BRPI1006246A2 - "kit para imagem médica marcada e/ou terapias, sonda efetora e método" - Google Patents

Description

KIT PARA IMAGEM MÉDICA MARCADA E/OU TERAPIAS, SONDA EFETORA E MÉTODO

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um método de pré-marcação, para imagem médica marcada e/ou terapias, em que o uso é feito por grupos químicos reagentes a abióticos que exibem reatividade biortogonal um em direção ao outro. A invenção também se refere a um kit de pré-marcação que compreende pelo menos uma sonda de pré-marcação e pelo menos uma sonda efetora, em que a sonda de pré-marcação compreende uma Parte da Marcação Primária e um primeiro Grupo Reagente Biortogonal, e em que a sonda efetora compreende uma Parte Efetora, como um marcador ou um composto farmaceuticamente ativo, e um segundo Grupo Reagente Biortogonal. A invenção também se refere aos agentes de pré-marcação utilizados no método e kit descritos acima. A invenção particularmente tem a ver com a imagem nuclear e radioterapia.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Em muitas áreas de diagnóstico médico e terapia, deseja-se administrar seletivamente um agente, como um agente terapêutico (uma droga) ou um agente de diagnóstico (por exemplo, imagem), para um local específico, ou uma região confinada, no corpo de uma pessoa como um paciente.

A marcação ativa de um órgão ou um tecido é obtido '25 pela conjugação direta ou indireta das partes ativas desejadas (por exemplo, um agente de reforço de contraste ou um composto citotóxico) para uma construção de marcação, que liga às superfícies da célula ou promove a utilização celular ou o local alvo de interesse. As partes de marcação 30 utilizadas para marcar tais agentes são construções típicas que tem afinidade para as marcações da superfície celular (por exemplo, receptores da membrana), proteínas estruturais (por exemplo, placas amiloides) , ou marcações intracelulares

2/49 (por exemplo, RNA, DNA, enzimas, passagens de sinalização da célula). Estas partes podem ser anticorpos (fragmentos), proteínas, aptâmeros, oligopeptídeos, oligonucleotídeos, oligossacarídeos, bem como peptídeos, peptóides e compostos de droga orgânica conhecidos para acumular em uma doença particular ou mau funcionamento. Alternativamente, um agente de contraste/terapêutico pode marcar uma passagem metabólica, que é aumentado durante a doença (como infecção ou câncer) como DNA, proteína, e síntese da membrana e retenção do carboidrato. Em tecidos doentes, os marcadores mencionados acima podem discriminar as células doentes do tecido saudável e possibilidades únicas freqüentes para detectar precocemente, diagnóstico específico e terapia (marcada).

Um critério importante para os agentes de imagem/terapia moleculares com sucesso em geral e agentes nucleares de imagem/terapia em particular é que eles exibem uma alta utilização da marcação quando mostram uma rápida liberação (através dos sistemas renal e/ou hepatobiliar) do tecido não marcado e do sangue. Entretanto, isto é geralmente uma problemática: por exemplo, estudos da imagem em humanos mostraram que a concentração máxima de um anticorpo radiomarcado no local do tumor é alcançável nas próximas 24 horas, mas muito mais dias são necessários antes da concentração do anticorpo marcado na circulação diminui para níveis abaixo do suficiente para a imagem com sucesso ocorrer.

Estes problemas (especialmente para imagem e terapia nucelar) com acúmulo baixo e insuficiente no tecido marcado e lenta liberação das áreas não marcadas levaram à aplicação das abordagens de pré-marcação.

A pré-marcação refere-se a uma etapa em um método de marcação, em que a marcação primária (por exemplo, uma superfície da célula) é provida com a sonda de pré-marcação.

3/49 último compreende uma marcação secundária, que eventualmente será marcada por uma sonda adicional (a sonda efetora) equipada com uma parte da marcação secundária.

Assim, na pré-marcação, a sonda de pré-marcação é ligada a uma marcação primária. A sonda de pré-marcação também carrega as marcações secundárias, que facilitam a conjugação específica para um diagnóstico (imagem) e/ou agente terapêutico, a sonda efetora. Após a formação da construção a sonda de pré-marcação localizou no local de 10 marcação (levando tempo, por exemplo, 24 h), um agente de compensação pode ser utilizado para remover o excesso de sangue, se a liberação natural não suficiente. Em uma segunda etapa da incubação (preferivelmente levando um tempo mais curto, por exemplo, de 1 a 6 horas) , a sonda efetora liga à 15 sonda de pré-marcação (pré)ligada através de sua parte de marcação secundária. A marcação secundária (presente na sonda de pré-marcação) e a parte da marcação secundária (presente na sonda efetora) deveríam ligar rapidamente, com alta especificidade e alta finidade e deve ser estável no próximo 20 corpo.

conceito geral de pré-marcação é imagem na figura 1. Aqui na sonda efetora ê uma sonda de imagem compreendendo um marcador detectável para uma modalidade da imagem. A sonda efetora liga na sonda de pré-marcação (pré)ligada através de '25 seus grupos de marcação secundária.

Exemplos comuns para os pares da marcação secundária/parte da marcação secundária são sistemas biotina/estreptavidina ou anticorpo/antígeno. Para ser efetiva, a sonda efetora deve ser rapidamente excretada do 30 corpo (por exemplo, através dos rins) para prover o alto acúmulo de tumor desejado com acúmulo não marcado relativamente baixo. Desta forma, estas sondas são geralmente pequenas.

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Na imagem nuclear e na radioterapia o conceito de pré-marcação também é uma vantagem, como a pré-marcação consome tempo, a etapa pode ser realizada utilizando radionuclídeos, enquanto a etapa da marcação secundária utilizando um radionuclídeo pode ser realizada mais rápido. A última permite o uso de radionuclídeos com resistência mais curta com a vantagem de reduzir a dose de radiação no paciente e, por exemplo, a utilização de agentes PET (Position Emission Tomography) em vez de agentes SPECT. Além disso, em general, esta abordagem facilita a utilização de um agente de contraste universal.

As entidades que realizam as interações altamente seletivas na biologia em geral (como anticorpo-antígeno), e na pré-marcação em particular (biotina-estreptavidina, anticorpo/haptenos, oligonucleotídeos antisentido), são muito grandes. Como resultado, a pré-marcação com peptídeos e pequenas partes orgânicas como grupos de marcação primária, bem como imagem metabólica e imagem de marcação intracelular, permaneceram fora de alcance como o tamanho das marcações secundárias faz uso de pequenos grupos primários sem sentido.

Além disso, os sistemas atuais de pré-marcação são prejudicados pelos fatores associados com sua natureza biológica. A biotina é uma molécula endógena e suas conjugações podem ser divididas pela* biotinadase da enzima do soro. Quando a pré-marcação antisenso é utilizada, os oligonucleotídeos podem estar sujeitos ao ataque pelos RNAse e DNAse. As proteínas e peptídeos também estão sujeitos às passagens de decomposição natural. Estas interações podem ser adicionalmente prejudicadas por sua natureza não-covalente e dinâmica e tempo limitado de residência na marcação. Como resultado, o tempo entre a adição dos dois componentes na pré-marcação é limitado, que pode levar a marcação subótima nos índices de não-marcação. Ainda, a biotina endógena

5/49 compete com as conjugações da biotina para a ligação de estreptavidina. Finalmente, a estreptavidina é altamente imunogênica.

Um desenvolvimento recente é evitar desvantagens associadas com pré-marcação somente com base nas construções de marcação natural/biológica (ou seja, biotina/estreptavidina, anticorpo/hapteno, oligonucletídeos antisenso).

Neste aspecto, a referência pode ser feita ao WO 2006/038185 como uma revelação de um método de pré-marcação, para imagem médica marcada e/ou terapias, em que o uso é feito por grupos químicos reagentes a abióticos que exibem reatividade biortogonal uma em direção a outra. Nesta referência, os grupos biortogonalmente reagentes são parceiros de reação em uma ligação de Staudinger, ou seja, uma azida e um fosfina. A seleção descrita da ligação de Staudinger como a química de acoplamento na pré-marcação resulta na disponibilidade de parceiros reagentes que são abióticos, que forma um produto de adição estável sobre condições fisiológicas, e que reconhecem apenas um ao outro, enquanto ignoram sua borda celular/fisiológica (ou seja, eles são biortogonais).

Outra referência no uso, em um método de prémarcação, de grupos químicos reagentes a abióticos que exibem reatividade biortogonal um em direção ao outro, é WO 2007/039858. Neste documento, os Grupos Reagentes Biortogonais são os parceiros de reação em uma cicloadição de azida - alcano [3+2].

Outro tipo de química de união é descrito por Neal K. Devaraj, Ralph Weissleder, e Scott Hilderbrand em Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2297-2299. Este refere-se a aplicação de cicloadições de tetrazina biortogonal em marcação de células vivas. Os parceiros de reação aqui são 3 / 49 (p-benzilamino)-1,2,4,5-tetrazina e um norborneno, viz. (IS,2S,4S)-biciclo[2,2,1]hept-5-en-2-il ácido acético, que passa por uma Cicloadição Diels-Alder seguida por uma reação retro Diels-Alder, na qual o dinitrogênio (N₂) é liberado.

Esta química de união também é referida como uma reação Diels-Alder de demanda por elétron inversa. A referência é feita à pré-marcação de células SKBR3 de câncer de mama humano pelo trastuzumab de anticorpo monoclonal (Herceptin) marcadas com norborneno, seguido por marcação das células com 10 tetrazina ligada com a sonda fluorescente IR VT680 próxima.

Os tipos de química de união mencionados, embora úteis, estão sujeitos a maior intensificação. Este, inter alia, no sentido que as concentrações de reagentes relativamente altas são necessárias. Particularmente, isto 15 significa que as sonda efetoras, a fim de suficientemente ligar às sondas de pré-marcação, exigem um tempo de circulação relativamente longo e/ou alta concentração. É desejado poder reduzir a concentração necessária de sonda efetoras, enquanto retém as vantagens do método de pré20 marcação biortogonal previamente mencionado.

Ainda, particularmente com referência à aplicação em imagem nuclear e radioterapia, é desejado apresentar uma química de união biortogonal rápida e eficiente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO '25 A fim de melhor direcionar estes desejos, a invenção, em um aspecto, provê um kit para imagem médica marcada e/ou terapias, compreendendo pelo menos uma sonda de pré-marcação e pelo menos uma sonda efetora, em que a sonda de pré-marcação compreende uma Parte da Marcação Primária e 3 0 um primeiro Grupo Reagente Biortogonal, e em que a sonda efetora compreende uma parte efetora, como um marcador ou um composto farmaceuticamente ativo, e um segundo Grupo Reagente Biortogonal, em que o primeiro e segundo Grupos Reagentes

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Biortogonais é um dienófilo e o outro do primeiro e segundo Grupos Reagentes Biortogonais é um dieno, em que o dienófilo é um denófilo de anel de 8 membros satisfazendo a fórmula (1) :

R₂ R₂ c—^c\

R₂CCR

R₂C\^^^cr

XC=CY(1) em que cada R independentemente denota H, ou, em no máximo seis casos, um substituinte selecionado do grupo que consiste alquila, O-alquila, S-alquila, F, Cl, Br, I, SO₂, NO₂, NR'R com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila, C(=0)Oalquila, C(=O)Oarila, CONR'R com R' e R cada um independentemente sendo H, arila ou alquila, OCOalquila, OCOarila, NR'COalquila com R' sendo H ou alquila, NR'COarila com R' sendo ou alquila, NR'C (=0) Oalquila com R' sendo H ou alquila, NR'C(=0)Oarila com R' sendo H ou alquila, OCONR'alquila com R' sendo H ou alquila, OCONR'arila com R' sendo H ou alquila, NR'CONRalquila com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila, NR'CONRarila com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila,

NR'CSNRalquila com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila, e NR'CSNRarila com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila; com pelo menos um R compreendido em uma parte ligadora, opcionalmente através de um espaçador, para a sonda de pré-marcação ou a sonda efetora, e em que X e Y cada um independentemente denotam H, ou um substituinte selecionado do grupo que consiste alquila,

O-alquila, S-alquila, F, Cl, Br, I, S0₂, NO₂, e NRR' com R e R' cada um independentemente sendo H ou alquila, ou juntos formam uma ligação; e em que o dieno é selecionado de forma a

8/49 poder reagir com o dienófilo passando por uma Cicloadição Diels-Alder seguida por uma reação retro Diels-Alder.

Em outro aspecto, a invenção provê um método de pré-marcação, bem como agentes de pré-marcação utilizados 5 neste, e imagem médica marcada ou terapia em que este kit é utilizado.

Ainda em um aspecto adicional, a invenção é um composto que satisfaz a fórmula (1), para uso em um método de pré-marcação em um animal ou um ser humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será descrita com relação às modalidades particulares e com referência a certos desenhos, mas a invenção não é limitada a isto, mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas 15 reivindicações não devem ser construídos como limitação do escopo. Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e não são limitativos. Nos desenhos, o tamanho dos elementos pode ser exagerado e não desenhado em escala para finalidades ilustrativas. Onde o termo compreendendo é utilizado na 20 presente descrição e reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Onde o artigo definido ou indefinido é utilizado ao referir a um substantivo no singular, por exemplo, um ou uma, o e a isto inclui um plural deste substantivo a menos que algo seja especificadamente 25 declarado.

