BRPI1003298A2 - processo eletroforÉtico de uma énica etapa, em tubo capilar revestido, para separaÇço acurada de oligonucleotÍdeos ligados a proteinas - Google Patents

Abstract

PROCESSO ELETROFORETICO DE UMA éNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇçO ACURADA DE OLIGONUCLEOTIDEOS LIGADOS A PROTEÍNAS. O objeto desta Patente faz avançar o Estado da Técnica pelas seguintes inovações: - Cria um novo processo eletroforético a ser realizado em capilar de sílica fundida, previamente revestido internamente, por substâncias hifrofílicas neutras, que reduz o processo eletroforético de sete passos obrigatórios, conforme o Estado da Técnica, ao novo processo de uma só corrida eletroforética, de alto poder de separação do composto "proteína - oligonucleotídeo", que permite obter resultados nos quais a proteina amostral, bem como outras substâncias, fique fisicamente bem separado de complexos semelhantes, obtendo-se, portanto, uma estreita faixa de composto, no tubo capilar revestido internamente, composta da proteína amostral ligada, pela mais forte e específica ligação, a pelo menos um oligonucleotideo, eliminando a formação da "janela de coleta" (a fraction collection window), fenômeno típico descrito no Estado da Técnica. 20 - Desenvolvimento de um capilar de sílica fundida revestido internamente por substâncias hidrofílicas neutras, que anulam os efeitos polarizadores das superfícies internas de sílica fundida, dos capilares convencionais, o que elimina o fluxo eletrosmótico, o que serve de base para a criação do novo processo acima descrito, sendo tais substâncias octadecilsilanos, polivinilsiloxanos, ciclodextrinas, celulose, polimetacrilato, aminoácidos, proteínas, peptídeos, poliaminas, outros ácidos orgânicos, e/ou quaisquer outras que tenham propriedades que levem aos mesmos resultados.

Description

"PROCESSO ELETROFORÉTICO DE UMA ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS A PROTEÍNAS."

Campos desta Patente.

· Eletroforese capilar.

• Processo de isolamento, em uma única etapa, por eletroforese capilar, de proteínas ou outras substâncias ligadas a oligonucleotídeos, por tubo capilar revestido internamente por substâncias hidrofílicas neutras.

• Acurácia, rapidez e economia em isolamento de proteínas e outras substâncias ligadas a oligonucleotídeos.

• Eliminação do efeito eletrosmótico em eletroforese capilar.

• Revestimento interno de capilares por substâncias hidrofílicas neutras.

• Desenvolvimento de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade, aptâmeros (aptamers), para proteínas ou outras

moléculas não protéicas.

Estado da Técnica.

A comunidade científica mundial se utiliza do Estado da Técnica de "Separação Eletroforética em Capilar" observando métodos de ação que facilitam as comparações dos resultados encontrados por vários pesquisadores; desta forma, a extensão dos tubos capilares, a tensão aplicada nas extremidades dos mesmos, o pKa das soluções-tampões, bem como as próprias constituições destas e as temperaturas em que se passam as operações, ou seja, os "protocolos de condução" dos experimentos mantêm o princípio de que, "nas mesmas condições, as mesmas causas produzem os mesmos efeitos", o qual fica metodologicamente ampliado para "sob as mesmas condições, efeitos diferentes devem-se a causas diferentes", no caso, nas mesmas condições, o comportamento migratório eletroforético específico de uma substância no interior de um tubo capilar, deve-se à sua especificidade e difere do comportamento de todas as outras substâncias.

Assim, a partir de trabalhos que indiquem seguramente que uma proteína desconhecida, oriunda de uma determinada fonte, à qual é ligada a um ou mais de um oligonucleotídeo presente na biblioteca de oligonucleotídeos, após um determinado tempo de corrida eletroforética em capilar, em condições e aparatus padronizados, tem tal comportamento, a comunidade científica pode iniciar pesquisas certa de está se referindo ao mesmo objeto de pesquisa.

A utilização da biblioteca de oligonucleotídeos para a obtenção de oligonucleotídeos de alta afinidade e especificidade para uma proteína amostrai foi estabelecida em dois trabalhos científicos, independentes, publicados no ano de 1990:

1o - Tuerk & Gold, "Systematic evoiution of Iigands by exponential enrichment: RNA Iigands to bacteriophage T4 DNA polymerase", Science 1990; 249:505-10;

2o - Ellington & Szostak,'7n vitro selectiori of RNA molecules that bind specific ligands", Nature 1990; 346:818-22

Os oligonucleotídeos obtidos receberam da comunidade científica mundiai a denominação "aptamers" traduzido para o português como aptâmeros.

Uma vez firmado e confirmado, experimentalmente, o comportamento específico de uma amostra de uma determinada proteína, ligada a um ou mais de um oligonucleotídeo (aptâmero), em corridas eletroforéticas em capilar, a ocorrência de comportamento idêntico em uma amostra protéica, indica a presença desta proteína específica; é sua "impressão digital".

Consequentemente, o oligonucleotídeo ligado a esta proteína, aptâmero (aptamer), se comporta como um anticorpo específico para a mesma, pois esteve ligado a ela durante toda a corrida eletroforética, podendo ser separado da mesma e reproduzido em quantidades industriais, pelos vários métodos conhecidos, tais como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e a clonagem em bactérias através de vetores de clonagem.

