BRPI1004898B1

BRPI1004898B1 - vetor expressão de superfície, microorganismo recombinate, vacina para tratar cervical e método para preparar um microorganismo

Info

Publication number: BRPI1004898B1
Application number: BRPI1004898-7A
Authority: BR
Inventors: Moon-Hee Sung; Haryoung Poo; II Han Lee
Original assignee: Bioleaders Corporation
Priority date: 2009-01-08
Filing date: 2010-01-08
Publication date: 2020-10-13
Also published as: JP2012514469A; US8685721B2; EP2386645A2; KR20100082155A; BRPI1004898A2; CN102341499B; GB2466856A; ES2513440T3; CN102341499A; RU2011133057A; EP2386645B1; WO2010079991A2; RU2492240C2; EP2386645A4; GB0907207D0; WO2010079991A3; GB2466856B; US20110318384A1; PL2386645T3; KR101471043B1

Abstract

vetor expressão de superfície, microorganismo recombinante, vacina para tratar cancer cervical e método para preparar um microorganismo a presente invenção refere-se a um vetor de expressão de superfície para preparar vacinas hpv, em que o vetor de superfície de expressão contém um gene que codifica uma proteína mutante repe tendo uma sequência de aminoácidos de seq id no: 1, um promotor, um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo, e um gene que está ligado com o gene poli-gama-glutamato sintetase complexo e codifica uma proteína associada a indução de tumor antígeno de papilomavírus humano. a invenção provê um vetor de expressão expressando constitutivamente um alto nível de proteína antígeno de papiloma vírus humano (hpv). além disso, a invenção provê bactéria de ácido láctico recombinante, transformada com a expressão do vetor e expressando a proteína antígeno hpv sobre a superfície, e uma composição consistindo de bactéria de ácido láctico recombinante. a bactéria de ácido láctico recombinante e a composição são tão eficazes quanto uma vacina para o tratamento de câncer cervical, porque eles podem ser aplicados na forma oral ou diretamente à vagina.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um vetor de expressão de superfície para preparar vacinas terapêuticas HPV, em que o vetor de expressão de superfície contém um gene que codifica uma proteína repE mutante tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, um promotor, um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo, e um gene que está ligado com o gene poli- gama-glutamato sintetase complexo e codifica uma proteína associada a indução do tumor antígeno de papilomavírus humano.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] Sabe-se que a produção de proteínas úteis estranhas na tentativa de expressar grandes quantidades de proteínas estranhas depende do número de cópias de genes, isto é, o número de plasmídios, e a energia de promotores que são usados para controlar a transcrição. Foi relatado que a expressão de proteínas alvos podem ser aumentadas através da troca do número de vetores plasmídios em bactérias individuais, além de promotores de alta expressão que são convencional e frequentemente usados (Tornio, M. et al,. Appl. Microbiol. Biotecnol., 28: 170, 1988) . Além disso, foi relatado que as mutações RepE em plasmideo mini-F podem mudar o número de 25 plasmideos em bactérias individuais (Yasuo, K. et al., J. Biol. Chem., 267:11520, 1992) .

[003] Estima-se que o papilomavirus (HPV) infecta mais que 50% dos adultos do mundo. Particularmente, foi relatado que quatro tipos de HPV incluindo HPV 16, 18, 31 e 45 causam mais de 80% das causas de câncer cervical (Lowy, D. R. et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 91: 2436, 1994).

[004] O câncer cervical é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres propensas a câncer de mama e, de acordo para OMS (Organização Mundial da Saúde), estima-se que mais de 500.000 novos casos de câncer cervical ocorrem no mundo a cada ano e mais de 300.000 pacientes ao redor do mundo morrem a cada ano de câncer cervical. Especialmente em paises desenvolvidos, o câncer cervical é uma causa de morte que lidera em mulheres (Pisani, P. et ah, Int. J. Câncer, 55: 891, 1993) . O relatório IARC mostrou que o número de pacientes com infecção de HPV crônica em paises desenvolvidos é significantemente maior que em paises avançados e que o modo mais eficaz de erradicar a infecção de HPV é administrar vacinas HPV profiláticas.

[005] O desenvolvimento de vacinas associadas ao câncer cervical tem sido focado em dois tipos de vacinas profiláticas e vacinas terapêuticas. O objetivo das vacinas profiláticas é produzir um anticorpo neutralizante mais potente através do antigeno HPV L1/L2, prevenindo assim um hospedeiro da infecção HPV, e prevenindo a doença de progredir mais, mesmo se já infectado. Por outro lado, a vacina terapêutica atinge o HPV E6/E7 e o objetivo de induzir resposta imune celular especifica para degenerar lesões formadas ou tumores malignos.

[006] Devido a proteina HPV E6/E7 ser um antigeno especifico de câncer associada a carcinogeneses de células infectadas com HPV, estudos sobre o uso da proteina E6/E7 como objetivo da terapia imune de câncer cervical tem sido continua. De fato, há um relato de que quando a proteina HPV E6/E7 sintetizada em um sistema microbial for administrada em camundongos injetados com células tumorais, a formação de tumor foi inibida ou retardada (Gao. L. et al. , J. Gen. Viol.,75: 157, 1994, Meneguzzi, G. et al. , Virologia, 181: 62, 1991) . Entretanto, no caso em que as vacinas virais vivas são usadas, os problemas associados a replicação virai excessiva podem aumentar, similar a outros casos. Assim, as vacinas de virus vivos em muitos casos são usadas somente para propósitos de pesquisa e têm desvantagens quando elas levam um longo periodo de tempo para serem comercializadas e precisam de ensaios clinicos consideráveis.

[007] Enquanto isso, estudos sobre o desenvolvimento de vacinas incluindo vetores bacteriais estão sendo ativamente conduzidos, e há um relatório em que o HPV 16 VLP sintetizado em Salmonela tipimurium atenuada induz a produção de anticorpos antigeno especifico na mucosa ou em todo corpo dos camundongos (Denis, N. et al., Infecção e imunidade, 65: 3328, 1997) . No caso de vacinas compostas de peptideos sintéticos, somente os epitopos requerem induzir respostas imunes que são sintetizadas pela vacinação, e os epitopos causando resposta do Linfócito T citotóxico (CTL) para HPV 16 E6/E7 já tem sido esclarecido (Ressing, M. E. et al. , J. Imunol. , 154: 5934, 1995).

[008] A publicação W02004035795A1, intitulada VECTOR FOR ANTI-HPV VACCINE AND TRANSFORMED MICROORGANISM BY THE VECTOR refere-se a vetores de expressão que podem produzir eficientemente proteína do virideo capsideo, proteina associada a tumores de papilomavirus humano em uma superfície microbiana e cepas bacterianas que abrigam esses vetores de exibição de superfície e o uso das cepas bacterianas ou de seu extrato, produtos purificados como vacinas complexas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a vetores de exibição de superficie contendo um ou mais de dois genes selecionados entre pgsB, pgsC e pgsA, que codificam um complexo sintetase do ácido poliglutâmico (pgsBCA) de um Bacillus sp.

[009] O documento de patente KR100972843B1, intitulado Novel Constitutive Strong Promoter and Use Thereof refere-se ao promotor e uso do gene da aldolase originado por Lactobacillus casei (Lactobacillus casei), mais especificamente ao promotor do gene da aldolase originado por Lactobacillus casei com a sequência base da sequência número 1 e o vetor de expressão contendo o promotor e o microorganismo transformado para o vetor de expressão.

[010] A patente KR100609866B1, intitulada Vector for anti-HPV Vaccine and Transformed Microorganism by the Vector refere-se a um vetor para expressar uma vacina contra um antigeno da cápside de superficie ou um antigeno causador de câncer do papilomavirus, um microorganismo transformado com o vetor e uma vacina usando o microorganismo transformado ou seus extratos.

