BRPI0925344B1 - cepa de escherichia coli produtora de l-treonina e método de produção de l-treonina - Google Patents

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Ho Lee Kwang
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Abstract

cepa de escherichia coli produtora de l-treonina e método de produção de l-treonina. são descritos uma escherichia coli produtora de l-treonina em que um promotor de um gene da carboxilase do fosfoenolpiruvato (ppc) sobre o cromossomo é substituído por um promotor de um gene da sintase da cisteína (cysk) e um método de produção de l-treonina usando o mesmo. a escherichia coli recombinante pode produzir l-treonina com um alto rendimento e, deste modo, pode ser extensamente usada em indústrias médicas, farmacêuticas e de alimentação, particularmente para uma alimentação animal..

Description

1. Este Pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente coreano 10-2008-0002310, depositado em 8 de janeiro de 2008, no Escritório de Propriedade Intelectual coreano, cuja revelação é aqui incorporada em sua totalidade por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
2. Campo da Invenção
3. Uma ou mais modalidades da presente invenção relacionam-se com uma cepa de Escherichia coli (E. coli) produtora de Ltreonina com com produtividade intensificada de L-treonina em que um promotor de um gene da carboxilase do fosfoenolpiruvato (ppc) sobre o cromossomo é substituído por um promotor de um gene da sintase da cisteína (cysK) e um método de produzir L-treonina usando o mesmo.
4. Descrição da Técnica Correlata
5. A L-treonina é um aminoácido essencial e é extensamente usado como aditivo da alimentação animal ou aditivo de alimentos e também é usado como matéria-prima para a síntese de fluidos ou drogas médicas. Enquanto a proteína animal contém uma quantidade suficiente de L-treonina, a proteína vegetal é deficiente em L-treonina. Deste modo, é provável que a L-treonina seja deficiente em dietas animais principalmente vegetarianas e, deste modo, é extensamente usada em particular como aditivo para a alimentação animal.
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6. A L-treonina é principalmente produzida por um processo de fermentação usando Escherichia coli (E.coli) ou Corynebacterium, que é desenvolvida por mutagênese artificial ou recombinação genética. Para produzir a L-treonina, é usada uma cepa mutante derivada a partir de uma cepa do tipo selvagem de Escherichia coli (E.coli), Corynebacteria sp., Serratia sp., ou Providencia sp. Os exemplos da cepa mutante incluem uma cepa análoga do aminoácido ou mutante resistente a droga e um diaminopimellic ácido diaminopimélico, uma metionina, uma lisina ou uma cepa mutante auxotrófica de isoleucina que tem também um análogo de aminoácido ou resistência a droga. Entre os métodos de produzir L-treonina usando uma cepa mutante, um método de uso de um microorganismo que pertence à espécie Escherichia coli tem fenótipos auxotróficos de ácido diaminopimélico e metionina e é mutacionado de forma que a biossíntese da L-treonina não é afetada pela inibição de regeneração de treonina é revelada na Patente japonesa 10037/81.
7. Um processo de fermentação que usa uma cepa recombinante pode também ser usado na produção de L-treonina. Por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente japonesa 05-227977 revela um método de produção de L-treonina usando um E. coli recombinante em que um operon de treonina que consiste em genes que codificam a aspartoquinase, a desidrogenase da homosserina, a homosserina quinase e a sintase da treonina é introduzido numa forma de plasmídio e um método de produção de L-treonina usando Brevibacterium flavum de produção de treonina em que é introduzido um operon de treonina derivado a partir de E. coli (Turba E, et al, Agric. Biol. Chem. 53:22692271, 1989).
