BRPI1008890B1 - Método para fabricar uma formulação de caldo de fermentação, formulação de caldo de fermentação, composição e kit - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA FABRICAR UMA FORMULAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO, FORMULAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO, COMPOSIÇÃO E KIT. A presente invenção refere-se a formulações de caldos de fermentação que contêm ácidos orgânicos e/ou sais de ácidos orgânicos, e métodos para fabricar e usar tais formulações.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE AFINS

[001] Este pedido de patente reivindica prioridade para os pedidos de patente provisórios números de série US 61/154.235, depositado em 20 de fevereiro de 2009, 61/185.865 depositado em 10 de junho de 2009, e 61/304.219 depositado em 12 de fevereiro de 2010, sendo cada um deles aqui incorporado em sua totalidade.

1. CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se a formulações de caldos de fermentação e métodos para fabricar e usar as mesmas.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Em vários processos para cultivar e fermentar microorganismos, algumas vezes é necessário, durante ou na conclusão do processo de fermentação, exterminar células ativas na mistura. Isso é particularmente verdadeiro quando microorganismos que contêm DNA recombinante são desenvolvidos como hospedeiros da produção e for desejável impedir que quaisquer organismos recombinantes sejam liberados para dentro do ambiente. Mesmo se os microorganismos não contiverem DNA recombinante, frequentemente é desejável exterminar as células antes do processamento, para assegurar que as células viáveis não sejam liberadas para o ambiente seja no produto ou nos produtos residuais do processo.

[004] Muitos métodos convencionais necessários ara exterminar microorganismos, tal como calor, são severos demais e podem destruir ou alterar o produto secretado desejado antes que as células sejam exterminadas. Neste caso, o produto deve ser recuperado sem exterminar as células, o que requer o uso de processos de contenção e equipamentos morosos e onerosos. As patentes nos US 5.801.034 e 5.378.621 descrevem um método para exterminar células microbianas com um único ácido orgânico que tem 1 a 5 átomos de carbono. Entretanto, de acordo com os exemplos daquelas patentes, um alto nível de ácido orgânico e um pH baixo é ideal. A condição de baixo pH é frequentemente prejudicial para a estabilidade de muitos pro-dutos enzimáticos de interesse no meio de fermentação e o alto nível de ácido orgânico frequentemente é inibidor para aplicações a jusante nas quais é desejável usar os produtos enzimáticos, tais como fermentação de um micro-organismo que produz uma substância orgânica sobre um substrato que foi produzida por catálise enzimática com o produto enzimático. Além disso, o uso de alta concentração de um agente químico para exterminar células microbianas pode aumentar significativamente o custo do produto recuperado a partir do meio de fermentação.

[005] Consequentemente, permanece existindo uma necessidade de se desenvolver métodos para exterminar células sob condições menos severas e com uma concentração mais baixa de agentes químicos seria desejável.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Muitas proteínas industriais, tais como enzimas, são frequentemente fornecidas comercialmente nos caldos de fermentação nos quais elas são produzidas. Tipicamente, as proteínas são expressadas e secretadas por células (recombinantes ou não-recombinantes) dentro do caldo de fermentação que contém um meio de fermentação e as células. Frequentemente é desejável inativar, por exemplo, exterminar, as células antes de usar as proteínas em aplicações industriais de modo a não liberar células replicadoras para dentro do ambiente. A presente invenção se dedica à necessidade de inativar as células de uma maneira que não interfere substancialmente com a atividade das proteínas, por exemplo, enzimas.

[007] Em certos aspectos, a presente invenção fornece um método para fabricar uma formulação de caldo de fermentação, compreendendo incubar uma primeira mistura que compreende: (a) um ou mais caldos de fermentação, (b) um primeiro componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 1 -5 carbonos (isto é, um ácido orgânico com um total de 1-5 carbonos no seu esqueleto de cadeias laterais) e/ou um seu sal em uma quantidade entre 0,1% e 15% em peso da primeira mistura, e (c) um segundo componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos (isto é, um ácido orgânico com um total de 6 ou mais carbonos no seu esqueleto de cadeias laterais) e/ou um seu sal em uma quantidade entre 0,025% e 5% em peso da primeira mistura, por um período de tempo e sob condições que resultam em um decréscimo de pelo menos 4 log em células viáveis nos ditos um ou mais caldos de fermentação, fabricando desta forma a formulação de caldo de fermentação.

[008] Em modalidades específicas, o primeiro componente ácido orgânico está presente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, ou 1%, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, ou 15% em peso da primeira mistura, por exemplo, em quantidades na faixa entre 0,2% e 1%, entre 0,2% e 0,5%, entre 0,1 % e 10%, entre 0,25% e 5% ou entre 0,3% e 3% em peso da primeira mistura, etc.

