 mostra uma vista superior, enquanto a figura 6.2 mostra uma vista em corte transversal ao longo da linha A-A da figura 6.1. A figura 6.3 mostra uma representação em 3-D. A figura 7 mostra uma modalidade exemplificativa de um micro- carreador 2 que possui um formato semelhante a disco e um código sob a formade um padrão de orifícios atravessantes 21 através do microcarreador

2. O microcarreador 2 exibe uma marca de orientação de triângulo 20 que é usada para determinar se o microcarreador 2 está invertido e também serve i como o ponto de partida do padrão de código. O microcarreador 2 possui os k elementos de codificação na periferia, desse modo, deixando uma porção significativa, em torno do centro do microcarreador 2, da superfície para uma região uniforme e plana dedicada adequada para a leitura biológica. A figura 8 mostra duas fotografias tiradas por uma câmera CCD e que ilustram a leitura biológica de microcarreadores 2 em um ensaio de muiltiplexação simples. Dois conjuntos de microcarreadores 2 foram introdu- zidosno microcanal: um primeiro conjunto de microcarreadores 11 (código com um furo) funcionalizado com uma sonda de DNA P1 (5' - CAA CCC CAG CTA ATA TTA TT — 3') e um segundo conjunto de microcarreadores 12 (código com três furos) funcionalizado com outra sonda de DNA P2 (5"- TGG GTA AGT TAG GGC GAT GG — 3'). Uma solução contendo um alvo de DNA marcado de maneira fluorescente T1 (5' Cy5 — AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG — 3') complementar com a sonda P1 foi então purgada e ape- nas os microcarreadores 11 funcionalizados com a sonda de DNA P1 reagi- dos (veja a diferença entre campo claro (luz branca) na figura 8.1 e luz fluo- rescente na figura 8.2). A figura 9 ilustra como a leitura biológica pode ser realizada com o tempo enquanto ocorre o ensaio para fornecer informações sobre a cinéti- ca da reação. Essa figura também mostra que o dispositivo é muito eficiente

W em termos de transferência de massa visto que o mesmo é capaz de detec- tar reações de hibridização em alguns segundos (realizadas em concentra- " ção-alvo de 200 nM). A fotografia foi tirada por uma câmera CCD sob luz fluorescente.

A figura 10 mostra outra modalidade exemplificativa onde os mi- crocarreadores codificados 2 que possuem um formato semelhante a disco (como descrito acima na figura 7) estão em um microcanal 1 com um corte transversal retangular. O corte transversal do microcanal 1 é tal que os mi- crocarreadores 2 formam uma disposição em monocamada (esses não po- dem se sobrepor) e têm seus movimentos rotacionais restritos de modo que esses se estendam essencialmente de maneira plana dentro do microcanal.

A figura 11 ilustra um chip 13 para multiplexação. O dito chip : compreende vários microcanais 1 que contêm diversos conjuntos de micro- . carreadores funcionalizados 2. Os microcanais 1 se conectam a um local de entrada 5 e a um local de saída 15. Os microcarreadores 2 possuem um formato semelhante a disco e são codificados (como descrito acima na figura 10).

A figura 12 ilustra vários exemplos de micropartículas com o formato de um tablete. A face frontal possui o formato de um disco (esquer- da) ,deum quadrado (meio) ou um hexágono (direita).

A figura 13 mostra uma modalidade exemplificativa onde os mi- crocarreadores 2 possuem um formato semelhante a disco e são codificados com um padrão de orifícios atravessantes 21 e uma marca de orientação em formato de L 20. A figura 13.1 mostra uma imagem de campo claro (luz branca) dos microcarreadores. A figura 13.2 mostra uma imagem fluorescen- te que expõe os microcarreadores que foram reagidos após o fluxo da amos- tra 9. Ambas as imagens foram obtidas aqui após o fluxo da amostra 9.

A figura 14 mostra como os arcos podem ser formados em um funil que orienta os microcarreadores 2 para dentro de um microcanal estrei- to1e, portanto, obstruem a entrada 14 do microcanal 1.

A figura 15 mostra uma imagem de um arco de microcarreado- res 2 que é formada em uma construção de funil, que bloqueia a entrada de

: um microcanal 1. A figura 16 mostra vários exemplos não-limitativos de formas - que são retangulares ou "quase retangulares". Esses ilustram os cortes transversais preferidos dos microcanais 1 ou dos microcarreadores 2 quando esses estiverem sob a forma de um tablete.

A figura 17 mostra duas imagens de uma modalidade exemplifi- cativa. Um chip 13 feito utilizando técnicas de moldagem de PDMS e fixado a uma lâmina de microscópio de vidro (como descrito em Fundamentals and Applications of Microfluidics by Nam-Trung Nguyen and Steve Wereley, ISBN: 9781580533430, capítulo 3) compreende um microcanal 1 que se co- necta, em uma extremidade, a um local de entrada 5 e, na outra extremida- de, a um local de saída 15. Um meio de bloqueio 4 que consiste em uma estrutura de filtro feita de colunas retangulares é construído na saída do mi- F crocanal 1. Ademais, colunas cilíndricas 17 são construídas no microcanal 1 para ajudar a estabilizar a altura do microcanal (ou seja, evitar que esse se comprima) quando pressões negativas forem aplicadas.

A figura18 mostra uma imagem de um tablete que compreende micropartículas de silício que ainda não foram liberadas. As micropartículas possuem um formato semelhante a disco e são codificadas por um padrão deorifícios atravessantes 21. Os microcarreadores possuem um diâmetro de 50 mícrons e incluem uma marca de orientação em forma de L 20.

Modos para Realizar a Invenção Dentro do escopo da presente invenção, as seguintes definições se aplicam: 'Multiplexação' se refere ao desempenho paralelo de inúmeros ensaios, tipicamente em um grande número de compostos ou moléculas, com a capacidade de discriminar os resultados de cada ensaio individual- mente. Esses ensaios podem ser, por exemplo, de natureza biológica e/ou química e tipicamente envolvem diversas moléculas-alvo que serão detecta- dase diversas moléculas de captura que servem como agentes para detec- tar essas moléculas-alvo. As ditas moléculas de captura são tipicamente |i- gadas como ligantes em substratos carreadores. O número de ensaios que

W são conduzidos em paralelo em um ensaio multiplexado é geralmente referi- do como o "nível" de multiplexação e pode variar de apenas alguns (2 ou 3) , a centenas de milhares para os níveis superiores de multiplexação. Os últi- mos são geralmente ensaios de hibridização de ácido nucleico tipicamente conduzidos hoje em microarranjos, porém que podem ser realizados pelo dispositivo de ensaio descrito aqui.

'*Ensaio único' se refere ao desempenho de um único ensaio, onde exige-se que apenas uma molécula-alvo seja detectada por uma molé- cula de captura.

'Câmara de reação' se refere a um espaço onde ocorre a reação biológica e/ou química entre uma molécula-alvo e uma molécula de captura.

'Microcanal' ou 'canal microfluídico' se refere a um canal fecha- i do, ou seja, uma passagem aumentada para fluidos, com um corte transver- . sal microscópico em tamanho, ou seja, com a maior dimensão (do corte transversal) sendo tipicamente de 1 a 500 micrômetros, de preferência, 10 a 500 micrômetros, com mais preferência, de 20 a 300 micrômetros, com ain- da mais preferência, de 30 a 300 micrômetros. Um microcanal possui uma direção longitudinal, que não é necessariamente uma linha reta, e que cor- responde à direção na qual os fluidos são conduzidos dentro do microcanal, ouseja, essencialmente à direção correspondente à adição de vetor dos ve- tores de velocidade de um fluido que passa no microcanal, assumindo um regime de fluxo laminar. Um microcanal possui, em uma extremidade, uma entrada 14 e, na outra extremidade, uma saída 16, que são aberturas no microcanal que, por exemplo, permitem que os fluidos entrem no microcanal, respectivamente saiam do microcanal. O corte transversal de um microcanal é geralmente constante ao longo da maior parte de seu comprimento, porém esse corte pode variar e pode tipicamente aumentar ao menos próximo à entrada 14 ou próximo à saída 16 para se conectar a um local de entrada 5, a um local de saída 15, a um ou mais outros microcanais ou a outro compo- nente microfluídico (como um mecanismo de válvula). Um microcanal pode se estender de modo que a linha formada pela direção longitudinal possua qualquer formato ou comprimento e pode se estender tridimensionalmente

. (ou seja, a linha formada pela extensão na direção longitudinal não perma- nece em um plano). - Quando se refere ao "corte transversal", entende-se o corte transversal perpendicular ao eixo geométrico longitudinal. O termo "perímetro" se refere ao perímetro interno do microcanal ou à circunferência do corte transversal.

'*Funcionalizada' se refere a uma partícula ou micropartícula que possui um ou mais, porém, de preferência, um, ligantes ligados à sua super- fície, que pode servir como a molécula de captura ou receptora para uma determinada molécula-alvo (analito). O termo 'molécula' deve ser amplamen- te entendido e também pode incluir várias moléculas, partículas ou células. Por exemplo, a 'molécula'-alvo pode ser uma partícula viral e/ou a 'molécula' i de captura (ligante) pode ser um grupo de fragmentos de ligação ao antíge- - no. Em outro exemplo, a 'molécula'-alvo pode ser um ácido nucleico como um, DNA, um RNA ou fragmento de ssDNA e a 'molécula' de captura pode ser outro ácido nucleico como um fragmento de DNA, RNA ou ssDNA que é projetado para se hibridizar com o formador. Também pode ser que para capturar especificamente uma molécula-alvo, moléculas de captura diferen- tes sejam necessárias. Dentro do escopo da presente invenção, os exem- plos mencionados serão qualificados como uma 'molécula de captura' ou 'molécula-alvo', respectivamente. Os ligantes e moléculas-alvo podem ser naturais, sintéticos ou semissintéticos.

