BRPI1003740A2 - Sequencias de aminoácidos de proteínas imunogênicas detoxificadas, plasmídeo recombinante, formulações farmacêuticas e/ou veterinárias contendo o derivado da toxina termo-lábil (ltk4r) e seus usos - Google Patents

Abstract

SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS IMUNOGÊNICAS DETOXIFICADAS, PLASMÍDEO RECOMBINANTE, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS CONTENDO O DERIVADO DA TOXINA TERMO-LÁBIL (LTK4R) E SEUS USOS. A presente invenção provê sequências de aminoácidos de proteínas imunogênicas detoxificadas (SEQ. ID. Nº1 à SEQ. ID. Nº4) da subunidade A1, atenuada e derivada da toxina termolábil (LT) de Escherichía coli enterotoxigênica (ETEC), contendo alterações de aminoácido na posição 4, particularmente, troca de usina por uma arginina (K4R), combinada (LT4) ou não (LTK4R) a alterações no domínio A2 (K213E, N238D) e na subunidade B (S4T, A46E, E1O2K), seu plasmídeo recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias, preferencialmente, vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso das sequências e/ou plasmideo recombinante que codificam para LT4 e/ou LTK4R como adjuvantes vacinais a outros ativos de interesse e/ou no preparo de formulações vacinais aplicadas no controle profilático ou terapêutico de doenças não-infecciosas e/ou infecciosas.

Description

"SEQÜÊNCIAS DE AMINOACIDOS DE PROTEÍNAS IMUNOGENICAS DETOXIFICADAS, PLASMÍDEO RECOMBINANTE, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS CONTENDO O DERIVADO DA TOXINA TERMO-LÁBIL (LTK4R) E SEUS USOSm Campo da Invenção

A presente invenção provê seqüências de aminoácidos de proteínas imunogênicas detoxificadas (SEQ. ID. N°1 à SEQ. ID. N°4) da subunidade Al, atenuada e derivada da toxina termolábil (LT) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), contendo alterações de aminoácido na posição 4, particularmente, troca de lisina por uma arginina (K4R), combinada (LT4) ou não (LTK4R) a alterações no domínio A2 (K213E, N238D) e na subunidade B (S4T, A46E, E102K), seu plasmídeo recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias, preferencialmente, vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso das seqüências e/ou plasmídeo recombinante que codificam para LT4 e/ou LTK4R como adjuvantes vacinais a outros ativos de interesse e/ou no preparo de formulações vacinais aplicadas no controle profilãtico ou terapêutico de doenças não-infecciosas e/ou infecciosas. Antecedentes da Invenção

Adjuvantes são componentes fundamentais na composição de qualquer formulação vacinai, particularmente para as denominadas vacinas de subunidades que empregam apenas frações acelulares. Embora a pesquisa de novas vacinas tenha crescido de forma geométrica nos últimos anos, o número de adjuvantes atualmente em uso em seres humanos é limitado a combinações de sais de alumínio e cálcio e uma emulsão oleosa.

Muitos compostos de origem bacteriana possuem propriedades adjuvantes. Entre eles se destacam as toxinas termo- lábeis (LT), produzidas por algumas linhagens de Eschenchia coli enterotoxigênica (ETEC), que, ao contrário dos adjuvantes atualmente em uso, exercem seus efeitos quando administrados por diferentes vias incluindo vias parenterais, de mucosa e transcutânea.

Estudos demonstraram que a co-administração de LT a

antígenos solúveis ou particulados resulta em forte aumento de respostas imunológicas tanto em compartimentos sistêmicos como em sítios de mucosa e secreções. Além disto, tais adjuvantes podem favorecer tanto respostas imunológicas humorais (anticorpos), priorizadas em formulações profiláticas convencionais contra patógenos extracelulares, como celulares (linfócitos T CD4+ e CD8+), adequadas a formulações com propriedades terapêuticas e a profilaxia de patógenos intracelulares.

A toxina LT de ETEC é uma proteína oligomérica composta por uma subunidade A de 28 kDa e 5 subunidades B idênticas de 11,5 kDa (STREATFIELD, S. J.; SAN D KVI ST, M.; SIXMAN, T. K.; BAGDASARIAN, M.; HOL, W. G. J.; HIRST, T. R. Intermolecular interactions between the A and B subunits of heat-labile enterotoxin from Eschenchia coli promote holotoxin assembly and stability in vivo. Proe. Natl Aead. Sei. USA, v. 89, p. 12140-12144, 1992). As subunidades B são arranjadas em anel e ligam-se fortemente ao gânglio sídeo GMl e fracamente ao GDlb e a algumas glicoproteínas intestinais, mediando a interação da toxina à célula eucariótica (TENEBERG, S.; HIRST, T- R.; ÂNGSTRÔM, J.; KARLSSON, K. A. Comparison of the glycolipid-binding specificities of cholera toxin and porcine Eschenchia coli heat-labile enterotoxin: identification of a receptor-active non-ganglioside glycolipid for the heat-labile enterotoxin in infant rabbit small intestine. Glycoeonj. J., v. 11, p. 533-540, 1994). Após a ligação à membrana da célula hospedeira, a toxina é endocitada 3/31 : .. . í' : '

e translocada através da célula em um processo envolvendo transporte ^ vesicular trans-Golgi (LENCER, W. I.; CONSTABLE, C.; MOE, S.; JOBLING, M. G.; WEBB, H. M.; RUSTON, S.; MADARA, J. L.; HIRST, T. R.; HOLMES, R. K. Targeting of cholera toxin and Escherichia coli heat labile toxin in polarized epithelia: role of COOH-terminal KDEL. J. Cell Biol., v. 131, p. 951-962, 1995). A subunidade A é responsável pela atividade enzimática da toxina e dentro da célula hospedeira é proteoliticamente clivada, gerando os peptídeos Al e A2 que permanecem ligados até redução da ponte dissulfeto. A cadeia Al catalisa a ADP-ribosilação da proteína estimulatória GTP-Iigante (Gsa) associada ao comolexo enzimàtico da adenilato riria se na superfície basolateral de células epiteliais, resultando em elevação intracelular de AMP cíclico (AMPc). O aumento de AMPc causa secreção de água e eletrólitos para o lúmen do intestino delgado através da interação com dois mecanismos de transporte de íons AMPc-sensíveis, envolvendo co- transporte de NaCl pelas células epiteliais vilosas e secreção eletrogênica Na+-dependente de Cl~ pelas células criptas. Assim, o acúmulo de água e eletrólitos no lúmen do intestino delgado desencadeado pela ação enzimática da LT resulta na diarréia aquosa. A LT pode ainda estimular síntese de prostaglandina de forma dependente ou não de AMPc e estimular o sistema nervoso entérico, ativando a secreção e inibindo a absorção de íons e água (FIELD, M. Regulation of small intestinal ion transport by cyclic nucleotides and calcium. In: FIELD, M.; FORDTRAN, J. S.; SCHULTZ, S. G. (Ed.). Secretory diarrhea. Baltimore: Waverly Press, 1980. p. 21-30).

A capacidade de LT ativar vias de sinalização nas células hospedeiras não está limitada à indução de AMPc e de outros mensageiros secundários. A ligação da subunidade B a receptores gangliosídios pode ainda induzir alterações na composição dos agrupamentos de lipídios associados a proteínas e formados nas membrana externa, principalmente glicoesfingolípídios, resultando em mudanças de transdução de sinais intracelulares que podem culminar em ativação celular, proliferação e diferenciação em vários tipos de células, incluindo células imunológicas (ARCE, S.; NAWAR7 H. F.; RUSSELL, M. W.; CONNELL, T. D. Differential binding of Eschenchia coli enterotoxins LT-IIa and LT-IIb and cholera toxin elicits differences in apoptosis, proliferation, and activation of lymphoid cells. Infect. Immun., v. 73, p. 2718-2727, 2005; de HAAR, L.; HIRST, T. R. Cholera toxin: a paradigm for multi-functional engagement of cellular mechanisms (Review). MoL Membr. Biol.. v. 21. p. 77-92, 2004; MTT,.IAN1 Ε. A.; BREMER, E. G. Regulation of growth factor receptor by gangliosides. Science, v. 160, p. 1-10, 2002).