Assim, pela técnica abaixo descrita, podem-se identificar e isolar oligonucleotídeos que agem como aptâmeros (aptamers), anticorpos altamente específicos para determinadas proteínas, fazendo com as mesmas fortes ligações químicas, para revelarem a presença destas, quando em contato com tais oligonucleotídeos.

Pode-se considerar como Estado da Técnica de "Isolamento por eletroforese capilar, de composto formado por um ou mais de um oligonucleotídeo, aptâmeros (aptamers), oriundo da biblioteca de oligonucleotídeos, ligado à amostra protéica", o descrito e patenteado sob o número US 7.672.786 B2, Patente concedida em 2 de março de 2010 que é o seguinte:

- Pelo Estado da Técnica, a obtenção do composto formado pela amostra de proteína ligada fortemente ao seu oligonucleotídeo específico, seu aptâmero (aptamer), em alto grau de pureza, é obtida pelos seguintes oito passos, dos quais os primeiro sete passos são obrigatórios e o oitavo é opcional, para o caso de se desejar a amplificação do aptâmero (aptamer) obtido em grau de pureza:

1o passo - é feita a corrida eletroforética capilar da amostra protéica e o resultado - espaço percorrido e perfil da fração em função do tempo - é registrado,

2o passo - é feita a corrida de amostra da biblioteca de oligonucleotídeos não ligada a qualquer amostra de proteína, a qual contém cerca de 1014 oligonucleotídeos diferentes e o resultado - espaço percorrido e perfil da fração em função do tempo - é registrado,

A ordem destes dois primeiros passos pode ser qualquer e ambos podem ser feitos, simultaneamente, em condições e aparatus idênticos.

3o passo - é feita a corrida eletroforética capilar da amostra protéica após a mesma ter reagido com a amostra da biblioteca de oligonucleotídeos e ter se ligado a um, ou mais de um oligonucleotídeo; embora a condição ideal a ser obtida, ao fim desta terceira corrida eletroforética, seja a nítida separação física, em estreita região ao longo do capilar, de um composto formado por pelo menos um oligonucleotídeo ligado, específica e fortemente, à proteína amostrai, na prática, pelo atual Estado da Técnica, isto não acontece e a separação física deste composto, ao longo do tubo capilar se apresenta ocupando uma larga região do capilar, denominada "janela de coleta" (a fraction collection window).

4o passo - os compostos da proteína amostrai formados pelas ligações desta com um, ou mais de um oligonucleotídeo, que se localizaram na região da "janela de coleta" (a fraction collection window), são isolados e amplificados pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).

5o passo - os oligonucleotídeos obtidos pela amplificação através da técnica de PCR, descrita no 4o passo, acima, são submetidos à quarta corrida eletroforética, em condições idênticas às anteriores e em presença da proteína amostrai, de forma a se obter um composto mais puro na região do tubo capilar denominada, pelo atual Estado da Técnica, de "janela de coleta" (a fraction collection window).

6o passo - os compostos da proteína amostrai formados pelas ligações desta com um, ou mais de um oligonucleotídeo, que se localizaram na região da "janela de coleta" (a fraction collection window) obtidos ao final do 5o passo, são isolados e amplificados pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).

7o passo - os oligonucleotídeos obtidos pela amplificação através da técnica de PCR no 6o passo são submetidos à quinta corrida eletroforética, em condições idênticas e em presença da proteína amostrai, de forma a se obter um composto mais puro em uma posição mais nítida e mais estreita no interior do tubo capilar, na forma de picos, o que tem por finalidade isolar a fração na qual é mais forte a ligação específica do oligonucleotídeo com a amostra protéica submetida à corrida eletroforética, ou seja, obter os aptâmeros (aptamers) em elevado grau de pureza. 8o passo, opcional - os aptâmeros (aptamers), identificados no 7o passo como acima descrito, manifestados na forma de picos na quinta corrida eletroforética, são isolados e submetidos à amplificação para obtenção em quantidades industriais, pelos vários métodos conhecidos, tais como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e a clonagem em bactérias através de vetores de clonagem.

Findos os oito passos do Estado da Técnica descritos acima, são obtidos oligonucleotídeos específicos de alta afinidade, aptâmeros (aptamers), para a proteína amostrai.

Crítica ao Estado da Técnica.

Eis os problemas devidos ao atual Estado da Técnica:

1 - em função das proximidades de valores de polarização elétrica e massas moleculares das substâncias envolvidas há várias ligações mais fracas de oligonucleotídeos com a amostra envolvida, de forma que o resultado não é em forma de pico de concentração do composto formado pela reação da proteína amostrai com um único oligonucleotídeo específico ligante, mas a distribuição dos resultados da corrida eletroforética por um espaço relativamente amplo, no capilar - "janela de coleta" (a fraction collection window) - que significa que a amostra protéica está ligada a vários oligonucleotídeos, em vários graus de força de ligação e que estes compostos variados estão fisicamente localizados nesta região chamada de "janela de coleta" (a fraction collection window) e não exatamente em um único pico nítido e determinado de comportamento eletroforético.

Em outras palavras, isto significa que, nessa corrida eletroforética, não se conseguiu separar, em um único passo, e colocar em exata e diferenciada posição, no tubo capilar, um ligante específico em ligação forte com a proteína amostrai - aptâmero (aptamer) - o que, quando acontece, é demonstrado, no eletroforegrama, em forma de pico de elevação e queda, abruptos.