O termo 'função' se refere à capacidade de se ligar e/ou reagir com uma determinada molécula-alvo e, consequentemente, se refere à pre- —sençade um ligante específico.

Os termos 'ligante', 'molécula de captura' e 'molécula receptora' são usados aqui de forma sinônima. O mesmo se aplica aos termos 'molécu- la-alvo' e 'analito, embora o analito possa compreender várias moléculas- alvo.

'Micropartículas' se referem a qualquer tipo de partículas micros- cópicas em tamanho, tipicamente com a maior dimensão sendo 100 nm a 300 micrômetros, de preferência, de 1 um a 200 um.

. 'Microcarreadores' como usado aqui são micropartículas que são funcionalizadas para analisar e/ou reagir com um analito em uma amostra. O - termo "microcarreador funcionalizado" é usado de forma simultânea aqui. Quando se descreve aspectos que não são ligados à sua função, como as- pectos geométricos ou aspectos de microfabricação, os 'Microcarreadores' e 'Micropartículas' podem ser considerados de forma equivalente aqui.

Um 'conjunto' ou 'conjunto de microcarreadores' se refere a um ou mais microcarreadores com a mesma funcionalização. Um conjunto pode ser apenas um microcarreador ou mais de um microcarreador. Os microcar- readores de um conjunto podem transportar mais de uma molécula de captu- ra para capturar duas ou mais moléculas-alvo, porém isso ainda é referida como uma função. Dois conjuntos diferentes de microcarreadores, que são í distinguíveis entre si, podem possuir a mesma funcionalização. . O termo 'leitura biológica' se refere à detecção para verificar se um ligante fixado a um microcarreador foi ou não ligado ou reagido com um analito-alvo. A leitura biológica também pode fornecer informações quantita- tivas que são indicativas da quantidade de analito-alvo que foi reagida.

Um 'código' como usado aqui é qualquer atributo ou característi- ca de uma micropartícula ou microcarreador que é distinguível mediante a observação ou detecção e que é usado para identificar a micropartícula ou microcarreador ou para associar a micropartícula de microcarreador a uma população específica (por exemplo, a população de microcarreadores que possui uma determinada função). Um código em um microcarreador pode ser determinado independentemente de sua posição e independentemente do desempenho de um ensaio, ou seja, não exige que a presença de um analito-alvo seja revelada. Tipicamente, um código é caracterizado pela res- posta óptica ou magnética da micropartícula ou microcarreador mediante a observação. Essa resposta pode ser definida para a micropartícula ou mi- crocarreador como um todo (por exemplo, a cor do microcarreador) ou pode ser espacialmente modulada na micropartícula ou microcarreador para resul- tar em um formato padronizado (por exemplo, um código de barras obtido pela modulação da cor no microcarreador). Exemplos de códigos incluem,

. porém sem caráter limitativo, cor, formato, tamanho, padrões impressos ou gravados, configuração de furos, padrões holográficos, assinaturas magnéti- - cas, composição química, modificação de transmissão de luz ou característi- cas de reflexão, emissão de pontos quânticos ou objetos estranhos detectá- veis distintivos (por exemplo, oligonucleotídeo ou outros polímeros) fixados à superfície.

O termo 'microcarreadores codificados', respectivamente 'micro- partículas codificadas' se refere aqui a microcarreadores, respectivamente micropartículas que possuem um código. Os microcarreadores da invenção são individualmente codificados, ou seja, cada microcarreador transmite seu próprio código, mesmo que vários microcarreadores (tipicamente os micro- carreadores de um conjunto) possam transmitir um código com um mesmo ' valor (ou seja, os microcarreadores não são distinguíveis com base apenas - em seu código). Os diferentes conjuntos de microcarreadores codificados da invenção podem ser distinguidos e/ou identificados independentemente da posição dos microcarreadores no microcanal e independentemente do de- sempenho de um ensaio.

Disposto "lado a lado" ou colocado "lado a lado" como usado aqui se refere a uma propriedade geométrica que relaciona a geometria de duas ou mais micropartículas com a geometria do microcanal. Diz-se que uma ou mais micropartículas são dispostas "lado a lado" em uma determina- da posição no microcanal quando essas (i) estão em uma configuração co- mo as duas ou mais micropartículas ajustadas dentro do microcanal e (ii) intersectam o corte transversal naquela determinada posição e (iii) suas su- perfícies projetadas ao longo da direção longitudinal (naquela determinada posição) não se sobrepõem e são encerradas na superfície do corte trans- versal (naquela determinada posição). Em geral, em um microcanal que não possui um corte transversal constante ao longo de todo o seu comprimento, é possível que uma ou mais micropartículas sejam dispostas lado a lado em — algumas posições, porém não em outras posições (embora essa regra geral não se aplique ao microcanal 1 da invenção que é exigido para ser capaz de ter os microcarreadores colocados lado a lado ao longo de todo o seu com-

: primento). Dependendo da geometria das micropartículas, é possível que duas ou mais micropartículas permaneçam lado a lado em uma determinada - posição no microcanal apenas quando essas estiverem em determinadas orientações. Quando estão lado a lado, as micropartículas podem estar em contato umas com as outras ou possuem uma distância entre essas.

A "forma de um tablete" se refere aqui a um formato particular de uma micropartícula onde a altura é notavelmente menor (por exemplo, por ao menos um fator de dois) do que a largura e o comprimento e onde a mi- cropartícula possui duas superfícies essencialmente paralelas e essencial- mente planas (faces frontais) na parte superior e na parte inferior (veja a fi- gura 12). Um formato "semelhante a disco" se refere a um formato sob a forma de um tablete com uma face frontal circular.

i O microcanal - O microcanal 1 da invenção é, de preferência, reto, ou seja, a di- reção longitudinal se estende ao longo de uma linha reta, porém também pode possuir um contorno sinuoso, ou seja, a direção longitudinal se estende para formar uma linha com trilhas paralelas conectadas com arcos, para limi- tar a área ocupada. O microcanal 1 é, de preferência, essencialmente plano, porém também pode se estender de forma tridimensional.

O comprimento do canal microfluídico 1 pode variar dependendo de seu corte transversal e da área ocupada desejada, geralmente para se ajustar dentro do chip microfluídico 13 no qual esse é tipicamente compre- endido. Tipicamente, esse irá variar de 1 mm a 500 centímetros, de prefe- rência, de 5 mm a 200 cm. A largura e altura do microcanal possuem, de preferência, de 500 nm a 300 micrômetros. Por exemplo, um microcanal 1 com um contorno sinuoso e que possui um corte transversal pequeno (por exemplo, menor do que 100 mícrons), pode atingir um comprimento relati- vamente longo como centenas de centímetros em uma área ocupada relati- vamente pequena (alguns centímetros quadrados). Por exemplo, em um centímetro quadrado é possível ajustar um microcanal sinuoso 1 de 100 cm de comprimento que possui um corte de 50 um (supondo que metade da superfície seja ocupada pelo microcanal 1 e que a outra metade seja o es-

. paçamento). Em uma modalidade muito preferida, o microcanal 1 é substan- cialmente reto e possui um comprimento de 2 mm a 10 mm, uma largura de - 200 mícrons a 600 mm e uma altura de 10 mícrons a 20 mícrons. O microcanal 1 da invenção possui uma entrada 14 e uma saída 16 que permitem que os fluidos 9 entrem, respectivamente saiam do micro- canal 1. A entrada 14 também é usada para introduzir os microcarreadores 2 no microcanal 1 e é tipicamente conectada a um poço de entrada 5, de pre- ferência, através de uma extremidade aumentada 6. O microcanal 1 da in- venção, de preferência, termina em um meio de bloqueio 4 como descrito abaixo e é tipicamente prolongado por outro canal microfluídico (que não serve como uma câmara de reação) que conduz os fluidos 9 até um local de saída 15.

i O microcanal 1 possui, de preferência, um corte transversal que é retangular ou quase retangular (veja a figura 16), trapezoide ou similar a um paralelogramo. O microcanal possui tipicamente duas paredes laterais 101, uma base 102 e uma cobertura 103. As paredes laterais são, de prefe- rência, porém não necessariamente, retas e posicionadas em um ângulo de quase 90 graus em relação à base (face inferior) e à cobertura (face superi- or), respectivamente. As paredes laterais podem ser curvadas de maneira côncava ou convexa ou podem se conectar à base ou à cobertura com um ângulo que não é reto, por exemplo, 45 graus ou 60 graus. Tipicamente, a altura do microcanal é notavelmente menor (por exemplo, por ao menos um fator de dois) do que sua largura. Em outra modalidade, a base 102 e/ou a cobertura 103 são ligeiramente curvadas ou estruturadas com sulcos ou sa- liências, por exemplo, para facilitar o fluxo de fluidos 9.

