BRPI1002115A2 - processo de isolamento e purificação de biomarcador; processo de obtenção de um extrato padronizado com propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias, composições farmacêuticas de uso tópico, processo de preparação das mesmas - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE ISOLAMENTO E PURIFICAçãO DE BIOMARCADOR, PROCESSO DE OBTENçãO DE UM EXTRATO PADRONIZADO COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATõRIAS, COMPOSIçOES FARMACéUTICAS DE USO TóPICO, PROCESSO DE PREPARAçãO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de um extrato padronizado com propriedades antinociceptivas e antiinflamatór,as a partir de uma planta do gênero Sphagneticola trilobata, denominada anteriormente como Acmella brasilìensis e Wedelia paludosa, utilizando-se, pelo menos, uma parte da planta, preferencialmente as partes aéreas. A presente invenção também se refere a um processo de isolamento e purificação do biomarcador do extrato padronizado. Adicionalmente, fornecer uma formulação farmacêutica à base do referido extrato em uma quantidade suficiente e eficaz, sendo útil no tratamento de manifestações clínicas como dor e inflamação em mamíferos, bem como um método de preparação da mesma.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

"PROCESSO DE ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE BIOMARCADOR, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UM EXTRATO PADRONIZADO COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIAS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE USO TÓPICO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DAS MESMAS.

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de um extrato padronizado com propriedades antinociceptivas e anti-inflamatórias a partir de uma planta identificada como Sphagneticola trilobata, também denominada Acmella brasiliensis e/ou Wedelia paludosa, utilizando-se, pelo menos, uma parte da planta, preferencialmente as partes aéreas. A presente invenção também se refere a um processo de isolamento e purificação do biomarcador do extrato padronizado. Adicionalmente, fornecer uma formulação farmacêutica de uso tópico à base do referido extrato em uma quantidade segura e eficaz, sendo útil no tratamento de manifestações clínicas como dor e inflamação em mamíferos, bem como um método de preparação da mesma.

Fundamentos e Antecedentes da Invenção

Para melhor compreensão da presente invenção, faz-se necessário uma explanação detalhada do estado da técnica e do problema que a envolve para auxiliar no melhor entendimento.

A dor crônica é um problema de saúde de proporções assustadoras. Dados fornecidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS) a cerca da dor crônica (aquela que se prolonga por mais de três meses) indica uma perda anual de aproximadamente 550 milhões de dias de trabalho em todo o mundo. Nos Estados Unidos, a dor foi considerada o mal da década. Segundo Holden e Pizzi (2003), 48 milhões de americanos sofrem de dores crônicas e gastam aproximadamente $100 bilhões de dólares em tratamentos, perdendo cerca de 4 bilhões de dias de trabalho anualmente a um custo de $65 bilhões em perdas de produtividade (Hollen, J.E.; Pizzi1 J.A., 2003, Advanced Drug DeIiveryReviews, v. 55, p. 935-948,).

Os fármacos analgésicos e antiinflamatórios mais utilizados atualmente são os da classe dos antiinflamatórios não esteroidais (AINES). Infelizmente, quando se trata dos medicamentos para o tratamento de processos dolorosos e inflamatórios, apesar do extenso arsenal disponíveis no mercado, a maioria deles é munida de inúmeros efeitos colaterais e/ou adversos que impedem o uso em tratamentos crônicos (Calixto et al., 2000, Phytother. Res. v. 14, n. 6, p. 401 - 418; Calixto et al., 2001, Expert. Opin. Emerging Drugs. v. 6, p. 261-279; Calixto et al., 2004 Br. J. Pharmacol, v. 143, p. 803-818). Tais efeitos incluem gastrites, ulcerações, dispepsia, náuseas, vômitos, alergias (por exemplo, urticária na pele e eritemas), insuficiência renal (reversível com a cessação da medicação), nefropatia irreversível (por exemplo, associado à medicação continua com paracetamol), síndrome de Reye (grave condição causada raramente pela aspirina em crianças), acidose metabólica (por exemplo, overdose de aspirina), crises hipertensivas e risco de doenças cardiovasculares (por exemplo, inibidores seletivos da COX-2).

Ademais, indivíduos que vivem com dores crônicas têm quatro vezes mais propensão de desenvolver quadros de depressão e de ansiedade, devido aos tratamentos disponíveis não levarem a cura efetiva da dor, apenas aliviando os sintomas e não tratando a causa real da dor. Mais de 70% dos pacientes portadores de câncer sofrem de dor causada pelo desenvolvimento da própria doença ou pelo seu tratamento (Brennan et al. 2007, Anest Analg. v. 75, p. 199-207).

Nos dias atuais, as terapias disponíveis para o tratamento de quadros dolorosos crônicos incluem, além dos (1) anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) já citados, os (2) fármacos opióides e, (3) um grupo de drogas, com ações farmacológicas diversas, conhecido como adjuvante, compreendendo antidepressivos, anticonvulsivantes, anestésicos locais, agonistas dos receptores a2-adrenérgicos e agonistas gabaérgicos, entre outros. Entretanto, como já citado acima, estas terapias também tem seu uso restringido pelo surgimento de efeitos colaterais sérios.

Dentro do exposto, é compreensível que o desenvolvimento de terapias mais seguras ou, em outras palavras, com melhor risco-benefício, para tratamento da dor e inflamação, faz-se necessário, considerando-se especialmente os riscos associados aos fármacos correntemente empregados.

Neste contexto, a fitoterapia apresenta-se como uma alternativa relevante ao arsenal terapêutico predominantemente sintético, constituindo uma forma de medicina que vem crescendo visivelmente ao longo dos anos. Acredita-se que o principal fator a contribuir consideravelmente para o crescimento em questão consista na evolução dos estudos científicos, particularmente os estudos químicos e farmacoiógicos, que comprovam, cada vez mais, a eficácia das plantas medicinais, principalmente aquelas empregadas na medicina popular com finalidades terapêuticas (Cechinel Filho, V.; Yunes, R. A. 1998, Quim. Nova, v. 21, n. 1, p. 99- 105, 1998; Malheiros, Bittencourt, Niero e Cechinel Filho, em: Fármacos e Medicamentos, uma Abordagem Multidisciplinar, cap. 2, pp. 17-44, 2009).

Medicamentos fitoterápicos são produtos obtidos empregando-se exclusivamente matérias-primas de origem vegetal, como óleos e extratos. São caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Seus princípios ativos são substâncias quimicamente caracterizadas, cuja ação farmacológica é conhecida e responsável, total ou parcialmente, pelos efeitos terapêuticos do fitoterápico (Brasil, ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n2 48, de 16 de março de 2004).

O potencial das plantas como fonte de pesquisa na busca por novos medicamentos, com novos modos de ação, alta seletividade e atividade farmacológica, ainda é pouco explorado, uma vez que, cerca de 250.000 a 350.000 espécies de plantas existentes no mundo, somente 15% têm sido estudadas fitoquimicamente e 6% biologicamente (Di Stasi, L. C., 2005, Plant Genetic Resources, 3, 2, 199-205; Gurib-Fakim, A., 2006, Mol. aspects med., 27, 1-93; Molina-Salinas et al., 2006, Archives Of Medicinai Research, 37, 45-49).

A W. paiudosa é utilizada pela terapêutica popular em processos infecciosos, inflamatórios, dolorosos, respiratórios (expectorante), entre outros (Corrêa, Ρ. M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, v. 5, p. 137,1984). Na forma de tinturas, é indicada para hematomas, machucaduras, ferimentos, nevralgias, anemia e inflamações no geral (Michalak, E. Apontamentos fitoterâpicos da Irmã Eva Michalak. Florianópolis: EPAGRI, 1997. 94p.).

Todavia, pouquíssimos estudos que possam justificar sistematicamente este amplo potencial terapêutico são descritos em literatura. Estudos realizados pelos inventores e colaboradores com a S. trílobata demonstraram maior concentração de compostos de natureza terpênica, esteroidal e fenólica (flavonóides) e ausência de alcalóides. As diferentes partes da planta (raiz, caule, folha e flor) possuem perfis cromatográficos distintos, indicando uma constituição química quantitativa diferente entre elas, porém com alguma similaridade em relação a alguns compostos. O diterpeno ácido caurenóico encontra-se em todas as partes da planta, porém em concentrações maiores na raiz, e considerando a variação sazonal, é produzido em maior concentração na raiz e caule durante o outono (Bresciani, L. F. V.; Yunes, R. A.; Bürger, C.; De Oliveira, L. E.; Bóf, K. L.; Cechinel Filho, 2004, V. Zeitschrift Fur Naturforschung, v. 59, n. 3-4, p. 229-232,). Já o flavonóide Iuteolina está concentrado apenas nas folhas e nas flores.