2 - Como conseqüência desta separação de menor grau de discriminação e de pouca nitidez da separação física das frações de uma corrida eletroforética, o acurado isolamento de uma amostra de uma proteína desconhecida, em ligação forte e específica com um, ou mais de um dos oligonucleotídeos presentes na biblioteca de oligonucleotídeos, exige, para sua acurácia, os oito passos acima descritos que têm como conseqüências:

A - ser um processo demorado,

B - ser um processo com alto grau de risco de contaminação, devido ao grande número de manipulações,

C - ser um processo caro.

3 - Estas grandes desvantagens do Estado da Técnica são devidas aos fenômenos de interação superficial entre a superfície interna, de sílica fundida, de que são feitos os capilares, com a solução aquosa tamponada, utilizada para a execução da corrida eletroforética, que gera o fenômeno denominado fluxo eletrosmótico ou eletrosmose.

O fluxo eletrosmótico é uma conseqüência inseparável da eletroforese realizada em capilares de sílica fundida.

A relação "área da superfície interna do capilar / volume de líquido no interior do mesmo" é muito grande - os capilares têm entre 10 e 100 micra de diâmetro interno - e isto faz com que os fenômenos de interação das superfícies de sílica fundida dos capilares com a solução tampão sejam significativos.

Na superfície interna dos capilares de sílica fundida convencionais, submetidos à ação da água e/ou de soluções-tampões de pH alcalino, os grupos silanóis se ionizam formando uma superfície negativa.

Tal ionização provoca a formação de:

A- uma camada fixa justaposta à superfície interna do capilar, de íons positivos, dos componentes da solução eletroforética, a fim de manter a eletro-neutralidade,

B - uma segunda camada, imediatamente justaposta à primeira, que é difusa e, também, eletricamente positiva. Quando o campo elétrico é aplicado, nas extremidades do capilar, forças elétricas atuam nas cargas da camada difusa e estes cátions arrastam moléculas de água, formando um fluxo que é direcionado para o catodo, enquanto a parede do capilar permanecer negativa.

Este fenômeno denomina-se fluxo eletrosmótico ou eletrosmose.

Como o campo eletrostático empregado na eletroforese é de cerca de 15 kV, aplicado a uma distância de cerca de 50 cm, isto significa um campo elétrico de cerca de 300 V/cm, forte o suficiente para fazer com que ocorra a migração de uma corrente de água em direção ao catodo, corrente esta que flui na direção contrária à do fluxo das moléculas formadas pela união dos oligonucleotídeos e proteínas, que são postas a migrar pela corrida eletroforética, em direção ao anodo do aparatus.

Esta migração do complexo "proteína - oligonucleotídeo" acontece em direção ao anodo em função do grande número de cargas negativas dos íons fosfatos presentes nos oligonucleotídeos.

Assim, pode-se dizer que a velocidade de migração do complexo "proteína - oligonucleotídeo", em direção ao anodo, é uma velocidade menor do que a velocidade com que migraria se não houvesse o fluxo eletrosmótico, isto é, o fluxo da água da "fase móvel", em direção ao catodo, em função da polarização negativa da superfície de sílica fundida do capilar.

O fluxo eletrosmótico, é algo caótico uma vez que é contido pelo estreito diâmetro do capilar de sílica fundida e retarda a migração do complexo "proteína - oligonucleotídeo" em direção ao anodo, de forma que durante o tempo da corrida, vários destes complexos - formados pela proteína ligada a diferentes tipos de oligonucleotídeos - os quais têm cargas e massas moleculares muito próximas, se distanciam muito pouco uns dos outros vindo a formar a mistura de amplo espectro denominada "janela de coleta" (a fraction collection window), isto é, uma extensa região de compostos semelhantes - e, portanto, não puros - que é obtida com o método eletroforético convencional, quando são utilizados capilares de sílica fundida sem revestimento. Avanços trazidos ao Estado da Técnica pelo objeto desta Patente.

O objeto desta Patente, "PROCESSO ELETROFORÉTICO DE ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS", além de se constituir num valioso avanço em relação à Patente requerida de número, PCTBR/2010/000076, de título "PRODUCTION PROCESS OF HIGH AFFINITY AND HIGH SPECIFICITY OLIGONUCLEOTIDES FOR ORGANIC AND INORGANIC MOLECULES", do mesmo autor, faz avançar o Estado da Técnica com as seguintes quatro inovações:

Primeira inovação: - A criação de um novo processo eletroforético, em tubo capilar revestido internamente com substâncias hidrofílicas neutras, conforme é descrito oportunamente neste Relatório, processo este, no qual, em apenas uma única corrida eletroforética, é coletado em alto grau de pureza, um composto formado pela proteína amostrai ligada a um ou mais de um oligonucleotídeo, de alta especificidade e alta afinidade com a amostra protéica, sendo que esse composto se manifesta, no eletroforegrama, em forma de nítido pico de separação e localização no interior do capilar, reduzindo para um só passo, de uma só corrida eletroforética, seis passos do processo de sete passos obrigatórios e um passo opcional, conforme o atual Estado da Técnica;