[011] A patente KR100469800B1, cujo titulo é Surface Expression Vector Including PGSBCA, Gene Encoding Poly-Gamma- Glutamate Synthetase, and Method for Expressing Target Protein on Surface of Microorganism Using the Same diz respeito a um vetor de expressão de superfície incluindo pgsBCA, um gene que codifica a sintetase de poli-gama- glutamato e um método para expressar uma proteína alvo na superfície de um microorganismo usando o mesmo. Dito vetor de expressão de superfície para produzir uma proteína em uma superfície microbiana contêm um ou mais de dois genes selecionados entre pgsB, pgsC e pgsA, que codificam um complexo de poli-y-glutamato sintetase, em que o gene é derivado de um Bacillus sp. estirpe que produz poli-y- glutamato sintetase; e as sequências nucleotídicas dos genes pgsB, pgsC e pgsA são homólogas às das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, com uma homologia de 80%. É descrito um método para expressar uma proteína alvo na superfície de um microorganismo compreendendo as etapas de: (a) construção de um vetor de expressão recombinante inserindo um gene que codifica a proteína alvo no vetor de expressão da superfície; (b) transformar uma célula hospedeira Gram- negativa com o vetor recombinante; e cultivar a célula hospedeira transformada e expressar a proteína alvo na superfície da célula hospedeira.

[012] O documento de patente US2005033025, intitulado Polyepitopic protein fragments of the E6 and E7 proteins of HPV, their production and their use particularly in vaccinationdescreve peptídeos poliepitópicos das proteínas E6 e E7 do Papilomavirus Humano, sua produção e métodos de tratamento de patologias nas quais um peptídeo poliepitópico da proteína E6 e E7 do Papilomavirus Humano é reconhecido pelo sistema imunológico celular.

[013] A referência AM3 / RepE from Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis),UniProt, (19961101), Database accession no. Q52249, refere-se a informações e sequência de aminoácidos de uma proteína repE derivada de Streptococcus faecalis.

[014] A publicação DNA-binding domain of the RepE initiator protein of mini-F plasmid: involvement of the carboxyl- terminal region, Matsunaga et al. J Bacteriol. 1995 Apr;177(8):1994-2001, diz respeito à proteína iniciadora RepE (251 resíduos) que é essencial para a replicação mini-F em Escherichia coli, exibindo duas funções principais: iniciação da replicação de DNA a partir de ori2 e repressão autógena da transcrição repE. Enquanto a iniciação é mediada por monômeros RepE que se ligam aos iterons ori2 (repetições diretas), a repressão autógena é mediada por dímeros que se ligam ao operador repE, que contém uma sequência de repetição invertida relacionada aos iterons. Esse documento relata que a ligação de RepE a esses locais de DNA é determinada principalmente pela região C-terminal desta proteína. As proteínas RepE mutantes sem os resíduos 33 (ou mais) do terminal N ou os resíduos 7 (ou mais) do terminal C mostraram primeiro ser defeituosas na ligação aos DNAs ori2 e operador. No entanto, a triagem direta e a análise de RepEs mutantes que são especificamente afetadas na ligação aos iterons ori2 revelaram que as mutações (principalmente substituições de aminoácidos) ocorrem exclusivamente na região C-terminal (resíduos 168 a 242) . Essas proteínas mutantes exibiram ligação reduzida ao ori2 e nenhuma ligação detectável ao operador. Assim, enquanto o truncamento de qualquer extremidade do RepE pode destruir as atividades de ligação ao DNA, a região C-terminal parece representar um domínio primário de ligação ao DNA do RepE para o ori2 e o operador. Os domínios de ligação a DNA análogos parecem ser conservados entre as proteínas iniciadoras de certos plasmídeos relacionados.

[015] A publicação Therapeutic human papillomavirus vaccines: current clinical trials and future directions, Hung Chien-Fu et al., é um panorama do desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o HPV, uma vez que o câncer do colo do útero é a segunda maior causa de morte por câncer em mulheres no mundo. É agora evidente que a infecção persistente com o vírus do papiloma humano de alto risco (HPV) é necessária para o desenvolvimento e manutenção de câncer do colo do útero. Assim, a vacinação eficaz contra HPV representa uma oportunidade de restringir o câncer cervical e outros cânceres importantes .

[016] Além dessas tentativas, estão sendo conduzidos estudos usando vegetais transgênicos por si só (obtidos de vegetais que incluem tomate e batata) como vacinas orais ou vacinas comestíveis para produzir antigenos virais em vegetais. Exemplos tipicos incluem partículas antigenas de superfície de hepatite B (Thavala, Y. F. e Artzen, C. J., Pro. Natl. Acad. Sei. EUA.,92: 3358, 1995) e proteínas capsideas LI e L2 de papilomavirus (Patente Coreana No. 0366608) . Entretanto, os sistemas de vegetais têm o problema de uso comercial ser limitado, porque a quantidade de proteina LI HPV expressada é pequena e os problemas associados com a purificação ocorrem.

[017] Portanto, em vista do fato de que a população infectada com HPV está principalmente concentrada em paises desenvolvidos, é urgente o desenvolvimento do método de preparação em antigenos HPV, de maneira mais econômica e estável, para prevenir e tratar tumores derivados de papilomavirus na mucosa de cavidades orais ou órgãos genitais.

[018] Os inventores desenvolveram previamente um vetor para expressar eficazmente uma proteina antigeno HPV sobre a superfície de microorganismos recombinantes transformados e um método para expressar uma proteína antigeno HPV sobre a superfície dos microorganismos (Patente Coreana No. 0609866).

[019] Consequentemente, os inventores têm feito grandes esforços para desenvolver um vetor capaz de expressar mais estavelmente e constitutivamente um alto nível de uma proteína antigeno HPV sobre a superfície da bactéria de ácido láctico recombinante transformado e, como resultado, encontraram que a proteína antigeno HPV é mais estavelmente expressada em um alto nível em microorganismos recombinantes transformados com um vetor contendo um gene mutante repE, completando assim a presente invenção.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

[020] É o objetivo principal da presente invenção prover um vetor capaz de expressar, estável e constitutivamente, um alto nível de proteína antigeno HPV sobre a superfície da bactéria de ácido láctico recombinante transformada usando um gene mutante repE.

[021] Outro objetivo da presente invenção é prover uma bactéria de ácido láctico recombinante transformada com dita expressão do vetor e um método para preparar a proteína antigeno HPV usando dita bactéria de ácido láctico.

[022] Ainda outro objetivo da presente invenção é prover uma vacina para tratar câncer cervical que consiste de dita bactéria de ácido láctico recombinante transformada.

[023] Para atingir os objetivos acima, a presente invenção provê uma vetor de expressão de superfície contendo: um gene mutante repE tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; um promotor; um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo; um gene que está ligado com o gene poli-gama- glutamato sintetase complexo e codifica uma proteina antigeno associada a indução de um tumor do papilomavirus humano.

[024] A presente invenção também provê um microorganismo recombinante transformado com dito vetor.

[025] A presente invenção também provê uma vacina para tratar câncer cervical, que contém, como ingrediente ativo, um microorganismo recombinante tendo uma proteina antigeno HPV sobre a superfície do mesmo.

[026] A presente invenção também provê um método para preparar um microorganismo tendo um antigeno HPV expressado sobre a superfície do mesmo, o método compreendendo as etapas de: cultivar um microorganismo recombinante transformado com dito vetor para expressar um antigeno HPV sobre a superfície do microorganismo; e coletar o microorganismo recombinante tendo um antigeno HPV expressado sobre a superfície do mesmo.

[027] A presente invenção também provê uma vacina para tratar câncer cervical que contém, como ingrediente ativo, o microorganismo preparado por dito método e tem um antigeno HPV expressado sobre a superficie do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[028] A figura 1 mostra um mapa de clivagem de um vetor pKV-Pald-PgsA-Amilase com um gene mutante repE.

[029] A figura 2 mostra um mapa de clivagem de dois tipos de vetores de expressão expressando o gene E7 sobre a superficie do microorganismo.

[030] A figura 3 mostra os resultados das análises Western blot para expressão de E7 sobre a superficie da bactéria de ácido láctico transformada com pKV-Pald-PgsA-E7.

[031] A figura 4 mostra um programa para administrar uma bactéria de ácido láctico em camundongos para examinar a capacidade com resposta de indução imune de bactéria de ácido láctico recombinante transformada expressando E7 sobre a superficie do mesmo.

