BRPI1008009B1

BRPI1008009B1 - Métodos para criopreservação de tecido sem gelo

Info

Publication number: BRPI1008009B1
Application number: BRPI1008009-0A
Authority: BR
Inventors: G. M. Brockbank Kelvin
Original assignee: Cell & Tissue Systems, Inc.; Lifeline Scientific, Inc.
Priority date: 2009-02-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2018-05-29
Also published as: CN102438445B; BRPI1008009A2; EP2398316B1; EP2398316A2; CN102438445A; CA2753291C; US8440390B2; WO2010096821A3; US20100216110A1; WO2010096821A2; CA2753291A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO SEM GELO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO O presente pedido não-provisório reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/154.495 depositado em 23 de fevereiro de 2009. O relatório do pedido anterior é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

A invenção refere-se a um método para preservação de tecidos. Mais especificamente, a invenção refere-se a um método para preservação de matrizes de tecido através do emprego de altas concentrações de agentes químicos crioprotetores. A invenção é aplicável a aplicações de matrizes de tecido extracelulares intactas que não requerem células vivas ou viáveis. ANTECEDENTES

Preservação em baixa temperatura de tecidos biológicos tais como órgãos, isto é, criopreservação, tem sido o objeto de muito esforço de pesquisa. A criopreservação pode ser abordada através de congelamento ou através de vitrificação. Se o tecido for congelado, cristais de gelo podem se formar dentro do tecido que pode romper mecanicamente sua estrutura e então danificar a sua habilidade em funcionar corretamente quando ele é transplantado para um recipiente. Tecidos organizados são particularmente suscetíveis a dano mecânico por cristais de gelo formados durante o congelamento.

Tecidos humanos e animais criopreservados são usados em uma variedade de aplicações médicas. Em particular, transplante de válvulas cardíacas criopreservadas (aloenxertos) representa uma opção para substituição de válvula bem estabelecida. Vide 0'Brien,M M.F., Flarrocks, S., Staf-ford, E.G. e outros, J. Heart Valve Dis. 10:334-344 (2001).

No entanto, aplicação deste conceito de tratamento é limitada pela degeneração e falha a longo prazo e complicada devido a infraestrutu-ras de preservação, armazenamento e transporte caras. Vide Mayer, J.E. Jr., Sem. Thorac. Cardiovasc. Surg. 7:130-132 (1995).

Mesmo quando todas as variáveis de criopreservação estão controladas, há um limite, que é amplamente uma função de volume e geometria de tecido (incluindo quaisquer fluidos associados e embalagem), além do qual métodos de criopreservação tradicionais não funcionam consistentemente. Por exemplo, em válvulas cardíacas de aloenxerto criopreservadas, os fibroblastos de folheto sobrevivem bem (70-90%), mas nem as células endoteliais nem as células de músculo liso do tecido aórtico associado com a válvula sobrevivem. Os problemas incluem a formação de gelo ou dentro das células, na matriz extracelular, na cápsula ou, como caso de endotélio da válvula cardíaca, compressão no lúmen da artéria associada.

Transplante de válvulas cardíacas de aloenxerto foi primeiro clinicamente introduzido em 1962. Vide Ross, D., Lancet 12:487 (1962). Válvulas cardíacas de aloenxerto foram mostradas demonstrar características hemodinâmicas iniciais excepcionalmente boas, dificilmente quaisquer eventos tromboembólicos sem anticoagulação e melhor resistência à endocardite comparado com substitutos bioprostéticos ou de válvula mecânica. Vide O'-Brien, M., Stafford, E., Gardner, M., Pohlner, P., McGiffin, D., J. Thorac. Car-diovasc. Surg. 94:812-23 (1987); vide também Tuna, I.C., Orszulak, T.A., Schaff, H.V., Danielson, G.K., Ann. Thorac. Surg. 49:619-24 (1990).

Inicialmente, as válvulas foram coletadas e imediatamente transplantadas como chamados homovitais. Vide Gonzalez-Lavin, L., Mc-Grath, L.B., Amini, S., Graf, D., J. Card. Surg. 3:309-12 (1988). Devido a questões logísticas, os enxertos foram subsequentemente armazenados a 4o C em meio de cultura de tecido com antibióticos por até 6 semanas antes do implante. Vide Jonas, R.A., Ziemer, G., Britton, L., Armiger, L.C., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 96:746-55 (1988).

Eventualmente, a fim de permitir armazenamento a longo prazo e melhorar a segurança por meio de microbiologia e virologia, criopreservação com congelamento de taxa controlada e armazenamento em nitrogênio de fase de vapor foi introduzida. Vide Watts, L.K., Duffy, P., Field, R.B., Stafford, E.G., 0'Brien, M.F., Ann. Thorac. Surg., 21:230-6 (1976). Durante os últimos 20 anos, criopreservação congelada (FC) (Frozen Cryopreservation) tem sido a escolha em todo o mundo para preservação de válvulas cardíacas humanas. Vide Standards for Tissue Banking, 11th Edição, American Association of Tissue Banks, 2006.

Os métodos de FC empregavam uma estratégia onde formação de gelo foi encorajada porque formação de gelo é uma parte crítica do processo de congelamento. Vide Schenke-Layland, K., Madershahian, N., Rie-mann, I. e outros, Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006). Funcionamento a longo prazo de válvulas cardíacas criopreservadas (aloenxertos) é limitado por respostas imunes, inflamação, deterioração estrutural subsequente e uma infraestrutura cara. Vide Mitchell, R.N., Jonas, R.A., Schoen, F.J., J Thorac. Cardiovasc. Surg. 115:118-27 (1998); vide também; Mayer, J.E. Jr., Sem. Thorac. Cardiovasc. Surg. 7:130-132 (1995). A durabilidade de válvulas de aloenxerto criopreservadas contemporâneas varia de 50% a 90% em 10 a 15 anos. Vide 0'Brien, M.F., Har-rocks, S., Stafford, E.G. e outros, J. Heart Valve Dis. 10:334-344 (2001). Em particular, em pacientes pediátricos a função de aloenxerto é limitada por deterioração estrutural mais precoce e mais rápida necessitando de procedimentos de reintervenção mais frequentes. Bonhoeffer, P., Boudjemline, Y., Saliba, Z. e outros, Lancet 356:1403-5 (2000); vide também Joudinaud, T.M. e outros, Eur. J. Cardiothorac. Surg. 33:989-94 (2008). Uma variedade de mecanismos para esta deterioração de estrutura aumentada foi proposta incluindo inflamação mediada por célula T. Vide Legare J.F., Lee T.D., Crea-ser K., Ross D.B., Ann. Thorac. Surg. 70:1238-45(2000).

Outro mecanismo potencial é o próprio processo de congelamento e armazenamento. Embora tenha sido mostrado anteriormente que FC acelera a degeneração em um modelo de roedor singeneico, o impacto direto de formação de gelo sobre tecidos contendo fibra elástica e colágeno não poderia ser mostrado conclusivamente usando métodos de visualização convencionais. 14. Legare, J.F., Lee, D.G., Ross, D.B., Circulation 102: III75-78 (2000). O desenvolvimento e a aplicação de autofluorescência induzida por multifóton e imagem por SHG permitiram a visualização de alterações de ECM com resolução submícron. Vide Schenke-Layland, K. e outros, Ann.

Thorac. Surg. 81:918-26 (2006); vide também Schenke-Layland, K. e outros, Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50 (2007).

Estudos utilizando metodologias de imagem com multifóton (Ml) demonstraram que FC convencional através de congelamento controlado é acompanhada por sérias alterações de estruturas de matriz extracelular. Vide Schenke-Layland, K., Madershahian, N., Riemann, I. e outros, Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006).

Criopreservação vítrea (VC) (Vitreous Cryopreservation) foi identificada como uma abordagem de preservação alternativa que evita formação de gelo e preserva ECM in vitro. Vide Song, Y.C., Khirabadi B.S., Light-foot, F.G., Brockbank, K.G.M., Taylor, M.J., Nature Biotech 18: 296- 299 (2000); vide também Schenke-Layland, K., Xie, J., Hagvall, S.H. e outros, Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50 (2007).

Vitrificação significa solidificação, como em um vidro, sem formação de cristal de gelo. Princípios de vitrificação são bem-conhecidos. Em geral, a temperatura mais baixa para a qual uma solução possivelmente su-peresfria sem congelar é a temperatura de nucleação homogênea Th, temperatura na qual cristais de gelo nucleiam e se desenvolvem, e um sólido cristalino é formado a partir da solução. Soluções de vitrificação têm uma temperatura de transição vítrea Tg, temperatura na qual o soluto vitrifica, ou se torna um sólido não-cristalino. Devido à cinética de nucleação e formação de cristal, é efetivamente impossível que as moléculas de água fiquem alinhadas para formação de cristal em temperaturas muito abaixo da Tg. Ainda, quando do esfriamento da maior parte das soluções aquosas diluídas para sua temperatura de transição vítrea, Th é encontrada antes da Tg, e nucleação de gelo ocorre, o que torna impossível vitrificar a solução. A fim de tornar tais soluções úteis na preservação de materiais biológicos através de vitrificação, é então necessário mudar as propriedades da solução de maneira que vitrificação ocorra ao invés de nucleação e formação de cristal de gelo.

Embora seja geralmente conhecido que pressões hidrostáticas altas aumentam a Tg e diminuem a Th, vitrificação da maior parte das solu- ções através da aplicação de pressão é frequentemente impossível ou im-prático. Em particular, para muitas soluções vitrificáveis através da aplicação de pressão, as pressões requeridas causam lesão severa inaceitável a bio-materiais não-protegidos durante sua vitrificação. Embora seja também conhecido que muitos solutos, tais como crioprotetores geralmente empregados tal como DMSO, aumentam a Tg e diminuem a Th, concentrações de solução de DMSO ou solutos similares altas o suficiente para permitir vitrificação tipicamente abordam a concentração eutética e são geralmete tóxicas para materiais biológicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As modalidades incluem um método para preservação de um tecido compreendendo imersão do tecido em uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso e esfriamento deste tecido na solução tendo a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso para uma temperatura entre cerca de -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução tendo a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso.