8. Em geral, a expressão de um gene específico num microorganismo pode ser intensificada aumentando o número de cópia do gene no microorganismo. Para isto, é usado um plasmídio que dá um número de cópias maior para um microorganismo [Sambrook et al.,
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Molecular Cloning, 2°, 1989, 1.3-1.5]. Isto é, o número do gene pode ser aumentado tanto quanto o número de cópias do plasmídio por um microorganismo único inserindo um gene alvo no plasmídio cujo número de cópia pode ser mantido num nível alto e, então, transformando o microorganismo com o plasmídio recombinante obtido. Têm sido feitas também tentativas para intensificar a produtividade da treonina usando este método e foi reportado um sucesso parcial (Patente US 5.538.873). Contudo, esta tecnologia que usa um plasmídio induz a expressão excessiva de apenas um gene específico na maioria dos casos, impondo, assim, um fardo pesado sobre um microorganismo hospedeiro. Além disso, podem ser perdidos plasmídios durante o cultivo de uma cepa recombinante, diminuindo, assim, a estabilidade do plasmídio. Para resolver estes problemas do método de produção de treonina usando uma cepa recombinante em que é introduzido um plasmídio, foram desenvolvidos a adição de um antibiótico numa cultura e métodos de uso de um plasmídio cuja expressão é controlável [Sambrook et al. Molecular Cloning, 2°, 1989, 1.5-1.6, 1.9-1.11]. No caso de usar o plasmídio cuja expressão é controlável para aliviar o fardo sobre um microorganismo hospedeiro e obter uma grande quantidade de células, durante a fase de crescimento, um microorganismo hospedeiro é propagado artificialmente sob condições em que não acontece a expressão de um gene alvo sobre o plasmídio e, depois do crescimento suficiente do microorganismo hospedeiro, é induzida a expressão temporária do gene, obtendo-se, assim, um material alvo. Todavia, os métodos que usam plasmídios cuja expressão é controlável podem ser apenas usados quando um produto de gene final for uma proteína ou um metabolito secundário. Num caso em que um produto de gene é um metabolito primário que é produzido ao mesmo tempo em que os microorganismos começam a crescer, deve ser induzida a expressão de um gene alvo durante a fase de crescimento. De outra forma, é difícil antecipar a acumulação do metabolito primário. Visto que a treonina pertence a um metabolito primário, o caso posterior é também aplicado à treonina.
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9. Deste modo, para intensificar a produtividade da treoni- na, que é um metabolito primário, é revelada a inserção de genes envolvidos na biossíntese da treonina no DNA cromossômico de um microorganismo na Patente US 5.939.307, em vez de usar um método de introduzir um plasmídio com genes relacionados com a biossíntese da treonina num microorganismo. Os métodos de aumentar os genes relacionados com a biossíntese da treonina e a expressão da mesma foram diversamente desenvolvidos, mas existe ainda uma necessidade de desenvolver um método de produção mais econômica de L-treonina com alto rendimento.
10. Para aumentar o rendimento da produção de L-treonina, tem sido intensivamente conduzida pesquisa sobre uma rota de biossíntese a partir do oxaloacetato até à treonina. Com relação a isto, pretendemos primeiro induzir o fluxo de carbono ao longo de uma rota de fosfoenolpiruvato até o oxaloacetato intensificando a atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase envolvida numa etapa exatamente antes da biossíntese da L-treonina. Para isto, estudamos e apuramos que uma cepa de microorganismo capaz de produzir L-treonina em que um promotor de um gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) sobre o cromossomo era substituído por um promotor de um gene que codifica a sintase da cisteína (cysK) para aumentar a expressão de um gene que codifica ppc, que é uma primeira enzima na biossíntese da L-treonina depois da glicólise, produzia L-treonina com alto rendimento, completando, deste modo, a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
11. Uma ou mais modalidades da presente invenção proporcionam uma cepa de Escherichia coli (E. coli) capaz de produzir Ltreonina com alto rendimento.
12. Uma ou mais modalidades da presente invenção também proporcionam um método de produzir L-treonina usando a cepa de
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E. coli, por meio do que a L-treonina pode ser produzida com eficiência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
13. As características e vantagens da presente invenção descritas acima e outras tornar-se-ão mais evidentes pela descrição em detalhe de modalidades exemplificativas da mesma com referência aos desenhos anexos em que:
14. a Figura 1 é um diagrama que ilustra um processo de construção de um vetor recombinante pUC-PcysK; e
15. a Figura 2 é um diagrama que ilustra um processo de construção de um vetor recombinante pUCpcysKmloxP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
16. A presente invenção proporciona um microorganismo produtor de L-treonina em que um promotor de um gene de fosfoenolpiruvato carboxilase natural (ppc) sobre o cromossomo é substituído por um promotor de um gene da sintase da cisteína (cysK).
