BRPI1002067A2 - Formulação leishmanicida e seu uso - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO LEISHMANICIDA E SEU USO. A presente invenção refere-se o desenvolvimento de formulações farmacêuticas obtidas a partir extrato de Agaricus biaze e suas frações purificadas para o tratamento da leishmaniose. Mais particularmente, a presente invenção descreve formulações preferencialmente de uso tópico e oral, sob as formas farmacêuticas sólidas, semi-sólidas e líquidas selecionadas do grupo compreendendo gel, creme, pomada, pastas, emulsões em geral, soluções, comprimidos e cápsulas.

Description

FORMULAÇÃO LEISHMANICIDA E SEU USO A presente invenção refere-se o desenvolvimento de formulações farmacêuticas obtidas a partir extrato de Agarícus blaze e suas frações purificadas para o tratamento da leishmaniose. Mais particularmente, a presente invenção descreve formulações preferencialmente de uso tópico e oral, sob as formas farmacêuticas sólidas, semi-sólidas e líquidas selecionadas do grupo compreendendo gel, creme, pomada, pastas, emulsões em geral, soluções, comprimidos e cápsulas.

Agarícus blazei (A. blazei) é um fungo aeróbio que tem o potencial de degradar matéria orgânica rica em celulose, hemicelulose e lignina para a obtenção de energia. Esse cogumelo foi reclassificado por Wasser para Agarícus brasilienses, porém, a denominação de Agarícus blazei tem sido a mais usada na literatura científica devido aos aspectos biotecnológicos e medicinais do cogumelo, assim como na maioria dos seus produtos comercializados [WASSER, S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 60, p. 258-74, 2002); AMAZONAS, M.A.L.A. Agarícus brasiliensis (= Agarícus blazei ss. Heinem.): última visão sobre a polêmica questão da identidade taxonômica de um dos cogumelos mais promissores no mercado mundial. In: Simpósio internacional sobre cogumelos no Brasil, Brasília, DF. p. 78-80, 2004], O seu valor nutricional e medicinal, aliado a características peculiares como seu sabor, fragrância de amêndoas e excelente textura, o tornam particularmente adequado a inúmeras aplicações culinárias, sendo um dos cogumelos cultivados mais valorizados no mercado mundial (STIJVE, T, AMAZONAS, M.A.L., GILLER, V. Flavor and taste components of Agarícus blazei ss. Heinenm: a new gourmet and medicinal mushroom. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, Stuttgart, v. 98, p. 448-453, 2002).