Também foram identificados nas flores dois ácidos caurânicos (ácido 3a- tigloiloxicar-16-en-19-óico e ácido 3a-cinamoiloxicar-16-en-19-óico), estigmasterol, uma mistura de 3b-0-b-D-glicopiranosilsitosterol e 3b-0-b-D- glicopiranosilestigmasterol e uma mistura de três ésteres 3b-0-aciloleanóicos (Carvalho, J. A.; Carvalho, M. G.; Ferreira, D. T.; Faria, T. J.; Braz-Filho, R. Quim. Nova, v. 24, n.1, p. 24-26, 2001), e mais recentemente, foi identificada uma nova Iactona eudesmanolide, a paludolactona (Cechinel Filho, V.; Block1 L. C.; Yunes, R. A.; Monache, F. D., 2004, Λ/aí. Prod. Res., v. 18, n. 5, p. 447-451). Foi evidenciado também ο forte efeito analgésico do extrato bruto de S. trilobata, sendo muito mais potente do que alguns fármacos utilizados clinicamente, como a ácido acetilsalicílico, o paracetamol, a dipirona e o diclofenaco de sódio. Além disso, o extrato inibiu o edema de pata de rato induzido pela carragenina, dextrana e bradicinina, apresentando potencial antiinflamatório (Block, L. C.; Scheidt, C.; Quintão, N. L. M.; Santos, A. R. S.; Cechinel Filho, V. Pharmazie, v. 53, n. 10, p. 716-718,1998). Tanto o extrato hidroalcóolico como os compostos (ácido caurenóico, Iuteolina e paludolactona) obtidos da planta apresentaram significativo efeito antinociceptivo em vários modelos de nocicepção química, tais como ácido acético, formalina e capsaicina em camundongos. O extrato das raízes foi cerca de 2 a 4 vezes mais potente do que o extrato obtido dos caules e folhas, ou seja, os princípios ativos responsáveis pelo efeito dessa planta encontram-se em maior concentração nas raízes, ou mesmo, devido a presença de outros compostos diferentes (Scheidt, C. Estudo da ação antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato hidroalcóolico e de compostos isolados da Wedelia paludosa D.C. (Compositae). 1998. 53f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)-Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 1998; Calixto, J. B. et al., 2000, Phytotherapy Research, v. 14, p. 401-418).

Witek e Bretzke (1999) relataram que os extratos obtidos da W. paludosa apresentaram efeito anti-hiperalgésico significativo quando analisados na hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar de carragenina, bradicina e capsaicina, sendo mais eficazes que o fármaco utilizado clinicamente (diclofenaco) (Witek LM, Bretzke PE 1999. Atividade anti-hiperalgésica da Wedelia paludosa e Aleurites moluccana em ratos. Itajaí, 50p. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)- Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí)

As frações de hexano e de diclorometano, obtidas de S. trilobata, foram mais ativas no modelo de dor analisado do que as frações de acetato de etila e butanol, sugerindo que os compostos mais apolares são os responsáveis em parte pelo potencial analgésico da planta. Já os compostos puros isolados (ácido caurenóico e luteolina) são também são responsáveis, pela atividade analgésica apresentada pelas frações de hexano e diclorometano, respectivamente, sendo mais potentes do que a aspirina, acetoaminofeno, indometacina e dipirona. Com exceção das flores, todas as outras partes da planta (raízes, caules e folhas) inibiram de forma dose- dependente as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos, sendo que o extrato metanólico das raízes foi mais efetivo (Block, L. C. Determinação dos princípios ativos de Wedelia paludosa D.C., (Compositae). 1997. 63f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)-Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 1997; Schlemper, S. R. M.; Cordeiro, F.; Cechinel Filho, V.; Block, L. C. Alcance (Pesquisa), ano V, n. 2, p. 14-18,1998).

Além disso, o extrato hidroalcoólico inibiu o edema de pata de rato induzido pela carragenina, dextrana e bradicinina, sugerindo potencial antiinflamatório (Block, L. C.; Scheidt, C.; Santos, A. R. S.; Yunes, R. A.; Souza, M. M.; Monache, F. D.; Cechinel Filho, V., 1998, Ethnopharmacoi.,:ν. 61, ρ. 85-89). Resultados de Bretzke e Witek (1999) demonstraram que os extratos obtidos da S. tríiobata bem como o diclofenaco sódico apresentaram efeito anti-hiperalgésico significativo quando analisados na hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar de carragenina, substância P, bradicina e capsaicina. Contudo os extratos utilizados foram mais eficazes que o fármaco utilizado clinicamente (diclofenaco - 30 mg/kg, i.p.).

A luteolina foi cerca de cinco vezes mais efetiva do que a aspirina e paracetamol usados como controle positivo, corroborando os usos populares no tratamento de processos dolorosos e inflamatórios. Os extratos e compostos analisados foram efetivos em reduzir de forma significativa a migração de leucócitos totais bem como, somente de neutrófilos na cavidade pleural, sem, no entanto, interferir com o extravasamento do azul de Evans (exsudação) causada pela injeção intrapleural de carragenina. Provavelmente, os extratos e os compostos estudados estejam inibindo fatores envolvidos na migração de células para o sítio inflamatório, sem interferir com a exsudação (Niero, R. Obtenção de novas moléculas com atividade analgésica e antiinflamatória a partir de plantas medicinais brasileiras. 2000. Tese (Doutorado) - Curso de Pós Graduação em Química, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2000). Foi verificado que a W. paludosa apresenta também propriedades antibacterianas em extratos de hexano e de diclorometano (compostos apolares), principalmente contra cocos piogênicos. Os compostos puros isolados das frações semi-purificadas de hexano e de diclorometano, o ácido caurenóico e a Iactona eudesmanolide, foram eficazes contra as bactérias Gram-positivas (Block, L. C.; Scheidt, C.; Santos, A. R. S.; Yunes, R. A.; Souza, M. M.; Monache, F. D.; Cechinel Filho, V., 1998, J. Ethnopharmacol., v. 61, p. 85-89).

Além de todas essas atividades farmacológicas, as flores da W. paludosa apresentaram-se eficazes contra fungos dermatófitos, validando o uso popular de uma das partes da planta que é utilizada na medicina popular para o tratamento de doenças da pele, porém não exerceu atividade contra micoses sistêmicas (Sartori, M. R. K.; Pretto, J. B.; Cruz, A. B.; Bresciani, L. F. V.; Yunes, R. A.; Sortino, M.; Zacchino, S. A.; Cechinel Filho, V., 2003, Pharmazie, v. 58, n. 8, p. 567-569). Por outro lado, esta planta também apresentou atividade tripanossomicida (protozoário Trypanosoma cruzi) atribuída aos diterpenos existentes na planta (Batista, R.; Chian, E.; Oliveira, A. B., 1999, Planta Med., v. 65, p. 283-284, 1999; Vieira, H. S.; Takahashi, J. A.; Boaventura, M. A. D., 2001, Fitoterapla, v. 72, p. 854-856).

Os resultados toxicológicos agudo e subagudo demonstram que a DL50 selecionada para o extrato hidroalcóolico da W. paludosa é maior que 4000 mg/kg, possuindo baixa toxicidade quando administrado pela via oral em camundongos comprovando que o extrato é praticamente destituído de toxicidade em estudos de toxicidade aguda e subaguda (Fischer, D. R.; Cordenunzzi, D. A. Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico da Wedelia paludosa em camundongos. 2000. 48 f. Monografia (Graduação) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2000; Burger, C.; Ficher, D. R.; Cordenunzzi, D. A.; Batschauer, A. P.; Cechinel Filho, V.; Soares, A. R., 2005, J. Pharm. Pharm. Sci., v. 19, n. 8(2), p. 3870-3873).

Cavalcanti e cols. (2006) determinaram a genotoxicidade in vitro do ácido caurenóico utilizando células de fibroblastos pulmonares de camundongos chineses (V79). A duração do teste foi de 3 horas e utilizou-se como controle positivo metilmetanosulfonato (MMS). Nas concentrações de 2,5, 5 e 10 ug/m L não ocorreu dano no DNA celular. Contudo, em altas concentrações (30 e 60 ug/mL) de ácido caurenóico houve aumento significante de dano celular.

Em ensaio para avaliar citotoxicidade, leveduras de Saccharomyces cerevisiae foram cultivadas em diferentes concentrações do extrato de W. paludosa e utilizado como controle o ácido acetilsalicílico. Aparentemente a ação citotóxica do extrato desempenha uma ação aguda, sendo que posteriormente existe uma redução dos seus efeitos tóxicos (Miguel, C. O. Bosco, Μ. B. Análise da citotoxicidade da Acmeia brasiiiensis utilizando células de Saccharomyces cerevisiae. 2005. 40 f. Monografia (Graduação) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2005).