Também deve ser observado que o termo compreendendo, utilizado na descrição e nas reivindicações, deveria ser interpretado como sendo restrito aos meios listados depois disso; ele não exclui outros componentes ou 30 etapas. Assim, o escopo da expressão um dispositivo compreendendo meios A e B não deveria ser limitado aos dispositivos que consistem apenas em componentes A e B. Isto

9/49 significa que com relação a presente invenção, os únicos componentes relevantes do dispositivo são A e B.

A referência às várias fórmulas químicas é feita para a alquila e arila. Neste aspecto, a alquila, cada 5 uma independentemente, indica um grupo de alquila alifática, direta, ramificada ou cíclica e até dez átomos de carbono, possível incluindo de 1 a 3 heteroátomos como 0, N, ou S, e preferivelmente de 1 a 6 átomos de carbono e arila, cada um independentemente, indica um grupo hetero ou aromático de até 10 dez átomos de carbono, possivelmente incluindo de 1 a 3 heteroátomos como N ou S. Em várias fórmulas, grupos ou substituintes são indicados com referência à letra como A, B, X, Y, e vários grupos R enumerados. As definições destas letras serão lidas com referência a cada fórmula, ou 15 seja, em fórmulas diferentes, estas letras, cada uma independentemente pode ter significados diferentes a menos que indicado de outra forma.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 descreve um esquema geral de um conceito 20 de pré-marcação, conforme discutido acima;

A figura 2 provê o esquema de reação para uma Reação Diels-Alder [4+2]; entre (3,6)-di-(2-piridil)-stetrazina e E-ciclootecteno seguidos por uma reação retro Diels Aider na qual o produto e o nitrogênio são formados. '25 Por causa do derivado de trans-ciclootecteno não conter grupos de remoção de elétron como na Reação Diels Alder clássica, este tipo de Reação Diels Alder é distinguido da clássica, e frequentemente referida como uma reação inversa Diels Alder de demanda do elétron. No texto a seguir, a 30 sequencia de ambas as etapas da reação, ou seja, a cicloadição Diels Alder inicial (tipicamente uma cicloadição inversa Diels Alder da demanda de elétron) e a reação

10/49 subsequente retro Diels Alder será referida como estenografia como a reação retro Diels Alder.

A figura 3 (a e b) descreve esquemas gerais para a pré-marcação utilizando a química retro Diels-Alder;

Da figura 4 a figura 7 ilustram os esquemas da síntese para compostos utilizados nos exemplos.

As figuras 8 e 9 ilustram esquemas da síntese para compostos utilizados no exemplo in vivo.

As figuras de 10 a 12 ilustram a viabilidade in 10 vivo da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES

REAÇÃO RETRO DIELS-ALDER

A química de união retro Diels-Alder geralmente envolve um par de reagentes que se unem para formar um 15 intermediário instável, cujo intermediário elimina uma pequena molécula (dependendo dos compostos iniciais isto pode ser, por exemplo, N₂, CO₂, RCN, como o único subproduto através de uma reação retro Diels-Alder para formar um produto estável). Os reagentes em par compreender, como um 20 reagente (ou seja, um Grupo Reagente Biortogonal), um dieno adequado, como um derivado de tetrazina, e como o outro reagente (ou seja, o outro Grupo Reagente Biortogonal), um ciclootecteno ou ciclooctano de acordo com a fórmula (1).

A química de união retro Diels-Alder geralmente '25 envolve um par de reagentes que se unem para formar um intermediário instável, cujo intermediário reorganiza para um produto de adição estável através de uma reação retro DielsAlder. Os reagentes em par compreendem, como um reagente (ou seja, um Grupo Reagente Biortogonal), um dieno como uma 30 tetrazina deficiente de elétron, ou semelhante, e, como o outro reagente (ou seja, o outro Grupo Reagente Biortogonal), um ciclootecteno ou ciclooctano tensionado de acordo com a fórmula (1).

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A reação excepcionalmente rápida de, por exemplo, tetrazinas deficientes de elétron (substituídas) com, por exemplo, E-ciclootecteno tensionado resulta em uma ligação intermediária que reorganiza em uma diidropiridina estável 5 eliminando N₂ como um único subproduto em uma Cicloadição Retro Diels-Alder [4+2]. Isto é mostrado na figura 2.

As duas espécies reagentes são abióticas e, então, não passam por um metabolismo rápido in vivo. Elas são biortogonais, por exemplo, reagem seletivamente uma com a 10 outro no meio fisiológico.

As referências na Reação inversa Diels Alder de demanda por elétron, e o comportamento do par de espécies reagentes incluem: Thalhammer, F; Wallfahrer, U; Sauer, J, Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47), 6851-6854; Wijnen, JW;

Zavarise, S; Engberts, JBFN, Journal Of Organic Chemistry, 1996, 61, 2001-2005; Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM,

Journal Of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19).

Será entendido que, em um amplo sentido, de acordo 20 com a invenção a química de união previamente mencionada pode ser aplicada em basicamente qualquer par de moléculas, grupos, ou partes que podem ser utilizados na pré-marcação. Ou seja, um deste tal par compreenderá uma Parte da Marcação Primária, que pode ligar a uma marcação primária, e '25 adicionalmente compreender pelo menos uma marcação secundária. A outra será uma parte da marcação secundária adequada para uso na ligação para a dita marcação secundária, e adicionalmente compreende uma parte adequada para exercer a ação terapêutica (tipicamente um composto farmaceuticamente 30 ativo), ou para ser direcionado por uma técnica de imagem (ou seja, um marcador), ou ambos.

Assim, de acordo com a invenção, tanto a sonda de pré-marcação quanto à sonda efetora é funcionalizada com um

12/49 ciclootecteno ou ciclooctano, e a outra é funcionalizada com uma tetrazina, ou outro dieno adequado. Isto é ilustrado na figura 3. 0 esquema na parte superior (figura 3a) indica uma sonda de pré-marcação que compreende di-piridil tetrazina ligada, através de uma parte ligadora (preferivelmente compreendendo um espaçador flexível) em um anticorpo como a Parte da Marcação Primária, e uma sonda efetora compreendendo ciclootecteno (como a parte da marcação secundária) preso, através de um vinculador (um espaçador flexível), em um marcador detectável. 0 esquema abaixo (figura 3b) mostra exatamente o oposto, viz. A sonda de pré-marcação compreendendo o ciclootecteno e uma sonda efetora compreendendo a tetrazina.

técnico no assunto é ciente sobre o recurso de dienos que são reagentes na reação retro Diels-Alder. Os dienos preferidos são dados abaixo, com referência às fórmulas (2)- (7) .

(2) em que R¹ é selecionado do grupo que consiste alquila, arila, 0-alquila, C(=0)O-alquila, 0-, e NH₂; A e B cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste carbono substituído por alquila, arila carbono substituído, nitrogênio, N⁺0’, N⁺R com R sendo alquila, com a ressalva que A e B não são ambos carbonos; X é selecionado do grupo que consiste 0, N-alquila, e C=0, e Y é CR com R sendo selecionado do grupo que consiste H, alquila, arila,

C(=0)Oalquila;

O dieno da fórmula (2) é particularmente adequado como um parceiro de reação para um dienófilo de ciclootina, ou seja, um dienófilo de acordo com a fórmula (1) em que X e

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Y, conforme definido na fórmula (1), juntos formam uma ligação.

Um dieno particularmente adequado como um parceiro de reação para o ciclootecteno é:

R¹

Y^A

I I

X^B

R² (3) em que R¹ e R² cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste H, alquila, arila, OH, C(=0)0-alquila, CF3, C(=0)NH-alquila, e N02 ; A é selecionado do grupo que consiste N-alquila, N-arila, C=0, e CN-alquila; B é 0; X é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, CC(=0)0-alquila e N; Y é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, N, e N⁺0‘.

Um dieno particularmente comparável adequado como um parceiro de reação para ciclooctano é:

R¹

Y^A

I I

X^-B

R² (4) em que R¹ e R² cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste H, alquila, arila, OH, C(=0)0-alquila, CF3 , C(=0)NH-alquila, e N02 ; A é selecionado do grupo que consiste CO, Calquila-alquila. CN-alquila, Nalquila, e N-arila; B é 0; X é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, CC(=0)0-alquila e N; Y é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, N, e N⁺0.

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Outro dieno particularmente adequado como ciclootecteno é:

um parceiro de reação for

R¹

R² em que R¹ selecionados do grupo

C(=0)0-alquila, CF3, C(=0)NH-alquila, e N02 ; A é selecionado do grupo que consiste N, C-alquila, C-arila, e N⁺0;

é selecionado do grupo

CC(=0)0-alquila e N; Y

CH, C-alquila, C-arila,

Um dieno particularmente comparável adequado como um parceiro de reação para ciclooctano

R¹ e R² cada um independentemente que consiste H, alquila, arila, que consiste CH, C-alquila, é selecionado do grupo que N, e N⁺O.

são

OH,

B é N; X

C-arila, consiste

R² em que R¹ é selecionado do alquila, arila, OH, selecionado do grupo que consiste H, C(=0)0-alquila, CF3, e N02;

A é selecionado do grupo alquila, C-arila, CC(=0)0-alquila, selecionado do grupo que consiste

CC (=0) 0-alquila e N; Y é selecionado do grupo que CH, CCN, C-alquila, C-arila, N, e N⁺0‘.

Os derivados de tetrazina particularmente úteis são tetrazinas deficientes de elétron, ou seja, tetrazinas grupo que consiste H,

CF3, e N02; R² é

C(=0)0-alquila, alquila, arila, CN, OH, que

CH, consiste N,

N⁺O~; B é

C-alquila,

CH, CN; X é

C-arila, consiste

15/49 substituídas com grupos ou partes que geralmente não seguram como um doador de elétron, e preferivelmente carregando substituintes removedores de elétron.

Estas tetrazinas deficientes de elétron geralmente satisfazem a fórmula estrutural a seguir:

R1

R² (7)

Aqui, R¹ e R² cada um independentemente denotam um substituinte selecionado do grupo que consiste 2-piridil, fenila, ou fenila substituído com um ou mais grupos removedores de elétron como NO2, CN, COOH, COOR, CONH₂, CONHR, CONR₂, CHO, COR, SO₂R, SO₂OR, NO, Ar, em que R é C^-Cg alquila e Ar é responsável pelo grupo aromático, particularmente fenila, piridil, ou naftil.

Nos compostos de acordo com cada uma das fórmulas (2) - (7) , os grupos R¹ e R² (incluindo os no X ou Y) , podem adicionalmente ser providos com partes adequadas do vinculador ou espaçador conforme discutido abaixo. De maneira análoga, e independentemente desta, ainda o dienófilo da fórmula (1) pode ser adicionalmente provido com partes adequadas do vinculador ou espaçador conforme discutido abaixo.

O dienófilo preferivelmente é um E-ciclootecteno ou um ciclooctano. Mais preferivelmente, este E-ciclootecteno ou ciclooctano é insubstituível (longe do vinculador ou espaçador), ou seja, um E-ciclootecteno de acordo com a fórmula 8 ou o ciclooctano da fórmula 9.

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Uma vantagem da o mesmo significado mencionado, utilização da reação retro Diels5 Alder [4+2] em uma estratégia de pré-marcação é que o dieno e o ciclootecteno ou ciclooctano são abióticos e essencialmente não reagentes em direção às biomoléculas dentro ou sobre as superfícies das células e todas as outras regiões como o soro etc. Assim, os compostos e o método da invenção podem ser 10 utilizados em uma célula viva, tecido ou organismo. Além disso, os grupos reagentes são relativamente pequenos e podem ser introduzidos nas amostras biológicas ou os organismos vivos alteram o tamanho biológico significantemente. Utilizar a reação retro Diels-Alder [4+2] é possível para ligar as 15 partes da marcação primária que são grandes no tamanho, por exemplo, anticorpos, com marcadores ou outras moléculas utilizando pequenos parceiros de reação, por exemplo, tetrazina ou ciclootecteno. De maneira ainda mais vantajosa, as partes da marcação primária podem ser ligadas que são 20 relativamente pequenas, por exemplo, peptídeos, com marcadores ou outras moléculas utilizando parceiros de reação relativamente pequenos (combinados), por exemplo, tetrazina e ciclootecteno. O tamanho e as propriedades da sonda de prémarcação e sonda efetora não são muito afetadas pela marcação 25 secundária e parte da marcação secundária, permitindo esquemas de (pré)marcação a serem utilizados para pequenas partes de marcação. Por causa disto, outros tecidos podem ser

17/49 marcados, ou seja, o destino das sondas não é limitado ao sistema vascular e espaço intersticial, como é o caso para a pré-marcação atual com anticorpo-estreptavidina. De acordo com uma realização, a invenção é utilizada para a imagem 5 marcada.

De acordo com esta realização, a imagem de uma marcação primária específica é obtida pela ligação específica da Parte da Marcação Primária da sonda de pré-marcação e detecção desta ligação utilizando marcadores detectáveis 10 compreendido na sonda efetora.