[032] A figura 5 mostra trocas em IgG e IgA sobre administração oral de bactéria de ácido láctico recombinante transformada expressando E7 sobre a superficie do mesmo.

[033] A figura 6 mostra os resultados de análises de secreção de E7-especifica IFN-gama sobre administração oral de bactéria de ácido láctico recombinante transformada expressando E7 sobre a superfície do mesmo.

[034] A figura 7 mostra resultados de um ataque a ensaio de tumor conduzido por administração oral de bactéria de ácido láctico recombinante transformada expressando E7 sobre a superfície do mesmo e determinar se o tamanho do tumor aumentou.

[035] A figura 8 mostra uma mapa de clivagem de um vetor de expressão que expressa um gene E7(Rb) sobre a superfície dos micoorganismos.

[036] A figura 9 mostra os resultados de análises de expressão de E7(Rb) sobre a superfície da bactéria de ácido láctico recombinante transformada com pKV-Pald-PgsA-E7(Rb).

[037] A figura 10 mostra resultados de ELISA E7 especifico.

[038] A figura 11 mostra os resultados de análises de secreção de E7(Rb) especifica IFN-gama sobre administração oral de bactéria de ácido láctico transformada expressando E7(Rb) sobre a superfície do mesmo.

REALIZAÇÃO PREFERIDA DA INVENÇÃO

[039] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um vetor de expressão de superfície contendo: um gene mutante repE tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; um promotor; um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo; e um gene que está ligado com o gene poli-gama-glutamato sintetase complexo e codifica uma proteina antigeno associado à indução de tumor de papilomavirus humano.

[040] Na presente invenção, um gene mutante repE tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, que pode ser estavelmente mantido em microorganismos transformados, foi introduzido em microorganismos transformados junto com um promotor aldolase (Paid) derivado do gene aldolase de Lactobacillus casei. Como resultado, foi visto que a expressão de uma proteina alvo no microorganismo foi aumentada. Para confirmar que um vetor de transporte da presente invenção está estavelmente mantido em um microorganismo recombinante e que uma proteina alvo está expressada em microorganismos recombinantes, um gene amilase como gene alvo foi introduzido em microorganismos recombinantes e a expressão da amilase em microorganismos recombinantes foi analisada.

[041] Além disso, para a expressão de superfície de uma proteina alvo, um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo que é um motivo de superfície de ancoragem foi localizada de forma que foi expressada em um estado ligado com uma proteina alvo. Aqui, o gene poli-gama-glutamato sintetase complexo é preferivelmente o pgsBCA, mais preferivelmente o pgsA (Patente Coreana No. 469800).

[042] Em uma realização da presente invenção, um gene HPV16 e7-codifiçado foi fusionado com pgsA de forma que a proteína HPV16 como uma proteina alvo foi fusionada com a extremidade terminal-C de PgsA, preparando portanto, um vetor pKV-Pald- PgsA-E7 capaz de expressar constitutivamente uma proteina antigeno HPV sobre a superficie da bactéria de ácido láctico.

[043] Como usado aqui, o termo "proteina alvo" ou "proteina estranha" refere-se a uma proteina que não pode ser normalmente encontrada em células hospedeiras transformadas expressando a proteina. Por exemplo, quando a manipulação é desenvolvida de forma que o virus derivado ou proteina derivada de tumor seja artificialmente expressada na bactéria de ácido láctico, a proteina refere-se a uma proteina estranha ou uma proteina alvo.

[044] Em outro aspecto, a presente invenção é também direcionada a um microorganismo recombinante transformado com dito vetor, o microorganismo recombinante expressando uma proteina antigeno HPV sobre a superficie do mesmo, e uma vacina para tratar o câncer cervical que contém, como um ingrediente ativo, o microorganismo recombinante transformado.

[045] Como usado aqui, o termo "hospedeiros" ou "microorganismos" refere-se a bactérias de ácido láctico que são bactérias probióticas gram-positivas, e critérios comuns usados para selecionar microorganismos probióticos incluem os seguintes: (i) um microorganismo derivado de humano; (ii) estabilidade contrária a bile, ácido, enzima e oxigênio; (iii) capacidade de aderir à mucosa intestinal; (iv) colonização potencial em trato gastrointestinal humano; (v) produção de substâncias antimicrobials; e (vi) eficácia e segurança demonstráveis. Sobre a base de tais critérios, é evidente que a bactéria de ácido láctico é amigável e inofensiva ao corpo humano. Portanto, quando os transformadores que usaram as bactérias de ácido láctico como hospedeiros foram aplicados ao corpo humano com o objetivo de entregar um gene ou proteina para prevenir ou tratar doença, uma etapa de cepas bacterianas desintoxicante não é requerida, diferente de um método convencional para preparar vacinas que usam cepas bacterianas.

[046] Na presente invenção, as bactérias de ácido láctico que são usadas como hospedeiros incluem Lactobacillussp., Streptococcussp. e Bifidobacteriumsp. Tipicamente, dito Lactobacillus sp. inclui L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. ferementum, L. delbrueckii, L. johnsonii LJI, L. reuterie L. bulgaricus, dito Streptococcussp. inclui S. thermophilus, e Bifidobacteriumsp. inclui B. infantis, B. bijidum, B. longum, B. psuedolongum, B. breve, B. lactis Bb-12 e B. adolescentis.Preferencialmente, Lactobacillus sp. é usado como hospedeiro.

[047] Em outro aspecto ainda, a presente invenção é direcionada a um método para preparar um microorganismo tendo antigeno HPV expressado sobre a superfície do mesmo, o método compreendendo as etapas de: cultivar um microorganismo recombinante transformado com dito vetor para expressar um antigeno HPV sobre a superfície do microorganismo; e coletar o microorganismo recombinante tendo o antigeno HPV expressado sobre a superfície do mesmo.

[048] A cultura do microorganismo recombinante de acordo com a presente invenção pode ser realizado de acordo com um método bem conhecido na técnica, e condições de cultura, que incluem a temperatura de cultura, o tempo e o pH do meio, que podem ser adequadamente controlados. A coleção de células microbianas recombinantes do caldo de cultura pode ser realizada usando técnicas de isolamento convencional, por exemplo, centrifugação ou filtração.

[049] Em outro aspecto ainda, a presente invenção é direcionada a uma vacina para tratar câncer cervical que contém, como ingrediente ativo, o microorganismo preparado por dito método e tem um antigeno HPV expressado sobre a superfície do mesmo.

[050] Além disso, a presente invenção é direcionada a uma vacina oral para tratar câncer cervical.

[051] Vacinas são drogas que usam organismos vivos para propósitos preventivos contra doenças para estimular o sistema imune. A ativação imune refere-se a um processo de remover eficazmente antigenos através da produção de anticorpos em organismos, estimulo do linfócito-T ou estimulo de outras células imunes (por exemplo, macrófagos) . Uma visão detalhada de imunologia relacionada a tais detalhes é facilmente entendida por aqueles especializados na técnica (Barret, J. T., Textbook de imunologia, 1983). Uma vacina de microorganismo transformada expressando uma proteina alvo como um antigeno que pode ser administrado em mamíferos, e preferencialmente em humanos.

[052] A preparação da composição da vacina pode ser realizada usando técnicas padrão. Uma dose adequada para administração varia dependendo dos produtos de antigenecidade dos genes e pode ser uma quantidade na qual a vacina pode ser facilmente determinada através de procedimentos experimentais. A dose inicial tipica da vacina é 0,001-1 mg antigeno/Kg em peso. Se necessário, a dose pode ser aumentada para oferecer um nivel preferido de proteção, ou a vacina é usada em doses múltiplas. A dose pode ser determinada por aqueles especializados na técnica e pode variar dependendo do método da formulação, tipo de administração, idade do paciente, peso corpóreo, sexo, gravidade da doença, dieta, frequência da administração, via de administração, taxa de excreção e resposta de sensibilidade.