As propriedades imunogênicas e adjuvantes de LT envolvem a participação da atividade enzimática da subunidade A, da ligação a diferentes receptores das células eucarióticas pelo pentâmero B e da ação reguladora imunologicamente de regiões da toxina ainda pouco estudadas (HAJISHENGALLIS, G.; ARCE, S.; GOCKEL, C. M.; CONNEL, T. D.; RUSSEL, M. W. Immunomodulation with enterotoxins for the generation of secretory immunity or tolerance: applications for oral infections. J. Dent. Res., v. 84, p. 1104-16, 2005). A interação de LT com o sistema imunológico do hospedeiro é apontada também através de outras evidências experimentais: (i) indução em células epiteliais e células do sistema imunológico da produção de citocinas e/ou de moléculas pro-inflamatórias como prostaglandinas e leucotrienos; (ii) aumento da apresentação de antígenos; (iii) indução do aumento de expressão de moléculas co-estimuladoras em células apresentadoras de antígenos (APCs); (iv) promoção da mudança de isotipo de superfície de células B IgM+ para linfócitos B SlgG+ e SlgA+ e (v) capacidade de < 7 7

5/31

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persistir em superfícies de mucosa e aumentar a permeabilidade dos tecidos expostos para a penetração dos antígenos co-administrados aos tecidos adjacentes, onde células do sistema imunológico podem ser encontradas (HIRST, T. R. Cholera toxin and Escherichia coli heat-labile enterotoxin. In: ALOUF, J. E.; FREER, J. H. (Ed.). The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. London: Aeademic Press, 1999. p. 104-129; MARTIN, M.; SHARPE, A.; CLEMENTS, J. D.; MICHALEK, S. M. Role of B7 costimulatory molecules in the adjuvant activity of the heat-labile enterotoxin of Esehenehia coli. J. Immunol, v. 169, p. 1745- 52, 2002; FREYTAG, L. C.; CLEMENTS, J. D. Mucosal adjuvants. Vaeeine, v. 23, p. 1804-13T 2005). Essas propriedades em partp sãn atribuídas ao aumento dos níveis intracelulares de AMPc associado à atividade ADP-ribosilante promovida pela subunidade Al e em parte à capacidade de interação da toxina através da subunidade B a receptores de membrana nas células hospedeiras.

associadas com o efeito adjuvante, posto que, se relatou a existência de mutantes de LT produzidos em laboratório que preservaram suas atividades enzimáticas e de ligação ao GM1, mas apresentaram

atividade adjuvante reduzida (RYAN, E. J.; MCNEELA, E.; PIZZA, M.; RAPPU0LI, R.; OtNEILL, L.; MILLS, Κ. H. G. Modulation of innate and acquired immune responses by Esekeriehia coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflamatory effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity. J. Immunol, v. 165, p. 5750-59, 2000;

FRASER, S. A.; HAAN, LOLKE de; HEARN, A. R.; BONE, H. K.; SALMOND, R. J.; RIVETT, A .J.; WILLIAMS, Ν. A.; HIRST, T. R. Mutant Escheriehia coli heat-labile toxin B subunit that separates toxoid- mediated signaling and immunomodulatory action from trafficking and delivery functions. Infeet. Immun., v. 71, p. 1527-37, 2003;

Outras regiões reguladoras presentes na LT sao também rlt^ 6/31 . ' ' -

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HAJISHENGALLIS, G.; ARCE, S.; GOCKELj C. M.; CONNEL, Τ. D.; RUSSEL, Μ. W. Immunomodulation with enterotoxins for the generation of secretory immunity or tolerance: applications for oral infections. J. Dent. Res., v. 84, p. 1104-16, 2005). No entanto, a real contribuição de cada uma das regiões funcionais da toxina LT para suas propriedades imunológicas ainda não foi totalmente esclarecida.

Um grande avanço no estudo dos mecanismos pelos quais a LT interage e ativa o sistema imunológico ocorreu devido às pesquisas envolvendo análises das atividades funcionais e imunológicas de diferentes mutantes de LT com alterações de aminoácidos pontuais ou com uma das subunidades isoladas (LTA ou LTB). _

Além disso, a construção desses mutantes abriu perspectivas para o uso de LT como adjuvante em formulações vacinais dirigidas para humanos, posto que, a holotoxina intacta e não atenuada causa efeito tóxico desencadeado até mesmo quando pequenas doses são administradas por via de mucosa ou parenteral (FREYTAG, L. C.; CLEMENTS, J. D. Mucosal adjuvants. Vaccinef v. 23, p. 1804-13, 2005).

A LTK63 é um exemplo de um desses mutantes atóxicos e apresenta a substituição de uma serina por uma lisina na posição 63 da subunidade A, região onde o NAD+ interage com a toxina para que o ADP-ribosil possa ser transferido para a proteína Gsa {Dl DI TOMMASO, A.; SALEHTI, G.; PIZZA, M.; RAPPUOLI, R.; DOUGAN, G.; ABRIGNANI, S.; DOUCE, G.; DE MAGISTRIS, Μ. T. Induction of antigen-specific antibodies in vaginal secretions by using a nontoxic mutant of heat-labile enterotoxin as a mucosal adjuvant. Infect. Immun., v. 64, p. 974-979, 1996).

Outro mutante bastante usado em ensaios de imunização em camundongos é a LTR72 (Ala-72-Arg), que possui ainda uma toxicidade residual. Ambos os mutantes acima descritos preservam parcialmente as propriedades adjuvantes de LT e apresentam um padrão de resposta direcionado mais para Thl ou para Th2, respectivamente (RYAN, E. J.; MCNEELA, E.; PIZZA, M.; RAPPUOLI, R.;

0'NEILL, L.; MILLS, Κ. H. G. Modulation of innate and acquired immune responses by Eschenchia coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflamatory effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity. J. Immunoly v. 165, p. 5750-59, 2000; FREYTAG, L. C.; CLEMENTS, J. D. Mucosal adjuvants. Vaccinei v. 23, p. 1804-13, 2005). Apesar disso, os mutantes LTK63 e LTR72 demonstram ser os adjuvantes derivados da enterotoxina LT mais promissores em humano até o momento.

Uma toxina variante, denominada LT4, foi encontrada em um estudo da biodiversidade de linhagens de ETEC isoladas da população brasileira (LASARO, M. A. S.; RODRIGUES, J. F.; MATHIAS- SANTOS, C.; GUTH, B. E.; BALAN, A.; SBROGIO-ALMEIDA, M. E.; FERREIRA, L. C. S. Genetic diversity of heat labile toxin (LT) expressed by enterotoxigenic Eseherichia coli (ETEC) strains isolated from humans. J. Baeteriol, v. 190, p. 2400-10, 2008; RODRIGUES, J. F. Diversidade genética do óperon etx em amostras de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC): determinação da variabilidade das seqüências gênicas e capacidade de síntese da toxina termo-lábil (LT). 173 f. Tese (Doutorado em Microbiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2009). Foi demonstrado um significativo polimorfismo do óperon etx em amostras de ETTEC isoladas de humanos em São Paulo, Rio de Janeiro e Pernambuco. Dentre os 50 sítios polimórficos encontrados no óperon etx através desta pesquisa, trinta resultaram em alterações de aminoácidos na toxina, gerando 16 variantes de LT. O tipo de LT (LTl) mais freqüentemente encontrado foi àã Pr

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compartilhado por 24 das 51 linhagens de ETEC testadas, incluindo

linhagem de referência H10407 e todas as linhagens pertencentes ao sorotipo 06:H 16. A toxina variante LT2 foi a segunda mais freqüente e apresentou um acúmulo de alterações de aminoácidos na subunidade A (S190L, G196D, K213E, S224T), como também um sítio polimórfico na subunidade B (T75A). Apesar das diversas trocas de aminoácidos presentes na LT2, a capacidade de se ligar ao receptor GMl e a atividade citotóxica avaliada por ensaios in vitro e in vivo não foram alteradas (LASARO, M. A. S.; RODRIGUES, J. F.; MATHIAS-SANTOS, C.; GUTH, B. E.; BALAN, A.; SBROGIO-ALMEIDA, M. E.; FERREIRA, L. C. S. Genetic diversity of heat labile toxin (LT) expressed by enterotoxigenic Eschenchia coli (ETEC) strains isolated from humans. J. Bacteriol, v. 190, p. 2400-10, 2008; LASARO, M. A. S.; MATHIAS- SANTOS, C.; RODRIGUES, J. F.; FERREIRA, L. C. S. Functional and immunological characterization of a natural polymorphic variant of a heat-labile toxin (LT-I) produced by enterotoxigenic Eseherichia coli (ETEC). FEMSImmunol Med. Mierobiol., v. 55, p. 93-99, 2009).

entanto, sugeriu que anticorpos anti-LT gerados a partir da imunização de camundongos com a toxina LT2 possuem maior poder de neutralização e maior afinidade aos epítopos tanto de LTl quanto de LT2 em comparação aos anticorpos induzidos em animais tratados com a toxina de referência LT1. Tal fenômeno estaria relacionado à alteração K213E na subunidade A2, posto que apenas este sítio polimórfico encontra-se exposto na superfície da toxina (LASARO, M. A. S.; MATHIAS-SANTOS, C.; RODRIGUES, J. F.; FERREIRA, L. C. S. Functional and immunological characterization of a natural polymorphic variant of a heat-labile toxin (LT-I) produced by

O estudo das propriedades imunológicas desta variante, no M '

enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). FEMS Immunol Med.. Microbiol, v. 55, p. 93-99, 2009).