MARCAÇÃO PRIMÁRIA

A marcação primária conforme utilizada na presente invenção refere-se a uma marcação a ser detectada em um método de diagnóstico e/ou de imagem, e/ou a ser modulado, 15 ligado, ou de outra forma direcionado por um composto farmaceuticamente ativo, ou outra modalidade terapêutica.

A marcação primária pode ser selecionada de quaisquer marcações adequadas no corpo humano ou animal ou em um patógeno e ou parasita, por exemplo, um grupo 20 compreendendo células como as membranas celulares e paredes celulares, receptores como os receptores da membrana celular, estruturas intracelulares como complexo de Golgi ou mitocôndria, enzimas, receptores, DNA, RNA, vírus ou partículas virais, anticorpos, proteínas, carboidratos, ‘25 monossacarídeos, polissacarídeos, citosinas, hormônios, esteróides, receptor de somastotatina, monoamino oxidase, receptores de muscarínico, sistema nervoso simpático do miocárdio, receptores de leucotrieno, por exemplo, nos leucócitos, receptor ativador de plasminogênio de uroquinase 30 (uPAR), receptor de folato, marcador de apoptose, marcador (anti-) angiogênese, receptor de gastrina, sistema dipomérgico, sistema serotonérgico, sistema GABAérgico, sistema adrenérgico, sistema colinérgico, receptores opóides,

18/49 receptor GPIIb/IIIa e outros receptores relacionados a trombose, fibrina, receptor de calcitonina, receptor de tuftsina, receptor de integrina, receptores VEGF/EGF, metalo proteína matricial (MPM), receptor seletina P/E/L, receptor 5 LDL, P-glicoproteína, receptores neurotensina, receptores neuropeptideos, receptores de substância P, receptor NK, receptores CCK, receptores sigma, receptores interleucina, herpes simplex tirosina quinase do virus simples de herpes, tirosina quinase humana.

De acordo com uma realização particular da presente invenção, a marcação primária é uma proteína como um receptor. Alternativamente, a marcação primária pode ser uma passagem metabólica, que e aumentado durante uma doença, por exemplo, infecção ou câncer, como a síntese de DNA, síntese de proteína, síntese da membrana e retenção de carboidrato.

Nos tecidos doentes, os marcadores mencionados acima podem diferenciar do tecido saudável e oferecer possibilidades únicas para detecção precoce, diagnóstico específico e terapia, especialmente terapia marcada.

SONDA DE PRÉ-MARCAÇÃO

A sonda de pré-marcação compreende a parte que pode ligar na marcação primária de interesse.

As partes de marcação são construções tipicamente que têm afinidade para marcações da superfície celular (por '25 exemplo, receptores da membrana) , proteínas estruturais (por exemplo, placas amiloides) , ou marcações intracelulares (por exemplo, RNA, DNA, enzimas, passagens de sinalização da célula). Estas partes podem ser anticorpos (fragmentos), proteínas, aptâmeros, oligopeptídeos, oligonucleotídeos, oligossacarídeos, bem como, peptídeos, peptóides e compostos de droga orgânica conhecidos para acumular em uma doença particular ou mau funcionamento.

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As realizações particulares de partes da marcação primária adequadas para uso nos kits da presente invenção são aqui descritas e incluem receptores ligando peptídeos e anticorpos. Uma realização particular da presente invenção 5 refere-se ao uso de pequenas partes de marcação, como peptídeos, para obter uma sonda de marcação permeável da célula.

A Parte da Marcação Primária conforme utilizado na presente invenção refere-se à parte da sonda de marcação 10 que liga a uma marcação primária. Exemplos particulares das partes da marcação primária são peptídeos ou proteínas que ligam em um receptor. Outros exemplos de partes da marcação primária são anticorpos ou fragmentos deste que ligam em um composto celular. Os anticorpos podem ser liberados e 15 aumentados nos compostos não protéicos bem como nas proteínas ou peptídeos. Outras partes da marcação primária podem ser feitas de aptâmeros, oligopeptídeos, oligonucleotídeos, oligossacarídeos, bem como peptóides e compostos de droga orgânica. A Parte da Marcação Primária preferivelmente liga 20 com alta especificidade, com uma lata afinidade e ligada com a marcação primária é preferivelmente estável no corpo.

A fim de permitir a marcação das marcações primárias listadas acima, a Parte da Marcação Primária da sonda de marcação pode compreender compostos incluindo, entre *25 outros, anticorpos, fragmentos de anticorpo, por exemplo, Fab2, Fab, scFV, polímeros (marcação de tumor em virtude do efeito EPR), proteínas, peptídeos, por exemplo, octreotídeo e derivados, VIP, MSH, LHRH, peptídeos quimiotáticos, bombesina, elastina, miméticas de peptídeo, carboidratos, 30 monossacarídeos, polissacarídeos, vírus, drogas, agentes quimioterapêuticos, agonistas e antagonistas receptores, citosinas, hormônios, esteroides. Exemplos de compostos orgânicos concebidos no contexto da presente invenção são, ou

20/49 são derivados de estrógenos, por exemplo, estradiol, andrógenos, progesterona, corticoesteróides, paclitaxel, etopóside, doxorrubricina, metotrexato, ácido fólico, e colesterol.

De acordo com uma realização particular da presente invenção, a marcação primária é um receptor e partes da marcação primária adequadas incluem, entre outros, o ligando de um tal receptor ou uma parte deste que ainda liga no receptor, por exemplo, um receptor ligando o peptídeo no caso 10 do receptor ligando os ligandos da proteína.

Outros exemplos das partes da marcação primária da natureza da proteína incluem interferonas, por exemplo, interferonas alfa, beta, e gama, interleucinas, e fator de crescimento da proteína, como o fator de crescimento do 15 tumor, por exemplo, fator de crescimento do tumor alfa, beta, fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), uPAR proteína de marcação, apolipoproteína, LDL, anexina V, endostatina, e angiostatina.

Exemplos alternativos das partes da marcação 20 primária incluem DNA, RNA, PNA e LNA que são, por exemplo, complementares à marcação primária.

De acordo com uma realização particular da invenção, pequenas partes lipófilas da marcação primária são utilizadas e podem ligar uma marcação primária intracelular.

De acordo com uma realização particular adicional da invenção, a marcação primária e a Parte da Marcação Primária são selecionadas como resultado na marcação específica e aumentada de um tecido ou doença, como câncer, uma inflamação, uma infecção, uma doença cardiovascular, por exemplo, trombose, lesão aterosclerótica, sítio hióxico, por exemplo, acidente vascular cerebral, tumor, distúrbio cardiovascular, distúrbio cerebral, apoptpse, angiogênse, um órgão, e gene/enzima relatora. Isto pode ser obtido

21/49 selecionando as marcações primárias com expressão específica de tecido, célula ou doença. Por exemplo, os receptores de ácido fólico da membrana mediam o acúmulo intraceluar de folato e seus análogos, como metotrexato. A expressão é limitada nos tecidos normais, mas os receptores são superexpressados em vários tipos de células cancerígenas.

De acordo com uma realização, a sonda de prémarcação e a sonda efetora podem ser compostos multiméricos, compreendendo uma pluralidade de marcações primárias e/ou secundárias e/ou partes da marcação.

A sonda de pré-marcação adicionalmente compreende primeiro Grupo Reagente Biortogonal mencionado acima. Este grupo serve como uma marcação secundária, ou seja, como parte da sonda de marcação que provê o primeiro parceiro de reação para a química de união retro Diels-Alder.

A dita marcação secundária pode ser parceira da reação da união, conforme descrito acima. Ou seja, em uma realização é uma tetrazina deficiente de elétron. Em outra realização é um ciclootecteno tensionado. Na sonda de prémarcação, a Parte da Marcação Primária e o primeiro Grupo Reagente Biortogonal podem ser diretamente ligados um ao outro. Eles também podem ser ligados um ao outro através de um vinculador, e ainda, eles podem ser ligados a um molde de marcação primária, por exemplo, um biopolímero como um polipeptídio. As partes adequadas do vinculador incluem, entre outros, cadeias polietilenoglicol (PEG).

SONDA EFETORA

Uma sonda efetora compreende uma Parte efetora que pode prover o efeito desejado do diagnóstico, imagem e /ou terapêutico. A sonda efetora adicionalmente compreende a parte da marcação secundária.

A parte da marcação secundária refere-se a parte da sonda efetora que forma o parceiro de reação para a marcação

22/49 secundária disponível, ou seja, o Grupo Reagente Biortogonal (ou grupos) compreendidos na sonda de pré-marcação. Será entendido que, para a extensão que a marcação secundária é um ciclootecteno, a parte da marcação secundária será uma tetrazina, e vice-versa.

A parte efetora pode, por exemplo, ser um marcador detectável. Um marcador detectável conforme aqui utilizado refere-se à parte da sonda efetora que permite a detecção da sonda, por exemplo, quando presente em uma célula, tecido ou organismo. Um tipo de marcador detectável concebido no contexto da presente invenção é um agente provedor de contraste. Os tipos diferentes de marcadores detectáveis são concebidos no contexto da presente invenção e são descritos abaixo.

Assim, de acordo com uma realização particular da presente invenção, os kits de pré-marcação e os métodos da presente invenção são utilizados na imagem, especialmente imagem médica. A fim de identificar a marcação primária, o uso é feito como a sonda efetora, de uma sonda de imagem compreendendo um ou mais marcadores detectáveis. Exemplos particulares de marcadores detectáveis da sonda de imagem são partes provedoras de contraste utilizadas nos sistemas de imagem tradicionais como construções imagináveis por RM, marcadores de spin, marcadores ópticos, construções reagentes a ultrasonografia, partes reagentes a radiografia, radionuclídeos, tinturas (bio)luminescentes e FRET. Marcadores detectáveis exemplares concebidos no contexto da presente invenção incluem, e não são necessariamente limitados a, moléculas fluorescentes, por exemplo, moléculas autofluorescentes, moléculas que fluorescem sobre contato com um reagente, etc., marcadores radioativos; biotina, por exemplo, a ser detectados através da ligação de biotina por avidina; marcadores fluorescentes, construções de imagem para

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RM compreendendo metal paramagnético, reagentes de imagem, por exemplo, os descritos no Pedido da Patente NorteAmericana Nos. 4.741.900 e 5.326.856) e semelhantes. O radionuclídeo utilizado para imagem pode ser, por exemplo, um 5 isótopo selecionado do grupo que consiste ³H, ^X1C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ¹⁹F, ⁵¹Cr, ⁵²Fe, ⁵²Mn, ⁵⁵Co, ^eoCu, ⁶¹Cu, ⁶²Zn, ^S2Cu, ⁶³Zn, ^e4Cu,

	66Ga,	67Ga,	68Ga,	70As , 71As ,	72AS, 74As, 75Se	, 75Br,	76Br,	77Br,
	80Br,	82Br,	82Rb,	86Y, 88Y, 89Sr, 89Zr, 97Ru,	Tc,	110In,	X11ln,
	113ln,	114In,	117Sn,	120I, 122Xe	123j 124j 125-j-	166Ho,	1S7Tm,	169Yb,
10	193Pt,	195Pt,	201rp η	e 203Pb.
		Outros	elementos	e isótopos, como sendo utilizado

para terapia também podem ser aplicados para imagem em certas aplicações.

A parte imaginável por RM pode ser um íon paramagnético ou uma partícula superparamagnética. O íon paramagnético pode ser um elemento selecionado do grupo que

consiste	Gd,	Fe, Mn, Cr, Co,	Ni,	Cu, Pr, Nd,	Yb,	Tb, Dy, Ho,
Er, Sm,	Eu,	Ti, Pa, La, Sc,	V,	Mo, Ru, Ce,	Dy,	T1. A parte
reagente	à ultrassonografia	pode	compreender	uma	microbolha,
20 a casca	da	qual consiste	um	fosfolipídeo,	e/	ou polímero

(biodegradável), e/ou albumina de soro humano. A microbolha pode ser preenchida com gases ou líquidos fluorados.

As partes reagentes à radiografia incluem, entre outros, iodo, bário, sulfato de bário, gastrografina ou podem 25 compreender uma vesícula, lipossoma ou cápsula de polímero com compostos de iodo e/ou sulfato de bário.

Além disso, os marcadores detectáveis concebidos no contexto da presente invenção também incluem peptídeos ou polipeptídios que podem ser detectados pela ligação de 30 anticorpo, por exemplo, pela ligação de um anticorpo detectado pelo marcador ou pela detecção de um anticorpo ligado através de uma avaliação do tipo sandwich. Em uma realização os marcadores detectáveis são marcadores orgânicos

24/49 de tamanho pequeno PET e SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography), como ¹⁸F, ^1:LC ou ¹²³I. Devido ao pequeno tamanho, os marcadores orgânicos PET ou SPECT são idealmente adequados para monitorar os eventos intracelulares, pois não 5 afetam muito as propriedades do dispositivo de marcação em general e seu transporte da membrana em particular. Uma sonda de imagem que compreende um marcador PET e das partes ativas retro Diels-Alder, pois uma parte da marcação secundária é lipofílica e pode passivamente difundir dentro e fora das 10 células até que encontre seu parceiro de ligação. Além disso, ambos os componentes não excluem o cruzamento da barreira hemato-encefálica e assim permitir a imagem das regiões no cérebro.