O microcanal 1 da invenção, que serve como uma câmara de reação 1, é projetado de modo que esse possa conter ao menos dois con- juntos de microcarreadores 2 como quaisquer dois microcarreadores 2 po- dem ser dispostos lado a lado sem se tocarem e sem tocarem no perímetro —aolongo de todo o seu comprimento, notavelmente como a sua entrada 14. Em uma modalidade, o microcanal 1 possui ao menos uma dimensão de seu corte transversal que é maior do que a soma da maior extensão da maior superfície projetada de quaisquer dois microcarreadores 2. Por exemplo, em um microcanal 1 com um corte transversal retangular ou quase retangular e - os microcarreadores 2 sob a forma de um tablete, a dita dimensão pode ser a largura do microcanal 1 que é maior do que a soma das larguras de quais- quer dois microcarreadores 2. Assim, o microcanal 1 pode possuir uma lar- gura tal que duas micropartículas podem ser dispostas lado a lado sem inibir o movimento das micropartículas na direção longitudinal do microcanal 1, por exemplo, durante o preenchimento. Com mais preferência, a largura é tal que as micropartículas podem se passar umas pelas outras sem se tocarem esem tocarem no perímetro do microcanal 1 que devido ao atrito também pode resultar em bloqueio. Em uma modalidade preferida, o corte transver- sal do microcanal 1 é, de preferência, constante ou essencialmente constan- i te ao longo de todo o comprimento do microcanal 1. Em outra modalidade, o ' microcanal 1 é conectado a uma extremidade aumentada 6, onde o corte transversal aumenta, tipicamente na entrada 14, para facilitar a introdução dos microcarreadores. Em uma modalidade preferida, a extremidade aumen- tada 6 na entrada 14 de um microcanal retangular ou essencialmente retan- guiar é feita ao aumentar a distância das paredes laterais 101 até o eixo ge- ométrico longitudinal enquanto a altura do microcanal (ou seja, a distância entrea basee a cobertura), de preferência, permanece essencialmente constante.

Em uma modalidade preferida, o microcanal 1 é feito de ou compreende silício, SU-8 (uma resina fotorresistente à base de epóxi), poli- imida (PI), polidimetilsiloxano (PDMS), silicone, ou outros elastômeros ter- —moplásticos (TPE), polimetilmetacrilato (PMMA), Teflon (PTFE), elastômeros termoplásticos (TPE), Victrex PEEKTY, Policarbonato, Cloreto de polivinila (PVC), polipropileno (PP), polietileno (PE), poliestireno (PS), Etileno- Propileno Fluorado (FEP), (Co)polímero de Olefina Cíclica (COP ou COC) ou outros polímeros termoplásticos, quartzo, vidro ou metais laminados como níquel, prata ou ouro, com mais preferência, de polímeros transparentes. Com mais preferência, o microcanal é feito de (Co)polímero de Olefina Cícli- ca.

' De preferência, o microcanal 1 é transparente em ao menos um lado. Assim, as micropartículas podem ser facilmente observadas através de - um meio de inspeção óptica, por exemplo, um microscópio. Isso permite uma fácil identificação dos conjuntos de microcarreadores 2 que são codifi- cados com técnicas ópticas quando esses forem colocados dentro do micro- canal 1 e a determinação da leitura biológica por técnicas convencionais com base na resposta óptica usada aqui para aquela determinação. Os ma- teriais adequados para proporcionar a transparência são, por exemplo, SU- 8, PDMS ou silicone.

O microcanal 1 pode ser fabricado utilizando fotolitografia e/ou estampagem e/ou técnicas de moldagem por injeção convencionais que são extensivamente descritas na literatura (por exemplo, Fundamentals of micro- ' fabrication by Marc J. Madou, ISBN: 0849308267, 9780849308260, Funda- : mentals and Applications of Microfluidics by Nam-Trung Nguyen and Steve Wereley, ISBN: 9781580533430, capítulo 3). Por exemplo, o microcanal 1 pode ser produzido ao gravar um canal em um substrato por métodos co- nhecidos e então vedar o mesmo com uma placa, por exemplo, feita de vidro ou um segundo canal que também foi gravado em um substrato. As técnicas de microfabricação também podem ser usadas para produzir micropartícu- las, por exemplo, para produzir micropartículas de silício em um tablete co- mo descrito em EP1276555B1.

Nas escalas que são consideradas, os fluxos são laminares. Pa- ra garantir que as moléculas-alvo de interesse na amostra passem na proxi- midade de um máximo de microcarreadores 2, o microcanal 1 deve ser pro- jetado de modo que os microcarreadores 2 deixem aberto um corte mínimo em torno desses para permitir que a amostra 9 flua através dessa. A taxa de fluxo será, por exemplo, limitada pelo corte deixado aberto em torno dos mi- crocarreadores, pelo comprimento do microcanal, pelas forças que movem os fluidos (por exemplo, a pressão que é aplicada) e pelas propriedades fluí- dicasda amostra (viscosidade, tamanho de moléculas que a amostra trans- porta, etc.).

Microcarreadores e conjuntos de microcarreadores

O microcanal 1 suporta simultaneamente ao menos dois conjun- tos de microcarreadores 2, porém também pode compreender três, quatro, - cinco, dez ou centenas ou mais conjuntos de microcarreadores.

Para níveis superiores de multiplexação (por exemplo, para ensaios de hibridização de ácido nucleico)o microcanal pode conter centenas de milhares de conjuntos.

Isso é, por exemplo, obtenível com microcanais compridos e grandes 1 aco- plados com microcarreadores pequenos 2. Os tamanhos, formatos e material bem como a distinção entre as micropartículas e os microcarreadores são descritos na seção de defini- ções.

As micropartículas ou microcarreadores 2 da invenção podem ser feitos de ou compreender qualquer material usualmente usado em tecno- : logia de triagem de alto desempenho e diagnóstico.

Exemplos não-limitativos R desses materiais incluem látex, poliestireno, dextranos reticulados, polimeti- lestireno, policarbonato, polipropileno, celulose, poliacrilamida, polidimetila- crilamida, etileno-propileno fluorado bem como materiais comumente usados em microfabricação ou microfresamento como vidro, SiO>, silício, PMMA (polimetilmetacrilato), ouro, prata, alumínio, aço ou outros metais ou materi- ais fotossensíveis à base de epóxi como SU-8. As micropartículas podem ter quaisquer formatos e tamanhos.

De preferência, os microcarreadores 2 são feitos de silício.

Os microcarreadores 2 da invenção são codificados de modo que sua função possa ser determinada mediante a leitura do código.

As micropartículas e os microcarreadores 2 possuem, de prefe- rência, um formato esférico ou a forma de um tablete que significa que sua altura é notavelmente menor (por exemplo, em ao menos um fator de dois) do que sua largura e seu comprimento e que esses possuem duas superfi- cies essencialmente paralelas e essencialmente planas (faces frontais) na parte superior e na parte inferior.

Assim, quando os microcarreadores 2 com a forma de um table- te forem introduzidos em um microcanal 1 com um corte retangular ou quase retangular como descrito acima, esses se encontram planos sobre suas fa-

. ces frontais e esses podem ser facilmente detectados por meios ópticos. À figura 13 mostra modalidades exemplificativas de microcarreadores em for- - ma de tablete 2. A superfície principal pode possuir qualquer formato; exem- plos não limitativos consistem em um quadrado, um retângulo, um círculo, umtriânguloou um hexágono (figura 12, à direita).

Em uma modalidade preferida, os microcarreadores 2 possuem um formato semelhante a disco com a face frontal sob a forma de um círcu- lo, e são codificados por um padrão de furos atravessantes 21, que também incluem, de preferência, uma marca de orientação assimétrica 20 como um triângulo ou uma marca em forma de L. Essa combinação de código e for- mato permite uma fácil identificação através de técnicas de decodificação de imagens.

i Em outra modalidade, os microcarreadores 2 possuem proprie- y dades magnéticas que são, por exemplo, adequadas para imobilizar as mesmas dentro do microcanal.

Os microcarreadores 2 de cada conjunto são tipicamente funcio- nalizados de forma idêntica. Os microcarreadores 2 também podem possuir tamanhos e formatos diferentes uns em relação aos outros. Os microcarrea- dores 2 são codificados de modo que os vários conjuntos sejam distinguíveis unsdos outros por ao menos um atributo ou característica que é observável, ou seja, o código. Embora todos os microcarreadores 2 sejam individualmen- te codificados, os microcarreadores 2 de um determinado conjunto partilham, de preferência, um mesmo código. Visto que os microcarreadores codifica- dos 2 são usados, esses podem ser introduzidos em uma sequência aleató- riaemvezdeem uma maneira controlada.

Os microcarreadores 2 servem como suportes para ensaios químicos ou biológicos. Nessa capacidade, os microcarreadores 2 podem conter um ou mais ligantes fixados à sua superfície e podem ser colocados em contato com os analitos-alvo para determinar a presença ou ausência de analitos particulares de interesse, ou esses podem servir como suportes pa- ra reações químicas combinatórias realizadas no ligante fixado. Em uma modalidade preferida, cada microcarreador possui um ligante fixado à sua superfície.

Será entendido que o termo 'um ligante' como usado aqui não pretende se referir numericamente a apenas uma molécula, porém a um tipo - de ligante.

Um amplo espectro de funcionalidades químicas e biológicas po- de ser agregado como ligantes às micropartículas da invenção, inclusive an- ticorpos e outras proteinas bem como ácidos nucleicos como fragmentos ou aptâmeros de DNA, RNA ou ssDNA projetados para se ligarem a moléculas específicas de interesse.

Essas funcionalidades incluem todas as funcionali- dades que são usualmente usadas em tecnologia de triagem de alto desem- penho e diagnóstico.

Ademais, os microcarreadores 2 podem ser funcionali- zadosem uma variedade de maneiras para permitir a fixação de um reagen- te inicial.

Exemplos de analitos-alvo para os ligantes fixados aos microcarre- adores 2 incluem antígenos, anticorpos, receptores, haptenos, enzimas, pro- Á teinas, peptídeos, ácidos nucleicos, fármacos, hormônios, patógenos, toxi- " nas, células ou quaisquer outras substâncias químicas ou moléculas de inte- resse.