As modalidades incluem um método para preservação de um tecido compreendendo imersão do tecido em uma série de soluções tendo concentrações altas de crioprotetor para obter imersão em uma solução final com uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, e esfriamento do tecido na solução tendo a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso para uma temperatura entre cerca de -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução tendo a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso. A presente invenção refere-se a essas necessidades através da provisão de um método de criopreservação sem gelo para preservar integridade da matriz, diminuir a resposta imune e melhorar a função a longo prazo de tecido de mamífero, tais como válvulas cardíacas de aloenxerto, para implante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS O presente pedido de patente contém pelo menos um desenho colorido. A figura 1 demonstra a morfologia bruta de válvulas cardíacas pulmonares explantadas após 7 meses do implante na posição ortotópica. A figura 1A mostra válvula cardíaca criopreservada (FC) congelada com es-pessamento dos folhetos (setas). A figura 1B mostra válvula cardíaca criopreservada sem gelo (IFC) com aparência normal dos folhetos. A figura 2 demonstra a histologia de válvulas pulmonares explantadas 7 meses após o implante. Válvulas FC são mostradas nas figuras 2A-2D e válvulas IFC são mostradas nas figuras 2E-2H. A figura 3 demonstra a histologia de imunoistoquímica usando CD3 com um anticorpo primário reativo cruzado. Válvulas IFC são mostradas nas figuras 3A-3D e válvulas FC são mostradas nas figuras 3E-3H. A figura 4 demonstra a imagem por autofluorescênica excitada com multifóton (figuras 4A, 4B, 4D e 4E) e traçado de perfil de sinal de geração de segundo harmônico (SHG) (Second Harmonic Generation) (figuras 4C e 4F) de estruturas de folheto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES

Um método de criopreservação sem gelo (IFC) (Ice-free cryo-preservatiori) para preservação de tecidos,tais como matrizes de tecido ex-tracelulares intactas que não requerem células vivas ou viáveis, pode compreender: imersão do tecido em uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso ou imersão do tecido em uma série de soluções com a solução final tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso; e etapa de esfriamento única, de gradiente ou em etapas, onde o tecido é esfriado para uma temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20° C; uma etapa de armazenamento, onde o tecido é armazenado em temperatura entre a temperatura de transição vítrea da solução crioprotetora e -20° C; e etapa de reaquecimento opcional, onde o tecido é aquecido em uma etapa de reaquecimento única, de gradiente ou em etapas; e uma etapa de imersão ou lavagem ocorrendo durante ou após a etapa de reaquecimento, onde o crioprotetor é retirado do tecido em etapas única, de gradiente ou múltiplas. "Tecido" é usado aqui para se referir a quaisquer matrizes de tecido extracelulares biológicas naturais ou engenheiradas que não requerem células viáveis, vivas, incluindo matrizes de tecido extracelulares de tecidos vascularizados e tecidos avasculares, incluindo tecido vascular, tais como vasos sanguíneos, tecido musculoesqueletal, tais como cartilagem, menisco, músculo, ligamentos e tendões, pele, tecido cardiovascular, tais como válvulas cardíacas e miocárdio, tecido periodontal, nervos periféricos, tecidos gastrointestinais, ureter e uretra. "Vaso sanguíneo" é usado aqui para se referir a qualquer tubo biológico que transporta sangue. Desta maneira, a expressão refere-se, inter alia, a uma artéria, capilar, veia, seio ou construto enge-nheirado.

Conforme aqui usado, o termo "transplante" refere-se a qualquer tipo de transplante ou implante seja autólogo ou não, homólogo ou heterólo-go, e seja realizado ou não diretamente ou subsequente a processamento adicional do tecido.

Conforme aqui usado, o termo "vitrificação" refere-se à solidificação sem formação de cristal de gelo. Conforme aqui usado, um tecido é vitrificado quando ele atinge a temperatura de transição vítrea (Tg). O processo de vitrificação envolve um aumento acentuado em viscosidade da solução crioprotetora conforme a temperatura é diminuída de maneira que nu-cleação e formação de gelo são inibidas. Na prática, vitrificação ou criopre-servação vítrea pode ser conseguida mesmo na presença de uma quantidade de gelo pequena, restrita, que é menos do que uma quantidade que causa lesão ao tecido.

Conforme aqui usado, a "temperatura de transição vítrea" refere-se à temperatura de transição vítrea de uma solução de formulação sob as condições nas quais o processo está sendo conduzido. Em geral, o processo da presente invenção é conduzido em pressões fisiológicas. No entanto, pressões altas podem ser usadas, contanto que o tecido não seja significan-temente danificado.

Conforme aqui usado, "pressões fisiológicas" refere-se a pressões que os tecidos sofrem durante função normal. O termo "pressões fisio- lógicas" então inclui condições atmosféricas normais, bem como as pressões maiores, que vários tecidos, tais como tecidos vascularizados, sofrem sob condições diastólicas e sistólicas.

Conforme aqui usado, o termo "perfusão" significa o fluxo de um fluido através do tecido. Técnicas para perfusão de órgãos e tecidos são discutidas na, por exemplo, Patente U.S. No. 5.723.282 para Fahy e outros, que é aqui incorporada em sua totalidade.

Conforme aqui usado, o termo "crioprotetor" significa um agente químico que minimiza a formação de cristal de gelo em um tecido quando o tecido é esfriado para temperaturas subzero e não resulta em substancialmente nenhum dano ao tecido após aquecimento, em comparação com o efeito de esfriamento sem crioprotetor.

Conforme aqui usado, o termo "tecido substancialmente livre de crioprotetor" refere-se a um tecido não tendo substancialmente nenhum crioprotetor nele, tal como um tecido contendo menos do que 2% em peso de crioprotetor ou um tecido tendo menos do que 1% em peso de crioprotetor ou um tecido tendo menos do que 0,1% em peso de crioprotetor. Conforme aqui usado, o termo "tecido livre de crioprotetor" refere-se a um tecido não tendo nenhum crioprotetor nele.

Conforme aqui usado, o termo "solução substancialmente livre de crioprotetor" refere-se a uma solução não tendo substancialmente nenhum crioprotetor nela, tal como uma solução contendo menos do que 1% de crioprotetor em peso ou uma solução tendo menos do que 0,5% de crioprotetor em peso ou uma solução tendo menos do que 0,1% de crioprotetor em peso. Conforme aqui usado, o termo "solução livre de crioprotetor" refere-se a uma solução não tendo nenhum crioprotetor nela.

Conforme aqui usado, "equilíbrio osmótico aproximado" significa que não há mais do que 10% de diferença entre as concentrações de soluto intracelular e extracelular, tal como uma diferença de não mais do que 5% entre as concentrações de soluto intracelular e extracelular. Uma diferença de não mais do que 10% significa, por exemplo, que se a concentração extracelular for 4M a concentração de soluto intracelular está entre 3,6 e 4,4M.

Vitrificação pode ser obtida usando uma variedade de misturas crioprotetores e condições de esfriamento/aquecimento. As variáveis-chave devem ser otimizadas para cada tipo de matriz de tecido extracelular particular e tamanho de amostra. A escolha de misturas crioprotetoras e das etapas de equilíbrio necessárias para adição de crioprotetor e remoção sem choque osmótico indevido deve ser otimizada com base na cinética medida de per-meação de crioprotetor em amostras de tecido. Criossubstituição pode ser também empregada para verificar que preservação sem gelo foi obtida para um dado protocolo.

As modalidades podem compreender um processo de esfriamento único ou em etapa, tal como quando o tecido é esfriado (em uma taxa constante) em uma primeira solução contendo crioprotetor em temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20° C; e uma etapa de armazenamento, onde o tecido é armazenado em uma temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20° C. A etapa de esfriamento única pode ser também realizada em uma etapa única de diminuição da temperatura do tecido onde a taxa de esfriamento permanece constante ou muda ou aumentando ou diminuindo. Alternativamente, o tecido pode ser esfriado em um processo de esfriamento em etapas onde a temperatura do tecido é diminuída para uma primeira temperatura em uma primeira solução contendo crioprotetor em uma primeira temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20° C, então ela é diminuída mais para uma segunda temperatura em uma segunda solução contendo crioprotetor em uma temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20° C e este processo pode ser repetido com uma terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, etc, solução até que a temperatura desejada seja atingida.

Em modalidades, a temperatura de transição vítrea da primeira solução (formulação de solução de crioprotetor) está na faixa de a partir de cerca de -100° C a cerca de -140° C, tal como cerca de -110° C a cerca de -130° C ou -115° C a cerca de -130° C, por exemplo, cerca de -124° C. Em modalidades, o tecido pode ser esfriado e subsequentemente armazenado em temperaturas entre a temperatura de transição vítrea e cerca de -20° C, tal como cerca de -120° C a cerca de -20° C, tal como entre cerca de -110° C a cerca de -30° C ou entre cerca de -90° C e cerca de -60° C.

Durante a etapa de esfriamento e a etapa de armazenamento, é importante prevenir quebra de tecido-vidro e formação de gelo. Em contraste com outros métodos de criopreservação, um método para preservação de um tecido, tal como tecido de mamífero, é focado na preservação de matriz sozinha, e o método não precisa ser especificamente planejado para preservar células em um estado viável. "Mamífero" é usado aqui para se referir a qualquer mamífero, tal como um ser humano.

Em modalidades, uma etapa de esfriamento única; um processo de esfriamento em etapas em intervalos reguladores, crescentes ou decrescentes; ou uma etapa de esfriamento de gradiente onde a taxa de esfriamento é aumentada ou diminuída durante o processo de esfriamento, pode ser usado para esfriar o tecido para uma temperatura na faixa de cerca de -60° C a cerca de -100° C, tal como -70° C a cerca de 90° C, por exemplo, cerca de -80° C.

Ao empregar uma formulação de solução de criopreservação de concentração alta, esfriamento e armazenamento em uma temperatura entre a temperatura de transição vítrea da formulação de crioprotetor e cerca de -20° C podem ser obtidos sem quebra de tecido-vidro e congelamento. Em modalidades, a primeira solução contém cerca de 75% em peso ou mais de crioprotetor, tal como cerca de 80% a cerca de 99% de crioprotetor ou cerca de 83% a cerca de 95% de crioprotetor.

Após ser imerso em uma solução livre de crioprotetor, o tecido pode ser imerso em uma solução contendo crioprotetor com e sem perfusão. A concentração de crioprotetor final pode ser obtida em um processo de esfriamento em etapas onde o tecido pode ser imerso em uma primeira solução contendo uma primeira concentração de crioprotetor, então o tecido pode ser imerso em uma segunda solução contendo uma segunda concentração de crioprotetor (que é maior do que a primeira concentração de criopro- tetor) e este processo pode ser repetido com uma terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, etc, solução até que a concentração desejada seja obtida. A solução de crioprotetor pode conter qualquer combinação de crioprotetores. Crioprotetores incluem, por exemplo, sulfóxido de dimetila, 1,2-propanodiol, etileno glicol, n-dimetilformamida e 1,3-propanodiol em adição àqueles listados abaixo na Tabela 1.

Agentes de crioproteção impermeáveis tal como polivinilpirroli-dona ou hidroxietilamido podem ser mais eficazes na proteção de sistemas biológicos esfriados em taxas rápidas. Tais agentes são frequentemente macromoléculas grandes, que afetam as propriedades da solução para um grau maior do que seria esperado de sua pressão osmótica. Alguns desses agentes crioprotetores têm efeitos de proteção diretos sobre a membrana celular. No entanto, o mecanismo primário de ação parece ser a indução de formação de vidro extracelular. Quando tais crioprotetores são usados em concentrações extremamente altas, formação de gelo pode ser eliminada totalmente durante esfriamento para e aquecimento a partir de temperaturas criogênicas. Agentes químicos impermeáveis com atividade crioprotetora demonstrada incluem agarose, dextranos, glicose, hidroxietilamido, inositol, lactose, metil glicose, polivinilpirrolidona, sorbitol, sacarose e ureia.