Segunda inovação: - eliminação da "janela de coleta (a fraction collection window), pela eliminação do efeito eletrosmótico em função do uso de capilar revestido internamente por substâncias hidrofílicas neutras e, consequentemente, da necessidade de se fazer sucessivas corridas eletroforéticas e amplificações pela PCR em que consistem o primeiro, o segundo, o quarto, o quinto, o sexto e o sétimo passos descritos no Estado da Técnica;

Terceira inovação: - diferentemente do descrito pelo Estado da Técnica, no qual, o material de interesse da corrida eletroforética é coletado em ampla região do capilar denominada "janela de coleta (a fraction collection window), neste novo processo é coletada apenas uma parte selecionada e central, da região mais elevada do pico de separação eletroforético do composto formado pela proteína amostrai ligada a um ou mais de um oligonucleotídeo, de alta especificidade e alta afinidade com a amostra protéica, consistindo assim, esta técnica de coleta em uma eficaz técnica de purificação, conforme ilustrado oportunamente pela Figura 2, a qual é responsável, em parte, pela diminuição, para apenas um passo, dos sete passos obrigatórios do processo descrito no Estado da Técnica.

A comparação entre as Figuras 1 e 2 evidencia os avanços no Estado da Técnica trazidos pelo objeto desta Patente.

Quarta inovação: - desenvolvimento de capilares de sílica fundida, revestidos internamente por substâncias hidrofílicas neutras, conforme está descrito oportunamente neste Relatório, para eliminar o efeito eletrosmótico típico de capilares de sílica fundida, para permitirem que, em uma única corrida eletroforética, sejam separados, acuradamente e com alto grau de pureza, os oligonucleotídeos livres da biblioteca universal, dos oligonucleotídeos combinados com proteínas.

Na Figura 1 são mostrados os resultados típicos obtidos em corridas eletroforéticas de acordo com o Estado da Técnica; na Figura 2 são mostrados os resultados típicos obtidos em corridas eletroforéticas de acordo com as inovações do objeto desta Patente.

A Figura 1 deste Relatório é a reprodução fiel, da "Figure 15, Sheet 15 of 16 da U.S. Patent US 7,672,786 concedida em Mar, 2, 2010" e ilustra eletroforegramas típicos do Estado da Técnica e corresponde aos resultados obtidos pelo 2o passo, 3o passo, 5o passo e 7o passo dos sete passos obrigatórios do Estado da Técnica, como anteriormente citado neste documento.

Nesta Figura 1 vemos no painel (D) uma ilustração do 2° passo obrigatório do Estado da Técnica onde se observa o perfil de comportamento eletroforético dos oligonucleotídeos da biblioteca de oligonucleotídeos, não ligados à proteína amostrai, os quais se isolam no pico (Aptamers and non- bound oligonucleotides), após o decurso de 10 minutos; vemos também o painel (A) que representa o terceiro passo obrigatório do Estado da Técnica, no qual a proteína amostrai e a biblioteca de oligonucleotídeos após terem sido postos a reagir, foram submetidos à eletroforese capilar, gerando o fenômeno típico do Estado da Técnica denominado "janela de coleta" (a fraction collection window) que corresponde ao espaço físico do capilar, de sílica fundida e não revestido internamente, contido entre o tempo de 4 minutos e 8 minutos desta corrida específica que, de acordo com o Estado da Técnica, corresponde à região do capilar na qual há maior probabilidade de se encontrar a proteína amostrai ligada a um conjunto de oligonucleotídeos, da biblioteca de oligonucleotídeos, em vários graus de afinidade.

Como se vê no painel (A) desta Figura 1, a quantidade do composto formado pela proteína amostrai ligada aos oligonucleotídeos da biblioteca de oligonucleotídeos, obtida por este Estado da Técnica, se encontra difusa em larga faixa do capilar, formando a "janela de coleta" (a fraction collection window), o que determina que por esta técnica, os oligonucleotídeos aí colhidos deverão ser submetidos ao 4o passo obrigatório do Estado da Técnica, que é amplificação pela PCR.

Na Figura 1, o painel (B) ilustra o 5o passo obrigatório do Estado da Técnica, em que os oligonucleotídeos amplificados pela PCR no 4o passo são colocados juntos com a proteína amostrai em uma nova corrida para uma nova coleta na "janela de coleta" (a fraction collection window), contida entre o tempo de 4 minutos e 8 minutos.

O material coletado é submetido ao 6o passo para a amplificação pela PCR. O produto desta amplificação é submetido ao 7o passo obrigatório, descrito no Estado da Técnica, que é representado pelo painel (C) da Figura 1, onde se podem identificar os oligonucleotídeos de alta afinidade, aptâmeros (aptamers) ligados na proteína amostrai, revelando-se como quatro picos (Complexes of Aptamers with PFTase). Os aptâmeros (aptamers) identificados no 7o passo são isolados e podem ser amplificados pelo 8o passo, opcional, do Estado da Técnica. A Figura 2 é um eletroforegrama típico obtido em corrida eletroforética, em um único passo e de alto poder de discriminação, de acordo com as descrições das inovações objeto desta Patente; nela vemos o Pico (P1) que corresponde aos oligonucleotídeos da biblioteca de oligonucleotídeos que não se ligaram à proteína amostrai e que, em função da eliminação do efeito eletrosmótico, decorrente do uso de capilar de sílica fundida revestido internamente por substâncias hidrofílicas neutras, objeto desta Patente, migraram nos primeiros 3,25 minutos da corrida eletroforética; vemos também, na mesma Figura 2, o Pico (P2), que corresponde à proteína amostrai ligada fortemente a um, ou mais de um oligonucleotídeo sendo que, o espaço (2), localizado entre o Pico (P1) e Pico (P2), corresponde aos vários oligonucleotídeos, de baixa e média afinidades com a proteína amostrai e que dela se desligaram entre 3,25 minutos e 4,75 minutos e que serão desprezados, juntamente como os oligonucleotídeos do Pico (P1); o material a ser coletado pelo processo objeto desta Patente é apenas a fração contida dentro do segmento de extensão variável para coleta (S3), localizado no interior do Pico (P2).