17. No microorganismo produtor de L-treonina, a expressão de ppc aumenta de tal modo que um promotor de um gene de codificação de ppc, que converte o fosfoenolpiruvato produzido depois da glicólise em oxaloacetato, o material de partida da biossíntese da Ltreonina é substituído pelo promotor do gene cysK e a produtividade da L-treonina pode aumentar, em consequência.
18. O microorganismo pode incluir uma célula procariótica ou eucariótica capaz de produzir L-treonina em que um promotor de um gene ppc sobre o cromossomo é substituído por um promotor de um gene cysK. Por exemplo, o microorganismo pode ser uma cepa de microorganismo que pertence ao gênero da Escherichia, ao gênero da Erwinia, ao gênero da Serratia, ao gênero da Providencia, ao gênero da Corynebacterium ou ao gênero da Brevibacterium. Em particular, o
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6/13 microorganismo pode ser um microorganismo que pertence à família da Enterobacteriaceae e, mais particularmente, um microorganismo que pertence ao gênero da Escherichia. Mais particularmente, o microorganismo pode ser Escherichia coli CA030031 (KCCM 10910).
19. A E. coli CA030031 é derivada a partir de E. coli KCCM 10541 que é derivada a partir de uma E. coli produtora de L-treonina, KFCC 10718 (Publicação de Patente coreana 92-8395). A E. coli KFCC 10718 tem resistência a um análogo da L-metionina, um fenótipo auxotrófico da metionina, resistência a um análogo da L-treonina, um fenótipo auxotrófico da isoleucina de escape, resistência a um análogo da L-lisina e resistência ao ácido a-aminobutírico e é capaz de produzir L-treonina. Deste modo, o microorganismo pode incluir também um microorganismo mutante para produzir L-treonina, além de um microorganismo do tipo selvagem. Por exemplo, o microorganismo mutante pode ser um microorganismo que tem resistência a um análogo da Lmetionina, uma fenótipo auxotrófico da metionina, resistência a um análogo da L-treonina, um fenótipo auxotrófico da isoleucina de escape, resistência a um análogo da L-lisina e resistência ao ácido aaminobutírico e pertence à E. coli capaz de produzir L-treonina.
20. Numa modalidade, o microorganismo pode ser E. coli que tem uma fenótipo auxotrófico da metionina e resistências a um análogo da treonina, um análogo da lisina, um análogo da isoleucina e um análogo da metionina. Por exemplo, o análogo da L-metionina pode ser pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em D,L-metionina, norleucina, α-metilmetionina e L-metionina-D,Lsulfoximina, o análogo da L-treonina pode incluir pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste no ácido a-aminoβ-hidroxi valérico e D,L-treonina hidroxamato e o análogo da L-lisina pode ser pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em S-(2-aminoetil)-L-cisteína e δ-metil-L-lisina. Os exemplos do microorganismo mutante podem incluir um microorganismo em que
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7/13 um gene pckA envolvido na conversão do oxaloacetato (OAA) em fosfoenol piruvato (PEP), que é um intermediário envolvido na biossíntese da L-treonina, é inativado, um microorganismo em que um gene tyrR que reprime um gene lysC que é envolvido na conversão do oxaloacetato em aspartato é inativado ou um microorganismo em que um gene gálR que reprime a expressão de um gene gálP que é envolvido no influxo de glicose é inativado.
21. No microorganismo da presente invenção, o promotor do gene ppc sobre o cromossomo é substituído pelo promotor do gene cysK para aumentar a expressão do mesmo. O promotor do gene cysK aqui usado pode ser derivado a partir de um gene cysK com uma taxa de expressão alta e pode ter uma seqüência de nucleotídios de SEQ ID NO:
10.
22. A presente invenção também proporciona um método de produção de L-treonina, incluindo o método: cultivar um microorganismo transformado com produtividade intensificada de L-treonina em que um promotor de um gene ppc natural sobre o cromossomo é substituído por um promotor de um gene cysK; e isolar a L-treonina a partir da cultura do microorganismo.
23. No método de produção de L-treonina, o microorganismo transformado pode ser E. coli, por exemplo, E. coli CA030031 (KCCM 10910).
24. Uma ou mais modalidades da presente invenção serão, agora, descritas mais completamente com referência aos exemplos seguintes. Todavia, estes exemplos são proporcionados apenas com propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o escopo da presente invenção.