Foi desenvolvido e validado um método de quantificação por CLAE do ácido caurenóico nos extratos de W. paludosa (Zanela, A.H. et al., Desenvolvimento e validação de método de determinação de ácido caurenóico por clae em extrato das partes aéreas de Wedelia paludosa d.c. compositae e fitoterápico de uso tópico. In: V Seminário de Iniciação Científica, 2006, Itajaí. Anais do V Seminário de Iniciação Científica. Itajaí: Editora da Univali, 2006. v. 1. p. 1-1) e a obtenção de um extrato mole padronizado desta planta (Baccarin.et al. Standardization of hydroalcoholic extracts oi Acmela brasiiiensis (Wedelia paludosa) (Asteraceae). In: 5th International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2005, Ribeirão Preto. RBCF - Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. São Paulo : USP1 2005. v. 41. p. 469-469) utilizando o método de turbo-extração.

Assim, os estudos conduzidos anteriormente pelos inventores e colaboradores lograram identificar um potencial do emprego da espécie para desenvolvimento de um novo medicamento fitoterápico.

Estudos e pesquisa ora apresentados pelos inventores demonstram novas atividades antinociceptivas e antiinflamatórias relacionadas aos extratos de S. trilobata como comprovam os dados e testes ora descritos no presente relatório.

Os inventores também identificaram procedimentos e métodos ainda não relatados na literatura, conforme descritos a seguir, que contribuem ao emprego da S. trílobata reconhecidamente como medicamento/insumo farmacêutico com garantia de segurança e eficácia quanto às propriedades analgésicas e antiinflamatórias sejam reprodutíveis e consistentes.

Podem ser encontradas algumas patentes de invenção, que utilizem a mesma planta tratando de uma outra patologia ou utilizando processos diferentes dos apresentados.

Um exemplo consiste no pedido de patente CN 1631106 (A) - que fornece um método de reprodução de S. trilobata que compreende as seguintes cinco etapas: (1) desinfecção do emplante, com 65-75% de etanol e 0,1% de cloreto de mercúrio, (2) a obtenção de brotos estéreis através de MS empregando meio para cultura de 15- 30 dias, (3) gerando o incentivo aglomeração gomos, (4) induzindo a raiz de gerar, (5) transplantar as tensões regeneradas. Pode ser verificado a partir deste pequeno resumo do pedido, que o objeto dos pedidos.

Outro exemplo é o pedido de patente PI0701125-3, PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE MEDICAMENTO Λ BASE DO EXTRATO DA PLANTA Sphagneticola trílobata, que apresenta um processo para obtenção de medicamento para utilização como anestésico, anti-inflamatório e cicatrizante, que pode também ser utilizado em queimaduras de insetos e na eliminação de manchas da pele, caracterizado por o processo para obtenção de medicamento à base do extrato da planta Sphagneticola tribolata ser iniciado com a coleta de folhas e flores da planta, higienização e seleção para infusão em um volume de álcool na proporção de: para cada litro de álcool um volume de folhas e flores. Esta proporção (álcool+folhas/flores) é colocada em um recipiente, que e hermeticamente fechado, e depois mantida em infusão á temperatura ambiente durante vinte e quatro (24) horas. Cumprido este período a infusão é filtrada obtendo-se uma solução ideal onde o extrato é mantido com todas as suas propriedades farmacológicas em solução com o álcool para ser utilizado em gotas e na forma de creme dermatológico na associação com elementos próprios. O dito pedido de patente de invenção (PI0701125-3) apresenta um processo artesanal de conhecimento popular, que não alcança a complexidade do processo apresentado neste pedido. Tendo em vista o acima exposto, torna-se particularmente interessante um processo de obtenção de um extrato padronizado a partir de S. trilobata, um processo de isolamento do seu biomarcador, um processo de preparação de uma composição farmacêutica fitoterápica com propriedades analgésicas e antiinflamatórias, um método de tratamento e sua utilização como uma terapia alternativa a AINES de uso tópico, em vista do potencial terapêutico possivelmente desprovido de efeitos colaterais.

Obieto da Invenção

O objeto principal da presente invenção é fornecer um processo de obtenção de um extrato padronizado com propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias, a partir de uma planta do gênero Spagneticola. Preferencialmente, a obtenção do extrato padronizado se dá a partir de uma parte da planta S. trilobata, mais preferencialmente, das partes aéreas de S. trilobata.

Também é um dos objetos desta invenção, fornecer um processo de isolamento, purificação e caracterização do biomarcador do extrato e principal responsável pelo efeito farmacologico, mais particularmente, Ácido Caurenóico.

Outro objeto desta invenção é fornecer a caracterização farmacológica do extrato padronizado citado acima, quanto às suas atividades antinociceptivas e antiinflamatórias, antiedematogênicas, anti-hipernociceptivas, além da avaliação de sua toxicidade aguda e citotoxicidade.

Além disso, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente ativo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um extrato padronizado em relação a um ou mais biomarcadores, preferencialmente o ácido caurenóico, bem como um método de preparação da mesma.

Breve Descrição das Figuras

As figuras apresentadas demonstram a presente patente, a título de exemplo não limitativo, proporcionando melhor compreensão da mesma.

A Figura 1 - Apresenta o perfil cromatográfico por CLAE do padrão de ácido caurenóico isolado (lote AC001/06) em 210 nm.- sistema isocrático A Figura 2 - Apresenta o espectro de absorção do padrão de ácido caurenóico isolado (lote AC001/06) na região do infravermelho.

A Figura 3 - Apresenta o espectro de RMN 1H do padrão de ácido caurenóico isolado (lote AC001/06).

A Figura 4 - Apresenta o espectro de RMN 13C do padrão de ácido caurenóico isolado (lote AC001/06).

A Figura 5 - Apresenta o Perfil em CCD dos extratos moles de S. trilobata coletados na primavera de 2006. P: ác. caurenóico (biomarcador; 1: extrato mole (lote WP311106a,b,c); 2: extrato mole (lote WP311106d,e,f); 3: extrato mole (lote WP311106 sombra a,b,c); 4: extrato mole (lote WP311106sombra d, e,f)

A Figura 6- Apresenta o perfil cromatográfico por CLAE do extrato mole de S. trilobata padronizado (lote WP010307), em 210 nm - sistema isocrático

A Figura 7- Apresenta o perfil cromatográfico por CLAE do extrato seco de S. trilobata padronizado em aumento de escala (lote 3453), em 210 nm - sistema isocrático

A Figura 8 - Apresenta o perfil cromatográfico por CLAE do extrato seco de S. trilobata padronizado em aumento de escala (lote 3403), por CLAE em 210 nm. - sistema gradiente

A Figura 9 - Apresenta os extratos secos de S. trilobata lotes:1: ES001/08 (20% aerosi); 2: ES002/08 (25% aerosil) e 3: ES003/08 (30% aerosil) - escala laboratorial

A Figura 10 - Efeito do tratamento tópico com creme contendo 3 extratos secos de S. trilobata padronizado (lotes ES001/08, ES002/08 e ES003/08 ), padrão de ácido caurenóico isolado (lote AC00108), extrato mole (lote SE001/08) e dexametasona, no edema de orelha induzido pelo óleo de cróton (2,5 %) em camundongos. η = 6, ** ρ < 0,01 e *** ρ < 0,001. ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Dunnett.

A Figura 11 - Efeito do tratamento tópico com creme contendo extrato seco de S. trilobata padronizado em aumento de escala (lote 3453) a 1, 2, 3 e 5% e dexametasona a 0,5%, no edema de orelha induzido pelo óleo de cróton (2,5 %) em camundongos. η = 6, ** ρ < 0,01 e *** ρ < 0,001. ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Dunnett.

Descrição Detalhada da invenção

A presente invenção, conforme se depreende das figuras apresentadas, consiste em um processo de obtenção de um extrato padronizado com propriedades antinociceptivas e anti-inflamatórias. Processo de isolamento e purificação do biomarcador, composições farmacêuticas, processos de preparação das mesmas, que podem ser melhor compreendidos a partir da apresentação do conhecimento da planta do gênero Wedelia e dos processos utilizados para alcançar os objetos desta invenção.

A planta W. paludosa, também denominada como Acmella brasiliensis Spreng e Sphagneticola trilobata (1996) (Hind, N. Publicação eletrônica), é referenciada popularmente pelos sinônimos: Vedélia, Margaridão, Pingo-de-Ouro, Malmequer-do- Brejo, Picão-da-Praia, Pseudo-Arnica. É uma planta nativa no Brasil, amplamente encontrada em várias regiões do país, incluindo o estado de Santa Catarina. Ocorre de forma espontânea ao longo da costa, formado um colchão verde uniforme (15-30 de espessura), apresentando vistosas flores amarelas durante quase todo o ano e produzindo excelente efeito ornamental. Planta perene, reproduzida por semente; adaptada à áreas úmidas; tolera um certo grau de sombreamento, florescendo com intensidade se bem iluminada (Kismann, K. G.; Groth, D. Plantas infestantes e nocivas. Rio de Janeiro: BASF Brasileira, 1992. p.383-385).