Esta coleta de fração do composto contido no interior do pico (P2) tem seu grau de capacidade de purificação como função da dimensão "espaço- tempo" do segmento de extensão variável para coleta (S3) e é determinada pelo analista em função do grau de purificação que o mesmo quer impor ao processo; quanto maior é a extensão do segmento de extensão variável para coleta (S3), maior é a chance de haver mais de um oligonucleotídeo de alta afinidade e alta especificidade ligado à proteína amostrai; reciprocamente, quanto menor a extensão determinada para o segmento de extensão variável para coleta (S3) menor é esta probabilidade. A comparação dos eletroforegramas, mostrados na Figura 1 e Figura 2, mostra:

1°-o composto da proteína amostrai ligada fortemente a um ou mais de um oligonucleotídeo fica isolado, no interior do capilar revestido, em um nítido pico de concentração, quando utilizado o processo objeto desta Patente, diferentemente do que localizado em uma ampla "janela de coleta" (a fraction collection window), conforme o Estado da Técnica; por isto o processo, objeto desta Patente, reduz os sete passos obrigatórios descritos no Estado da Técnica para uma única etapa para separação acurada de oligonucleotídeos ligados a proteínas;

2o - o surgimento de um agudo pico de concentração do composto formado pela proteína amostrai com os oligonucleotídeos a ela ligados, numa estreita região do interior do capilar revestido, possibilita ao analista uma coleta em alto grau de purificação deste composto.

3o - o comportamento, das substâncias em análise, na corrida eletroforética, quando não sofrem os efeitos do fluxo eletrosmótico, os quais se separam logo no tempo inicial da corrida eletroforética, ao contrário do que acontece quando submetidos à corridas eletroforéticas em capilares não revestidos, conforme o Estado da Técnica.

4o - formação da "janela de coleta" (a fraction collection window) no processo eletroforético convencional, demanda 240 segundos, conforme a Figura 1; e para obtenção do Pico (P2) é de apenas 30 segundos, conforme a Figura 2, que exemplifica as inovações do Estado da Técnica objeto desta Patente.

5o - que, enquanto pelo Estado da Técnica, para a formação da ampla "janela de "coleta" (a fraction collection window) necessária ao recolhimento de material do terceiro e quinto passos e do fim da corrida é de cerca de 900 segundos, com as inovação do Estado da Técnica do objeto desta Patente o tempo total da corrida eletroforética é de apenas cerca de 360 segundos sendo o tempo de coleta de até 30 segundos.

O eletroforegrama do processo objeto desta patente, mostrado pela Figura 2 foi realizado de acordo com o procedimento a seguir descrito.

A proteína Ferritina (Ferritin Protein), obtida do plasma sangüíneo humano, foi usada como proteína amostrai para caracterizar e exemplificar um resultado típico do processo objeto desta Patente. No processo foi utilizada uma biblioteca constituída por 1014 oligonucleotídeos feitos de DNA fita simples comprada da IDT Technologies (USA - http://www.idtdna.com); esta biblioteca é constituída por seqüencias de DNA marcadas com fluoresceína na extremidade (cinco linha) contendo duas regiões conservadas (19-mer e 22-mer) e uma região randômica (39-mer), constituída por uma igual probabilidade de ocorrência dos quatro nucleotídeos A, T, C e G, sendo a seguinte a seqüencia: - 5'-FAM - CTT CTG CCC GCC TCC TTC CNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NGG AGA CGA GAT AGG CGG ACA CT -3\ onde N representa um nucleotídeo aleatório.

Para a realização do processo de eletroforese capilar, objeto desta Patente, exemplificado na Figura 2, foi utilizado um aparato comercial modelo PACE MDQ (Beckman-Coulter, EUA) equipado com laser indutor de fluorescência na freqüência de 480 nm e detector de fluorescência a 520 nm. Os capilares de sílica fundida com revestimento interno, objeto desta Patente, utilizados no processo de eletroforese, tem o seu desenvolvimento descrito abaixo neste relatório. Para o processo exemplificado na Figura 2, o capilar de sílica fundida revestido internamente tem as seguintes especificações: comprimento total de 60 cm; ponto de detecção da fluorescência induzida por laser localizado a 45 cm da extremidade inicial do capilar; diâmetro interno de 75 pm e diâmetro externo de 375 pm.