Meios para restringir o movimento longitudinal dos microcarreadores A invenção proporciona um meio para aumentar a velocidade do fluxo relativo àquele dos microcarreadores 2 para aumentar as chances de contato entre as moléculas de interesse 3 no fluido 9 e os receptores 8 fixa- dos aos microcarreadores 2. Portanto, é importante restringir o movimento dos microcarreadores 2 na direção do fluxo, que está na direção longitudinal enquanto ainda permite que os fluidos 9 fluam.

A presença de um meio de restrição proporciona uma configuração essencialmente estática para reali- zar o ensaio e a leitura no mesmo local permitindo a leitura cinética além de transferência de massa mais rápida.

O movimento de microcarreadores 2 perpendicular ao fluxo pode ocorrer e pode ainda exercer um impacto positi- vo sobre a velocidade de transferência de massa, se o movimento dos mi- crocarreadores 2 for rápido o suficiente, pois isso aumenta o tamanho virtual da superfície de captura (essa é uma forma de agitação que pode ser obtida, porexemplo, através de derivação, vibração ou sonicação). A restrição do movimento longitudinal dos microcarreadores po- de ser realizada de várias maneiras.

Por exemplo, ao menos um meio de bloqueio 4 que permite que os fluidos 9 fluam, porém bloqueia a passagem das micropartículas 2 pode ser usado na extremidade da câmara de reação " 1. Exemplos não limitativos do dito meio de bloqueio 4 incluem uma grade, um fio, um filtro de tela, uma construção de barreira, uma ou mais colunas, umaredução do corte do microcanal, forças eletrostáticas, em particular uma ou mais micropartículas retidas utilizando forças eletrostáticas, forças diele- troforéticas, em particular uma ou mais micropartículas retidas utilizando for- ças dieletroforéticas, uma partícula magnética, etc.

Soluções baseadas na compressão parcial de microcanais não-rígidos 1 (ou seja, contraindo a ge- ometria do microcanal, por exemplo, no caso de microcanais feitos de polí- mero macio como PDMS ou parafina) também são usadas como o meio de bloqueio 4. O meio de bloqueio 4 pode ser fixo ou removível.

O meio de blo- í queio removível, por exemplo, partículas magnéticas, permite uma fácil re- - moção das micropartículas 2 na direção do fluxo 9 para a substituição de micropartículas ou análise de micropartículas.

O meio de bloqueio fixo 4, como uma grade, pode ser removido por um laser para remover as micropar- tículas 2, por exemplo, para a análise dessas.

De maneira alternativa ou adicional, se os microcarreadores 2 possuírem propriedades magnéticas, os microcarreadores 2 podem ser imo- bilizados ao aplicar um campo magnético.

Então, a presença de um meio de bloqueio 4 pode não ser necessária.

Em uma modalidade alternativa, os mi- crocarreadores 2 são imobilizados utilizando forças dieletroforéticas.

Devido ao movimento restrito dos microcarreadores, a configu- ração também facilita as etapas de lavagem, o descarte de reagentes adi- cionaisbem como a leitura biológica, que é, de preferência, realizada em um modo estático.

Desenho do microcanal em relação aos microcarreadores De acordo com a presente invenção, o microcanal 1 possui um corte transversal que permite que ao menos dois microcarreadores 2 sejam dispostos lado a lado ao longo de todo o comprimento do microcanal 1, no- tavelmente na entrada 14, sem se tocarem e sem tocarem no perímetro.

No- ta-se que, a rigor, o microcanal 1 da invenção, que serve como uma câmara de reação 1, termina em qualquer meio de bloqueio que pode ser construído no microcanal (por exemplo, um filtro ou estrutura de tela ou a redução do - corte, etc.). Isso significa que qualquer porção microfluídica que contém um meio de bloqueio 4 não é considerada parte do microcanal 1 da invenção e, portanto, não é exigida para permitir que dois ou mais microcarreadores 2 permaneçam lado a lado. Para propósitos de clareza, quando um microcanal continua após o meio de bloqueio 4, essa parte é considerada como outro microcanal (que não serve como uma câmara de reação) conectado ao mi- crocanal 1 da invenção (que serve como uma câmara de reação), por exem- plo, para permitir que os fluidos saiam através de um local de saída (veja a figura 1).

O fato de que o corte transversal do microcanal 1 e o formato ' dos microcarreadores 2 permitem que ao menos dois microcarreadores E permaneçam lado a lado sem se tocarem e sem tocarem o perímetro não significa que esses devem se tocar ou tocar o perímetro. Isso significa ape- nas que as respectivas geometrias do microcanal 1 e dos microcarreadores 2 não obrigam que os microcarreadores 2 se toquem ou toquem o perímetro quando esses estiverem lado a lado, embora esses ainda devam fazer isso quando se movem livremente dentro do microcanal 1 ou à medida que esses seassentam após terem seu movimento longitudinal restringido. A capacidade de permanecerem lado a lado sem se tocarem e sem tocarem o perímetro do microcanal 1 significa que os microcarreadores 2 podem passar um pelo outro se esses se moverem em velocidades dife- rentes na direção longitudinal do microcanal 1, sem se submeterem a atrito contra as paredes do microcanal 1 ou uns contra os outros. Essa configura- ção reduz as chances de obstruir a entrada 14 até o microcanal 1 visto que é muito mais difícil formar arcos quando dois microcarreadores 2 puderem permanecer lado a lado na entrada 14 e notavelmente mais difícil em moda- lidades preferidas onde permite-se que mais de dois microcarreadores per- —maneçam lado a lado. lsso também permite que os microcarreadores 2 pas- sem um pelo outro sem serem obstruídos por um obstáculo. Os obstáculos podem ser resíduos que podem estar presentes no microcanal 1, por exem-

plo quando o método for realizado em um ambiente laboratorial de pesquisa (oposto a um ambiente industrial controlado) pouco antes de realizar um en- - saio. Os obstáculos também podem ser construções, como colunas, que são construídas no canal microfluídico 1 para facilitar a fabricação do microcanal 1ouparagarantir sua rigidez, por exemplo, no caso de microcanais constru- ídos utilizando polímeros macios como PDMS. A derivação do dispositivo que compreende o canal microfluídico 1 também ajuda durante a introdução dos microcarreadores 2. Quando micropartículas mais pesadas forem usa- das, como micropartículas de silício, a derivação é mais eficiente quando essaforrealizada em baixas frequências, tipicamente abaixo de 5 Herz.

Em uma modalidade mais preferida, mais de dois microcarrea- dores 2 podem ser dispostos lado a lado no microcanal 1 para reduzir ainda Ô mais a sensibilidade a obstáculos (por exemplo, pós) ou formação de arcos, , tipicamente de 3 (três) a 50 (cinquenta) microcarreadores, com mais prefe- rência, de 3 (três) a 12 (doze).

Em modalidades preferidas, os microcarreadores 2 possuem um formato que reduz a superfície de contato entre esses quando os mesmos estiverem no microcanal 1 para reduzir o atrito. Tipicamente, os formatos com superfícies curvadas, como esferas ou formatos semelhantes a disco, são preferidos comparados com superfícies com bordas (como formatos cú- bicos ou poligonais).

Em uma modalidade preferida, os microcarreadores 2 possuem um formato semelhante a disco que oferece o benefício adicional de ser fa- cilmente identificável em uma imagem. Outros formatos que apresentam su- perfícies curvadas que podem entrar em contato com outros microcarreado- res 2 também podem ser considerados, como os microcarreadores 2 sob a forma de um tablete com uma face frontal que possui um formato oval, elip- soide ou quase circular.

A disposição em monocamada Em uma modalidade mais preferida, o formato dos microcarrea- dores 2 e o corte transversal do microcanal 1 são selecionados de modo que os microcarreadores 2 formem uma disposição em monocamada e deixem aberto um corte mínimo em torno desses para que a amostra 9 flue. A "dis- posição em monocamada" como usada aqui se refere a uma configuração - espacial onde há um ponto a partir do qual todos os microcarreadores 2 po- dem ser observados em linha direta sem ocultar ou obstruir qualquer outra parte que é essencial para a sua identificação (ou seja, para determinar o código). No caso de um microcanal 1 que se estende de forma plana (ou seja, com uma direção longitudinal que se estende essencialmente de ma- neira horizontal) esse traduz a incapacidade de os microcarreadores 2 se sobreporem quando esses estiverem dentro do microcanal 1. Desde que o microcanal 1 seja transparente em ao menos um lado, a disposição em mo- nocamada é muito preferida visto que essa irá facilitar a leitura biológica e a identificação dos microcarreadores por meios ópticos simples diretamente í dentro da câmara de reação 1.

.- Combinado com o fato de que ao menos dois microcarreadores 2 podem estar lado a lado como estabelecido pela invenção, essa configura- ção forma uma disposição em monocamada quase bidimensional enquanto ainda irá reduzir o corte em torno dos microcanais para que a amostra 9 flua (veja, por exemplo, a figura 4). Como ilustrado na figura 4.2, isso não envol- ve necessariamente um alinhamento estrito dos microcarreadores 2 em um único plano. De preferência, permite-se que mais de dois microcarreadores 2 sejam posicionados lado a lado, tipicamente de 3 (três) a 50 (cinquenta) mi- crocarreadores 2, com mais preferência, de 3 (três) a 12 (doze). Essa dispo- sição irá consumir mais fluido de amostra 9 do que o alinhamento estrito dos microcarreadores 2 um atrás do outro como observado na técnica anterior, porém será muito mais fácil de preparar.

De preferência, o corte do microcanal 1 é constante na área on- de ocorre a reação nos microcarreadores 2 para facilitar a uniformidade das condições de fluxo.

