BRPI0924177B1

BRPI0924177B1 - polipeptídeo com atividade de xilanase, composição e uso do mesmo

Info

Publication number: BRPI0924177B1
Application number: BRPI0924177-9A
Authority: BR
Inventors: Ole Sibbesen; Jens Frisbaek Sorensen
Original assignee: Dupont Nutrition Biosciences Aps
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2020-10-13
Also published as: DK3444343T3; JP5713918B2; EP2382309B1; ES2561427T3; EP3037528A3; DK3037528T3; EP3037528B1; WO2010072224A1; EP2382309A4; US20150175992A1; EP3444343A1; JP2012513206A; US20110312058A1; EP3037528A2; US9249403B2; CN104293747A; CA2747223A1; UA103216C2; MX2011006645A; KR20110104539A

Abstract

POLIPEPTÍDEO, SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO, SUA COMPOSIÇÃO, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO E USO. A presente invenção refere-se a polipeptídeos com atividade de xilanase modificada para aumentar a solubilização e/ou atividade de xilanase. A modificação compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na posição 110 e pode ter também modificações de um ou mais aminoácidos na posição 11, 12, 13, 34, 54, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 ou 175, em que as posições são determinadas como a posição que corresponde à posição de xilanese de Bacillus subtilis (SEQ ID N°:l). Os polipeptídeos têm pelo menos 88% de identidade com a SEQ ID N°:l ou 75% de identidade com uma sequência selecionada de SEQ ID N°: 2-22.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a polipeptídeos com atividade de xilanase e usos dos mesmos. A presente invenção também refere-se a um método de modificação de polipeptídeos com atividade de xilanase para afetar, preferivelmente aumentar, a atividade de xilanase e/ou solubilidade de farelo.

Antecedentes da Invenção

Durante muitos anos, endo-β-1,4-xilanases (EC 3.2.1.8) (referido aqui como xilanases) foi utilizado para a modificação de carboidratos complexos derivados de material de parede celular de planta. É bem conhecido na técnica que a funcionalidade de xilanases diferentes (derivadas de diferentes micro-organismos ou plantas) difere enormemente. Com base na informação estrutural e genética, xilanases foram classificadas em diferentes famílias de Glicosídeo hidrolase (GH’s) (Henrissat, 1991; Coutinho e Henris- sat, 1999). Até recentemente, todas as xilanases conhecidas e caracterizadas pertenciam às famílias GH10 ou GH11. Trabalho recente identificou numerosos outros tipos de xilanases que pertencem às famílias GH5, GH7, GH8 e GH43 (Coutinho e Henrissat, 1999; Collins e outros, 2005). Até agora a família GH11 difere de outros GH’s, sendo a única família somente consistindo em xilanases específicas de xilano. A estrutura das xilanases GH11 pode ser descrita como uma estrutura de cilindro β-jeleia (veja, figura 1, descrita aqui).

US 6.682.923 refere-se à atividade de proteínas xilanase e ácidos nucleicos.

Estudos abrangentes caracterizando a funcionalidade de xilanases foram feitos em substratos bem caracterizados e puros (Kormelink e outros, 1992). Estes estudos mostram que xilanases diferentes têm diferentes requerimentos específicos com respeito à substituição do esqueleto de xilo- se do arabinoxilano (AX). Algumas xilanases requerem três resíduos de xilo- se não substituídos para hidrolisar o esqueleto de xilose; outros requerem somente um ou dois. As razões para estas diferenças em especificidade são consideradas serem devido às estruturas tridimensionais nos domínios catalíticos, que sucessivamente é dependente da estrutura primária da xilanase, isto é, a sequência de aminoácido. Entretanto, a translação destas diferenças nas sequências de aminoácido em diferenças na funcionalidade das xi- lanases, até agora não foi documentado quando a xilanase atua em um ambiente complexo, tal como material de planta.

Os substratos de xilanase encontrados no trigo (farinha de trigo),

Aforam tradicionalmente divididos em duas frações: O AX não extraível de água (WU-AX) e o AX extraível de água (WE-AX). A relação de WU-AX:WE- AX é aproximadamente 70:30 em farinha de trigo. Houve várias explicações a respeito de porque há duas frações diferentes de AX. A literatura mais antiga (D’Appolonia e MacArthur (1976) e Montgomery e Smith (1955)) descreve diferenças muito elevadas no grau de substituição entre WE-AX e WU- AX. O grau superior de substituição foi constatado em WE-AX. Isto foi utilizado para explicar porque alguns dos AX foram extraíveis. O grau elevado de substituição tornou o polímero solúvel, comparado com um grau de substituição inferior, que causaria a ligação de hidrogênio entre os polímeros e consequentemente a precipitação.

A diferença entre a funcionalidade de diferentes xilanases foi considerada ser devido às diferenças na especificidade de xilanase e desse modo sua preferência para os substratos WU-AX ou WE-AX.

Entretanto, literaturas mais recentes não encontram a mesma diferença enorme entre o grau de substituição do WE-AX e WU-AX. Portanto, outros parâmetros do que a especificidade do substrato de xilanase podem ser de importância. Estes parâmetros podem ser a preferência de xilanases para WE-AX versus WU-AX, determinado por outros meios do que a especificidade de substrato clássica. Este parâmetro pode ser encontrado descrito na literatura como seletividade de substrato.

Em algumas aplicações (por exemplo, padaria) é desejável produzir polímeros solúveis de peso molecular elevado (HMW) da fração de WU-AX. Tais polímeros foram correlacionados com um aumento de volume na fabricação de pão (Rouau, 1993; Rouau e outros, 1994 e Courtin e outros, 1999).

Em outras aplicações é desejável modificar o WU-AX e WE-AX, solubilizar o WU-AX, tornando o peso molecular mais baixo, reduzir seu efeito de hidrocoloide, produzir oligossacarídeos de arabinoxilano, dando acesso à outra degradação de outros componentes da parede celular (tal como em produção de bolachas, separação de farinha, aplicação de alimento, Bio- - ethanol production, Prebiotics, etc.). f Todas as características mencionadas acima de xilanases utili zadas em várias aplicações são direcionadas para o desempenho de xilanases e são de grande importância para obter a funcionalidade necessária. Entretanto, a seleção de xilanases tendo as características corretas para uma certa aplicação ou construção de xilanases conhecidas para'obtê-las, geralmente resulta em uma molécula de xilanase menos eficiente, por e- xemplo, uma molécula com baixa atividade catalítica (isto é, atividade específica caracterizada pelas unidades de molécula/mg de proteína xilanase). Uma vez que estas moléculas devem ser utilizadas em aplicações comerciais é, portanto de grande importância para ter atividade catalítica tão elevada quanto possível. A melhora desta característica será de aplicação comercial destas enzimas no futuro, devido ao uso aumentado de subprodutos agrícolas tal como farelo de cereal ou o uso e, produção de bioetanol celulósico.

Sumário da Invenção

A presente invenção é predita na descoberta surpreendente que é possível - modificando-se um polipeptídeo com atividade de xilanase na posição 110 comparada com a sequência de polipeptídeo xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1, aumentar a solubilização do farelo e/ou atividade de xilanase da enzima.

Desse modo, foi mostrado pelos inventores da presente invenção que é possível produzir polipeptídeos xilanase tendo atividade de xilanase e/ou solubilização de farelo aumentadas. Isto, por exemplo, torna fácil hidrolisar a fração hemicelulósica durante o processamento cereal relacionado com a produção de bioetanol celulósico, ou permitir uma redução na quantidade de xilanase requerida em várias aplicações tais como alimento animal, liquefação de amido, padaria, separação de farinha (moagem úmida), produção de pré-bióticos, e produção de papel e polpa.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 ou ter pelo menos 75% de identidade com uma sequência de aminoácido selecio- 'nada de SEQ ID N°: 2-22, e cujo polipeptídeo tem uma modificação de ami- »noácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição correspondendo a posição 110 de sequência de xilanase de B. sub- tilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 de sequência de xilanase de B. subtilis mostrado como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 2 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 de sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 3 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de identificar um polipeptídeo de acordo com a invenção, o referido método compreendendo: (i) preparar um polipeptídeo tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 ou tendo pelo menos 75% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°: 2-22, e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posi- 'Ção 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 da »sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento; (ii) comparar a solubilização de farelo e/ou atividade de xilanase do referido polipeptídeo com a solubilização de farelo e/ou atividade de xilanase da sequência de aminoácido selecionada entre SEQ ID N°s: 1-22 com a qual tem a porcentagem mais elevada de identidade; e (iii) selecionar o polipeptídeo se ele melhorou a solubilização de farelo e/ou melhorou a atividade de xilanase comparado com a sequência de aminoácido selecionada entre SEQ ID N°s: 1-22 com a que tem a maior porcentagem de identidade.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de preparara um polipeptídeo de acordo com a invenção, o referido método compreendendo expressar uma sequência de nucleotídeo codificando o referido polipeptídeo; e opcionalmente isolar e/ou purificar o polipeptídeo após a expressão.

Em algumas modalidades o polipeptídeo é preparado modificando-se ou uma sequência de aminoácido de polipeptídeo na posição 110 ou um códon que codifica um resíduo de aminoácido na posição 110 em uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido de polipeptídeo, onde a posição 110 é determinada com referência à sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula que foi transformada com a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção ou o vetor que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um orga- * nismo hospedeiro que foi transformado com a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção ou o vetor que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende o polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende a polipeptídeo identificado de acordo com os métodos da invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende a polipeptídeo preparado de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende o vetor que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende a célula que foi transformada com a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende o vetor que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende o organismo que foi transformado com a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção ou o vetor que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção misturada com um componente não tóxico.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma -massa que compreende o polipeptídeo de acordo com a invenção ou um ^polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a invenção misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um produto de padaria que compreende o polipeptídeo de acordo com a invenção ou um polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a invenção misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção ou uma massa de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um alimento animal que compreende o polipeptídeo de acordo com a invenção ou um polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de a- cordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a invenção misturado com um componentes não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição de limpeza que compreende xilanase. Em algumas modalidades, as composições de limpeza são composições detergentes de lavanderia, ao mesmo tempo em que em outras modalidades as composições de limpeza são detergentes de lavagem de louças. Em algumas outras modalidades, os detergentes de lavagem de louças são detergentes de lavagem de louça automática. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza contendo xilanase também compreendem uma ou mais enzimas adicionais. Em algumas modalidades, as enzimas adicionais são selecionadas de hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, xilanases, lipases, ’fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, r ceratinases, reductases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, B-glucanases, arabinosi- dases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, uma combinação de enzimas encontra uso (isto é, um "coquetel").

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de degradar ou modificar uma parede de célula de planta cujo método compreende contatar a referida parede de célula de planta com o polipeptídeo de acordo com a invenção ou um polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a invenção misturados com um componentes não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de processar um material de planta cujo método compreende contatar o referido material de planta com o polipeptídeo de acordo com qualquer um da invenção ou um polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a in-venção misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso do polipeptídeo de acordo com a invenção ou um polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a invenção misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção em um método de modificação de materiais de planta.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso do ’polipeptídeo de acordo com a invenção ou um polipeptídeo identificado de acordo com a invenção ou um polipeptídeo preparado de acordo com a invenção ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção ou o vetor de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção ou o organismo de acordo com a invenção misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a invenção em qualquer um ou mais de: cozimento, processamento de cereais, liquefação de amido, produção de Bioetanol de material celulósico, alimento animal, em processamento de madeira, realce do branqueamento de polpa de madeira.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo ou fragmento do mesmo substancialmente como descrito aqui anteriormente com referência aos Exemplos e desenhos.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método substancialmente como aqui anteriormente descrito com referência aos Exemplos e desenhos.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição substancialmente como aqui anteriormente descrito com referência aos Exemplos e desenhos.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso substancialmente como aqui anteriormente descrito com referência aos E- xemplos e desenhos.

Legendas Para a Figura

Referência deve ser feita aqui à seguinte figura. Figura 1 mostra a xilanase de variante XynA de Bacillus subtilis (T110A) (preta), a xilanase de variante Xyn2 de Trichoderma reesei (T120A) (cinza escuro) e a xilanase de variante XynA de Thermomyces lanuginosus (T120A) (cinza claro) sobreposto. Os resíduos mutados, T110 e T120 respectivamente estão em destaque. Figura 2 mostra um alinhamento de sequência múltipla de SEQ ID N°:1-22 no programa AlignX (parte do vectorNTI adequado) com parâmetros básicos para alinhamento múltiplo (penalidade de abertura de espaço * vazio: 10 og Penalidade de extensão de espaço vazio 0,05). Os números na (esquerda da sequência representam as SEQ ID NoS.

Descrição Detalhada da Invenção

As enzimas xilanase foram reportadas de quase 100 organismos diferentes, incluindo plantas, fungos e bactérias. As enzimas xilanase são classificadas em várias das mais do que 40 famílias de enzimas glicosil hi- drolase. As enzimas de glicosil hidrolase, que incluem xilanases, manana- ses, amilases, β-glucanases, celulases, e outras carboidrases, são classificadas com base em tais propriedades como a sequência de aminoácidos, a estrutura tridimensional e a geometria do sítio catalítico (Gilkes, e outros, 1991, Microbiol. Reviews 55: 303-315).

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e que compreende pelo menos três, tal como cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido relativo a qualquer uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°:1-22, e cujo polipeptídeo tem uma substituição de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e que compreende uma sequência de aminoácido, a referida sequência de aminoácido tendo pelo menos 88% de i- dentidade com SEQ ID N°: 1 ou tendo pelo menos 75% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada de 2-22 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

A posição de um aminoácido particular em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é determinada por alinhamento da sequência de aminoácido do referido polipeptídeo com SEQ ID N°: 1 utilizando uma ferramenta de alinhamento de sequência tal como um alinhamento de duas -sequências utilizando o algoritmo Smith-Waterman, ou com os algoritmos • CLUSTALW2, onde as sequências são ditas serem alinhadas quando o es-core de alinhamento for mais elevado. Os escores de alinhamento podem ser calculados de acordo com os métodos descritos por Wilbur, W. J. e Lipman, D. J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730. Preferivelmente parâmetros básicos são utilizados no algoritmo ClustalW2 (1.82): Penalidade de Abertura de Espaço Vazio de Proteína = 10,0; Penalidade de Extensão de Espaço Vazio de Proteína = 0,2; Matriz de Proteína = Gonnet; Proteína/DNA END- GAP = -1; Proteína/DNA GAPDIST = 4.

Preferivelmente, uma posição de um aminoácido particular em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é determinada por alinhamento da sequência de aminoácido do polipeptídeo com SEQ ID N°: 1 utilizando o programa de AlignX (parte do vetorNTI adequado) com parâmetros básicos para múltiplos alinhamentos (Penalidade de abertura de espaço vazio: 10 og Penalidade de extensão de espaço vazio 0,05). Para algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o alinhamento pode ser feito utilizando-se a figura 2 como descrito aqui.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e tendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 de sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por ali-nhamento.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 2 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- • peptídeo tendo atividade de xilanase e tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 3 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 4 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde a posição 110 de sequência de xilanase de 8. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e que compreende um sequência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 1, e cujo polipeptídeo tem uma substituição de aminoácido na posição 110 para qualquer um diferente resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: ácido glutâmico, triptofano, alanina e cisteína, onde a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 de sequência de xilanase de 8. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

A menos que de outro modo declarado o termo "Identidade de sequência" para aminoácidos como utilizado aqui refere-se à identidade de sequência calculada como (nref- ndiò^OO/nref, onde ndifé o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e onde nrefé o número de resíduos em uma das sequências. Portanto, a sequência de aminoácido ASTDYWQNWT terá uma identidade de sequência de 80% com a sequência ASTGYWQAWT (ndif=2 e nrer=10).

Em algumas modalidades a identidade de sequência é determinada por métodos convencionais, por exemplo, Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pela pesquisa para método de similaridade de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, utilizando o algoritmo CLUSTAL W de Thompson e outros, 1994, Nucleic Acids Res -22:467380, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). O algoritmo BLAST (Altschul e outros, 1990, Mol. Biol. 215:403-10) pelo qual o software pode ser obtido através de National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) pode também ser utilizado. Ao utilizar quaisquer dos algoritmos mencionados acima, os parâmetros básicos para extensão de "Janela", penalidade de espaço vazio, etc., são utilizados.