A Figura 2 mostra o eletroforegrama da corrida eletroforética realizada com oligonucleotídeos da biblioteca dissolvidos em um tampão (Tris-acetate 50 mM de pH 8.2, NaCI 100 mM e MgCI2 5 mM) na concentração final de 100 μΜ e volume final de 5 μΙ , aos quais se adicionou uma amostra de 1 μΙ da proteína Ferritina dissolvida na concentração de 2,4 mg/ml no mesmo tampão da biblioteca de oligonucleotídeos. A amostra da proteína Ferritina misturada com a biblioteca de oligonucleotídeos foi mantida a temperatura de 23°C durante 15 minutos, para posteriormente ser submetida à corrida eletroforética, de forma que esta amostra foi injetada no capilar através de um pulso de pressão de 5 segundos a 0,5 psi. Antes da corrida, o capilar foi lavado durante 5 minutos com uma solução tampão Tris-acetato 50 mM de pH 8.2, que foi o mesmo tampão utilizado durante a corrida eletroforética realizada em um campo elétrico de 18 kV (300 V/cm). O eletroforegrama obtido após 6 minutos de corrida eletroforética em capilar com revestimento interno, objeto desta Patente, é mostrado na Figura 2. Deve ser entendido que a invenção apresentada neste Relatório não deve ser limitada ao exemplo representado pela Figura 2; a invenção permite variadas modificações e arranjos equivalentes para aplicações com outras proteínas além da proteína Ferritina, usada apenas como exemplo neste Relatório. Da mesma forma o processo descrito neste relatório, objeto desta Patente, pode ser aplicada para outras substâncias não protéicas.

A quarta inovação - revestimento das superfícies internas dos capilares de sílica fundida, por moléculas hidrofílicas neutras, objeto desta Patente - tem como objetivo anular os efeitos polarizadores das superfícies de sílica fundida dos capilares convencionais e eliminar o fluxo eletrosmótico.

Nos revestimentos internos dos capilares, por substâncias hidrofílicas são empregadas moléculas que têm a propriedade de se ligarem, por adsorção de superfície, aos grupos silanóis, após um tratamento físico-químico específico da superfície interna dos capilares de sílica fundida e, por isto, anular as forças eletrostáticas que os grupos silanóis ionizados exercem sobre as moléculas de água, eliminando o fluxo eletrosmótico tal como ocorre nas corridas eletroforéticas realizadas com capilares de sílica fundida convencionais e não revestidos internamente.

As moléculas hidrofílicas neutras utilizadas para o revestimento das superfícies internas dos capilares, objeto desta Patente, podem ser octadecilsilanos, polivinilsiloxanos, ciclodextrinas, celulose, polimetacrilato, aminoácidos, proteínas, peptídeos, poliaminas, outros ácidos orgânicos, ou quaisquer outros que produzam o mesmo fenômeno, por produzirem propriedades iguais ou similares.

O processo de revestimento interno das superfícies dos capilares de sílica fundida, objeto desta Patente se passa em três etapas:

Na primeira etapa são realizados os seguintes passos:

1o passo - preenchimento do capilar com HCI na concentração de 12 M, selagem das extremidades do capilar na chama e incubação a 80°C durante 12 horas; 2o passo - lavagem do interior do capilar com água deionizada, seguida de lavagem com propanona, seguida de lavagem com éter dietílico, sendo este processo repetido cinco vezes, utilizando-se de reagentes PA.

3o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio durante uma hora em temperatura ambiente;

4o passo - preenchimento do capilar com uma solução de hidrogeno-fluoreto de amônio (NH4HF2) a 5% em peso por volume, dissolvido em metanol e manutenção em repouso por uma hora, em temperatura ambiente;

5o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio por 30 minutos, a temperatura ambiente;

6o passo - selagem, a chama, das extremidades do capilar e aquecimento entre as temperaturas de 300°C a 400°C, por um período de 3 a 4 horas.

Na segunda etapa são realizados os seguintes passos:

1o passo - tratamento da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de uma solução de amônia, de 0,1 - 0,2 ml / h (6 mM, pH 10), durante 20 horas;

2o passo - lavagem do interior do capilar com água deionizada, seguida de lavagem com HCI (0,1 M) e, finalizada, com uma nova lavagem de água deionizada;

3o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio por 30 minutos a temperatura ambiente;

4o passo - preenchimento do capilar com uma solução de trietoxisilano (1,0 M) dissolvido em dioxano, selagem, a chama, do capilar e incubação do capilar por 90 minutos a 90°C;

5o passo - lavagem da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de 0,1 - 0,2 ml / h de ácido hexacloroplatínico (THF) durante 2 horas, seguida de nova lavagem, por mais 2 horas, com uma solução de THF dissolvido em água (1:1); 6o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio por 30 minutos a temperatura ambiente;

7o passo - lavagem do capilar com tolueno por 5 minutos;

8o passo - tratamento da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de 0,1- 0,2 ml / h de solução de ácido hexacloroplatínico 10 mM, dissolvido em 2-propanol, aquecido a 100°C, durante 90 horas;

9o passo - cerca de 10 lavagens alternadas de ácido hexacloroplatínico e tolueno durante 1 hora.