Orientação e identificação dos microcarreadores Quando trabalha-se com microcarreadores codificados 2 em conjunto com a disposição em monocamada, é adicionalmente vantajoso selecionar o formato dos microcarreadores 2, o formato e o material do mi-

crocanal 1 e o mecanismo de decodificação de tal modo que os códigos E possam ser lidos sem a necessidade de manipular ativamente os microcar- . readores 2 para posicionar e/ou orientar os mesmos de maneira adequada quando esses forem observados diretamente no microcanal 1. Isso pode ser realizado, por exemplo, utilizando mecanismos de codificação que não exi- gem qualquer orientação ou posição particular, como o tamanho ou a cor do microcarreador total 2 que pode ser, por exemplo, esférica (desse modo, não exigindo qualquer orientação particular).

Alternativamente, o formato dos microcarreadores pode ser tal que sua rotação é passivamente restrita, ou seja, restrita sem exigir quais- quer forças externas que não aquelas resultantes das restrições geométri- cas, quando estiverem dentro do microcanal 1 de modo que qualquer código ' seja adequadamente apresentado a um dispositivo de observação/detecção. H Uma modalidade exemplificativa desse conceito é desenhar mi- crocarreadores 2 com a forma de um tablete que possui um código presente em uma ou ambas as faces e os coloca dentro de um microcanal 1 com um corte transversal retangular ou quase retangular que é, de preferência, feito de material transparente (veja a figura 8) ao menos na base 102 ou na co- bertura 103. A altura do microcanal 1 é, de preferência, menor do que a altu- rade dois microcarreadores, que têm o efeito que os microcarreadores 2 não podem se sobrepor. Desse modo, os microcarreadores formam uma disposição em monocamada e podem estar apenas invertidos, porém sem- pre apresentam essencialmente uma das superfícies a qualquer dispositivo de captação que é posicionado para observar o plano do microcanal 1 (como nafigura5). Essa restrição adicional sobre o formato dos microcarreadores 2 na verdade não torna seu carregamento muito mais difícil quando realizado através de um local de entrada vertical 5 com um fluido 9 que é sugado para dentro do microcanal 1 (como mostrado nas figuras 2 e 3) devido ao uso de um microcanal 1 que é relativamente grande comparado com o tamanho do —microcarreador 2, como fornecido pela invenção. As modalidades exemplifi- cativas de tal microcanal 1 podem ser observadas nas figuras 4 a 6. Se qualquer código estiver presente sobre uma face dos micro-

carreadores 2 esse é facilmente observável por todos os microcarreadores que possuem a face reta apresentada ao dispositivo (estatisticamente meta- py de desses). Ademais, se o código estiver presente ou visível a partir de am- bos os lados, então todos os microcarreadores 2 podem ser decodificados sema necessidade de qualquer manipulação ativa adicional para orientá-los.

Uma modalidade preferida desse conceito consiste em utilizar códigos que atravessam os microcarreadores 2 de modo que o código possa ser lido e interpretado de ambos os lados.

Nota-se que, se o esquema de codificação for padronizado (ao contrário de ser uma característica não loca- lizada da face total, como cor, tamanho, etc.), pode ser necessário que esse seja combinado com uma marca que indica a orientação (ou seja, uma mar- ca com uma assimetria como uma marca em forma de L ou um triângulo). A : figura 7 mostra uma imagem de uma modalidade exemplificativa de tal códi- : go criado utilizando furos atravessantes 21 em um microcarreador sob a forma de um tablete (um microcarreador semelhante a disco na figura). O dito esquema de codificação permite ainda identificar os microcarreadores independentemente do desempenho de um ensaio e independentemente de sua posição dentro do microcanal.

Visto que a orientação e a posição dos microcarreadores 2 no plano não são controladas, o método preferido para detectar e decodificar tais microcarreadores 2 em forma de tablete é capturar uma imagem ou vá- rias imagens da câmara de reação 1 utilizando um sensor tipo matriz (por exemplo, uma matriz de fotossensor CCD ou C-MOS) como ilustrado na fi- gura 5 ou um sistema de triagem rápida que constrói a imagem e então rea- liza uma operação analítica sobre a imagem para detectar a posição do mi- crocarreador 2 e interpretar seu código.

Essa operação analítica tipicamente inclui um algoritmo de identificação de formato como o algoritmo de Hough para detectar a posição dos microcarreadores 2 e uma "rotação virtual” do microcarreador 2 para interpretar seu código independentemente de sua ori- entação.A operação analítica sobre a imagem também é tipicamente capaz de reduzir ou eliminar o efeito da presença de resíduos ou bolhas de ar na câmara de reação 1. Uma "fotografia" tirada por uma câmera CCD (ou C-

MOS) com um microscópio pode ser usada para detectar e decodificar tais É microcarreadores 2 e essa mesma câmera também pode ser usada para ler - o sinal fluorescente para a leitura biológica (como mostrado na figura 8). Introdução de microcarreadores no microcanal O microcanal 1 da invenção possui uma entrada 14 que permite a introdução dos microcarreadores 2 no microcanal 1. Um método clássico para introduzir as micropartículas 2 no microcanal 1 é colocar as mesmas em uma suspensão em uma solução tampão que flui através de um local de entrada 5, conectado à entrada 14, no microcanal 1.

O microcanal 1 possui, de preferência, próximo à sua entrada 14, um corte aumentado 6 conectado a um ou mais poços verticais 7 que servem como o local de entrada 5 para introduzir as micropartículas 2 no ' microcanal 1 (veja as figuras 2, 3). O corte aumentado 6 forma um funil que y permite orientar os microcarreadores 2 e os fluidos 9 a partir do local de en- trada5S5 para dentro do microcanal 1.

Como explicado acima, o microcanal 1 da invenção possui um corte transversal relativo ao formato dos microcarreadores 2 que permite possuir ao menos microcarreadores 2 dispostos lado a lado no microcanal 1 ao longo de todo o seu comprimento, particularmente na entrada 14, redu- zindo assim as chances de obstruir a entrada 14 mediante a formação de arcos.

Um problema comum que é encontrado quando as micropartícu- las 2 forem introduzidas em suspensão nos microcanais 1 é que, quando o fluxo 9 é interrompido (por exemplo, quando muda de uma solução para ou- tra), as micropartículas restantes 2 tendem a se depositar no fundo do poço 7, possivelmente em áreas onde essas podem ser capturadas em vórtices laminares 8 (veja a figura 3). Isso as tornam difíceis de se moverem de ma- neira controlada e aumenta o risco de conjuntos diferentes de microcarrea- dores 2 serem misturados, o que não ocorre se os microcarreadores 2 forem individualmente codificados, porém poderia ser problemático se os microcar- readores 2 de cada conjunto precisassem ser introduzidos de maneira con- trolada no microcanal 1 como exigido pela técnica existente. Tipicamente,

leva tempo para que as micropartículas 2 sejam completamente assentadas e residirem no fundo do local de entrada 5. Essas são então movidas para - dentro do microcanal 1 sob as ações combinadas da aspiração da solução tampão e de forças de gravidade que atuam sobre as micropartículas 2 ao inclinaro dispositivo.

Esse método é particularmente eficaz para microparti- - culas pesadas 2 como micropartículas de silício.

A agitação e o movimento podem ajudar adicionalmente o processo.

Para superar o problema de micropartículas 2 que se assentam em locais onde essas não podem ser removidas, em uma modalidade da invenção, além do poço 7 um segundo poço 7' usado como um local de en- trada 5' para um fluxo de enxágue 9' está presente.

Assim, um fluxo de en- xágue contínuo 9' (ou micropulsado) que flui através do microcanal 1 pode Í ser obtido enquanto introduz-se as micropartículas 2 para impedir a sedi- : mentação dessas (veja a figura 2). Quando as micropartículas 2 forem pesa- das, como as feitas de silício, isso geralmente não é exigido visto que as forças de gravidade que atuam sobre as micropartículas 2 ao inclinar o dis- positivo são suficientes para mover as mesmas na direção desejada.

Também é aconselhado purgar um fluido limpo 9 (ou seja, sem micropartículas em suspensão) no local de entrada 5 das micropartículas após a introdução de micropartículas para garantir que nenhuma partícula seja deixada no poço 7 ou na extremidade aumentada 6 do microcanal 1. Isso também pode ser combinado com uma inspeção óptica da extremidade aumentada 6 do microcanal 1 para aumentar adicionalmente a confiabilidade do procedimento.

Método Em um segundo aspecto, a invenção proporciona um método para realizar um ensaio multiplexado baseado em microcarreadores que compreende as etapas de a) proporcionar um dispositivo de ensaio que compreende um —microcanal 1 como a câmara de reação e proporcionar ao menos dois con- juntos de microcarreadores codificados 2, em que o código dos ditos micro- carreadores 2 é indicativo da função e em que o formato e o tamanho dos ditos microcarreadores 2 relativos ao corte transversal do dito microcanal 1 i permitem possuir, ao longo de todo o comprimento do dito microcanal 1, ao - menos dois dos ditos microcarreadores 2 que se encontram lado a lado; b) preencher ao menos parcialmente o dito microcanal 1 com os ditos aomenos dois conjuntos de microcarreadores codificados 2; - c) restringir o movimento dos ditos microcarreadores 2 na dire- ção longitudinal do dito microcanal 1 enquanto ainda permite-se que os flui- dos 9 fluam; d) permitir o fluxo de uma amostra que compreende potencial- mente uma ou mais moléculas-alvo 3 através do dito microcanal 1 que com- preende os ditos microcarreadores 2; e) identificar os conjuntos de microcarreadores 2; e í f) detectar uma reação entre o ligante e a molécula-alvo, ou seja, N realizar uma leitura biológica, e correlacionar a presença ou ausência de umareação com a identidade de um conjunto específico para deduzir a pre- sença ou ausência de uma molécula-alvo 3 na amostra. Isso está tipicamen- te correlacionado com a identificação dos microcarreadores 2.