[009] Em modalidades específicas, o segundo componente ácido orgânico está presente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, ou 1%, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, ou 5% em peso da primeira mistura, por exemplo, em quantidades na faixa entre 0,04% e 3%, entre 0,2% e 0,5%, entre 0,1% e 1%, entre 0,25% e 5% ou entre 0,3% e 3% em peso da primeira mistura, etc. O ácido orgânico pode ser adequadamente um ácido orgânico com 6 a 10 carbonos, um ácido orgânico com 6 a 9 carbonos, ou um ácido orgânico com 6 a 8 carbonos. Assim sendo, em modalidades específicas, o segundo componente compreende ou consiste em um ácido com 6 carbonos e/ou um seu sal, um ácido com 7 carbonos e/ou um seu sal, um ácido com 8 carbonos e/ou um seu sal, um ácido com 9 carbonos e/ou um seu sal, ou um ácido com 10 carbonos e/ou um seu sal.

[010] O período de tempo para a incubação é adequadamente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas ou 20 horas, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 12 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas, 28 horas, 32 horas ou 36 horas, por exemplo, entre 4 horas e 36 horas, por exemplo, entre 8 horas e 36 horas, entre 20 horas e 28 horas, entre 8 horas e 16 horas, entre 10 horas e 20 horas, entre 16 horas e 30 horas, etc.

[011] As condições para a incubação incluem uma temperatura que é adequadamente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 20°C, 22°C, 25°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 38°C, ou 40°C, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 28°C, 33°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, ou 55°C, por exemplo, entre 20°C e 50°C, entre 25°C e 40°C, entre 28°C e 33°C, etc.

[012] As condições para a incubação incluem um pH que é adequadamente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 3,5, 3,6, 3.7, 3,8, 3,9, 4, ou 4,2, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,2, ou 5,5, por exemplo, um pH entre 3,5 e 5, entre 4 e 4,7, ou 4,2 a 4,5. O pH pode ser ajustado no início da incubação e/ou uma ou mais vezes durante o período de incubação, por exemplo, adicionando um agente para ajuste do pH. Em modalidades específicas, o agente para ajuste do pH é ácido fosfórico, ácido sulfúrico ou hidróxido de sódio. Contempla-se aqui também que em certas modalidades primeiro e/ou segundo componente ácido orgânico pode desempenhar um papel para ajustar o pH no início da incubação e/ou durante o período de incubação, e assim mitigar parcial ou completamente a necessidade de outros agentes para ajuste do pH.

[013] Em certos aspectos, os métodos da invenção realizam um decréscimo de pelo menos 5 log, um decréscimo de 6 log, um decréscimo de 7 log ou um decréscimo de 8 no número de células viáveis em um ou mais caldos de fermentação na mistura.

[014] Em modalidades específicas, o decréscimo em células viáveis nas ditas pelo menos 0,25 vez, pelo menos 0,5 vez, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que para uma segunda mistura ou mistura alternativa submetida às ditas condições, que contém apenas um componente ácido orgânico em uma quantidade de até as porcentagens ponderais totais do primeiro e segundo componentes ácidos orgânicos na primeira mistura.A título exemplificative, o uso de uma primeira quantidade (por exemplo, 1% em peso) de um primeiro componente ácido orgânico e uma segunda quantidade (0,5% em peso) de um segundo componente ácido orgânico com relação aos métodos da invenção resulta em um decréscimo maior do número de células viáveis do que o uso de uma terceira quantidade que é até a soma das ditas primeira e segunda quantidades (por exemplo, 1,5% em peso) do primeiro componente ácido orgânico ou segundo componente ácido orgânico isoladamente sob condições iguais ou similares.

[015] Os presentes métodos podem ser usados para inativar células fúngicas, por exemplo, células fúngicas filamentosas. Em modalidades específicas, as células fúngicas filamentosas são dos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium, ou Neurospora. Outros tipos de células apropriadas para os métodos, formulações e composições da presente invenção está descritos na Seção 5.2.1 abaixo.

[016] Em modalidades específicas, o primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético, um sal do ácido acético, ácido fórmico, um sal do ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do ácido propiônico, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes. Em uma modalidade, o primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético e/ou um seu sal.

[017] Em modalidades específicas, o segundo componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido benzoico, um sal do ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, um sal do ácido ciclo- hexanocarboxílico, ácido 4-metil-valérico, um sal do ácido 4-metil-valérico, ácido fenil-acético, um sal do ácido fenil-acético, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes. Em uma modalidade, o segundo componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido benzoico e/ou um seu sal.

[018] Em certas modalidades dos presentes métodos, o primeiro componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio do dito ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou o segundo componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio do dito ácido orgânico com 6 ou mais carbonos.

[019] Em certas modalidades específicas, o primeiro componente ácido orgânico compreende ácido acético em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso e o segundo componente ácido orgânico compreende benzoato de sódio em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso e/ou o período de tempo é 24 horas e/ou as condições incluem uma temperatura de 40°C e/ou as condições incluem um pH entre 4 e 4,6.