O termo "modificação" como utilizado aqui significa qualquer modificação química para qualquer aminoácido ou para a sequência de aminoácido do polipeptídeo selecionado de SEQ ID N°: 1-22, como também manipulação genética do DNA codificando aquele polipeptídeo. A modificação pode ser substituições, deleções e/ou inserções de um ou mais aminoá- cidos como também substituições de uma ou mais cadeias laterais de ami-noácido. Em algumas modalidades, os polipeptídeos têm atividade de xilanase somente se tendo substituição de aminoácidos relativas à SEQ ID N°:1-22.

Deve ser entendido que "modificação" em um determinado polipeptídeo é relativa ao polipeptídeo selecionado de SEQ ID N°: 1-22 com a porcentagem maior de identidade de sequência com este determinado polipeptídeo.

A terminologia para substituição de aminoácidos utilizada nesta descrição é como segue. A primeira letra representa o aminoácido naturalmente presente em uma posição de uma sequência particular. O seguinte número representa a posição relativa à SEQ ID N°: 1. A segunda letra representa o aminoácido diferente substituindo para o aminoácido natural. Um exemplo é D11F/R122D/T110A, onde o ácido aspártico na posição 11 de SEQ ID N°:1 é substituído por uma fenilalanina e a arginina na posição 122 de SEQ ID N°:1 é substituído por um ácido aspártico, e a treonina na posição 110 é substituída por uma alanina, todas as três mutações estando no mesmo polipeptídeo tendo atividade de xilanase.

Aparte das modificações de aminoácido nos polipeptídeos com •atividade de xilanase de acordo com a invenção, os polipeptídeos podem ter outras modificações de aminoácido de uma natureza menor, que é substituições de aminoácido conservadoras ou inserções que significantemente não afetam a duplicação e/ou atividade da proteína; pequenas deteções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões de terminal de amino ou carboxila, tal como resíduo de metionina de terminal de amino; um peptídeo ligante pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação alterando-se a carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservadoras estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). A substituição de aminoácidos que não geralmente alteram a atividade específica é conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. As trocas mais geralmente ocorrendo são Ala a Ser, Vai a lie, Asp a Glu, Thr a Ser, Ala a Gly, Ala a Thr, Ser a Asn, Ala a Vai, Ser a Gly, Tyr a Phe, Ala a Pro, Lys a Arg, Asp a Asn, Leu a lie, Leu a Vai, Ala a Glu, e Asp a Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, os aminoácidos não padrão (tais como 4-hidroxiprolina, 6-/V-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isova- lina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos para resíduos de aminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservadores, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos para resíduos de aminoácido. "Aminoácidos não naturais" foram modificados após a síntese de proteína, e/ou têm uma estrutura química em sua cadeia lateral diferente daquela dos aminoácidos padrões. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferivelmente, são comercialmente disponí- "veis, e incluem ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, deidroproli- na, 3- e 4-metilprolina, e 3,3-dimetilprolina.

O termo "organismo hospedeiro", como utilizado aqui, inclui qualquer tipo de célula que seja susceptível à transformação, transfecção, transdução e similares com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo codificando os polipeptídeos da presente invenção.

Para os presentes propósitos, uma xilanase significa uma proteína ou um polipeptídeo tendo atividade de xilanase.

A frase "um polipeptídeo tendo atividade de xilanase" como utilizado aqui refere-se a qualquer proteína ou polipeptídeo que tem atividade em um ensaio de xilanase tal como descrito aqui.

Atividade de xilanase pode ser medida utilizando qualquer ensaio, no qual um substrato é empregado o qual inclui endo-ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanos. O pH e a temperatura utilizados no ensaio devem ser adaptados a xilanase em questão. Exemplos de valores de pH adequados são 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Os exemplos de temperaturas adequadas são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80°C. Diferentes tipos de substratos estão disponíveis para a determinação de atividade de xilanase, por exemplo, comprimidos de xilazima (substrato de xilano pintado, reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda).

Preferivelmente, atividade de xilanase é medida utilizando o seguinte ensaio.

Ensaio de Xilanase (Atividade de Endo-β-1,4- xilanase)

As amostras foram diluídas em tampão de ácido cítrico (0,1 M) - fosfato de dissódio-hidrogênio (0,2 M), pH 5,0, para obter aproximadamente OD590 = 0,7 neste ensaio. Três diluições diferentes da amostra foram pré- incubadas durante 5 minutos a 40°C. No tempo = 5 minutos, 1 comprimido de Xilazima (substrato de xilano pigmentado, reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda) foi adicionado à solução de enzima em um volume de reação de 1ml. No tempo = 15 minutos a reação foi terminada adicionando-se 10 ml de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. Os brancos foram preparados utilizando 10OOpl ■de tampão em vez da solução de enzima. A mistura de reação foi centrifugada (1500 x g, 10 minutos, 20°C) e o OD do sobrenadante foi medido em 590 nm. Uma unidade de xilanase (XU) é definida como a atividade de xilanase aumentando o OD590 com 0,025 por minuto.

O substrato (arabinoxilano reticulado e pigmentado extraído de trigo) utilizado no ensaio acima é uma boa aproximação do substrato correspondente em aplicações comerciais.

As enzimas podem também ser classificadas com base no manual Nomenclatura de Enzima de NC-IUBMB, 1992), veja também o site de ENZIMA na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZIMA é um repositor de informação relativo à nomenclatura de enzimas. É principalmente com base nas recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUB-MB) e descreve cada tipo de enzima caracterizada para que um número de EC (Comissão de Enzima) tenha sido fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic A- cids Res 28:304-305). Esta nomenclatura de Enzima IUB-MB é com base em sua especificidade de substrato e ocasionalmente em seu mecanismo molecular; uma tal classificação não reflete as características estruturais destas enzimas.

Em um aspecto da invenção, a xilanase é uma enzima classificada como EC 3.2.1.8. O nome oficial é endo-1,4-beta-xilanase. O nome sistemático é 1,4-beta-D-xilan xilanoidrolase. Outros nomes podem ser utilizados, tais como endo-(1-4)-beta-xilanase; (1-4)-beta-xilano 4-xilanoidrolase; endo-1 ,4-xilanase; xilanase; beta-1 ,4-xilanase; endo-1 ,4-xilanase; endo- beta-1 ,4-xilanase; endo-1 ,4-beta-D- xilanase; 1 ,4-beta-xilano xilanoidrola- se; beta-xilanase; beta-1 ,4-xilano xilanoidrolase; endo-1 ,4-beta-xilanase; beta-D-xilanase. A reação catalisada é a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanos.

Outra classificação de certas enzimas glicosídeo hidrolase, tal como endoglucanase, xilanase, galactanase, mananase, dextranase e alfa- galactosidase, em famílias com base nas similaridades de sequência de a- minoácido foi proposta a alguns anos atrás. Eles atualmente se incluem em 90 famílias diferentes: Veja o site de internete CAZy(ModO) (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server at: http://afmb.cnrs- mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html (documentos correspondentes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In "Recent Advances in Carbohidrato Bioengineering", HJ. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat e B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) The modular structure of celulases and other carbohidrato- active enzymes: an integrated database approach. In "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita e T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15- 23).

Em um aspecto da invenção, a xilanase da invenção é uma xilanase da Família 11 de Glicosídeo Hidroliase (GH). O termo "da Família 11 de Glicosídeo Hidroliase (GH)" significa que a xilanase em questão é ou pode ser classificada na família 11 de GH.

Deve ser entendido que as pesquisas de similaridade de proteína (como ProteinBlast em, por exemplo, http://toolkit.tuebingen.mpg.de/prot_blast ) podem não necessariamente determinar ser uma sequência desconhecida atualmente se inclui no termo de um membro da família de xilanase GH11. As sequências de proteína encontradas utilizando uma pesquisa de blasto podem ter identidade/homologia relativamente elevados e ainda não serem xilanases atuais, e também, não serem xilanases pertencendo a GH11. Alternativamente, as sequências de proteína podem ter uma identidade de sequência de aminoácido primária relativamente baixa e ainda ser um membro da família de GH11 xilanase. Para determinar se uma sequência de proteína desconhecida é uma proteína xilanase na família GH11, a avaliação terá que ser feita, não somente na similaridade de sequência, porém também em similaridade de estrutura em 3D, uma vez que a classificação nas famílias GH depende da duplicação em 3D. Um software que irá prever a duplicação em 3D de uma sequência de proteína desconhecida é HHpred (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred). A força deste software para predição de estrutura de proteína conta com a i- dentificação de sequências homólogas cm estrutura conhecida a ser utilizada como modelo. Isto funciona tão bem porque as estruturas divergem muito mais lentamente do que as sequências primárias. As proteínas da mesma família podem ter estruturas muito similares mesmo quando suas sequências divergiram além do reconhecimento.

Na prática, uma sequência desconhecida pode ser colocada no software (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred) no formato FASTA. Tendo feito isto, a pesquisa pode ser submetida. O resultado da pesquisa mostrará uma lista de sequências com estruturas em 3D desconhecidas. Para confirmar que a sequência desconhecida realmente é uma GH11 xilanase, GH11 xilanases devem ser encontradas na lista de homólogos tendo uma probabilidade de > 90. Nem todas as proteínas identificadas como homólogas serão caracterizadas como GH11 xilanases, porém algumas serão. As últimas proteínas são proteínas com uma estrutura conhecida e a caracterização bioquímica identificando-as como xilanases. A anterior não foi bioquimicamente caracterizada como GH11 xilanases. Várias referências descrevem este protocolo tal como Sõding J. (2005) Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics 21, 951-960 (doi:10.1093/bioinformatics/bti125) e Sõding J, Biegert A, e Lupas AN. (2005) The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Research 33, W244-W248 (Web Server issue) (doi:10.1093/nar/gki40).

De acordo com o site Cazy(ModO), os glicosideo hidrolases da Família 11 podem ser caracterizados como segue: Atividade Conhecida: xilanase (EC 3.2.1.8) Mecanismo: Retenção Nucleófilo Catalítico/Base : Glu (experimental) Doador de Proton Catalítico: Glu (experimental) Estado da Estrutura em 3D: Duplicação: rolo de p-geleia Clã: GH-C

Como utilizado aqui, "Clã C" refere-se aos agrupamentos de famílias que compartilham uma duplicação tri-dimensional comum e máquina catalítica idêntica (veja, por exemplo, Henrissat, B. e Bairoch, A. , (1996) Biochem. J. ,316, 695-696).

Como utilizado aqui, "Família 11" refere-se a uma família de enzimas como estabelecido por Henrissat e Bairoch (1993) Biochem J.,293,781-788 (veja, também Henrissat e Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997, &:637-644). As características comuns para os membros da família 11 incluem homologia genética elevada, um tamanho de cerca de 20 kDa e um mecanismo catalítico de deslocamento duplo (veja, Ten- kanen e outros, 1992; Wakarchuk e outros, 1994). A estrutura das xilanases da família 11 inclui duas grandes β-folhas feitas de β-filamentos e a- hélices.

As xilanases da família 11 incluem, porém não estão limitadas às seguintes: Aspergillus niger XynA, Aspergillus kawachii XynC, Aspergillus tubigensis XynA, Bacillus circulans XynA, Bacilluspunzilus XynA, Bacillus subtilis XynA, Neocalliniastix patriciarum XynA, Streptomyces lividans XynB, Streptomyces lividans XynC, Streptomyces therinoviolaceus Xynll, Thermo- monospora fusca XynA, Trichoderma harzianum Xyn, Tyichoderma reesei Xynl, Trichoderma reeseiXynll, Trichodermaviride Xyn.

Como utilizado aqui, "tipo selvagem" refere-se a uma sequência ou uma proteína que é nativa ou de ocorrência natural.

Em outra modalidade particular, a xilanase da invenção é derivada de uma xilanase bacteriana, tal como de uma bacteria (i) do filo de Fir- micutes; (ii) da classe de Bacilli; (iii) da ordem de Bacillales; (iv) da família de Paenibacillaceae; ou (v) do gênero de Paenibacillus; tal como de uma bactéria (vi) das espécies de Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa, ou Paenibacillus sp.; tal como de (vii) cepas de Paenibacillus pabuli, ou Paenibacil- lus polymyxa.

A expressão "xilanase derivada de uma xilanase bacteriana" como utilizado aqui acima inclui qualquer xilanase do tipo selvagem isolada da bactéria em questão, como também variantes ou fragmentos dos mesmos que retêm a atividade de xilanase.

Em uma outra modalidade particular, a xilanase da invenção é derivada de uma xilanase fúngica.

A definição acima de "derivado de" (no contexto de xilanases bacterianas) é aplicável por analogia também às xilanases fúngicas.

Exemplos de xilanases fúngicas do glicosídeo hidrolase da família 11 são aqueles que podem ser derivados dos seguintes gêneros fúngicos: Aspergillus, Aureobasidium, Emericella, Fusarium, Gaeumannomyces, Hu- micola, Lentinula, Magnaporthe, Neocallimastix, Nocardiopsis, Orpinomyces, Paecilomyces, Penicillium, Pichia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermomy- ces, Trichoderma.

As xilanases fúngicas incluem xilanases fúngicas de levedura e filamentosas. Em algumas modalidades, a xilanase é derivada de um fungo (i) do filo de Ascomycota; (ii) da classe de Pezizomycotina; (iii) da ordem de Eurotiomycetes; (iv) da sub-ordem de Eurotiales', (v) da família de Trichoco- maceae, tal como o mitospórico Trichocomaceae', ou de um fungo (vi) do gênero Aspergillus; tal como das (vii) cepas de Aspergillus niger. Será entendido que a definição das espécies acima mencionadas inclui ambos os estados perfeito e imperfeito, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome das espécies pelo qual elas são conhecidas. Aqueles versados na técnica facilmente reconhecerão a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas das bactérias e fungos acima mencionados são facilmente acessíveis ao público de várias coleções de cultura, tais como a Coleção de Cultura do Tipo Americano (ATCC), Deutsche Sammlung von Mi- kroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor S- chimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

As questões relacionadas com a taxonomia podem ser resolvidas consultando-se um banco de dados de taxonomia, tal como o NCBI Taxonomy Browser que está disponível no seguinte site da internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/. Entretanto, preferivelmente referência é feita aos seguintes manuais: Dictionary of the Fungi, 9- edição, editada por Kirk, P.M., P. F. Cannon, J. C. David & J.A. Stampers, CAB Publishing, 2001; e Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Segunda edição (2005).

A presente invenção refere-se às modificações em certas posições de aminoácido. Estas posições são listadas com referência à sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1. Na presente invenção, os polipeptídeos com atividade de xilanase têm uma modificação pelo menos na posição 110 comparado com a sequência de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1. As posições equivalentes na ordem de xilanases da família 11 podem ser encontradas alinhando-se outras xilanases da Família 11 com SEQ ID N°: 1 e determinando que os alinhamentos de aminoácido com o aminoácido específico de SEQ ID N°: 1 (por exemplo, veja E- .xemplo 5). Tal alinhamento e uso de uma sequência como uma primeira referência é simplesmente uma questão de rotina para alguém de experiência ordinária na técnica.

Em um aspecto, uma xilanase variante de acordo com a invenção tem uma atividade de solubilização de farelo melhorada que é mais elevada do que o que pode ser obtido pelo uso da xilanase do tipo selvagem correspondente, ou qualquer xilanase que compreenda uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°: 2-22 como medido em um "ensaio de solubilização de farelo".

Em um aspecto, a xilanase de acordo com a invenção tem uma atividade de solubilização de farelo melhorada como um resultado da modificação na posição 110.

De modo adequado, a atividade de solubilização de farelo de xilanase pode ser medida utilizando o ensaio de solubilização de farelo fornecido aqui. Desse modo, os polipeptídeos tendo atividade de xilanase aumen- tada e/ou atividade de solubilização de farelo aumentada podem ser fornecidos. O requerimento para especificidade para o WU-AX é de modo crescente cada vez mais importante, uma vez que muitas aplicações estão utilizando concentração elevada de farelo de cereal. A indústria de fabricação de farelo 5 aumenta a concentração de farelo em muitos produtos, devido à questões de saúde e nutricionais, a indústria alimentícia incorpora quantidade crescente de material de farelo (fibra, Grãos Secados em Destiladores com So lúveis (DDGS)) devido ao uso de cereal na produção de Bioetanol, por e- xemplo. É, portanto, vantajoso fornecer novas xilanases com especificdade 10 aumentada, e, portanto, eficácia na solubilização deste material de farelo.

Ensaio de Solubilização de Farelo

Preferivelmente, a solubilidade de farelo é medida utilizando o seguinte ensaio.