[053] A realização preferida do vetor de expressão de superfície da invenção para preparar a vacina HPV codificando a proteina antigeno HPV E7 é um vetor de expressão de superfície contendo: um gene que codifica uma proteina mutante repE tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, um promotor derivado de aldolase bactéria de ácido láctico; um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo selecionado do grupo consistindo de pgsB, pgsC e pgsA para expressão de superfície, e um gene que codifica a proteina antigeno E7 associada a indução de tumor de papilomavirus humano e está ligada ao gene poli-gama-glutamato sintetase complexo. A bactéria de ácido láctico recombinante transformada com o vetor pode ser cultivada para expressar a proteina antigeno E7 HPV sobre a superfície do mesmo, e então usada diretamente como uma vacina.

[054] A realização preferida do vetor de expressão de superfície da invenção para preparar uma vacina HPV codificando a proteina antigeno E7(Rb) HPV é um vetor de superfície de expressão contendo: um gene codificando uma proteina repE mutante tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, promotor de aldolase derivado de bactéria de ácido láctico; um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo selecionado do grupo consistindo de pgsB, pgsC e pgsA para expressão de superfície; e um gene que codifica a proteina antigeno E7(Rb) associada a indução de tumor de papilomavirus humano e está ligada com o gene poli-gama-glutamato sintetase complexo. A bactéria de ácido láctico recombinante transformada com o vetor pode ser cultivada para expressar a proteina antigeno E7(Rb) sobre a superfície do mesmo, e então usada diretamente como uma vacina.

[055] Afim de tornar a vacina mais eficaz na produção de um anticorpo, uma substância antigêncica deve ser liberada in vivo, de forma que o mecanismo da produção de anticorpo de indivíduos vacinados pode ser questionado. Portanto, um carregador microbiano de um produto de gene pode ser preferencialmente introduzido in vivo para respostas imunes. Afim de estimular uma resposta preferida através de um gene que é apresentado em uma bactéria de ácido láctico da presente invenção, a vacina é preferencialmente administrada oralmente ou diretamente ao colo uterino em forma de spray.

[056] Para administração oral da composição da vacina para indivíduos, a composição de vacina é preferencialmente provida em uma forma liofilica, por exemplo, uma forma de cápsula. A cápsula é provida com um revestimento entérico contendo Eudragate L, acetato celulose, fitalato de celulose ou celulose hidroxiprolimetil. A cápsula pode ser usada como se fosse ou pode ser administrada após ter sido reconstituída em um material liofilico tal como uma suspensão. A reconstituição é preferencialmente desenvolvida em um amortecedor tendo um valor de pH adequado a sobrevivência de microorganismos recombinantes transformados. Afim de proteger os microorganismos recombinantes transformados e a vacina de ácido gástrico, é preferível administrar uma formulação de bicarbonato de sódio sempre antes de administrar a vacina. A vacina pode ser seletivamente preparada para administração parenteral ou administração intramamária.

EXEMPLOS

[057] Assim, a presente invenção será descrita detalhadamente com referências a exemplos. Será evidente para uma pessoa tendo capacidade na técnica que os exemplos têm somente propósito ilustrativo e não limitam o escopo da presente invenção. Isto é, as seguintes etapas são descritas como ilustrativas e não se limitam ao escopo da presente invenção.

Exemplo1:Preparaçãodovetordaexpressãodesuperficie (pKV-Pald-PgsAL-Amilase)contendogenemutanterepE

[058] Neste exemplo, afim de estabilizar um vetor de expressão em células hospedeiras, um vetor de expressão de superfície contendo um gene mutante repE mostrando um nivel de expressão aumentado de uma proteina alvo foi formado.

[059] Primeiramente, para aumentar a expressão de uma proteina alvo em bactéria de ácido láctico, um fragmento de um promotor aldolase que é um promotor derivado de Lactobacillus casei foi obtido. O promotor aldolase foi obtido pela PCR usando pDT-PgsA-Amilase (divulgado Patente Coreana No. 10- 2008-0086161) como um modelo e primers de SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 2: 5'-cgc gca tgc aat acc cac tta ttg cg-3' SEQ ID NO: 3: 5'-cag ttc ttt ttt cat gta gat ate ctc c-3'

[060] Como um resultado, um fragmento 421-bp DNA contendo um promotor aldolase, um local de restrição da enzima Sphl de extremidade 5 e uma região N-terminal 17-bp de pgsA na extremidade 3' foi obtida. Além disso, o fragmento do gene pgsA que pode ser ligado com o fragmento promotor aldolase formado acima obtido pelo PCR usando o vetor descrito acima como um padrão e primers de SEQ ID NO: 4 θ SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 4: 5'-gga gga tat eta cat gaa aaa aga act g-3' SEQ ID NO: 5: 5'-ggc get ggc ggt cgt ttg g-3'

[061] O fragmento de DNA obtido foi um fragmento 782 bp contendo uma extremidade 13 bp 3' do promotor aldolase e tendo pgsA conectado diretamente ao mesmo. A região pgsA deste fragmento incluiu um local de enzima de restrição PstI.

[062] Os dois fragmentos obtidos foram ligados um ao outro e sujeitos ao PCR usando os primers em ambas extremidades, assim obtendo um fragmento 1175 bp DNA. O fragmento DNA foi digerido com Sphl e PstI,assim obtendo um fragmento contendo o promotor aldolase e a parte N-terminal de pgsA.

[063] pBT:pgsA-Amilase (pAT-PslpA-pgsA-amilase; ver Exemplo Indireto da Patente Coreana No. 0872042) foram digeridas com Sphl e PstIpara remover a região promotora SlpA7, obtendo assim a espinha dorsal do vetor de expressão.

[064] O fragmento DNA contendo o promotor aldolase digerido com Sphl e PstIfoi ligado com pBT: PslpA-Amilase ingerida com as mesmas enzimas de restrição, construindo, assim pTA-Pald- PgsA-Amilase. O vetor pAT-Pald-PgsA-Amilase foi sujeito a mutagênese sitio dirigido para substituir o códon TTA codificando o 475° aminoácido leucina do gene repE comum códon de parada TGA como sendo para cortar os aminoácidos 21 C- terminal da proteina RepE, assim formando pKV-Pald-PgsA- Amilase tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (Fig.l).

Exemplo2:PreparaçãodovetordesuperficiedeE7HPV16(pKV- Pald-PgsA-E7)

[065] Usando o vetor de superficie de expressão (pKV-Pald- PgsA-Amilase) preparado no Exemplo 1, um gene codificando a proteina E7 HPV16 foi inserido na extremidade do terminal-C do PgsA, preparando, assim um vetor pKV-Pald-PgsA-E7 capaz de expressar uma proteina alvo sobre a superficie da bactéria de ácido láctico.

[066] Para esse propósito, o gene amilase fusionado com pgsA no vetor pKV-Pald-PgsA-Amilase preparado no Exemplo 1 foi removido e o gene codificado HPV16 E7 foi inserido no vetor. Como mostrado na Fig.l, um fragmento contendo o gene PHV16 E7 foi obtido através do desenvolvimento PCR usando pHAT: PgsA-E7 (Poo et al. , Int. J. Câncer, 119: 1702, 2006) como um modelo e primers de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 6: 5'-gcg gga tcc cat gga gat aca cct aca ttg c- 3 ’ SEQ ID NO: 7: 5'- acg cag aag cgg tct gat aa -3'

[067] Como resultado, um fragmento 386-bp contendo o gene HPV16 E7 foi obtido. O fragmento continha um local de enzima de restrição BamHI na extremidade 5' e um local de enzima de restrição Xbal na extremidade 3' . O fragmento de DNA obtido foi digerido com BamHI e Xbal, obtendo assim um fragmento 306- bp.

[068] O vetor pKV-Pald-PgsA-Amilase foi obtido com BamHI e Xbal para remover a região do gene amilase, obtendo assim um fragmento vetor.

[069] O fragmento DNA contendo o gene E7 digerido com BairíRI e Xbal foi ligado com o vetor digerido com as mesmas enzimas de restrição, formando assim pKV-Pald-PgsA-E7 (Fig.2A).