Em modalidades, a solução crioprotetora contém sulfóxido de dimetila, formamida e 1,2-propanodiol em uma solução veículo, tal como solução Euro-Collins. Tal solução pode conter cerca de 75% a cerca de 99% p/v de crioprotetor. A quantidade de sulfóxido de dimetila pode ser variada de 20 a 50% p/v. Similarmente, a quantidade de 1,2-propanodiol e formamida pode ser variada cada um de a partir de cerca de 10 a 40% p/v. No entanto, a quantidade total de crioprotetor na solução de resistência integral (ou solução final onde o tecido é armazenado) deve ser cerca de 75% em peso ou mais de crioprotetor, tal como cerca de 80% a cerca de 99% de crioprotetor ou cerca de 83% a cerca de 95% de crioprotetor. A molaridade de crioprotetor em uma solução de crioprotetor de 75% em peso ou mais (isto é, a solução final onde o tecido é armazenado) vai depender do peso molecular do crioprotetor. Em geral, a molaridade da solução de crioprotetor deve ser maior do que cerca de 6M (6 rnols de crioprotetor por litro de solução) para crioprotetores de peso molecular maior e maior para crioprotetores de peso molecular menor, tal como, por exemplo, uma concentração de crioprotetor de a partir de cerca de 8M a cerca de 25M ou uma concentração de crioprotetor de a partir de cerca de 10M a cerca de 20M ou uma concentração de crioprotetor de a partir de cerca de 12M a cerca de 16M. A solução de crioprotetor pode ser também modificada com crio-protetores convencionais e/ou moléculas de bloqueio de gelo naturais ou sintéticas, por exemplo, acetamida, agarose, alginato, alanina, albumina, acetato de amônio, proteínas anticongelamento, butanodiol, sulfato de con-droitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodióis, ciclo-hexanodionas, ciclo-hexanotrióis, dextranos, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, eritritol, etanol, etileno glicol, etileno glicol monometil éter, glicose, glicerol, glicerofosfato, gliceril monoacetato, glicina, glicoproteínas, hidroxietilamido, inositol, lactose, cloreto de magnésio, magnésio, sulfato, maltose, manitol, manose, metanol, metoxi propanodiol, metil acetamida, metil formamida, me-til ureias, metil glicose, metil glicerol, fenol, glicóis Pluronic, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, piridina, N-óxido, rafinose, ribose, serina, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de tri-metilamina, ureia, valina e/ou xilose.

Ainda, em modalidades adicionais da invenção, 1,2-propanodiol pode ser substituído por concentrações similares de 2,3-butanodiol. Similarmente, sulfóxido de dimetila pode ser substituído por concentrações similares de glicerol ou etileno glicol ou combinações dos mesmos.

Em modalidades, a formulação de solução de crioprotetor pode conter pelo menos um ou mais de crioprotetores que são acetamida, ciclo-hexanodióis, formamidas, polietileno glicol, glicerol, dissacarídeos e propanodiol.

Outros crioprotetores que podem ser usados são descritos na Patente U.S. No. 6.395.467 para Fahy e outros; Patente U.S. No. 6.274.303 para Wowk e outros; Patente U.S. No. 6.194.137 para Khirabadi e outros; Patente U.S. No. 6.187.529 para Fahy e outros; Patente U.S. No. 5.962.214 para Fahy e outros; Patente U.S. No. 5.955.448 para Calaco e outros; Patente U.S. No. 5.629.145 para Meryman; e/ou WO 02/32225 A2, que corresponde à Patente U.S. No. 6.740.484 para Khirabadi e outros cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em suas totalidades. O volume das soluções empregadas pode variar considerável- mente, tal como de a partir de cerca de 1 a cerca de 100 ml ou mais, com base no tamanho dos pedaços de tecido sendo preservados ou no tamanho dos tecidos sendo imersos em solução.

Em modalidades, a solução inclui crioprotetores em uma solução aquosa tal como solução Euro-Collins, água estéril, soluções salinas, meios de cultura e qualquer solução fisiológica. Solução Euro-Collins (EC-Solution) em uma solução aquosa descrita na Tabela 2 abaixo. TABELA 2___________________________________________________ *pH = 7,4 *miliosmolalidade = 350-365 miliosmolal Outros exemplos de soluções aquosas adequadas são discutidos nas Tabelas 3 e 4 abaixo. TABELA 3_______________________________________________________ (Nota: Solução RPS-2® é RPS-2 modificada sem CaCI2 e também sem Mg-Cl2). TABELA 4 ________________===__^^^^==ι (Nota: Solução UW modificada No. 2 não contém HES, mas contém mais glicose do que a Solução UW modificada No. 1) O veículo para solução de crioprotetor pode ser qualquer tipo de solução que mantenha a integridade da matriz sob condições in vitro. Em modalidades, o veículo compreende geralmente solutos de penetração lenta. Em modalidades, a solução veículo é uma solução Euro-Collins contendo HEPES 10 mM. HEPES está incluído como um tampão e pode ser incluído em qualquer quantidade eficaz. Ainda, outros tampões, bem como nenhum tampão, podem ser usados. Alternativamente, veículos incluem, por exemplo, as soluções discutidas nas Tabelas 2 e 3 acima.

Em modalidades, a maioria ou todas as células do tecido podem ser mortas através de manipulação da magnitude do aumento em concentração de crioprotetor através do uso de um aumento único, em etapas ou gradiente em concentração de crioprotetor. A citotoxidez da solução de crioprotetor pode também matar as células do tecido. A citotoxidez da solução de crioprotetor aumenta conforme temperaturas do tecido (e solução) próximas a 37° C são atingidas. Em modalidades, exposição do tecido ao crioprotetor em tais temperaturas pode matar a maioria ou todas as células do tecido por causa do nível alto de citotoxidez da solução crioprotetora. Em moda- lidades, a temperatura na qual o tecido pode ser mantido e exposto a crio-protetores e/ou temperatura na qual o aumento único, em etapas ou gradiente em concentração de crioprotetor ocorre para realizar a morte da célula do tecido pode estar na faixa de a partir de cerca de 0o C a cerca de 37° C, tal como cerca de 10° C a cerca de 37° C ou cerca de 25° C a cerca de 37° C. O tempo durante o qual o tecido pode ser imerso em tal solução tendo uma concentração de crioprotetor alta será uma função da massa do tecido. Em modalidades, as taxas de esfriamento de tais soluções podem ser ajustadas para prover permeação de tecido crioprotetor adequada (função de concentração e tempo) para prevenir formação de gelo. A concentração final da solução de crioprotetor usada para preservação de tecido é pelo menos 75% de crioprotetor em peso. Em modalidades, o tecido a ser preservado, tal como um tecido livre de crioprotetor, ou um tecido substancialmente livre de crioprotetor, que pode ou não ter sido previamente exposto a um crioprotetor, pode ser imerso em (ou exposto a) uma solução única tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% (em peso) em uma etapa única. Em modalidades, tal etapa única pode aumentar a concentração do crioprotetor na solução onde o tecido é imerso de menos do que 1M a mais do que 12M, aumentando a concentração do crioprotetor na solução onde o tecido é imerso de menos do que 0,5M para mais do que 15M. Em modalidades, tal etapa única pode matar a maioria das células vivas presentes ou todas as células vivas presentes (por exemplo, através de exposição a condições extremas, tais como estresses osmó-ticos e/ou citotoxidez química severos). Em modalidades, o tecido pode ser imerso em solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% (em peso) por um tempo suficiente para o crioprotetor penetrar no tecido, tal como pelo menos 15 minutos ou pelo menos 60 minutos ou pelo menos 120 minutos.

Em modalidades, o tecido a ser preservado pode ser imerso em (ou exposto a) uma solução onde a concentração de crioprotetor da solução pode ser gradualmente aumentada, tal como através do uso de um gradiente de concentração linear ou não linear, para obter uma solução final tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso de crioprote-tor. Em modalidades, o gradiente de concentração é um gradiente de concentração linear ou não linear onde uma solução livre de crioprotetor é gradualmente substituída com uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso. Em modalidades, a taxa na qual a solução livre de crioprotetor é substituída com uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso pode ser alta o suficiente para matar a maioria das células vivas presentes ou todas as células vivas presentes (por exemplo, através de exposição a condições extremas, tais como estresses osmóticos e/ou citotoxidez química severos). Por exemplo, a solução livre de crioprotetor pode ser substancialmente (pelo menos 99% em peso) substituída por uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso em menos do que cerca de 120 minutos, tal como menos do que cerca de 30 minutos ou menos do que cerca de 10 minutos ou menos do que cerca de 1 minuto. Em modalidades, a taxa na qual a solução livre de crioprotetor é substituída com uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso pode ser baixa o suficiente para não matar a maioria das células vivas presentes ou todas as células vivas presentes, tais taxas vão depender do tecido específico e do tamanho do tecido. Em modalidades, a mudança em concentração no processo de gradiente é baixa o suficiente para atingir equilíbrio osmótico aproximado.

Em modalidades, a concentração da solução é aumentada de uma maneira em etapas para obter uma solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso. Por exemplo, em modalidades, a concentração do crioprotetor pode ser adicionada em etapas para obter um platô particular, que pode ser mantido por um tempo suficiente para obter equilíbrio osmótico aproximado, tal como por pelo menos 10 minutos, tal como por cerca de 15 minutos. Então, ou crioprotetor adicional pode ser adicionado à primeira solução de crioprotetor para aumentar a concentração de crioprotetor ou uma segunda solução mais concentrada de crioprotetor pode substituir a primeira solução de crioprotetor. Então, após manutenção da concentração por tempo suficiente para obter equilíbrio osmótico aproximado, mais crioprotetor pode ser adicionado, ou um mais concentrado pode ser substituído, em uma ou mais etapas para obter a concentração desejada de pelo menos 75% em peso de crioprotetor.