Uma suspensão de farelo de trigo em (0,1 M)- dissódio-tampão 15 de fosfato de hidrogênio (0,2 M), pH 5,0 é preparada a uma concentração de 1,33% de farelo (peso/peso. A partir desta suspensão, as alíquotas de 750 pl são transferidas em tubos eppendorf sob agitação. Cada tubo de substrato é preaquecido durante 5 minutos a 40°C. Até aqui, 250 pl de solução de enzima são adicionados, preparando a concentração final de substrato a 1%.

Três diluições (em duplicata) são feitas de cada xilanase, com concentração de enzima crescente (0,33; 1,0 e 3,0 pg de xilanase/grama de farelo) para cada tempo de determinação (0, 30, 60 e 240 minutos). Como branco, uma solução desnaturada quente da xilanase é utilizada. A reação é terminada para os determinados tempos, transferindo-se os tubos para uma incubadora ajustada em 95°C. As amostras desnaturadas termicamente são mantidas a 4°C até que todas as reações de enzima sejam terminadas. Quando todas as reações de enzima são terminadas, os tubos Eppendorph são centrifugados para obter um sobrenadante claro. A capacidade das enzimas de solubi- lizar o farelo é expressa como o aumento na redução de grupos terminais como determinado utilizando PAHBAH (Lever, 1972).

Uma vez que as atividades laterais, tais como atividade de ami- lase, podem interferir com o ensaio acima, o ensaio de solubilização de fare- lo não deve ser somente realizado em amostras de xilanase purificadas (veja, Ex. 2).

Em um aspecto, a xilanase de acordo com a invenção tem uma sensibilidade reduzida a um inibidor de xilanase quando comparada com qualquer uma xilanase do tipo selvagem, ou qualquer uma xilanase que compreenda uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°: 2- 22.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com a invenção tem uma sensibilidade reduzida a um inibidor de xilanase como um resultado da modificação na posição 110 em combinação com uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 11, 12, 13, 34, 54, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 e 175.

O inibidor pode ser um inibidor encontrado naturalmente em tecidos de planta.

Como utilizado aqui, o termo "inibidor de xilanase" refere-se a um composto, tipicamente uma proteína, cujo papel é controlar a despolime- rização de carboidratos complexos, tais como arabinoxilano, encontrado em paredes de célula de planta. Esses inibidores de xilanases são capazes de reduzir a atividade de enzimas de xilanase de ocorrência natural como também aquelas de origem fúngica ou bacteriana. Embora a presença de inibidor de xilanases tenha sido reportada em sementes de cereal (veja, por e- xemplo, McLauchlan e outros 1999a; Rouau e Suget 1998).

McLauchlan e outros (1999a) descrevem o isolamento e caracterização de uma proteína de trigo que se liga a e inibe duas xilanases de fa- mília-11. Do mesmo modo, WO 98/49278 demonstra o efeito de um extrato de farinha de trigo na atividade de um grupo de xilanases microbianas todas das quais são classificadas como xilanases da família 11. Debyser e outros (1999) também descrevem que endoxilanases de Aspergillus nigere Bacillus subtilis, que são ambos os membros das xilanases da família 11 foram inibidas por um inibidor de xilanase de trigo chamado TAXI. McLauchlan e outros (1999b) ensinam que os extratos de farinhas comerciais tal como trigo, cen- teio, cevada e milho são capazes de inibir ambas as xilanases de família 10 e 11.

O inibidor de xilanase pode ser qualquer inibidor de xilanase a- dequado. Por modo de exemplo, o inibidor de xilanase pode ser o inibidor descrito no WO-A-98/49278 e/ou o inibidor de xilanase descrito por Rouau, X. e Surget, A. (1998), McLauchlan, R., e outros (1999) e/ou o inibidor de xilanase descrito no Pedido de Patente UK Número 9828599.2 (depositado •em 23 de dezembro de 1998), Pedido de patente UK Número 9907805.7 (depositado em 6 de abril de 1999) e Pedido de patente UK Número 9908645.6 (depositado em 15 de abril de 1999).

Os inibidores descritos na técnica anterior podem também ser u- tilizados em ensaios para determinar a sensibilidade de um polipeptídeo variante da invenção ao inibidor de xilanases. Eles podem também ser utilizados como descrito abaixo para modular a funcionalidade de uma xilanase.

Ensaio de Inibidor de Xilanase

Preferivelmente, a atividade de inibição de xilanase é medida utilizando o seguinte ensaio. 100 µl Processamentopreparação de inibidor (contendo várias concentrações de inibidor de xilanase (para quantificação veja Quantificação de Inibidor de xilanase abaixo)), 250 |il de solução de xilanase (contendo 12 XU de xilana- se/ml) e 650 y.l de tampão (tampão de ácido cítrico a 0,1 M - fosfato de hidrogênio de d/ssódio a 0,2M, 1% de BSA (Sigma-Aldrich, USA), pH 5,0) foram misturados. A mistura foi termostatizada durante 5 minutos a 40,0°C. No tempo = 5 minutos um comprimido de Xilazima foi adicionado. No tempo = 15 minutos a reação foi terminada adicionando-se 10 ml de TRIS/NaOH a 2%, pH 12. A mistura de reação foi centrifugada (1500 x g, 10 minutos, 20° C) e o sobrenadante medido em 590 nm. A inibição de xilanase foi calculada como atividade residual em %, comparado com o branco.

O inibidor de endo-β-1,4-xilanase endógeno utilizado é obtenível de farinha de trigo. O inibidor é um dipeptídeo, tendo um MW de cerca de 40 kDa (como medido por SDS-PAGE ou espectrometria de massa) e um pl de cerca de 8 a cerca de 9,5. A análise de sequência até a data revelou que o inibidor tem a sequência apresentada como SEQ ID N°: 24 ou é altamente homólogo a este.

Um método para quantificar a concentração de inibidor em uma determinada preparação de inibidor pode ser encontrado no Ex. 3

Os brancos foram preparados do mesmo modo, porém substitu indo-se a solução inibidora com água.

A presente invenção também refere-se à sequência de nucleotí- -deo que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção que compreende a sequência de nucleotídeo operavelmente ligada a uma ou mais se- 10 quências de controle que direcionam a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modo para fornecer expressão do polipeptídeo. A manipulação da sequência de polinu- 15 cleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar a polis- sequência de nucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinantes são bem conhecidas na técnica.

A sequência de controle pode ser uma sequência promotora a- 20 propriada, uma sequência de nucleotídeo que seja reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. A sequência promotora contém sequências de controle transcricionais que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeo que mostre a atividade 25 transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a trans- 30 crição das construções de ácido nucléico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos de óperon de laca de E. coli, gene agarase Streptomyces coelicolor (dagA), ge- ne de levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene alfa-amilase Bacillus licheniformis (amyL), gene amilase maltogênico de Bacillus stearothermophi- lus (amyM), gene alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA e xylB Bacillus subtilis, e gene beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff e outros, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), como também o promotor tac (DeBoer e outros, 1983, Proceedings of the National -Academy of Sciences USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook e outros, 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes para amilase TAKA d Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor mi- ehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável de ácido Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori {glaA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryza- e, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), protease do tipo de tripsina Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Thchoderma reesei, celobioidrolase I de Tri- choderma reesei, celobioidrolase II de Thchoderma reesei, endoglucanase I de Thchoderma reesei, endoglucanase II de Thchoderma reesei, endoglucanase III de Thchoderma reesei, endoglucanase IV de Thchoderma reesei, endoglucanase V de Thchoderma reesei, xilanase I de Thchoderma reesei, xilanase II de Thchoderma reesei, beta-xilosidase de Thchoderma reesei, como também o promotor de NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutro de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos.

Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoci- nase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool deidrogena- se/gliceraldeido-3- fosfato deidrogenase Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), aqueles fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), e 3-fosfoglicerat cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos e outros, 1992, Yeast 8: 423- ■488.

A sequência de controle pode também ser uma sequência de terminador de transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência de terminador é operavelmente ligada ao terminal de 3' da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser utilizado na presente invenção.

Os terminadores para células hospedeiras fúngicas filamentosas podem ser obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, gli- coamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum. Os terminadores para células hospedeiras de levedura podem ser obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocroma C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), e gliceraldeído-3-fosfato deidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos e outros, 1992, supra.

A sequência de controle pode também ser uma sequência líder adequada, uma região não transladada de um mRNA que é importante para translação pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada à extremidade 5' da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser utilizada na presente invenção.

Os líderes para células hospedeiras fúngicas filamentosas podem ser obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e Trio- se fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3- fos- foglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, alfa-fator de Saccharomy- 5 ces cerevisiae, e álcool deidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato deidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada ao terminal de 3' da sequência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célu- 10 la hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser utilizada na presente invenção.

As sequências de poliadenilação para células hospedeiras fúngicas filamentosas podem ser obtidas dos genes para TAKA amilase de As- 15 pergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum, e n/geralfa-glicosidase de Aspergillus.

As sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Bio- 20 logy 15: 5983-5990.

A sequência de controle pode também ser uma região de codificação de peptídeo de sinal que codifica para uma sequência de aminoácido ligada ao terminal de amino de um polipeptídeo e direciona polipeptídeo codificado na série de reações secretora da célula. A extremidade 5' da se- 25 quência de codificação da sequência de nucleotídeo pode inerentemente conter um peptídeo de sinal codificando uma região naturalmente ligada na estrutura de leitura de translação com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma região de codificação de peptí- 30 deo de sinal que é estranha para a sequência de codificação. A região de codificação de peptídeo de sinal estranho pode ser requerida onde a sequência de codificação não naturalmente contém uma região de codificação de peptídeo de sinal. Alternativamente, a região de codificação de peptídeo de sinal estranho pode simplesmente substituir a região de codificação de peptídeo de sinal natural para realçar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer região de codificação de peptídeo de sinal que direciona o poli- 5 peptídeo expresso na série de reação secretora de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretada em um meio de cultura, pode ser utilizada na presente invenção.

As regiões de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões de codificação de peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as regiões de codificação de peptídeo de sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, neutral amilase de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, en-doglucanase V de Humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa.

Os peptídeos de sinal úteis para as células hospedeiras de levedura são obtidas dos genes para alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras regiões de codificação de peptídeo de sinal úteis são descritas por Romanos e outros, 1992, supra.

A sequência de controle pode também ser uma região de codificação de pró-peptídeo que codifica para uma sequência de aminoácido posicionada no terminal de amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido para um polipeptídeo ativo maduro por clivagem catalítica ou autoca- talítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A região de codificação de pró- peptídeo pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprf), alfa-fator de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (\NO 95/33836).

Onde ambas as regiões de pró-peptídeo e peptídeo de sinal estão presentes no terminal de amino de um polipeptídeo, a região de pró- peptídeo é posicionada próxima do terminal de amino de um polipeptídeo e a - região de peptídeo de sinal está posicionada próxima do terminal de amino da região de pró-peptídeo.

Pode também ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativo ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores são a- queles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem o s sistemas operadores lac, tec, e tip. Em levedura, o sistema A- DH2 ou sistema GAL1 podem ser utilizados. Em fungos filamentosos, o promotor de TAKA alfa-amilase, promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, e promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser utilizados como sequências reguladoras. Outros exemplos de sequências reguladoras são aqueles que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióti- cos, estes incluem o gene de di-hidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo seria operavelmente ligada com a sequência reguladora.

A presente invenção também refere-se aos vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação trans- cricional e translacional. Os vários ácidos nucleicos e sequência de controle descritos aqui podem ser unidos uns aos outros para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição con- venientes para permitir a inserção ou substituição da sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção pode se expressa inserindo-se a sequência de nucleotídeo ou uma construção de ácido nucléico que compreende a sequência em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor de modo que a sequência de codificação seja operavel- mente ligada com as sequências de controle apropriadas para expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e possa realizar a expressão da sequência de nucleotídeo. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos circulares fechados ou lineares.

O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma, ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para assegurar a autorre- plicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o cromossoma^) no qual foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um elemento transponível pode ser utilizado.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais marcadores selecionáveis que permitem fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou células similares. Um marcador selecionável é um gene o produto do qual fornece resistência biocida ou virai, resistência a metais pesados, prototróficos a auxotróficos, e similares.

Exemplos de marcadores selecionáveis bactericidas são os ge- nes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência ao antibiótico tal como resistência à ampicilina, canamici- na, cloranfenicol, ou tetraciclina. Os marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, porém não estão limitados a, amdS (acetami- dase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransfe- -rase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (oro- tidina-5'-fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antra- nilato sintase), como também equivalentes dos mesmos. Em algumas moda-lidades os genes de amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus são utilizados em uma célula de Aspergillus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um e- lemento(s) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma. Para integração no genoma de célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter sequências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local preciso no cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais devem preferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de base, preferivelmente 400 a 10.000 pares de base, e mais preferivelmente 800 a 10.000 pares de base, que teve um grau elevado de identidade com a sequência-alvo correspondente para realçar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência-alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser sequências de nucleotídeo de codificação ou não codificação. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga. Para replicação autônoma, o vetor pode também compreender uma origem de replicação permitindo o vetor replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" é definido aqui como uma sequência de nucleotídeo que permite um plasmídeo ou vetor replicar in vivo.

Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 permitindo a replicação em E. coli, e pUB1 10, pE194, pTA1060, e pAMβi permitindo a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de 2 microns de replicação, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANSI (Gems e outros, 1991 , Gene 98: 61-67; Cullen e outros, 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO .00/24883). O isolamento do gene AMA1 e construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene pode ser realizado de acordo com os métodos descritos no WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópia do polinucleotídeo pode ser obtido integrando-se pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma de célula hospedeira ou incluindo-se um gene marcador selecioná- vel amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene de marcador selecionável, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos utilizados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinante da presente invenção são bem conhecidos por alguém versado na técnica (veja, por e- xemplo, Sambrook e outros, 1989, supra).

A presente invenção também refere-se a células hospedeiras re- combinantes, que compreendem um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção, que são vantajosamente utilizadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor que compreende um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito posteriormente. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer progénie de uma célula de origem que não seja idêntico às células de origem devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha da célula hospedeira dependerá em grande parte do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um micro-organismo unicelular, por exemplo, um procariota, ou um micro-organismo não unicelular, por exemplo, um eucariota. Os micro-organismos unicelulares úteis são células bacterianas tais como bactérias gram positivas incluindo, porém não limitado a, uma célula de Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloli- quefaciens. Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coa- gulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus mega- teríum, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis\ ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, Streptomyces lividans e Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, ou Bacillus subtilis. Em outro aspecto, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalofílico. A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (veja, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), utilizando células competentes (veja, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81 : 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971 , Journal of Molecular Biology 56: 209-221 ), eletroporação (veja, por exemplo, Shigeka- wa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 ), ou conjugação (veja, por e- xemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira pode também ser um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta, ou fúngica.

Em um aspecto, a célula hospedeira ié uma célula fúngica. "Fungos" como utilizado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth e outros, In, -Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8- edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) como também o Oomycota (como citado em Hawksworth e outros, 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth e outros, 1995, supra). Em outro aspecto, a célula hospedeira fúngica é uma célula de levedura. "Levedura" como utilizado aqui inclui levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporo- genosa, e levedura pertencendo ao Fungi Imperfecti (Blastomicetos). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no future, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Em ainda um outro aspecto, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia.

Em um aspecto particular, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluy- veri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis. Em outro aspecto, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lac- tis. Em outro aspecto, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytica.

Em outro aspecto, a célula hospedeira fúngica é uma célula fúngica filamentosa. "Fungos Filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth e outros, 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glucano, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbi- co. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccha- 5 romyces cerevisiae é por germinação de um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Em outro aspecto, a célula hospedeira fúngica filamentosa é - uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceri- poriopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humico- 10 la, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paeci- lomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schi- zophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

Em outro aspecto, a célula hospedeira fúngica filamentosa é 15 uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foeti- dus, Aspergillus Japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crook- wellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, 20 Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcoc- hroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulo- sum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em outro aspecto, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta, 25 Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceripo- riopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hir- sutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerocha- 30 ete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride. As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Os procedimentos adequados para transformação de célula hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos na EP 238 023 e Yelton e outros, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 : 1470-1474. Os métodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritos por -Malardier e outros, 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada utilizando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, In Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito e outros, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen e outros, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75; 1920.