Exemplo3:ExamedeexpressãodepHAT-E7epKV-Pald-PgsA-E7em bactéria de ácido láctico transformada.

[070] Nesse exemplo, Lactobaci11us casei foi transformado com cada pHAT: PgsA-E7 e pKV-Pald-PgsA-E7, feito no Exemplo 2. A cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada foi cultivada, e a expressão da proteina E7 na cepa recombinante foi examinada. A expressão da proteina E7 fusionada com PgsA na cepa de Lactobaci11us casei recombinante transformada foi examinada.

[071] A cepa de Lactobacillus casei recombinante, transformada com cada pHAT-PgsAE7 e PKV-Pald-PgsA-E7 cultivada de forma estacionária no meio MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickison e Companhia Sparks, EUA) a 30° para induzir a expressão de superfície da proteina HPV16 E7 fusionada com a extremidade terminal C do gene poli-gama-glutamato pgsA sintetase.

[072] A célula completa da cepa de Lactobacillus casei cultivada foi sujeita a electroforese de gel poliacrilamida SDS e Western blotting usando um anticorpo PgsA especifico.

[073] Especificamente, a célula completa da cepa de Lactobacillus casei recombinante, transformada na qual a expressão do gene E7 havia sido induzida foi desnaturada com a proteina obtida na mesma concentração da célula, para preparar a amostra. A amostra foi analisada pela eletroforese de gel poliacrilamida SDS, e então as frações de proteina foram transferidas para as membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad). As membranas PVDF, para as quais foram transferidas as frações de proteina, foram bloqueadas através de agitação no tampão de bloqueio (50 mM Tris HCL, 5% de leite desnatado, pH 8,0) por 1 hora, e então incubado por 1 hora com antibióticos primários anti-PgsA policloral derivados de coelho que tinham sido diluídos 1000 vezes no tampão de bloqueio. Após a realização da incubação, as membranas foram lavadas com a solução tampão e incubadas por 1 hora com anticorpos secundários anti-coelho HRP- conjugados que tinham sido diluidos 10000 vezes em um tampão de bloqueio. Após a realização da incubação, as membranas foram lavadas com solução tampão, e as membranas lavadas foram desenvolvidas com cores por aproximadamente 1 minuto através da adição de um substrato (lumigen PS-3 acridan, H2O2) e uma ligação especifica entre o anticorpo PgsA-especifico e a fusão de proteina foi observada com a câmera CCD (Fig.3).

[074] Na Fig.3, a linha C representa a cepa de Lactobacillus caseirecombinante transformada na qual somente o PgsA foi expressado (pKV-Pald-PgsA-E7) , a linha 1 representa a proteina de expressão da cepa de Lactobaci11us casei recombinante transformada com pHAT-PgsA-E7, e a linha 2 representa a proteina de expressão da cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada com PKV-Pald-PgsA-E7. Como mostrado na Fig.3, a expressão de uma fusão de proteina 54.4-kDa PgsA- E7 poderia ser observada nas linhas 1 e 2 usando a PgsA Ab especifica, e foi observado que a expressão da proteina de fusão PgsA-E7 através da pKV-Pald-PgsA-E7 foi mais forte do que a expressão da fusão de proteina PgsA-E7 através da pHAT: pgsA-E7.

[075] No caso da estrutura na qual a região PslpA-PgsA-E7 de pHAT:PgsA-E7 contendo RepE normal foi substituído com Pald- PgsA-E7, a bactéria de ácido láctico transformada não pode ser obtida através do método de preparação da bactéria de ácido láctico transformada conduzida da mesma maneira como descrita acima.

Exemplo4:Comparaçãodacapacidadedeinduzirrespostaimune humoralentrecepasdeLactobacillusexpressandoantigenoHPV16 E7 sobre a superfície do mesmo

[076] As cepas de Lactobacillus casei foram transformadas com cada vetor de expressão de superfície, e a expressão do antigeno HPV E7 sobre as superficies das cepas foi induzida da mesma maneira que no Exemplo 2. Assim, os dois tipos de cepas de Lactobacillus casei recombinantes transformados foram comparados com relação à capacidade da fusão de proteina PgsA- HPV16 E7 para induzir respostas imunes humorais. Além disso, as duas cepas transformadas tendo diferentes niveis de expressão da fusão de proteina foram administradas em camundongos em quantidades variadas (1, 1/5, e 1/10) e comparadas com relação a capacidade de induzir respostas imunes.

[077] A cepa de Lactobacillus casei foi transformada com cada vetor, cultivada, colhida e liofilizada para preparar o pó. O pó foi dissolvido no tampão (PBS, Ph 7,4) e então administrado oralmente a camundongos fêmeas Balb/c de 6 semanas.

[078] Especificamente, cada pó liofilizado das cepas de Lactobacillus casei recombinante transformado (pHAT-E7 e pKV- E7) expressando o antigeno HPV16 E7 da cepa de Lactobacillus casei (pAT) não expressando o antigeno HPV 16 E7 foi dissolvido em PBS de várias concentrações (5 x 109 células/200[il, 1 x 109 células/200jil, e 5 x 106 células/200jil) e imunizando os camundongos cinco vezes por semana por 2 semanas (dias 0-4, e dias 7-11) . Após 1 semana, a carga foi oralmente administrada(dias 35-39). Afim de medir o anticorpo IgG HPV16 E7 especifico em soro de camundongos e anticorpo IgA HPV16 E-7 especifico secretados da mucosa do camundongo, uma lavagem intestinal e uma lavagem vaginal foram coletadas de cada camundongo de 14 dias, 28 dias e 42 dias (Fig.4). Especificamente, sangue foi obtido do olho do camundongo usando um tubo micropilário revestido de heparina, e a lavagem intestinal e vaginal coletadas em quantidades de 0,8 ml e 250 [d,respectivamente usando 1 mM de tampão PBS contendo PMSF. Portanto, cada lavagem foi centrifugada em 13.000 rpm por 20 minutos, e o sobrenadante foi isolado e sujeito a análise ELISA.

[079] Na análise ELISA, a proteina HPV16 E7 foi diluida em tampão de revestimento (0,1 M carbonato de cálcio, 0,02% azida de sódio, pH 9, 6) em uma concentração de 500 ng/100 [Al por poço, e então 100j.ilda diluição foi adicionada às placas ELISA de 96 poços, incubada em 4D durante a noite. As placas ELISA foram lavadas três vezes através da adição de PBST (PBS+0,05% Tween 20) portanto uma quantidade de 300 pl/poço, e as placas ELISA foram bloqueadas com lOOpl de 5% de leite desnatado a 37D por 1 hora, seguido pela remoção do tampão de bloqueio. Então, as placas foram lavadas três vezes com PBST, e lOOpl de cada soro diluido e lavagens de mucosa foram adicionadas às placas. Após as amostras serem adicionadas, elas foram incubadas a 37D por 2 horas, e então lavadas três vezes com tampão de lavagem. Portanto, o IgG anti-camundongo conjugado com peroxidase horseradishou anticorpo IgA foi diluido em 1:5000, adicionado em cada poço e incubado a 37C° por 1 hora. Então, cada poço foi lavado com tampão de lavagem e desenvolvido com cor e foi estancado com 2,5 ácido sulfúrico M. A quantidade de antigeno HPV16 E7 especifico foi analisada através da medida com leitor ELISA a 45nm.

[080] Como resultado, como mostrado na Fig.5A, quando a média do valor de OD de soro IgG E-7 especifico foi medido por 2 semanas de imunização, os grupos administrados com cada pAT-E7 e pKV-E7 mostraram valores OD maiores que aquele do grupo controle pAT. Além disso, foi observado que a quantidade de anticorpo de E-7 especifico aumentou dependendo da quantidade de cepa administrada. A média do valor OD de soro IgG E-7 especifico após o primeiro impulso foi aumentada em ambos grupos administrados pAT-E7 e no grupo pKV-E7 administrado comparado com o valor medido após 2 semanas de imunização e indicado o efeito do impulso. A média do valor OD de soro IgG E-7 especifico após o segundo impulso também indicado em efeito de impulso em dois grupos administrados. Particularmente, no caso do grupo administrado com pAT-E7, o grupo administrado com pKV-E7 em uma quantidade de 1/5 mostrada em um efeito potenciador similar de IgG para aquele do grupo administrado com pAT em uma quantidade de 1/1.