Em modalidades, pode haver qualquer número de platôs de concentração de crioprotetor, tal como um inteiro entre 2 e 10, antes de atingir a concentração desejada de pelo menos 75% em peso de crioprotetor. Por exemplo, em modalidades, quatro platôs de concentração de crioprotetor podem ser usados antes de atingir a concentração desejada de pelo menos 75% em peso de crioprotetor. Em modalidades, pode haver seis etapas, a primeira etapa usando uma solução livre de crioprotetor, que é seguida por quatro platôs de concentração de crioprotetor altas e então uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso de crioprotetor. Por exemplo, em modalidades, na etapa 1, nenhum crioprotetor pode ser usado; na etapa 2, cerca de 5 a cerca de 20%, tal como cerca de 10 a 15%, da concentração de crioprotetor final podem ser usados; na etapa 3; cerca de 15 a cerca de 35%, tal como cerca de 20 a cerca de 30%, da concentração de crioprotetor final podem ser usados; na etapa 4, cerca de 40 a cerca de 60%, tal como cerca de 45 a cerca de 55%, da concentração de crioprotetor final podem ser usados; na etapa 5, cerca de 65 a cerca de 85%, tal como cerca de 70 a cerca de 80%, da concentração de crioprotetor final podem ser usados; e na etapa 6; a concentração de crioprotetor final, que é pelo menos 75% em peso de crioprotetor, pode ser usada. Cada etapa de concentração de crioprotetor pode ser mantida por um tempo suficiente para obter equilíbrio osmótico aproximado. Em uma modalidade adicional, o tecido pode ser per-fundido com a solução em cada etapa.

Após o tecido ter sido imerso em uma solução contendo uma concentração de crioprotetor suficiente para obter a concentração desejada de pelo menos 75% em peso de crioprotetor, o tecido que é mantido em uma solução contendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso de crioprotetor, pode ser rapidamente esfriado para uma temperatura entre -20° Cea temperatura de transição vítrea. A taxa de esfriamento rápi- do pode ser de a partir de cerca de 0-,5 a cerca de -100° C por minuto. A taxa de esfriamento rápido pode ser geralmente pelo menos cerca de -15, -20, -25 ou -30° C por minuto. Por exemplo, a taxa de esfriamento média pode ser de a partir de cerca de -10° a cerca de -80° C, tal como de a partir de cerca de -30 a -60° C por minuto, ou de a partir de cerca de -35 a -50° C por minuto ou de a partir de cerca de -40 a -45° C por minuto. A temperatura para a qual o tecido é esfriado durante o processo de resfriamento rápido está entre cerca de -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução de cri-oprotetor final de pelo menos 75% em peso de crioprotetor, tal como entre cerca de -30° C e cerca de -130° C ou entre cerca de -40° C e cerca de -110° C. O tecido pode também sofrer um processo de esfriamento lento, opcionalmente após o processo de esfriamento rápido, onde o tecido pode ser esfriado para uma taxa média de menos do que 30° C por minuto, tal como em uma taxa média de menos do que 10° C por minuto para uma temperatura de armazenamento predeterminada acima da temperatura de transição vítrea. O processo de esfriamento pode ser conduzido em uma taxa média de menos do que 5o C por minuto. Em modalidades, a taxa de esfriamento durante esta etapa toda não aumenta acima de 30° C por minuto, tal como uma taxa de esfriamento que não aumenta acima de 10° C por minuto, ou uma taxa de esfriamento que não aumenta acima de 5o C por minuto. Em modalidades, taxas de esfriamento (para processos de esfriamento de etapa única ou multietapa) incluem, por exemplo, taxas de esfriamento na faixa de a partir de cerca de 0,5 a cerca de 10° C/min, tal como cerca de 2 a cerca de 8o C/min ou cerca de 4 a cerca de 6o C/min. Em modalidades, o processo é independente da taxa de esfriamento contanto que formação de gela seja evitada.

Em modalidades, uma primeira taxa de esfriamento pode ser maior do que a segunda taxa de esfriamento; no entanto, em modalidades, as duas taxas de esfriamento podem ser iguais.

Em modalidades, uma taxa de esfriamento lenta é obtida mudando o ambiente no qual o recipiente contendo a solução é posto. Em mo- dalidades, uma taxa de esfriamento rápido é obtida pondo o recipiente em um líquido, tal como 2-metilbutano, que foi pré-esfriado para uma temperatura abaixo de -100° C, tal como próximo da temperatura de transição vítrea da solução a ser esfriada. Então, para obter a taxa de esfriamento lento, o recipiente é removido do líquido e esfriado em um ambiente gasoso em uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea. Em modalidades, a temperatura de transição vítrea da solução de crioprotetor pode ser cerca de -120° C a -135° C sob condições atmosféricas normais. O tecido pode ser armazenado por um período de tempo longo em uma temperatura de menos do que -20° C, mas acima da temperatura de transição vítrea. Por exemplo, o tecido pode ser armazenado em temperatura entre a temperatura de transição vítrea da solução crioprotetora e -20° C, tal como cerca de -10° C 80° C acima da temperatura de transição vítrea da solução crioprotetora final (ou resistência integral) com pelo menos 75% em peso de crioprotetor, ou cerca de 20° C a 50° C acima da temperatura de transição vítrea da solução crioprotetora final (ou resistência integral) com pelo menos 75% em peso de crioprotetor. Na etapa de armazenamento, armazenamento do tecido em uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea previne a quebra e a formação de gelo.

Em modalidade, tecidos tais como válvulas cardíacas podem ser armazenados em cerca de -80° C.

Em modalidades, o método pode compreender ainda etapa de transporte, onde o tecido é transportado. Em modalidades, o tecido é transportado em uma temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20° C, tal como cerca de -20° C a 80° C acima da temperatura de transição vítrea da solução crioprotetora de resistência integral com pelo menos 75% em peso de crioprotetor, ou 40° C a 60° C acima da temperatura de transição vítrea de solução crioprotetora de resistência integral com pelo menos 75% em peso de crioprotetor. Por exemplo, o tecido pode ser transportado em gelo seco em cerca de -79,6° C.

Após armazenamento o tecido pode ser removido da solução crioprotetora de 75% em peso com ou sem perfusão. Métodos para remoção do tecido da solução crioprotetora de pelo menos 75% em peso podem compreender aquecimento lento do tecido em solução crioprotetora de pelo menos 75% em peso para temperatura mais quente na faixa entre -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução crioprotetora com pelo menos 75% em peso de crioprotetor. Uma taxa de aquecimento lenta abaixo de 50° C por minuto pode ser usada para aquecer o tecido na solução crioprotetora de pelo menos 75% em peso. Em modalidades, a taxa de aquecimento média durante este estágio pode ser de a partir de cerca de 10-40° C por minuto, tal como de a partir de cerca de 25-35° C por minuto. Ainda, a temperatura para a qual o tecido armazenado é lentamente aquecido pode ser entre cerca de -30° C e -80° C, tal como entre cerca de -45° C e -65° C.

Após o tecido ter sofrido este processo de aquecimento lento opcional, o tecido pode então ser rapidamente aquecido para uma temperatura acima de -20° C. Em modalidades, a temperatura deve ser suficientemente alta de maneira que a solução seja suficientemente fluida que o tecido possa ser removido dela. O processo de aquecimento rápido pode ser conduzido em uma taxa acima de cerca de 80° C por minuto, tal como acima de cerca de 100° C por minuto. A taxa de aquecimento média durante esta etapa pode ser de a partir de cerca de 200-300° C por minuto, tal como de a partir de cerca de 215-250° C por minuto. Em modalidades, o tecido pode ser aquecido para uma temperatura acima de cerca de -20° C, tal como acima de cerca de -10° C, ou uma temperatura acima de cerca de -5° C, tal como entre cerca de -5° C e cerca de 5° C. Em modalidades, o processo é independente de taxa de aquecimento, contanto que formação de gelo seja evitada.

Em modalidades, a taxa de aquecimento rápido pode ser obtida mudando o ambiente no qual o recipiente contendo a solução é posto. Em modalidades, a taxa de aquecimento lenta pode ser obtida pondo o recipiente em um ambiente gasoso em uma temperatura acima da temperatura na qual o tecido foi armazenado. Então, para obter a taxa de aquecimento rápido, o recipiente pode ser posto em um líquido, tal como uma solução aquosa de, por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO), em uma temperatura acima de -75° C, tal como acima de 0o C, ou em temperaturas atmosféricas normais.

Em modalidades, após o tecido ter sido aquecido para uma temperatura acima de -65° C, a concentração do crioprotetor na solução pode ser reduzida de uma maneira única, de gradiente ou em etapas. Em modalidades, o tecido (tal como um tecido que foi imerso em pelo menos 75% em peso de solução crioprotetora) onde a concentração do crioprotetor deve ser reduzida pode ser imerso em (ou exposto a) uma solução livre de crioprotetor ou solução substancialmente livre de crioprotetor em uma etapa única. Em modalidades, tal etapa única pode diminuir a concentração do crioprotetor na solução inicial e formar uma solução substancialmente livre de crioprotetor; por exemplo, a concentração da solução na qual o tecido é imerso pode ser diminuída de mais de 12M para menos do que 1M em uma etapa única (ou etapas múltiplas), tal como de mais do que 15M a menos do que 0,1M em uma etapa única (ou etapas múltiplas). Em modalidades, tal etapa pode matar a maioria das células vivas presentes ou todas as células vivas presentes (por exemplo, através de exposição a condições extremas, tais como estresses osmóticos e/ou citotoxidez química severos). Em modalidades, o tecido pode ser imerso na solução livre de crioprotetor ou solução substancialmente livre de crioprotetor por um tempo suficiente para o crioprotetor sair do tecido, tal como pelo menos 15 minutos ou pelo menos 60 minutos ou pelo menos 120 minutos.

Em modalidades, o tecido onde a concentração de crioprotetor deve ser reduzida pode ser imerso em (ou exposta a) uma solução onde a concentração de crioprotetor da solução pode ser gradualmente diminuída, tal como através do uso de um gradiente de concentração linear ou não-linear, para obter uma solução substancialmente livre de crioprotetor ou solução livre de crioprotetor. Em modalidades, a concentração de gradiente é uma concentração de gradiente linear ou não linear onde uma solução tendo uma solução crioprotetora de pelo menos 75% em peso é gradualmente substituída com uma solução livre de crioprotetor. Em modalidades, a taxa na qual a solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso é substituída pela solução livre de crioprotetor pode ser alta o suficiente para matar a maioria das células vivas presentes ou todas as células vivas presentes (por exemplo, através de exposição a condições extremas, tais como estresses osmóticos e/ou citotoxidez química a severos). Por exemplo, a solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso pode ser substancialmente (pelo menos 99% em peso) substituída por uma solução livre de crioprotetor em menos do que cerca de 30 minutos, tal como menos do que cerca de 10 minutos ou menos do que cerca de 5 minutos ou menos do que cerca de 1 minuto. Em modalidades, a taxa na qual solução tendo uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso é substituída com uma solução livre de crioprotetor pode ser baixa o suficiente para não matar a maioria das células vivas presentes ou todas as células vivas presentes, tais taxas vão depender do tecido específico e do tamanho específico. Em modalidades, a mudança em concentração no processo de gradiente é baixa o suficiente para obter equilíbrio osmótico aproximado.