A presente invenção também refere-se a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, sob condições propícias para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Preferivelmente, a célula é do gênero Aspergillus e mais preferivelmente Aspergillus fumigatus.

A presente invenção também refere-se aos métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições propícias para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo de frasco em agitação, e fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações de estado contínuo, em batelada, batelada de alimento, ou sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e em condições que permitem o polipeptídeo ser expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio de nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos da Coleção de Cultura do Tipo Americano). Se o polipeptídeo for secretado no meio de nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado direta-mente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado no meio, ele pode ser - recuperado de lisados celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados utilizando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima.

Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser utilizado para determinar a atividade do polipeptídeo como descrito aqui.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio de nutriente por procedimentos convencionais incluindo, porém não limitado a, centrifugação, filtração, extração, secagem por vaporização, evaporação, ou precipitação. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, porém não limitado a, cromatografia (por exemplo, permuta de íon, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétria preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amónio), SDS- PAGE, ou extração (veja, por exemplo, Protein Purification, J. -C. Janson e Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

Em um aspecto, a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição de aminoácido.

Em um aspecto, a modificação de aminoácido na posição 110 é uma deleção de aminoácido.

Em um aspecto, a modificação de aminoácido na posição 110 é uma inserção de aminoácido.

Em algumas modalidades, a identidade de sequência é medida relativo à SEQ ID N°: 1, onde a sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID N°: 1 também abrange uma sequência de peptídeo de sinal, tal co- 5 mo sua sequência de peptídeo de sinal natural.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem pelo menos 90, 92 ou 95% de identidade com SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem pelo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ou 95% de identidade com 10 a sequência com a qual ele tem a maior porcentagem de identidade selecionada de SEQ ID N°: 2-22.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem pelo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ou 95% de identidade com SEQ ID N°: 2.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a in venção tem pelo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ou 95% de identidade com SEQ ID N°: 3.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem uma estrutura de rolo de β-geleia.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção a modifica ção de aminoácido na posição 110 é uma substituição de aminoácido.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição para qualquer um resíduo aminoácido diferente selecionado do grupo consistindo em: alanina, 25 arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição para qualquer um re- 30 síduo de aminoácido diferente selecionado do grupo consistindo em: alanina, arginina, asparagina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição para qualquer um resíduo de aminoácido diferente selecionado do grupo consistindo em: ácido glutâmico, triptofano, alanina e cisteína.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição para alanina.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem um número total de aminoácidos menor do que 250, tal como menor do que 240, tal como menor do que 230, tal como menor do que 220, tal como menor do que 210, tal como menor do que 200 aminoácidos, tal como na faixa de 160 a 240, tal como na faixa de 160 a 220 aminoácidos.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 11, 12, 13, 34, 54, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 e 175, a posição sendo determinada como a posição correspondente da sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: 11F, 12F, 54Q, 54W, 122D, 113A, 13Y, 113D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K, 811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V, e 77Y, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: D11F, G12F, N54Q, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, N141Q, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M, I77S, I77V, e I77Y, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 e 175, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a in- -venção compreende substituições nas posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 e 175, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção também compreende uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 114 e 166, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção também compreende uma ou mais substituições em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 114 e 166, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende substituições em pelo menos quatro das seguintes posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159, 166, e 175, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende substituições nas posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159 e 175, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a in- venção compreende substituições nas posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, 166 e 175, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende substituições nas posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, e 175, a posição sendo determinada como a posição - correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K, e 175L, a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido comparado com sequência selecionada entre SEQ ID N°: 1-22 com a qual ela tem a maior identidade.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem pelo menos nove ou dez substituições de aminoácido.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: a. D11F, R122DeT110A; b. D11F, R122D, T110Ae Y113A; c. G13Y, T110A, Y113D, R122DeQ175L; d. G13Y, T110A, Y113D, R122FeQ175L; e. G13Y, G34K, T110A, Y113D, R122DeQ175L; f. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159DeQ175K; g. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Q175eV81l; h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166FeQ175L; i. G13Y, T110A, Y113D, R122D, K154R, N159D e Q175L; j. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; k. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162EeQ175L; -1. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162D e Q175L; m. G13Y, T110A, Y113D, R122D, W164F e Q175L; n. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159DeQ175L; o. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159D e Q175.L; p. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, 15 N159DeQ175L; q. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, 1118V, R122F, K154R, -N159D e Q175L; r. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159DeQ175K; s. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159DeQ175K; t. G13Y, I77L, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159DeQ175L; u. G13Y, I77M, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, 25 N159DeQ175L; v. G13Y, I77S, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159DeQ175L; w. G13Y, I77V, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; x. G13Y, I77Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159DeQ175L y. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175L; z. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175; aa. G13Y, N54W, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, 141Q, K154R, N159D, 175L; bb. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D, Q175L; - cc. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L;e dd. G13Y, 54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L; a posição sendo determinada como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: a. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D e Q175K; b. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F e Q175L; c. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; d. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D e Q175L; e. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159DeQ175L; A(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a posição correspondente de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a in- venção tem atividade de solubilização de farelo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção está na forma isolada.

O termo "isolado" como utilizado aqui significa que o polipeptídeo é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual a sequência é naturalmente associada por natureza.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção a modifica- - ção de aminoácido na posição 110 não é T110D.

Em algumas modalidades o polipeptídeo tendo atividade de xilanase não tem um ácido aspártico na posição 110.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem atividade de xilanase melhorada comparada com a sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 como medido em um ensaio de atividade de xilanase.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem atividade de xilanase melhorada como um resultado da modificação na posição 110.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem atividade de solubilização de farelo melhorada comparado com a sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 como medido em um ensaio de atividade de solubilização de farelo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem atividade de solubilização de farelo melhorada como um resultado da modificação na posição 110.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem sensibilidade reduzida a um inibidor de xilanase.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem uma sequência de aminoácido que compreende as modificações nas posições selecionadas da lista que consiste em: a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; c) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; f) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; l) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; m) 13/110/113/122/164/175; n) 13/110/113/122/162/175; o) 13/110/113/122/175; p) 11/122/110/113; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 11/122/110; s) 13/34/110/113/122/175; t) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; u) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; v) 13/99/104/110/113/118/122/154/159/175; w) 13/110/113/122/162/175; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; y) 13/99/104/110/113/122/141/154/159/175; z) 13/54/99/104/110/113/122/141 /154/159/175; aa) 13/54/99/104/110/113/122/141 /154/159/175; bb) 13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175; cc) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; e dd) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175;

A(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a posição correspondente de sequência de aminoácido de subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem uma sequência de aminoácido que compreende substituição de aminoácidos selecionada da lista consistindo em: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/17 5 L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; 5 e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; 10 j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175 L; l) 13Y/811/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; m) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; 15 o) 13Y/110A/113D/122D/175L; p) 11F/122D/110A/113A; ' q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; r) 11F/122D/110A; s) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; ' 20 t) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; u) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; v) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; x) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 25 y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; z) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; aa) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; bb) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; e 30 dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/17 5L;

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1 que compreende substituição de aminoácidos selecionados da lista consistindo em 5 a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/ Q175L; - c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159DZ Q175L; ’d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D ZQ175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D ZQ175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D ZQ175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110AZY113D/N114Y/R122F/K154R/N159D /Q175K; k) G13Y/I77L/K99YZT104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q 175L; l) G13Y/V811/K99Y/T104WZT110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q 175L; m) G13Y/T110AZY113D/R122D/W164F/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; p) D11F/R122D/T110A/Y113A; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q 175L; r) D11F/R122D/T110A; s) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q 175L; u) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q 175L; v) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/ Q175L; - w) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; e x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q ' 175L y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q17 5L; z) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159 D/Q175L; aa) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D Z175L; bb) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159 D/Q175L; cc) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159 D/Q175L; e G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N 159D/Q175L.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem uma sequência de aminoácido que consiste na substituição de 25 aminoácidos selecionados da lista consistindo em: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; 30 e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/1 ?5K; 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104W/110A/113 D/114Y/122F/154R/159 D/175 K; 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/811/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/110A/113D/122D/164F/175 L; 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; 13Y/110A/113D/122D/175L; 11F/122D/110A/113A; 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 11F/122D/110A; 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; 13Y/77V/99Y/104W/110A/113 D/122F/154R/159 D/175 L; 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/17 5I_; 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L; 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141 Q/154R/159D/175L; e 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141 Q/154R/159D/175L,

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção tem uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1, que consiste na substituição de aminoácidos selecionados da lista que consiste em a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175 L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; - I) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; m) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; ' n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; p) D11F/R122D/T110A/Y113A; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; r) D11F/R122D/T110A; s) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; - u) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; v) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/I118V/R122F/K154R/N159D/Q175L; w) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; e x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; z) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q 175L; aa) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/17 5L; bb) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q 175L; cc) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q 175L;e dd) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N1 59D/Q175L

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a in- venção não é SEQ ID N°: 25. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a invenção não tem a sequência selecionada da lista que consiste em: SEQ ID N°: 57 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 62 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 59 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 53 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 65 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 56 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 64 do Pedido de Patente Internacional WO0238746: SEQ ID N°: 52 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 63 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 61 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 60 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 58 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 55 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 12 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 11 do Pedido de Patente Internacional WO0238746; SEQ ID N°: 21 do Pedido de Patente Internacional W00068396; e SEQ ID N°: 22 do Pedido de Patente Internacional W00068396.

Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de aminoácido é utilizada para aplicações de grande escala.

Preferivelmente a sequência de aminoácido é produzida em uma quantidade de 1 g por litro a cerca de 100 g por litro do volume de cultura de 25 célula total após o cultivo do organismo hospedeiro.

A presente invenção também se refere a uma composição que compreende sequências de aminoácidos e/ou sequências de nucleotídeos codificando uma xilanase como descrito aqui.

A composição da presente invenção pode levar ao aroma, sabor, 30 suavidade, consistência, textura, corpo, sensação na boca, firmeza, viscosidade, fratura de gel, estrutura e/ou propriedades organolépticas melhoradas e nutrição de produtos para consumo contendo a referida composição. Além disso, a composição da presente invenção pode também ser utilizada em combinação com outros componentes de produtos para consumo para liberar as referidas melhorias.

Embora seja preferido que a composição da presente invenção seja utilizada para melhorar o aroma, sabor, suavidade, consistência, textura, corpo, sensação na boca, firmeza, viscosidade, fratura de gel, estrutura, maciez da superfície e/ou propriedades organolépticas e nutrição de produ- - tos para consumo contendo a referida composição - a presente invenção também abrange o uso da composição da presente invenção como um componente de combinações farmacêuticas com outros componentes para liberar benefício médico ou fisiológico para o consumidor.

Consequentemente, a composição da presente invenção pode ser usada em combinação com outros componentes.

Os exemplos de outros componentes incluem um ou mais de: espessantes, agentes gelificantes, emulsificantes, aglutinantes, modificadores de cristal, adoçantes (incluindo adoçantes artificiais), modificadores de - reologia, estabilizadores, antioxidantes, tintas, enzimas, carreadores , veículos, excipientes, diluentes, agentes lubrificantes, agentes aromatizantes, material corante, agentes de suspensão, desintegrantes, os aglutinantes de granulação etc. Estes outros componentes podem ser naturais. Estes outros componentes podem ser preparados pelo uso de técnicas químicas e/ou enzimáticas.

Como usado aqui o termo "agente espessante ou gelificante" como usado aqui se refere a um produto que previne a separação reduzindo ou prevenindo o movimento de partículas, gotículas de líquidos imiscíveis, ar ou sólidos insolúveis. O espessamento ocorre quando as moléculas hidratadas individuais causam um aumento na viscosidade, reduzindo a separação. A gelificação ocorre quando as moléculas hidratadas se ligam para formar uma rede tridimencional que captura as partículas, desse modo imobilizando-as.

O termo "estabilizador" como usado aqui é definido como um ingrediente ou combinação de ingredientes que mantêm um produto (por e- xemplo, um bom produto) que muda durante o tempo.

O termo "emulsificante" como usado aqui se refere a um ingrediente (por exemplo, um bom ingrediente do produto) que previne a separação de emulsões. As emulsões são duas substâncias imiscíveis, uma presente em forma de gotícua, contida dentro da outra. As emulsões podem consistir em óleo em água, onde a gotícula ou fase dispersa é óleo e a fase contínua é água; ou água em óleo, onde a água torna-se a fase dispersa e a fase contínua é óleo. As espumas, que são gás em líquido, e suspensões, que são sólido em líquido, podem também ser estabilizadas por meio do uso de e- mulsificantes. O arejamento pode ocorrer em um sistema de três fases onde o ar é apanhado por óleo líquido em seguida estabilizado por cristais de gordura aglomerados estabilizados com um emulsificante. Os emulsificantes têm um grupo polar com uma afinidade com água (hidrofílico) e um grupo não polar que é ligado ao óleo (lipofílico). Eles são absorvidos nas interfaces das duas substâncias, fornecendo uma ação de película interfacial para estabilizar a emulsão. As propriedades hidrofílicas/lipofílicas de emulsificantes ■são afetadas pela estrutura da molécula. Estas propriedades são identificadas pelo valor de balanço hidrofílico/lipofílico (HLB). Os valores de HLB baixos indicam tendências lipofílicas maiores que são usadas para estabilizar emulsões de água em óleo. Os valores de HLB altos são designados para emulsificantes hidrofílicos, tipicamente usados em emulsões de óleo em á- gua. Estes valores são derivados de sistemas simples. Devido ao fato dos alimentos frequentemente conterem outros ingredientes que afetam as propriedades emulsificantes, os valores de HLB nem sempre podem ser uma guia segura para seleção de emulsificante.

Como usado aqui o termo "aglutinante" refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentar) que liga o produto juntamente por meio de uma reação física e química. Durante a "exultação", por exemplo, água é absorvida, fornecendo um efeito de ligação. Entretanto, os aglutinantes podem absorver outros líquidos, tais como óleos, mantendo-os dentro do produto. No contexto da presente invenção os aglutinantes podem tipicamente ser usados em produtos sólidos ou de baixa umidade, por exemplo, produtos de cozimento: pastéis, sonhos, pão e outros.

O termo "modificador de cristal" como usado aqui se refere a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente alimentar) que afeta a cristalização da gordura ou água. A estabilização de cristais de gelo é importante por duas razões. A primeira está diretamente relacionada à estabilidade do produto a partir de um ponto de vista da separação. Quanto mais ciclos de congela- mento/descongelamento um produto enfrenta, mais cristais de gelo se for- ■ mam. Estes cristais grandes podem quebrar a estrutura do produto, que o- corre naturalmente, como no caso de paredes celulares, ou aquela que é criada por "exultação". Por que a água não é mais mantida no local, o produto pode apresentar sinérese, ou escorrimento, após o descongelamento.

Em segundo lugar, no caso de um produto que é consumido congelado, estes cristais grandes resultam em uma sensação de boca arenosa, indesejável.

"Carreadores" ou "veículos" significam materiais adequados para administração de compostos e incluem qualquer tal material conhecido na -técnica tal como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizante, ou similares, que é não tóxico e que não interage com quaisquer componentes da composição de uma maneira deletéria.

Os exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis incluem, por exemplo, água, soluções de sal, álcool, silicone, ceras, geleia de petróleo, óleos vegetais, polietileno glicóisglicóis, propileno glicol, lipossomas, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, tensoati- vos, ácido silícico, parafina viscoso, óleo de perfume, monoglicerídeos e di- glicerídeos de ácido graxo, éteres de ácido graxo de petroetral, hidroximetil- celulose, polivinilpirrolidona, e similares.

Os exemplos de excipientes incluem um ou mais de: celulose microcristalina e outras celuloses, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, glicina, amido, lactose e polietileno glicóis de alto peso molecular.

Os exemplos de desintegrantes incluem um ou mais de: amido (preferivelmente amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos.

Os exemplos de aglutinantes de granulação incluem um ou mais de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelu- lose (HPC), sacarose, maltose, gelatina e acácia.

Os exemplos de agentes lubrificantes incluem um ou mais de: estearato de magnésio, ácido esteárico, behenato de glicerila e talco.

Os exemplos de diluentes incluem um ou mais de: água, etanol, ■ propileno glicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

Os outros componentes podem ser usados simultaneamente 10 (por exemplo, quando estão juntos em mistura ou até quando eles são liberados por rotinas diferentes) ou sequencialmente (por exemplo, eles podem ser liberados por rotinas diferentes).