[020] Nos métodos da invenção, a primeira mistura pode conter também um ou mais agentes antimicrobianos, por exemplo, para inibir o crescimento de bactérias ou fungos contaminantes. Em modalidades específicas, o um ou mais agentes antimicrobianos estão presentes em uma quantidade de 0,0005 a 0,05% em peso da primeira mistura, por exemplo, em uma quantidade de 0,001 a 0,025% em peso da dita mistura. Em uma modalidade específica, o agente antimicrobiano compreende extrato de lúpulo contendo iso-alfa-ácidos, tetra-iso-alfa-ácidos, e/ou beta-ácidos. Contempla-se aqui também que em certas modalidades o primeiro e/ou segundo componente ácido orgânico pode desempenhar um papel antimicrobiano, e assim sendo, minorar parcial ou completamente PA necessidade de outros agentes antimicrobianos.

[021] Os presentes métodos podem compreender ainda a etapa de fabricar a primeira mistura antes da etapa de incubação descrita acima, por exemplo, combinando um ou mais caldos de fermentação com pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal, pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal e opcionalmente um ou mais outros reagentes, tal como um agente para ajuste do pH e/ou um agente antimicrobiano.

[022] Em certas modalidades, os métodos aqui descritos compreendem ainda uma etapa de cultivar células para produzir um ou mais caldos de fermentação empregados na presente invenção.A título exemplificativo, mas não limitativo, os caldos de fermentação podem ser preparados de acordo com qualquer um dos métodos de cultura de células descritos na Seção 5.2.2 abaixo. Consequentemente, as composições e formulações da presente invenção podem incluir caldos de fermentação preparados pelos métodos aqui descritos.

[023] Sem se atarem a qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que o uso dos dois componentes ácidos orgânicos aqui descritos resulta na redução global de componente ácido orgânico necessário para atingir inativaçâo de células (por exemplo, reduzindo o número de células viáveis em um fator de 4 ou mais log como aqui descrito) em comparação com o uso de um único componente ácido orgânico e permite que a reação de incubação seja conduzida em um pH maior do que possível de outra forma, minimizando desta forma os efeitos adversos sobre a dobragem e estabilidade de proteínas, por exemplo, enzimas, no caldo de fermentação de partida. Assim sendo, em certos aspectos, os presentes métodos são conduzidos sob condições que resultam em uma formulação de caldo de fermentação na qual uma ou mais enzimas retêm pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% da sua atividade enzimática de partida.

[024] A presente invenção fornece ainda uma formulação de caldo de fermentação obtida ou obtenível pelos métodos aqui descritos.

[025] Assim sendo, em certos aspectos, a presente invenção fornece uma composição que compreende (a) um ou mais caldos de fermentação que compreendem células; (b) um primeiro componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 1 -5 carbonos e/ou um seu sal em uma quantidade de 0,2% a 1,5% em peso da dita composição, (c) um segundo componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal em uma quantidade de 0,04% a 0,6% em peso da dita composição.

[026] Em modalidades específicas, o primeiro componente ácido orgânico está presente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, ou 1%, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, ou 15% em peso da composição, por exemplo em quantidades na faixa entre 0,2% e 1%, entre 0,2% e 0,5%, entre 0,1% e 10%, entre 0,25% e 5% ou entre 0,3% e 3% em peso da composição, etc.

[027] Em modalidades específicas, o segundo componente ácido orgânico está presente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, ou 1%, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, ou 5% em peso da composição, por exemplo em quantidades na faixa entre 0,04% e 3%, entre 0,2% e 0.5%, entre 0.1% e 1%, entre 0,25% e 5% ou entre 0,3% e 3% em peso da composição, etc.

[028] Deve-se entender que os componentes ácidos orgânicos nas formulações e composições da invenção estão tipicamente na forma pelo menos parcialmente dissociada e quando tais componentes estão na forma dissociada, a porcentagem ponderai do componente refere-se não apenas ao peso dos íons dissociados (por exemplo, cátion), mas não ao peso do material seco (por exemplo, ácido ou sal) usado para fabricar a composição ou formulação. O grau até o qual tais componentes estão dissociados dependerá dos seus respectivos valores de pKa. Prefere-se que essa formulação ou composição seja fabricada sob condições de pH e temperatura nas quais pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 70% do componente ácido orgânico estejam dissociados.

[029] Em certos aspectos, as composições da invenção estão em um pH que está adequadamente em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, ou 4,2, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8,4,9, 5, 5,2, ou 5,5, por exemplo, um pH entre 3,5 e 5, entre 4 e 4,7, ou 4,2 a 4.5.