Em modalidades, a concentração de crioprotetor é reduzida de uma maneira em etapas. Em modalidades, diminuição da concentração de crioprotetor do tecido pode ser obtida imergindo o tecido em uma série de soluções de concentração de crioprotetor baixa para facilitar a eluição de crioprotetor a partir do tecido. O tecido pode também ser perfundido com as soluções. As soluções estão geralmente em uma temperatura acima de cerca de -15° C, tal como entre cerca de -15° C e cerca de 15° C ou entre cerca de 0o C e cerca de 10o C.

Em modalidades, a concentração de crioprotetor pode ser reduzida para obter um platô particular, que pode ser mantido por um tempo suficiente para obter equilíbrio osmótico aproximado, por exemplo, por pelo menos cerca de 10 minutos, tal como por cerca de 15 minutos. Então, a concentração de crioprotetor pode ser reduzida mais, o que pode ou não prover uma solução livre de crioprotetor. Se não, após manter a concentração por tempo suficiente para obter equilíbrio osmótico aproximado, a concentração de crioprotetor pode ser novamente reduzida em uma ou mais etapas para eventualmente prover uma solução livre de crioprotetor. Em modalidades, o tecido pode ser imerso em cada solução por pelo menos 15 minutos ou mais de uma hora.

Em modalidades, a maioria ou todas as células do tecido podem ser mortas através de manipulação da magnitude da etapa de diminuição em concentração de crioprotetor através do uso de uma diminuição única, em etapas ou de gradiente em concentração de crioprotetor. Conforme acima discutido, a citotoxidez da solução crioprotetora pode ser também usada para matar a maioria ou todas as células do tecido. Em modalidades, a temperatura na qual o tecido pode ser mantido e/ou a temperatura na qual a diminuição única, em etapa ou gradiente em concentração de crioprotetor ocorre para realizar a morte das células do tecido pode estar na faixa de a partir de cerca de 0o C a cerca de 37° C, tal como cerca de 10° C a cerca de 37° C ou cerca de 25° C a cerca de 37° C. O tempo durante o qual o tecido pode ser imerso em tais soluções tendo uma concentração de crioprotetor desejada será uma função da massa do tecido.

Para diminuir a concentração de crioprotetor, a solução com crioprotetor pode ser misturada com uma solução de um tipo similar à solução livre de crioprotetor utilizada em adição de crioprotetor ao tecido. A solução pode também compreender pelo menos um agente de tamponamento osmó-tico.

Conforme aqui usado, "agente de tamponamento osmótico" significa um soluto extracelular de não penetração de peso molecular baixo ou alto que age contra os efeitos osmóticos das concentrações mais intracelulares do que extracelulares de crioprotetores durante o processo de efluxo de crioprotetor.

Conforme aqui usado, "não penetração" significa que a maioria das moléculas do agente químico não penetra nas células do tecido, mas ao contrário permanece no fluido extracelular do tecido.

Conforme aqui usado, "peso molecular baixo" refere-se, por e-xemplo, a uma massa molecular relativa de 1.000 daltons ou menos. Conforme aqui usado, "agentes de tamponamento osmótico de peso molecular baixo" têm uma massa molecular relativa de 1.000 daltons ou menos. Agentes de tamponamento osmótico de peso molecular baixo incluem, por exemplo, potássio e sódio frutose 1,6-difosfato, potássio e sódio lactobionato, potássio e sódio glicerofosfato, maltopentose, estaquiose, manitol, sacarose, glicose, maltotriose, gluconato de sódio e potássio, glicose 6-fosfato de sódio e potássio e rafinose. Em modalidades, o agente de tamponamento osmótico de peso molecular baixo é pelo menos um de manitol, sacarose e rafinose.

Conforme aqui usado, "peso molecular alto" refere-se, por e-xemplo, a uma massa molecular relativa de mais do que 1.000 a 500.000 daltons. Conforme aqui usado, "crioprotetor de peso molecular alto e agentes de tamponamento osmóticos" geralmente têm uma massa molecular relativa de mais do que 1.000 a 500.000 daltons. Agentes de tamponamento osmótico de peso molecular alto incluem, por exemplo, hidroxietilamido (HES), polivinilpirrolidona (PVP), rafinose undeca-acetato de potássio (> 1.000 daltons) e Ficoll (maior do que 1.000 a 100.000 daltons). Em modalidades, o agente de tamponamento osmótico de peso molecular alto é HES, tal como HES tendo um peso molecular de cerca de 450.000. A solução livre de crioprotetor pode conter menos do que cerca de 500 mM de um agente de tamponamento osmótico, tal como de a partir de cerca de 200 a 400 mM de agente de tamponamento osmótico. Como o agente de tamponamento osmótico, um agente de tamponamento osmótico de peso molecular baixo pode ser usado. Em modalidades, o agente de tamponamento osmótico de peso molecular baixo é manitol.

Em modalidades, o crioprotetor pode ser removido em uma série de etapas tais como três, quatro, cinco, seis, sete etapas, etc. Em modalidades, o crioprotetor pode ser removido em uma série de sete etapas, onde na etapa 1 o tecido pode ser exposto a uma solução de crioprotetor com uma concentração que pode ser cerca de 40 a cerca de 80%, tal como cerca de 55 a cerca de 75%, da concentração de crioprotetor mais alta usada; em uma etapa 2, o tecido pode ser exposto a uma concentração de crioprotetor que pode ser cerca de 30 a cerca de 45%, tal como cerca de 35 a cerca de 40%, da concentração de crioprotetor mais alta usada; na etapa 3, o tecido pode ser exposto a uma concentração de crioprotetor que pode ser cerca de 15 a 35%, tal como cerca de 20 a cerca de 30%, da concentração de crioprotetor mais alta usada; na etapa 4, o tecido pode ser exposto a uma concentração de crioprotetor que pode ser cerca de 5 a cerca de 20%, tal como cerca de 10 a cerca de 15%, da concentração de crioprotetor usada; e na etapa 5, o tecido pode ser exposto a uma concentração de crioprotetor que pode ser cerca de 2,5 a cerca de 10%, tal como cerca de 5 a cerca de 7,5, da concentração de crioprotetor usada. Nas etapas acima, o restante da solução pode ser solução livre de crioprotetor contendo agente de tampona-mento osmótico. Na etapa 6, essencialmente todo o crioprotetor pode ser removido e o agente de tamponamento osmótico pode ser retido. Na etapa 7, o agente de tamponamento osmótico pode ser removido. Em modalidades, as etapas 6 e 7 podem ser combinadas em uma etapa única. Por e-xemplo, o agente de tamponamento osmótico pode ser removido ao mesmo tempo que o restante do crioprotetor. Em modalidades, se nenhum agente de tamponamento osmótico for usado ou se ele não for removido, a etapa 7 pode ser eliminada. Cada uma dessas etapas de concentração pode ser mantida por um tempo suficiente para obter um equilíbrio osmótico aproximado, tal como cerca de 10 a 30 minutos ou 15 a 25 minutos. Em modalidades, o crioprotetor é removido em uma ou mais lavagens empregando uma solução livre de crioprotetor. A temperatura da série de soluções usada para remoção do crioprotetor do tecido pode estar acima de 15° C, tal como entre cerca de -15 e cerca de 15° C, ou entre cerca de 0°C e cerca de 37° C. Em modalidades, a etapa 1 pode ser iniciada quando o tecido está em uma temperatura acima de cerca de -75° C, tal como acima de -65° C. Em modalidades, a temperatura do tecido pode estar abaixo da temperatura da solução onde ele é imerso na etapa 1, e o tecido pode ser aquecido mais para uma temperatura a-cima de cerca de -15° C durante a etapa 1 da remoção de crioprotetor. A solução livre de crioprotetor empregada para lavagem do tecido pode ser água estéril, uma solução salina fisiológica (por exemplo, solu- ção salina, Solução Salina Equilibrada de Hanj, Solução de Ringer Lactada ou Solução de Krebs-Henseliet) ou meio de cultura de tecido (por exemplo, meio do Roswell Park Memorial Institute, Meio da Eagle Modificado da Dul-becco (DMEM), Meio da Eagle ou Meio 199) empregado para tecidos, tais como células de mamífero. O número de lavagens, o volume de cada lavagem e a duração de cada lavagem podem variar dependendo da massa do tecido e da concentração química residual final desejada. Em modalidades, a última lavagem (enxágue) pode ser em uma solução salina médica geralmente empregada, tal como solução salina ou Solução de Ringer.

Os tecidos podem ser processados mais após armazenamento. Por exemplo, após armazenamento os tecidos podem ser semeados com células do paciente. Desta maneira, os tecidos preservados sem gelo podem prover materiais para a fabricação de implantes engenheirados com tecido mais complexos para aplicações médicas. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Preparação de Tecido Nos exemplos, grupos de seis válvulas pulmonares preservadas ou com FC ou IFC foram implantados em um modelo de ovelha juvenil orto-tópico. Vide Stock, U.A., Nagashima, M., Khalil, P.N. e outros, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 119:732-40 (2000), "tissue engineered three folheto heart valves". A ovelha se aproxima muito da anatomia e da fisiologia humana com tamanho do anel similar, taxa cardíaca equivalente, rendimento cardíaco e pouco crescimento somático. Vide Gallegos, R.P., Nockel, P.J., Rivard, A.L., Bianco, R.W., J. Heart Valve Disease 14:423-432 (2005), "the current State of in-vivo pre-clinical animal models for heart valve avaluation".

Duas linhagens diferentes de ovelha (cruzamento Whiteface vs. Heidschnuck, um cruzamento de rabo curto nórdico) foram escolhidas para garantir um modelo alogeneico verdadeiro.

Corações de 15 ovelhas Whiteface cruzadas, adultas, (9 ovelhas e 5 carneiros) foram obtidos de um abatedouro em Minnesota usando condi- ções assépticas. Os corações foram enxaguados com solução de Ringer lactada e postos em meio da Eagle Modificado com da Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad/CA, USA) e transportados da noite para o dia para o laboratório de processamento (Cell&Tissue Systems, North Charleston, SC). Válvulas pulmonares foram excisadas assepticamente. As válvulas foram postas individualmente em volumes de 100 ml de DMEM contendo 4,5 mg/l de Glicose com 126 mg/L de Lincomicina, 52 mg/L de Vancomicina, 157 mg/l de Cefoxitina e 117 mg/l de Polimixina para armazenamento da noite para o dia a 4o C. As válvulas foram então aleatoriamente alocadas para criopre-servação através de criopreservação congelada ou sem gelo. Criopreservação Congelada (FC) e armazenamento FC foi previamente descrita em detalhes. Vide Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006), "Impact of Cryopreservation on extracelular matrix structures of heart valve leaflets". Um protocolo padrão, de acordo com as orientações da American Association of Tissue Banks (AATB), foi aplicado. Vide Standards for Tissue Banking. 11a Edição, American Association of Tissue Banks, 2006. Este protocolo requer um congelador de taxa de controle, armazenamento em tanques esfriados com nitrogênio e um fornecimento contínuo de nitrogênio líquido.