Como usado aqui o termo "componente adequado para consumo animal ou humano" significa um composto que é ou pode ser adicionado 15 à composição da presente invenção como um suplemento que pode ser benefício nutricional, um substituto de fibra ou ter um efeito geralmente benéfico ao consumidor. Os ingredientes podem ser usados em uma ampla variedade de produtos que exigem gelificante, texturização, estabilização, suspensão, formação de película e estruturação, retenção de suculência, sem ‘ 20 adição de viscosidade desnecessária. Preferivelmente, os ingredientes serão capazes de melhorar a vida de prateleira e a estabilidade da cultura viável.

Por meio de exemplo, os componentes podem ser prebióticos tais como alginato, xantano, pectina, goma de feijão alfarrobeira (LBG), insulina, goma guar, galacto-oligossacarídeo (GOS), fruto-oligossacarídeo 25 (FOS), lactosacarose, oligossacarídeos de feijão de soja, palatinose, isomal- to-oligossacarídeos, glico-oligossacarídeos e xilo-oligossacarídeos.

A composição da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - um alimento. Aqui, o termo "alimento" é usado em um sentido amplo - e abrange alimento para seres humanos bem como alimen- 30 to pra animais (isto é, uma ração). Em um aspecto preferido, o alimento é para consumo humano.

O alimento pode estar na forma de uma solução ou como um só- lido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de ad-ministração.

Quando usada como - ou na preparação de - um alimento - tal como alimento funcional - a composição da presente invenção pode ser u- 5 sada junto com um ou mais de: um carreador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente • ativo.

A composição da presente invenção pode ser usada como um 10 ingrediente alimentar.

Como usado aqui o termo "ingrediente alimentar" inclui uma formulação que é ou pode ser adicionada aos alimentos funcionais ou gêneros alimentícios como um suplemento nutricional e/ou suplemento de fibra. O termo ingrediente alimentar como usado aqui também se refere a formula- 15 ções que podem ser usadas em níveis baixos em uma ampla variedade de produtos que exigem gelificação, texturização, estabilização, suspensão, -formação de película e estruturação, retenção de suculência e sensação de boca melhorada, sem adição de viscosidade.

O ingrediente alimentar pode estar na forma de uma solução ou 20 como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

A composição da presente invenção pode ser - ou pode ser adicionada a - suplementos alimentares.

A composição da presente invenção pode ser - ou pode ser adi- 25 cionada a - alimentos funcionais.

Como usado aqui, o termo "alimento funcional" significa alimento que é capaz de fornecer não apenas um efeito nutricional e/ou uma satisfação de gosto, mas também capaz de liberar outro efeito benéfico para o consumidor.

Consequentemente, os alimentos funcionais são alimentos co muns que têm componentes ou ingredientes (tais como aqueles descritos aqui) incorporados neles que dão ao alimento um efeito funcional específico - por exemplo, benefício médico ou fisiológico - diferente de um puramente nutricional.

Embora não exista nenhuma definição legal de um alimento funcional, a maioria das partes com um interesse nesta área concorda que eles 5 são alimentos comercializados como tendo efeitos específicos sobre a saúde.

Alguns alimentos funcionais são nutracêuticos. Aqui, o termo - "nutracêutico" significa um alimento que é capaz de fornecer não apenas um efeito nutricional e/ou uma satisfação de gosto, mas é também capaz de li- 10 berar um efeito terapêutico (ou outro benefício) para o consumidor. Os nutracêuticos atravessam as linhas divisórias tradicionais entre os alimentos e a medicina.

Análises sugeriram que os consumidores coloquem a máxima ênfase nas reivindicações de alimento funcional relacionado com doença 15 cardíaca. A prevenção de câncer é outro aspecto de nutrição que interessa muito aos consumidores, porém de modo interessante, essa é a área sobre a qual os consumidores sentem que podem exercer menos controle. De fato, de acordo com World Health Organization, pelo menos 35% dos casos de câncer estão relacionados com dieta. Além disso, as reivindicações relacio- 20 nadas com efeitos de osteoporose, saúde do intestino e obesidade são também fatores-chave que são suscetíveis de incitar à compra de alimentos funcionais e impulsionar o desenvolvimento do comércio.

A composição da presente invenção pode ser usada na preparação de produtos alimentícios tal como um ou mais de: compotas de frutas , 25 marmeladas, geleias, produtos lácteos (tal como leite ou queijo), produtos de carne, produtos de aves domésticas, produtos de peixe e produtos de padaria.

Por meio de exemplo, a composição da presente invenção pode ser usada como ingredientes para refrigerantes, um suco de fruta ou uma 30 bebida compreendendo proteína do soro de leite, chás para saúde, bebidas de cacau, bebidas lácteas e bebidas de bactérias do ácido lático, iogurte e iogurte de beber, queijo, sorvete, sorvetes de frutas e sobremesas, confeitaria, biscoitos, bolos e misturas de bolo, lanches, cereais de café da manhã, macarrões instantâneos e macarrões de copo, sopas instantâneas e sopas de copo, alimentos e bebidas balanceados, adoçantes, barra de refeição leve de textura melhorada, barras de fibra, recheios de fruta estáveis ao cozimento, revestimento para bolos, recheio de padaria de chocolate, recheio aromatizado de bolo de queijo, recheio de bolo aromatizado com fruta, glacê de sonho e bolo, recheio de padaria estável ao calor, cremes de recheio de - padaria instantâneos, recheio para biscoitos, recheio de padaria pronto para uso, recheio de caloria reduzida, bebida nutricional para adulto, soja acidifi- cada/bebida de suco, bebida de chocolate asséptica/replicada, misturas de barra, bebidas em pó, leite de soja/comum e chocolate fortificado com cálcio, bebida de café fortificada com cálcio.

Uma composição de acordo com a presente invenção pode também ser usada como um ingrediente em produtos alimentícios tais como molho de queijo americano, agente antiaglutinação para queijo ralado & cortado em pedaços, imerso em pedaços, queijo cremoso, creme fermentado livre de -gordura bem batido misturado a seco, creme de leite batido congela- do/descongelado, queijo cheddar de baixo teor de gordura & totalmente natural, batido estável ao congelamento/descongelamento, iogurte do tipo Suíço de baixo teor de gordura, sobremesas congeladas aeradas, e barras de novidade, sorvete em pacote duro, sorvete com baixo teor de gordura, amistosamente rotulado, economias & prazer melhorados de sorvete em pacote duro: fácil de servir, molho de barbecue, molho imersão de queijo, recheio de queijo espécie de ricota, molho Alfredo misturado a seco, molho de queijo misturado, molho de tomate misturado a seco e outros.

Para certos aspectos, preferivelmente o gênero alimentício é uma bebida.

Para certos aspectos, preferivelmente o gênero alimentício é um produto de padaria - tal como pão, pastel dinamarquês, biscoitos ou bolinhos.

A presente invenção também fornece um método de preparar um alimento ou um ingrediente alimentar, o método compreendendo xilana- se produzida pelo processo da presente invenção ou a composição de acordo com a presente invenção com outro ingrediente alimentar. O método de preparação ou um ingrediente alimentar é também outro aspecto da presente invenção.

Em um sentido geral, um polipeptídeo tendo atividade de xilana se da invenção pode ser usado para solubilizar e/ou degradar o material da parede celular de planta insolúvel contendo arabinoxilano, após, por exem- - pio, reduzir a viscosidade derivada da presença de hemicelulose ou arabinoxilano em uma solução ou sistema compreendendo material da parede celu- 10 lar de planta. Tipicamente os referidos materiais da parede celular de planta compreenderão um ou mais inibidores de xilanase.

Especificamente, um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da invenção pode ser usado no processamento de materiais de planta para uso como gêneros alimentícios, tal como ração animal, na produção de amido, 15 no cozimento, na produção de bioetanol a partir de material celulósico e no processamento de polpa de madeira para fazer papel.

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da invenção pode ser usado para processar os materiais de planta tais como cereais que são usados em gêneros alimentícios incluindo ração animal. Como usado aqui, o ' 20 termo "cereal" significa qualquer espécie de grão usada para alimento e/ou qualquer grama produzindo este grão tal como, porém não limitado a, qualquer um de trigo, trigo moído, cevada, milho, sorgo, centeio, aveias, triticale e arroz ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o cereal é um cereal de trigo.

A xilana no alimento e/ou suplemento alimentar é modificada contactando-se a xilana com o polipeptídeo tendo a atividade de xilanase da presente invenção.

Como usado aqui, o termo "contactando" inclui, porém não está limitado a, vaporização, revestimento, impregnação ou formação em cama- 30 das do alimento e/ou suplemento alimentar com o polipeptídeo tendo atividade de xilanase da presente invenção.

Em uma modalidade, o alimento e/ou suplemento alimentar da presente invenção podem ser preparados misturando-se o polipeptídeo tendo atividade de xilanase diretamente com um alimento e/ou suplemento alimentar. Por meio de exemplo, o polipeptídeo tendo atividade de xilanase pode ser contactado (por exemplo, por vaporização) em um alimento e/ou 5 suplemento alimentar com base em cereal tal como trigo moído, milho ou farinha de soja.

É também possível incorporar o polipeptídeo tendo atividade de -xilanase em um segundo (e diferente) alimento e/ou alimentação ou água potável que é em seguida adicionado ao alimento e/ou suplemento alimentar 10 da presente invenção. Consequentemente, não é essencial que o polipeptídeo tendo atividade de xilanase fornecida pela presente invenção seja incorporado no alimento e/ou suplemento alimentar com base em cereal sozinho, por meio da tal incorporação forma um aspecto particularmente preferido da presente invenção.

Em uma modalidade da presente invenção, o alimento e/ou su plemento alimentar podem ser combinados com outro alimento e/ou compo- -nentes alimentares para produzir um alimento e/ou alimentação com base em cereal. Tais outros alimentos e/ou componentes alimentares podem incluir um ou mais outros suplementos de enzima (preferivelmente termoestá- 20 veis), alimento e/ou suplementos alimentares de vitamina, alimento e/ou suplementos alimentares minerais e alimento e/ou suplementos alimentares de aminoácido. O alimento e/ou suplemento alimentar (combinados) resultantes compreendendo possivelmente vários tipos diferentes de compostos podem em seguida ser misturados em uma quantidade apropriada com o outro ali- 25 mento e/ou componentes alimentares tais como suplementos de cereal e proteína para formar um alimento humano e/ou uma ração animal.

Em uma modalidade preferida, o alimento e/ou suplemento alimentar da presente invenção podem ser preparados misturando-se enzimas diferentes tendo as atividades apropriadas para produzir uma mistura de en- 30 zima. Por meio de exemplo, um alimento e/ou suplemento alimentar com base em cereal formado de, por exemplo, trigo ou milho moído podem ser contatados (por exemplo, por vaporização) simultaneamente ou sequencial- mente com a enzima de xilanase e outras enzimas tendo atividades apropriadas. Estas enzimas podem incluir, porém não estão limitadas a, qualquer uma ou mais de uma amilase, uma glicoamilase, uma mananase, uma galactosidase, uma fitase, uma lipase, uma fosfolipase, uma galactolipase, uma 5 glicanase, uma arabinofuranosidase, um feruliol esterase, uma pectinase, uma protease, um glicose oxidase, uma hexose oxidase e uma xilanase. As enzimas tendo as atividades desejadas podem, por exemplo, ser misturadas com a xilanase da presente invenção antes contatando estas enzimas com um alimento e/ou suplemento alimentar com base em cereal ou alternativa- 10 mente tais enzimas podem ser contatadas simultaneamente ou sequencialmente em tal suplemento com base em cereal. O alimento e/ou suplemento alimentar são em seguida sucessivamente misturados com um alimento e/ou alimentação com base em cereal para preparar o alimento e/ou alimentação finais. É também possível formular o alimento e/ou suplemento alimentar 15 como uma solução das atividades enzimáticas individuais e em seguida misturar esta solução com um alimento e/ou meterial alimentar antes do proces- - sarnento do alimento e/ou suplemento alimentar em péletes ou como uma mistura.

A presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo tendo ati- ■ 20 vidade de xilanase da invenção em um processo para preparar um gênero alimentício. Os produtos de padaria típicos (cozidos) de acordo com a presente invenção incluem pão - tais como pães, baguetes, pãezinhos doces, bases de pizza etc. - salgadinhos, tortillas, bolos, bolinhos, biscoitos, bolachas etc. A preparação de gêneros alimentícios tais como produtos de pada- 25 ria é bem conhecida na técnica. A produção de massa, por exemplo, é descrita no exemplo 4. O uso de um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da invenção para alterar desempenho de cozimento é descrito no exemplo 4.

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da invenção pode também ser usado em produção de amido de materiais de planta derivados 30 de cereais e tubérculos, tais como batatas.

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da invenção pode também ser usado no processamento de poupa de madeira, por exemplo, em uma preparação de papel.

Processamento de Material Celulósico para Produção de Bioetanol

Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase da invenção pode também ser usado na hidrólise de material de planta celulósico para a pro- 5 dução de açúcares fermentáveis para bioetanol.

Em algumas modalidades particulares o polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com a invenção tem uma atividade de xilanase ■ ideal em temperaturas de processamento de massa, tal como na faixa de cerca de 20 a cerca de 40°C. Em algumas modalidades o polipeptídeo tendo 10 atividade de xilanase de acordo com a invenção é inativado durante um processo de cozimento.

Em algumas modalidades alternativas o polipeptídeo tendo atividade de xilanase de acordo com a invenção tem termoestabilidade e/ou temperatura ideal aumentadas quando comparado com a enzima do tipo 15 selvagem correspondente para reter a atividade após o tratamento por a- quecimento. Ambas as características são conhecidas pelas pessoas versa- ■das na técnica.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Mutaqênese direcionada ao sítio de xilanases e expressão Os mutantes específicos do Bacillus subtilis xilanase foram obti dos usando um construto compreendendo o sítio de ligação do ribossomo de pET24a (ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat) fundido no gene de xilanase do tipo selvagem sem a sequência de sinal (atggctagcacagactactggca- a tggtaa) ser transferida para o vetor pCRBIunt (InVitrogen, Carlsbad, 25 CA, USA). Isto resultou na expressão constitutiva de xilanase em células TOP10 (InVitrogen) após a transformação com o vetor construído, com a condição de que a orientação do gene fosse em um sentido "horário". A mutação direcionada ao sítio no gene foi em seguida obtida pelo uso do kit de mutagênese de "QuickChange" (Stratagene, La Jolla, CA, USA) de acordo 30 com o protocolo do fabricante. Os mutantes foram verificados por sequenci- amento. A produção suficiente dos mutantes verificados foi obtida pelo crescimento das células TOP10 transformadas em escala de 1 L.

Exemplo 2 - Estudos de solubilização de farelo de mutantes de xilanase Foi usado o farelo de trigo como substrato para avaliar a atividade específica das variantes de xilanase visto que esta é usada em aplicações comerciais.

Substrato de Farelo: Por meio de exemplo, o farelo pode ser farelo de trigo obtido de moagem a seco de trigo usando uma escala de laboratório Chopin CD Auto Mill (Chopin Technologies, France), usando a colocação e condições fornecidas pelo fornecedor, para moer o trigo em farinha e farelo de trigo. A fração 10 de farelo obtida pode ser usada como substrato no ensaio de solubilização de farelo. Neste exemplo o trigo foi usado como a fonte de cereal.

Ensaio de Solubilização de Farelo:

Uma suspensão de farelo de trigo em tampão de hidrogeno fosfato (0,2 M) de dissódio- (0,1 M), pH 5,0 é preparada a uma concentração de 1,33% de farelo (peso/peso). A partir desta suspensão, alíquotas de 750 I são transferidas em tubos Eppendorph sob agitação. Cada tubo de substrato -é preaquecido durante 5 minutos a 40°C. Antes disso, 250 pl de solução de enzima são adicionados, tornando a concentração final de substrato a 1%. Três diluições (em duplicata) são feitas de cada xilanase, com aumento da ' 20 concentração de enzima (0,33; 1,0 e 3,0 pg de xilanase/farelo de grama) a cada momento determinante (0, 30, 60 e 240 minutos). Como absoluto, uma solução de calor desnaturada da xilanase é usada. A reação é terminada nos tempos determinados, transferindo os tubos para uma incubadora fixada a 95°C. As amostras de calor desnaturada são mantidas a 4°C até todas as 25 reações de enzima serem terminadas. Quando todas as reações de enzima são terminadas, os tubos Eppendorph são centrifugados para obter um so-brenadante claro. A capacidade das enzimas de solubilizar farelo é expressa como aumento de OD41o, determinado pelo aumento nos grupos redutores finais usando reagentes de PAHBAH (Lever, 1972).