Dentre os vários benefícios de A. blazei para o organismo humano estão o controle da diabetes do tipo II, da hipertensão arterial e da osteoporose, recaptação de cálcio por meio do ergosterol, tratamento do câncer e da AIDS. Algumas destas propriedades estão relacionadas às substâncias presentes no composto alimentar do A. blazei, tais como o óete-D-glucano, cerebrosídeos, esteróides, ergosterol e ácidos graxos (MIZUNO, M., MORIMOTO, Μ. MINATO, K., TSUCHIDA, H. Polysaccharides from Agarícus blazei stimulate lymphocyte T-cell subsets in mice. Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 62, p. 434-437, 1998.Mizuno et al., 1998) (Mizuno, 2002). Sua atividade mais destacada ocorre ao nível do sistema imunológico, protegendo contra infecções e ajudando a eliminar células malignas (URBEN, A.F. Caracterização morfológica e fisiológica de acessos de Agarícus blazei e A. sylvaticus. In: V Congresso latino americano de micologia, Brasília, p. 203-205, 2005). O principal mecanismo de ação de A. blazei parece estar relacionado com a atividade biológica de polissacarídeos, principalmente o chamado (1—>6)-(1-^3)-P-D-glucano, encontrado no corpo de frutificação. Em países como Japão, Rússia, China e Estados Unidos, diferentes polissacarídeos com atividades antitumorais foram extraídos do corpo de frutificação e micélio de várias espécies de cogumelos medicinais. A maioria destes polissacarídeos não atua sobre as células tumorais diretamente, porém produz efeitos antitumorais indiretos devido à ativação de diferentes vias da resposta imunológica do hospedeiro. A ação imunomoduladora dos cogumelos se deve principalmente ao aumento da estimulação e ativação de macrófagos, células que apresentam papel essencial na imunidade específica em mamíferos (WASSER, S.P. & WEIS, A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: Current perspectives (review). Int. J. Med., v. 1, p. 31-62, 1999). A atividade imunoestimulatória de A. blazei já foi bem caracterizada por diversos grupos de pesquisa (MIZUNO, T. & HAGIWARA, T. Antitumor activity and some properties of water-soluble polysaccharides from “Himematsutake”, the fruiting body of Agarícus blazei Murrill. Agricult Biologic Chemist, Tokyo, v. 54, p. 2889-2896, 1990a; MIZUNO, T„ INAGAKI, R„ KANAO, R. Antitumor activity and some properties of water-insoluble hetero-glycans from “Himematsutake”, the fruiting body of Agarícus blazei Mu rill. Agric. Biol. Chem., 54, 2897-2905, 1990b; EBINA, T. & FUJIMIYA, Y. Antitumor effect of a peptide-glucan preparation extracted from Agarícus blazei in a double-grafted tumor system in mice. Biotherapy, v. 11, p. 259-65, 1998; KUO, Y.C., HUANG, Y.L., CHEN, C.C. Cell cycle progression and cytokine gene expression of human peripheral blood mononuclear cells modulated by Agaricus blazei. J. Lab. Clin. Med., v. 140, p. 176-87, 2002). Estudos utilizando frações solúveis em água a 100°C indicaram sua ação inibitória sobre o crescimento de tumores sólidos e de células tumorais, além da redução do aparecimento de metástases. Mais especificamente, as frações estudadas levaram a um aumento significativo na proliferação de linfócitos T e B in vitro e ao aumento da atividade das células NK (DONG Q, YAO J, YANG XT, FANG JN. Structural characterization of a water-soluble beta-D-glucan from fruiting bodies of Agaricus blazei Murr. Carbohydr Res., v. 3, p.1417-21, 2002; FUJIMIYA Y; SUZUKI Y; OSHIMAN K.; Selective tumoricidal effect of soluble proteoglucan extracted from the basidiomycete, Agaricus blazei Murill, mediated via natural killer cell activation and apoptosis. Cancer Immunol Immunother., v. 46, p. 147-59, 1998). Ainda, estudos in vivo demonstraram a ação imunoestimulatória dessas frações sobre linfócitos T, indução do aumento da expressão de citocinas e interleucinas (tais como a IL-6 e IL-1 β), da diferenciação de células B, da produção de anticorpos e da expressão dos receptores CR3 (Mac-1), B7-1 e CD25 (marcadores de superfície celular que reconhecem células tumorais e patógenos) (NAKAJIMA, A., ISHIDA, T., KOGA M. Effect of hot water extract from Agaricus blazei Murill on antibody-producing cells in mice. Int Immunopharmacol., v. 2, p. 1205-11, 2002). Outros estudos demonstraram a inibição de células tumorais através da ativação imunológica, dependente da via alternativa do complemento, pelo A. blazei e a formação de um complexo opsonizante entre A. blazei e C3bi no soro humano (SHIMIZU, S., KITADA, H., YOKOTA, H. Activation of the alternative complement pathway by Agaricus blazei murill. Phytomedic., v. 9, p. 536-45, 2002).

Sorimachi e colaboradores (2001) observaram que componentes de A. blazei são capazes de ativar macrófagos, resultando em um aumento na produção de citocinas tais como TNF-α, IL-8 e NO. Já um extrato aquoso de A. blazei aumentou a expressão de mRNA de IL-1 β e IL-6, tanto em macrófagos peritoneais quanto nas células esplênicas estimuladas de camundongos (SORIMACHI, K., AKIMOTO, K., IKEHARA, Y. Secretion of TNF-α, II-8 and nitric oxide by macrophages activated with Agaricus blazei murrill fractions in vitro. Cell Struct. Func., v. 26, p. 103-108, 2001; NAKAJIMA, A., ISHIDA, T, KOGA M. Effect of hot water extract from Agaricus blazei Murill on antibody-producing cells in mice. Int Immunopharmacol., v. 2, p. 1205-11, 2002). Diferentes frações extraídas do extrato aquoso de A. blazei, originário da cultura de micélio e do corpo de frutificação, induziram a secreção de citocinas, tais como IL-8 e TNF-α, pelos macrófagos da medula óssea de ratos e o aumento na secreção de óxido nítrico (NO) in vitro (Sorimachi e col, 2001). A estimulação das células NK, a geração de células citotóxicas seletivas e a indução de apoptose nas células tumorais in vitro pelo extrato de proteoglicanas extraídas do A. blazei também foram demonstradas (FUJIMIYA Y; SUZUKI Y; OSHIMAN K.; Selective tumoricidal effect of soluble proteoglucan extracted from the basidiomycete, Agaricus blazei Murill, mediated via natural killer cell activation and apoptosis. Cancer Immunol Immunother., v. 46, p. 147-59, 1998). Além da sua atividade antitumoral, estudos têm demonstrado que polissacarídeos de cogumelos têm propriedades antimicrobianas, antivirais, hepatoprotetor, antifibrótico, hipoglicêmico e hipocolesterolêmico (SAKAGAMI, Η., AOKI, T., SIMPSON, A. Induction of immunopotentiation activity by a protein-bound polysaccharide, PSK (Review). Anticancer Res., v. 11, p. 993-1000, 1991; SORIMACHI, K., NIWA, A., YAMAZAKI, S. Antiviral activity of water-solubilized lignin derivatives in vitro. Agric. Biol. Chem., v. 54, p. 1337-1339, 1990; OOI, V.E.C. Hepatoprotective effect of some mushrooms. Phytother. Res. West Sussex, v. 10, p. 536-538, 1996; PARK, E.J., KO, G., KIM, J. Antifibrotic effects of a polysaccharide extracted from Ganoderma lucidum, glyclyrrhizin, and pentoxifyline in rats with cirrhosis induced in biliary obstruction. Biol. Pharm. Bull., v. 20, p. 417-420, 1997; HIKINO, H. & MIZUNO, T. Hypoglycemic actions of some heteroglycans of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta Med., v. 55, p. 385, 1989; CHEUNG, P.C.K. The hypocholesterolemic effect of extracellular polysaccharide from the submerged fermentation of mushroom. Nutr. Res., v. 16, p. 1953-1957, 1996). A presente invenção descreve o emprego do extrato de A. blazei e de frações purificadas, a partir deste, no tratamento de leishmanioses.