A família Asteraceae consiste de plantas prostradas, radicantes nos nós, com caule castanho-avermelhado, esparsamente piloso; folhas opostas, curto-pecioladas, membranáceas, pilosas nas duas faces, mais pronunciadamente na dorsal, estreitada em direção à base acima do meio, provida de dois pequenos lobos laterais e um terminal, maior e denteado, 6 cm de comprimento e 3 cm de largura; pecíolo semicilíndricos, ciliado, com 4 mm de comprimento; capítulos solitários, longo-pedunculados, axilares; pedúnculo piloso, 10 cm de comprimento; brácteas involucrais foliáceas, em 2 séries, pilosas no dorso, 8-12 mm de comprimento; receptáculo cônico, carnoso, paleáceo; flores amarelas, as marginais femininas, cerca de 13, como corola ligulada, trilobada no ápice, com 8 mm de comprimento e hermafroditas, com corola tubulosa; estilete da flor feminina com os ramos glabros, carnosos, obtusos, semicilíndricos; anteras negras, de base sagitada; aquênio túrgido, tríquetro, glabro, estreitado na base, com papus ciatiforme de 1 mm de comprimento (Corrêa, Ρ. M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, v. 5, p.137,1984; Kismann, K. G.; Groth1 D. Plantas infestantes e nocivas. Rio de Janeiro: BASF Brasileira, 1992. p.383-385).

As folhas se concentram na parte final dos caules e ramos, desaparecendo nas partes mais velhas que ficam no interior da plantas e que não recebem iluminação adequada; sistema subterrâneo composto por raízes superficiais; folhas simples, subsésseis, ocorrendo de forma oposta. O limbo é membranáceo, de formato subastado, com base regularmente atenuada, dois lobos laterais, ápice agudo e margens irregularmente dentadas; nervuras proeminentes na face dorsal, sendo que a nervura central segue única na parte atenuada da base; coloração verde escura e superfície brilhante na face ventral e mais clara na dorsal; minúsculos pêlos hialinos na face dorsal especialmente sobre as nervuras; as folhas são também levemente ásperas em ambas as faces. Os capítulos são isolados, com pedúnculo fino e reto, chegando a 10 cm de comprimento a partir de uma axila foliar; florescimento ocorre quase todo ano, com maior intensidade nos meses de verão; flores com capítulos vistosos, com 2-3cm de diâmetro, de coloração amarela intensa, com pontos escuros (anteras) sobressaindo aos flósculos centrais; invólucro formado por duas séries de cinco filarias lanceoladas, de comprimento qual à metade do comprimento das lígulas, soldadas na base, verdes e com finos pêlos hialinos na face externa; na periferia ocorrem cerca de 15 lósculos femininos, com lígulas desenvolvidas, chegando a 8mm de comprimento, espaciformes e de ápice com 2-3 pequenas entradas, de coloração amarela intensa; na área central um grande número de flósculos hermafroditos, com uma bráctea membranácea lanceolada, amarelo-pálida, acompanhando a corola, que é tubulosa, abrindo-se em 5 lobos possuindo minúsculos pêlos, amarelos como os lobos das corolas; androceu com anteras lineares, dispostas em forma de tubo, de coloração castanha escura; as anteras são projetadas para fora da corola; gineceu com estiletes que projetam um estigma bífido, amarelo, afora da corola; receptáculo cônico, carnoso, paleáceo; aquêneo de obconoidal a ovóide, base obtusa a longo acuminada; ápices truncados, mais estreito que o corpo do aquênio; disco epígeno elíptico deprimido na base do grosso estilete esbranquiçado; papilo ausente; plântula com hipocótilo cilíndrico, liso e glabro; folhas cotiledonares suborbiculares, epicótilo piloso; folhas verdadeiras ovaladas, de base arredondada e ápice curtamente agudo, margens denteadas, nervuras bem marcadas, superfícies lisas e glabras, verdes (Kismann, K. G.; Groth, D. Plantas infestantes e nocivas. Rio de Janeiro: BASF Brasileira, 1992. p.383-385).

ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR

A eleição, isolamento, purificação e caracterização de um ou mais constituintes / biomarcadores de um extrato tornam-se particularmente necessários para os procedimentos de quantificação e padronização dos extratos.

De acordo com a presente invenção, determinou-se preferencialmente o ácido caurenóico (Figuras 1 a 4) como o biomarcador mais apropriado para um processo de obtenção de um extrato padronizado. Tal seleção é justificável por se tratar de um composto majoritário na planta e por estar relacionado com as propriedades farmacológicas do extrato (Figura 10). Além deste composto, outras substâncias presentes no extrato podem ser utilizadas como biomarcadores como observado na análise por CLAE em sistema gradiente (Figura 8). Possivelmente estes compostos sejam a coreopsina, luteolina, paludolactona ou ácido cafeico já previamente isolados desta planta (Bresciani, L. F. V.; Yunes, R. A.; Bürger, C.; De Oliveira, L. E.; Bóf, K. L.; Cechinel Filho, 2004, V. Zeitschrift Fur Naturforschung, v. 59, n. 3-4, p. 229-232; Cechinel Filh Cechinel Filho, V.; Block, L. C.; Yunes, R. A.; Monache, F. D., 2004, Nat. Prod. Res., v. 18, n. 5, ρ. 447-451o, V.; Block, L. C.; Yunes, R. A.; Monache, F. D., 2004, Nat. Prod. Res., v. 18, n. 5, p. 447-451), entre outros não identificados.

Estes procedimentos de quantificação e padronização dos extratos ocorrem de acordo com as seguintes etapas: I. Isolamento,

II. Purificação, e

III. Caracterização do biomarcador.

O isolamento do biomarcador ácido caurenóico (etapa I) pode ser realizado por técnicas que incluem, mas não se limitam à partição líquido-líquido, CCD preparativa (CCDP), cromatografia em coluna, cromatografia centrífuga, CLAE preparativa (CLAEP) ou semi-preparativa, uma combinação das mesmas e similares.

O isolamento do biomarcador ácido caurenóico pode ser realizado empregando-se, seqüencialmente, as técnicas de partição líquido-líquido e cromatografia em coluna aberta, utilizando-se diferentes fases estacionárias (sílica, sephadex-LH20. quitina, etc.), preferencialmente a sílica e misturas de solventes como eluente (hexano, diclorometano.acetona, acetato de etila), preferencialmente de Hexano:Acetato de Etila (100:0 a 0:100), e preferencialmente na proporção 85:15; ou cromatografia em coluna tipo flash, ou CLAE preparativa ou semi-preparativa utilizando colunas de fase normal ou reversa, preparativa ou semi-preparativa, utilizando como fase móvel diferentes solventes como misturas de acetonitrila, metanol e água ultrapura acidificada (pH 3,5), preferencialmente na proporção 40:45:15, monitorado em 210 nm.

A purificação do biomarcador ácido caurenóico (etapa II) pode ser realizada por técnicas que incluem dissolução e recristalização com solventes como hexano, metanol, acetato de etila, entre outros, com ou sem aquecimento. Mais preferencialmente, a purificação do biomarcador é realizada através de lavagem e recristalização com hexano.

De acordo com a presente invenção, através da utilização dos procedimentos acima descritos, deve-se alcançar um teor de pureza do biomarcador equivalente a aproximadamente > 90%.

De acordo com a presente invenção, a análise qualitativa e quantitativa do biomarcador ácido caurenóico isolado e purificado, ou seja, sua caracterização (etapa III) pode ser realizada por técnicas que incluem, mas não se limitam à ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio e de carbono-13, espectrofotometria no infravermelho (IV), espectrofotometria no ultravioleta (UV), CLAE, CCD, análises térmicas.

O biomarcador ácido caurenóico isolado e purificado é particularmente caracterizado por FTIR (Figura 2), por RMN, apresentando um espectro de RMN H1 (Figura 3) e C13 (Figura 4), bem como por CLAE (Figura 1), com perfil de absorção característico, com máxima em 210 nm, Rf característico em análise por CCD (Figura 5) e faixa de fusão característica 176-180°C (Boeck, P.; Sá, M. M.; Souza, B. S.; Cercená, R.; Escalante, A. M.; Zachino, S. A.; Cechinel Filho, V.; Yunes1 R. Α., 2005, J. Braz. Chem. Soc., v. 16, η. 6B, p. 1360-1366).