Quando a sonda efetora é direcionada para 15 compreender um marcador detectável com base em um metal, como um lantanídeo (por exemplo, Gd) para intensificação do contraste RM, como é preferivelmente provido na forma de um quelato. Neste caso a sonda efetora preferivelmente compreende a parte estrutural que pode formar um complexo de 2 0 coordenação com tal metal. Um bom exemplo deste são os quelatos macrocíclicos de lantanídeo(III) derivados de 1,4,7,10-tetrazociclododecano-l,4,7,10-tetra ácido acético (H₄dota), e 1,4,7,10-tetrazociclododecano-a, oí', oí, a ' tetrametil-1,4,7,10-tetra ácido acético (H₄dotma).

•25 A parte efetora também pode ser uma parte terapêutica como um composto farmaceuticamente ativo.

Exemplos de compostos farmaceuticamente ativos são providos aqui. Uma sonda terapêutica também pode opcionalmente compreender um marcador detectável.

Assim, de acordo com outra realização, os kits e os métodos de pré-marcação da invenção são utilizados para a terapia marcada. Isto é obtido fazendo uso de uma sonda efetora que compreende uma parte da marcação secundária e um

25/49 ou mais agentes farmaceuticamente ativos (ou seja, uma droga ou um isótopo radioativo para terapia de radiação). As drogas adequadas para uso no contexto da administração da droga marcada são conhecidas na técnica. Opcionalmente, a sonda 5 terapêutica também pode compreender um marcador detectável, como um ou mais agentes de imagem. Um radionuclídeo utilizado para terapia pode ser um isótopo selecionado do grupo que

	consi	ste 24Na, 32P,	33P,	47Sc, 59Fe, 67Cu, 76As, 77As, 80Br,	82Br,
	89Sr,	90Nb, 90 Y, 103Ru, 105	Rh, 109Pd, iriAg, 121Sn, 127Te, 131I,	140La,
10	141Ce,	142pr 143pr	144Pr	, 149Pm, 149Tb, 151Pm, 153Sm, 159Gd,	161Tb,
	165Dy,	1G6Dy, 166Ho,	169Er	, 172Tm, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re,	198Au,
	199Au,	211At, 211Bi,	212Bi,	212Pb, 213Bi, 214Bi, 223Ra, e 225Ac.

Alternativamente, a droga na sonda terapêutica é selecionada dos sensibilizantes para terapia fotodinâmica.

Na sonda efetora, a parte da marcação secundária, ou seja, o segundo Grupo Reagente Biortogonal e a parte efetora podem ser diretamente ligados um ao outro. Eles também podem ser ligados um ao outro através de um vinculador, e, ainda, eles podem ser ligados a um molde da marcação secundária. 0 vinculador pode, independentemente, ser selecionado das mesmas partes, por exemplo, polietileno glicol, conforme discutido acima. O molde da marcação secundária pode ser, por exemplo, um biopolímero como um polipeptídio.

‘25	A invenção também se refere	a	um método	de pré-
marcação,	utilizando a reação retro	Diels-Alder.	Aqui, a
sonda de	pré-marcação compreendendo	a	Parte da	Marcação
Primária	(por exemplo, um anticorpo,	e fragmento do

anticorpo, ou um receptor ligando o peptídeo), funcionalizada 30 com um dieno adequado, preferivelmente um composto de acordo com qualquer uma das fórmulas de (2) a (7) acima mencionadas, ou com um ciclootecteno ou ciclooctano de acordo com a fórmula (1) acima, respectivamente, é injetado em um sujeito.

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Após a ligação da marcação (por exemplo, uma lesão primária ou metastática, uma plaqueta asterosclerótica, uma área infringida, um sítio de inflamação ou infecção, etc.) e liberação da circulação e dos tecidos não marcados (por 5 exemplo, sangue, fígado, baço, rim, etc.) uma sonda efetora compreendendo uma parte da marcação secundária, por exemplo, carregando um derivado de E-ciclootecteno ou tetrazina, respectivamente (ou seja, a contraparte reagente do Grupo Reagente Biortogonal presente na sonda de pré-marcação), e 10 uma droga ou um marcador imaginável, é injetado. A sonda efetora liga em uma parte da Marcação Primária e provê alto constrate ou trata seletivamente o sítio doente.

A invenção também se refere à marcação de uma pasagem metabólica geral, que é aumentada durante a doença 15 (como infecção ou câncer) como a síntese de DNA, proteína, e membrana e retenção de carboidrato. As sondas adequadas compreendem aminoácidos marcados por dieno ou dienófilo, açúcares, ácidos nucléicos e colina, análogos aos traçadores metabólicos atualmente utilizados na técnica, [^1XC]-metonina, 20 [¹⁸F] -fluordeoxiglucose (FDG) , deoxi- [^1SF] -fluorotimidina (FLT) e [^1ZLC] -colina. As células com um alto metabolismo ou proliferação têm uma retenção maior destes blocos de construção. Neste método, por exemplo, derivados de tetrazina ou E-ciclootecteno entram nestas ou outras passagens e ‘25 acumulam nas e/ou sobre as células. Após acumulação e liberação suficiente da sonda livre uma sonda de tetrazina dectectavelmente marcada ou que carrega droga (célula permeável) ou sonda de E-ciclootecteno (ou sondas que carregam outros dienos/dienófilos de acordo coma invenção) é 30 enviada para ligar o E-ciclootecteno acumulado, respectivamente metabólito de tetrazina. Como uma vantagem sobre a imagem do tipo FDG (fluorina 18 fluordeoxiglucose) normal, tempo suficiente é disponível para permitir alta

27/49 acumulação da parte da marcação antes da radioatividade ser enviada, aumentando assim a marcação para o índice não marcado. Alternativamente, uma passagem metabólica e/ou metabólito que é específico para a doença pode ser marcado.

A invenção também se refere à pré-marcação de marcações intracelulares. Devido aos seus pequenos tamanhos, marcadores orgânicos PET (¹⁸F, ^1XC) são idealmente adequados para monitorar os eventos intracelulares, pois eles não afetam muito as propriedades do dispositivo de marcação em 10 geral e seu transporte da membrana em particular (contrário às conjugações das construções de quelato radioneltal grande e polar). Embora a parte da tetrazina substituída e o Eciclootecteno utilizados na invenção não sejam necessariamente pequenos, eles são relativamente não polares 15 e podem ser utilizados para imagem intracelular de proteínas, mRNA, passagens de sinalização etc. A parte da tetrazina substituída (PET marcado) ou sonda de E-ciclootecteno (ou seja, a sonda efetora) pode passivamente difundir para dentro e para fora das células até que encontre seu parceiro de 20 ligação. Estas propriedades também permitem o uso da reação retro Diels-Alder para pré-marcação no cérebro, pois ambos os componentes não exclui o cruzamento da barreira hematoencefálica.

A invenção também tem a ver com a amplificação do '25 sinal pré-marcado e/ou instalação de polivalência. Pelo menos um dispositivo de marcação primária é conjugado em um dendrímero ou polímero contendo várias partes de tetrazina. Após a ligação do receptor, um (um ou mais) ciclootecteno ou ciclooctano conjugado para uma ou mais partes do contraste 30 para a imagem nuclear (por exemplo, um quelato de radiometal, um radiohalógeno, etc.) ou RM (por exemplo, quelatos Gd) é injetado. A reação retro Diels-Alder subsequente resulta em uma alta concentração de agente de contraste RM no tecido

28/49 alvo. Além disso, a polivalência no sítio alvo aumentará a cinética da reação com o efetor conjugado de ciclootecteno ou ciclooctano, fornecendo um acúmulo alvo suficiente de, por exemplo, agentes de contraste RM. Naturalmente, o 5 ciclootecteno ou ciclooctano também pode ser utilizado no dispositivo de marcação conjugado e na tetrazina (ou outro dieno da invenção) conjugado ao repórter.

ROTA E KITS DE CONJUGAÇÃO

A invenção também tem a ver com o uso da reação retro Diels-Alder como uma rota para a conjugação de agentes da imagem e drogas para as construções de marcação como peptídeos. O efetor pode conter os grupos prostéticos marcados de PET orgânico, complexos de metal para

PET/SPECT/RM e microbolhas para imagem por ultrassonografia, mais ainda os emissores a e β para radioterapia e, em geral, um agente anticâncer citotóxico. Os agentes de imagem/terapia podem ser funcionalizados com uma tetrazina ou outra parte do dieno adequado e o grupo de marcação com um ciclootecteno ou derivado de cicloctina, ou vice versa.

A presente rota é especialmente vantajosa para a imagem nuclear e radioterapia; em vista da queda do radionuclídeo é vantajoso conduzir a etapa que mais consome tempo (a marcação atual no corpo de um sujeito) como uma etapa de pré-marcação. A seleção, de acordo com a invenção, da química retro Diels-Alder muito rápida acima descrita para a marcação secundária, permite a utilização de uma ampla faixa de radionuclídeos, incluindo os de vida mais curta com os métodos existentes. As sondas efetoras de ciclootecteno ou ciclooctano funcionalizadas e o dieno adequado, por exemplo, as sondas de pré-marcação carregando a tetrazina podem ser unidas nas concentrações extremamente baixas in vivo para a necessidade da circulação de sangue sustentada de uma parte efetora (como o radionuclídeo). Será entendido que este

29/49 suporta igualmente as sondas de pré-marcação que carregam o ciclootecteno/ciclooctano combinado com as sondas efetoras funcionalizadas de dieno, particularmente tetrazina. Além disso, os grupos reagentes são vantajosamente estáveis, e assim presentes em uma reatividade de vida mais longa, sendo muito facilmente propensos às reações adversas.

Será entendido que o mencionado provê vantagens como minimizar a dose de radiação no paciente. Ainda, leva a permitir a utilização de PET, ou seja, agentes de Tomografia 10 Emissão de Positrões em vez de SPECT, ou seja, agentes de Tomografia Computadorizada de Emissão de Fótons isoladamente.

A presente invenção é particularmente adequada para uso em imagem multimodal, opcionalmente utilizando diferentes agentes de imagem para visualizar o mesmo alvo.

Alternativamente, a sonda de imagem compreende pelo menos 2 marcadores diferentes para permitir a imagem multimodal.

A aplicação da guímica retro Diels-Alder [4+2] na imagem molecular abre a pré-marcação para todos os tipos e tamanhos de construções de marcação. Isto permite a imagem 20 intracelular e metabólica para se beneficiar do alto acúmulo da marcação e baixa experiência, alcançável através da acumulação da pré-marcação. De maneira semelhante, os esquemas de amplificação do sinal pré-marcado, por exemplo, dendrímeros ou lipossomos de politetrazina e/ou polialcano, 25 se tornam disponíveis para dispositivos de marcação menores e mais diversos.

Como os parceiros de reação são abióticos e biortogonais, a pré-marcação que utiliza a reação retro Diels-Alder [4+2] conforme descrito acima, não é prejudicada 30 pela competição endógena e metabolismo/decomposição, e fornece uma ligação covalente estável. Escolher uma passagem metabólica alvo, e o derivado de tetrazina-metabólito correspondente em virtude de seu alto fluxo, por exemplo, nas

30/49 células cancerígenas comparadas às células normais, fornece a instalação de uma alta densidade de receptores de tetrazina artificial ou outra química manipula nas células ou nas superfícies de células alvo, evitando o uso de receptores da superfície celular endógena que pode às vezes estar em níveis baixos.

Realizações particulares adicionais da presente invenção referem-se aos kits compreendendo um precursor metabólico e uma sonda de imagem, mais particularmente uma sonda de imagem que compreende um marcador detectável, que é um agente de contraste utilizado nos sistemas de imagem tradicionais. Tal marcador detectável pode ser, entre outros, um marcador selecionado do grupo que consiste construções imagináveis por RM, marcadores de spin, marcador ópticos, agentes reagentes à ultrasonografia, agentes receptivos por radiografia, radionuclídeo, e tinturas do tipo FRET. Em uma realização particular da presente invenção, o uso é feito por sondas relatoras. A sonda repórter pode ser o substrato de uma enzima, mais particularmente uma enzima que não é endógena para a célula, mas foi introduzida em forma de terapia ou infecção de gene com um agente estranho. Nãoendógeno, referindo a um gene em uma célula ou tecido aqui, é utilizado para indicar que o gene não está naturalmente presente e/ou expressado nesta célula ou tecido. Alternativamente, tal sonda repórter é uma molécula que é introduzida na célula em forma de receptor ou uma bomba, que pode ser endógena ou introduzida na célula em forma de terapia ou infecção de gene com um agente estranho. Alternativamente, a sonda repórter é uma molécula que reage a certas condições (de mudança) em um ambiente da célula ou do tecido.

A invenção também inlcui agentes para uso nos kits descritos acima. Tal agente é um agente de pré-marcação que

31/49 compreende a Parte da Marcação Primária e um Grupo Reagente Biortogonal, em que o Grupo Reagente Biortogonal é um parceiro de reação para uma reação retro Diels-Alder [4+2], Parceiros de reação particulares são descritos anteriormente 5 neste documento, ou seja, geralmente uma tetrazina deficiente de elétron ou outro dieno adequado conforme discutido acima, ou um ciclootecteno (preferivelmente um E-ciclootecteno) ou ciclooctano. A invenção também se refere ao uso destes agentes na imagem médica marcada ou terapia marcada, e aos 10 agentes para uso em tal método. Particularmente, a invenção refere-se ao uso destes agentes em um método de pré-marcação, e a estes agentes para uso em tal método. Outro agente é uma sonda de imagem compreendendo um marcador detectável e um Grupo Reagente Biortogonal, em que o Grupo Reagente 15 Biortogonal é um parceiro de reação para uma reação retro Diels-Alder [4+2].