As leishmanioses são doenças causadas por parasitas protozoários pertencentes ao gênero Leishmania, que podem causar desde lesões cutâneas únicas, de cura espontânea, até a forma visceral, fatal, se não tratada (DESJEUX, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., v. 27, p. 305-318, 2004). O parasita Leishmania apresenta duas formas evolutivas: a promastigota e amastigota. As formas promastigotas são formas alongadas, flageladas, móveis, com núcleo único, cinetoplasto localizado entre a porção anterior e o núcleo e que se multiplicam no trato digestivo do inseto vetor. As formas amastigotas são formas arredondadas, sem flagelo aparente, com cinetoplasto em forma de bastão, e que se multiplicam nas células do sistema fagocítico-monocitário do hospedeiro mamífero (Grimaldi, G.Jr. & Tesh, R.B. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev., v. 6, p. 230-250, 1993).

Diferentes espécies de mamíferos, dentre os quais roedores e canídeos, são reservatórios naturais do parasita e servem como fonte de infecção para o vetor. O cão pode ser apontado como o principal reservatório doméstico para a leishmaniose visceral. Raposas e lobos são reservatórios silvestres da leishmaniose visceral, enquanto marsupiais e roedores podem ser reservatórios de espécies que causam a leishmaniose tegumentar. Os vetores são flebotomíneos, fêmeas (Díptera: Psicodidae), pertencentes ao gênero Lutzomya nas Américas e Phlebotomus em países do Velho Mundo (SACKS, D. & KAMHAWI, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annu. Rev. Microbiol., v. 55, p. 453-483, 2001). A infecção pelo vetor ocorre no momento em que a fêmea se alimenta de um hospedeiro infectado quando, juntamente com o sangue, macrófagos contendo formas amastigotas são ingeridos. Ocorre então a liberação das amastigotas no tubo digestivo do vetor que, rapidamente, passam por mudanças bioquímicas e morfológicas e evoluem para a forma promastigota procíclica e, então, à promastigota metacíclica. O hospedeiro mamífero é infectado quando é picado por um vetor contaminado; quando o mesmo injeta as formas promastigotas metacíclicas de Leishmania na pele do hospedeiro.