Na terceira etapa as superfícies internas dos capilares são ligadas às moléculas hidrofílicas neutras escolhidas para fazer os revestimentos internos das mesmas e consta dos seguintes passos:

1o passo - escolha da substância que será usada para o revestimento, que pode ser: - octadecilsilanos, polivinilsiloxanos, ciclodextrinas, celulose, polimetacrilato, aminoácidos, proteínas, peptídeos, poliaminas, outros ácidos orgânicos, ou quaisquer outras que produzam o mesmo fenômeno, por terem as propriedades iguais ou similares;

2o passo - tratamento da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de 0,1- 0,2 ml / h de uma solução da substância escolhida no passo 1, aquecido a 100°C, durante 90 horas. Em síntese, utilizando-se os capilares revestidos internamente por substâncias hidrofílicas conforme descrito acima, neste Relatório, obtém-se o objeto desta Patente - "PROCESSO ELETROFORÉTICO DE UMA ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS" - e o mesmo pode ser aplicado, também, para a análise de componentes de diferentes naturezas e origens, como por exemplo, mas não limitadas a estes exemplos: amostra de origem biológica (sangue, plasma, soro, urina, fezes, líquor, fluídos corporais, sêmem, saliva, biópsia tecidual, líquido inflamatório, excreções nasais, suco gástrico, entre outros), molécula orgânica, proteína, peptídeo natural, peptídeo sintético, ácido nucléico, aptâmero (aptamer), carboidrato, glicoproteína, lipoproteína, organela, célula, vírus, partícula, membrana plasmática, ou outros reagentes separados por eletroforese capilar. Os componentes acima citados podem, também, ser pré-tratados por métodos adequados, mas não limitados a estes tais como lise, congelamento, aquecimento, enriquecimento, filtração e fracionamento.

Os componentes acima citados podem ser identificados por fluorescência, fluorescência induzida por laser, absorbância de luz, propriedades físico- químicas, carga e massa específica. Para separação de componentes de diferentes origens e naturezas através do processo objeto desta Patente, os seguintes parâmetros eletroforéticos podem ser otimizados: temperatura, voltagem, composição do tampão, adição de mediadores de separação eletroforética ao tampão, pH do tampão, dimensões do capilar (comprimento, diâmetro interno, diâmetro externo), composição química do capilar, substância química escolhida para o revestimento interno do capilar.

Os oligonucleotídeos obtidos através do objeto desta Patente - "PROCESSO ELETROFORÉTICO DE UMA ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS A PROTEÍNAS" - podem ser utilizados para:

1- Desenvolvimento de drogas;

2 - Identificação de novas moléculas candidatas em desenvolvimento de drogas;

3 - Desenvolvimento de métodos de diagnóstico in vitro e in vivo;

4 - Desenvolvimento de tratamentos médicos;

- Desenvolvimento de aptâmeros (aptamers);

6 - Desenvolvimento dos seguintes métodos analíticos: PCR, imunoensaios, cromatografia líquida, cromatografia de afinidade, espectometria de massa

ou eletroforese capilar de afinidade;

7 - Identificação de proteínas em análise de proteomas; 8 - Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade para identificação, marcação, purificação e caracterização funcional de macromoléculas tais como proteínas, polissacarídeos, glicoproteínas, hormônios, receptores celulares e membrana plasmática;

10 - Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade para identificação, marcação, purificação e caracterização funcional de moléculas de dimensões condizentes com toxinas, venenos, metabólitos, co- fatores enzimáticos, corantes, conservantes, óligo-elementos, átomos de metais pesados e moléculas inorgânicas;

11 - Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade para aplicações em "kits" laboratoriais de diagnóstico clínico, seleção de células em culturas e tecidos - método de "cell sorting" - sonda para identificação de função de moléculas-alvo, "in vivo" e "in vitro", sonda de marcação em diagnóstico por imagem ou de lâminas para citologia,

histologia e patologia;

12 - Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade, em quantidades industriais para uso como agentes sequestrantes de polímeros sintéticos usados na indústria química e como agentes catalíticos em processos químicos industriais e bioquímicos.

Claims (8)

1. PROCESSO ELETROFORÉTICO DE UMA ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS A PROTEÍNAS", ou outras moléculas não protéicas, que reduz para um só passo, de uma só corrida eletroforética, seis passos do processo de sete passos obrigatórios e um passo opcional, conforme o atual Estado da Técnica e eliminando o efeito eletrosmótico, podendo os oligonucleotídeos obtidos serem utilizados para: Desenvolvimento de drogas; Identificação de novas moléculas candidatas em desenvolvimento de drogas; Desenvolvimento de métodos de diagnóstico in vitro e in vivo; Desenvolvimento de tratamentos médicos; Desenvolvimento de aptâmeros; Desenvolvimento dos seguintes métodos analíticos: PCR, imunoensaios, cromatografia líquida, cromatografia de afinidade, espectometria de massa ou eletroforese capilar de afinidade; Identificação de proteínas em análise de proteomas; Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade para identificação, marcação, purificação e caracterização funcional de macromoléculas tais como proteínas, polissacarídeos, glicoproteínas, hormônios, receptores celulares e membrana plasmática; Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade para identificação, marcação, purificação e caracterização funcional de moléculas de dimensões condizentes com toxinas, venenos, metabólitos, co-fatores enzimáticos, corantes, conservantes, óligo-elementos, átomos de metais pesados e moléculas inorgânicas; Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade para aplicações em "kits" laboratoriais de diagnóstico clínico, seleção de células em culturas e tecidos - método de "cell sorting" - sonda para identificação de função de moléculas-alvo, "in vivo" e "in vitro", sonda de marcação em diagnóstico por imagem ou de lâminas para citologia, histologia e patologia; Produção de oligonucleotídeos de alta afinidade e alta especificidade, em quantidades industriais para uso como agentes sequestrantes de polímeros sintéticos usados na indústria química e agentes catalíticos em processos químicos industriais e bioquímicos, sendo ainda aplicado na análise de amostra de origem biológica (sangue, plasma, soro, urina, fezes, líquor, fluídos corporais, sêmem, saliva, biópsia tecidual, líquido inflamatório, excreções nasais, suco gástrico, entre outros), molécula orgânica, proteína, peptídeo natural, peptídeo sintético, ácido nucléico, aptâmero (aptamer), carboidrato, glicoproteína, lipoproteína, organela, célula, vírus, partícula, membrana plasmática, ou outros reagentes separados por eletroforese capilar e ainda por eliminar a "janela de coleta" (a fraction collection window), caracterizado por ser realizado em uma única corrida eletroforética de apenas cerca de 360 segundos e coletar em alto grau de pureza, um composto formado pela proteína amostrai ligada a um ou mais de um oligonucleotídeo, de alta especificidade e alta afinidade com a amostra protéica, sendo que esse composto se manifesta, no eletroforegrama, em forma de nítido pico (P2) de separação e localização no interior do capilar, dita corrida sendo realizada em tubo capilar revestido internamente com substâncias hidrofílicas neutras.