A invenção também se refere a uma sonda de imagem que compreende um marcador detectável e um Grupo Reagente Biortogonal, em que o Grupo Reagente Biortogonal e um 20 parceiro de reação para uma reação retro Diels-Alder [4+2]. A invenção ainda refere-se a uma sonda terapêutica que compreende um composto farmaceuticamente ativo e um Grupo Reagente Biortogonal, em que o Grupo Reagente Biortogonal e um parceiro de reação para uma reação retro Diels-Alder 25 [4 + 2] .

Parte da invenção também é um método de pré-marcação que compreende administrar um agente de pré-marcação conforme descrito acima a um sujeito e permitir que o agente circule no sistema do sujeito por um período de tempo efetivo para 3 0 obter a ligação de uma parte da Marcação Primária em uma marcação primária, seguida pela compensação do agente não ligado do corpo. Um período de tempo típico para isto é de 12 a 96 horas, particularmente aproximadamente 48 horas.

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Além disso, a invenção provê um método de imagem que compreende conduzir um método de pré-marcação conforme descrito acima, seguido pela administração de uma sonda de imagem também de acordo com a invenção, em que os Grupos 5 Reagentes Biortogonais no agente de pré-marcação e na sonda de imagem juntos formam os parceiros reagentes para a reação retro Diels-Alder [4+2]. Semelhantemente, a invenção provê um método de tratamento médico marcado em um sujeito, que compreende conduzir um método de pré-marcação conforme 10 descrito acima, seguido pela administração de uma sonda terapêutica também de acordo com a invenção, em que os Grupos Reagentes Biortogonais no agente de pré-marcação e na sonda de imagem juntos formam os parceiros reagentes para a reação retro Diels-Alder [4+2].

A invenção também tem a ver com os agentes de prémarcação previamente mencionados para uso em um método de imagem ou terapêutico conforme descrito acima.

Em resumo, cm base na química retro Diels-Alder, a imagem e a terapia molecular pré-marcadas servem para trazer 20 grandes vantagens aos pacientes. Por um lado, serve para fornecer a aquisição de imagens superiores de tecidos alvo como câncer e lesões cardiovasculares. Por outro lado, os efeitos colaterais intrínsecos derivados da administração de compostos radioativos e, em geral, drogas potencialmente -25 tóxicas podem ser grandemente reduzidos ao aumentar a dose efetiva que atinge um tecido doente. Além disso, expandirá muito a coleta de eventos moleculares rastreáveis que fundamentam a doença. Em particular, esta tecnologia pode dar acesso aos tecidos alvo longe dos vasos sanguíneos e 30 facilitarão a imagem do ambiente intracelular rico em informações.

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A invenção será ilustrada com referência aos exemplos a seguir não limitativos e figuras não limitativas anexas.

Exemplo 1

Como um exemplo para ligação da parte derivada da tetrazina para um anticorpo conforme descrito na figura 3a, uma molécula 1 (ver figura 4) é preparada. Um exemplo de uma sonda correspondente 2, derivada de E-ciclootecteno, é apresentada na figura 5. Ambas as moléculas contém cadeias 10 PEG. A molécula 1 compreende uma parte de Nhidroxisuccimidil, que é utilizada para acoplar a molécula com grupos de aminoácido presentes no anticorpo. A parte derivada da DOTA em 2 pode ser utilizada para carregar um íon de metal terrestre raro como Gd para imagem MR ou Lu-177 para 15 imagem nuclear e terapia (SPECT).

A síntese de 1 é descrita na figura 4. A molécula derivada de tetrazina inicial 5 é feita de acordo com Blackman et al. (Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM, Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19). Ê 20 convertida em ácido 6 por reação com anidrido succinico seguida pela formação de N-hidroxisuccinimida éster 7. Esta N-hidroxisuccinimida éster é utilizada para formar ácido 9 pela reação com o derivado comercialmente disponível (IRIS biochem) PEG 8 que por sua vez é convertido em N-25 hidroxisuccinimida éster 1.

A síntese de 2 é descrita na figura 5. (E)-ciclooct-

4-enol (10) é preparado de acordo com Yap et al. (Yap, GPA; Royzen, M; Fox, JM, Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (12), 3760 -61) . Com a ajuda do derivado de siocianato comercialmente disponível (Aldrich) 11 é convertido em éster 12, seguido pela saponificação ao ácido 13. N-hidroxisuccinimida éster 14 formada por 13 é feita para reagir com a amina derivada DOTA e PEG 18 para formar o

34/49 produto final 2. 0 derivado DOTA 18 é preprado após a desproteção do 17 que por sua vez é preparado do derivado DOTA 15 e derivado PEG 16, ambos comercialmente disponíveis (de Macrocyclics e IRIS biotech, respectivamente).

Exemplo 2

Conforme comparado ao exemplo 1, este exemplo ilustra o par inverso das moléculas denominadas, 1) o derivado de E-ciclootecteno 3 destinado para formar a parte da pré-marcação após conjugar no anticorpo e, 2) a tetrazina 10 /sonda derivada DOTA 4 que pode servir como sonda efetora conforme descrito na figura 3b, são mostrados nas figuras 6 e 7, respectivamente.

O derivado de E-ciclootecteno 3 é formado pela reação do derivado PEG comercialmente disponível (IRIS biochem) 8 com N-hidroxisuccinimida éster 14 (ver figura 5) para formar ácido 19, seguido pela formação do derivado de Nhidroxisuccinimida fora deste ácido.

A síntese da tetrazina/sonda derivada DOTA 4 é descrita na figura 7. Esta sonda é feita pela reação da amina derivada de DOTA e PEG 18 (ver figura 5) com Nhidroxisuccinimida éster 7 (ver figura 4).

Exemplo 3; Imagem in vivo

Todos os reagentes e solventes foram obtidos das fontes comerciais (Sigma-Aldrich, Acros, ABCR, Invitrogen, e ‘25 Merck para reagentes, Biosolve, Merck e Cambridge Isotope Laboratories para solventes normais e deuterados) e utilizados também na purification a menos que declarado de outra forma. l-Amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36 dodecaoxanonatriacontan-39-oic ácido (Sll) e terc-butil (3530 amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33undecaoxapentatriacontil)carbamato (S3) foram obtidos de Polypure (Noruega) e Iris Biotech (Alemanha), respectivamente. 2,2',2''-(10-(2-((2,5-Dioxopirrolidina-1

35/49 il)oxi)-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetrazociclododecano-l,4,7triil)triácido acético (S6) como um sal com HPF₆ e aproximadamente 3 eq. de trifluoroácido acético (TFA) foi obtido de Macrocyclics (EUA). Soluções rituximab (MabThera®) foram adquiridas da Roche (Suíça). [^i:L1In] cloreto de índio e sulfato [¹²⁵I] soluções de iodo forma adquiridas da PerkinElmer (EUA) . A água foi destilada e deionizada (18 mQcm'¹) por meios de um sistema de filtração de água milli-Q (Millipore, EUA) . Os tampões de marcação foram tratados com resina Chelex-100 (BioRad Laboratories, EUA) durante a noite, então filtrados através de 0,22 pm e armazenados a 4°C. Tubos de iodinação lodogen, kits para ensaio de ácido bicinconinico (BCA) e soluções de coloração de proteína azul gelcode foram adquiridas da Pierce Proteína Research (Thermo Fisher Scientific, EUA). Tablets para preparar solução salina sulfato tamponada (PBS) pH 7,4 foram adquiridas de Calbiochem (Merck, Alemanha). Unidades de filtro de centrigução Amicon Ultra-4 e Ultra-15 (50 kDa MW cut-off) foram adquiridas da Millipore. 0 soro de rato foi adquirido da Innovative Research (EUA).

Espectros por NMR foram registrados em colorofórmio deuterado (CDC1₃) ou hexadeuterado dimetilsulfóxido (DMSOD_s) , utilizando um espectrômetro Bruker DPX3 00 ou um espectrometro Bruker Avance600 (Bruker BioSpin, Holanda). Multiplicidades de ¹³C-NMR (q=quaternário, t=terciário, s=secundário e p=primário) foram diferenciadas utilizando uma sequência de pulso DEPT. Espectros em massa ESI de alta resolução (HRMS) foram registrados em um espectrômetro em massa Agilent ESI-TOF (Agilent Technologies, EUA), medindo no modo de íon positivo. A cromatografia da coluna preparatória foi realizada em um aparelho Combiflash Companion (Teledyne Isco, EUA) utilizando colunas de silinca (SiliCycle, Canadá). HPLC preparatório foi realizado utilizando um aparelho

36/49

Agilent 1200, equipado com uma coluna C18 Zorbax (21,2x150 mm, partículas de 5 μιη) aplicando um gradiente de água e acetonitrilo (ACN) contendo 0,1% TFA. HPLC por rádio analítica foi realizada em um sistema Agilent 1100 equipado 5 com um detector radioativo Gabi (Raytest, Alemanha). As amostras foram carregadas em uma coluna Agilent Eclipse XDBC18 (4,6x150 mm, partículas de 5 μιη) , que foi eluída a1 mL/min com um gradiente linear de ACN em água contendo 0,1% TFA (2 min a 10% ACN seguido por um aumento em 45% ACN em11 min) . 0 comprimento da onda UV foi predefinido a 254 nm.A exclusão do tamanho (SEC) HPLC foi realizada no sistema Agilent 1200 equipado com um detector radioativo Gabi. As amostras foram carregadas em uma coluna BioSep-SEC-S 2000 (300x7,8mm, partículas de 5pm, Phenomenex, EUA) e eluídas com 15 fosfato de 20 mM, 150 mM NaCl, pH 6,8, a 1 mL/min. 0 comprimento da onda UV estava presente a 260 e 280 nm.

As produções de rotulagem foram determinadas por

TLC à rádio, utilizando faixas ITLC-SG (Pali, EUA) eluídas com 200 mM etilenediaminetetraácido acético em 0,9% aq. NaCl 20 e espelhadas em um gerador de imagens de fósforo (FLA-7000,

Fujifilm, Japão) . Nestas condições, ^li:LIn livre migra com Rf = 0,9, enquanto ^11:LIn-tetrazina permanece na origem. Os rendimentos da marcação ¹²⁵I foram determinados com TLC à radio, utilizando faixas ITLC-SG eluídas com uma solução de 25 ácido cítrico de 20 mM (pH 5,2) e espelhadas em um gerador de imagens de fósforo. Nestas condições, ¹²⁵I livre migra com Rf = 0,9, enquanto ¹²⁵I-mAbs permanecem na sua origem.

A análise no foco isoelétrico (IEF) e SDS-PAGE foram realizadas em um sistema Phastgel utilizando géis IEF-3-9 e 30 7,5% géis homogêneos PAGE (GE Healthcare Life Sciences, EUA), respectivamente. A solução de calibração IEF (amplo PI, pH 310) foi adquirida da GE Healthcare, e a solução padrão de proteína MW (padrão da cor dupla Precision Plus) foi

37/49 adquirida da BioRad. Na eletroferese, os géis foram coloridos por 2 h com gelcode azul, descoloridos durante a noite em água e então digitalizados com um scanner plano de descanso convencional.

A concentração de CC49 e soluções rituximab foi detemrinada com um espectrômetro NanoDrop 1000 (absorção a 280 nm; Thermo Fisher Scientific, The Netherlands) ou com urn teste BCA.

Síntese da terazina DOTA (S7) _L0 a visão geral da síntese de 2,2¹,2' '-¢10-(2,40,44trioxo-44-((6-(6-(piridin-2-il)-l,2,4,5-tetrazin-3il)piridin-3-il)amino)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36 undecaoxa-3,39-diazatetratetracontil)-1,4,7,10tetrazociclododecano-1,4,7-triil)triácido acético (S7) mostrada na figura 8.

5- 0x_O-5-(6-(6-(piridina-2-ill_sl,2,4.5-tetra^i_Baz3r

11)pirldina-3-ilamino) ácido pentanóico (32Λ.