Seguido tratamento com antibiótico, as válvulas FC foram postas individualmente em bolsas de poliéster estéreis contendo 70-80 ml de solução de crioproteção fria (90 ml de M199 contendo 10 ml de sulfóxido de di-metila 10% (DMSO, MS2SO, Sigma, St. Louis/MO, USA) em DMEM). Cada bolsa teve ar evacuado, foi vedada com calor e congelada em taxa controlada a -1° C/minuto por 60 minutos de a partir de 4° C até -80° C. As válvulas foram então postas e armazenadas na fase de vapor de um congelador de armazenamento de nitrogênio líquido em aproximadamente -160° C. Após 1 ano de armazenamento, as válvulas foram transportadas para um transportador de nitrogênio seco de North Charleston, South Carolina (USA) para Berlin (Alemanha) para implante.

Reaauecimento após FC Válvulas FC foram descongeladas conforme previamente descri- to. Vide Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006). Imediatamente antes do implante, válvulas FC foram removidas do transportador de nitrogênio seco e postas em gelo seco por 45 minutos. Elas foram então rapidamente descongeladas por 10 minutos em um banho de água a 37° C. As bolsas foram externamente limpas usando etanol 70%. A solução de criopreservação foi então removida em três etapas pondo as válvulas por 15 minutos em DMEM pré-esfriado com 0,5M de ma-nitol, seguido por DMEM com 0,25M de manitol e finalmente em DMEM sozinho. Eventualmente as válvulas foram transferidas para DMEM fresco e armazenadas em gelo até implante.

Criopreservação sem Gelo (IFC) e armazenamento IFC foi obtida infiltrando gradualmente os tecidos da válvula cardíaca em etapas de 15 minutos a 4o C com concentrações altas de uma solução de criopreservação pré-esfriada (CS) para obter uma concentração final de 12,6 mol/L (CS 83% em peso; formada de três componentes: 4,65 mol/L de DMSO, 4,65 mol/L de formamida e 3,31 mol/L de 1,2-propanodiol (todas da Sigma-Aldrich) em solução Euro-Collins (Solução EC). Vide Song, Y.C., Khirabadi, B.S., Lightfoot, F.G. Brockbank, K.G.M., Taylor, M.J., Nature Biotech 18:296-299 (2000), criopreservação vítrea mantém a função de enxertos vasculares.

Após a etapa final as válvulas cardíacas foram postas individualmente em bolsas de poliéster estéreis contendo 70-80 ml da solução de criopreservação. Uma amostra de imitação foi estabelecida com um termo-par de não intrusão, construído, no centro da válvula cardíaca/bolsa preso a um termômetro digital para monitorar as temperaturas experimentais durante a criopreservação. Cada bolsa teve ar evacuado, foi vedada com calor e esfriada a 5,4° C/min até -100° C em um banho pré-esfriado de 2-metilbutano (isopentano). As bolsas foram então armazenadas a -80° C por um ano. A-pós 1 ano de armazenamento, as válvulas foram transportadas para o sítio de implante em Berlin (Alemanha) em gelo seco. As válvulas foram armazenadas a -80° C até o implante.

Uma formulação de criopreservação de 83% em peso foi empre- gada, e nenhum gelo foi observado na temperatura de armazenamento a -80° C. Em contraste, gelo foi observado quando formulações de criopreser-vação de 55-70% em peso foram usadas.

Nos exemplos acima, um protocolo de adição em etapas foi empregado para os crioprotetores para obter a concentração de formulação final. No entanto, a formulação de crioprotetor pode ser adicionada em uma etapa única, muitas etapas ou como um gradiente.

As soluções onde as válvulas foram postas permaneceram claras, livres de ambos as quebras e o gelo, em todos os pontos de tempo incluindo pós-esfriamento, quando da colocação em gelo seco para transporte e ambos antes e durante o reaquecimento.

De acordo com o acima, o tecido foi armazenado acima da temperatura de transição vítrea da formulação de crioprotetor e abaixo de -20°C, sem quebra ou formação de gelo.

Reaquecimento após IFC

Cada válvula foi posta em um banho de água a 37° C até que a solução se movesse livremente. A válvula foi então transferida para gelo e a bolsa externamente limpa com etanol 70%. A válvula foi enxaguada rapidamente em Solução EC gelada contendo manitol 200 mM. Então 3 enxágues sequenciais foram realizados por 15 minutos cada um com agitação cuidadosa contínua em Solução EC gelada com 200 mM de manitol, seguido por Solução EC sozinha e finalmente DMEM. As válvulas foram armazenadas em gelo em DMEM até o implante.

As válvulas foram então armazenadas em gelo em DMEM até o implante. Todas as válvulas foram enxaguadas em uma solução salina de grau médico antes do implante.

Transporte Válvulas FC também necessitaram de transporte em equipamento para transporte de nitrogênio seco para o sítio de implante onde as válvulas precisaram ser mantidas em congeladores esfriados com nitrogênio até o implante. Em contraste, nenhum deste equipamento caro e fornecimento de nitrogênio foi necessário para as válvulas IFC. Para válvulas IFC, o único equipamento necessário foi um congelador de armazenamento a -80° Ceo transporte foi conseguido usando uma caixa isolada com gelo seco. O método IFC facilita preservação, armazenamento e transporte significantemente. Em particular, em países em desenvolvimento com recursos financeiros e logísticos limitados, IFC vai permitir transplantes de aloen-xerto.

Implante e acompanhamento Após aproximadamente um ano de armazenamento, as válvulas foram implantadas na posição ortotópica de 12 ovelhas Heidschnucke.

Grupos de seis válvulas pulmonares preservadas ou com FC ou IFC foram implantados em um modelo de ovelha juvenil ortotópico. 12 ovelhas jovens (idade média 28 semanas ± 2 semanas, peso 21 kg ± kg) sofreram substituição de válvula pulmonar e artéria pulmonar principal com válvulas de aloenxerto FC ou IFC usando um protocolo recentemente descrito. Vide Stock, U.A. Nagashima, M., Khalil, P.N. e outros, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 119:732-40 (2000).

Em suma, o coração foi exposto através de uma toracotomia an-terolateral esquerda. Usando canulação arterial femoral e venosa atrial direita, by-pass cardiopulmonar normotérmico foi estabelecido. Com o coração batendo uma transecção da artéria pulmonar (PA) (Pulmonary Artery) foi realizada e um segmento da PA principal e todos os três folhetos nativos foram removidos. O conduíte com válvula foi implantado usando 5-0 suturas de monofilamento (Prolene, Ethicon, Inc.). Nenhuma anticoagulação adicional foi dada. Todos os animais foram mantidos em uma instalação de alojamento interna no sítio e receberam cuidado humano em obediência ao "Gui-de for the Care and Use of Laboratory Animais" publicado pelo National Insti-tutes of Health (NIH Publication no. 85-23, revisado em 1985).

Acompanhamento da função da válvula foi determinado através de eco-DoppIer bidimensional após 4, 12 e 24 semanas. Após o implante, ecocardiografia com doppler usando um SonoSite Micro Max ou Titan (So-noSite, Bothell, WA, USA) equipado com um transdutor disposto em fase de 7,5 Mhz foi usada periodicamente para avaliar o funcionamento da válvula.

Exame de eco-DoppIer bidimensional que foi realizado do trato de fluxo externo ventricular direito, conduíte e artéria pulmonar principal distai após 4, 12 e 24 semanas incluía imagem do conduíte e folhetos da vista de eixos longo e curto. Avaliação quantitativa de competência de válvula pulmonar foi feita usando mapeamento de Doppler de fluxo colorido.

Explicação Os animais sobreviventes foram eutanizados usando aplicação intravenosa de embutramida. A toracotomia lateral foi restabelecida e após inspeção de morfologia bruta as válvulas foram excisadas e processadas mais.

Histoloqia Seguindo eutanásia e inspeção quanto à morfologia bruta, as válvulas foram processadas quanto à histologia. Amostras de cada válvula cardíaca foram processadas conforme descrito antes. Vide Schenke-Layland, K. e outros, Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50 (2007). Para determinar morfologias celular e de tecido gerais, seções representativas foram tingidas com Hematoxilina-Eosina (HE), Van Gieson Elástico (EVG) e Pentacromo Movat. Para imunoistoquímica de CD3, um anticorpo primário reativo cruzado (DCS, Hamburg, Alemanha) foi aplicado. Para deposição de cálcio, um tingimento von Kossa foi realizado.

Após tingimento todas as seções foram desidratadas em etanol (Mallinckrodt Baker, Inc., Deventer, Países Baixos), limpas em xileno (Merck KgaA, Darmstadt, Alemanha), montadas usando Entellan® (Merck), analisadas e documentadas usando microscopia de luz de campo brilhante de rotina (Axio Observer Z1, Car Zeiss, Gõttingen, Alemanha).

Imagem Multifóton de Infravermelho Próximo (NIR) Então dois conjuntos representativos, selecionados, de amostras de válvula foram processados para imagem multifóton Infravermelho próximo (NIR). Vide Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006) e Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50 (2007). Um teste t não emparelhado foi empregado para análises estatísticas, diferenças de p<0,05 foram consideradas estatisticamente significantes.

Amostras representativas de espécimes de folheto congeladas e vitrificadas (cada uma n=6) foram estudadas usando um sistema de microscópio de varredura a laser femtossegundo NIR conforme anteriormente descrito. Vide Schenke-Layland, K. e outros, Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50 (2007). Comprimentos de onda de 760 nm e 840 nm foram empregados neste estudo para induzir autofluorescência dependente de componente ECM bem como geração de segundo harmônico (SHG). Vide Mayer, J.E. Jr., Sem. Thorac. Cardiovasc. Surg. 7:130-132 (1995). Seções horizontais ópticas seriais não invasivas de ambos os lados de fluxo de entrada (ventricula-ris) e de saída (arterialis-fibrosa) dos espécimes de folheto diferentes foram obtidas em etapas zde 5 pm e 10 pm. A formação de radiação SHG, que ocorre em metade do comprimento de onda de laser incidente, foi provada com um filtro FB420-10 (Thorlabs Inc., Newton/NJ, USA) em frente ao detector. Um filtro passa-baixa de 700 nm (E700SP, Chroma Technology, Brattle-boroA/T, USA) foi usado para bloquear radiação UV (faixa de transmissão: 390 nm - 700 nm) e para prevenir a radiação de laser de difração de atingir o detector.

Avaliação de Viabilidade O ensaio alamarBlue®foi usado para avaliar a viabilidade celular em tecidos de válvula cardíaca através da medição das reações de oxida-ção/redução que acontecem dentro das células ou em folheto, músculo ou conduíte arterial associado com cada válvula. O alamarBIue® foi adicionado diretamente às placas contendo tecidos em meios de cultura e incubado por 3-6 horas a 37° C.