O microcanal 1, os microcarreadores 2 e o meio de restrição 4 são, de preferência, aqueles descritos acima. Consequentemente, o elemen- toversado na técnica irá reconhecer que as etapas (a) a (c) do método para realizar os ensaios multiplexados descritos aqui como um segundo aspecto da invenção realmente formam um dispositivo de ensaio multiplexado do primeiro aspecto da invenção. As descrições de cada um desses dois aspec- tos da invenção podem ser, portanto, entendidas no contexto do outro as- pecto.

Para propósitos de multiplexação, o microcanal 1 é, de preferên- cia, carregado com conjuntos diferentes de microcarreadores 2, sendo que cada conjunto possui uma funcionalização diferente. Todos os conjuntos es- tão presentes na câmara de reação antes da amostra fluir e esses são sub- metidos ao ensaio simultaneamente. Visto que mais de um conjunto de mi- crocarreadores funcionalizados 2 é usado e a posição dos microcarreadores não precisa ser controlada, os vários conjuntos de microcarreadores 2 preci-

sam ser distinguíveis uns dos outros, ou seja, deve haver uma maneira de Ú determinar a função dos microcarreadores 2 quando esses estiverem na - câmara de reação 1, independentemente de sua posição dentro do microca- nal 1. Isso é realizado utilizando microcarreadores codificados 2 em que o código é indicativo da função. Exemplos de códigos foram descritos acima. - Para as técnicas de multiplexação, também é desejado que os microcarrea- dores possam ser distinguidos e/ou identificados mesmo na ausência de um sinal produzido por um analito, ou seja, independentemente do desempenho do ensaio (ou seja, a técnica não deve contar com a presença do analito pa- rarevelar a qual conjunto um microcarreador pertence) visto que há modali- dades onde os conjuntos não podem ser revelados no caso de ausência do alvo correspondente, desse modo, tornando o controle de qualidade difícil e Ô também limitando significativamente o número de conjuntos diferentes que ' pode ser usado (ou seja, o nível de multiplexação), pois há uma necessidade de contar com métodos onde a reação deve ser distinguível para cada con- junto (em caso de leituras fluorescentes, isso é tipicamente realizado utili- zando fluoróforos diferentes, porém o nível de multiplexação é então limitado por suas características espectrais e, na prática, isso é traduzido para um máximo típico de 5 ou 6 conjuntos diferentes de microcarreadores que po- dem ser usados simultaneamente). Isso pode ser obtido utilizando técnicas de codificação física. Por exemplo, os microcarreadores podem ser individu- almente codificados ou de outro modo produzidos com um atributo que é distintivo mediante a observação assim como o código ou atributo é indicati- vo da função.

Em uma modalidade preferida dos exemplos de códigos descri- tos acima na descrição do primeiro aspecto, os microcarreadores 2 do méto- do possuem um formato semelhante a disco e, com ainda mais preferência, esses possuem um código que compreende furos atravessantes 21, de pre- ferência, também incluem uma marca de orientação 20. Consequentemente, o microcanal 1 possui, de preferência, um formato plano com um corte transversal retangular e os microcarreadores 2 são dispostos em uma mo- nocamada dentro do microcanal 1 (como na figura 6).

A etapa (b) pode ser realizada ao fluir um fluido 9 que compre- P ende os microcarreadores 2 em suspensão através de um local de entrada 5 - que se conecta à entrada 14 do canal microfluídico 1, de preferência, através de um corte aumentado 6. Como explicado acima, a implementação prática dessa etapa é facilitada pelo fato de que o corte transversal do microcanal 1 - é tal que ao menos dois microcarreadores podem permanecer lado a lado no canal microfluídico 1 ao longo de todo o seu comprimento. A etapa (b) tam- bém pode ser acompanhada por uma derivação do dispositivo de ensaio que compreende o microcanal. Isso poderia facilitar o fato de que os microcarre- adores podem passar uns pelos outros, como permitido pela geometria da configuração, na ocorrência onde um microcarreador poderia ser bloqueado por um obstáculo.

" Para a etapa (b), prefere-se permitir estritamente que mais de 1 dois microcarreadores sejam dispostos lado a lado sem tocarem as paredes do microcanal. Tipicamente, permitindo-se que 3 (três) a 50 (cinquenta) mi- crocarreadores sejam dispostos lado a lado pode-se facilitar a preparação da configuração visto que isso permite reduzir os riscos de obstruir a entrada do microcanal e também enfrentar os obstáculos ou resíduos que podem estar no microcanal.

A etapa (c) é implementada pelo uso de um meio de restrição como descrito na descrição do meio de restrição acima. Os microcarreado- res 2 têm seu movimento na direção longitudinal restringido ou são imobili- zados dentro do microcanal 1 enquanto ainda permitem que os fluidos fluam.

Na etapa (d), a amostra que possivelmente compreende a(s) —molécula(s) de interesse flui através do microcanal 1 e, desse modo, entra em estreito contato com os microcarreadores 2. Isso pode ser realizado utili- zando várias técnicas inclusive pressão, potencial elétrico (fluxo eletro- osmótico), capilaridade, forças de gravidade ou centrífugas. Em uma moda- lidade preferida, o microcanal 1 é conectado em uma extremidade a um ou mais locaisde entrada 5 (como explicado acima) e na outra extremidade a um ou mais locais de saída, permitindo que os fluidos sejam movidos ao a- plicar uma pressão diferencial entre um ou mais locais de entrada e um ou mais locais de saída, criando assim um fluxo induzido por pressão (PDF). Pressões positivas e/ou negativas (sucção) podem ser aplicadas a um ou - mais locais de entrada e/ou locais de saída utilizando mecanismos de bom- beamento ou pneumáticos. Assim, em uma modalidade, os fluidos 9 são movidos ao aplicar uma pressão positiva em um local de entrada conectado * ao microcanal e/ou uma pressão negativa (sucção) em um local de saída conectado ao microcanal. Os fluidos 9 podem fluir de maneira contínua ou de maneira interrupta (ou seja, uma sequência para mover os fluidos 9 e os fluidos estáticos 9 no microcanal).

A velocidade na qual a amostra 9 deve fluir, e, desse modo, o tempo que uma molécula de interesse passa em proximidade a um microcar- reador 2, podem ser otimizados com base na velocidade de difusão das mo- ] léculas-alvo 3 e na concentração de microcarreadores 2 revestidos com re- p ceptores 10 da molécula-alvo 3.

Visto que os microcarreadores 2 possuem seu movimento longi- tudinal restringido na câmara de reação, é fácil realizar as etapas de ensaio adicionais, se necessário. Isso pode ser simplesmente realizado ao permitir o fluxo de vários fluidos 9 de maneira sequencial ou simultânea, por exem- plo, para realizar uma lavagem ou a adição de novos reagentes, sem exigir qualquer manipulação particular dos microcarreadores 2.

Em uma modalidade, a amostra 9 flui para trás e para frente dentro do microcanal 1. De preferência, esse movimento é otimizado para ocorrer em uma distância correspondente à distância média entre dois mi- crocarreadores 2 que possuem os ligantes 10 da mesma molécula-alvo 3.

Uma modalidade em que a amostra 9 é movida para trás e para frente pode ser realizada utilizando o meio de bloqueio 4 baseado em forças que atuam sobre as micropartículas 2 (como forças magnéticas) ou utilizando um meio de bloqueio "ativável" 4 próximo à entrada 14 do microcanal 1 (como a com- pressão de uma parte do microcanal 1) para permitir a introdução dos micro- carreadores 2 antes de ativar o meio de bloqueio 4.

Em uma modalidade adicional, a amostra 9 é recirculada ao lon- go de todo o microcanal 1 proporcionando uma conexão fluídica a partir do local de saída até o local de entrada e um meio para atuar os fluidos como E uma bomba peristáltica. - A recirculação ou o movimento para trás e para frente da amos- : tra 9 é útil em situações onde é difícil controlar a velocidade da amostra 9 el/ounocaso de amostras muito diluídas 9.

- A etapa de identificação (e) pode ser realizada antes, durante ou após o fluxo da amostra (etapa d). Essa também pode ser realizada simulta- neamente ou após a detecção da reação (etapa f), em particular quando os microcarreadores 2 forem identificáveis independentemente do desempenho doensaio, por exemplo, ao combinar os métodos que são usados para am- bos os objetivos, por exemplo, utilizando métodos ópticos similares como captura de imagem e análise tanto para identificar os conjuntos como detec- ' tar as reações. A identificação é realizada utilizando microcarreadores codifi- E: cados 2 como já descrito acima em várias passagens. Embora sua posição no microcanal 1 não seja controlada, os conjuntos diferentes de microcarre- adores 2 da invenção podem ser identificados e/ou distinguidos quando es- ses estiverem no microcanal 1 com base nas características intrínsecas que não precisam ser reveladas pela presença de moléculas-alvo, ou seja, inde- pendentemente do desempenho do ensaio e independentemente de sua posição dentro do microcanal 1, por exemplo, por um código sob a forma de furos ou pelo formato dos microcarreadores.

A etapa de detecção (f) pode ser realizada durante o fluxo da amostra (etapa d) para obter informações cinéticas sobre o progresso da reação à medida que o ensaio procede ou após a etapa (d) para leitura final.

Também é possível realizar a identificação dos vários conjuntos antes do fluxo da amostra (etapa d). A etapa de detecção pode, por exemplo, envol- ver a observação dos microcarreadores (por exemplo, detecção óptica) ou a detecção dos microcarreadores (por exemplo, detecção magnética), um por um ou vários simultaneamente, por exemplo, por meio de técnicas de obser- vação de campo. Os microcarreadores 2 do método descrito aqui são, de preferência, os microcarreadores 2 descritos acima.