A toxina variante LT4 apresentou o maior número de sítios polimôrficos na subunidade B (S4T, A46E e E102K) dentre as demais variantes e mais três alterações na subunidade A (K4R, K213E e N238D). Ao contrário da LT2, a variante LT4, em ensaios preliminares, mostrou reduzido efeito tóxico em ensaios de cultura de células eucarióticas e de alça ligada em coelho, sem, no entanto, mostrar alteração na afinidade pelo receptor GMl em ensaios de ELISA competitivo (LASARO, M. A. S.; RODRIGUES, J. F.; MATHIAS-SANTOS,

C.; GUTH, B. E.; BALAN, A.; SBROOIO-ALMEIDA. M F, ; FF.RRFTRA L____________

C. S. Genetic diversity of heat labile toxin (LT) expressed by enterotoxigenic Eseheriehia coli (ETEC) strains isolated from humans. J. Bacteriol, v. 190, p. 2400-10, 2008). A patente européia EP 869.181 trata de uma proteína

imunogênica desintoxicada compreendendo uma seqüência de aminoácidos da subunidade A da toxina da cólera (CT-A), ou seu fragmento ou uma seqüência de aminoácidos de uma subunidade da toxina termo-lábil de Escherichia coli (LT-A) ou seu fragmento, onde o aminoácido na posição correspondente à Pro-106 é substituído por outro aminoácido.

A patente européia EP 941.333 refere-se a uma proteína imunogênica desintoxicada que compreende a seqüência de aminoácidos de uma subunidade A de uma toxina termo-lábil de E. coli (LT-A) ou um fragmento em que pelo menos o aminoácido Ala-72 da subunidade A é mutante, de preferência por substituição de Arginina. O toxóide é útil como uma vacina contra a cepa de E. coli enterotoxigênica e é produzido por meio de DNA recombinante por mutagênese. A patente européia EP 971.738 apresenta adjuvantes parenterais compreendendo mutantes detoxificados para a ADP- ribosilação de toxinas bacterianas, particularmente nas formas das toxinas pertussis (PT), colérica (CT) e termo-lábil de E. coli (LT).

A patente americana US 5.888.810 provê uma proteína de

fusão que compreende a subunidade B da toxina termo-lábil (LT-B) de E. coli e parte de uma flagelina (flaA) proteína de Campylobacter jejuni sendo antigênica e útil para diminuir a colonização de frangos por Campylobacter spp.

O pedido de patente americano US 2008274126 destina-se

ao desenvolvimento, composição e produção de vacinas de mnmsas (oral) para peixes contendo um complexo de proteínas que compreende um antígeno de interesse fusionada a subunidade B da toxina do Vibrio cholerae (TC-B) ou da enterotoxina termo-lábil de E. coli (LT-B). Mais especificamente, a invenção está relacionada aos complexos de proteínas para o fornecimento de antígenos através das mucosas dos peixes para a indução de uma resposta imune.

A publicação internacional WO 2004/020585 descreve composições e métodos para a utilização da toxina termo-lábil de E. coli (LT) e análogos conhecidos como adjuvantes em pássaros.

A publicação internacional WO 2000/37609 trata de polipeptídeos mutantes da toxina termolábil (LT) de E. coli e da toxina de V. cholerae (CT) e os polinucleotídeos que os codificam. A LT mutante e o polipeptídeos CT podem ser facilmente produzidos em plantas e podem ser usados para tratar ou prevenir doenças causadas por E. coli e V. cholerae.

A publicação internacional WO 2007/111500 mostra a invenção no campo da engenharia genética, mais especificamente, para a produção de vacinas de mucosa nos cogumelos através de um método 11/31

para produzir uma vacina de mucosa, incluindo a introdução em uma célula eucariótica (basidiomiceto) de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína imunogênica, compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga a uma subunidade da enterotoxina termo-lábil (LT) de E. coli ou a uma subunidade da toxina colérica (CT) de V. cholerae.

para o desenvolvimento de novas vacinas mais seguras e eficientes. O potencial da enterotoxina LT como adjuvante, principalmente pela via de mucosa, já é bem estabelecido, no entanto, permanece o desafio de tornar este produto bacteriano seguro para uso em humano sem alterar suas propriedades imunológicas.

possível identificar a variante LT4 que de fato apresenta redução na sua toxicidade decorrente de uma drástica diminuição da atividade enzimática (90%) observada a partir de ensaios de ADP-ribosilação. Alterações na interação de LT4 a células Yl em comparação a LT de referência (LTl) foram descartadas. Interessantemente, foi demonstrado que a variante natural com toxicidade reduzida (LT4) apresenta o potencial imunogênico e adjuvante preservados quanto às respostas humorais e celulares, quando a proteína ovalbumina (OVA) foi utilizada como antígeno modelo em imunizações de camundongos pela via nasal.

aminoãcido na posição 4 da subunidade A de LT (troca de uma lisina por uma arginina) capaz de reduzir em 90% a atividade enzimática desta toxina sem afetar as propriedades imunológicas, de modo que as atividades imunogênicas e adjuvantes desencadeadas, por este novo mutante (LTK4R), permanecessem completamente preservadas. Assim,

A pesquisa de novos adjuvantes representa uma prioridade

Em recentes estudos de variantes naturais de LT foi

Neste estudo identificamos também uma alteração de o mutante LTK4R construído com base na variante natural LT4 representa um promissor adjuvante vacinai.

Diante de todo o exposto, a Depositante desenvolveu um mutante LTK4R que representa uma promissora alternativa para o uso de LT como produto biotecnológico com foco em formulações vacinais não apenas para humanos como também para animais de criação de interesse econômico.

Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a comparação das propriedades bioquímicas das toxinas de referência LT1, LTR72 e LTK63 e das toxinas da invenção LT4 e LTK4R. Figura IA 1irrta fntr> dp SnR-.

PAGE a 17% com as LTs purificadas e tratadas (Linhas 2 a 6) ou não (Linha 1) com tripsina por 30 minutos a 37°C; Linhas M: Marcador de massa molecular (Fermentas)j 1 e 2: LTl, 3: LT4, 4: LTK4R, 5: LTR72, 6: LTK63. As figuras IB e IC mostram gráficos dos ensaios de estabilidade das subunidades AeB, respectivamente, das proteínas LTl (■), LT4 (Á) e LTK4R {·) sob tampões com diferentes pHs. As toxinas foram expostas às diferentes condições de pH e, posteriormente, as moléculas não desnaturadas foram detectadas em GMI-ELISA com o uso de anticorpos monoclonais que reconhecem regiões conformacionais das subunidades AeB.

A figura 2 revela a avaliação da cito toxicidade das toxinas purificadas em cultura de células Yl. As proteínas de referência LT1, LTR72 e LTK63 e aquelas em teste LT4 e LTK4R foram incubadas com as células Yl por 8h a 37°C. Células não expostas à LT estão representadas na figura como CN. Valor indicado nas fotos à direita representa a concentração mínima em ng/mL de LT capaz de causar efeito cito tóxico em 50% das células. A figura 3 demonstra a comparação das atividades tóxicas das proteínas LT1, LT4, LTK4R, LTR72 e LTK63 através da análise da produção de AMP cíclico (AMPc) pelas células Yl expostas à 1 Mg de cada enterotoxina.

A figura 4 mostra a comparação das atividades funcionais

das toxinas. (A) ADP-ribosilação in vitro usando como substrato poli- arginina. Nessa avaliação foram usadas as toxinas LTl (■}, LT4 (A) e LTK4R (·). Valores obtidos com LTK4R são diferentes em relação àqueles obtidos com LTl pelo teste í Student (* ρ < 0,05 e ** p< 0,001). (BeC) Representação por histograma de fluorescência da ligação das proteínas LTl (linha cinza claro, figuras B e C), LT4 (linha cinza escnrn, figura B) e LTK4R (linha cinza escuro, figura C) às células Yl. As células foram incubadas a 1 pg de LT por Ih e a marcação foi feita com anticorpo anti-LT de camundongo e anticorpo anti-IgG de camundongo marcado com FITC.

A figura 5 apresenta a avaliação da imunogenicidade das LTs. Comparação entre as toxinas de referências LT1, LTR72 e LTK63 e as da invenção LT4 e LTK4R quanto a habilidade de induzir resposta de IgG sérico anti-LT (A) e S-IgA anti-LT na mucosa (B) após imunização nasal. Fêmeas de camundongos C57BL/6 receberam 3 doses de 10 Mg de cada toxina em 0, 14 e 28 dias. Os soros e os lavados pulmonares foram coletados 2 semanas depois da última dose. Os dados mostrados representam os valores individuais e as médias dos títulos de anticorpos IgG e S-IgA LT-específicos dosados por GMl-ELISA. Foram realizados 1 a 2 experimentos independentes com grupos de no mínimo 6 animais por grupo.

A figura 6 apresenta a avaliação das propriedades adjuvantes das LTs. Camundongos C57BL/6 foram imunizados com 3 doses de OVA apenas ou OVA em combinação com uma das toxinas 14/31

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LTl5 LT4, LTK4R, LTR72 ou LTK63 pela rota nasal em 0, 14 e 28 dias. Os soros e os lavados pulmonares foram coletados após duas semanas da última dose. Os dados mostrados representam os valores individuais e as médias dos títulos de anticorpos IgG (A) e S-IgA (B) OVA-específicos dosados por ELISA e foram debitados do valor médio encontrado para o grupo imunizado apenas com OVA. Foram realizados 1 a 2 experimentos independentes com grupos de no mínimo 6 animais.