[030] Em certos aspectos, as células em uma composição da invenção são predominantemente ou completamente células não-viáveis. Por exemplo, em certas modalidades, caso células viáveis estejam presentes na composição, então a razão de células não-viáveis para células viáveis na dita composição é pelo menos 10:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 1.000:1, pelo menos 10.000:1, pelo menos 100.000:1 ou pelo menos 1.000.000:1.

[031] Em certos aspectos, as células compreendem células fúngicas, por exemplo, células fúngicas filamentosas. Em modalidades específicas, as células fúngicas filamentosas são dos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium, ou Neurospora.

[032] Em certas modalidades das composições da invenção, o primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético, um sal do ácido acético, ácido fórmico, um sal do ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do ácido propiônico, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes. Em uma modalidade específica, o primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético e/ou um seu sal.

[033] Em certas modalidades da composição da invenção, o segundo componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido benzoico, um sal do ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, um sal do ácido ciclo- hexanocarboxílico, ácido 4-metil-valérico, um sal do ácido 4-metil-valérico, ácido fenil-acético, um sal do ácido fenil-acético, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes. Em uma modalidade específica, o segundo componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido benzoico e/ou um sal deles.

[034] Em certas modalidades, o primeiro componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio de um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou o segundo componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio de um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos.

[035] Outros detalhes e modalidades dos ácidos orgânicos apropriados nos métodos e composições da presente invenção estão descritos na Seção 5.2.4 abaixo.

[036] Em modalidades específicas, o primeiro componente ácido orgânico compreende ácido acético em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso e/ou o segundo componente ácido orgânico compreende benzoato de sódio em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso.

[037] As composições da invenção podem compreender um ou mais agentes antimicrobianos. Em modalidades específicas, o um ou mais agentes antimicrobiano estão presentes em uma quantidade de 0,0005 a 0,05% em peso da composição, por exemplo, em uma quantidade de 0,001 a 0,025% em peso da dita composição. Em modalidade específicas, o agente antimicrobiano compreende extrato de lúpulo contendo iso-alfa-ácidos, tetra- iso-alfa-ácidos e/ou beta-ácidos.

[038] Os caldos de fermentação usados nos métodos, formulações e composições da invenção contêm tipicamente uma ou mais proteínas secretadas pelas células. Pelo menos uma das ditas uma ou mais proteínas pode ser expressada de forma recombinante e/ou é uma enzima, por exemplo, uma exoglicanase, ou endoglicanase, a hemicelululase ou uma β-glicosidase. Em certas modalidades, os caldos de fermentação contêm uma pluralidade de enzimas expressadas de forma recombinante e secretadas pelas células, por exemplo, duas ou mais entre uma exoglicanase, uma endoglicanase, uma hemicelulase ou uma β-glicosidase. Outras enzimas que estão adequadamente presentes nas composições e formulações da presente invenção estão descritas na Seção 5.2.3 abaixo. Em certos aspectos, as proteínas constituem entre 3 e 30% em peso de uma formulação ou composição da invenção. Em modalidades específicas, as proteínas constituem 5 a 15% em peso, entre 7 e 10% em peso, entre 6 e 12% em peso, entre 5 e 20% em peso, entre 10 e 25% em peso, entre 10 e 20% em peso, entre 8 e 15% em peso, ou entre 6 e 10% em peso da formulação ou composição da invenção.

[039] Em certas modalidades específicas, uma formulação ou composição da invenção tem uma, duas, ou todas as três das seguintes atividades:(a) uma atividade de endoglicanase em uma faixa na qual o limite inferior é selecionado entre 2.000, 2.100, 2.200, 2.350, 2.500 ou 2.650 CMC U/g, e na qual o limite superior é selecionado independentemente entre 2.400, 2.600, 2.800, 3.000, 3.200, 3.500, 3.750 ou 4.000 CMC U/g, por exemplo, em uma faixa entre 2.200 CMC U/g e 2.800 CMC U/g, entre 2.200 CMC U/g e 3.200 CMC U/g, entre 2.500 e 3.500 CMC U/g, etc.;(b) uma atividade de β- glicosidase na faixa entre um limite inferior selecionado entre 300, 375, 450, 475, 500, 525, 550, 600, 650, ou 700 pNPG U/g, e um limite superior selecionado independentemente entre 475,525, 575, 635, 700, 775,800,850, 900 ou 950 pNPG U/g, por exemplo, em uma faixa entre 525 pNPG U/g e 775 pNPG U/g, entre 300 pNPG U/g e 800 pNPG U/g, entre 350 pNPG U/g e 850 pNPG U/g, etc.; e(c) uma atividade de xilanase na faixa entre um limite inferior selecionado entre 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.250, 2.500, 2.750 ou 3.000 ABX U/g e um limite superior selecionado independentemente entre 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000 ou 7.000 ABX U/g, por exemplo, em uma faixa entre 2.000 ABX U/g e 5.000 ABX U/g, entre 1.500 ABX U/g e 4500 ABX U/g, entre 3.500 ABX U/g e 5500 ABX U/g, etc.