Além de realizar o ensaio, uma leitura biológica é realizada para determinar quais microcarreadores 2 foram reagidos e, opcionalmente, o À grau (veja etapa f). Em uma modalidade preferida, o microcanal 1 é dese- . nhado para permitir a observação dos microcarreadores 2 diretamente den- tro do microcanal 1 ao permitir que os sinais observáveis atravessem ao menos um lado da porção que contém os microcarreadores 2. Em uma mo- - dalidade mais preferida, o microcanal 1 é transparente em ao menos um la- do e sobre uma porção para permitir a observação óptica. Alternativa ou adi- cionalmente, o microcanal 1 também pode ser permeável a campos magné- ticos ou radiação eletromagnética e permite a detecção magnética ou ele- tromagnética dos microcarreadores para identificar os vários conjuntos e/ou realizar a leitura biológica (por exemplo, utilizando marcadores magnéticos). Em uma modalidade preferida, os microcarreadores 2 possuem : uma disposição em monocamada e o microcanal 1 é transparente em ao ! menos um lado permitindo uma observação óptica direta simples de todos os microcarreadores 1 individualmente. Se os microcarreadores não estive- rem em uma disposição em monocamada, técnicas ópticas confocais mais complexas podem ser usadas desde que os microcarreadores sejam (se- miltransparentes.

A leitura biológica é tipicamente realizada ao gerar um sinal ob- servável, de preferência, um sinal opticamente observável, quando a ligação ocorrer, por exemplo, por meio de uma resposta luminométrica ou uma res- posta magnética ou outro tipo de emissão eletromagnética, tipicamente utili- zando uma molécula marcada complementar. A reação pode ser indicada por uma resposta colorimétrica, quimiluminométrica, emissão de pontos quânticos e/ou resposta fluorométrica. A leitura biológica também pode obter informações quantitativas (ou seja, informações sobre a quantidade de anali- to presente na amostra) ao medir a intensidade do sinal que é gerado pela reação. Visto que diversos conjuntos de microcarreadores são usados em uma câmara de reação, é necessário que o mecanismo de geração de sinal seja colocalizado no microcarreador e não liberado no volume da solução. Tipicamente, a reação é revelada utilizando uma molécula complementar que se liga ao complexo formado pelo ligante e a molécula-alvo (se o último estiver presente na amostra). Alternativamente, pode haver um complexo ] que compreende um fluoróforo e um supressor fixado à superfície do micro- - carreador e uma reação que é projetada para clivar o supressor enquanto deixa o fluoróforo ancorado na superfície, portanto, gerando um sinal sobre a i 5 superfície do microcarreador.

A leitura biológica também pode envolver téc- : nicas de detecção isentas de marcador conhecidas, por exemplo, Resso- nância Plasmônica de Superfície (SPR) ou métodos elétricos (por exemplo,

alteração na condutividade). Como ilustrado na figura 5, um método preferido consiste em preparar uma configuração onde os microcarreadores 2 estão em uma dis- posição monocamada e em posicionar um sensor, de preferência, um sensor óptico, para observar os microcarreadores 2 diretamente na área onde a re- í ação ocorre, ou seja, dentro da câmara de reação 1, de preferência, sem B mover os microcarreadores 2. O sensor poderia ser um sensor de campo amplo que observa/capta múltiplos microcarreadores 2 de uma vez (por e- xemplo, uma matriz de fotossensor CCD ou CMOS acoplada com o meio óptico necessário como lentes e objetivas para formar uma configuração re- lacionada a um microscópio) ou um sensor de campo estreito (por exemplo, um fotodiodo, um fotomultiplicador, ou um scanner confocal, ou um sensor magnético) que observa/capta um microcarreador de uma vez.

Para senso- res ópticos, o microcanal 1 precisa ser transparente ao menos em um lado a partir do qual os microcarreadores são observados.

De preferência, um sen- sor de campo amplo é usado para "capturar" uma imagem ou uma série de imagens dos microcarreadores 2 dentro da câmara de reação 1 e revelar as reações através do processamento de imagem.

Essa técnica pode ser com- binada com a detecção dos códigos para identificar os conjuntos de micro- carreadores desde que o mecanismo de codificação se baseie em contraste óptico que pode ser detectado com óptica similar (por exemplo, utilizando um mecanismo de codificação baseado em furos atravessantes). Um sensor de campo estreito também pode ser usado, porém precisa ser movido de modo a passar por todos os microcarreadores 2 e gerar um sinal que pode ser analisado para revelar as reações.

Visto que a posição dos microcarrea-

dores 2 é relativamente livre dentro do microcanal 1, o sensor de campo es- Ê treito pode ser usado de maneira onde esse construa uma imagem ao exa- ' minar a câmara de reação 1. Alternativamente, diversos sensores de campo estreito podem ser usados para observar várias zonas do microcanal 1 si- i 5 multaneamente. Também é possível combinar o uso de um sensor de cam- : po amplo para a identificação dos microcarreadores 2 juntamente com um sensor de campo estreito para a detecção da reação.

Nas modalidades onde os microcarreadores 2 são observados diretamente na câmara de reação 1, o meio de bloqueio 4 não precisa ser removido e os microcarreadores 2 não precisam ser liberados para propósi- tos de detecção; entretanto, o microcanal 1 é, de preferência, transparente ao menos em um lado e/ou ao menos em uma porção permitindo a observa- ' ção óptica dos microcarreadores 2. Essa modalidade também permite a lei- | tura cinética da reação. Na verdade, é possível observar as indicações bio- lógicas à medida que o ensaio progride e, portanto, obter informações atuais sobre a cinética de reação (veja a figura 9). Alternativamente aos sensores ópticos, outros tipos de sensores, como sensores magnéticos ou espectro- métricos, também poderiam ser usados se o ensaio for projetado para alterar a assinatura magnética ou o espectro de emissão dos microcarreadores 2 quando uma reação ocorrer. Isso pode realizado, por exemplo, utilizando "marcadores magnéticos" fixados a anticorpos complementares da mesma maneira que os marcadores fluorescentes são usados. Outra alternativa consiste em liberar ou mover, no final do ensai- o, os microcarreadores 2 através de outra porção do microcanal 1 (uma por- çãode observação ou janela) e ler os sinais biológicos à medida que esses passam, similar ao que é realizado em Fluorescent-Activating Cells Sorting [FACS] ou, alternativamente, recuperar os microcarreadores 2 através de um poço de saída e colocar os mesmos em outro dispositivo para observação, por exemplo, em uma lâmina de microscópio posicionada em um microscó- —piofluorescente. Esse método permite apenas a leitura biológica final, porém não permite a leitura cinética. Aqui, novamente um sensor de campo amplo (como uma matriz de fotossensor CCD ou C-MOS) ou um sensor de campo estreito (como um fotodiodo) pode ser usado.

Isso também pode ser combi- ' nado com a detecção do código para identificar os conjuntos de microcarre- ' adores 2. Para o dito propósito, a restrição do movimento longitudinal deve ser removida como explicado acima, por exemplo, ao remover o meio de : 5 —bloqueio4 ouaoremover o campo magnético. - Na etapa (f), a observação da leitura biológica está correlaciona- da com a identidade de um microcarreador 2 como observado na etapa (e). Essa correlação de duas observações (ou seja, a observação da identidade e a observação do sinal biológico) pode, por exemplo, ser feita ao combinar as duas observações em uma (ou seja, utilizando um mesmo sinal ou uma mesma imagem óptica) ou utilizando a posição dos microcarreadores para correlacionar as duas observações (ou seja, utilizando dois sinais ou ima- 7 gens ópticas que correspondem à mesma posição espacial onde o microcar- : reador 2 está presente). A disposição estática dos microcarreadores 2 facilita essa correlação visto que as duas observações podem ser separadas no devido tempo, por exemplo, quando a etapa de identificação (e) for realizada antes do fluxo da amostra (etapa d). Em uma modalidade preferida, a etapa de identificação (e) é realizada essencialmente de maneira simultânea com a etapa de leitura biológica (f) para garantir que qualquer movimento inadverti- do dos microcarreadores 2 não impeça a correlação da identidade dos mi- crocarreadores 2 com seu sinal biológico.

Isso pode ser realizado, por e- xemplo, ao obter duas imagens com uma câmera CCD ou C-MOS simulta- neamente ou em um período de tempo muito curto após ou durante o fluxo da amostra (etapa d). A primeira imagem, tipicamente uma imagem de cam- —poclaro,é usada para identificar os microcarreadores 2 enquanto a segunda imagem, tipicamente uma imagem fluorescente, é usada para realizar a leitu- ra biológica.

Alternativamente, a identificação e a leitura biológica podem estar baseadas em uma única observação (por exemplo, uma mesma ima- gem). A última é aplicável a modalidades onde os microcarreadores 2 são liberados em uma área de observação e observados à medida que passam.

Chip Em outro aspecto, a invenção proporciona um chip 13 para a multiplexação. O dito chip 13 compreende o dispositivo de ensaio descrito no ] primeiro aspecto da invenção. Um chip exemplificativo 13 é mostrado na fi- . gura 11. O dito chip 13 pode ser, por exemplo, usado para propósitos de di- agnóstico. Em uma modalidade mais preferida, os microcarreadores 2 po- dem ser observados sem a necessidade de liberar os microcarreadores 2 do D microcanal 1. Exemplo 1 Uma configuração contendo um microcanal conectado a um po- ço de entrada e a um poço de saída e que compreende uma estrutura de filtro bem como colunas centrais de estabilização (veja a figura 17) foi fabri- cada utilizando técnicas de moldagem PDMS e fixada a uma lâmina de mi- croscópio de vidro (como descrito em Fundamentals and Applications of Mi- q crofluiddcs by Nam-Trungg Nguyen and Steve Wereley ISBN: . 9781580533430, capítulo 3).