Essas formas são opsonizadas por proteínas do sistema do complemento ou anticorpos e fagocitadas por macrófagos, formando os fagolisossomos, que se transformam em amastigotas. Após sucessivas replicações das amastigotas, por divisão binária, essas causam a lise dos macrófagos com consequente liberação das mesmas. As amastigotas podem ser fagocitadas por novos macrófagos, finalizando o ciclo de infecção no hospedeiro mamífero, ou podem ser ingeridas por outro vetor, completando, assim, o ciclo biológico do parasita (Grimaldi, G.Jr. & Tesh, R.B. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev., v. 6, p. 230-250, 1993; Sacks, D. & Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat. Immunol., v. 3, p. 1041-1047, 2002.) Diversas espécies de Leishmania já foram descritas, podendo ser apontadas como causadoras de diferentes formas clínicas da doença. A leishmaniose tegumentar caracteriza-se por uma diversidade de manifestações clínicas e de espécies causadoras da doença. No Brasil, ela pode ocorrer devido à infecção por Leishmania braziliensis, L. guyanensis, L. amazonensis, L. shawi, L. laisoni e L. naiffi podendo, clinicamente, apresentar-se de forma localizada ou disseminada. A forma cutânea da leishmaniose tegumentar caracteriza-se pela existência de uma lesão única com bordas elevadas, de fundo granuloso e indolor. Lesões vegetantes, verrucosas ou infiltrativas são menos frequentes (MARZOCHI, M.C., MARZOCHI, K.B., CARVALHO, R.W. Visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro. Parasitol. Today, v. 10, p. 34-37, 1994; DESJEUX, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., v. 27, p. 305-318, 2004; Silveira FT, Lainson R, Corbett CE. Clinical and immunopathological spectrum of American cutaneous leishmaniasis with special reference to the disease in Amazonian Brazil: a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. V. 99, p. 239-251, 2004. ). Existem ainda casos de leishmaniose mucocutânea, que ocorrem em diversos países e são causados pelas espécies L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis e L. amazonensis. Na forma mucosa, as lesões apresentam caráter infiltrativo que podem ulcerar e sangrar. A forma cutâneo-difusa ocorre devido à infecção pela espécie L. aethiopica, existente na África ou pelas espécies L. amazonensis e L. mexicana em países da América do Sul. É uma forma em que as lesões podem apresentar-se como placas, nódulos, às vezes vegetantes, mas que raramente ulceram. As lesões disseminam-se em regiões expostas do corpo e tal quadro pode estar associado à ineficiência ou ausência de resposta imune celular (WEIGLE, K. & SARAVIA, N.G. Natural history, clinical evolution, and the host-parasite interaction in New World cutaneous leishmaniasis. Clin. Dermatol., v. 14, p. 433-450, 1996.; Desjeux, 2004).

Dados da Organização Mundial de Saúde indicam haver incidência dessa doença em cerca de 88 países, dos quais 72 são países em desenvolvimento. A incidência anual estimada é de cerca de 1.0 a 1.5 milhões de novos casos de leishmaniose tegumentar e cerca de 500 mil casos de leishmaniose visceral. Cerca de 350 milhões de pessoas estão em áreas de risco para infecção e estima-se o aumento do número de casos em todo o mundo nos próximos anos (SHAW, J. The leishmaniasis-survival and expansion in a changing world. A mini-review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 102, p. 541-7, 2007).

Outro aspecto que tem apresentado importância clínica e epidemiológica é a co-infecção entre o vírus HIV e Leishmania. As leishmanioses podem modificar a progressão da doença pelo HIV e a imunossupressão causada pelo vírus, de forma similar, pode facilitar a progressão da doença. A co-infecção é considerada doença emergente de alta gravidade em diversos países no mundo e calcula-se um crescimento contínuo devido à co-existência das duas infecções, como consequência da urbanização da leishmaniose e da interiorização da infecção pelo HIV. O tratamento clínico das leishmanioses deve ser realizado para se evitar a mortalidade causada pela doença visceral e reduzir a morbidade provocada pelas lesões desfigurantes nas formas mais severas de leishmaniose tegumentar. Normalmente o tratamento consiste na aplicação local ou sistêmica de compostos antimoniais pentava lentes, dos quais o estibogluconato de sódio (Pentostam®, Glaxo Wellcome, Inglaterra) e o N-metil antimoniato de meglumina (Glucantime®, Rhone Poulenc Rorer, França) são os mais utilizados (CARVALHO, P.B.; ARRIBAS, M.A.G.; FERREIRA, E.l.

Leishmaniasis. What do we know about its chemotherapy? Braz. J. Pharmac. Sci., v. 36, p. 69-96, 2000. FRANKE, E.D.; WIGNALL, F.S.; CRUZ, M.E.; ROSALEZ, E.; TOVAR, A.A.; LUCAS, C.M.; LIANOS-CUENTAS, A.; BERMAN, J.D. Efficacy and toxicity of sodium stibogluconate for mucosal leishmaniasis. Ann. Intern. Med., v. 113, p. 934-940, 1990. HERWALDT, B.L. Leishmaniasis. Lancet, v. 354, p. 1191-1199, 1999).