Quando da redução, alamarBIue® mudou de cor e esta mudança de cor foi medida usando a leitora de placa fluorescente Gemini EM (Molecular Dynamics) em um comprimento de onda de excitação de 544 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm. A Tabela 5 mostra viabilidade de congelamento sem gelo e crio-preservado de tecidos de válvula. TABELA 5_________________________________________________________ * Todos os dados são expressos como unidades fluorescentes relativas/mg de peso seco de tecido. A viabilidade de válvulas cardíacas de ovelha sem gelo e válvulas que foram criopreservadas através de congelamento das válvulas cardíacas de ovelha foi avaliada. Conforme mostrado na Tabela 5, a viabilidade era insignificante nos tecidos sem gelo comparado com a viabilidade celular antecipada alta que foi preservada em tecidos criopreservados através de congelamento.

Dois animais IFC e três FC foram perdidos no processo de a-companhamento devido ou a complicações cirúrgicas ou endocardite bacte-riana. No grupo FC sobrevivente, estenose valvular severa com falência cardíaca direita subsequente foi observada. Esta observação estava relacionada com dados de eco em 6 meses revelando ingredientes de pressão signifi-cantemente aumentados no grupo FC comparado com o grupo IFC (média 35 versus 14 mmFlg, p<0,05).

Resultados hemodinâmicos No grupo FC estenose valvular severa com subsequente falência cardíaca direita foi observada. Esta observação se relacionava com dados de eco em 6 meses, revelando gradientes de pressão aumentados no grupo FC comparado com animais IFC com uma média de 35 versus 14 mmHg.

Resultados de morfoloqia bruta A figura 1 demonstra a morfologia bruta de válvulas cardíacas pulmonares explantadas após 7 meses de implante na posição ortotópica. A figura 1A mostra válvula cardíaca criopreservada congelada (FC) com es-pessamento dos folhetos (setas). A figura 1B mostra válvula cardíaca criopreservada vítrea (IFC) com aparência normal dos folhetos.

Conforme mostrado na figura 1, no grupo FC, morfologia bruta mostrou que válvula cardíaca criopreservada (FC) espessou significante-mente folhetos (setas). Em contraste, no grupo IFC, válvula cardíaca criopreservada vítrea mostrou aparência normal dos folhetos.

Resultados de histologia A figura 2 demonstra uma histologia de válvulas pulmonares ex-plantadas 7 meses após o implante. Válvulas FC são mostradas nas figuras 2A-2D e válvulas IFC são mostradas nas figuras 2E-2FI.

Conforme mostrado nas figuras 2E-2H, nenhum espessamento de folheto ou infiltrados de célula inflamatória foram observados em válvulas IFC. Nenhum grupo demonstrou calcificação. Tingimento revelou um espessamento significante das válvulas FC (figura 2A) com células em proliferação e formação de trombo no lado de fluxo de entrada (asterisco).

Em contraste, IFC mostrou uma ECM quase acelular (figura 2E). Tingimento com EVG e Pantacroma Movat quanto a ECM confirmou esta observação mostrando estruturas de ECM extremamente bem mantidas nas válvulas IFC (figuras 2F e 2G). Formação de tecido fibroso foi observada no grupo FC (figuras 2B e 2C). Tingimento Von Kossa não mostrou calcificação significante em nenhum grupo (figuras 2D e 2H). Barras de escala iguais a 100 pm. Histologia convencional confirmou a observação na figura 1 e revelou a presença de infiltrados de célula inflamatória crônica. A figura 3 demonstra uma histologia de folhetos de válvula cardíaca 7 meses após implante. Imunoistoquímica usando CD3 com um anticorpo primário reativo cruzado (DCS, Hamburg, Alemanha) revelou que FC preservou válvulas cardíacas que demonstraram inflamação mediada por célula T aumentada significante no estroma da válvula. Em válvulas cardíacas IFC, células CD3 positivas foram observadas exclusivamente no pano migrando ao longo do folheto no lado ventricular (figuras 3C e 3D). Histologia convencional confirmou a observação na figura 1 e revelou a presença de infiltrados de célula inflamatória crônica. Em contraste, nenhum espessamento de folheto ou infiltrados de célula inflamatória foram observados em válvulas IFC. Nenhum grupo demonstrou calcificação. A: (100x) Tingimento com pentacromo Movat com demonstração clara de matriz de ECM preservada (amarelo=colágeno, a-zul=proteoglicanos, preto=elastina). B: (400x) A mesma válvula com maior amplificação e visualização de estruturas de fibra elástica no ventricular). C: Tingimento com H&E (100x) de um folheto quase livre de célula com formação de pano migratório no lado ventricular. D: Tingimento em 3D de formação de pano indicando apenas células CD3 positivas esparsas. E: Tingimento com pentacromo Movat (100x) em folheto FC com rompimento de matriz severo e espessamento acentuado. F: Ampliação maior (400x) confirmando alteração de matriz. G: Tingimento H&E (100x) revelando tecido com infiltração celular difusa. H: Tingimento com CD3 confirmando infiltração de célula T do estroma da válvula inteira. Barras de escala são iguais a 100 pm.

Resultados de imagem multifóton próximo ao infravermelho (NIR) A figura 4 demonstra imagem de autofluorescência excitada por multifóton (figuras 4A, 4B, 4D e 4E) e traçado de perfil de sinal de geração de segundo harmônico (SHG) (figuras 4C e 3F) de estruturas de folheto a-pós 7 meses in vivo empregando comprimentos de onda de laser de 760 nm (verde: fibras elásticas, células) e 840 nm (vermelho: colágeno). As figuras 4A e 4D representam varreduras de regiões ventriculares ricas em elástica; as figuras 4B e 4E são áreas de transição entre ventricular e espongiosa.

Imagens de autofluorescência de tecidos FC (figuras 4A e 4B) revelaram estruturas de folheto ECM deterioradas. Em contraste, as estruturas de ECM em válvulas IFC (figuras 4D e 4E) são bem preservadas).

Os gráficos representam SHG de pico e intensidades de autofluorescência de estruturas contendo colágeno (vermelho) e fibras de elastina (verde) nas imagens de sobreposição de pilha lambda correspondentes de lados de fluxo de saída de folheto FC (figura 4C) e IFC (figura 4F), denotados por cruzamentos vermelho e verde, respectivamente. Barras de escala são iguais a 20 μιη.

Conforme mostrado na figura 4, imagem multifóton e microsco-pia de geração de segundo harmônio (SHG) revelaram autofluorescência induzível reduzida dentro de estruturas ECM nas amostras FC quando expostas a pulsos de laser de 760 e 840 nm (figuras 4A e 4B) e sinais e SHG fracos de estruturas de colágeno (figura 4C). Em contraste, nos explantes de IFC a requerente encontrou estruturas ECM bem preservadas (figuras 4D e 4E), comparável com tecidos frescos. Avaliação quantitativa de SHG de pico e sinais de autofluorescência usando impressão digital espectral confirmaram essas observações (figuras 4C e 4F). O sinal de SHG de colágeno de folheto de pico a 420 nm foi significantemente maior em explantes vitrifica-dos do que em explantes criopreservados (172+/-32 versus 137+/- 11, p<0,05). Este dado tem similaridades impressionantes com as análises in vitro previamente publicadas e indica que há pouco, se algum, reparo ECM in vivo. Vide Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006) e Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50(2007).

Os resultados da requerente mostraram que válvulas IFC com componentes ECM preservados sobreviveram a teste in vivo prolongado, mais de 24 milhões de ciclos de uso, sem espessamento dos folhetos ou deterioração ultraestrutural.

Uma variedade de razões para falha de válvula cardíaca de alo-enxerto foi discutida no passado e a maioria dos investigadores enfatizou questões imunológicas. Vide Rajani, B., Mee, R.B., Ratliff, N.B., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 115:111-7 (1998), "evidence for rejection of homograft cardiac valves in infants". Vide também Koolbergen, D.R., Hazekamp, M.G., de Heer, E. e outros, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 124:689-97 (2002), "the pathology of fresh and cryopreserved homograft heart valves: An analysis of forty explanted homograft valves".

Avaliações celulares e de matriz quantitativas e qualitativas padrão tais como avaliações bioquímicas, imunoistoquímicas e histologia de rotina não ajudaram a resolver a discussão controversa se células alogenei-cas restantes ou matriz extracelular potencialmente alterada contribuíram para a degeneração observada.

Dados preliminares de pacientes tratados com aloenxertos des-celularizados demonstraram recentemente que descelularização não melhorou significantemente o resultado em termos de gradientes de pressão e deterioração estrutural comparado com aloenxertos não-descelularizados. Vide Bechtel, J.F., Stierle. U., Sievers, H.H., J. Heart Valve Dis. 17:98-104 (2008), "fifty-two months mean follow up of decellularized SynerGraft-treated pulmo-nary valve allografts".

Esses resultados clínicos iniciais, com um acompanhamento médio de 52 meses, questionam a validade de teorias que as células remanescentes em válvulas cardíacas halogeneicas contribuem subsequentemente para inflamação e imunorreatividade como a única causa de deterioração estrutural. A formação de gelo extracelular é bem-conhecida ser perigosa para tecidos e órgãos estruturados. Vide Brockbank, K.G., Lightfoot, F.G., Song, Y.C., Taylor, M.J., J. Heart Valve Dis. 9(2): 200-206 (2000), "in-terstitial ice formation in cryopreserved homografts: a possible cause of tis-sue deterioration and calcification in vivo".

Formação de cristal de gelo durante criopreservação foi evitada através da aplicação de concentrações altas de crioprotetores para promover solidificação amorfa ao invés de cristalização. Vide Patente U.S. No. 6.740.484. Armazenamento a -80° C ao invés de abaixo de -135° C em nitrogênio de fase de vapor manteve as válvulas em um estado não-vitrificado acima da temperatura de transição vítrea da formulação de crioprotetor (-124° C) e então evitou o risco de quebra do tecido que pode ocorrer em tecidos vitrificados durante armazenamento e transporte.

Embora tenha sido anteriormente mostrado que FC acelera degeneração em um modelo de roedor singeneico, o impacto direto de formação de gelo sobre tecidos contendo fibra elástica e colágeno não podería ser mostrado conclusivamente usando métodos de visualização convencionais. Vide Legare, J.F., Lee, D.G., Ross, D.B., Circulation 102: III75-78 (2000), "cryopreservation of rat aortic valves results in increased structural failure". O desenvolvimento e a aplicação de microscopia multifóton pró- ximo do infravermelho em combinação com tomografias de laser femtosse-gundo permitiram visualização de alterações de ECM com resolução submí-cron. Vide Ann. Thorac. Surg. 81:918-26 (2006) e Ann. Thorac. Surg. 83:1641-50 (2007).