[040] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para hidrolisar um material celulósico, compreendendo colocar o material celulósico em contato com qualquer uma das formulações ou composições de caldos de fermentação precedentes. Em algumas modalidades, o material celulósico é um material de biomassa vegetal, tal como um material lignocelulósico que opcionalmente foi pré-tratada para intensificar a hidrólise enzimática. Consequentemente, em certos aspectos as formulações e composições da invenção compreendem ainda um material celulósico não hidrolisado, material celulósico parcialmente hidrolisado, ou material celulósico substancialmente hidrolisado completamente (por exemplo, >90% hidrolisado ou >95% hidrolisado). Em modalidades específicas, o material celulósico parcialmente hidrolisado (i) é um material celulósico até 40%, até 50%, até 60%, até 70%, até 80% ou até 90% hidrolisado; (ii) é um material celulósico pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, ou pelo menos 70% hidrolisado; ou (iii) é hidrolisado até uma faixa entre um par dos valores selecionados independentemente entre (i) e (ii), por exemplo, 30%-80% ou 40%-90% hidrolisado. Deve-se assinalar que as faixas ponderais dos componentes (por exemplo, ácidos orgânicos) das formulações e composições aqui genericamente descritas não incluem materiais celulósicos ou produtos da hidrólise de materiais celulósicos.

[041] Outros detalhes e modalidades das formulações e composições da presente invenção estão descritos na Seção 5.3 abaixo.

[042] Em certos aspectos, a invenção fornece métodos para produzir substâncias orgânicas fermentando um micro-organismo que produz uma substância orgânica em uma formulação ou composição da invenção. Em uma modalidade, o micro-organismo é um micro-organismo etanologênico e a substância orgânica é etanol. Uma composição da invenção pode ser usada em uma reação simultânea de sacarificação e fermentação ("SSF") ou uma reação separada de hidrólise e fermentação ("SHF").

[043] Sem desejar se atar a qualquer teoria, as formulações e composições da invenção contêm vantajosamente menos inibidores de micro- organismos fermentadores do que uma formulação ou composição (aqui referida como uma "formulação alternativa" ou "composição alternativa", respectivamente) que é similar ou idêntica a uma composição da invenção, mas contendo apenas um componente ácido orgânico em uma quantidade para inativar ou exterminar as células no(s) caldo(s) de fermentação na formulação ou composição alternativa. Consequentemente, em certas modalidades, o rendimento de substância orgânica produzida pelo micro- organismo fermentador na presença da formulação ou composição da invenção é pelo menos 0,25 vez maior, pelo menos 0,5 vez maior, pelo menos 1 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior ou pelo menos 10 vezes maior do que o rendimento da substância orgânica na presença dessa formulação ou composição alternativa.A título exemplificative, quando uma composição ou formulação da invenção que contém enzimas, uma quantidade (por exemplo, 1% em peso) de um primeiro componente ácido orgânico e uma segunda quantidade (0,5% em peso) de um segundo componente ácido orgânico é empregado com um micro-organismo fermentador, o rendimento de substância orgânica produzida pelo micro- organismo fermentador é maior do que o rendimento quando uma composição que contém as mesmas enzimas e uma terceira quantidade que é até a soma das ditas primeira e segunda quantidades (por exemplo, 1,5% em peso) do primeiro componente ácido orgânico ou segundo componente ácido orgânico isoladamente é empregado sob condições iguais ou similares.

[044] Assim sendo, em certas modalidades, as presentes formulações e composições são usadas em uma reação SSF. Os métodos compreendem submeter uma mistura da reação de SSF, contendo uma formulação ou composição da invenção, a um micro-organismo fermentador e um substrato celulósico a condições de SSF. Opcionalmente, os métodos incluem a etapa de formar a mistura da reação de SSF, por exemplo, combinando uma formulação ou composição da invenção, o etanologênio e opcionalmente o substrato celulósico. Em uma modalidade específica, as condições de SSF incluem a ausência de uma fonte suplementar de nitrogênio. Em outra modalidade específica, as condições conduzem à hidrólise de celulose para glicose e/ou açúcar de hemicelulose (por exemplo, xilose, arabinose, e/ou manose) e à conversão de glicose e/ou hemicelulose em substância orgânica (por exemplo, etanol). As misturas de reação SSF que compreendem uma formulação ou composição da invenção, um micro-organismo fermentador e, opcionalmente, um material celulósico, também estão englobadas pela presente invenção, são como produtos da reação SSF nas quais o material celulósico foi pelo menos parcialmente hidrolisado e fermentado.