No Brasil, o Glucantime® tem sido utilizado como fármaco de escolha. Entretanto, tal fármaco pode interagir com sulfidrilas de proteínas celulares do hospedeiro mamífero causando perda de função e/ou formando complexos com ribonucleosídeos, o que torna a ação do produto inespecífica em relação a células infectadas e àquelas não-infectadas. Fármacos de segunda linha, como a anfotericina B, têm sido recomendados nos casos de intolerância ou resistência ao tratamento convencional, devendo ser administrados exclusivamente em ambiente hospitalar (SUNDAR, S., SINGH, A., AGARWAL, D., RAI, M„ AGARWAL, N„ CHAKRAVARTY, J. Safety and efficacy of high-dose infusions of a preformed amphotericin B fat emulsion for treatment of Indian visceral leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 80, p. 700-3, 2009). O tratamento com antimoniais pentavalentes possui diversas limitações que reduzem a adesão do paciente ao mesmo, dentre elas a longa duração do tratamento (20 a 40 dias, com aplicações diárias dos produtos), as vias de aplicação dos fármacos (intramuscular ou endovenosa) e os efeitos colaterais graves provocados pelo uso dos fármacos. Altas doses diárias, necessárias no curso do tratamento, podem causar fadiga, artralgias, mialgias além de toxicidade renal (insuficiência renal crônica), hepática (cirroses) e cardíaca (arritmias). Pode-se citar ainda a dificuldade de transporte dos pacientes, que normalmente residem em áreas rurais, até os centros mais especializados de saúde, além do custo elevado dos fármacos (CARVALHO, P.B.; ARRIBAS, M.A.G.; FERREIRA, E.l. Leishmaniasis. What do we know about its chemotherapy? Braz. J. Pharmac. Sci., v. 36, p. 69-96, 2000. GROGL, M.; MARTIN, R.K.; ODUOLA, A.M.J.; MILHOUS, W.K.; KYLE, D.E. Characteristics of multidrug resistance in Plasmodium and Leishmania: detection of P-glycoprotein-like components. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 45, p. 98-111, 1991. TAVARES CA, FERNANDES AP, MELO MN. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Expert Rev Mol Diagn. v. 3, p. 657-667, 2003). Tais aspectos dificultam a adesão dos pacientes ao tratamento, sendo comum o abandono ou a interrupção do mesmo, o que leva ao aumento da resistência do parasita aos fármacos utilizados.

Cunninghan (.) relatou que cerca de 10 a 25% dos pacientes com leishmaniose visceral, tratados com antimoniais pentavalentes, apresentaram resistência ao tratamento ou casos de recidiva. Sundar (2001) também relatou que uma porcentagem significativa de pacientes com a doença visceral causada por L. donovani apresentaram resistência ao tratamento com o Pentostam®(CUNNINGHAM, A.C. Parasitic adaptive mechanisms in infection by Leishmania. Exp. Mol. Pathol., v. 72, p. 131-141, 2002. Para estes casos, a pentamidina e anfotericina B podem ser utilizadas, apesar da toxicidade elevada e do alto custo desses fármacos (Grimaldi & Tesh, 1993).

Pelo diversos fatos expostos no item anterior, relacionados à dificuldade atual no tratamento correto das leishmanioses, há necessidade de novas pesquisas voltadas para a descoberta de uma melhor forma de tratamento das leishmanioses. Há necessidade da identificação de compostos/produtos/fármacos menos tóxicos aos pacientes, haja vista que os antimoniais pentavalentes, comumente utilizados, são considerados de elevada toxicidade orgânica e cardiopulmonar nas dosagens normalmente administradas. Ainda, os produtos devem ser economicamente mais viáveis, fato que não é observado nos fármacos atualmente utilizados; a via de administração dos produtos deve ser melhorada a fim de provocar o menor desconforto possível aos pacientes, pois o tratamento atual utiliza as vias intramuscular e/ou endovenosa bem como a aplicação diária dos fármacos.

Dessa forma, um novo produto que seja economicamente mais viável, que não cause efeitos colaterais e/ou tóxicos nos pacientes tratados e que apresente uma via de administração menos invasiva torna-se altamente desejável. A utilização de extrato aquoso do fungo Agaricus blazei e/ou suas frações purificadas e formulações contendo estes, propõe minimizar e solucionar tais problemas.

Quando se trabalha com extrato e o objetivo é incorporá-lo à uma formulação, o primeiro passo é colocá-lo em uma formulação compatível com seus constituintes, que mantenha uma boa estabilidade e auxilie na sua ação.

Além disso, existem alguns trabalhos na literatura relacionando a não-toxicidade do fungo quando utilizado em pacientes humanos, seja por via oral ou tópica e não há constatado nenhum efeito colateral ou tóxico relatado nos indivíduos. Assim, a administração do extrato do fungo e suas frações por via tópica (para leishmaniose cutânea) não é considerada invasiva e, com certeza, será muito menos desconfortável ao paciente quando comparada às vias normalmente utilizadas com os antimoniais, no caso, a intramuscular e endovenosa. Além disso, formulações farmacêuticas na forma sólida e ou líquida também serão desenvolvidas para a administração oral no caso do tratamento da leishmaniose visceral.