2. "PROCESSO ELETROFORÉTICO DE UMA ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS A PROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tempo de coleta, obtenção do Pico (P2), ser de aproximadamente 30 segundos.

3. "PROCESSO ELETROFORÉTICO DE UMA ÚNICA ETAPA, EM TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS A PROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo material a ser coletado ser preferencialmente apenas a fração contida dentro do segmento de extensão variável para coleta (S3), localizado no interior do Pico (P2).

4. TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS", caracterizado por suas superfícies internas serem revestidas com moléculas hidrofílicas neutras que podem ser octadecilsilanos, polivinilsiloxanos, ciclodextrinas, celulose, polimetacrilato, aminoácidos, proteínas, peptídeos, poliaminas, outros ácidos orgânicos, ou quaisquer outros que produzam o mesmo fenômeno, por produzirem propriedades iguais ou similares.

5. TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo processo de revestimento das superfícies dos capilares de sílica fundida, se passar em três etapas.

6. TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de na primeira etapa serem realizados os seguintes passos: 1o passo - preenchimento do capilar com HCI na concentração de 12 M, selagem das extremidades do capilar na chama e incubação a 80°C durante 12 horas; 2o passo - lavagem do interior do capilar com água deionizada, seguida de lavagem com propanona, seguida de lavagem com éter dietílico, sendo este processo repetido cinco vezes, utilizando-se de reagentes PA; 3o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio durante uma hora em temperatura ambiente; 4o passo - preenchimento do capilar com uma solução de hidrogeno-fluoreto de amônio (NH4HF2) a 5% em peso por volume, dissolvido em metanol e manutenção em repouso por uma hora, em temperatura ambiente; 5o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio por 30 minutos, a temperatura ambiente; 6o passo - selagem, a chama, das extremidades do capilar e aquecimento entre as temperaturas de 300°C a 400°C, por um período de 3 a 4 horas.

7. TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de na segunda etapa serem realizados os seguintes passos: 1o passo - tratamento da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de uma solução de amônia, de 0,1 - 0,2 ml / h (6 mM, pH 10), durante 20 horas; 2o passo - lavagem do interior do capilar com água deionizada, seguida de lavagem com HCI (0,1 M) e, finalizada, com uma nova lavagem de água deionizada; 3o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio por 30 minutos a temperatura ambiente; 4o passo - preenchimento do capilar com uma solução de trietoxisilano (1,0 M) dissolvido em dioxano, selagem, a chama, do capilar e incubação do capilar por 90 minutos a 90°C; 5o passo - lavagem da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de 0,1 - 0,2 ml / h de ácido hexacloroplatínico (THF) durante 2 horas, seguida de nova lavagem, por mais 2 horas, com uma solução de THF dissolvido em água (1:1); 6o passo - secagem do capilar com um fluxo de Nitrogênio por 30 minutos a temperatura ambiente; 7o passo - lavagem do capilar com tolueno por 5 minutos; 8o passo - tratamento da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de 0,1- 0,2 ml / h de solução de ácido hexacloroplatínico 10 mM, dissolvido em 2-propanol, aquecido a 100°C, durante 90 horas;9° passo - cerca de 10 lavagens alternadas de ácido hexacloroplatínico e tolueno durante 1 hora.

8. TUBO CAPILAR REVESTIDO, PARA SEPARAÇÃO ACURADA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS Á PROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de na terceira etapa serem realizados os seguintes passos: 1o passo - escolha da substância que será usada para o revestimento, que pode ser: - octadecilsilanos, polivinilsiloxanos, ciclodextrinas, celulose, polimetacrilato, aminoácidos, proteínas, peptídeos, poliaminas, outros ácidos orgânicos, ou quaisquer outras que produzam o mesmo fenômeno, por terem as propriedades iguais ou similares; 2o passo - tratamento da superfície interna do capilar com um fluxo contínuo de 0,1- 0,2 ml / h de uma solução da substância escolhida no passo 1, aquecido a 100°C, durante 90 horas.