[045] Em outras modalidades, as presentes formulações e composições são usadas em uma reação SHF. Os métodos compreendem submeter uma mistura de reação SHF que contém uma formulação ou composição da invenção e um substrato celulósico a condições de SHF. Opcionalmente, os métodos incluem a etapa de formar a mistura da reação SHF, por exemplo, combinando uma formulação ou composição da invenção e um substrato celulósico. Em uma modalidade específica, as condições de SHF conduzem à hidrólise de celulose para glicose e/ou açúcar de hemicelulose (por exemplo, xilose, arabinose, e/ou manose). Opcionalmente, os produtos da reação SHF são então usados em uma reação de fermentação para conversão da glicose e/ou hemi-celulose na substância orgânica (por exemplo, etanol). As misturas de reação SHF que compreendem uma formulação ou composição da invenção e um material celulósico também estão englobadas pela presente invenção, assim como o estão os produtos da reação SHF nos quais o material celulósico foi pelo menos parcialmente hidrolisado.

[046] Outros detalhes e modalidades dos métodos para hidrolisar material celulósico, e métodos para produzir substâncias orgânicas estão descritos nas Seções 5.4 e 5.5 abaixo.

[047] Em outro aspecto, a invenção fornece kits que contêm uma embalagem e uma formulação, composição, mistura da reação SSF, produto da reação SSF, mistura da reação SSF ou produto da reação SHF de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, o kit contém ainda instruções para uso em um método para produzir uma substância orgânica com um micro-organismo fermentador, por exemplo, instruções para uso em um método para produzir etanol com um micro-organismo etanologênico e um substrato celulósico hidrolisado com o caldo integral com células exterminadas ou composição no kit. Outros detalhes e modalidades dos kits da presente invenção estão descritos na Seção 5.6 abaixo.

[048] Outras modalidades específicas dos métodos, formulações e composições da presente invenção são fornecidas na Seção 5.7 abaixo.

4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[049] A Figura 1 ilustra os efeitos da temperatura e da concentração química da formulação sobre a exterminação de células de T. reesei.

[050] A Figura 2 ilustra o efeito da concentração de benzoato de sódio sobre a exterminação de células de T. reesei a 40°C e pH 4.

[051] A Figura 3 ilustra o efeito de condições de exterminação de células sobre a exterminação de células fúngicas.

[052] A Figura 4 ilustra estruturas químicas e valores de pKa para ácidos orgânicos com 6 ou mais carbonos.

[053] A Figura 5 ilustra os efeitos de diferentes ácidos orgânicos com 6 ou mais carbonos sobre a exterminação de células de T. reesei a 40 °C e pH 4.

[054] A Figura 6 ilustra a produção de ácido lático a partir de L. rhamnosus em hidrolisado de APB lavado como descrito no Exemplo 2.

[055] A Figura 7 ilustra a produção de etanol a partir da levedura Thermosacc® em hidrolisado de APB lavado, como descrito no Exemplo 2.

[056] A Figura 8 ilustra a acumulação de glicose durante a fermentação da levedura Thermosacc® em hidrolisado de APB lavado, como descrito no Exemplo 2.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 5.1 Definições

[057] Como aqui utilizado, o termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula ou linhagem de células na qual um vetor de expressão recombinante para produção de um polipeptídeo pode ser transfectada para a expressão do polipeptídeo. As células hospedeiras incluem a progénie de uma única célula hospedeira, e a progénie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico total) à célula parental original devido a uma mutação natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas ou transformadas in vivo com um vetor de expressão. "Célula hospedeira" refere-se a células e protoplastos criados a partir de células de uma cepa fúngica filamentosa e particularmente uma cepa de Trichoderma sp.

[058] O termo "recombinante" quando utilizado com relação a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim sendo, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra forma expressados anormalmente expressados ou não expressados de forma alguma.

[059] O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina e Oomycota (vide Alexopoulos, C. J. (1962), "Introductory Mycology", Wiley, New York). Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular constituída de quitina, beta-glicano, e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente e geneticamente distintos de leveduras. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico.

[060] Como aqui utilizado, o termo "Trichoderma" ou "Trichoderma sp." Refere-se a qualquer gênero fúngico anteriormente ou correntemente classificado como Trichoderma.

[061] O termo "cultivar" refere-se uma população em crescimento de células microbianas sob condições apropriadas para crescimento, em um meio líquido ou sólido.

[062] Como aqui utilizados, os termos "substrato celulósico" ou "material celulósico," são aqui utilizados de forma intercambiável para se referir a um material que contém celulose e/ou hemicelulose. Um substrato celulósico pode ser um material lignocelulósico, que contém celulose, hemicelulose, e beta-glicanos que são reticulados entre si e com lignina. Tais substratos celulósicos podem conter também outros materiais, tais como pectinas, proteínas, amido, e lipídeos, mas tipicamente contêm celulose, hemicelulose, e beta-glicanos como componentes principais.

[063] O termo "micro-organismo fermentador" refere-se a qualquer micro-organismo apropriado para uso em um processo de fermentação desejado para a produção de substâncias orgânicas.