[081] Enquanto isso, afim de medir as respostas imunes mucosais, os anticorpos IgA E-7 específicos nas lavagens de intestino e vagina foram medidos pelo ELISA. Como resultado, como mostrado na Fig.5B e Fig.5C, a média do valor de OD (por exemplo, IgA E-7 especifico) após 2 semanas de imunização foi aumentada em ambos grupos administrados pAT-E-7 e pKV-E-7 comparado ao grupo de controle pAT, e o anticorpo E-7 especifico foi aumentado dependendo da quantidade de cepa administrada. A média do valor de OD após o primeiro potenciador foi ainda aumentada, e o segundo efeito potenciador foi discretamente maior que o primeiro efeito potenciador.

[082] Concluindo, quando as cepas de Lactobacillus casei recombinantes transformadas inventivas expressando HPV16 E7 foram administradas oralmente em camundongos, eles puderam induzir respostas imunes humorais HPV16 E-7 especificas (indução do soro IgG) e resposta imune mucosal (indução IgA intestinal e vaginal). Particularmente, o grupo administrado com pKV-E7 expressando um nivel maior de E7 poderia mais eficazmente induzir respostas imunes comparado ao grupo administrado com pAT-E7.

Exemplo5:Comparaçãodacapacidadedeinduzirrespostasimunes celularesentrecepas.LactobacillusexpressandoantigenoHPV16 E7 sobre a superfície do mesmo.

[083] A fim de examinar se dois tipos de cepas de Lactobacillus casei recombinantes transformadas (pHAT-E7 e pKV-E7) têm diferentes niveis de superfície de expressão de antigeno HPV 16 E-7 que diferem com relação à capacidade de induzir respostas imunes mediada por células T CD8+ antigeno especifico E7, e respostas imunes por células T, cada coloração da cintocina intracelular e IFN-y ELISPOT foi realizada usando camundongos administrados oralmente com cada uma das cepas, examinando, assim a capacidade das cepas de induzir respostas imunes celulares.

[084] Para este propósito, esplenócitos foram isolados de camundongos administrados com cada cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada expressando E7 sobre a superficie do mesmo como mencionado no Exemplo 4. Os esplenócitos foram suspensos em meio RPMI-1640, contendo FBS a 10% e semeados em placas de 24 poços, numa densidade de 5xl06 células/poço. Cada poço foi tratado com uma classe I MHC contendo epitopo E7 peptídeo (a.a 49-57, AniGen, Coréia) e GolgiPlug (BD Biociências) , e as células foram cultivadas a 37°C por 16 horas. As células cultivadas foram tingidas com anticorpo CD8 de rato anti-camundongo ficoeritrina (PE) - monoclonal conjugada a 4°C por 40 minutos, e IFN-y em células foram tingidas com anticorpo IFN-y de rato anti-camundongo FITC-monoclonal conjugado usando o kit Cytofix/Cytoperm.

[085] Como descrito acima, após os camundongos terem sido administrados oralmente com cada cepa de Lactobacillus casei recombinante, o fingimento de citocina intracelular foi realizado para medir o número de células T de CD8+ E7 especifico IFN-y-secretante. Como resultado. Como pode ser visto na Fig. 6, o número de células percursoras T 25 CD8+ de E7 especifico IFN-y-secretante foi aumentado pelas cepas Lactobacillus casei recombinantes transformadas expressando E7. Particularmente, em um estágio inicial no qual a resposta imune foi induzida pela cepa de Lactobacill us casei recombinante pKV tendo um maior nivel de superficie de expressão que foi discretamente aumentado comparado aqueles induzidos pela bactéria de ácido láctico pHAT-E7, mas as respostas imune mediadas por células induzidas pela bactéria de ácido láctico pHAT-E7 foram aumentadas a um nivel similar aquele da cepa pKV-E7 após o impulso.

[086] Afim de examinar a indução de respostas imunes de células T E7 especificas, o IFN-y ELISOP foi realizado para medir o número total de células T secretando IFN-y especificamente a estimulação do peptideo E7. Para este propósito, um dia antes da isolação de esplenócitos, uma placa de 24 poços foi revestida com anticorpo de captura anti- camundongo IFN-y, e os esplenócitos isolados no dia do experimento foram semeados em cada poço da placa a uma densidade de 2 x 105 células/poço. Cada poço semeado com as células foi tratado com peptideo E7 ou PHA-M, e as células foram cultivadas por 2 dias. Após 2 dias, o conteúdo da placa foi removido e lavado duas vezes com água destilada e três vezes com 0,05% de PBS contendo tween-20, e biotinalado anti- camundongo IFN-y foi adicionado a cada poço da placa e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. Após a realização da incubação, o conteúdo da placa foi removido, cada poço foi lavado três vezes com 0,05% de PBS contendo tween-20, e então streptavidina-HRP foi adicionada em cada poço da placa e incubado em temperatura ambiente por 1 hora. Após o conteúdo da placa ter sido removido, cada poço foi lavado 4 vezes com 0,05% de PBS contendo tween-20 e duas vezes com PBS. Então um substrato foi adicionado em cada poço, e o desenvolvimento da cor foi observado em cada poço por 5-60 minutos. A reação do desenvolvimento de cor foi cessado pela água destilada, e o número de manchas em cada poço foi medido usando o leitor ELISPOT.

[087] O resultado,como mostrado na Fig.6, em camundongos administrados oralmente com bactéria de ácido láctico recombinante transformada com pHAT-E7 ou pKV-E7, o número de células secretando IFN-y especificamente para peptideo E7 foi aumentado. Além disso, o número de células secretando IFN-y no grupo administrado com cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada com pKV-E7 foi discretamente maior que aquele no grupo administrado com cepa de Lactobaci11us casei recombinante transformada com pHAT-E7.

Exemplo6:Ataqueacélulatumoralemcamundongosimunizados comLactobacillusexpressandoantigenoHPVE7sobre a superfície do mesmo

[088] A fim de confirmar o efeito anticâncer de dois tipos de cepas de Lactobacillusrecombinantes transformadas (pHAT-E7 e pKV-E7) tendo diferentes níveis de superfície de expressão de antigeno HPV 16 E7 e confirmar o efeito anticâncer de acordo com a quantidade do mesmo, o ataque da célula tumoral foi realizado usando modelo de célula tumoral TC-1 expressando a proteína E7.

[089] Para este propósito, camundongos fêmeas C57BL/6 de 6-8 semanas de idade foram divididos em vários grupos, cada um consistindo de 5 animais, e cada cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada expressando E7 sobre a superfície do mesmo foi administrada oralmente aos camundongos. A administração oral foi realizada 5 vezes por semana, e os camundongos foram tratados de acordo com o seguinte cronograma: 1 semana de administração oral seguido de 1 semana de descanso, e então 1 semana do segundo impulso. Após 1 semana de administração oral, 2 x 104 de células tumorais TC foram injetadas subcutaneamente na coxa esquerda de cada camundongo para induzir tumores. O tamanho do tumor formado foi medido três vezes por semana usando calibradores.

[090] Como resultado, como pode ser visto na Figura 7, no grupo administrado oralmente com cepa de Lactobaci11us casei recombinante transformada com pHAT-E7 ou pKV-E7, o tamanho do tumor formado foi aproximadamente 50% menor que o tamanho do tumor do grupo de controle. Além disso, o grupo administrado com a cepa de Lactobacillus easel recombinante pKV-E7 em uma quantidade reduzida de 1/5 mostrou um tamanho de tumor menor do que o do grupo de controle.