Além de todas estas vantagens temos ainda o fato do fungo ser abundante em nossa flora.

Breve Descrição da Figuras Figura 1: Eletroforese em gel de poliacrilamida na concentração de 12% das frações protéicas do extrato aquoso do fungo Agaricus blazei sobre as formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de L. amazonensis, L chagasi e L. major. As frações protéicas são indicadas como: F1: < 3.0 kDa; F2: entre 3.0 e 10.0 kDa; F3: entre 10 e 50 kDa; F4: entre 50 e 100 kDa e F5: acima de 100 kDa.

Figura 2: Atividade leishmanicida do extrato aquoso do fungo Agaricus blazeie de suas 5 frações protéicas purificadas sobre as formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de L. amazonensis, L. chagasi e L. major. Como controle, a anfotericina B (Anfot. B) foi utilizada também na concentração de 50 μg/mL. As barras indicam a média e desvio-padrão dos grupos experimentais. O gráfico é representativo de três experimentos que apresentaram resultados similares.

Descrição Detalhada da Tecnologia A presente invenção caracteriza-se pelo uso do extrato de Agarícus blazei e suas frações derivadas, combinados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis no tratamento da Leishmaniose. Mais particularmente, a presente invenção descreve composições preferencialmente de uso tópico e oral, sob as formas farmacêuticas sólidas, semi-sólidas e líquidas selecionadas do grupo compreendendo gel, creme, pomada, pastas, emulsões em geral e soluções, comprimidos e cápsulas.

Essas composições podem ser administradas pelas vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados; sendo preferencialmente administradas por via tópica. A tecnologia aqui proposta poderá ser mais bem compreendida através dos seguintes exemplos, não limitantes: Exemplo 1 - Cultura dos Parasitas As cepas IFLA/BR/1967/PH-8 de L. amazonensis, MHOM/BR/1970/BH46 de L. chagasi e MHOM/IL/1980/Friedlin de L. major foram utilizadas neste trabalho.

Os parasitas foram cultivados em meio de cultura de Schneider’s completo, o qual é constituído pelo meio de Schneider’s (Sigma) acrescido com 20% de soro fetal bovino (Sigma) inativado, 20 mM de L-glutamina, 50 pg/mL de gentamicina, 200 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, em pH 7.4. Os parasitas permaneceram em cultivo a 24°C, sendo que repiques das culturas foram efetuados para a manutenção das cepas e obtenção das formas promastigotas em fase estacionária de crescimento.

Exemplo 2 - Preparo do extrato aquoso e alcoólico do fungo Agarícus blazei Para o preparo dos extratos nas formas aquosa e alcoólica do fungo Agarícus blazei, cerca de 1 (um) grama do fungo é pesado e triturado em 1 mL de tampão Tris-HCI 10 mM, pH 7.0. Após 1 h de incubação a 4°C, o extrato foi centrifugado a 6.280 G (centrífuga SORVAL LC5C) por 1 h 30 minutos e o sobrenadante foi recuperado e sua concentração estimada pelo método de Bradford (Bradford, 1976). No preparo do extrato alcoólico, o fungo foi tratado com álcool etílico e álcool isopropílico para a obtenção do extrato, em condições similares ao descrito no preparo do extrato aquoso.

Exemplo 2.1 - Preparação de frações protéicas obtidas do extrato aquoso do fungo Agaricus blazei.

Para a preparação e extração das frações protéicas a partir do extrato aquoso do fungo Agaricus blazei, aproximadamente 28 gramas do cogumelo (sendo usado o corpo de frutificação), fresco e limpo, foi adicionado em 50 mL de água milli-Q e 50 μί. de coquetel de inibidor de protease (SIGMA, código P8340), sendo então macerado em banho de gelo, com auxílio de graal e pistilo. Posteriormente, o conteúdo permaneceu em repouso a 4°C por 1 hora e foi filtrado em papel filtro para a retirada do material não solubilizado. O material foi centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos e a 4°C, e o sobrenadante foi coletado e novamente centrifugado em uma coluna com Amicon de 100.000 Dáltons (Da) na velocidade de 6.000 rpm por 45 minutos e a 4°C. Após, o material retido no filtro foi retirado e o restante do mesmo foi transferido para um novo Amicon de 50.000 Da e centrifugado 6.000 rpm por 30 minutos e a 4°C. O material retido foi recolhido e o restante foi passado para um novo tubo Amicon de 10.000 Da. As amostras foram centrifugadas a 6.000 rpm por 30 minutos a 4°C e o material retido foi retirado, sendo o restante aplicado em Amicon de 3.000 Da. O mesmo procedimento de centrifugação foi repetido e o material retido na membrana para 3.000 Da foi retirado, sendo o restante do material liofilizado.