[064] O termo "caldo de fermentação", como aqui utilizado, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que não sofre qualquer recuperação e/ou purificação ou sofre recuperação e/ou purificação mínima. Por exemplo, os caldos de fermentação são produzidos quando culturas microbianas são desenvolvidas até a saturação, incubadas sob condições limitadoras de carbono, para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode conter também teores não fracionados ou fracionados de materiais da fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação é não fracionado e compreende o meio de cultura gasto e os resíduos celulares presentes depois que as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) são removidas, por exemplo, por centrifugação. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação contém o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[065] "Etanologênico" refere-se à capacidade de um micro-organismo produzir etanol a partir de um carboidrato como produto principal de fermentação. Em algumas modalidades, os micro-organismos etanologênicos podem ser usados também para produzir outras substâncias orgânicas.

[066] Uma "unidade de carbóxi-metil-celulose" ou "CMC U" refere-se a uma unidade de atividade de endoglicanase que libera 1 μmol de açúcar redutor sugar (expressado como equivalentes de glicose) em um minuto a 50°C e pH 4,8.

[067] Uma "unidade de pNP-glicosídeo" ou "pNPG U" refere-se a uma unidade de atividade de beta-glicosidase que libera 1 μmol de nitrofenol a partir de para-nitrofenil-B-D-glicopiranosídeo a 50°C e pH 4,8.

[068] Uma "unidade de ABX" ou "ABX U" refere-se e uma unidade de atividade de xilanase que libera 1 μmol de equivalentes do açúcar redutor xilose a partir de uma solução de 1% de xilano a partir de bétula em tampão de citrato de sódio/cítrico 50 mM, pH 5,3 a 50°C, como testado usando o método de ácido dinitro-salicílico (DNS) (Miller, Anal. Chem., 31:426-428 (1959)).

5.2 Métodos para Exterminar Células

[069] A invenção fornece métodos para exterminar células em um meio de cultura, produzindo desta forma um caldo integral com células exterminadas. Em algumas modalidades, o método inclui colocar as células em contato com uma combinação de um primeiro ácido orgânico que tem 1 a 5 átomos de carbono, em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 1 % em peso, e um segundo ácido orgânico que tem 6 ou mais átomos de carbono, em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 0,3% em peso. Em algumas modalidades, o método inclui colocaras células em contato com uma combinação de um primeiro ácido orgânico que tem 1 a 5 átomos de carbono, em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso, e um segundo ácido orgânico que tem 6 ou mais átomos de carbono, em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso. Em outras modalidades, o método inclui colocar as células em contato com um ácido orgânico que tem 6 ou mais átomos de carbono, em uma concentração de cerca de 0,25% a cerca de 0,5% em peso. O método é realizado por um período de tempo apropriado e um pH e temperatura apropriada para efetuar exterminação substancial mente completa de células (isto é, um decréscimo de pelo menos cerca de 4, 5, ou 6 log em células viáveis depois do tratamento) ou exterminação completa de células (isto é, nenhuma célula viáveis depois do tratamento). Tipicamente, o pH é cerca de 3,5 a cerca de 4,5, cerca de 4 a cerca de 4,4, ou cerca de 3,9 a cerca de 4,2, a temperatura é cerca de 30°C a cerca de 40°C, e o método é realizado neste pH e temperatura por cerca de 8 a cerca de 24 horas. Em uma modalidade, o método é realizado em pH cerca de 4 e temperatura de cerca de 40°C por cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, as células são exterminadas sem lise. Em algumas modalidades, algumas ou todas as células são lisadas.

5.2.1 Células Microbianas

[070] As células são tipicamente células microbianas, por exemplo, células bacterianas ou fúngicas, e tipicamente produzem pelo menos uma molécula de interesse, tal como uma enzima ou composto orgânico. Em algumas modalidades, as células produzem pelo menos uma enzima que é expressada de forma recombinante. Em algumas modalidades, a molécula de interesse é secretada dentro do meio de cultura extracelular. Em algumas modalidades, a molécula de interesse é produzida de forma intracelular e não é secretada de forma extracelular dentro do meio de cultura. Quando a molécula é produzida de forma intracelular e não secretada de forma extracelular, a lise das células exterminadas pode ser necessária para liberar a molécula dentro do meio líquido.

[071] Em algumas modalidades, as células microbianas são células fúngicas filamentosas, incluindo fungos filamentosos de ocorrência natural, fungos filamentosos com mutações de ocorrência natural ou induzidas, e fungos filamentosos que foram geneticamente modificados.