6- (6-(Piridin-2-il)-l,2,4,S-tetrazln-3-ll)piridin-3amine (Sl) foi sintetizada de acordo com um procedimento literal (M. I». Blackman, M. Royzen, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130, 13518 (2008).). Uma mistura de Sl (103 mg, 0,410 mmol) e anídrido glutárioo (234 mg, 2,05 mmol) em tetrahldrofurano (12 mb) foi aquecida a 70-C por 18 h em um frasco vedado. Apôs o resfriamento, o precipitado for lavado com diclorometano (DCM) (2x12 mb) e acetato de etilo (12mb) para o rendimento S2 como um sólido roxo (62 mg, 42%) . HNMR (DMSO-Ds, 300 MHz, δ): 12,13 (s, 1H), 10,58 (s, 1H), 9,05 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 8,94 (d, J - 4,2 Hz, 1H) , 8,62 (d, d -8,8

HZ, 1H), 8,60 (d, J = 8,8 Hz , 1H), 8,43 (dd, d,= 2,3 HZ,=

8,8 HZ, 1H), 8,16 (td, = 7,8 Hz, da = 1,7 Hz, 1H) , 7,73 (ddd, Ja - 1,1 HZ, da - 4,4 HZ, d₃ = 7,4 Hz) , 2,50 (t, J = 7,3 HZ, 2H), 2,33 (t, d - 7,3 Hz, 2H), 1,86 (q, J - 7,3 Hz, 2H), ¹³C NMR (DMSO-D₆, 75 MHz, 6): 174,1 (q) , 172,0 (q) , 163,0 (q),

38/49

162,7 (q) , 150,6 (t) , 150,2 (q) , 143,8 (q) , 141,3 (t) , 138,4 (q) , 137,7 (t) , 126,5 (t) , 126,1 (t) , 124,8 (t) , 124,1 (t) , 35,4 (s), 32,9 (s), 20,2 (s), HRMS (ESI, m/z): Calculado para C₁₇H1₆N₇O3⁺ ( [M+H] ⁺) : 366,1314; Encontrado: 366,1313.

Terc-butil (37,41-dioxo-41-((6-(6-(piridin-2-il)1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-il)amino)-3,6,9,12,15,18,

21,24,27,30,33-undecaoxa-36-azahentetracontil)carbamato (S4).

N,N-Diisopropiletilamine (95 pL, 0,41 mmol) foi adicionada a uma mistrua agitada De S2 (15 mg, 0,041 mmol), 10 S3 (29 mg, 0,045 mmol), e (benzotriazol-1iloxi)tris(dimetilamino)phosphonium hexafluorophosphate (19 mg, 0,043 mmol) em dimetilformamide (DMF) (1 mL). Após agitar por 16 h em temperatura ambiente (RT), a mistura foi evaporada e o produto foi purificado pela cromatografia da

15 coluna em silica	utilizando um gradiente	de	metanol	em	DCM
(0-10%) dando S4	como um	sólido	roxo	(30	mg	, 74%) .		NMR
(CDC13, 300 MHz,	δ): 9,07	(d, J =	2,2	Hz,	1H)	, 8,97	(d,	J =
4,6 Hz, 1H), 8,73	(d, J =	8,8 Hz,	1H) ,	8,72 (	d, J =	8,8	Hz,

1H) , 8,63 (dd, Jx = 2,3 Hz, J₂ = 8,8 Hz, 1H) , 8,03 (td, Ji =

20	7,8	Hz, J2 =	: 1,7	Hz,	1H) , 7	,59 (ddd, Ji = 1,1 :	Hz, J;	j = 4,6 Hz,
	J3 =	7,4 Hz	) , 7	, 01 (	S, 1H)	, 5,14	(s, 1H) , 3,	9-3,2	(broad s,
	48H)	, 2,60	(t,	J =	7,1 Hz	, 2H) ,	2,37 (t, J	= 7,:	1 Hz, 2H),
	2,09	(q, J	= 7	, 1 Hz	, 2H) ,	1,43	(s, 9H) , 13C	NMR	(CDCI3, 75
	MHz,	δ) : 17	3,8	(q),	173, 1	(q), 163,8 (q), 1	63,7	(q), 151,3
-25	(t) ,	150,5	(q) ,	144,	0 (q),	142,7	(t), 139,2	(q) ,	137,9 (t),
	127,	0 (t) ,	126,	9 (t)	, 125,	5 (t) ,	124,7 (t),	79,5	(q), 70,5
	(s) ,	70,1 (	s) ,	40,7	(s) , 3	9,7 (s)	, 36,5 (s),	35,5	(s), 28,8
	(p),	21,9	(s) ,	HRMS	! (ESI,	m/z) :	Calculado	para	C46H74NgOi5+

([M+H]⁺) : 992,5304; Encontrado: 992,5301.

2,2' , 2' ' -(10-(2,40,44-Trioxo-44-((6-(6-(piridina-21)-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridina-3-il)amino)6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-undecaoxa~3,39

39/49 diazatetratetracontil)-1,4,7,10-tetrazociclododecano-l,4,7tril)triácido acético (S7).

O produto S4 (30 mg, 0,030 mmol) foi agitado por 30 min em TA em uma mistura de TFA (1,5 mL) e DCM (5 mL). Após a evaporação, os resíduos (principalmente S5) foram dissolvidos em DMF (5 mL), S6 (27 mg, 0,028 mmol) e triètilamina (40 pL,

0,27 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada por 2 h a TA. Após a evaporação; o material bruto foi dissolvido em

DMSO e purificado pelo HPLC preparatório. Após a liofilização, S7 (24 mg, 69%) foi obtido como um sal TFA roxo, como confirmado pela análise ¹³C-NMR (5=158,7ppm, q, J=32,3Hz e 5=117,6ppm, q, J=298,2Hz), ³H NMR (DMSO-D₆, 600

MHz, 5): 9,22 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 9,10 (dd, J_x = 4,7 Hz, J₂ = 1,1 Hz, 1H), 8,78 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,75 (d, J = 7,8 Hz,

1H) , 8,59 (dd, J_x = 2,4 Hz, J₂ = 8,7 Hz, 1H) , 8,32 (td, J_x =

7,8 Hz, J₂ = 1,7 Hz, 1H), 8,08 (ddd, J_x = 1,1 Hz, J₂ = 4,7 Hz,

J₃ = 7,8 Hz) , 3,9-3,1 (m, 80H) , 2,60 (t, J = 7,3 Hz, 2H) ,

2,34 (t, J = 7,3 Hz, 2H) , 2,02 (q, J = 7,3 Hz, 2H) , ¹³C NMR (DMSO-D₆, 150 MHz, 5): 172,8 (q) , 172,5 (q), 163,8 (q), 163,5 (q) , 151,3 (t) , 150,9 (q) , 144,5 (q) , 142,0 (t) , 139,3(q) ,

138,5 (t) , 127,3 (t) , 126,9 (t) , 125,6 (t) , 124,9 (t) ,70,5 (s) , 70,3 (s) , 69,9 (s) , 69,5 (s) , 39,2 (s) , 36,4 (s),35,2 (s) , 21,7 (s) , HRMS (ESI, m/z) : Calculado para C₅₇H₉₂N₁₃02o⁺ ( [M+H]⁺) : 1278,6582; Encontrado: 1278,6557.

Síntese de TCO-NHS, S13

A síntese de (E)-2,5-Dioxopirrolidina-l-il l-(4((Ciclooct-4-en-l-iloxi)metil)fenila)-1-oxo5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-dodecaoxa-2azahentetracontan-41-oate (S13) é mostrada na figura 9.

(E) -2,5-Dioxopirrolidina-l-il_________4- ( (Ciclooct-4eniloxi)metil)benzoato (S10).

(E)-Ciclooct-4-enol (S8, principal isômero contendo aproximadamente 13% do isômero Z) foi sintetizado de acordo

40/49 com um procedimento literal (M. Royzen, G. P. A. Yap, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130, 3760 (2008)). Uma dispersão de hidreto de sódio de 60% (1,8 g, 45 mmol) foi adicionada a solução resfriada em banho de gelo de S8 (1,70 g, 13,5 mmol) em 60 mL DMF. Após agitar por 4 h a TA, 4-bromometilbenzoic ácido (3,85 g, 17,9 mmol) foi adicionado em partes e a suspensão foi agitada durante a noite a TA. A mistura doi despejada em água (100 mL) , t-butil metil éter (100 mL) foi adicionado seguido por 37% ácido hidroclorídrico (5 mL). Após a separação, a camada aquosa foi extraída com t-butil metil éter (2x100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (25 mL) , secada sobre MgSO₄ e evaporada. 0 resíduo passou por uma camada de silica com 4:1 hexane/acetato de etilo. O resíduo obtido após a evaporação foi dissolvido em heptano (50 mL) a 7 0°C e então resfriado, fornecendo S9. 0 produto foi dissolvido em DCM (40 mL) , Nhidroxissuccinimida (0,57 g, 4,9 mmol) foi adicionado, a mistura foi resfriada em banho de gelo, seguido por adição de N,Ν'-diciclohexilcarbodiimida (1,03 g, 4,99 mmol). Após 30 min o banho de gelo foi removido e a mistura da reação foi agitada a TA por 18 h. Após filtração e evaporação, o resíduo foi purificado pela cromatografia da coluna em silicautilizando um gradiente de acetato de etilo em heptano (0-15%). Depois, o resíduo foi dissolvido em t-butil metil •25 éter (20 mL) e despejado no heptano (50 mL) , rendendo S10 (1,42 g, 29%) como um sólido branco. ^XH NMR (CDC1₃, 300 MHz, δ): 8,10 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,45 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,60 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 4,54 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 13,4 Hz, 1H) , 3,09 (m, 1H) , 2,91 (s, 4H) , 2,43-1,40 (m,

10H) , ¹³C NMR (CDC1₃, 75 MHz, δ): 169,0 (q) , 161,5 (q) , 146,7 (q) , 135,1 (t) , 132,1 (t) , 130,4 (t) , 127,0 (t), 123,7 (q) ,

85,3 (t) , 68,0 (s) , 40,5 (s), 37,7 (s) , 34,2 (s) , 32,7 (s) ,

41/49

31,4 (s) , 25,4 (s), HRMS (ESI, m/z) : Calculado para

C₂₀H₂₃NO₅Na⁺ ( [M+Na] ⁺) : 380,1474; Encontrado: 380,1472.

(E)-2,5-Dioxopirrolidina-l-il 1-(4-((Ciclooct-4-en1-iloxi)metil)fenila)-1-oxo-5,8,11,14,17,20,23,26,

29,32,35,38-dodecaoxa-2-azahentetracontan-41-oate (S13).

Uma solução de S10 (100 mg, 0,280 mmol) em DCM (2 mL) foi adicionada gota a gota em uma solução de Sil (175 mg, 0,283 mmol) e trietilamina (290 pL, 2,08 mmol) em DCM (2 mL) agitado em um banho de gelo. A mistura da reação foi agitada a TA por 16 h. 0 intermediário bruto S12 obtido após a evaporação foi dissolvido em DCM (5 mL) e resfriado em um banho de gelo. Bis (2,5-Dioxopirrolidina-l-il) carbonato (170 mg, 0,664 mmol) e piridina (28 pL, 0,35 mmol) foram adicionados e a mistura da reação foi agitada a TA por 3 h. A mistura foi filtrada e evaporada e o produto foi purificado pela cromatografia da coluna em silica utilizando um gradiente de metanol em DCM (5-10%) fornecendo S13 como um

óleo viscoso	(119 mg, 39%)	. 3H NMR (CDCI3, 600	MHz,	δ) :	7,79
(d, J = 8,2	Hz, 2H), 7,36	(d, J = 8,2 Hz, 2H) ,	7,00	(s,	1H) ,
5,59 (m, 1H)	, 5,33 (m, 1H)	, 4,49 (d, J = 12,5	Hz,	1H) ,	4,42

(d, J = 12,5 Hz, 1H) , 3,85 (t, J = 6,5 Hz, 2H) , 3,8-3,5 (m,

48H)	, 3,09	(m, 1H) ,	2,90 (t, J =	6,5 Hz, 2H) , 2,85 (s,	4H) ,
2,43	-1,40	(m, 10H) ,	13C NMR (CDC1	3, 150 MHz, δ) : 167,0	(q),
165,	4 (q) ,	164,8 (q)	, 140,8 (q),	133,5 (t), 131,7 (q),	130,4
(t) ,	125,3	(t), 83,4	(t), 68,7 (s	), 68,4 (s), 68,0 (s),	67,6
(s) ,	68,4	(s), 63,9	(s) , 38,9 (s)	, 37,9 (s), 36,1 (s),	32,6
(s) ,	31,1 1	(s), 30,3	(s), 29,8 (s),	23,7 (s). , HRMS (ESI,	m/z) :

Calculado para C₄₇H76N₂Oi8Na⁺ ( [M+Na]⁺) : 957,5171; Encontrado:

957,5174.

Produção de anticorpo.

CC49 foi produzido da linha celular hibridoma CC49 adquirido da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). As células hibridomas foram desenvolvidas em um bioreator

42/49

CELLine CL 1000 (Integra Biosciences AG, Switzerland) em meio de hibridoma livre de soro (H-SFM, Gibco, EUA) suplementadas com penicilina (10 U/ml) e estreptomicina (10 pg/ml). A cada duas semanas a célula sobrenadante foi coletada e CC49 foi 5 purificado pela cromatografia de afinidade da proteína G utilizando um kit MabTrap (GE Healthcare Biosciences, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O CC49 purificado foi lavado com PBS utilizando a unidade de centrifugação Amicon Ultra-15. Este procedimento forneceu uma solução CC49 10 contendo uma única espécie de aproximadamente 150 kDa, conforme combinado na análise SDS-PAGE e SEC-HPLC.

Modificação de anticorpo.

Tipicamente, 2 mg CC4 9 (5 mg/mL solução em PBS) foi modificada com 10 molar eq. de TCO-NHS (S13, 127,6 pg em 12,8 pl DMSO) em um volume total de 500 pL PBS. 0 pH foi ajustado para 9 com tampão de carbonato de sódio 2M. As reações foram realizadas na agitação por 3 0 min a TA no escuro.