Thl/Th2 in vivo. Camundongos C57BL/6 foram imunizados pela via nasal com 3 doses de OVA apenas ou OVA em combinação com uma das toxinas LTl, LT4, LTK4R. LTR72 ou LTK63 pela rr>ta nasal em 0. 14 e 28 dias. Após duas semanas da última dose, os baços dos animais foram coletados e os esplenócitos foram re-estimulados in vitro com OVA inteira (5 μg/mL). Os sobrenadantes foram coletados e as concentrações das citocinas INF-γ e IL-5 foram determinadas por ELISA. A relação INF-γ (bJ/IL-5 (□) está representada na figura. Os dados indicam médias das concentrações das citocinas (± desvio padrão) a partir de dois ensaios independentes.

células T CD8+ OVA-específica induzida pela ação adjuvante das toxinas in wvo. Camundongos C57BL/6 foram imunizados por via nasal com 3 doses de OVA apenas ou co-administrada a uma das toxinas LT. (A) Células T CD8+ presentes nos esplenócitos foram re-estimuladas in vitro com o peptídeo OVA257-264 (2,5 μg/mL) direcionado para células T CD8+ e analisadas para secreção de IFN-γ em ELISPOT. (B) Citotoxidade in vivo gerada em camundongos imunizados com o peptídeo OVA257-264. Após a imunização, 2 χ IO7 células-alvo marcadas com CFSE e sensibilizadas com o peptídeo OVA257-264 foram transferidas para todos os animais e, depois de 24h, as células foram recuperadas e contadas

A figura 7 revela o efeito das toxinas na indução de resposta

A figura 8 mostra a avaliação da resposta imunológica por em citômetro de fluxo. Os resultados representam o percentual dé-V células mortas por células T CD8+ citotóxicas especificas para o peptídeo OVA257-264 em 2 χ IO7 células-alvo. Os dados apresentados em ambas as figuras representam a média de 1 a 2 experimentos independentes com grupos de no mínimo 6 animais.

DescricAo da Invenção A presente invenção prove seqüências de aminoácidos de proteínas imunogênicas detoxificadas (SEQ. ID. N°1 à SEQ. ID. N°4) da subunidade Al, atenuada e derivada da toxina termolábil (LT) de Eschenchia coli enterotoxigênica (EH1EC)f contendo alterações de aminoácido na posição 4r particularmente, troca de Iisina por uma arginina (K4R), combinada (LT4) ou não (LTK4R) a alterações no domínio A2 {K213E, N238D} e na subunidade B (S4T, A46E, E102K), seu plasmídeo recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias, preferencialmente, vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso das seqüências e/ou plasmídeo recombinante que codificam para LT4 e/ou LTK4R como adjuvantes vacinais a outros ativos de interesse e/ou no preparo de formulações vacinais aplicadas no controle profilático ou terapêutico de doenças não-infecciosas e/ou infecciosas.

Em uma primeira realização o presente pedido de patente trata das seqüências de aminoácidos de proteínas imunogênicas detoxificadas, tais como, SEQ. ID. N°1 à SEQ. ID. N°4.

Particularmente, a SEQ. ID N°l, fragmento recombinante 1, constitui-se de dois peptídeos sinais, do polipeptídeo A (1 monõmero na estrutura) e do polipeptídeo B (5 monômeros na estrutura) da toxina derivada da linhagem selvagem de ETEC 1372-1 e denominada LT4, a qual totaliza como holotoxina aproximadamente 86 kDa. A SEQ. ID N°2, fragmento recombinante 2, constitui-se de dois peptídeos sinais, do polipeptídeo A (1 monômero na estrutura) e do polipeptídeo B (5 monômeros na estrutura) da toxina mutante LTK4R, a qual totaliza como holotoxina aproximadamente 86 kDa.

A SEQ. ID N°3, fragmento recombinante 3, é uma proteína

recombinante com 28 KDa, constituída de polipeptídeo estrutural da subunidade A {domínios Ale A2) da toxina LTK4R.

A SEQ. ID N°4, fragmento recombinante 4, é uma proteína recombinante com 22 KDat constituída de polipeptídeo estrutural da subunidade Al enzimaticamente ativa da toxina LTK4R.

Em uma segunda realização a invenção descreve um plasmídeo recombinante pK4R obtido a partir da clivagem por enzimas de restrição (NdeI e Psfl) dos plasmideos pML19 e ρ 1372, os quais são derivados do vetor pBSPKS(-) e possuem os óperons etx das linhagens de EniEC H10407 e 1372-1 respectivamente, gerando uma troca de nucleotídeo na posição +65 do gene etxA e consequentemente uma alteração de códon AAA (Iisina) para AGA (arginina) no polipeptídeo A.

Particularmente, a enzima NdeI digere o óperon etx no gene etxA entre as posições +377 e +383, após o sítio polimórfico responsável pela mudança de códon, enquanto a enzima de restrição Psü cliva o DNA numa região à jusante dos óperon etx.

Como resultado da dupla digestão dos plasmideos ρ 1372 e pML19, foram gerados fragmentos de DNA de tamanhos moleculares iguais a 4.513 pb e 791 pb. O fragmento de 4.513 pb do plasmídeo ρ 1372 e o fragmento

de 791 pb do plasmídeo pML19 foram extraídos do gel de agarose 0,8%, purificados utilizando-se, por exemplo, o kit de extração " QIAquickx Geln e ligados através de enzimas de ligação, tal como T4 Ligase, resultando no plasmídeo recombinante contendo o etxK4R, que coc para a toxina mutante LTK4R.

Em terceira realização, o presente pedido de patente

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destina-se a formulações farmacêuticas e/ou veterinárias contendo a toxina termo-lábil (LT4 e/ou LTK4R), preferencialmente, vacinas. Preferencialmente, as formulações farmacêuticas e/ou veterinárias podem apresentar 10 μg de toxina termo-lábil atenuada LT4 e/ou LTK4R e de 30 μg da proteína alvo como em veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As proteínas alvos podem ser escolhidas entre proteínas de

origem viral, bacteriana e/ou fúngica, bem como, proteínas He natureza não infecciosa.

presente invenção, podem ser administradas por via de mucosa, transcutânea e/ou via parenteral, em particular intranasal.

seqüências e/ou plasmídeo recombinante (LT4 e/ou LTK4R) como adjuvante vacinai a outros ativos de interesse e no preparo de formulações vacinais aplicadas no controle profilático e/ou terapêutico de doenças não-infecciosas e/ou infecciosas.

pode ser empregada como adjuvante vacinai em combinação a diferentes antígenos de interesse médico contra doenças que necessitam de resposta imunológica humoral e/ou celular, posto que sua ação imunológica envolve a ativação de células do sistema imunológico, como linfócitos B e linfócitos T CD4+ e CD8+t e o desenvolvimento de reposta mista Thl/Th2.

As formulações farmacêuticas e/ou veterinárias, da

Em uma quarta realização, a invenção pleiteia o uso das

Em razão da redução no efeito tóxico a presente invenção

Exemplos

A toxina atenuada LTK4R foi construída em laboratório com base no estudo e na caracterização fisiológica e imunológica de urrfat^. variante natural de LT (LT4) com atividade enzimática e citotoxidade drasticamente reduzida devido à troca de aminoácido na posição 4 da subunidade A (lisina por uma arginina). A variante natural LT4 foi encontrado numa pesquisa de biodiversidade brasileira dentro da população de ETEC isolada de crianças assintomáticas ou diarréicas.

Construção das Proteínas Recombiwawtes LT4 e LTK4R

O plasmídeo recombinante ρ 1372, que codifica para a toxina LT4, foi obtido a partir da inserção do produto de ampliflcação do óperon etx da linhagem selvagem de ETEC 1371-1 no vetor pBSPKS(-)

nos sítios de clivagem das enzimas de restrição KpnJ e_Eati__Qs—

iniciadores utilizados na amplificação por PCR continham sítios de clivagem para as referidas enzimas.

O plasmídeo recombinante pK4R foi obtido a partir da clivagem por enzimas de restrição {NdeI e Psü) dos plasmídeos ρ 1372, o qual possui o sítio polimórfico K4R, e pML19, o qual codifica para a proteína LT1, e da ligação de fragmentos resultantes da clivagem de forma que o óperon etx resultante tivesse uma troca de nucleotídeo na posição +65 do gene etxA, o que corresponde a uma alteração de códon AAA (lisina) para AGA (arginina). A enzima Ndel digere o óperon etx no gene etxA entre as posições +377 e +383, após o sítio polimórfico responsável pela mudança de códon, enquanto a enzima de restrição PsiI cliva o DNA numa região à jusante dos óperon etx. Após a dupla digestão dos plasmídeos ρ 1372 e pML19, foram obtidos dois fragmentos para ambos os plasmídeos recombinantes de tamanhos moleculares iguais a 4.513 e 791 pb. O fragmento de 4.513 pb do plasmídeo pl372 e o fragmento de 791 pb do plasmídeo pML19 foram extraídos do gel de agarose 0,8% e purificados utilizando-se o "QIAquick® Gel extraction kit" conforme instruções do fabricante. Os fragmentos purificados foram ligados utilizando-se a T4 Ligase, também, conforme instruções dd, fabricante. Desta forma, obteve-se no final o plasmídeo recombinante contendo o etxK4R, que codifica para a toxina mutante LTK4R. Os demais procedimentos de confirmação da obtenção do plasmídeo recombinante e de transformação em linhagens de E. coli K-12 laboratoriais.