Em resumo, os grupos redutores finais são reagidos com PAH

BAH formando um produto de reação colorido, que pode ser quantificado em OD OD410.

O ensaio de solubilização de farelo acima é sensível à atividade colateral de enzimas ativas em amido residual no substrato de farelo. Protocolo de purificação de xilanase de Bacillus subtilis:

As células E. coli TOP10 tendo expresso a xilanase foram colhi- 5 das por centrifugação (20 minutos, 3500 x g, 20°C) e novamente suspensas em Tris a 50 mM, EDTA a 2 mM, pH 7,4. As células foram abertas pela adição de 1 mg/ml de lisozima (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, Estados ■ Unidos, cat. n° 100831), agitação da suspensão durante duas horas em temperatura ambiente, congelamento e descongelamento seguido sonica- 10 ção. O pH foi ajustado para 4,0 usando HCI a 1M seguido por centrifugação (20 minutos, 3500 x g, 20°C). O sobrenadante contendo a xilanase foi dessalgado usando colunas de dessalinização PD-10 disponíveis (Amersham Bioscience, Sweden) equilibrados em e eluídos com acetato de sódio a 50 mM, pH 4,5. A amostra dessalgada foi carregada sobre uma coluna SOUR- 15 CE 15S a 10 ml (Amersham Bioscience, Sweden) pré-equilibrada com acetato de sódio a 50 mM, pH 4,5. A coluna foi em seguida lavada com tampão de -equilíbrio e eluída com um gradiente de NaCI linear (acetato de sódio a 50 mM, NaCI a 0 - 0,35M, pH 4,5). As frações contendo atividade de xilanase foram misturadas e usadas para outra análise.

Os protocolos similares podem ser adaptados às variantes de xi lanase derivadas de não Bacillus subtilis XynA tendo um pl significantemente diferente de Bacillus subtilis XynA Tabela 1. Atividade de solubilização de farelo de xilanase expressa como, densidade óptica máxima, índice de declividade de mutantes de xilanase, densidade óptica relativa e declividade comparada à xilanase BS1 (a enzima de Bacillus subtilis mostrada como SEQ ID n° 1) e a xila- nase BS3 (variante de Bacillus subtilis mostrada como SEQ IP n° 23)

Exemplo 3 - Teste de atividade de xilanase e inibição relativa por inibidores de xilanase de cereal

Os mutantes de exemplo 2 foram testados quanto à atividade de xilanase e sensibilidade relativa a um inibidor de xilanase pelos protocolos 5 apresentados abaixo e de acordo com as instruções.

Ensaio de xilanase (atividade de endo-β-1,4-xilanase)

As amostras foram diluídas em tampão de ácido cítrico (0,1 M) - - hidrogeno fosfato de dissódio- (0,2 M), pH 5,0, para obter aproximadamente OD590 = 0,7 neste ensaio. Três diluições diferentes da amostra foram pré- 10 incubadas durante 5 minutos a 40°C. Em tempo = 5 minutos, 1 comprimido de xilazima (de ligação cruzada, substrato de xilana tingido, Megazyme, Bray, Irlanda) foi adicionado à solução de enzima em um volume de reação de 1 ml. Em tempo =15 minutos a reação foi terminada adicionando-se 10 ml de TRIS/NaOH a 2%, pH 12. Os absolutos foram preparados usando 15 1000 pl de tampão em vez de solução de enzima. A mistura reacional foi centrifugada (1500 x g, 10 minutos, 20°C) e o OD do sobrenadante foi medi- -do em 590 nm. Uma unidade de xilanase (XU) é definida como a atividade de xilanase aumentando o OD590 com 0,025 por minuto.

Determinação da atividade específica:

A densidade óptica em 280 nm das amostras purificadas foi me dida pra determinar a concentração de proteína de xilanase. Um OD280 específico, teoricamente calculado (Gasteiger e outros, 2003) de 0,25 unida- de/mg x ml foi usado para cálculo da atividade específica das variantes de Bacillus subtilis XynA. A atividade de xilanase foi determinada como descrito 25 acima.

Ensaio de Inibidor de Xilanase

100 pl de preparação de inibidor (contendo várias concentrações de inibidor de xilanase (quanto à quantificação, vide a quantificação de inibidor de xilanase abaixo)), 250 pl de solução de xilanase (contendo 12 XU de 30 xilanase/ml) e 650 pl de tampão (tampão de ácido cítrico a 0,1 M -hidrogeno fosfato de dissódio a 0,2M, 1% de BSA (Sigma-Aldrich, Estados unidos da América), pH 5,0) foram misturados. A mistura foi termoestabelecida durante minutos a 40,0°C. Em tempo = 5 minutos um comprimidos de xilazima (de ligação cruzada, substrato de xilana tingido, Megazyme, Bray, Irlanda) foi adicionado. Em tempo =15 minutos a reação foi terminada adicionando-se 10 ml de TRIS/NaOH a 2%, pH 12. A mistura reacional foi centrifugada 5 (1500 x g, 10 minutos, 20°C) e o sobrenadante medido em 590 nm. O inibi dor de xilanase foi calculado como a atividade residual em %, comparada com o absoluto. Os absolutos foram preparados da mesma forma, porém - substituindo a solução inibidora com água.

Quantificação de inibidor de Xilanase: 1 XIU (Xilanase Inhibitor Unit) é definida como a quantidade de inibidor que aumenta 1 XU da xilanase de Bacillus subtilis XynA (SEQ ID N° 1) para 0,5 XU sob as condições descritas abaixo. 250 pl de solução de xilanase contendo 12 XU/ml, aproximadamente 100 pl de solução inibidora de xilanase e tampão de Mcll- 15 vaine, pH 5, para alcançar um volume de reação de 1000 pl são pré- incubados durante 5 minutos a 40°C. Em t = 5 minutos, 1 comprimido de xi- -lazima é adicionado à mistura reacional. Em t = 15 minutos a reação é terminada, por adição de 10 ml de TRIS/NaOH a 2%, pH 12. A solução é filtrada e a absorção do sobrenadante é medida em 590 nm. Escolhendo várias 20 concentrações diferentes de inibidor no ensaio acima, é possível criar uma plotagem de OD versus concentração de inibidor. Usando a declividade (a) e a interceptação (b) desta plotagem e a concentração da xilanase é possível calcular a quantidade de XIU em uma determinada solução inibidora (equação 1). Equação 1 XIU = ((b/2)/-a)/x X = unidade de xilanase (XU) no ensaio

Preparação de inibidor: Uma preparação de inibidor bruto (contendo tanto TAXI quanto XIP, a seguir referida como preparação de inibidor) foi preparada a partir de 30 1 kg de farinha de trigo (Triticum aestivum). A preparação de inibidor foi ex traída da farinha usando água em uma relação de 1:3 (peso:peso) seguido por centrifugação (3500 x g, 20 minutos, 4°C). O extrato foi mantido a 65°C durante 40 minutos, centrifugado (3500 x g, 20 minutos, 4°C) e dessalgado usando colunas de dessalinização PD-10 disponíveis (Amersham Bioscien- ce, Sweden) pré-equilibradas com tampão de fosfato de sódio a 20 mM, pH 7. A concentração de TAXI na preparação de inibidor foi determinada como descrito acima. O protocolo para purificação e quantificação de TAXI é descrito em outro lugar (Sibbesen e Sorensen, 2001). Por meio de exemplo a- penas, o TAXI na preparação pode ser SEQ ID n° 24 ou uma sequência ten- - do 90% de identidade com ele. Tabela 2 - Atividade de xilanase (XU/mg) e sensibilidade de inibidor de 10 xilanase de mutantes indicados como atividade de xilanase residual em aumento das concentrações inibidoras de xilanase (ensaio de XlU/ml).

Exemplo 4 - Desempenho do Cozimento de Mutantes

O cozimento foi feito usando uma escala da receita Danish Roll (tabela 3), usando ou farinha de trigo ou farinha grossa total de trigo.

Nota: Água é a absorção de água @ 400BU determinada por análise Fari- nograph de farinha (isto é, absorvência de 400 padeiros - água adicionada • de acordo com a determinação de absorção de água usando um Brabrender Farinograph, Brabender, Alemanha). Se enzimas forem adicionadas à massa, elas são adicionadas como solução líquida e por substituição pela mesma quantidade de água.

Preparação de Massa e Cozimento

A farinha e ingredientes secos são misturados durante um minuto em 50 gramas de Farinograph (Brabender, Duisburg, Alemanha), a seguir água foi adicionada e a mistura foi continuada durante mais cinco minutos.

Após a mistura, quatro pedaços de massa foram pesados, cada ‘qual contendo 10 gramas de farinha de trigo. Estes foram moldados em pão usando um modelador manual. Os pães foram colocados em panelas de cozimento e colocados em um recipiente selado (com uma tampa) e deixados descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos. A seguir, os pães foram refratários a 34°C, 85% de umidade relativa (RH), durante 45 minutos e finalmente cozidos a 230°C durante cinco minutos em um forno Bago (Bago-line, Fâborg, Denmark).

Os pães foram resfriados durante 20 minutos antes da avaliação (pesando, medição de volume, avaliação de migalha e casca). Tabela 4 - Desempenho de cozimento de mutantes - volume de pão (ml/g) e aumento de volume relativo em comparação ao controle (nenhuma enzima adicionada) e BS3 (SEQ ID N°:1 com as modificações D11F e R122D) que mostram superior desempenho de cozimento em 5 comparação à Bacillus sub. XynA xilanase tipo selvagem (SEQ ID N°: * U

Exemplo 5 - Efeito de modificação para o resíduo 110 em xilanase

XynA de Bacillus subtilis (SEQ ID N°: 1) ou posição equivalente em outra família 11 xilanases.

Xilanase:

Xilanase mutada neste exemplo é a xilanase XynA do tipo sel vagem Bacillus subtilis (SEQ ID N°: 1), uma variante da xilanase Xyn2 de Trichoderma reesei (SEQ ID N°: 2) e a xilanase XynA do tipo selvagem de Thermomyces lanuginosus (SEQ ID N°: 3). O residuo mutado é T110 na xilanase do tipo selvagem Bacillus subtilis XynA (SEQ ID N°: 1), a posição equivalente, T120, em xilanase de Trichoderma reesei (SEQ ID N°: 2) e a posição equivalente, T120, em xila- nase XynA do tipo selvagem de Thermomyces lanuginosus (SEQ ID N°: 3). As seguintes mutações foram feitas em xilanase XynA do tipo selvagem de Bacillus subtilis (SEQ ID N°: 1): T110H, T110Y, T110S, T110R, T110F, -T110Q, T110G, T110K, T110L, T110M, T110I, T110T, T110N, T110E, T110W, T110A e T110C. Tanto em xilanase de Trichoderma reesei (SEQ ID N°: 2) e xilanase XynA do tipo selvagem Thermomyces lanuginosus (SEQ ID N°: 3) a posição equivalente, T120, foi mutada. As mutações feitas são para o aminoácido alanina.

Mutações, expressão, purificação e determinação de atividade específica das xilanases do tipo selvagem ou suas variantes são realizadas como descrito nos exemplos 1, 2 e 3. Exceto para a purificação da xilanase variante de Trichoderma reesei, a xilanase XynA do tipo selvagem de Ther- -momyces lanuginosus e sua variante T120A, aqui o protocolo de purificação foi modificado para refletir seu pl.

Tabela 5. Atividade Específica determinada como proteína xilanase a XU/mg da xilanase XynA de Bacillus subtilis do tipo selvagem (SEQ ID N°: 1), a xilanase variante XynA de Bacillus subtilis (T110A), a xilanase de Trichoderma reesei (SEQ ID N°: 2), a xilanase Xyn2 variante de Tri-choderma reesei (T120A), a xilanase XynA do tipo selvagem Thermomyces lanuginosus (SEQ ID N°: 3) e a xilanase variante XynA de Thermomyces lanuginosus (T120A.).

Em todos os casos, a mutaçao T110A na xilanase XynA de Ba-cillus subtilis do tipo selvagem (SEQ ID N°: 1) ou uma posição equivalente 10 (T120) na xilanase de Trichoderma reesei (SEQ ID N°: 2) ou a xilanase XynA do tipo selvagem Thermomyces lanuginosus (SEQ ID N° 3) resulta em uma atividade específica aumentada significante.

Em xilanase XynA do tipo selvagem Bacillus subtilis (SEQ ID N°: 1) também as mutações T110E, T110N, T110W, e T110C resultam em uma 15 atividade específica aumentada.

Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistema da presente invenção descritos serão evidentes para a- queles versados na técnica sem afastar-se do escopo e espírito da presente invenção. Embora a presente invenção foi descrita com relação às modalidades preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades. De fato, 5 várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvios para aqueles versados em bioquímica e biotecnologia ou campos relacionados destinam-se a ser incluídas no escopo das seguintes reivindi- - cações.

Exemplo 6: Atividade de variantes de xilanase sobre substrato insolú- 10 vel em água versus substrato insolúvel.

Variantes de xilanase do BACSU_XynA e TRIRE_Xyn2 foram geradas usando mutagênese de xilanase direcionada ao sítio e expressão em E. coli.

Ensaio para determinar a atividade sobre o substrato não extraí- vel em água, WU-AX age. (substrato insolúvel):

As amostras foram diluídas em ácido cítrico (0,1 M) - tampão de - hidrogeno fosfato de dissódio- (0,2 M), pH 5,0, para obter aproximadamente

OD59O = 0,7 neste ensaio. Três diluições diferentes da amostra foram pré- incubadas durante 5 minutos a 40°C. Em tempo = 5 minutos, 1 comprimido de Xilazima (substrato de xilano seco, reticulado, Megazyme, Bray, Irlanda) foi adicionado à solução de enzima em um volume de reação de 1 ml. Em tempo = 15 minutos a reação foi terminada adicionando 10 ml de 2% de TRIS/NaOH, pH 12. Os absolutos foram preparados usando 1000 pl de tampão em vez de solução de enzima. A mistura reacional foi centrifugada (1500 x g, 10 minutos, 20°C) e a OD do sobrenadante foi medida a 590 nm.

Uma unidade de xilanase (procedimento WU-AX) é definida como a atividade de xilanase aumentando a OD590 com 0,025 por minuto.

O substrato (arabinoxilano reticulado e seco extraído de trigo) usado no ensaio acima é uma boa aproximação para o substrato correspon- 30 dente em aplicações comerciais.

O seguinte ensaio foi usado para determinar a atividade sobre o substrato extraível de água, procedimento WE-AX (substrato solúvel).

O método usado é uma versão modificada do método descrito por Lever (Lever, M. Analytical Biochemistry. 47, 273-279, 1972). Arabinoxi- lano de trigo solúvel (viscosidade média, obtenível de Megazyme, Bray, Irlanda) foi usado como o substrato em um sistema tampão contendo NaOAc 5 a 50 mM, pH 5. A concentração de substrato foi de 0,5%. Atividade de xilanase foi medida por quantificação da formação de extremidades de redução usando os reagentes PAHBAH. A quantidade de extremidades de redução . formadas e pelas quais a atividade de xilanase foi determinada de uma curva-padrão de xilose. Aqui refere-se como procedimento WE-AX. Cadeias principais usadas para desenvolver novas variantes:

A tabela 6 mostra cadeias principais de variantes de xilanase usadas. Y5 corresponde a SEQ IP N°: 2.