Os microcarreadores de silício semelhantes a disco com um pa- drão de furos atravessantes sobre a periferia (para servir como o código) foram produzidos. Isso foi realizado em um ambiente limpo utilizando técni- cas de microfabricação baseadas em tablete que permitem a produção de milhares de microcarreadores com um diâmetro de 50 micrômetros e uma espessura de 10 micrômetros. O fluxo do processo foi composto das seguin- tes etapas: 1) proporcionar um tablete de SOI (silício sobre isolante) (tablete de substrato de 10,16 cm (4 polegadas) de diâmetro, 380 um de espessura, 1 um de espessura de BOX, 10 um de camada de dispositivo); 2) delinear o formato dos microcarreadores e seu código (veja a figura 18) utilizando técnicas de fotolitografias tradicionais (um método de "spin-coating" de um obstáculo protetor fotossensível, iluminação UV através de uma máscara, desenvolvimento, gravação do silício da camada de dispo- Sitivo, e por fim remoção do obstáculo); 3) preparar o desprendimento dos microcarreadores ao gravar a camada BOX do tablete; 4) depositar uma camada de óxido de uma espessura de apro-

ximadamente 110 nm por PECVD (deposição de vapor químico intensificada : por plasma) sobre os microcarreadores.

Essa camada é necessária para ! garantir um sinal fluorescente adequado sobre as partículas de silício (Bras, M., et al., Optimisation of a silicon/silicon dioxide substrate for a fluorescence —DNA microarray.

Biosensors & bioelectronics, 2004. 20(4): p. 797-806; Volle, - J.N,, et al., Enhanced sensitivity detection of protein immobilization by fluo- rescent interference on oxidized silicon.

Biosensors and Bioelectronics, 2003. 19(5): p. 457-464); 5) liberar os microcarreadores do substrato ao imergir o tablete em uma solução líquida como acetona sob sonicação.

Esse procedimento foi repetido para produzir dois conjuntos de microcarreadores com vários códigos diferentes. 7 Aproximadamente 300.000 microcarreadores de cada código fo- ram então funcionalizados com aminas primárias sobre a superfície por rea- ção com 10% v/v (3-aminopropil)trietoxissilano em 1 mL de acetona à tem- peratura ambiente durante 1 h com agitação.

Os microcarreadores foram peletizados e ressuspensos em 1 mL de 10 mM de tampão de borato, 150 mM de NaCl! pH 8,2 contendo 0,1% de Tween-20 (BBST). Os grupos amino sobre a superfície dos microcarreadores foram ativados ao adicionar 800 ul de10%vWde glutaraldeido em BBST.

Os microcarreadores foram aplicados nessa solução à temperatura ambiente durante 1 h.

Após a etapa de ativa- ção, os microcarreadores foram lavados em 1 mL de BBST 3 vezes.

Após isso, dois conjuntos de microcarreadores foram revestidos com sondas biológicas P1 (5' - CAA CCC CAG CTA ATA TTA TT — 3) e P2 (5-TGGGTAAGTTAG GGC GAT GG — 3'), respectivamente, ao adicionar uma solução de 500 nM de oligonucleotídeo (P1 ou P2) modificado por ami- no (5'- ou 3-) em BBST.

Os microcarreadores foram então agitados nessa solução à temperatura ambiente durante 1 h.

Após as etapas de lavagem como descrito acima com BBST, os grupos funcionais não reagidos foram — bloqueados pela reação com 35 mM de glicina em BBST à temperatura am- biente durante 15 min.

Os microcarreadores foram lavados com BBST duas vezes e então armazenados no mesmo tampão.

Uma suspensão de mistura principal dos dois conjuntos de mi- ] crocarreadores foi preparada ao misturar cuidadosamente 10 ul. da suspen- : são de microcarreador de cada conjunto como preparado acima. A mistura dos dois conjuntos de microcarreadores funcionalizados foi então carregada ' 5 nomicrocanal ao pipetar a suspensão de mistura principal no local de entra- ' da e aplicar pressão negativa no local de saída para sugar a suspensão de mistura principal de microcarreadores dentro do microcanal. O microcanal PDMS foi anteriormente carregado com etanol para aprimorar o comporta- mento hidrofílico.

Uma solução de amostra de alvos T1 (5' Cy5 — AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG — 3') complementar com P1 foi preparada ao fornecer uma solução de 200 nM de oligonucleotídeo T1 marcado com fluoróforo Cy5 ] na extremidade 5' em 5 x SSPE (contendo 125 mM de tampão de fosfato, 745 mM de NaCl, 5 mM de EDTA pH 7,4).

Após remover qualquer excesso de solução do poço de entrada, essa solução de amostra foi adicionada ao poço de entrada e purgada atra- vês do canal à temperatura ambiente durante 5 min. Após purgar a sequên- cia-alvo T1, o excesso de solução foi removido do poço de entrada e os mi- crocarreadores foram lavados por purgação 2 x SSC (15 mM de citrato de sódio, 150 mM de NaCl, pH 7) à temperatura ambiente durante 1 minuto. O sinal de fluorescência nos dois conjuntos de microcarreadores foi observado, através da camada de vidro, em um microscópio de fluorescência (Zeiss A- xiovert 135) com um conjunto de filtro Cy5. A figura 8 mostra os resultados do experimento como capturado por uma câmera CCD (câmera Hamamatsu —ORCA C4742-80-12AG).

Embora as modalidades e exemplos atualmente preferidos da invenção sejam mostrados e descritos, deve ser claramente entendido que a invenção não se limita a esses, porém podem ser, de outro modo, incorpo- rados e praticados dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES f 1. Dispositivo de ensaio que compreende uma câmara de reação : e ao menos dois conjuntos de microcarreadores individualmente codificados 2) Ú 5 em que a câmara de reação é um microcanal (1); e " em que os microcarreadores (2) possuem um formato relativo ao corte transversal do microcanal (1) que permite possuir, ao longo de todo o comprimento do microcanal (1), ao menos dois microcarreadores (2) dispos- tos lado a lado sem se tocarem e sem tocarem o perímetro do microcanal 10 (je em que o dispositivo (1) compreende um meio (4) para restringir o movimento dos microcarreadores (2) na direção longitudinal do microcanal (1) enquanto permite que os fluidos fluam; e em que o código dos microcarreadores é indicativo da função.
2. 2. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 1, em que o microcanal (1) é transparente ao menos em um lado e/ou ao menos em uma porção permitindo a observação óptica dos microcarreadores (2).
3. 3. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 ou 2, em que o corte transversal do microcanal (1) é retangu- larou quase retangular.
4. 4. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, em que os microcarreadores (2) possuem um formato re- lativo ao corte transversal do microcanal (1) que permite possuir, ao longo de todo o comprimento do microcanal (1), ao menos três dos microcarreadores (2) que são dispostos lado a lado sem se tocarem e sem tocarem o períme- tro do microcanal (1).
5. 5. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 4, em que os microcarreadores (2) são limitados a uma con- figuração em monocamada dentro do microcanal (1).
6. 6. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, em que os microcarreadores (2) possuem a forma de um tablete.
7. 7. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- Á vindicações 1 a 6, em que os microcarreadores (2) possuem um código sob : a forma de uma configuração de furos atravessantes (21).
8. 8. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- ' 5 vindicações 1 a7,em que o meio (4) para restringir o movimento dos micro- - carreadores (2) é uma construção de barreira, uma ou mais colunas, uma redução do corte transversal do microcanal, uma grade, um filtro de tela, uma ou mais micropartículas retidas utilizando forças dieletroforéticas, ou uma ou mais micropartículas magnéticas retidas em um campo magnético.
9. 9. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, em que os microcarreadores (2) são imobilizados através de um campo magnético ou utilizando forças dieletroforéticas. ”
10. 10. Dispositivo de ensaio, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 9, em que o movimento rotacional dos microcarreadores (2) dentrodo microcanal (1) é restringido em ao menos uma direção.
11. 11. Método para realizar um ensaio multiplexado baseado em microcarreadores que compreende as etapas de a) proporcionar um dispositivo de ensaio, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; b) preencher ao menos parcialmente o dito microcanal (1) com os ditos ao menos dois conjuntos de microcarreadores codificados (2); c) restringir o movimento dos ditos microcarreadores (2) na dire- ção longitudinal do dito microcanal (1) enquanto ainda permite-se que os fluidos fluam; d) permitir o fluxo de uma amostra (9) através do dito microcanal (1) que compreende os ditos microcarreadores (2); e) identificar os conjuntos de microcarreadores (2); e f) realizar uma leitura biológica em correlação com a identidade dos microcarreadores (2).
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa (e) é realizada ao observar os microcarreadores (2) diretamente na câmara de reação (1).
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a j etapa (f) é realizada simultaneamente com a etapa (d) e proporciona resul- : tados ao longo do tempo.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o 7 5 microcanal (1) é transparente ao menos em um lado e ao menos uma por- - ção e a etapa (f) é realizada utilizando uma matriz de sensores ópticos aco- plada com meios ópticos, em que o sensor é um fotossensor CCD ou C- MOS.
15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a14 em que os microcarreadores (2) possuem um formato relativo ao corte transversal do microcanal (1) que restringe seu movimento rotacional.
16. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 - a 15, em que a etapa (e) é realizada antes da etapa (d) e/ou simultaneamen- te com a etapa (f).
17. 17. Chip para ensaios multiplexados que compreende ao menos um dispositivo de ensaio, conforme definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10.

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