O ácido caurenóico (AC) foi isolado das raízes de S. trílobata e recebeu o número de lote AC001/06, submetido às análises acima citadas e apresentando conformidade com as especificações (Boeck, P.; Sá, M. M.; Souza, B. S.; Cercená, R.; Escalante, A. M.; Zachino, S. A.; Cechinel Filho, V.; Yunes, R. A., 2005, J. Braz. Chem. Soc., v. 16, η. 6B, p. 1360-1366)..

Conforme a figura 2 o espectro do composto isolado na região do IV apresentou os principais picos relacionados com os grupamentos químicos da molécula (principais bandas: 3300-2500, 1710-1680 e 1320-1210 cm"1) (Boeck, P.; Sá, M. M.; Souza, B. S.; Cercená, R.; Escalante, A. M.; Zachino, S. A.; Cechinel Filho, V.; Yunes, R. Α., 2005, J. Braz. Chem. Soc., v. 16, η. 6B, p. 1360-1366).

O espectro de RMN 1H do AC (Figura 3) apresenta como principais informações: dois simpletos em 0,9 e 1,20 ppm referentes as duas metilas e dois simpletos em 4,74 e 4,80 ppm referentes aos hidrogênios olefínicos. Os sinais entre 0,6 e 2,8 ppm são referentes aos metilenos e metinos. Os dados estão de acordo com os obtidos com o AC referência (lote 001/06) e os descritos na literatura (Boeck, P.; Sá, M. M.; Souza, B. S.; Cercená, R.; Escalante, A. M.; Zachino, S. A.; Cechinel Filho, V.; Yunes, R. A., 2005, J. Braz. Chem. Soc., v. 16, η. 6B, p. 1360-1366).

A figura 4 apresenta o espectro de RMN 13C do AC. São observados os sinais em 184,2 ppm referente a carbonila e em 155,8 e 102,9 ppm referentes aos carbonos olefínicos. Os demais sinais entre 60 e 15 ppm são referentes aos carbonos metilenos, metílicos e metinos. O espectro obtido está de acordo com os dados obtidos com ο AC referência (lote 001/06) e os descritos na literatura (BOECK et ai., 2005). O biomarcador selecionado foi utilizado para o desenvolvimento de um método quantitativo, por CLAE1 para a padronização do extrato adaptado (Zanela et al., Desenvolvimento e validação de método de determinação de ácido caurenóico por clae em extrato das partes aéreas de Wedelia paludosa d.c. compositae e fitoterápico de uso tópico. In: V Seminário de Iniciação Científica, 2006, Itajaí. Anais do V Seminário de Iniciação Científica. Itajaí: Editora da Univali, 2006. v. 1. p. 1-1).

A pureza foi determinada através da área do pico principal em relação ao somatório das áreas do cromatograma do padrão de AC por CLAE e o AC isolado apresentou um grau de pureza de 95 ± 1% (Figura 1). O método de análise por CLAE pode ser realizado usando modo normal ou fase reversa, preferencialmente usando uma coluna C18, de 10-25 cm de comprimento e de 3-4,6 mm de diâmetro, utilizando diversos solventes grau HPLC na fase móvel, tais como acetonitrila (ACN), metanol (MeOH), água ultrapura, tetrahidrofurano, entre outros, em modo gradiente ou isocrático. No modo isocrático preferentemente com MeOH: ACN::água pH 2,6 na proporção de 35:45:17, em fluxo de 0,3-2,0 mL/min, preferentemente a 1,0 mL/min, em temperatura de 20-60°C, preferentemene a 35°C, com detecção do pico de 200- 300 nm, preferentemente em 210 nm. No modo gradiente, preferentemente de acordo com o Quadro 1:

Quadro 1. Esquema do gradiente usado na análise do extrato seco de S. trilobata, por CLAE

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PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DE S. trilobata

Um extrato padronizado compreende um extrato mole ou seco, padronizado em relação a um dos seus biobiomarcadores principais de acordo com as seguintes etapas: a) coleta, secagem e subdivisão do material vegetal; b) extração com solvente extrator; c) filtração do extrato; d) concentração do extrato (extrato mole) e secagem (extrato seco); e) análise qualitativa e quantitativa (padronização) do extrato.

Após a colheita da planta, seleciona-se preferencialmente as partes aéreas da S. trilobata, procede-se à secagem da planta recém coletada em estufa de ar circulante, ou ao ar livre em temperatura ambiente, ou utilizando outros métodos de secagem.

As etapas do processo, de acordo com a presente invenção, são suficientes para assegurar uma concentração adequada do ácido caurenóico. Particularmente, as etapas do processo são capazes de prover ao extrato padronizado, uma concentração de flavonóides totais de 0,2 a 2 % de sua constituição. Mais preferencialmente, as etapas do processo são capazes de prover uma concentração de ácido caurenóico de 0,05 a 15% da sua constituição, preferentemente, entre 5-8%.

Na etapa de coleta, secagem e subdivisão do material vegetal, o material vegetal, de acordo com a presente invenção, compreende uma parte de uma planta do gênero Sphagneticota, mais especificamente, emprega-se como material vegetal uma parte da espécie S. trilobata, e mais preferencialmente as partes aéreas incluindo caules e folhas.

O material vegetal poderá ser obtido, com vantagens, a partir de indivíduos sadios da espécie S. tritobata, sejam estes adultos (£ 1 ano), jovens (< 3-12 anos), intactos ou em estágio de rebrota.

O material vegetal, de acordo com a presente invenção, poderá ser utilizado fresco, seco, inteiro, rasurado, picado, triturado, moído, pulverizado ou micronizado. Mais especificamente, torna-se útil o emprego do material vegetal seco e triturado em partículas com dimensões < 50 mm.

A etapa do processo de extração com solvente extrator, de acordo com a presente invenção, compreende um procedimento de extração tal como, mas não limitado à maceração, percolação, decocção, infusão, lixiviação, destilação, turbólise (ou turbo extração), extração supercrítica ou similar, soxlet, empregando-se um solvente extrator adequado.

Exemplos de solventes extratores incluem, mas não se limitam á água, metanol, etanol, propanol, isopropanol, propilenoglicol, solução ácida, acetato de etila, diclorometano, clorofórmio, hexano, glicerina, acetona, éter de petróleo, fluido O supercrítico, uma combinação dos mesmos e similares.

Preferencialmente, de acordo com a presente invenção, o processo de extração consiste em maceração dinâmica e o solvente extrator em uma solução hidroalcoólica água:etanol, sendo que o teor de água não é maior que o teor de álcool, preferencialmente etanol a 60% A extração poderá ocorrer sob presença ou ausência de luz e/ou oxigênio, sob agitação, por um período de 2-12 h, preferencialmente 8 h.

A razão solvente extrator:material vegetal, empregada no procedimento de extração pode variar de 1:1 à 20:1. Mais especificamente, a razão de solvente extrator:material vegetal é de 10:1. De acordo com a presente invenção, o processo de obtenção dos extratos exige um procedimento de filtração para eliminação do resíduo do material vegetal.

Os procedimentos de filtração incluem, mas não se limitam à filtração em profundidade ou em superfície, empregando-se diferentes tipos de materiais filtrantes. A ultrafiltração em membrana pode ser útil, também, para remoção de oxidases dos extratos, em especial aquelas com peso molecular elevado, tal como a lacase. A eliminação de oxidases pode ser especialmente desejável na estabilização dos extratos padronizados.

A etapa do processo de concentração do extrato, pode ser realizada com a utilização de um procedimento selecionado de um grupo que consiste de evaporação sob pressão reduzida, evaporação por convenção de calor, aquecimento, uma combinação dos mesmos e similares.

Mais preferencialmente, o procedimento de concentração do extrato refere-se à técnica de evaporação sob pressão reduzida, empregando-se temperatura de aquecimento de aproximadamente < 70°C e vácuo entre 200 e 400 mmHg, a qual é capaz de prover uma concentração de aproximadamente 90% de sólidos no extrato, e suficiente para eliminação total do álcool.

Um procedimento útil para estabilização de um extrato refere-se à descontaminação microbiana. A radiação por raios gama, radiação ultravioleta, pasteurização e similares são particularmente úteis neste caso.

Na etapa de obtenção do extrato seco podem ser utilizadas a adição de ajuvantes de secagem, tais como dióxido de silício coloidal, derivados da celulose, amido e derivados, açúcares como maltodextrose, lactose, entre outros. É particularmente útil o emprego de dióxido de silício coloidal, em proporção que variam de 0,05-90%, preferentemente entre 20-30%. A mistura pode ser realizada utilizando-se diferentes equipamentos, tais como tanques com diferentes tipos de agitação, com ou sem adição de solventes, tais como etanol, água, glicerina, propilenoglicol, acetona, entre outros, preferentemente o etanol. Quanto ao método de secagem podem ser empregados métodos como a nebulização (spray dryer), estufa de ar circulante, estufa a vácuo, liofilização, entre outros. A secagem pode ocorrer em temperaturas de 20-200°C, preferentemente até de 130-170°C no método de spray dryer, de 30-70°C em estufas de ar circulante e a vácuo.