Exemplo7:Preparaçãodabactériadeácidolácticoimunizada (pKV-Pald-PgsA-E7(Rb)expressandosobreasuperficiedomesmo umaproteinatendomutaçõesdeaminoácidosintroduzidasnotipo HPV 16 E7

[091] Se as células são infectadas com papilomavirus, a proteina E7 expressada pode se ligar à proteina retinoblastoma de crescimento supressor (pRb) para causar câncer. Por esta razão, as mutações na sequência de base de uma região ligando ao pRb do gene E7 foram induzidas. O gene E7 (Rb) induzido por mutação foi fusionado na extremidade do PgsA usando vetor transporte pKV que é estavelmente expressado na E. colle na bactéria de ácido láctico, portanto preparando um vetor pKV- Pald-PgsA-E7(Rb) capaz de ser expressado sobre a superficie da bactéria de ácido láctico.

[092] Os resultados do exame para o local ligando Rb de HPV tipo 16 E7 revelaram que a proteina de crescimento supressor retinoblastoma local (DLxCxE) ligando (pRb) consiste de residues de aminoácidos 21-26 do gene HPV16 E7 (Smahel M. et al. , Virology,281: 231, 2001) . Afim de substituir todos aminoácidos do 21c (D), 24° (C) e 26° (E) entre os resíduos de aminoácidos 21-26 com glicina, a capacidade da proteina E7 de se ligar à proteína pRb foi removida por mutagênese pontual usando primers. Especificamente, o PCR foi desenvolvido usando o vetor pKV-Pald-PgsA-E7 preparado no Exemplo 2 como modelo e cada série de um primer de SEQ ID NOS: 8 e 9 e uma série de primer de SEQ ID NOS: 10 e 11. SEQ ID NO: 8: 5'-tct gga tcc atg cat gga gat aca cct ac-3’ SEQ ID NO: 9: 5'-ttg ccc ata acc gta gag acc agt tgt c-3’ SEQ ID NO: 10: 5'-act ggt ctc tac ggt tat ggg caa tta aat g- 3' SEQ ID NO: 11: 5'-cat tct aga tea tta tgg ttt ctg aga aca g- 3 '

[093] Como resultado, um fragmento de DNA 87-bp contendo o gene HPV16 E7 foi obtido pelos primers da SEQ ID NOS: 8 e 9 e continha um local de enzima de restrição BamHI na extremidade 5'. Além disso, um fragmento DNA 249-bp foi obtido pelo primer da SEQ ID NOS: 8 e 11 adicionados ao produto PCR, que foi então sujeito ao PCR (30 seg a 95°C, 30 seg a 53°C e 30 seg a 72°C) . O fragmento DNA 312-bp obtido continha um local de enzima de restrição BamHI na extremidade 5'e um local de enzima de restrição Xbal na extremidade 3' . O fragmento foi digerido com enzimas de restrição BamHI e XbaT para obter um fragmento de gene mutante E7(Rb) 306-bp. 0 pKV-Pald-PgsA- Amilase foi digerido com BamHI e Xbal para remover a região do gene amilase, obtendo, assim uma região de vetor. 0 fragmento DNA contendo um gene mutante E7(Rb) digerido com BamHI e Xbal foi ligado com o vetor digerido com as mesmas enzimas de restrição, formando assim o pKV-Pald-PgsA-E7(Rb) (Fig.8).

[094] A formação do pKV-Pald-PgsA-E7(Rb) foi transformada em Lactobacillus casei por eletroporação, obtendo assim a bactéria de ácido láctico transformada com a formação.

Exemplo8:ExamedaexpressãodepKV-Pald-PgsA-E7(Rb)em bactéria de ácido láctico transformada

[095] Para examinar se a proteina de fusão PgsA-E7 tem mutações no local ligando Rb é expressado em Lactobacillus casei transformado com o vetor pKV-Pald-PgsA-E7 obtido para expressão sobre a superfície da bactéria de ácido láctico, o seguinte experimento foi realizado.

[096] O Lactobacillus casei recombinante transformado foi cultivado de forma estática em meio MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson e Companhia Sparks, EUA) a 30°C, e as células microbianas foram coletadas e analisadas pela Western blotting da mesma forma que no Exemplo 3. Como resultado, foi confirmado que a proteina de fusão foi expressada na cepa microbiana. Especificamente, o Western blotting foi desenvolvido usando o anticorpo PgsA especifico e o anticorpo HPV16 E7 especifico (E7 monoclonal Ab, Invitrogeno, EUA) e, o resultado, como mostrado na Fig.9, foi confirmado na expressão de aproximadamente um mutante 54.7-kDa proteina E7 fusionada com PgsA.

Exemplo9:Induçãoderespostasimuneshumoraispor Lactobacillusexpressando antigeno mutante HPV16 E7(Rb) sobre a superficie do mesmo

[097] A cepa Lactobacillus casei recombinante confirmada para expressar a proteina mutante E7 PgsA fusionada foi administrada oralmente em camundongos afim de examinar se as respostas imunes humorais foram induzidas. Para este propósito, o Lactobaci11us casei foi transformado com o vetor, cultivado, e então liofilizado para preparar o pó. O pó foi dissolvido em tampão (PBS, pH 7,4) e administrado oralmente a camundongos fêmeas Bald/c de 6 semanas.

[098] Especificamente, cada um dos pós de cepa de Lactobacillus casei recombinante transformado (E7-Rb) expressando HPV16 E7(Rb) e de uma cepa de Lactobaci11us casei (L525) não expressando HPV16 E7(Rb) foi dissolvida em PBS em uma concentração de 2-5 x 109 células/200 fd, e então imunizados em camundongos cinco vezes por semana por 2 semanas (dias 0-4, e dias 7-11) . Após uma semana, a primeira bateria foi administrada oralmente (dias 21-25); depois de uma semana, uma segunda bateria foi administrada oralmente (dias 35-39). Afim de medir o anticorpo IgG HPV16 E-7 especifico da mucosa do camundongo, uma lavagem intestinal e uma vaginal foram coletadas de cada camundongo nos dias 14, 28 e 42 como mostrado na Fig.3. Como descrito no Exemplo 4, sangue foi obtido do olho do camundongo usando tubo micropilário revestido de heparina, e uma lavagem intestinal e uma vaginal foram coletadas de cada camundongo em quantidades de 0,8ml e 250 M respectivamente, usando tampão de lavagem PBS de ImM contendo PMSF. Cada lavagem coletada foi centrifugada em 13.000 rpm por 20 minutos, e o sobrenadante foi isolado e analisado pelo ELISA da mesma maneira que no Exemplo 4.

[099] Como resultado, como mostrado na Fig.lOA, quando a média do valor de OD de soro IgG E7-especifico após 2 semanas de imunização foi medido, o grupo administrado com E7-Rb mostrou um valor OD mais alto do que o grupo administrado com L525 (grupo de controle negativo) . A média do valor OD de IgG E7 soro especifico após o primeiro impulso foi aumentado no grupo administrado com E7-Rb comparado ao valor de OD medido após 2 semanas de imunização e indicando um efeito de impulso. A média do valor de OD de soro IgG E7-especifico indicando um efeito de impulso. Entretanto, o grupo administrado com L525 não mostrou um efeito especial de impulso. Além disso, afim de medir repostas imunes humorais induzidas na mucosa, o anticorpo IgA E7-especifico em cada intestino e vagina foi medido pelo ELISA. 0 resultado, como mostrado na Fig.lOB e Fig.l, a média do valor de OD (IgA E7 especifico) após 2 semanas de imunização foi aumentado no grupo administrado E7- Rb comparado ao grupo administrado com L525 (grupo de controle negativo) . Além disso, a média de valor OD após o primeiro impulso foi aumentado comparado ao valor medido após 2 semanas de imunização, e o segundo efeito de impulso foi aumentado comparado ao primeiro efeito de impulso.

[0100] Concluindo, quando a cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada com E7-Rb foi administrada oralmente a camundongos, poderia induzir todas as respostas imunes humorais sistêmicas de HPV16 E7 especifico (indução do soro IgG) e resposta imune humoral de mucosa (indução IgA intestinal/vaginal).