Essas novas tecnologias de imagem revelaram que destruição de estruturas amorfas e particularmente matriz fibrilar predispõe aloenxertos de FC à falha estrutural, enquanto aloenxertos de IFC demonstraram preservação de matriz e perda de viabilidade de célula alogeneica. É acreditado que ambas a preservação de matriz e a perda de células nativas no tecido contribuíram para função in vivo aperfeiçoada. A preservação sem gelo resulta em tecidos que são menos propensos à inflamação do que tecidos descelularizados ou tecidos preservados em FC empregando práticas comerciais atuais.

Nos últimos anos, a aceitação clínica de aloenxertos diminuiu significantemente devido à sua durabilidade a longo prazo limitada. É antecipado que o resultado de aloenxertos de válvula cardíaca clinica será melhorado pela IFC, e que processamento, armazenamento e transporte serão ambos mais simples e consequentemente mais econômicos do que a prática de FC atual. Esta nova tecnologia de preservação é esperada mostrar utilidade para preservação de várias matrizes de tecido para outras aplicações médicas.

No exemplo, usando válvulas cardíacas pulmonares de ovino a-logeneicas, foi mostrado que dano por ECM causado por FC não é restaurado após 7 meses in vivo (equivalente a 5 anos em seres humanos). Os dados também demonstram que IFC mantém componentes ECM cruciais tais como elastina e colágeno, traduzindo em resultados de hemodinâmica in vivo superiores. Os explantes de IFC eram livres de infiltrados de célula in-flamatória e degeneração estrutural. IFC também reduziu significantemente as necessidades infraestruturais para preservação, armazenamento e transporte comparado com prática FC atualmente aplicada.

Esses resultados têm implicações importantes para transplante de válvula clínica com promessa de melhor funcionamento a longo prazo, taxas de reintervenção reduzidas e custos menores. Isto é particularmente importante em países em desenvolvimento com recursos financeiros limitados.

Este método é aplicável a outras aplicações médicas de matrizes de tecido extracelulares intactas que não requerem células viáveis, vivas. Especificamente, este método é também aplicável a outras aplicações médicas de matrizes de tecido extracelulares intactas de ambas as origens humana alogeneica e mamífero xenogeneica que não requerem células vivas, viáveis, tais como, por exemplo, pele, ligamento, tendão, osso, nervos periféricos, dura mater, pericárdio, artéria, veia, vesícula, tecidos do trato gastrointestinal e outros. As aplicações médicas para as quais essas matrizes podem ser usadas incluem, mas não devem ser limitadas a, curativos de ferida, reparo de defeitos do osso, reparo de vasos sanguíneos, reparo de tecidos do sistema nervoso periférico e central danificados, reparo de defeitos urogenitais e fitas de tecido de poliéster (patch grafts). EXEMPLO 2 Segmentos da artéria aórtica de porco foram conseguidos de um abatedouro. Todos os tecidos, ambos os controles frescos e grupos criopre-servados, foram tratados com antibióticos a 4o C. Criopreservação congelada convencional foi realizada usando uma taxa de esfriamento a 1o C/min e uma formulação de crioprotetor baseada em meio de cultura contendo sulfó-xido de dimetila 1,4M e armazenamento em nitrogênio de fase de vapor de acordo com protocolos padrão. Criopreservação sem gelo foi realizada através de infiltração do tecido com 12,6 M de solução de crioprotetor contendo sulfóxido de dimetila, formamida e 1,2-propanodiol em uma etapa única. Bolsas contendo os recipientes foram esfriadas por 10 minutos em um banho de metilbutano a -120° C e armazenadas a -80° C. Após reaquecimento e lavagem para remover os crioprotetores os ensaios que seguem foram realizados: 1) Teste de viabilidade através da medição de redução de resa-zurin (alamarBIue®): 2) A histologia foi avaliada através de tingimento com H&E e Pentacromo Movat; 3) Colágeno e elastina foram visualizados através de microsco-pia de varredura a laser de dois fótons (LSM); e 4) Teste de hemocompatibilidade foi realizado usando uma batería de ensaios.

Nenhuma quebra de tecido foi observada. Recipientes criopre-servados sem gelo demonstraram viabilidade baixa antecipada comparado com recipientes congelados convencionais devido à taxa de adição e remoção das concentrações extremamente altas de agentes crioprotetores potencialmente citotóxicos.

Histologia e LSM de rotina não revelaram quaisquer alterações estruturais entre ambos os grupos de tecido criopreservado e tecido fresco. Ensaios de histocompatibilidade (quantificação do complexo de trombi-na/antitrombina-lll, beta-tromboglobulina, marcador de inflamação PMN-elastase e complexo SC5b-9 de complemento terminal) não revelaram quaisquer diferenças significantes entre recipientes criopreservados frescos, sem gelo e convencionais.

Esses resultados indicam que criopreservação sem gelo não é apenas uma alternativa para preservação, armazenamento e transporte de custo eficaz para recipientes de sangue. Ela seria também um método seguro porque nenhuma deterioração estrutural ou de marcador de hemocompatibilidade foi observada. A perda de viabilidade associada com criopreservação sem gelo foi planejada no desenvolvimento da técnica de processamento sem gelo a fim de reduzir a imunogenicidade dos tecidos. É bem estabelecido que viabilidade é rapidamente perdida pós-implante em aloenxertos FC convencionais devido à resposta imune de recipiente de enxerto. Após implante, a baixa viabilidade de enxertos IFC é antecipada para melhorar o resultado clínico. Concluindo, quaisquer barreiras para progressão para estudos de implante de artéria animal grande planejados foram observadas.

Todas as referências à literatura e patente mencionadas no relatório são incorporadas a título de referência em suas totalidades.

REINVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para preservar um tecido, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) imergir um tecido em uma solução que apresenta uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso em relação ao peso da solução; (ii) resfriar o tecido na solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, em relação ao peso da solução, para uma temperatura entre -20°C e a temperatura de transição vítrea da solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, em relação ao peso da solução, sendo que o tecido é resfriado e preservado em uma temperatura inferior a -20°C, mas superior a temperatura de transição vítrea da solução sem a formação de gelo; e (iii) após o tecido atingir a temperatura entre -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, se altera a concentração da solução na qual o tecido foi esfriado na etapa (ii) para formar uma solução substancialmente livre de crioprotetor em uma etapa única.

2. Método para preservar um tecido, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) imergir um tecido livre de crioprotetor ou tecido substancialmente livre de crioprotetor em uma solução apresentando uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso em relação ao peso da solução; (ii) resfriar o tecido na solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75%, em peso em relação ao peso da solução, para uma temperatura entre -20°C e a temperatura de transição vítrea da solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75%, em peso em relação ao peso da solução, sendo que o tecido é resfriado e preservado em uma temperatura inferior a -20°C, mas superior a temperatura de transição vítrea da solução sem a formação de gelo; e (iii) imergir o tecido em uma solução livre de crioprotetor.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido na etapa (i) é um tecido livre de crioprotetor ou um tecido substancialmente livre de crioprotetor.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende: em uma etapa única, após o tecido atingir a temperatura entre -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, remover o tecido da solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso; e imergir o tecido em uma solução livre de crioprotetor.

5. Método para preservar um tecido, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) imergir o tecido em uma séria de soluções que apresentam concentrações altas de crioprotetor para obter imersão em uma solução final com uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso em relação ao peso da solução; (ii) resfriar o tecido na solução final tendo a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75%, em peso em relação ao peso da solução, para uma temperatura entre -20°C e a temperatura de transição vítrea da solução final que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, em relação ao peso da solução, sendo que o tecido é resfriado e preservado em uma temperatura inferior a -20°C, mas superior a temperatura de transição vítrea da solução sem a formação de gelo; e (iii) imergir o tecido em uma série de soluções que apresentam concentrações baixas de crioprotetor para obter um tecido substancialmente livre de crioprotetor imerso em uma solução substancialmente livre de crioprotetor.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) compreende ainda: matar a maioria das células vivas do tecido através do aumento da concentração de crioprotetor da etapa (i); ou matar todas as células vivas do tecido através do aumento da concentração de crioprotetor da etapa (i); em particular, através do aumento da concentração de crioprotetor da etapa (i) a partir de uma concentração de crioprotetor inferior a 1M para uma concentração de crioprotetor superior a 12M.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: a maioria das células vivas do tecido são mortas durante o aumento da concentração de crioprotetor da etapa (i) quando o tecido está em uma temperatura entre 0°C e 37°C, ou quando o tecido está em uma temperatura entre 20°C e 37° C; ou todas as células vivas do tecido são mortas durante o aumento da concentração de crioprotetor da etapa (i) quando o tecido está em uma temperatura entre 0°C e 37°C, ou quando o tecido está em uma temperatura entre 20°C e 37°C.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende ainda: armazenar o tecido em uma temperatura entre -20° Cea temperatura de transição vítrea da solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso, particularmente, sendo que a solução que apresenta a dita concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso na etapa (ii) apresenta uma temperatura de transição vítrea entre -110°C e -130°C, mais particularmente, sendo que o tecido é esfriado a uma temperatura entre -20° C e -110° C, ou a uma temperatura entre -40°C e -100°C, ou a uma temperatura entre -75° C e -85° C, na etapa (ii).

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) compreende: (i) imergir o tecido em uma série de soluções que apresentam concentrações altas de crioprotetor para obter imersão em uma solução final com uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso; ou aplicar um gradiente de concentração linear ou não-linear no qual uma solução livre de crioprotetor é gradualmente substituída com uma solução que apresenta uma concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso.

10. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende: imergir o tecido em uma série de soluções que apresentam concentrações baixas de crioprotetor para obter um tecido livre de crioprotetor imerso em uma solução livre de crioprotetor.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a concentração de crioprotetor de pelo menos 75% em peso na etapa (i) está entre 83% em peso e 99% em peso de crioprotetor, ou está entre 85% em peso e 95% em peso de crioprotetor, sendo que o crioprotetor na etapa (i) compreende pelo menos uma molécula selecionada do grupo que consiste em acetamida, cicloexa-nodiois, formamidas, sulfóxido de dimetila, etileno glicol, polietileno glicol, glicerol, dissacarídeos e propanodiol.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita solução crioprotetora na etapa (i) compreende pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em acetamida, agarose, alginato, alanina, albumina, acetato de amônio, proteínas anticongelamento, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, cicloexanodiois, dextranos, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil forma-mida, dimetil sulfóxido, eritritol, etanol, etileno glicol, etileno glicol monometil éter, formamida, glicose, glicerol, glicerofosfato, gliceril monoacetato, glicina, glicoproteínas, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, magnésio, sulfato, maltose, manitol, manose, metanol, metoxi propanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureias, metil glicose, metil glicerol, fenol, polióis pluronic, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, 1,2-propanodiol, N-óxido de piridina, rafinose, ribose, serina, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito tecido é uma válvula ou artéria pulmonar.