Realizações preferidas da presente invenção para obtenção de um extrato seco padronizado estão detalhadas no Exemplo I.

Uma etapa de fracionamento de um extrato padronizado, de acordo com a presente invenção, pode ser especialmente útil para concentração da(s) substância(s) potencialmente(s) relacionada(s) à atividade farmacológica da espécie. Mais particularmente, torna-se útil o emprego de cromatografia em coluna aberta ou do tipo flash, com diferentes suportes cromatográficos (por exemplo, sílica, Sephadex®, alumina, celulose e similares) e eluentes adequados ou partição líquido- líquido, empregando-se hexano, diclorometano, clorofórmio, acetato de etila, butanol e similares. Mais preferencialmente, podem ser empregados hexano e acetato de etila, para obtenção de uma fração concentrada relativa à substância de caráter apoiar/polar de um extrato, como o ácido caurenóico.

O processo de obtenção de um extrato padronizado, de acordo com a invenção, exige uma etapa de análise qualitativa e quantitativa por meio de metodologias analíticas devidamente validadas conforme normas oficiais (BRASIL, 2003).

De acordo com a invenção, metodologias analíticas úteis para a caracterização qualitativa e quantitativa incluem, mas não se limitam à cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em papel, cromatografia gasosa (CG), cromatografia em coluna (CC), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), espectrometria de massa (MS), técnicas termo-analíticas e similares.

Um extrato padronizado, de acordo com a presente invenção, apresenta-se com um pó fino, amarelo-esverdeado (Figura 9), o qual pode ser particularmente analisado por CCD, apresentando um perfil cromatográfico característico (Figura 5). A CCD pode ser realizada utilizando placa de sílica GF254, utilizando-se preferencialmente como eluentes a mistura de hexano:acetato de etila na proporção de 80:20 a 95:5, com revelação em câmara de UV e com anisaldeído sulfúrico. A CLAE também apresenta-se como uma ferramenta analítica importante e pode ser realizada dissolvendo-se a amostra em solvente adequado, como acetonitrila, metanol ou água, preferencialmente, metanol:água 50:50, seguido de sonicação por 1-30 min, e filtração por membrana, aplicando-se o mesmo método utilizado na análise do padrão de ácido caurenóico, previamente descrito. De acordo com o sistema, isocrático ou gradiente, o extrato padronizado de S. trilobata, apresenta um perfil cromatográfico característico em 210 nm, conforme demonstrado nas figuras (isocrático- Figura 7 e gradiente-Figura 8).

A seguir será apresentado um exemplos mais detalhados do processo preferido da presente invenção para a obtenção do extrato mole e seco. Os procedimentos propostos e os dados apresentados constituem exemplos representativos das aplicações da presente invenção e não devem ser interpretados como indicativos da limitação do uso do produto.

EXEMPLO I

Processo de obtenção do extrato mole e seco das partes aéreas de S. trilobata

O volume utilizado para a extração teve a correspondência de 10 partes de líquido extrator para 1 de material vegetal. A extração foi feita à temperatura ambiente, pelo método de maceração dinâmica, por 8 h.Para a obtenção do extratrato mole, as partes aéreas são secas, trituradas e classificadas através da passagem por tamis, provendo-se de droga vegetal de tamanho inferior a 50 mm, sendo após submetido à extração com solução hidroalcóolica de etanol/água na proporção de 60:40. A solução foi filtrada em papel de filtro. O filtrado foi concentrado à temperatura máxima de 70°C, em evaporador específico (Bernhauer), sob vácuo (400 mmHg), até obtenção de extrato mole, sem teor alcoólico e teor de sólidos totais de 20% a 40%. Para a obtenção do extrato seco, na seqüência, é adicionado ao extrato, uma quantidade variável de 20 a 30% de adjuvante de secagem em relação ao teor de sólidos do produto final. A mistura foi desidratada em spray-dryer empregando-se disco rotativo centrífugo, a velocidade de alimentação da bomba de 45 Hz1 gerando alimentação de 6,5 litros de concentrado/hora, temperatura de entrada de 150 a 170°C e temperatura de saída de 80-100°C.

O extrato foi submetido à secagem conforme parâmetros descritos acima. Os extratos secos foram analisados quanto a características físicas (cor, densidade, fluxo), teor de umidade e higroscopicidade , resultando em um extrato com perfil cromatográfico por CCD característico (Figura 5), por CLAE (figura 7 e 8) e com atividade farmacológica conforme figura 11.

CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS EXTRATOS PADRONIZADOS -

Os extratos padronizados, de acordo com a presente invenção, podem ser caracterizados quanto sua atividade farmacológica em modelos experimentais dor por nocicepção, hipernocicepção, dor neuropática e inflamação.

Diversos modelos animais podem ser aplicados para a caracterização farmacológica de um extrato com propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias, entre estes encontram-se: 1. Modelos de Hipernocicepção térmica e/ou mecânica de origem inflamatória (induzida pela injeção de carragenina, CFA, PGE2, LPS, epinefrina, etc), neuropática (constrição parcial do nervo ciático, avulsão do plexo braquial, neuropatia diabética) e/ou por câncer (melanoma ou sarcoma); 2. Ensaio de edema de pata e de orelha de rato e/ou camundongo, induzido por diferentes agentes flogísticos; 3. Modelo de Pleurisia, induzida por diferentes agentes flogísticos; 4. Modelos de Hipertermia induzida por LPS; 5. Avaliação de efeitos indesejáveis; e similares (avaliação da atividade locomotora, desempenho motor, temperatura corporal, úlcera gástrica e interferência nos limiares basais de sensibilidade térmica e mecânica, etc).

Extratos padronizados, de acordo com a presente invenção, quando caracterizados quanto sua atividade farmacológica, evidenciam propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias, conforme detalhado a seguir. Para análise farmacológica os extratos secos e o extrato concentrado foram incorporados em cremes não-iônicos (cera Polawax) na concentração de 3%. Foi calculado o fator de correção a fim de eliminar a influência do teor de umidade dos extratos assim como a proporção de adjuvante nos extratos secos. Como controles positivo foram usados cremes contendo ácido caurenóico 0,1% e creme contendo dexametasona 0,5%.

Foi analisado o efeito do tratamento tópico no edema de orelha induzido pelo óleo de cróton (2,5 %) em camundongos.

Os extratos secos (ES001/08, ES002/08 e ES003/08) apresentaram atividade semelhante na inibição do edema, assim como, o efeito dos extratos secos não diferiram significativamente do extrato concentrado (Figura 13). Os resultados mostram que mesmo os extratos secos tendo um menor teor de biomarcador, a atividade farmacológica não foi comprometida.

A partir dos resultados obtidos com o estudo de desenvolvimento do extrato seco de S. trilobata em escala laboratorial, propõem-se o emprego do Aerosil® na concentração de 20% como adjuvante de secagem do extrato concentrado da planta.

O extrato seco obtido com esta formulação apresentou boas características tecnológicas, maior teor de biomarcador e semelhante efeito farmacológico aos demais extratos secos com maior teor deste excipiente.

Os extratos obtidos em escala piloto apresentaram a manutenção da atividade farmacológica (Figura 11).

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DAS MESMAS

Um extrato mole ou seco padronizado de S. trilobata, obtido e caracterizado conforme descrito acima, com ação antinociceptica e/ou antiinflamatória tópica pode ser administrado isoladamente, mas preferencialmente incorporado em uma forma farmacêutica líquida, semisólida, sólida ou adesiva obtida em combinação com um ou mais veículos ou adjuvantes farmacêuticos e processo tecnológico de transformação, resultando em um medicamento fitoterápico eficaz, seguro e com qualidade. Composição farmacêutica líquida para uso tópico, de acordo com a presente invenção, pode conter um extrato padronizado tal como definido acima, em uma quantidade que representa de 0,05 a 90% do peso total da composição, preferencialmente uma quantidade que representa de 0,5 a 20% do peso total da composição na forma de solução ou suspensão e podendo ser administrado na forma gotas, spray ou aerossol, entre outras conhecidas do estado da técnica.

De acordo com a presente invenção, uma composição semisólida para uso tópico, preferencialmente, mas não limitadas a pomadas, ungüentos, cremes, loções, géis, pastas e outras conhecidas do estado da técnica, podem conter um ou mais excipientes farmacêuticos. Tais excipientes podem incluir veículo, umectantes, tensoativos, agentes suspensores, conservantes, antioxidantes, quelantes, corantes e essência.