Exemplo10:Induçãoderespostaimunecelularatravésde Lactobacillus expressando o antigeno mutante HPV16 E7(Rb) sobre a superficie do mesmo

[0101] A fim de saber se a cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada (E7-Rb) expressando o antigeno mutante HPV16 E7(Rb) sobre a superfície do mesmo tern a capacidade de induzir respostas imunes mediadas por célula T de E7(Rb) antigeno especifico, o IFN-y ELISPOT foi realizado usando camundongos administrados oralmente com a cepa, examinando assim a capacidade da cepa de induzir respostas imunes celulares. Para este propósito, a cepa de Lactobacillus casei recombinante transformada expressando E7(Rb) sobre a superfície do mesmo, feita no Exemplo 7, foi administrada oralmente em camundongos, e os esplenócitos foram isolados de camundongos. Os esplenócitos isolados foram suspendidos em 10% do meio contendo FBS RPMI-1640 e semeado em cada poço de placa de 24 poços em uma densidade de 5 x 10fe células. Cada um foi tratado com um peptideo de classe MHC contendo epitopo E7 (a.a 49-57, AniGen, Coréia) e GolgiPlug (BD Biociências), e as células foram cultivadas a 37°C por 16 horas. As células cultivadas foram tingidas com anticorpo CD8 anti-camundongo de ficoeritrina (PE) monoclonal conjugada, e o IFN-y em células foram tingidas com anticorpo IFN-y anti-camundongo FITC monoclonal conjugado usando o kit Cytofix/Cytoperm.

[0102] Como descrito acima, cada uma das cepas de Lactobacillus casei recombinante foi administrada oralmente em camundongos, e então o tingimento da citocina foi realizado para medir o número de células T de CD8+ E7(Rb) especifico IFN-y secretante. 0 resultado, como pode ser visto na Fig.ll, o número de percussores de células T CD8+ E7(Rb) especifico secretando IFN-y foi aumentado pelo Lactobacillus casei recombinante transformado expressando E7(Rb). Particularmente, no estágio inicial cujas respostas imunes foram induzidas, foi visto que as respostas imunes mediadas por células induzidas pela cepa de Lactobaci11us casei recombinante pKV-E7(Rb) tem um nivel maior de superfície de expressão que foi discretamente aumentado comparado aquelas induzidos pela bactéria de ácido láctico pHAT-E7(Rb), mas as respostas imunes mediadas por células induzidas pela bactéria de ácido láctico phAT-E7(Rb) foram aumentadas para um nivel similar aquele da cepa pKV-E7(Rb) após o impulso.

[0103] Para examinar a indução das respostas imunes de células T E7 especificas, o IFN-y ELISPOT foi realizado para medir o número total de células T secretando IFN-y especificamente a estimulação de peptideo E7.

[0104] Para este propósito, um dia antes do isolamento dos esplenócitos, uma placa de 24 poços foi revestida com anticorpo de captura IFN-y anti-camundongo, e os esplenócitos isolados no dia do experimento foram semeados em cada poço da placa em uma densidade de 2 x IO5 células/poço. Cada poço semeado com as células foram tratados com peptídeos E7 ou PHA- M, e as células foram cultivadas por 2 dias. Após 2 dias, o conteúdo da placa foi removido e lavado duas vezes com água destilada e três vezes com 0,05% PBS contendo tween-20, o IFN- y anti-camundongo biotinilado foi adicionado a cada poço da placa e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. Após a realização da incubação, o conteúdo da placa foi removido, e cada poço foi lavado três vezes com 0,05% PBS contendo tween- 20, e então o estreptavidina-HRP foi adicionado em cada poço da placa e incubado em temperatura ambiente por 1 hora. Após o conteúdo da placa ser removido, cada poço foi lavado 4 vezes com 0,05% tween-20 contendo PBS e duas vezes com PBS. Portanto, o substrato foi adicionado a cada poço, e a observação do desenvolvimento de cor em cada poço foi realizado por 5-60 minutos. A reação do desenvolvimento de cor foi cessada pela água destilada, e o número de manchas em cada poço foi medido usando o leitor ELISPOT.

[0105] O resultado, como mostrado na Fig.11, nos camundongos administrados oralmente com a bactéria de ácido láctico recombinante transformada com pHAT-E7(Rb) ou pKV-E7(Rb), o número de células secretando IFN-y especificamente ao peptídeo E7 foi aumentado. Além disso, o número de células secretando IFN-y no grupo administrado com a cepa de Lactobacillus casei recombinante transformado com pKV-E7(Rb) foi discretamente maior que aquele do grupo administrado com a cepa de Lactobacillus casei recombinante transformado com pHAT-E7(Rb).

[0106] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência a características especificas, será evidente para aqueles especializados na técnica que a descrição é somente para uma realização preferida e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e equivalentes do mesmo.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0107] Como descrito acima, a bactéria de ácido láctico recombinante, transformada com o vetor de expressão de superfície da invenção, expressando a proteina antigeno de papilomavirus humano (HPV) sobre a superfície do mesmo, e a composição contendo a bactéria de ácido láctico como um ingrediente ativo, pode ser usada como uma vacina para tratamento de câncer cervical. A cepa recombinante transformada constitutivamente expressando um alto nivel de antigeno HPV é mais eficaz, porque pode proliferar uma grande quantidade de maneira econômica e pode ser aplicado como uma vacina oral ou diretamente à vagina.

Claims

1. Vetor de expressão de superfície para preparar vacinas papilomavirus humana (HPV), caracterizadopor compreender um gene que codifica uma proteína repE mutante tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, um promotor, um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo para a expressão de superfície, e um gene que está ligado com o gene poli-gama- glutamato sintetase complexo e codifica uma proteína associada à indução de tumor antigeno do papilomavirus humano.

2. Vetor de expressão de superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a proteína associada à indução de tumor antigeno do HPV é E7 ou E7(Rb) do HPV.

3. Vetor de expressão de superfície de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor aldolase derivado de bactéria de ácido láctico.

4. Vetor de expressão de superfície de acordo com a reivindicação 1 caracterizadopelo fato de que o gene poli-gama-glutamato sintetase complexo é selecionado do grupo que consiste de pgsB, pgsC e pgsA.

5. Microorganismo recombinante caracterizado pelo fato de ser transformado com o vetor de acordo com a reivindicação 1.

6. Microorganismo recombinante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é uma bactéria de ácido láctico.

7. Vacina para tratar câncer cervical, caracterizada por compreender microorganismo recombinante transformado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, como um ingrediente ativo.

8. Método para preparar um microorganismo tendo um antigeno HPV expressado sobre a superfície, caracterizado por compreender as etapas de cultivar o microorganismo recombinante de acordo com a reivindicação 5 para expressar um antigeno HPV na superfície do microorganismo; e coletar o microorganismo recombinante tendo o antigeno HPV expressado sobre a superfície do mesmo.

9. Vacina para tratar câncer cervical, caracterizada por compreender o microorganismo recombinante tendo o antigeno HPV expressado sobre a superfície preparado pelo método da reivindicação 8 como um ingrediente ativo.

10. Vetor de expressão de superfície para preparar vacinas HPV, caracterizado por compreender um gene que codifica uma proteina mutante repE tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, um promotor aldolase derivado de bactéria de ácido láctico, um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo selecionado do grupo consistindo de pgsB, pgsC e pgsA para expressão de superfície, e um gene que está ligado com o gene poli-gama-glutamato sintetase complexo e codifica uma proteina associada à indução de tumor antigeno E7 do papilomavirus humano.

11. Vetor de expressão de superficie para preparar vacinas de HPV, caracterizadopor compreender um gene que codifica uma proteina mutante repE tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, um promotor aldolase derivada de bactéria de ácido láctico, um gene poli-gama-glutamato sintetase complexo selecionado de um grupo que consiste de pgsB, pgsC e pgsA para a expressão de superficie, e um gene que é ligado ao gene poli-gama-glutamato sintetase complexo e codifica uma proteina antigeno sintetase complexa e codifica uma proteina associada a indução do tumor antigeno E7(Rb) do papilomavirus humano.

12. Bactéria de ácido láctico recombinante caracterizada por ser transformada com o vetor de acordo com a reivindicação 10.

13. Bactéria de ácido láctico recombinante caracterizada por ser transformada com o vetor de acordo com a reivindicação 11.