Procedimentos para a Purificação das Proteínas LT4 e LTK4R

As etapas desenvolvidas para a purificação das proteínas LT4 e LTK4R referem-se à preparação da massa celular, extração da LT e cromatografia de afinidade.

Preparação da Massa Celular_

Uma alíquota do estoque congelado da E. coli recombinante, albergando o gene etxl371 ou etxK4R, foi inoculada em 50 mL de meio TB com ampicilina (200 pg/ mL) em erlenmeyer de 50 mL e incubada a 37°C, 250 rpm em agitador orbital por 18 horas. Este pré-inóculo foi utilizado como inóculo de 3 L (4 erlenmeyers de 3 L com 750 mL de meio cada) nas mesmas condições de cultivo do pré-inóculo. A amostra foi centrifugada a 10.000 χ g por 30 minutos a 4°C e a massa celular foi pesada e estocada a -80°C para processamento posterior. Este procedimento rendeu massa celular final de aproximadamente 40 g.

Extração da LT A massa bacteriana foi ressuspensa (10-20%) em tampão TEAN e as células foram lisadas por homogeneização à alta pressão (400-600 psi) utilizando o aparelho Gauton Maulin. O homogenato obtido foi clarificado por centrifugação a 10.000 rpm por Ih a 4°C. O sobrenadante foi micro-filtrado com pré-filtros de fibra de vidro AP20 Millipore. A solução obtida ao final desse processo foi denominada homogenato clarificado que foi aplicada à coluna de cromatografia de afinidade.

Cromatcxsrafia ρε Afinidade por Galactose

A resina Galactose-gel (Pierce, Immobilized D-Galactose Gel) foi empacotada em coluna XK 16/20 da Amersham Biosciences (1,6 cm 0 e 20 cm altura). A cromatografia foi realizada no Ãkta Explorer. A resina foi equilibrada com 10 volumes de coluna (vc) de tampão TEAN com fluxo de 2,5 mL/min. O homogenato clarificado (1 L) foi aplicado à coluna com fluxo de 1,0 mL/min. A fração não adsorvida foi denominada Flgal. A coluna foi re-equilibrada com 10 vc de tampão TEAN e a toxina LT foi eluída com 50 mL de tampão TEAN adicionado de galactose a 300 mM. A fração eluída foi denominada F2gal. A coluna foi regenerada com 5 vc de uréia a 8 M fpH 7.5) e 10 vc de áfnía destilada. Esse material coletado foi denominado fração F3gal. A fração F2Gal foi concentrada em filtros Amicon Ultra-15 (30000 MWCO), quantificada por espectrofotometria e caracterizada por SDS-PAGE a 17%.

AvaliacAo Bioquímica das Toxinas Tratamento com Tripsina

As toxinas (5 Mg) foram tratadas com 150 ng de tripsina (Cultilab) em um volume final de 10 μΐ de TEAN Ix a 37°C. Após 30 minutos de incubação, as amostras foram coletadas e a tripsina inativada pela adição de 60 ng de inibidor da enzima derivado de soja (Sigma Chemical Co). As amostras foram fervidas e, em seguida, caracterizadas por SDS-PAGE a 17%.

Estabilidade Estrutural das Toxinas A estabilidade das toxinas foi avaliada pela exposição de

500 ng de cada LT a soluções de Na2HP04 e/ou CeHsNaaO? com diferentes pHs (pH 9 a pH 1) num volume final de 100 pL e incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente 10 mL de cada toxina foram diluídos em 90 μΐ de PBSlx e aplicados em placas t ■:■ *

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anteriormente sensibilizadas com GMl e bloqueadas com PBS-BSA 0,1%. O GMl-EUSA foi realizado utilizando os anticorpos monoclonais CT17:13 (CT17) e LT39:13:1 (LT39) capazes apenas de reconhecer as subunidades A e B, respectivamente, em suas estruturas conformacionais.

Ensaios com Culturas de Células Yl Ligação das Toxinas às Células Yl

Para a realização deste experimento, células Yl foram cultivadas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (DMEM completo) em garrafas de cultivo e em seguida tripsinizadas. Cerca de 1 χ IO6 células foram expostas às toxinas (1.000 ng) num volume final de 100 μΐ, em DMEM completo durante 30 minutos a 4°C. Após incubação, as células foram lavadas por três vezes em PBS IX com 1% de soro fetal bovino (PBS-SFB) e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos. Nova série de lavagens foi realizada e em seguida foi adicionado soro anti-LT na diluição de 1/500 (título 1 χ IO5) com incubação de 30 minutos para marcação extracelular da toxina. As células foram novamente lavadas, conforme mencionado anteriormente, e incubadas com anticorpo anti-IgG de camundongo marcado com FITC na diluição 1 /100 por 30 minutos. Após mais uma série de lavagens, as células foram ressuspensas em 200 mL em PBS-SFB e examinadas por citometria de fluxo para detecção de fluorescência emitida pelas células marcadas, utilizando o aparelho FACS calibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Os dados foram analisados pelo programa "FlowJo" para a obtenção dos histogramas de fluorescência. Todo o ensaio de marcação foi realizado a 4°C e entre cada lavagem as células foram centrifugadas a 1.600 χ g por 5 minutos.

Ensaio de Avaliação do Efeito Tóxico pelas LTs

Células tumorais adrenais de camundongo Yl foram 22/31 ' ^Cj mantidas em meio "Dulbecco's MEM" suplementado com soro fetal bovino a 10% (Gibco). As células foram repicadas para placas de 96 poços na concentração de SxlO4 células/poço e incubadas a 37°C em atmosfera de CO2 a 5%. Após 16-18h as células foram usadas em ensaios de avaliação da citotoxicidade induzida pelas toxinas através da alteração de morfologia ou da produção de AMP cíclico (AMPc). No primeiro ensaio 100 μί de diluições seriadas (1/2) das toxinas purificadas foram inoculadas nos poços da placa. As placas foram incubadas a 37°C por aproximadamente 8 horas e em seguida analisadas quanto ao efeito característico de LT. A maior diluição da amostra que gerou 50% de alteração de morfologia na célula Yl foi— considerada como o poder citotóxico da LT.

No segundo ensaio, um micrograma de cada toxina foi tratado com 10 ng de tripsina em TEAN a 37°C por 45 minutos e, em seguida, adicionados aos poços com as células Yl. Após incubação, as células foram sujeitas à lise, e os extratos celulares foram usados para quantificação de AMPc por um sistema imunoenzimático (Amersham Life Science). As concentrações de AMPc (pmoL/mL) foram calculados segundo descrição do fabricante. Ensaio de ADP-RibosilaçAo

A atividade de ADP-ribosilação das toxinas foi mensurada pela incorporação de 32P-NAD em material precipitável em ácido tricloroacético (TCA) na presença de poli-L-arginina sintética. As reações foram realizadas a 25°C por 2 horas em 10 μί de tampão fosfato a 25 mM (pH 7,0) contendo 20 mM de ditioeritritol (DTT), 2 μΜ de 32P-NAD (9,25 MBq; 29,6 TBq/mmoL), 1 mg de poli-L-arginina (Sigma Chemical Co) e 1-10 μg de toxina ativada com tripsina. A precipitação da reação com TCA foi preparada em papel Whatman 3MM e a radiação incorporada pela arginina através da transferência do radical 32P-ADP- '.Cj'' Íí"'

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ribosil pela ação enzimática da toxina foi dosada em cintilador.

Ensaio de Imunização

Os camundongos utilizados foram da linhagem C57BL/6, fêmeas de 8 a 12 semanas de idade, obtidos junto ao Biotério de Isogênicos da Parasitologia-ICBII/USP. O protocolo de imunização consistiu da administração nasal de 3 doses com intervalo de 14 dias utilizando 10 μΐ de PBS contendo 30 pg de OVA {Sigma Chemical Co) apenas ou combinada a 10 pg de LTl ou de LTK4R. O sangue foi coletado um dia antes de cada dose e duas semanas após a última. Os soros dos animais foram recolhidos após a coagulação do sangue a 37°C por 30 minutos e retração do coágulo a 4°C por 30 minutos. Após centrifugação refrigerada de 3.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi retirado e estocado a -20°C.

Depois de duas semanas da última dose, os animais foram ainda submetidos à eutanásia e os lavados pulmonares e os baços foram coletados. Para coleta dos lavados pulmonares, foi realizada uma incisão na traquéia dos animais por onde 1 mL de salina foi injetado e, em seguida, recuperado e estocado a -20 0C até detecção dos anticorpos por ELISA.