Tais adjuvantes podem ser constituintes da fase aquosa, constituintes da fase oleosa, emolientes, umectantes, emulsificantes, tensoativos, conservantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes quelantes, ceras auto-emulsionantes, bases para pomadas, corantes, essências e semelhantes, conforme necessário. As quantidades destes veículos ou adjuvantes farmacêuticos podem ser iguais aquelas convencionalmente utilizadas no estado da técnica. Exemplos de constituintes da fase oleosa, agentes de consistência, emulsificantes e ceras auto-emulsionantes incluem, mas não estão limitados a ácido esteárico, álcool cetílico, álcool estearílico, álcool cetoestearílico, álcool cetoestearílico 20oe (20 moles de óxido de etileno), monoestearato de glicerila, monoestearato de propilenoglicol, monoestearato de sorbitano, cera microcristalina, cera autoemulsionante aniônica (por exemplo, Lanette®), cera autoemulsionante não-iônica (por exemplo, Polawax®) e similares. Exemplos de emolientes incluem, mas não estão limitados a miristato de isopropila, óleo mineral, álcool miristílico, palmitato de cetila, palmitato de octila, miristato de miristila, estearato de glicerila, estearato de polioxidoetileno, glicerídios do coco hidrogenados, lanolina, álcoois de lanolina, oleato de decila, outros ésteres e álcoois graxos e similares. Exemplos de constituintes da fase aquosa, agentes de consistência, umectantes e polímeros incluem, mas não estão limitados a carbômero (por exemplo, Carbopol®), ácido poliacrílico (por exemplo, Pemulem®), propilenoglicol, sorbitol, glicerina, silicone e seus derivados e similares. Exemplos de tensoativos incluem, mas não estão limitados a polissorbatos (tween e span) monopalmitato de sorbitano, Iauril sulfato de sódio e similares.

Exemplos de bases para pomadas incluem, mas não estão limitados a lanolina, vaselina, petrolato hidrófilo, pomada amarela, pomada branca, pomada hidrofílica, pomada de polietilenoglicol e similares.

Exemplos de conservantes, estabilizantes, antioxidantes e agentes quelantes incluem, mas não estão limitados a metilparabeno, ,propilparabeno, butilparabeno, cloreto de benzalcônico, cloreto de benzetônio, fenoxietanol, fenoxietanol + parabenos (por exemplo, Phenonip®), imidazolidiniluréia (por exemplo, Germall®), imidazolidiniluréia + iodopropinil butilcarbamato (germall plus®), ácido edético, EDTA dissódico, ácido ascórbico, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio e similares.

Um exemplo de composição farmacêutica na forma de creme pode ser obtido pela formulação descrita no quadro 2.

Quadro 2. Exemplo de solução contendo extrato padronizado de S. trilobata para uso tópico.

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De acordo com a presente invenção, uma composição líquida para uso tópico, preferencialmente, mas não limitadas a soluções e suspensões podem conter um ou mais excipientes farmacêuticos. Tais excipientes podem incluir veículo, umectantes, tensoativos, agentes suspensores, conservantes, antioxidantes, quelantes, corantes e essência. Exemplos de veículo incluem, mas não estão limitados a água, etanol, propilenoglicol, vaselina líquida, óleos vegetais, entre outros. Exemplos de umectantes incluem, mas não estão limitados a propilenoglicol, polietilenoglicol, glicerina, miristato de isopropila, óleo mineral, álcool miristílico, palmitato de cetila, palmitato de octila, miristato de miristila, estearato de glicerila, estearato de polioxidoetileno, glicerídios do coco hidrogenados, lanolina, álcoois de lanolina, oleato de decila, outros ésteres e álcoois graxos e similares, entre outros. Exemplos de tensoativos incluem, mas não estão limitados a polissorbatos como tweens e spans, monoestearato de glicerila, Iauril sulfato de sódio e similares, entre outros. Exemplos de agentes suspensores incluem, mas não estão limitados a derivados da celulose, amidos e derivados, gomas, entre outros. Exemplos de conservantes, antioxidantes e quelantes incluem, mas não estão limitados a metilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, cloreto de benzalcônico, cloreto de benzetônio, fenoxietanol, fenoxietanol + parabenos (por exemplo, Phenonip®), imidazolidiniluréia (por exemplo, Germall®), imidazolidiniluréia + iodopropinil butilcarbamato (germall plus®), ácido edético, EDTA dissódico, ácido ascórbico, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio e similares.

Um exemplo de composição farmacêutica na forma de solução ou suspensão pode ser obtido pela formulação descrita no quadro 3 ou 4, respectivamente. Quadro 3. Exemplo de solução contendo extrato padronizado de S. trilobata para uso tópico.

<table>table see original document page 28</column></row><table> Quadro 4. Exemplo de suspensão contendo extrato padronizado de S. trilobata para uso tópico.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

De acordo com a presente invenção, uma composição sólida para uso tópico, preferencialmente, mas não limitada a pó pode conter um ou mais excipientes farmacêuticos. Tais excipientes podem incluir diluentes como talco, amido, derivados da celulose, óxido de zinco entre outros.

Composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção podem ser obtidas por processos farmacêuticos industriais e operações unitárias conhecidas da técnica tais como, mas não limitados a mistura, moagem, levigação, micronização, lubrificação, molhagem, dissolução, emulsificação e homogeneização.

Para preparação de um creme (Quadro 2) os componentes são fracionados; os itens B, C, E e F são aquecidos até 80 0C em tanque homogenizador sob aquecimento. Na seqüência adiciona-se 50% do volume necessário de água (H) contendo o item G, mantido sobre agitação e aquecimento para emulsificação; adiciona-se o volume de água restante sob agitação. Separadamente, em tanque homogeneizador, leviga-se o extrato (A) com o item D e incorpora-se na emulsão base e homogeneíza-se.

Para preparação de uma solução (Quadro 3) os componentes são fracionados e, em tanque de agitação, o extrato (A) é dissolvido em B e C, juntamente com D. Na seqüência adiciona-se à mistura, gradualmente e sob agitação constante a água purificada até o volume final pretendido e filtra-se. Para preparação de uma suspensão (Quadro 4) os componentes são fracionados e, em tanque homogenização, o extrato (A) é misturado com B e C. Na seqüência adiciona-se à mistura, gradualmente e sob agitação constante, uma parte de G e os demais componentes. Em seguida acrescenta-se o restante de G até o volume final pretendido. Por agitação mecânica procede-se até homogeneização completa da mistura.

Claims (37)

1. PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" caracterizado por compreender o uso do ácido caurenóico como o biomarcador mais apropriado.

2. PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender as seguintes etapas: I. Isolamento, II. Purificação, e III. Caracterização do marcador.

3. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" caracterizado pelo fato do isolamento do biomarcador ácido caurenóico (etapa II) poder ser realizado empregando-se, seqüencialmente, as técnicas de partição líquido-líquido e cromatografia em coluna aberta.

4. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de compreender diferentes fases estacionárias (sílica, sephadex-LH20. quitina, etc.), preferencialmente a sílica e misturas de solventes como eluente (hexano, diclorometano, acetona, acetato de etila), preferencialmente de Hexano:Acetato de Etila (100:0 a 0:100), e preferencialmente na proporção 85:15; ou cromatografia em coluna tipo flash, ou CLAE preparativa ou semi-preparativa utilizando colunas de fase normal ou reversa, preparativa ou semi-preparativa.

5. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" caracterizado pelo fato de a purificação do biomarcador ácido caurenóico (etapa II) poder ser realizada por técnicas que incluem dissolução e recristalização com solventes como hexano, metanol, acetato de etila, entre outros, com ou sem aquecimento.

6. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de compreender preferencialmente a purificação do biomarcador através de lavagem e recristalização com hexano.

7. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" de acordo com a reivindicação 1 (etapa III), caracterizado pelo fato de compreender a análise por CLAE utilizando como fase estacionária, coluna analítica de fase reversa, utilizando o modo isocrático, com eluente consistindo de MeOH: ACN::água pH 2,6 na proporção de 35:45:17, em fluxo de 0,3-2,0 mL/min, preferentemente a 1,0 mL/min, em temperatura de 20-60°C, preferentemente a 35°C, com detecção do pico de 200-300 nm, preferentemente em 210 nm ou, no modo gradiente, utilizando-se ainda outros solventes como tetrahidrofurano, álcool propílico, entre outros (Quadro 1).

8. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" caracterizado pelo fato de sua caracterização (etapa III) poder ser realizada por técnicas que incluem também, mas não se limitam à ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio e de carbono-13, espectrofotometria no infravermelho (IV), espectrofotometria no ultravioleta (UV), CLAE, CCD, análises térmicas.