As mutações introduzidas e os resultados obtidos são ilustrados na tabela 7 Tabela 7. Mutações introduzidas e resultados obtidos. As cadeias prin- cipais usadas estão em negrito.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA (aminoácidos em neqriqo são os aminoácidos 'que correspondem a T110 de SEQ IP N°:1): A sequência de aminoácido da xilanase de Bacillus subtilis ma dura do tipo selvagem (SEQ IP N° 1):

ASTDYWQNWTDGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSP- FRT INYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKG- TVKSDGGTYDIYTT TRYNAPSIDGDRTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITF- 10 SNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVMA TEGYQSSGSSNVTVW

A sequência de aminoácido da xilanase de Trichoderma reesei madura (SEQ IP N° 2), também referida aqui como Y5:

QCIQPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYCNGPGGQFSVNWSNSGNFVGG KGWQPGTKNRVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNP 15 STGATKLGEVTSDGSVYDIYRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGS

VNTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSGSASITVSD

A sequência de aminoácido da xilanase XynA de Thermomyces lanuqinosus madura do tipo selvagem (SEQ IP N°: 3):

QTTPNSEGWHDGYYYSVWVSDGGAQATYTNLEGGTYEISWGDGGNLVGG

KGWNPGLNARAIHFEGVYQPNGNSYLAVYGWTRNPLVEYYIVENFGTYDP SSGATDLGTVECDGSIYRLGKTTRVNAPSIDGTQTFDQYWSVRQDKRTSG TVQTGCHFDAWARAGLNVNGDHYYQIVATEGYFSSGYARITVADVG

A sequência de aminoácido da xilanase de Streptomyces viri- dosporus madura (SEQ ID N° 4):

WTDAQGTVSMDLGSGGTYSTQWRNTGNFVAGKGWSTGGRKTVNYSGTF . NPSGNAYLTLYGWTTGPLIEYYIVDNWGTYRPTGKYKGTVTSDGGTYDIYK TTRYNAPSIEGTKTFDQYWSVRQSKRTGGTITSGNHFDAWARNGMNLGN ' HNYMIMATEGYQSSGSSTITV

SEQ ID N° 5 (qi|139868|sp|P18429.1|XYNA BACSU RecName: Full=Endo-1,4-beta-xilanase A; Short=Xilanase A; AltName: Full=1,4-beta-D- xylan xilano-hidrolase A):

MFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASAASTDYWQNWTDGGGIVNAVNGS GGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYG WTRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGWKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGD -RTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVMATEGYQSSGSSNVTVW

SEQ ID N° 6 (qi|2302074|emb|CAA03092.11 produto de proteína não denominado[não identificado!):

MRQKKLTLILAFLVCFALTLPAEIIQAQIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGSG TMILNHGGTFSAQWNNVNNILFRKGKKFNETQTHQQVGNMSINYGANFQP NGNAYLCVYGWTVDPLVEYYIVDSWGNWRPPGATPKGTITVDGGTYDIYE TLRVNQPSIKGIATFKQYWSVRRSKRTSGTISVSNHFRAWENLGMNMGKM YEVALTVEGYQSSGSANVYSNTLRINGNPLSTISNDESITLDKNN

SEQ IP N° 7 (qi|167246404|qb|ABZ24364.11 Sequência 5 de patente:US 7314743):

MVSFTSLLAASPPSRASCRPAAEVESVAVEKRQTIQPGTGYNNGYFYSYW NDGHGGVTYTNGPGGQFSVNWSNSGNFVGGKGWQPGTKNKVINFSGSY NPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPSTGATKLGEVTSDGSVYDI YRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGSVNTANHFNAWAQQGLTLG TMDYQIVAVEGYFSSGSASITVS

SEQ ID N° 8 (qi|5969551|qb|AAE10889.1| Sequência 2 de pat ente US 5817500):

MVGFTPVALAALAATGALAFPAGNATELEKRQTTPNSEGWHDGYYYSWW SDGGAQATYTNLEGGTYEISWGDGGNLVGGKGWNPGLNARAIHFEGVYQ PNGNSYLAVYGWTRNPLVEYYIVENFGTYDPSSGATDLGTVECDGSIYRLG KTTRVNAPSIDGTQTFDQYWSVRQDKRTSGTVQTGCHFDAWARAGLNVN GDHYYQIVATEGYFSSGYARITVADVG

SEQ ID N° 9 (qi|76059070|emb|CAJ30753.1| produto de proteína não denominado \Paenibacillus pabuli]):

MFKFGKKLLTWLAASMSFGVFAATTGATDYWQNWTDGGGTVNAVNGSG GNYSVNWQNTGNFWGKGWTYGTPNRWNYNAGVFSPSGNGYLTFYGW TRNALIEYYWDNWGTYRPTGTYKGTVTSDGGTYDIYTTMRYNQPSIDGYS TFPQYWSVRQSKRPIGVNSQITFQNHVNAWASKGMYLGNSWSYQVMAT- EGYQSSGSSNVTVW

SEQ ID N° 10 (qi|74197761 |emb|CAJ29666.1| produto de proteína não denominado \Bacillus halodurans]):

MFKFVTKVLTWIAATISFCLSAVPASANTYWQYWTDGGGTVNATNGPGG NYSVTWRDTGNFWGKGWEIGSPNRTIHYNAGVWEPSGNGYLTLYGWTR NQLIEYYWDNWGTYRPTGTHRGTWSDGGTYDIYTTMRYNAPSIDGTQTF QQFWSVRQSKRPTGNNVSITFSNHVNAWRNAGMNLGSSWSYQVLATE- GYQSSGRSNVTVW

SEQ ID N° 11 (qi|4756811|emb|CAB42305.1| produto de proteína não denominado [não identificadol):

MRQKKLTFILAFLVCFALTLPAEIIQAQIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGS GTMILNHGGTFSAQWNNVNNILFRKGKKFNETQTHQQVGNMSINYGANFQ PNGNAYLCVYGWTVDPLVEYYIVDSWGNWRPPGATPKGTITVDGGTYDIY ETLRVNQPSIKGIATFKQYWSVRRSKRTSGTISVSNHFRAWENLGMNMGK MYEVALTVEGYQSSGSANVYSNTLRINGNPLSTISNDKSITLDKNN

SEQ IP N° 12 (qi|2293951|emb|CAA02246.1| produto de proteína não denominado \Bacillus subtilis] Bacillus subtilis: (US 5306633)):

MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASAAGTDYWQNWTDGGGTVNAVNG SGGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYG WTRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGD NTTFTQYWSVRQSKRPTGSNAAITFSNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVLA TEGYKSSGSSNVTVW

SEQ ID N° 13 (qi|42688917|qb|AAS31735.11 Sequência 14 de patente US 6682923):

MNLRKLRLLFVMCIGLTLILTAVPAHARTITNNEMGNHSGYDYELWKDYGNT SMTLNNGGAFSAGWNNIGNALFRKGKKFDSTRTHHQLGNISINYNASFNPG . GNSYLCVYGWTQSPLAEYYIVDSWGTYRPTGAYKGSFYADGGTYDIYETT RVNQPSIIGIATFKQYWSVRQTKRTSGTVSVSAHFRKWESLGMPMGKMYE ' TAFTVEGYQSSGSANVMTNQLFIGN

SEQ ID N° 14 (qi|10040204|emb|CAC07798.1l produto de proteína não denominado \Penicillium funiculosum]):

MKLFLAAIVLCATAATAFPSELAQRAAGDLSKRQSITTSQTGTNNGYYYSF WTNGGGEVTYTNGDNGEYSVTWVDCGDFTSGKGWNPANAQTVTYSGEF NPSGNAYLAVYGWTTDPLVEYYILESYGTYNPSSGLTSLGQVTSDGGTYDI YSTQRVNQPSIEGTSTFNQYWSVRTEKRVGGTVTTANHFAAWKALGLEMG ■ TYNYMIVSTEGYESSGSSTITVS

SEQ ID N° 15 (qi|2302074|emb|CAA03092.1| produto de proteína não denominado[não identificado]):

QIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGSGTMILNHGGTFSAQWNNVNNILFRK GKKFNETQTHQQVGNMSINYGANFQPNGNAYLCVYGWTVDPLVEYYIVDS WGNWRPPGATPKGTITVDGGTYDIYETLRVNQPSIKGIATFKQYWSVRRSK RTSGTISVSNHFRAWENLGMNMGKMYEVALTVEGYQSSGSANVYSNTLRI NGNPLSTISNDESITLDKNN

SEQ IP N° 16 (qi|167246404|qb|ABZ24364.1| Sequência 5 de patente US7314743):

QTIQPGTGYNNGYFYSYWNDGHGGVTYTNGPGGQFSVNWSNSGNFVGG KGWQPGTKNKVINFSGSYNPNGNSYLSVYGWSRNPLIEYYIVENFGTYNPS TGATKLGEVTSDGSVYDIYRTQRVNQPSIIGTATFYQYWSVRRNHRSSGSV NTANHFNAWAQQGLTLGTMDYQIVAVEGYFSSGSASITVS

SEQ IP N° 17 (qi|76059070|emb|CAJ30753.1| produto de proteína não denominado \Paenibacillus pabulil):

TDYWQNWTDGGGTVNAVNGSGGNYSVNWQNTGNFWGKGWTYGTPNR WNYNAGVFSPSGNGYLTFYGWTRNALIEYYWDNWGTYRPTGTYKGTVT SDGGTYDIYTTMRYNQPSIDGYSTFPQYWSVRQSKRPIGVNSQITFQNHVN AWASKGMYLGNSWSYQVMATEGYQSSGSSNVTVW

SEQ ID N° 18 (qi|74197761|emb|CAJ29666.1| produto de proteína não denominado [Bacillus halodurans]):

NTYWQYWTDGGGTVNATNGPGGNYSVTWRDTGNFWGKGWEIGSPNRT . IHYNAGVWEPSGNGYLTLYGWTRNQLIEYYWDNWGTYRPTGTHRGTWS DGGTYDIYTTMRYNAPSIDGTQTFQQFWSVRQSKRPTGNNVSITFSNHVN ' AWRNAGMNLGSSWSYQVLATEGYQSSGRSNVTVW

SEQ ID N° 19 (qi|4756811 |emb|CAB42305.11 produto de proteína não denominado):

QIVTDNSIGNHDGYDYEFWKDSGGSGTMILNHGGTFSAQWNNVNNILFRK GKKFNETQTHQQVGNMSINYGANFQPNGNAYLCVYGWTVDPLVEYYIVDS WGNWRPPGATPKGTITVDGGTYDIYETLRVNQPSIKGIATFKQYWSVRRSK RTSGTISVSNHFRAWENLGMNMGKMYEVALTVEGYQSSGSANVYSNTLRI - NGNPLSTISNDKSITLDKNN

SEQ ID N° 20 (gi|2293951 |emb|CAA02246.11 produto de proteína não denominado [Bacillus subtilis] Bacillus subtilis: (US5306633)):

AGTDYWQNWTDGGGTVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSP FRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYKGT VKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDNTTFTQYWSVRQSKRPTGSNAAITFSN HVNAWKSHGMNLGSNWAYQVLATEGYKSSGSSNVTVW

SEQ ID N° 21 (qi|42688917|gb|AAS31735.11 Sequência 14 de patente US6682923):

RTITNNEMGNHSGYDYELWKDYGNTSMTLNNGGAFSAGWNNIGNALFRK GKKFDSTRTHHQLGNISINYNASFNPGGNSYLCVYGWTQSPLAEYYIVDSW GTYRPTGAYKGSFYADGGTYDIYETTRVNQPSIIGIATFKQYWSVRQTKRTS GTVSVSAHFRKWESLGMPMGKMYETAFTVEGYQSSGSANVMTNQLFIGN

SEQ ID N° 22 (qi|10040204|emb|CAC07798.1| produto de proteína não denominado [Penicillium funiculosum]):

AFPSELAQRAAGDLSKRQSITTSQTGTNNGYYYSFWTNGGGEVTYTNGDNGEYSVTWVDCGDFTSGKGWNPANAQTVTYSGEFNPSGNAYLAVYGWTT DPLVEYYILESYGTYNPSSGLTSLGQVTSDGGTYDIYSTQRVNQPSIEGTST FNQYWSVRTEKRVGGTVTTANHFAAWKALGLEMGTYNYMIVSTE- GYESSGSSTITVS

SEQ ID N° 23 mostra a sequência de aminoácido da xilanase de variante madura de Bacillus subtilis, BS3 (tipo selvagem com mutações de D11F/R122D):

ASTDYWQNWTFGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFWGKGWTTGSPF RTINYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYWDSWGTYRPTGTYKGTV KSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDDTTFTQYWSVRQSKRPTGSNATITFSNH VNAWKSHGMNLGSNWAYQVMATEGYQSSGSSNVTVW

SEQ ID N° 24 mostra a sequência da sequência inibidora de xilanase de trigo madura:

MPPVLLLVLAASLVALPSCQSLPVLAPVTKDPATSLYTIPFHDGASLVLDVA GPLVWSTCDGGQPPAEIPCSSPTCLLANAYPAPGCPAPSCGSDKHDKPCT AYPYNPVSGACAAGSLSHTRFVANTTDGSKPVSKVNVGVLAACAPSKLLAS

LPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQKVANRFLLCLPTGGPGVAIFGGGPV PWPQFTQSMPYTPLVTKGGSPAHYISARSIWGDTRVPVPEGALATGGVM

LSTRLPYVLLRPDVYRPLMDAFTKALAAQHANGAPVARAVEAVAPFGVCYD TKTLGNNLGGYAVPNVQLGLDGGSDWTMTGKNSMVDVKQGTACVAFVEM KGVAAGDGRAPAVILGGAQMEDFVLDFDMEKKRLGFSRLPHFTGCGGL

SEQ ID N° 25 (Sequência 11 de US 6,682,923):

ASTDWWENWTIGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFDVAKGWTTGSPFRTINYNAGV- WAPNGWGELELYGWTRSPLIEYLWDSWGTNRPTGTYKGTVKSDGGTY- DIYTDTRYNYPSEDGDRTTMTQYSSVRQSKRPTGSNA- TITFTNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQDMATEGYQSSGSSNVTVW

Modalidades da invenção:

1. Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreendendo uma sequência de aminoácido, a referida sequência de aminoácido tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 ou tendo pelo menos 75% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°: 2-22, e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, em que a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

2. Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreenden do uma sequência de aminoácido, a referida sequência de aminoácido tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 e cujo polipeptídeo tem . uma modificação de aminoácido na posição 110, em que a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da se- quência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

3. Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreendendo uma sequência de aminoácido, a referida sequência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 2 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, em que a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento.

4. Um polipeptídeo tendo atividade de xilanase e compreenden- 20 do uma sequência de aminoácido, a referida sequência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade com SEQ ID N°: 3 e cujo polipeptídeo tem uma modificação de aminoácido na posição 110, em que a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinha- 25 mento.

5. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2, em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 90, 92 ou 95% de identidade com SEQ ID N°: 1.

6. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 30 1 e 3 a 4, em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 76, 78, 80, 85, 90, , 98 ou 95% de identidade com a sequência com a qual tem a maior percentagem de identidade selecionada de SEQ ID N°: 2-22.

7. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 3, em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ou 95% de identidade com SEQ ID N°: 2.

8. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 4, em que o refe- 5 rido polipeptídeo tem pelo menos 76, 78, 80, 85, 90, 95, 98 ou 95% de identidade com SEQ ID N°: 3.

9. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades . 1-6 tendo uma duplicação de cilindro β-geleia.

10. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- 10 des 1 a 9, em que a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição de aminoácido.

11. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição para qualquer um resíduo de aminoácido diferente selecionado 15 do grupo consistindo em: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cis- teína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, -metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.

12. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- 'des 1 a 11, em que a modificação de aminoácido na posição 110 é uma ■ 20 substituição para qualquer um resíduo de aminoácido diferente selecionado do grupo consistindo em: ácido glutâmico, triptofano, alanina e cisteína.

13. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 12, em que a modificação de aminoácido na posição 110 é uma modificação para alanina.

14. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- 25 des 1 a 13 tendo um número total de aminoácidos de menos do que 250, tal como menos do que 240, tal como menos do que 230, tal como menos do que 220, tal como menos do que 210, tal como menos do que 200 aminoácidos, tal como na faixa de 160 a 240, tal como na faixa de 160 a 220 aminoácidos.

15. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 14, compreendendo uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 11, 12, 13, 34, 54, 77, 81, 99, 104, 113, 114, 118, 122, 141, 154, 159, 162, 164, 166 e 175, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

16. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- 5 des 1 a 15, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: 11F, 12F, 54Q, 54W, 122D, 113A, 13Y, 113D, 141Q, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 154R, 159D, 175K, 811, 166F, . 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V, e 77Y, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posi- ção de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

17. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 2, 5, 9 a 16, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: D11F, G12F, N54Q, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, N141Q, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M, I77S, I77V, e I77Y, a(s) posição(ões) sendo de- -terminada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

18. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- ' 20 des 1 a 17, compreendendo uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 e 175, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

19. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 18, compreendendo substiuição(ões) nas posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159 e 175, a(s) posição(ões) sendo determinada^) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

20. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- des 18 a 19, também compreendendo uma ou mais modificações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 114 e 166, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de a- minoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

21. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 19, também compreendendo uma ou mais substituições em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido: 114 e 166, a(s) posição(ões) 5 sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de a- minoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

22. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- . des 18 a 19, compreendendo substituição(ões) em pelo menos quatro das seguintes posições de aminoácido: 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159, 10 166, e 175, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

23. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 22, compreendendo substiuição(ões) nas posições de aminoácido: 15 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159 e 175, a(s) posição(ões) sendo deter minada^) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de - B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

24. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 22, compreendendo substiuição(ões) nas posições de aminoácido: ■ 20 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, 166 e 175, a(s) posição(ões) sendo deter minada^) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

25. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 20, compreendendo substiuição(ões) nas posições de aminoácido: 25 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, e 175, a(s) posição(ões) sendo determina da^) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

26. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 22 a 25, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido se- 30 lecionadas do grupo consistindo em: 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K, e 175L, a(s) posição(ões) sendo determinada^) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

27. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que a sequência de aminoácido do referido polipeptídeo tem pelo menos cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em comparação com a sequência selecionada entre SEQ ID N°: 1 a 22 com a qual ele tem a mais elevada identidade.

28. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 27, em que a . sequência de aminoácido do referido polipeptídeo tem pelo menos nove ou dez substituições de aminoácido.

29. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 28, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: a. D11F, R122D eT110A; b. D11F, R122D, T110Ae Y113A; c. G13Y, T110A, Y113D, R122D e Q175L; d. G13Y, T110A, Y113D, R122FeQ175L; -e. G13Y, G34K, T110A, Y113D, R122DeQ175L; f. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159DeQ175K; g. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Q175 e V81I; h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F e Q175L; i. G13Y, T110A, Y113D, R122D, K154R, N159DeQ175L; j. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159DeQ175L; k. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162EeQ175L; l. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162D e Q175L; m. G13Y, T110A, Y113D, R122D, W164F e Q175L; h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D e Q175L; o. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159D e Q175L; p. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D e Q175L; q. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, 1118V, R122F, K154R, N159D e Q175L; r. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159D e Q175K; - s. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D e Q175K; . t G13Y, I77L, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; u. G13Y, I77M, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; v. G13Y, I77S, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; w. G13Y, I77V, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e 15 Q175L; x. G13Y, I77Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L y. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, eQ175L; z. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, e Q175; aa. G13Y, N54W, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, 141Q, K154R, N159D, e 175L; bb. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, 25 N159D, e Q175L; cc. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, e Q175L; dd. G13Y, 54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, e Q175L; a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

30. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- des 1 a 29, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido sele-cionadas do grupo consistindo em: a. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159DeQ175K; b. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166FeQ175L; c. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D e Q175L; d. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159DeQ175L; e. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159DeQ175L; a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

31. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 30 tendo atividade de solubilização de farelo.

32. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31 em forma isolada.

33. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- 20 des 1 a 32, em que a modificação de aminoácido na posição 110 não é T110D.

34. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 33, tendo uma atividade melhorada de xilanase em comparação com a sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 como 25 medido em um ensaio de atividade de xilanase.

35. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 34, tendo uma atividade melhorada de xilanase como um resultado da modificação na posição 110.

36. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- 30 des 1 a 35 tendo uma atividade de solubilização de farelo melhorada em comparação com a sequência de aminoácido de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 como medido em um ensaio de atividade de solubilização de farelo.

37. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 36 tendo uma atividade de solubilização de farelo melhorada como um resultado da modificação na posição 110.

38. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 37, tendo uma sensibilidade reduzida a um inibidor de xilanase.

39. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- - des 1 a 38, em que o referido polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido compreendendo modificações em posições selecionadas da lista consis- 10 tindo em: a) 13/110/113/122/154/159/175; b) 13/99/104/110/113/122/154/159/166/175; c) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; d) 13/110/113/122/175; 15 e) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; f) 13/99/104/110/113/122/154/159/175; g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; h) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; i) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; • 20 j) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175; k) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; l) 13/81/99/104/110/113/122/154/159/175; m) 13/110/113/122/164/175; n) 13/110/113/122/162/175; o) 13/110/113/122/175; p) 11/122/110/113; q) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; r) 11/122/110; s) 13/34/110/113/122/175; t) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; u) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; v) 13/99/104/110/113/118/122/154/159/175; w) 13/110/113/122/162/175; x) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175; y) 13/99/104/110/113/122/141/154/159/175; z) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; aa) 13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175; bb) 13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175; cc) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175; e dd) 13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

40. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 39, em que o referido polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido compreendendo substituições de aminoácido selecionadas da lista con- 15 sistindo em: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; l) 13Y/811/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; m) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; o) 13Y/110A/113D/122D/175L; p) 11F/122D/110A/113A; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175 L; r) 11F/122D/110A; s) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; t) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; u) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; x) 13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; y) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; z) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; bb) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; e dd) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141 Q/154R/159D/17 a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de aminoácido de subtilis Sequência mostrada como SEQ ID N°: 1.

41. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 40, em que o referido polipeptídeo tem uma sequência de aminoáci- 'do de SEQ ID N°: 1 compreendendo substituições de aminoácido seleciona- • 20 das da lista consistindo em a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q 175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/ G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/ 30 Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N 114Y/R122F/K154R/N 159D/ Q175L; i) G13Y/K99Y/T104VWT110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159DZ Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/ Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110AZY113DZR122F/K154R/N159D/Q1 - 75L; I) G13Y/V811/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q1 . 75L; m) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; n) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; p) D11F/R122D/T110A/Y113A; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q1 75L; r) D11F/R122D/T110A; s) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q1 75L; u) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q1 - 20 75L; v) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q 175L; w) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; e x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q1 75L y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159DZ Q175L; z) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N 159D/Q175L; aa) G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/K154R/N1 59D/175L; bb) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N 9D/Q175L; cc) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N1 59D/Q175L; e dd) G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154 5 R/N159D/Q175L

42. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 41, em que o referido polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido, que consiste em substituições de aminoácido selecionadas da lista consistindo em: a) 13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L; b) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L; c) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; d) 13Y/110A/113D/122F/175L; e) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; f) 13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K; g) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K; - h) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L; i) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L; j) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K; k) 13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175 L; I) 13Y/811/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; m) 13Y/110A/113D/122D/164F/175L; n) 13Y/110A/113D/122D/162D/175L; o) 13Y/110A/113D/122D/175L; P) 11F/122D/110A/113A; q) 13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/17 5 L; r) 11F/122D/110A; s) 13Y/34K/110A/113D/122D/175L; t) 13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; u) 13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L; V) 13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L; w) 13Y/110A/113D/122D/162E/175L; e x) 13Y/77S/99Y/104W/11OA/113D/122F/154R/159D/175L y) 13Y/99Y/104W/11OA/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; z) 13Y/54Q/99Y/104W/11OA/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; aa) 13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141 Q/154R/159D/175L; 5 bb) 13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L; cc) 13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L; e dd) 13Y/54Q/99Y/104W/11OA/113D/114F/122F/141 Q/154R/159D/17 _ 5L, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a correspondente posição de sequência de aminoácido de subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

43. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 42, em que o referido polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 1, que consiste em substituições de aminoácido selecionadas da lista consistindo em a) G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L; b) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L; c) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L; -d) G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L; e) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; ’f) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K; g) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K; h) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L; i) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L; j) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K; k) G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; I) G13Y/V81I/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; m) G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L; l) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L; o) G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L; p) D11F/R122D/T110A/Y113A; q) G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; r) D11F/R122D/T110A; s) G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L; t) G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; u) G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L; v) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L; w) G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L; e x) G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L - y) G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L; z) G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q _ 175L; aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/17 10 5L; bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q 175L; cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q 175L; e dd)G13Y/54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N15 9D/Q175L.

44. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 43, que não é SEQ ID N°: 25.

45. Um método de identificação de um polipeptídeo de acordo 20 com qualquer uma das modalidades 1 a 44, o referido método compreendendo: (i) preparar um polipeptídeo tendo pelo menos 88% de identidade com SEQ ID N°: 1 ou tendo pelo menos 75% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID N°: 2-22, e cujo polipeptídeo 25 tem uma modificação de aminoácido na posição 110, em que a referida posição 110 é determinada como a posição que corresponde à posição 110 da sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1 por alinhamento; (ii) comparar a atividade de solubilização de farelo e/ou xilanase 30 do referido polipeptídeo com a atividade de solubilização de farelo e/ou xilanase da sequência de aminoácido selecionada entre as SEQ ID N°s: 1 a 22 com as quais tem a maior percentagem de identidade; e (iii) selecionar o polipeptídeo se ele tiver melhorado a solubilização de farelo e/ou melhorado a atividade de xilanase em comparação à sequência de aminoácido selecionada entre SEQ ID NoS: 1 a 22 com as quais tem a maior percentagem de identidade.

46. Um método de preparação de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44, o referido método compreendendo a expressão de uma sequência de nucleotídeo codificando o referido . polipeptídeo; e opcionalmente isolamento e/ou purificação do polipeptídeo após a expressão.

47. O método de acordo com a modalidade 46, em que o referi do polipeptídeo é preparado modificando ou uma sequência de aminoácido de polipeptídeo na posição 110 ou um códon que codifica um resíduo de aminoácido na posição 110 em uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido de polipeptídeo, em que a posição 110 é de- terminada com referência à sequência de xilanase de B. subtilis mostrada como SEQ ID N°: 1.

48. Uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44.

49. Um vetor compreendendo a sequência de nucleotídeo de - 20 acordo com a modalidade 48.

50. Uma célula que foi transformada com a sequência de nucleotídeo de modalidade 48 ou o vetor de modalidade 49.

51. Um organismo hospedeiro que foi transformado com a sequência de nucleotídeo de modalidade 48 ou o vetor de modalidade 49.

52. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com qualquer modalidade 45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a 30 célula de acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componente não tóxico.

53. Uma massa compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com a modalidade 45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a célula de 5 acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a modalidade 52.

54. Um produto de padaria compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo iden- 10 tificado de acordo com a modalidade 45, ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47, ou a sequência de nucleotídeo de a- cordo com a modalidade 48 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a célula de acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componente não tóxico ou uma composi- 15 ção de acordo com a modalidade 52 ou uma massa de acordo com a modalidade 53.

55. Ração animal compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de 'acordo com a modalidade 45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com - 20 as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a célula de acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a modalidade 52.

56. Uma composição de limpeza compreendendo o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com a modalidade 45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47.

57. Um método de degradação ou modificação de uma parede 30 de célula de planta cujo método compreende contatar a referida parede de célula de planta com o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com a modalidade 45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a célula de acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componen- 5 te não tóxico ou uma composição de acordo com a modalidade 52.

58. Um método de processamento de um material de planta, cujo método compreende contatar o referido material de planta com o polipep- . tídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com a modalidade 45 ou um polipeptídeo prepa- 10 rado de acordo com as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 47 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a célula de acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a modalidade 52.

59. Uso do polipeptídeo de acordo com qualquer uma das moda lidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com a modalidade -45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou o vetor de 'acordo com a modalidade 49 ou a célula de acordo com a modalidade 50 ou - 20 o organismo de acordo com a modalidade 51 misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a modalidade 52 em um método de modificação de materiais de planta.

60. Uso do polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 44 ou um polipeptídeo identificado de acordo com a modalidade 25 45 ou um polipeptídeo preparado de acordo com as modalidades 46 a 47 ou a sequência de nucleotídeo de acordo com a modalidade 48 ou o vetor de acordo com a modalidade 49 ou a célula de acordo com a modalidade 50 ou o organismo de acordo com a modalidade 51, misturado com um componente não tóxico ou uma composição de acordo com a modalidade 52 em qual- 30 quer um ou mais independentemente selecionado de: cozimento, processamento de cereais, liquefação de amido, produção de bioetanol de material celulósico, ração animal, em processamento de madeira, aperfeiçoando o alvejamento da polpa de madeira, e como uma composição de limpeza.

61. Um polipeptídeo ou fragmento do mesmo substancialmente como anteriormente descrito com referência aos exemplos e desenhos.

62. Um método substancialmente como anteriormente descrito 5 com referência aos exemplos e desenhos.

63. Uma composição substancialmente como anteriormente descrito com referência aos exemplos e desenhos.

64. Um uso substancialmente como anteriormente descrito com referência aos exemplos e desenhos.

REFERÊNCIAS

Collins,T., Gerday, C. e Feller,G. (2005) FEMS Microbiol Rev., 29 (1), 3-23. Courtin, C., Roelants, A. e Delcour, J. (1999). Fractionationreconstitution experiments provide insight into the role of endoxilanases in 15 bread-making. Journal of Agricultural e Food Chemistry. 47. 1870-1877. Coutinho, P.M. e Henrissat,B. (1999) Carbohydrate-Active En- .zymes server at URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/. D’Appolonia, B.L. e MacArthur, L.A. (1976). Comparison of bran 'e endosperm pentosans in immature e mature wheat. Cereal Chem. 53. 711 - 20 -718. Debyser, W. e Delcour, J. A. (1998). Inhibitors of cellolytic, xy- lanolytic e β-glucanolytic enzymes. WO 98/49278. Hazlewood, G. P. e Gelbert, H. J. (1993). Recombinant xilanases. PCT application. WO 93/25693. 25 Henrissat,B. (1991) Biochem. J. 280, 309-316. Ingelbrecht, J. A., Verwimp, T. e Delcour, J. A. (1999). Endoxilanases in durum wheat semolina processing: solubilisation of arabinoxylans, action of endogenous inhibitors e effects on rheological properties. J. Agri. Food Chem. 30 Jacobsen, T. S., Heldt-Hansen, H. P., Kofod, L. V., Bagger, C. e Müllertz, A. (1995). Processing plant material with xilanase. PCT application. WO 95/23514. Kormelink, F. J. M. (1992). Characterisation e mode of action of xilanases e some accessory enzymes. Ph.D. Thesis, Agricultural University Wageningen, Holland (175 pp., English e Dutch summaries). Lever, M. (1972). A new reaction for colorimetric determination of 5 carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279. McLauchlan, R., Garcia-Conesa, M. T., Williamson, G., Roza, M., Ravestein, P. e MacGregor, A. W. (1999a). A novel class of protein from .wheat which inhibits xilanases. Biochem.J. 338. 441-446. McLauchlan, R, Flatman, R et al. (1999) Poster Presentation 10 from meeting at University of Newcastle (1999) April 11th-April 17th. Xilanase inhibitors, a novel class of proteins from cereals. Montgomery, R. e Smith, F. (1955). The Carbohydrates of the Gramineae. VIII. The constitution of a water soluble hemicellulose of the endosperm of wheat (Triticum vulgare). J. Am. Chem. Soc. 77. 3325 - 3328. 15 Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. e Yaguchi, M. (1986) : A Xilanase Gene from Bacillus subtilis: Nucleotide Se- .quência e Comparison with B. pumilus Gene. Arch. Microbiol. 144, 201-206.) Rouau, X. (1993). Investigations into the effects of an enzyme ■preparation for baking on wheat flour dough pentosans. J. Cereal Science. - 20 18. 145-157. Rouau, X., El-Hayek, M-L. e Moreau, D. (1994). Effect of an enzyme preparation containing pentosanases on the bread-making quality of flour in relation to changes in pentosan properties. J. Cereal Science. 19. 259-272. 25 Slade, L., Levine, H., Craig, S., Arciszewski, H. e Saunders, S. (1993) . Enzyme treated low moisture content comestible products. US 5200215 by Nabisco. Soerensen, J.F. e Sibbesen,O. (1999). Bacterial xilanase. UK A 9828599.2.

Claims

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que apresenta atividade de xilanase e compreende uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID N°: 1 uma substituição de aminoácido na posição 110 por qualquer um resíduo de aminoácido diferente selecionado do grupo consistindo em: ácido glutâmico (E), triptofano (W), alanina (A) e cisteína (C), e uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: 11F, 12F, 122D, 113A, 13Y, 54Q, 54W, 113D, 141Q, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 154R, 159D, 175K, 811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77V, e 77Y, a(s) posição(ões) sendo determinada(s) como a(s) posição(ões) da sequência de aminoácidos de B. subtilis demonstrada como SEQ ID N°: 1; em que a variante de xilanase possui uma atividade de solubilização de farelo melhorada superior à que pode ser obtida pela utilização da xilanase de tipo selvagem correspondente de SEQ ID No. 1.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo possui uma atividade de xilanase superior em comparação com SEQ ID No. 1

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que possui uma dobra β-jelly roll.

4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a modificação de aminoácido na posição 110 é uma substituição por alanina.

5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, misturado^) com um componente não-tóxico.

6. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, misturado(a) com um componente não-tóxico, ou uma composição, como definida na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é em um método para modificar materiais vegetais.