Após isso, as amostras foram dosadas pelo método de Lowry e utilizadas nos ensaios biológicos (Tabela 1).

Tabela 1: Purificação das frações protéicas do extrato aquoso do fungo Agaricus blazei por coluna de Amicon. As frações protéicas foram separadas por gradiente de centrifugação e quantificadas pelo método de Lowry.

Exemplo 3 - Purificação das frações protéicas do extrato aquoso do fungo Agaricus blazei Para a purificação das frações protéicas do fungo, cerca de 500 mg do fungo foram pesadas e triturados em 1 mL de água deionizada pH 7.0. Após a centrifugação a 9.280 G (centrífuga SORVAL LC5C) a 4°C, aproximadamente 100 pL do sobrenadante das amostras foi aplicado em sistema de HPLC (modelo Thermo®). As amostras foram eluídas utilizando-se uma coluna C18 como fase fixa e o ácido trifluoracético (TFA) a 0.1% como fase móvel. As amostras foram submetidas ao tratamento contra um gradiente de concentração de acetonitrila (0 a 100%), coletadas e liofilizadas.

Exemplo 4- Eletroforese das frações protéicas do fungo em gel SDS-PAGE A eletroforese de proteínas em gel de SDS-PAGE foi realizada pelo sistema de Minigel da BioRad (Hercules, CA, USA) para géis de poliacrilamida descontínuos. O gel de separação foi preparado a partir de uma solução estoque de acrilamida a 30% e bis-acrilamida a 0.8% peso por volume (p/v) diluída em uma concentração final de 10%, sendo acrescido de Tris-HCI 1.5 M pH 8.8 e SDS a 10% p/v. Para o gel de aplicação, a solução estoque foi diluída a 4% em Tris-HCI 0.5 M pH 6.8 e SDS a 0.1% p/v. A polimerização dos géis ocorreu na presença de persulfato de amônio (APS) a 10% p/v e N, N, Ν', N'-Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED; Sigma), a 1:2.000 volume por volume (v/v).

Através do gel SDS-Page as frações protéicas (F1 a F5) foram separadas por diferença de peso molecular (F1: < 3.0 kDa; F2: entre 3.0 e 10.0 kDa; F3: entre 10 e 50 kDa; F4: entre 50 e 100 kDa e F5: acima de 100 kDa) para tal elas foram diluídas em tampão de amostra (Tris-HCI 0,7 M pH 6,8, azul de bromofenol a 0,25% e glicerol a 10%) em condições não-redutoras (proporção de 1:1), homogeneizadas e aplicadas no gel. A corrida eletroforética foi realizada por cerca de 2 h e a 90 Volts. O gel foi corado pelo método da prata e fotografado (figura 1).

Exemplo 5 - Ensaio da atividade leishmanicida com o extrato aquoso e as frações protéicas purificadas do fungo Agaricus blazei sob as formas promastigotas em fase estacionária de crescimento das espécies de Leishmania: Leishmania amazonensis, Leishmania major e Leishmania chagasi Em uma placa de cultura celular de 96 poços (Nunc, Nunclon®), 4 x 105 formas promastigotas na fase estacionária de crescimento das espécies Leishmania amazonensis, L. major e L chagasi foram incubadas com 50 pg/mL (concentração efetiva na placa = 5 pg/poço) do extrato aquoso do fungo assim como com as 5 (cinco) frações protéicas purificadas do extrato aquoso do fungo, em meio RPMI-PR' para um volume final de 100 pL, durante 2 h, a 24°C.

Então, 50 μΙ_ do reagente MTT (Thiazoly Blue Tetrazolium Bromide 98%; na concentração estoque de 5 mg/mL) foi adicionado e a placa foi incubada por 4 horas, a 24°C. As células foram então analisadas em um microscópio para a verificação da formação de cristais de formazan. Logo após, 60 pL de uma solução SDS 10%/HCL 0.1 M foram adicionados para a solubilização dos cristais de formazan e a placa foi incubada por 18 horas. As leituras das absorbâncias foram então realizadas em espectrofotômetro no comprimento de onda de 570 nanômetros (nm) (ver figura 2 e Tabela 2).

Por meio das leituras das absorbâncias coletadas nos experimentos, a Tabela 2 foi gerada para representar os percentuais da atividade leishmanicida dos materiais utilizados (extratos e frações protéicas) contra as três espécies de Leishmania. O cálculo da porcentagem de morte dos parasitas foi baseado na fórmula abaixo, utilizando as leituras das absorbâncias;

Tabela 2- Porcentagem de morte das formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de Leishmania amazonensis, Leishmania chagasi e Leishmania major utilizando o extrato aquoso (Ext.) do fungo Agaricus blazei e suas frações protéicas purificadas (FAb1: abaixo de 3.0 kDa; FAb2: 3.0 a 10.0 kDa; FAb3: 10.0 a 50.0 kDa; FAb4: 50.0 a 100.0 kDa e FAb5: acima de 100.0 kDa). Anfot = anfotericina B (controle negativo).