9. "PROCESSO DE ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOMARCADOR" caracterizado por alcançar um teor de pureza do biomarcador equivalente a aproximadamente > 90%.

10. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DE S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" caracterizado por compreender um extrato mole ou seco padronizado em relação a um de seus biomarcadores principais.

11. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DE S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) coleta, secagem e subdivisão do material vegetal; b) extração com solvente extrator; c) filtração do extrato; d) concentração do extrato (extrato mole) e secagem (extrato seco); e) análise qualitativa e quantitativa (padronização) do extrato.

12. PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DE S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ΑΝΤΙ IN FLAM ATÓRI O" de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de estabilização do extrato.

13. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 11 (etapa c), ser caracterizado pelo fato do procedimento ser selecionado de um grupo consistindo de, mas não limitado a filtração em profundidade ou filtração em superfície, empregando-se diferentes tipos de materiais filtrantes, para eliminação dos resíduos do material vegetal, como papel de filtro, membranas poliméricas e similares

14. PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DE S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de fracionamento de um extrato padronizado.

15. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" caracterizado pelo fato do extrato padronizado, compreender na sua constituição uma concentração de 0,2 a 2 % de flavonóides totais.

16. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato, compreender uma concentração de ácido caurenóico de 0,05 a 15% da sua constituição, preferentemente, entre 5-8%

17. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trílobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" caracterizado por compreender preferencialmente as etapas de; a) trituração; b) classificação através da passagem por tamis, provendo-se de droga vegetal preferencialmente de tamanho inferior a 50 mm; c) Extração preferencialmente por maceração dinâmica, à temperatura ambiente, por 8 h.; d) Filtração por papel de filtro e) Concentração do extrato; f) Secagem por spray dryer.

18. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trílobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 17 (etapa c), caracterizado pelo fato de compreender preferencialmente solução hidroalcoólica 60% V/V.

19. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trílobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" caracterizado pelo fato da extração ser feita à temperatura ambiente, preferencialmente pelo método de maceração dinâmica por 8 h.

20. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trílobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 17 (etapa e), caracterizado por compreender o uso de um grupo consistindo de, mas não limitado a evaporação sob pressão reduzida, evaporação por convenção de calor e similares, preferencialmente a pressã<£% - reduzida, à temperatura máxima de 70 0C, sob vácuo (400 mmHg), até obtenção de extrato mole, sem teor alcoólico e teor de sólidos totais de 20% a 40%.

21. PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 17 (etapa f), caracterizado pelo fato de serem empregados métodos como a nebulização (spray dryer), estufa de ar circulante, estufa a vácuo, liofilização, entre outros. A secagem pode ocorrer em temperaturas de 20-200°C, preferentemente até de 130-170°C no método de spray dryer, de 30-70°C em estufas de ar circulante e a vácuo.

22. "PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 17 (etapa f), caracterizado pelo fato de consistir na obtenção do extrato seco das partes aéreas secas por spray dryer da planta S. trilobata as seguintes etapas; a) adicionar preferencialmente de 20% a 30% de adjuvante de secagem ao teor de sólidos do produto final do extrato mole; b) desidratar em spray-dryer empregando-se preferencialmente disco rotativo centrífugo, a velocidade de alimentação da bomba de 45 Hz, gerando alimentação de 6,5 litros de concentrado/hora, temperatura de entrada de 150 a 170°C e temperatura de saída de 80-1OO0C.

23. ""PROCESSO DE OBTENÇÃO DO EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por compreender preferencialmente o emprego do dióxido de silício coloidal na concentração de 20% como adjuvante de secagem do extrato concentrado da planta.

24. "EXTRATO PADRONIZADO DA PLANTA S. trilobata COM PROPRIEDADES ANTINOCICEPTIVAS E ANTIINFLAMATÓRIO" caracterizado pelo fato de o extrato padronizado de S. trilobata, apresentar um perfil cromatográfico característico em 210 nm. (isocrático - Figura 7 e gradiente - Figura 8).

25. "CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS EXTRATOS PADRONIZADOS DA PLANTA S. trilobata" caracterizado pelo fato de compreender propriedades antinociceptivas e antiinflamatórias.

26. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender ação antinociceptica e/ou antiinflamatória tópica podendo ser administrado isoladamente, mas preferencialmente incorporado em uma forma farmacêutica líquida, semisólida, sólida ou adesiva obtida em combinação com um ou mais veículos ou adjuvantes farmacêuticos.

27. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender o uso do extrato padronizado, em uma quantidade que representa de 0,05 a 90% do peso total da composição, preferencialmente uma quantidade que representa de 0,5 a 20% do peso total da composição na forma de solução ou suspensão e podendo ser administrado na forma gotas, spray ou aerossol, entre outras conhecidas do estado da técnica.

28. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender na sua preparação como bases para pomadas, não estão limitadas a: lanolina, vaselina, petrolato hidrófilo, pomada amarela, pomada branca, pomada hidrofílica, pomada de polietilenoglicol e similares.

29. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender na sua preparação de constituintes da fase aquosa, agentes de consistência, umectantes e polímeros, não estão limitados a carbômero (por exemplo, Carbopol®), ácido poliacrílico (por exemplo, Pemulem®), propilenoglicol, sorbitol, glicerina, silicone e seus derivados e similares.

30. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender na sua preparação de tensoativos, que incluem, mas não estão limitados a polissorbatos (tween e span) monopalmitato de sorbitano, Iauril sulfato de sódio e similares.

31. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender na sua preparação, conservantes, estabilizantes, antioxidantes e agentes quelantes, que incluem, mas não estão limitados a metilparabeno, ,propilparabeno, butilparabeno, cloreto de benzalcônico, cloreto de benzetônio, fenoxietanol, fenoxietanol + parabenos (por exemplo, Phenonip®), imidazolidiniluréia (por exemplo, Germall®), imidazolidiniluréia + iodopropinil butilcarbamato (germall plus®), ácido edético, EDTA dissódico, ácido ascórbico, bissulfito de sódio, metabíssulfito de sódio e similares.

32. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender composição semisólida contendo extrato padronizado de S. trilobata para uso tópico - quadro 2 - composição farmacêutica na forma de creme: a) Extrato padronizado de S. trilobata 3% b) Cera não-iônica: 15% c) Álcool de Ianolina acetilado: 3% d) Propilenoglicol: 5% e) Metilparabeno: 0,1% f) Propilbarabeno: 0,1% g) EDTA: 0,1% h) Água purificada q.s.p.: 100%

33. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender composição líquida contendo extrato padronizado de S. trilobata para uso tópico - quadro 3 - composição farmacêutica na forma de solução: a) Extrato padronizado de S. trílobata: 10% b) Etanol: 10% c) Propilènoglicol: 5% d) Metilparabeno: 0,1% e) Água purificada q.s.p.: 100%

34. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" caracterizado por compreender composição líquida contendo extrato padronizado de S. trílobata para uso tópico - quadro 4 - composição farmacêutica na forma de suspensão: a) Extrato padronizado de S. trílobata: 30% b) Tween 40: 3% c) Propilenoglicol: 5% d) Hidroxieticelulose: 0,8% e) Metilparabeno: 0,1% f) Propilbarabeno: 0,1% g) Água purificada q.s.p.: 100%

35. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" de acordo com a reivindicação 32 caracterizado pelo fato de compreender na preparação do creme os seguintes componentes fracionados; a) Os itens B, C, E e F são aquecidos até 80 0C em tanque homogenizador sob aquecimento. b) Na seqüência adiciona-se 50% do volume necessário de água (H) contendo o item G1 mantido sobre agitação e aquecimento para emulsificação; c) Adiciona-se o volume de água restante sob agitação. d) Separadamente, em tanque homogeneizador, leviga-se o extrato (A) com o item D e incorpora-se na emulsão base e homogeneíza-se.

36. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" de acordo com a reivindicação 33 caracterizado pelo fato de compreender na preparação da solução ou suspensão os seguintes componentes fracionados; a) Em tanque de mistura, o extrato (A) e o item D são dissolvidos em B e C. b) Na seqüência adiciona-se à mistura, gradualmente e sob agitação, o item E até volume final pretendido.

37. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DA MESMA" de acordo com a reivindicação 34 caracterizado pelo fato de compreender na preparação da solução ou suspensão os seguintes componentes fracionados e; a) Em tanque de homogenização, o extrato (A) é Ievigado em B e C. b) Em tanque auxiliar, os itens EeF são dissolvidos em parte de G1 sob aquecimento e agitação. O item D é disperso nesta solução, sob agitação e aquecimento. c) A dispersão dos itens E, F e D em G, é adicionada gradualmente na mistura contendo o extrato (A) e o restante do item G é adicionado até volume final pretendido.