AvaliacAo da Resposta Humoral

Ewsaio de ELISA para Titulação de Anticorpos Específicos contra

Toxina

GMI-ELISA foi utilizado para detecção de anticorpos específicos contra toxina. Poços alternados de uma microplaca de poliestireno Polisorp (Nunc) foram sensibilizados por 18 horas a temperatura ambiente com 2 yg/mL de GMl (Sigma). As placas foram lavadas três vezes com PBS lx. Após a lavagem foi feito o bloqueio adicionando-se 200 μΐ de BSA a 0,1% em PBS Ix durante 30 minutos a 37°C. Após novo ciclo de lavagens (3x), 100 ng de toxina (LTl) foram . O '* ,Si-'

24/31 ·. [vf/ ·')

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adicionados aos poços e incubados a temperatura ambiente, por 1 hora ff^j a 37°C. Em seguida, uma nova série de lavagens foi realizada e 100 μΐ dos soros ou lavados pulmonares individuais ou em coleção de amostras de um mesmo grupo foram aplicados aos poços e incubados novamente a temperatura ambiente, por 1 hora e 30 minutos a 37°C. As placas foram novamente lavadas 3 vezes com PBS contendo Tween a 0,05% (PBST) e a revelação foi feita com 100 μΐ,/ροςο da solução reveladora por 20 minutos, a temperatura ambiente e no escuro, e interrompida com 50 μι, por poço de ácido sulfúrico a 1 Μ. A leitura da densidade óptica foi realizada a 492 nm em leitor de placa (Multiscan MS- Labsystems). Cada ensaio foi realizado em duplicata em pelo menos três ocasiões separadas. Os títulos foram calculados conforme citado anteriormente.

Ehsaio de ELISA para Titulação de Awticorpos Específicos cohtra

OVA

Poços alternados de uma microplaca de poliestireno Maxisorp (Nunc) foram sensibilizados por 18 horas a temperatura ambiente com OVA (Sigma Chemical Co) 10 pg/mL. As placas foram lavadas três vezes com PBST. Após a lavagem foi feito o bloqueio adicionando-se 200 μΐ de leite 5% em PBST durante 1 hora a 37°C. Após novo ciclo de lavagem (3x), 100 μΐ dos soros ou lavados pulmonares individuais ou em coleção de amostras de um mesmo grupo foram adicionados aos poços e incubados a temperatura ambiente por 1 hora e 30 minutos. Depois de um novo ciclo de lavagem (3x), foram adicionados 100 μΐ do segundo anticorpo aos poços sob as mesmas condições, na diluição para cada anticorpo secundário. Em seguida as placas foram lavadas 3 vezes com PBST e a revelação foi feita com 100 μι/poço da solução reveladora por 20 minutos, a temperatura ambiente 25/31 'Wl e no escuro, e interrompida com 50 μί por poço de ácido sulfúrico a 1 Μ. A leitura da densidade óptica foi realizada a 492 nm em leitor de placa (Multiscan MS- Labsystems). Cada ensaio foi realizado em duplicata em pelo menos três ocasiões separadas. Os títulos foram calculados conforme citado anteriormente.

Avaliação da Resposta Celular Pesquisa de Citocinas por ELISA Para avaliação da produção de citocinas por esplenócitos de animais imunizados frente a um re-estímulo in vitro, os animais foram submetidos à eutanásia após 14 dias da última dose de imunização e seus baços coletados para obtenção dos esplenócitos. Qs baçns foram macerados em 5 mL de RPMI contendo 1% de soro fetal bovino (RPMI 1%) e as células foram centrifugadas a 1.500 rpm e lavadas com RPMI 1%. Depois as células foram tratadas com ACK (1 mL/baço) para remoção das hemácias e novamente lavadas com RPMI 1%. As células foram contadas em câmara de Newbauer e 1 χ IO7 células/mL foram incubadas em estufa de CO2 a 37°C com a presença ou ausência da OVA inteira (5 μ§/πιί) ou com a presença de um dos peptídeos sintéticos MHC-I (Kb)-restrito SIINFEKL (OVA257 264) ou MHC-II (I-Ab)- restrito TEWTSSNVMEERKIKV (OVA265-280) (1,2 Mg/mL) durante 48h. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 1.500 rpm por 10 minutos e os sobrenadantes coletados e estocados a -80°C até serem usados para a dosagem das citocinas por ELISA.

Detecção de Linfócitos T CD8+ IWF-y+ por ELISPOT ÍEnzyme-Liwked Immukosorbewt SpotI

O ensaio ELISPOT foi realizado para detectar células produtoras de citocina IFN-γ específicas para o peptídeo OVA257-264. Esse ensaio detecta citocinas liberadas em resposta a estímulos in vitro no nível de uma única célula. Após duas semanas da última dose do Φ

esquema de imunização, os animais foram submetidos à eutanásia, seus baços retirados e as células utilizadas para o ensaio. As células (2 χ IO5) derivadas dos baços, processados como mencionado anteriormente e derivados de camundongos imunizados, foram adicionadas em cada poço de uma placa de 96 poços (Millipore), previamente sensibilizada com anticorpo monoclonal de captura anti- IFN-γ de rato (BD, Pharmingen). 0 anticorpo de captura foi utilizado na concentração final de 10 μ§/Γηί,. As células foram incubadas por 24h a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 na ausência ou presença do estímulo (1 Mg/mL de peptídeo). No dia seguinte, as células foram desprezadas, a placa lavada 3X com PBS e 5X com PBST e incubada com anticorpo monoclonal anti-IFN-γ de camundongo conjugado a biotina (BD, Pharmingen) na concentração fmal de 2 μg/mL. Após uma noite a 4°C, a placa foi novamente lavada e adicionou-se estreptavidina peroxidase (SIGMA). Após 2h de incubação a temperatura ambiente, a placa foi lavada e submetida ã revelação com uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) por 30 minutos. Os "spots" foram contados com auxílio de uma lupa.

Citotoxicidade in vivo por Lihfócitos T CD8* O ensaio de cito toxicidade in vivo foi realizado para verificar

a presença de células T CD8+ citotóxicas específicas para o peptídeo OVA257 264 em animais imunizados. Após 14 dias da imunização, um grupo de animais não imunizados foi submetido à eutanásia, seus baços foram retirados e processados, como já descrito. As células foram incubadas com 1 μΜ ou 10 μΜ de CFSE (carboxyfluorescein fluorescein diacetate, succinimidyl Ester, Invitrogen) em PBS, por 15 minutos a 37°C. Após a incubação, as células foram lavadas e ressuspensas em meio RPMI acrescido de 1% de soro fetal bovino (RPMI 1%). Ao tubo contendo a população de células marcadas com 10 μΜ de CFSE, foram 27/31 '-ν 'tf*

adicionados 25 μι do peptídeo e incubado por 40 minutos a 37°C. Após esse período, as células foram lavadas com meio RPMI 1% para remoção do peptídeo não ligado e as células foram contadas. Quantidades iguais das duas populações de células marcadas foram misturadas e centrifugadas a 1.500 rpm. O sedimento de células foi ressuspenso em RPMI de modo a conter 2-4 χ IO7 células/200 μΐ^ e injetado em todos os animais imunizados e no grupo não imunizado, pela via do plexo retro orbital.

No dia seguinte, todos os animais foram submetidos à eutanásia e os esplenócitos coletados. As células foram lavadas 3x com

PBS Ix contendo soro fetal bovino a 1% (PBS1%) e ressuspensas em_________

600 μι, de PBS1% e examinadas por citometria de fluxo como anteriormente descrito e os dados foram analisados para a determinação das porcentagens de células marcadas com 1 μΜ ou 10 μΜ de CFSE pelo "FlowJo".

Avaliações Estatísticas

Análises estatísticas foram realizadas com o teste í Student para comparações de médias. Os valores de P < 0,05 foram considerados como indicativo de significãncia estatística. Resultados

Ensaio 1

Um primeiro exemplo de formulação vacinai foi testada em modelo murino, por administração nasal, consistindo no uso da proteína recombinante com seqüência de aminoãcido da toxina padrão LTl com alteração na posição 4 da subunidade A de uma lisina por uma arginina (LTK4R) ou com seqüência de aminoácido da toxina natural LT4, a qual também possui a alteração K4R, co-administrada à proteína OVA.

Ewsaio 2 Os adjuvantes vacinais LT4 e LTK4R poderão, também, ser utilizados em co-administração a antígenos de patógenos extra ou intracelulares ou a antígenos de natureza não infecciosa como alérgenos ou proteínas tumorais.

Ensaio 3

As proteínas LT4 e LTK4R ainda podem ser empregadas em fármacos que necessitem de aumento de permeabilidade tecidual, como medicamentos tópicos.

Os produtos da presente invenção foram caracterizados em um estudo de suas propriedades bioquímicas, funcionais e

imunológicas:_

A variante natural LT4 e o mutante LTK4R apresentam propriedades eletroforéticas em SDS-PAGE semelhante à toxina de referência isolada da linhagem H10407 (LTl). Além disso, apresentam comportamento bioquímico similar à toxina LTl quando avaliadas em ensaios de sensibilidade à tripsina e de estabilidade sob diferentes pHs {figura 1).

Para se avaliar a atenuação toxigênica da variante LT4 e do mutante LTK4R, foram realizados inicialmente ensaios que requerem a funcionalidade tanto da subunidade A quanto da subunidade B através de estudos in vitro com cultura de células Yl. Nestes ensaios, células Yl foram expostas às toxinas purificadas por aproximadamente 8 horas e alterações morfológicas referentes aos efeitos citotônicos foram desencadeadas pelas toxinas LTl (LT de referência), LT4 (variante natural) e LTK4R (LT mutante) (figura 2). Por este ensaio foi constatado que LT4 e LTK4R apresentam atividade toxigênica reduzida em relação à LTl (aproximadamente oito vezes).