No presente trabalho, foi observado um efeito direto do extrato aquoso do fungo Agaricus blazei e de suas 5 frações protéicas purificadas sobre as formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de três diferentes espécies de Leishmania, no caso, L. amazonensis, L. chagasi e L. major, importantes espécies causadoras de leishmaniose tegumentar e visceral no Brasil e no mundo.

Após a purificação das 5 frações protéicas do fungo, um gel SDS-PAGE foi realizado e, na observação do perfil de proteínas obtidos, pode-se observar que, na fração corresponde à fração “4”, há cerca de 5 a 7 proteínas com uma delas apresentado um perfil de aparecimento mais destacado em relação às outras. Vale destacar que tal fração (FAbb4) foi aquela que apresentou um melhor perfil de atividade leishmanicida sobre as três espécies de Leishmania, sendo capaz de causar a morte in vitro de 70% de formas promastigotas de L. amazonensis, 50% de L. major e 76% de L. chagasi.

Este fato é de grande relevância uma vez que os valores encontrados são melhores em relação aos obtidos com o uso da anfotericina B, fármaco usado rotineiramente no tratamento quimioterápico das leishmanioses (neste caso, os valores encontrados foram 40% de morte in vitro de formas promastigotas de L. amazonensis, 43% de L. major e 35% de L. chagasi). As demais frações apresentaram atividade leishmanicida similar entre si apesar de maior complexidade para avaliação do perfil protéico no gel SDS-PAGE.

Dessa forma, a utilização do extrato aquoso de Agaricus blazei ou de suas frações purificadas em formulações farmacológicas, especificamente, a fração 4 (proteínas com alcance de 50 a 100 kDa) e a fração 5 (proteínas acima de 100 kDa) contribuirão para o tratamento de Leishmaniose.

Exemplo 6 - Tratamento in vitro de macrófagos infectados com Leishmania amazonensis.

Macrófagos peritoneais foram extraídos, quantificados e plaqueados na concentração de 5 x 106 células por poço, em placas de cultura celular de 24 poços (Nunc, Nunclon®). A incubação ocorreu por 2 h em estufa a 37°C, com ambiente de 5% CO2. Em seguida, as células foram lavadas em meio RPMI completo para a retirada das células não-aderidas. Após, 5 x 107 formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de L. amazonensis foram incubadas com os macrófagos (na proporção de 10 Leishmanias para cada 1 macrófago) durante 4 horas, em estufa 37°C e 5% C02. As células foram lavadas para a retirada dos parasitas não-aderidos ou não-fagocitados e, em seguida, os macrófagos infectados foram tratados com a fração “F5 (FAb5)” (na concentração de 50 μg/mL), por 48 horas e a 24°C.

Após a incubação, as células foram lavadas em meio RPMI completo e fixadas com metanol a 100% por 5 minutos. Após a retirada do metanol, as células foram coradas pelo corante hematológico May-Grunwald-Giemsa e levadas ao microscópio ótico para as avaliações (Tabela 3).

Tabela 3: Porcentagem do número de macrófagos infectados e a relação entre o número de parasitas por macrófago infectado, após o tratamento com a fração F5 com as formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de L. amazonensis.

Claims (5)

1. FORMULAÇÃO LEISHMANICIDA, caracterizada por compreender extrato bruto de Agaricus blazei e/ou suas frações purificadas 4 e 5 correspondentes a proteínas de 50 a 150 kDa, além de aomenos um excipiente farmacologicamente aceitável em formas farmacêuticas líquidas, semi-líquidas ou sólidas.

2. FORMULAÇÃO LEISHMANICIDA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser veiculada preferencialmente em formas farmacêuticas selecionadas do grupo compreendendo gel, creme, pomada, pastas, emulsões em geral, soluções, comprimidos e cápsulas.

3. FORMULAÇÃO LEISHMANICIDA, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada por ser administrada pelas vias oral e tópica.

4. USO DE FORMULAÇÃO LEISHMANICIDA, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser para preparação de medicamentos para prevenir a infecção ou tratar mamíferos já infectados por leishmania.

5. USO DO EXTRATO E OU FRAÇÕES PURIFICADAS DE Agaricus blazei caracterizado por ser no tratamento da Leishmaniose.