Exemplo 1:
Construção do vetor recombinante pUCpcysKmloxP
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8/13 (1) Preparação do fragmento Pcysk
25. Para obter um fragmento de DNA de 0,3 kb contendo um promotor de um gene cysK (SEQ ID NO: 10), foi extraído o DNA genômico (gDNA) de W3110, que é uma cepa de E. coli do tipo selvagem, usando um sistema QIAGEN Genomic-tip e foi realizada uma reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o gDNA como gabarito e um kit PCR HL premix (fabricado por BIONEER, Coréia). Para amplificar o promotor do gene cysK, foi realizado PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 1 e 2 como se segue: 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelando a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 2,5 minutos.
26. Os produtos de PCR foram digeridos com Kpnl e EcoRV, eletroforezados sobre um gel de agarose a 0,8% e então eluídos, para obter um fragmento de DNA de 0,3 kb (em seguida, chamado de “fragmento de PcysK”).
a. Construção do vetor recombinante pUC-PcysK
27. A Figura 1 é um diagrama que ilustra um processo de construção do vetor recombinante pUC-PcysK contendo um promotor de um gene cysK.
28. O plasmídio pUC19 (New England Biolabs, EUA) e o fragmento de PcysK obtido de acordo com o Exemplo 1-(1) foram, cada um, digeridos com enzimas de restrição Kpnl e Smal e ligados um com o outro para construir o vetor pUC-PcysK.
b. Construção do vetor recombinante pUCpcysKmloxP
29. A Figura 2 é um diagrama que ilustra um processo de construção de um vetor recombinante pUCpcysKmloxP.
30. Em geral, numa experiência de deleção de genes causada por inativação de uma etapa, sempre que um gene é deletado, uma
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9/13 seqüência de um sítio de reconhecimento da recombinase loxP permanece sobre um DNA cromossômico. Foi reportado que, devido às seqüências de loxP que permanecem sobre o DNA cromossômico, quando as cepa são adicionalmente modificadas para desenvolvimento adicional, a eficiência pode ser significativamente diminuída (Nagy A., Genesis, 26:99, 2000). Um método melhorado de deleção de genes usando mutantes loxP, que são chamados de 1οχ71 e lox 66 foi proposto por Suzuki (Appl. Environ. Microbiol. 71:8472, 2005). Deste modo, para substituir mais eficientemente um promotor de um gene ppc sobre o cromossomo por um promotor de um gene cysK usando os mutantes loxP, construímos o vetor pUCpcysKmloxP tendo tanto um cassete mutante loxP-CmR-loxP como o promotor do gene cysK.
31. Como mostrado na Figura 2, a PCR foi realizada usando o plasmídio pACYC184 (New England Biolab) como gabarito usando iniciadores de SEQ ID NOS: 3 e 4 como se segue: 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C por 1 minuto para obter 1,1 kb de fragmento de PCR. O vetor pUC-PcysK construído de acordo com o Exemplo l-(2) e o 1,1 kb de fragmento de DNA obtido usando pACYA184 como gabarito foram, cada um, digeridos com enzimas de restrição Ndel/Kpnl, ligados um ao outro e transformados em E. coli. Então, foram selecionadas células tendo DNA ligados com precisão ao vetor usando um método geral e o plasmídio pUCpcysKmloxP foi purificado a partir da cultura das células.
Exemplo 2:
Preparação de E. coli KCCM de 10541 pcyks-ppc recombinante
32. Para substituir um promotor nativo de um gene ppc (SEQ ID NO: 9) que codifica a fosfoenolpiruvato carboxilase sobre o
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10/13 cromossomo por um promotor de um gene cysK, foi realizado um método de inativação conhecido (Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000) sobre E. coli KCCM 10541.
33. Primeiro, foi realizada PCR usando o plasmídio pUCpcysKmloxP construído de acordo com o Exemplo 1 como gabarito usando iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 8 como se segue: 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 1 minuto para obter fragmentos de DNA e os fragmentos de DNA obtidos foram purificados usando um kit de QIAGEN (kit de PCR Purification). Subseqüentemente, foi realizada mais PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7 e os fragmentos de DNA purificados como gabarito, como se segue: 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 1 minuto. Os fragmentos de DNA resultante foram purificados, os fragmentos de DNA purificados foram introduzidos por eletroporação em E. coli KCCM 10541 em que o vetor pKD46 foi introduzido (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 97(12), 6640-6645(2000)) e uma colônia única foi selecionada sobre uma placa Luria-Bertani (LB) contendo 15 pg/mL de cloranfenicol. A cepa selecionada era uma cepa em que o fragmento de DNA foi inserido num sítio promotor de um gene ppc. O vetor pJW168 (BMG Biothechnol. 2001; 1:7. 26 de setembro de 2001) foi introduzido na cepa selecionada para preparar E. coli KCCM 10541-PcyK-ppc recombinante em que o promotor naive do gene ppc foi substituído pelo promotor do gene cysK, por remoção do gene de resistência a antibióticos.