Subsequentemente, o mAb modificado por TCO foi extensivamente lavado com PBS utilizando um dispositivo de centrifugação 20 Amicon Ultra-15. Este procedimento forneceu uma média 7,4 dos grupos TCO por anticorpo, conforme determinado com uma titração de tetrazina (vide infra). O aumento de MW resultante da conjugação de TCO não foi detectável por SDSPAGE. Conforme esperado, a modificação mAb resultou em uma -25 redução no ponto isoelétrico (de 6,5-6,8 a ca. 5,8) conforme observado pela análise IEF. O mesmo procedimento foi utilizado para produzir rituximab modificado por TCO (RtxTCO) para controlar as experiências in vivo, com resltados semelhantes.

Radiomarcação do anticorpo.

CC49 nativo ou modificado por TCO (200 pg) em PBS (500 pL) foi transferido a um tubo de ionização, que foi préenxaguado com 1 mL PBS. Sódio [¹²⁵I] iodeto (10-15 MBq) foi

43/49 adicionado, a solução foi incubada por 5 min em TA sobre agitação suave após a qual foi transferida para uma unidade

Amicon Ultra-4. 0 tubo de iodinação foi enxaguado duas vezes com 500 pL PBS e os enxágües foram reservados com a mistura da marcação. O ¹²⁵I-mAb marcado foi lavado extensivamente com

PBS e subsequentemente recuperado do Amicon. Com este procedimento, 88,3 + 9,3 o rendimento da radioiodinação (n=5) foi obtida para CC49 nativa e 30,4 + 4,3% (n=6) para CC49 modificado por TCO. Após a purificação de Amicon, a pureza da 10 radioquímica dos mAbs radiomarcados foi maior do que 98% como confirmado por TLC à rádio e análise SDS-PAGE. O mesmo procedimento foi utilizado para radioidinar Rtx-TCO para controlar as experiências in vivo, com resultados semelhantes. Para experiências animais, a atividade específica (SA) dos ¹²⁵I mAbs marcados purificados foi ajustada para 2 kBq/pg adicionando uma quantidade apropriada do mAb não marcado correspondente.

Radiomarcação de tetrazina.

A	tetrazina	modificada	por DOTA	(sonda	S7)	foi
20 dissolvida	(1	mg/mL)	em 0,2M de	acetato de	amônia	pH 7,	0 e
armazenada	a	-80°C	antes do	uso. Uma	alíquota	S7	foi
combinada	com	uma quantidade adequada de	[1:L1In] cloreto	de

índio e incubada por 10 min a 37°C sobre agitação suave.

Então, 5 pL 10 mM dietilenetriaminepeantaácido acético foi 25 adicionado e a solução foi incubada por 5 min adicionais.

Tipicamente, um rendimento de marcação quantitativo e uma pureza radioquímica maior do que 98% foram obtidas com este método, como confirmado pelo HPLC à rádio e TLC à rádio. Para experiências animais, a solução de ^li:LIn-tetrazina foi diluída 30 com salina estéril. A SA da solução ^1:L1In-tetrazina utilizada para experiências in vitro e para estudos de biodistribuição foi tipicamente 50-100 kBq/pg S7; a SA para experiências de imagem foi 1-2 MBq/pg S7.

44/49

Reatividade In vitro.

A reatividade ^1:L1In-tetrazina em direção a CC4 9-TCO foi testada em PBS (n=3) , 50% soro de camundongo (n=3) e sangue de rato com heparina. Tipicamente, 50 pg mAB modificado por TCO foi incubado com 0,43; 4,3 0 e 6,40 pg ^1:L1In-marcado S7 (1, 10 e 15 molar eq. com relação ao mAb) a 37°C em 100 pL volume total. Misturas de CC49 não modificado e 15 eq. ^luIn-marcado S7 foram utilizadas para avaliar a ligação não específica. Após 10 min, uma alíquota de cada mistura foi analisada por SDS-PAGE e gerador de imagem de fósforo. Observamos uma rápida reação entre os componentes in vitro em condições semi-equimolar e em baixa concentração (3,3 pM) em 10 min em PBS, soro e sangue. 0 mesmo procedimento foi utilizado para avaliar a reatividade de ^11:LIn-tetrazina em direção a Rtx-TCO. A reação entre ^11:LIntetrazina e CC49-TCO em três meios foi completo em 10 min (Tabela 1).

A ligação não apreciável entre a tetrazina marcada e CC49 não modificado ou outros componentes do meio foi detectada, demonstrando a ausência de interações não específicas.

Tabela 1: Rendimentos de reação (%) entre ^11:LIntetrazina (eq. com relação ao mAb) e CC49-TCO após 10 min de incubação (parênteses: # sondas de tetrazina ligadas por mAb) .

PBS Soro Sangue ±1,3 (0,9 ± 0,0) 88,3 ±1,8 (0,9 ± 0,0) 87,0(0,9) ± 6,9 (7,5 ± 0,7) 72,0 ± 1,3 (7,2 ± 0,1) 72,6(7,3) ± 1,5 (7,5 ± 0,2) 48,5 ± 0,4 (7,3 ± 0,1) 50,0(7,5)

0,3 +0,3 0,2 ± 0,20,0 __________eq.)________________________________________________________________________________________________________

Estudos in vivo

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com os princípios do cuidado com animal em laboratório (publicação NIH 85-23, revisado em 1985) e com a lei nacional eq.86,5 eq.74,7 eq.50,0

Controle (15

45/49 holandesa Wet op de Dierproeven (Stb 1985, 336). A linha da célula cancerígena de colo humano LS174T foi obtida do ATCC e mantida mo meio essencial Eagle mínimo (Sigma) suplementado com 10% de soro de bezerro fetal inativado por calor (Gibco), penicilina (100 U/mL), streptomicina (100 pg/mL) e 2 mM

Glutamax. Camundongos fêmeas Balb/C (peso do corpo de 20-25 g, Charles River Laboratories, Holanda) foram incubados via subcutânea com células de 5xl0⁶ em 100 pL PBS estéril. O peso do tumor no período das experiências de imagem e biodistribuição foi 0,38 ± 0,28 g. Animais com tamanhos diferentes foram aleatoriamente atribuídos aos diferentes grupos experimentais.

Os camundongos com tumor (n=4) foram injetados intravenosamente com ¹²⁵I-CC4 9 ou ¹²⁵I-CC4 9-TCO (100 pg/100 pL por camundongos, ca. 0,2 MBq) . Nos pontos de tempo selecionados (5 min, 3e6h, 1, 2e3 dias) as amostras de sangue foram retiradas da veia safena. Quatro dias após a injeção, os ratos foram anestesiados com isoflurano e o sangue foi retirado por punção do coração. As amostras de sangue forma pesadas e diluídas a 1 mL com PBS. A radioatividade da amostra foi medida em um contador γ (Wizard 1480, PerkinElmer) com padrões para determinar a porcentagem da dose injetada por grama (%ID/g) . A meia vida dos mAbs radiomarcados no sangue foi calculada da área sobre as curvas -25 (AUC, GraphPad Prism v. 5,01) na figura 10 utilizando Τχ/₂ =

Ln2xAUC/C₀. Neste estudo, o CC49 modificado por TCO exibiu uma meia vida mais curta do sangue (11,0 h) comparada ao mAb não modificado (19,8 h) . Nós atribuímos isto à mudança do ponto isoelétrico pela funcionalização de resíduos de 7,4 Lys por mAb. Para estudar todo o potencial deste sistema nós selecionados um intervalo de 24 h relativamente curto entre mAb e a administração da sonda.

Experiências de biodistribuição

46/49

Experiências de biodistribuição de isótopo duplo foram realizadas injetando camundongos com tumor (n=3) intravenosamente com ¹²⁵i- mAbs marcados (CC4 9-TCO, CC4 9 ou Rtx-TCO, 100 pg/100 pL por camundongo, ca. 0,2 MBq) e, 24 h mais tarde, com ^1:11In-tetrazina (21 pg/75 pL por camundongo, ca. 0,8 MBq). Resultados são visualizados na figura 11. Três horas após a administração da tetrazina, os animais foram anestesiados com isoflurano e sacrificados por deslocamento cervical. O sangue foi retirado por punção do coração e órgãos e tecidos de interesse foram coletados, engarrafados e pesados. A radioatividade das amostras foi medida em um contador γ com padrões para determinar %ID/g. As janelas de energia foram definidas a 10-80 keV e 100-510 keV para ¹²⁵I e ^i:L1In, respectivamente. A radioatividade da amostra foi medida novamente 3 semanas após a experiência, para verificar os valores ¹²⁵I para potencial ^i:L1In na contaminação cruzada. Durante a avaliação in vivo, as espécies iodinadas não estavam sujeitas a dealogenação significante, conforme evidenciado pela baixa quantidade de ¹²⁵I medido em tireóides e estômagos, e mostrou a distribuição padrão típica de anticorpos de longa circulação. Os ¹²⁵I-mAbs residuais ainda eram detectáveis no sangue (ca. 10%ID/g) e nos órgãos ricos em sangue, como o coração e pulmão (que foram engarrafados a seco mas não perfundidos com salina antes da contagem), 27 h após a injeção. Todas as espécies exibiram liberação hepatobiliar (¹²⁵I-atividade no fígado e intestino) e alguma excreção do rim (radiometabólitos menores). A baixa retenção foi observada no músculo, osso, e cérebro. Em tumores, ambos CC49 e CC49-TCO exibiram um alto acúmulo com um índice tumorpara-sangue (T/B) de 3,2 ± 2,2 e 2,8 ± 0,8 e o índice tumorpara-músculo (T/M) de 22,0 + 10,8 e 34,2 ± 23,8, respectivamente. A variabilidade na retenção do tumor foi observada em ambos os grupos, que é provavelmente devido ao

47/49 desenvolvimento rápido e irregular do tumor (e consequentemente, variação do tamanho do tumor). Entretanto, o acúmulo de tumor das construções de CC49 foi significantemente mais alto para Rtx-TCO (T/B = 0,6 + 0,0,

T/M = 4,9 ± 0,8), indicando a ligação específica por antígeno.

A distribuição de ^li:LIn-tetrazina nos camundongos pré-tratados com CC49-TCO ou Rtx-TCO espelhou ¹²⁵I. Nestes grupos, a alta retenção de ^1:L1In foi observada no sangue, 10 coração, pulmão e fígado, enquanto a baixa atividade foi encontrada no baço, músculo, osso e cérebro. Os órgãos onde não há diferenças significantes tiveram retenção entre ¹²⁵ICC49-TCO e ¹²⁵I-Rtx-TCO (sangue, coração, pulmão, baço, músculo, osso e cérebro), também não mostrou diferenças no 15 acúmulo de ^11:LIn-tetrazina. Uma retenção mais alta 5,2-vezes de ^1:L1In-tetrazina foi encontrada nos tumores contendo 18,8 + 4,7 %ID/g ¹²⁵I-CC49-TCO comparado aos contendo 6,3 ± 1,2 %ID/g ¹²⁵I-Rtx-TCO. Por outro lado, quase nenhuma retenção ^11:LIn foi detectada na maioria dos tecidos do grupo pré-tratado com 20 ¹²⁵I-CC49 não modificado. E importante, enquanto a retenção do tumor de ¹²⁵I-CC49 foi a mais alta entre os três grupos, a retenção do tumor de ^11:LIn neste mesmo grupo foi 16 vezes inferior ao grupo ¹²⁵I-CC49-TCO. Ainda, a retenção de sangue de ^11:Lln-tetrazina foi quase indetectável neste grupo apesar -25 da presença de 8,7 + 5,9 %ID/g ¹²⁵I-CC49. Apenas o rim exibiu uma retenção relativamente alta de ^11:LIn em todos os 3 grupos como uma conseqüência da excreção de tetrazina radiomarcada.

A observação que a tetrazina acumula apenas em órgãos e tecidos que contêm uma espécie modificada por TCO 30 mostra que uma reação química entre estas duas entidades ocorreu in vivo. Nós determinamos o rendimento da reação DA in vivo calculando a quantidade absoluta de TCO e tetrazina presente em tecidos de %ID/g de ¹²⁵I e ^li:LIn, respectivamente.

48/49

De acordo com a alta reatividade e seletividade entre a tetrazina e mAb-TCO observou in vitro, 56,7 ± 2,0% e 52,1 + 3,0% das partes de TCO presentes no sangue e tumor, respectivamente, reagiu com a sonda de tetrazina no grupo 5 pré-tratado com CC49-TCO. Estes rendimentos são remarcáveis considerando a baixa concentração dos componentes envolvidos na reação (0,42 + 0,20 e 0,93 ± 0,23 nmol/g no sangue e tumor, respectivamente, para TCO e um máximo de 2,3 nmol/g no sangue para a tetrazina diretamente após a injeção), a 10 complexidade do ambiente de reação e a meia vida biológica curta da tetrazina (11,8 min).

Experiências de imagem.