Para confirmar esses dados e para obter informações mais precisas em valores sobre as diferenças tóxicas entre LTl e as proteínas Γ13. —---

,ώ Riib:—β·—

de teste LT4 e LTK4R, células Yl foram novamente expostas por<S^-^- diferentes tempos {1, 2 ou 3 horas) às toxinas tripsinizadas e o AMPc produzido pelas células Yl foi quantificado nos extratos celulares. Assim foi possível determinar que LT4 e LTK4R conseguiram reter apenas 27, 50 e 20% da atividade tóxica da LTl após 1, 2 e 3 horas, respectivamente. Na figura 3, demonstra-se a produção de cAMP em células Yl expostas a LTl, LT4 e LTK4R em 1 hora de incubação.

Considerando tais resultados, a mais provável função biológica modificada nas holotoxinas LT4 e LTK4R refere-se à atividade enzimática conferida pela atuação da subunidade A.

Ainda, foi realizado um ensaio que avalia a ação enzimática de LT através do ensaio de ADP-ribosilação. Neste experimento, as toxinas foram ativadas pela tripsina e usadas em reação enzimática contendo um agente redutor para ativação final da toxina, um doador de grupamento ADP-ribosil marcado radioativamente (NAD+-32P) e um substrato rico em arginina (poli-L-arginina). Quanto maior a capacidade da toxina de transferir grupamentos ADP-ribosil marcados radioativamente a moléculas de poli-L-arginina, maior a radioatividade detectada no cintilador em contagem de radiação por minuto (cpm). Os resultados gerados a partir deste ensaio demonstram

que as toxinas LT1, LT4 e LTK4R possuem atividade ADP-ribosilante mesmo com o uso de 1 μg de toxina, entretanto uma quantidade IOx maior de LT4 ou de LTK4R foi necessária para se alcançar o poder ADP- ribosilante de LTl (figura 4a). Para demonstrar que a variante LT4 e o mutante LTK4R

não apresentam alteração na ligação às células eucarióticas foram realizados ensaios de interação das LTs com células Yl. Estas células foram expostas às toxinas LT1, LT4 ou LTK4R e a presença de toxina na superfície destas células foi mensurada através da marcação com anticorpos IgG anti-LT de camundongo e anticorpos anti-IgG de camundongo ligado a FITC e pela detecção de fluorescência por citometria de fluxo. Esse ensaio revelou que LT1, LT4 e LTK4R mostram o mesmo padrão de interação com as células Yl, visto que a intensidade de fluorescência detectada quando células interagiram com LTl foi similar a intensidade das células que tiveram contato com LT4 ou LTK4R (figuras 4b e 4c).

As propriedades imunológicas da variante LT4 e do mutante LTK4R estão preservadas, apesar da drástica atenuação na toxicidade, e podem ser exploradas para o desenvolvimento de vacinas.

O presente pedido de patente apresenta Tima variante natural e um mutante de LT com potencial imunogênico e adjuvante preservado quanto às respostas humorais e celulares quando a proteína OVA foi utilizada como antígeno modelo em imunizações de camundongos pela via nasal. As toxinas LT4 e LTK4R mostram títulos de IgG sérico e IgA de mucosa anti-LT e anti-OVA similares à toxina LTl (figura 5 e 6).

As toxinas LT1, LT4 e LTK4R foram capazes não só de potencializar as respostas humorais e celulares contra a OVA, como também foram capazes de modulá-las para um perfil de resposta mista Thl/Th2 com tendenciamento para Th 1, o que foi discreto no caso de LTl e LTK4R e meus acentuado no caso de LT4, como foi possível constatar pela relação INF-y/IL-5 (produção de citocinas em pg/mL) (figura 7). A produção de INF-γ foi preferencialmente detectada em esplenócitos re-estimulados com peptídeo OVA257-264 e, portanto, foi secretado principalmente por células T CD8+, enquanto a interleucina IL-5 foi produzida por células T CD4+. Além disso, LTl, LT4 e LTK4R foram capazes de estimular a ativação de linfócitos T CD8+ (ELISPOT) em níveis estatisticamente iguais e de ativar in vivo estas células da Py r

31/31

linfóides para um estado efetor de modo também similar. LTK4R induziu porcentagem de Iise OVA-específica por linfócitos T citotóxicos no mesmo nível demonstrado pelo grupo imunizado com LTl, enquanto LT4 potencializou esta resposta em comparação à toxina LTl (figura 8).

Assim, mediante os dados acima apresentados demonstra- se a utilidade da presente invenção (LT4 e LTK4R) para desenvolvimento em laboratório de vacinas contra diversos patógenos com potencial aplicação para humanos e animais de criação. A invenção pode ainda ser aplicada para desenvolvimento de fármacos tópicos. Listagews de Seqüências <110> Nome do requerente: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP

Av. Prof. Luciano Gualberto, Trav. "J", 374, 7o Andar - Cidade Universitária, São Paulo - SP, Brasil, CEP 05508-010, telefone: (11) 3091.4474, fax: (11) 3031.0922, email: pidireto@usp.br <110> FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP

Rua Pio XI, 1500, Alto da Lapa, São Paulo - SP, Brasil, CEP 05468-901, telefone: (11) 3838.4000, fax: (11) 3645.4167, email: pidireto@usp.br

<120> Título da invenção: "SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS IMUNOGÊNICAS DETOXIFICADAS, PLASMÍDEO RECOMBINANTE, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS CONTENDO O DERIVADO DA TOXINA TERMO- LÁBIL (LTK4R) E SEUS USOS"

<160> Número total de SEQ ID NOs: 4 <210> SEQ ID NO: 1 <211> Comprimento: 1148 <212> Tipo: ácido nucléico <213> Organismo: Escherichia colí <400> Seqüência: 1

ATGAAAAATA TAACTTTCAT TTTTTTTATT TTATTAGCAT CGCCATTATA TGCAAATGGC 60 GACAGATTAT ACCGTGCTGA CTCTAGACCC CCAGATGAAA TAAAACGTTC CGGAGGTCTT 120 ATGCCCAGAG GGCATAATGA GTACTTCGAT AGAGGAACTC AAATGAATAT TAATCTTTAT 180 GATCACGCGA GAGGAACACA AACCGGCTTT GTCAGATATG ATGACGGATA TGTTTCCACT 240 TCTCTTAGTT TGAG AAGT GC TCACTTAGCA GGACAGTCTA TATTATCAGG ATATTCCACT 300 TACTATATAT ATGTTATAGC GACAGCACCA AATATGTTTA ATGTTAATGA TGTATTAGGC 360 GTATACAGCC CTCACCCATA TGAACAGGAG GTTTCTGCGT TAGGTGGAAT ACCATATTCT 420 CAGATATATG GATGGTATCG TGTTAATTTT GGTGTGATTG ATGAACGATT ACATCGTAAC 480 AGGGAATATA GAGACCGGTA TTACAGAAAT CTGAATATAG CTCCGGCAGA GGATGGTTAC 54 0

AGATTAGCAG GTTTCCCACC GGATCACCAA GCTTGGAGAG AAGAACCCTÜ GATTCATCAT 600

GCACCACAAG GTTGTGGAAA TTCATCAAGA ACAATCACAG GTGATACTTG TAATGAGGAG 660

ACCCAÜAATC TGAGCACAAT ATATCTCAGG GAATATCAAT CAAAAGTTAA GAGGCAGATA 720

TTTTCAGACT ATCAGTCAGA GGTTGACATA TATAACAGAA TTCGGGATGA ATTATGAATA 780

AAGTAAAATG TTATGTTTTA TTTACGGCGT TACTATCCTC TCTATATGCA CACGGAGCTC 84 0

CCCAGACTAT TACAGAACTA TGTTCGGAAT ATCGCAACAC ACAAATATAT ACGATAAATG 900

ACAAGATACT ATCATATACG GAATCGATGG CAGGCAAAAG AGAAATGGTT ATCATTACAT 960

TTAAGAGCGG CGAAACATTT CAGGTCGAAG TCCCGGGCAG TCAACATATA GACTCCCAGA 1020

AAAAAGCCAT TGAAAGGATG AAGGACACAT TAAGAATCAC ATATCTGACC GAGACCAAAA 1080

TTGATAAATT ATGTGTATGG AATAATAAAA CCCCCAATTC AATTGCGGCA ATCAGTATGA ._U40

AAAACTAG 1148 cf % 3/5

<210> SEQ ID NO: 2 <211> Comprimento: 1148 <212> Tipo: ácido nucléico <213> Organismo; Escherichia coli

<400> Seqüência: 1

AT GAAAAATA TAACTTTCAT TTTTTTTATT TTATTAGCAT GACAGATTAT ACCGTGCTGA CTCTAGACCC CCAGATGAAA ATGCCCAGAG GGCATAATGA GTACTTCGAT AGAGGAACTC