Exemplo 3:
Comparação quanto à produtividade de L-treonina entre microorganismos recombinantes
34. O microorganismo recombinante preparado de acordo
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11/13 com o Exemplo 2 foi cultivado num meio de título de treonina, como mostrado na Tabela 1 abaixo, num frasco de Erlenmeyer, e foi confirmado se a produtividade de L-treonina foi melhorada.
Tabela 1
Composição Concentração (por litro)
Glicose 70 g
KH2SO4 2g
(NH4)2SO4 25 g
MgSO4-7H2O ig
FeSO4-7H2O 5 mg
MnSO4-4H2O 5 mg
DL-metionina 0,15 g
Extrato de levedura 2g
Carbonato de cálcio 30 g
pH 6,8
35. 1 alça de platina de E. coli KCCM 10541 e E. coli KCCM 10541 pcysks-ppc que foram cultivadas num meio sólido LB numa incubadora a 33°C durante a noite foram, cada uma, inoculadas em 25 ml de meio de título, como mostrado na Tabela 1, e cultivadas na incubadora a 33°C a 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo.
36. Como mostrado na Tabela 2, quando a cepa mãe E. coli KCCM 10541 foi cultivada durante 48 horas, produziu 29,8 g/L de LPetição 870180129795, de 13/09/2018, pág. 22/28
12/13 treonina, enquanto a E. coli KCCM 10541 pcysks-ppc do Exemplo 2 produziu 34,7 g/L de L-treonina, que tem uma produtividade 4,9 g/L mais alta do que aquela da cepa mãe. Deste modo, foi confirmado que a cepa recombinante em que o promotor do gene ppc foi substituído pelo promotor do gene cysK tem produtividade intensificada de Ltreonina. A E. coli KCCM 10541 pcysks-ppc transformada foi chamada de E. coli CA030031 e depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 20 de dezembro de 2007 (Acesso No: KCCM 10910).
Tabela 2
Cepa L-treonina (g/L)
KCCM 10541 (cepa mãe) 29,8
KCCM 10541-PcysK-ppc 34,7
37. Como descrito acima, de acordo com a presente invenção, num microorganismo em que um promotor de um gene ppc sobre o cromossomo é substituído por um promotor de um gene cysK, a expressão do gene ppc, que é uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em oxaloacetato que é um precursor da biossíntese da L-treonina, aumenta, intensificando, assim, significativamente a produtividade de Ltreonina em 16% ou mais. O microorganismo pode produzir L-treonina com alto rendimento e, deste modo, pode ser largamente usada nas indústrias médicas, farmacêuticas e de alimentação, particularmente para a alimentação animal.
38. Embora a presente invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a modalidades exemplificativas da mesma, ficará entendido por aqueles de capacidade ordinária na técnica que podem ser nela feitas várias mudanças na forma e nos detalhes
Petição 870180129795, de 13/09/2018, pág. 23/28
13/13 sem sair do espírito e do escopo da presente invenção, conforme definida pelas Reivindicações seguintes.

Claims (3)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Cepa de Escherichia coli Produtora de L-Treonina, caracterizada por que um promotor de um gene da carboxilase fosfoenolpiruvato (ppc) sobre o cromossomo é substituído com um promotor de um gene da sintase da cisteína (cysK), em que o promotor do gene cysK possui uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 10.
  2. 2. Cepa de Escherichia coli Produtora de L-Treonina, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por ser Escherichia coli CA030031 de número de acesso KCCM 10910.
  3. 3. Método de Produção de L-Treonina, caracterizado por que compreende: cultivar a cepa Escherichia coli de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 e 2; e isolar a L-treonina a partir da cultura da cepa de Escherichia coli.
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