Ratos com tumor foram injetados com ^li:LIn-tetrazina (21 pg/75 pL por camundongo, 20-42 MBq) 24 h após receber mAb 100 pg 15 (CC49-TCO, CC49 ou Rtx-TCO) . Aproximadamente 1 h depois, os camundongos foram anestesiados e posicionados em uma cama animal equipada com um cone em forma de nariz para anestesia e um sensor para monitoramento respiratório. A tomografia computada por única emissão de fóton (SPECT) foi realizada 2 20 h após a injeção de tetrazina com um sistema de imagem

SPECT/CT anima pequeno com multi-furo de quatro cabeças (NanoSPECT, Bioscan Inc., EUA). A aquisição SPECT (1 h total) foi realizada com furos de diâmetro de 1,4 mm e um período de aquisição de 120-140 seg por visão (24 projeções). A janela 25 de energia para ^11:LIn foi ajustada a 245 keV ± 15% e 171 keV ±

20%. Os camundongos foram eutanizados com uma overdose de anestesia 3 h após a injeção de tetrazina. Subsequentemente, scans de alta resolução post-mortem foram realizados com furos de 1,0 mm de diâmetro e um período de aquisição de 750 30 seg por visão (32 projeções) . Antes de cada sessão SPECT um scan CT (2 seg por projeção, 360 projeções) foi realizado para obter informações anatômicas na distribuição de radioatividade. Após a aquisição, os dados foram

49/49 reconstruídos iterativamente com o software do fabricante (InVivoScope 1,39, patch 1). As regiões de interesse (Ris) foram retiradas manualmente em triplicata para o tumor, fígado, rim e músculo da coxa. Um fantasma preenchido com uma quantidade conhecida de ^i:L1In foi utilizado para calibrar o scanner para quantificação da radioatividade do tecido.

A retenção do tumor pronunciada da ^11:LIn-tetrazina foi demonstrada pela imagem SPECT/CT de camundongos vivos até 3 h após a injeção (figura 12A/D; índice tumor-para-músculo (T/M)=13,l). Os tecidos não marcados de retenção limitada foram atribuídos com circulação residual CC49-TCO. De maneira importante, em ratos tratados com CC49 não modificado, o tumor não pode ser discriminado no tecido envolvendo (figura 12B/E, T/M=0,5). Quase nenhuma radiação foi retida no sangue e órgãos não marcados como a sonda foi rapidamente eliminada através da veia urinária, significando sua biortogonalidade. Os camundongos tratados com rituximab modificado por TCO, que não dispõe de especificidade para TAG72, mostraram retenção esperada de ^11:1In-tetrazina no sangue e órgãos não marcados, e um acúmulo de tumor muito reduzido (figura 12C/F).

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. KIT PARA IMAGEM MÉDICA MARCADA E/OU TERAPIAS, caracterizado por compreender pelo menos uma sonda de prémarcação e pelo menos uma sonda efetora, em que a sonda de pré-marcação compreende uma Parte da Marcação Primária e um primeiro Grupo Reagente Biortogonal, e em que a sonda efetora compreende uma Parte Efetora, como um marcador ou composto farmaceuticamente ativo, e um segundo Grupo Reagente Biortogonal, em que o primeiro e o Grupos Reagentes Biortogonais são dienófilo e o outro do primeiro e segundo Grupos Reagentes Biortogonais é um dieno, em que o dienófilo é um dienófilo do anel de 8 membros tensionados satisfazendo a fórmula (1) :

   R₂ R₂

   C r₂ccr

   II

   R₂C,^^

   XC=CY(D em que cada R independente denota H, ou, em no máximo seis exemplos, um substituinte selecionado do grupo

   5 que consiste alquila, 0-alquila, S-alquila, F, Cl, Br, I, S0₂, N0₂, NR'R com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila, C(=0)Oalquila, C(=0)0arila, CONR'R com R' e R cada um independentemente sendo H, arila ou alquila, OCOalquila, OCOarila, NR'COalquila com R' sendo H ou alquila, 10 NR'COarila com R' sendo ou alquila, NR'C(=0)Oalquila com R' sendo H ou alquila, NR'C(=0)Oarila com R' sendo H ou alquila, OCONR'alquila com R' sendo H ou alquila, OCONR'arila com R' sendo H ou alquila, NR'CONRalquila com R' e R cada um independentemente sendo H ou alquila, NR'CONRarila com R' e 15 R cada um independentemente sendo H ou alquila,

   NR'CSNRalquila com R' e R cada um independentemente sendo H

   2/7 ou alquila, e NR'CSNRarila com R' e R cada urn independentemente sendo H ou alquila; com pelo menos um R compreendido em uma parte ligadora, opcionalmente através de um espaçador, para a sonda de pré-marcação ou a sonda efetora em que X e Y cada um independentemente denotam H, ou um substituinte selecionado do grupo que consiste alquila, Oalquila, S-alquila, F, Cl, Br, I, SO₂, NO₂, e NRR' com R e R' cada um independentemente sendo H ou alquila, ou juntos formam uma ligação; e em que o dieno é selecionado de forma a poder reagir com o dienófilo submetendo uma Cicloadição Diels-Alder seguida por uma reação retro Diels-Alder, e em que o dieno é selecionado do grupo caracterizado por consistir compostos das formulas (2), (3),(4), (5) e (6) conforme definido abaixo:

   
2. (2) em que R¹ é selecionado do grupo que consiste alquila, arila, 0-alquila, C(=0)O-alquila, O-, e NH₂; A e B cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste carbono substituído por alquila, arila carbono substituído, nitrogênio, N⁺0‘, N⁺R com R sendo alquila, com a ressalva que A e B não são ambos carbonos; X é selecionado do grupo que consiste O, N-alquila, e C=0, e Y é CR com R sendo selecionado do grupo que consiste H, alquila, arila,

   C(=0)Oalquila;

   
3. (3)

   3/7 em que R¹ e R² cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste H, alquila, arila, OH, C (=0) 0-alquila, CF3, e N02; A é selecionado do grupo que consiste N-alquila, N-arila, C=0, e CN-alquila; B é 0; X é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, CC(=0)0-alquila e N; Y é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, N, e N⁺O‘;

   

   I I

   

   em que R¹ e R² cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste H, alquila, arila, OH, C (=0) 0-alquila, CF3, e N02; A é selecionado do grupo que consiste CO, Calquila-alquila. CN-alquila, N-alquila, e Narila; B é 0; X é selecionado do grupo que consiste CH, Calquila, C-arila, CC(=0)0-alquila e N; Y é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, N, e N⁺0* ;

   R¹

   

   

   em que R¹ e R² cada um independentemente são selecionados do grupo que consiste H, alquila, arila, OH, C (=0) 0-alquila, CF3, e N02; A é selecionado do grupo que consiste N, C-alquila, C-arila, e N⁺0‘; B é N; X é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, CC(=0)0-alquila e N; Y é selecionado do grupo que consiste CH, C-alquila, C-arila, N, e N⁺0‘;

   R¹

   

   R em que R é selecionado do grupo que consiste H, C(=0)O-alquila, CF3, e N02; R² é selecionado do grupo que consiste H, alquila, arila, OH, alquila, arila, CN, OH,

   C(=0)O-alquila, CF3, e NO2;

   A é selecionado do grupo alquila, C-arila, CC(=0)O-alquila, selecionado do grupo que consiste que

   CH, consiste N, CH, ΟN⁺O; B é

   C-alquila,

   CC (=0) O-alquila e N; Y é selecionado do grupo que

   C-arila, N, e N⁺0‘,

   CH, CCN, C-alquila, em que a dita sonda efetora

   Ν; X é

   C-arila, consiste compreende uma parte estrutural que pode formar um complexo de coordenação com um metal.

   KIT, de acordo com a reivindicação

   1, caracterizado

   H4dotma.

   caracterizado em que

   KIT, de em que o

   R1

   

   R² em substituinte fenila, ou a dita parte acordo com a dieno satisfaz estrutural é H4dota reivindicação 1 ou a fórmula ou

   2, que R¹ e R² cada um um independentemente denotam grupo que consiste 2-piridil, fenila substituída com um ou mais grupos selecionado do

   5/7 removedores de elétron como NO2, CN, COOH, COOR, CONH₂, CONHR, CONR₂, CHO, COR, SO₂R, SO₂OR, NO, e Ar, em que R é C_xC₆ alquila e Ar é responsável pelo grupo aromático, particularmente fenila, piridil, ou naftil.

   4. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado em que o dito dienófilo

   

   5. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a sonda de pré-marcação é caracterizada por compreender, como uma Parte da Marcação Primária, um anticorpo.

   6. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a sonda efetora é caracterizada por compreender, como uma parte efetora, um marcador detectável, preferivelmente um agente de contraste para uso em sistemas de imagem, selecionado do grupo que consiste agentes imagináveis por IRM, marcadores de spin, marcador ópticos, agentes receptivos por ultrassonografia, agentes receptivos por radiografia, radionuclídeos, tinturas do tipo FRET, moléculas (bio)luminescente ou fluorescentes ou tags, biotina, reagentes paramagnéticos de imagem e superreagentes paramagnéticos de imagem.

   7. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada em que a sonda efetora compreende, como uma parte efetora, um composto farmaceuticamente ativo.

   5 8. KIT, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado em que o composto farmaceuticamente ativo é um isótopo selecionado do grupo que consiste ²⁴Na, ³²P, ³³P, ⁴⁷Sc,

   ⁵⁹Fe, ⁶⁷Cu, ⁷⁶As, ⁷⁷ AS, ⁸⁰ Br, ⁸²Br, ⁸⁹Sr ·, ⁹⁰Nb 90γ ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ^xllAg, ¹²¹Sn, ¹²⁷Te, ¹³¹I, ¹⁴⁰La, ¹⁴¹Ce, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁴Pr, 10 ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵¹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁹Er, ¹⁷²Tm, ¹⁷⁵ Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹¹Bí, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²¹⁴bí, ²²³Ra, e ²²⁵Ac. 9 . SONDA EFETORA, conforme definida em qualquer uma

   das reivindicações 1 a 7, caracterizada por compreender um

   15 isótopo selecionado do grupo que consiste ³H, ^1:LC, ¹³n, ¹⁵0 ⁶³Zn, , ¹⁸F, ⁶⁴ Cu, ¹⁹f, ⁵¹Cr, ⁵²Fe, ⁵²Mn, ⁵⁵Co, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Zn, ^e2Cu, ⁶⁵Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁰As, ⁷¹As, ⁷²As, ⁷⁴As, ⁷⁵Se, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁸⁰Br, ⁸²Br, ⁸²Rb, S6y, ⁸⁹Sr, ⁸⁹Zr, ⁹⁷Ru, Tc, ¹¹⁰In, ³¹¹Ιη, ¹¹³ln , ¹¹⁴In, ¹¹⁷Sn 120j ¹²²Xe ¹²³J 124j ¹²⁵I, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁷Tm, ^1S9Yb, 20 ¹⁹³Pt , ¹⁹⁵Pt, ^2O1T1 , e ²⁰³Pb. 10. MÉTODO, caracterizado por compreender a

   administração de uma sonda de pré-marcação, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para um sujeito e permitindo que a sonda circule no sistema do sujeito por um -25 período de tempo efetivo para obter a ligação da Parte da

   Marcação Primária em uma marcação primária, seguida pela compensação do agente não ligado do corpo seguido pela administração de uma sonda efetora, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que os Grupos 30 Reagentes Biortogonais na sonda de pré-marcação e na sonda efetora juntas formam os parceiros reagentes para uma reação retro Diels-Alder [4+2].

   7/7

   11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado em que a dita sonda efetora compreende radionucleotídeo utilizado para a imagem selecionada do grupo

   que consiste ³H , ³¹c, ¹³n, ¹⁵O, ¹⁸F, ¹⁹f, ⁵¹Cr, ⁵²Fe, ⁵²Mn, ⁵⁵Co, 5 ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Zn, ⁶²Cu, ⁶³Zn , ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ^S7Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁰As, ⁷¹As, ⁷²As, ⁷⁴As, ⁷⁵Se, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁸⁰I 3r, ⁸² Br, ⁸²Rb, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁸⁹Sr, ⁸⁹Zr, ⁹⁷Ru, Tc, ¹¹⁰In, ³¹¹In , ¹¹³In, ¹¹⁴In, ¹¹⁷Sn, ¹²⁰I, ¹²²Xe, 123 j ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁹Yb , ¹⁹³Pt, ¹⁹⁵Pt, ^2O1T1, e ²⁰³Pb. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10,

   10 caracterizado em que a dita sonda efetora compreende um radionucletídeo utilizado para terapia selecionado do grupo que consiste ²⁴Na, ³²P, ³³P, ⁴⁷Sc, ⁵⁹Fe, ⁶⁷Cu, ⁷⁶As, ⁷⁷As, ⁸⁰Br,

   ⁸²Br, ⁸⁹Sr, ^9C ’Nb, ⁹⁰ Y, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd , ^li:LAg, ¹²¹Sn, ¹²⁷Te , ¹³¹I, ¹⁴⁰La, ¹⁴¹Ce, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁴Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵¹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁵⁹Gd, 15 ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁹Er, ¹⁷²Tm, ¹⁷⁵ Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²¹⁴Bi, ²²³Ra, e ²²⁵Ac. 13 . KIT , de acordo com a reivindicação 7 ou 8,

   caracterizado por ser para utilização na terapia marcada, preferivelmente radioterapia.