GATCACGCGA TCTCTTAGTT TACTATATAT

GAGGAACACA TGAGAAGTGC ATGTTATAGC

AACCGGCTTT TCACTTAGCA GACAGCACCA

GTCAGATATG GGACAGTCTA AATATGTTTA

CGCCATTATA TAAAACGTTC AAATGAATAT ATGACGGATA TATTATCAGG ATGTTAATGA

TGCAAATGGC CGGAGGTCTT TAATCTTTAT TGTTTCCACT ATATTCCACT TGTATTAGGC

60 120 180 240 300 360

GTATACAGCC CAGATATATG AGGGAATATA AGATTAGCAG GCACCACAAG ACCCAGAATC TTTTCAGACT AAGTAAAATG CCCAGTCTAT ACAAGATACT TTAAGAGCGG

CTCACCCATA GATGGTATCG GAGACCGGTA GTTTCCCACC GTTGTGGAGA T GAGC AC AAT ATCAGTCAGA TTATGTTTTA TACAGAACTA ATCATATACG CGCAACATTT

TGAACAGGAG TGTTAATTTT TTACAGAAAT GGATCACCAA TTCATCAAGA ATATCTCAGG GGTTGACATA TTTACGGCGT TGTTCGGAAT GAATCGATGG CAGGTCGAAG

AAAAAGCCAT TGAAAGGATG AAGGACACAT ATGTGTATGG AATAATAAAA

TTGATAAATT AAAACT AG

GTTTCTGCGT GGTGTGATTG CTGAATATAG GCTTGGAGAG ACAATTACAG AAATATCAAT TATAACAGAA TACTATCCTC ATCGCAACAC CAGGCAAAAG TCCCGGGCAG TAAGAATCAC CCCCCAATTC

TAGGTGGAAT ATGAACGATT CTCCGGCAGA AAGAACCCTG GTGATACTTG CAAAAGTTAA TTCGGAATGA TCTATGTGCA ACAAATATAT AGAAATGGTT TCAACATATA ATATCTGACC AATTGCGGCA

ACCATATTCT ACATCGTAAC GGATGGTTAC GATTCATCAT TAATGAGGAG GAGGCAGATA ATTATGAATA TACGGAGCTC ACGATAAATG ATCATTACAT GACTCCCAAA GAGACCAAAA ATCAGTATGG

420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1148 <210> SEQ ID NO: 3 <211> Comprimento: 720 <212> Tipo: ácido nucléico <213> Organismo: Escherichia coli

<400> Seqüência: 1

AATGGCGACA GATTATACCG TGCTGACTCT AGACCCCCAG ATGAAATAAA ACGTTCCGGA

GGTCTTATGC CCAGAGGGCA TAATGAGTAC TTCGATAGAG GAACTCAAAT GAATATTAAT

CTTTATGATC ACGCGAGAGG AACACAAACC GGCTTTGTCA GATATGATGA CGGATATGTT

TCCACTTCTC TTAGTTTGAG AAGTGCTCAC TTAGCAGGAC AGTCTATATT ATCAGGATAT

TCCACTTACT ATATATATGT TATAGCGACA GCACCAAATA TGTTTAATGT TAATGATGTA

TTAGGCGTAT ACAGCCCTCA CCCATATGAA CAGGAGGTTT CTGCGTTAGG TGGAATACCA

TATTCTCAGA TATATGGATG GTATCGTGTT AATTTTGGTG TGATTGATGA ACGATTACAT

CGTAACAGGG AATATAGAGA CCGGTATTAC AGAAATCTGA ATATAGCTCC GGCAGAGGAT

GGTTACAGAT TAGCAGGTTT CCCACCGGAT CACCAAGCTT GGAGAGAAGA ACCCTGGATT

CATCATGCAC CACAAGGTTG TGGAGATTCA TCAAGAACAA TTACAGGTGA TACTTGTAAT

GAGGAGACCC AGAATCTGAG CACAATATAT CTCAGGAAAT ATCAATCAAA AGTTAAGAGG

CAGATATTTT CAGACTATCA GTCAGAGGTT GACATATATA ACAGAATTCG GAATGAAT TA <210> SEQ ID NO: 4 <211> Comprimento: 576 <212> Tipo: ácido nucléico <213> Organismo: Escherichia coli

<400> Seqüência: 1

AATGGCGACA GGTCTTATGC CTTTATGATC TCCftCTTCTC TCCACTTACT TTAGGCGTAT TATTCTCAGA CGTAACAGGG GGTTACAGAT CATCATGCAC

GATTATACCG CCAGAGGGCA ACGCGAGAGG TTAGTTTGAG ATATAT ATGT ACAGCCCTCA TATATGGATG AATATAGAGA TAGCAGGTTT CACAAGGTTG

TGCTGACTCT TAATGAGTAC AACACAAACC AAGTGCTCAC TATAGCGACA CCCATATGAA GTATCGTGTT CCGGTATTAC CCCACCGGAT TGGAAATTCA

AGACCCCCAG TT CGAT AGAG GGCTTTGTCA TTAGCAGGAC GCACCAAATA CAGGAGGTTT AATTTTGGTG AGAAATCTGA CACCAAGCTT TCAAGA

ATGAAATAAA GAACTCAAAT GATATGATGA AGTCTATATT TGTTTAATGT CTGCGTTAGG TGATTGATGA ATATAGCTCC GGAGAGAAGA

ACGTTCCGGA GAATATTAAT CGGATATGTT ATCAGGATAT TAATGATGTA TGGAATACCA ACGATTACAT GGCAGAGGAT ACCCTGGATT

Claims (15)

1. SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS IMUNOGÊNICAS DETOXIFICADAS DA SUBUNIDADE Al, ATENUADA E DERIVADA DA TOXINA TERMOLÁBIL DE ESCHERICHIA COLI ENTEROTOXIGÊNICA, caracterizadas pelo fato de compreenderem alterações de aminoãcido na posição 4, particularmente, troca de lisina por uma arginina (K4R), combinada (LT4) ou não (LTK4R) a alterações no domínio A2 (K213E, N238D) e na subunidade B {S4T, A46E, E102K).

2. SEQÜÊNCIAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de compreenderem as SEQ. ID. N°1 à SEQ. ID. N04.

3. SEQÜÊNCIAS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fato da SEQ. ID N°l, fragmento recombinante 1, compreender dois peptídeos sinais, o polipeptídeo A (1 monômero na estrutura) e o polipeptídeo B (5 monômeros na estrutura) da toxina derivada da linhagem selvagem de ETEC 1372-1 totalizando aproximadamente 86 kDa.

4. SEQÜÊNCIAS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fato da SEQ. ID N°2, fragmento recombinante 2, compreender dois peptídeos sinais, o polipeptídeo A (1 monômero na estrutura) e o polipeptídeo B (5 monômeros na estrutura) da toxina mutante LTK4R, a qual totaliza como holotoxina aproximadamente 86 kDa.

5. SEQÜÊNCIAS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fato da SEQ. ID N°3, fragmento recombinante 3, compreender uma proteína recombinante com 28 KDa, constituída de polipeptídeo estrutural da subunidade A (domínios Al e A2) da toxina LTK4R. <image>image see original document page 39</image>

6. SEQÜÊNCIAS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fato da SEQ. ID N°4, fragmento recombinante 4, compreender uma proteína recombinante com 22 KDa, constituída de polipeptídeo estrutural do domínio Al da toxina LTK4R.

7. PLASMfDEO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender combinação dos óperons etx das linhagens de ETEC H10407 e 1372-1, gerando uma troca de nucleotídeo na posição +65 do gene etxA e consequentemente uma alteração de códon AAA (Iisina) para AGA (arginina) no polipeptídeo A na posição 4.

8. PLASMÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do plasmídeo compreender fragmentos de DNA de tamanhos moleculares de 4.513 pb e 791 pb ligados por tecnologia de DNA recombinante.

9. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelo fato de compreenderem, preferencialmente, vacinas.

10. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas pelo fato das formulações farmacêuticas e/ou veterinárias compreenderem particularmente cerca de 10 Mg de toxina termo-lãbil atenuada LTK4R e de 30 μg da proteína alvo em veículos farmaceuticamente aceitáveis.

11. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS, de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizadas pelo fato das proteínas alvos compreenderem proteínas de origem viral, bacteriana, fúngica e/ou proteínas de natureza não-infecciosa.

12. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS, de acordo com as reivindicações 9 a 11, caracterizadas pelo fato de compreenderem administrações por via de mucosa, . transcutânea e/ou parenteral, preferencialmente, intranasal.

13. USO, das seqüências e/ou plasmídeos recombinantes, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de compreender a aplicação como adjuvante vacinai a outros ativos de interesse e/ou no preparo de formulações vacinais aplicadas no controle profllático ou terapêutico de doenças não-infecciosas e/ou infecciosas.

14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender a aplicação como adjuvante vacinai a outros ativos de interesse e/ou no preparo de formulações vacinais profllãticas ou terapêuticas.

15. USO, de acordo com as reivindicações 13 e 14, caracterizado pelo fato de compreender a ativação de células do sistema imunológico, como linfócitos B e linfócitos T CD4+ e CD8+, e o desenvolvimento de reposta mista Thl/Th2.