[072] Em algumas modalidades, as células fúngicas são das espécies Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauveria, Bjerkandera, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Cryptococcus, Cyathus, Endothia, Endothia, Filobasidium, Fusarium, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paeilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Podospora, Paecilomyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Sporotrychum, Stagonospora, Talaromyces, Toypoladium, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton, e Trametes ou espécies derivadas delas. Em algumas modalidades, as células fúngicas são das espécies Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, ou Aspergillus oryzae. Em algumas modalidades, as células fúngicas são das espécies Fusarium bactridioides, Fusarium cereal is, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em algumas modalidades, as células fúngicas são das espécies Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Cerporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Scytalidium thermophilum, Thielavia terrestris, Trametes pleurotus, Trametes villosa, Trametes versicolor, Chaetomium paecilomyces, Endothia mucor, Penicillium purpurogenum, Penicillium funiculosum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiate, ou Pleurotus eryngii. Em algumas modalidades, as células fúngicas são das espécies Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

5.2.2 Cultura de Células Microbianas

[073] As células microbianas podem ser cultivadas por qualquer método de cultura conhecido nessas técnicas que resultam na expressão. Genericamente, as condições apropriadas para a produção de uma ou mais moléculas de interesse (por exemplo, uma ou mais enzimas e/ou compostos orgânicos) usadas são, por exemplo, condições apropriadas para a expressão de enzimas capazes de hidrolisar um substrato celulósico. A fermentação de uma cultura microbiana pode incluir cultivo em frascos agitados, germentação em pequena ou larga escala, tais como fermentações contínuas, em batelada, alimentadas em bateladas ou no estado sólido em fermentadores de laboratório ou industriais, realizadas em um meio apropriado e sob condições que permitem que a celulase seja expressada. A cultura ocorre em um meio nutriente apropriado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos nessas técnicas. Os meios de cultura, faixas de temperatura e outras condições apropriadas para o crescimento e produção de moléculas de interesse, por exemplo, biomoléculas, tais como enzimas ou outras proteínas, ou compostos orgânicos, são conhecidos nessas técnicas.

[074] A fermentação, por exemplo, fermentação de células fúngicas filamentosas, é frequentemente conduzida de uma maneira tal que o substrato que contém carbono possa ser controlado como um fator limitador, proporcionando desta forma uma boa conversão do substrato que contém carbono em células e evitando a contaminação das células com uma quantidade substancial de substrato não convertido. Esta última possibilidade não é um problema com substratos solúveis em água, pois quaisquer vestígios remanescentes são prontamente removidos por lavagem. Isto pode ser um problema, entretanto, no caso de substratos insolúveis em água, e requerem etapas adicionais de tratamento do produto tais como etapas de lavagem apropriadas.

[075] A fermentação pode ser conduzida desenvolvendo as células microbianas, por exemplo, células fúngicas filamentosas, até a fase estacionária e mantendo as células sob condições limitadoras de carbono por um período de tempo suficiente para expressar uma ou mais moléculas de interesse.

5.2.3 Enzimas Expressadas por Células Microbianas

[076] As células microbianas usadas nos métodos da invenção podem ser não recombinantes e/ou recombinantes, por exemplo, fungos filamentosos não-recombinantes e/ou recombinantes. Em algumas modalidades, as células microbianas contêm um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos para as células microbianas.

[077] Em algumas modalidades, as células microbianas, por exemplo, células fúngicas filamentosas, contêm um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos às células, onde o um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar um substrato celulósico. Os genes que codificam enzimas degradadoras de materiais celulósicos são conhecidos pelos versados nessas técnicas. Os exemplos apropriados não limitativos de genes que codificam enzimas que degradam substratos celulósicos incluem endoglicanases, celobio-hidrolases, glico-hidrolases, beta-glicosidases, xiloglicanases, xilanases, xilosidases, alfa-arabinofuranosidases, ala- glicuronidases, acetil xilano esterases, mananases, manosidases, alfa- galactosidases, manana acetil esterases, galactanases, arabinanases, pectato liases, pectina liases, pectato liases, poligalacturonases, pectina acetil esterases, pectina metol esterases, alfa-arabinofuranosidases, beta-galactosidases, galactanases, arabinanases, alfa-arabinofuranosidases, ramnogalacturonases, ramnogalacturonana liases, e ramnogalacturonana acetil esterases, xilogalacturonosidases, xilogalacturonases, ramnogalacturonana liases, lignina peroxidases, peroxidases dependentes de manganês, e lacases.

[078] Em algumas modalidades da invenção, as células microbianas recombinantes, por exemplo, células fúngicas filamentosas recombinantes, superexpressam uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Alternativamente, as células microbianas podem ser uma mistura de células não recombinantes e células recombinantes que superexpressam uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Em algumas modalidades da invenção, as células microbianas, por exemplo, células fúngicas filamentosas, superexpressam β- glicosidase. Alternativamente, as células microbianas podem ser uma mistura células não recombinantes e células recombinantes que superexpressam uma β-glicosidase.

[079] O termo "beta-glicosidase" é aqui definido como uma beta-D- glucosídeo glico-hidrolase classificada como EC 3.2.1.21, e/ou aquelas de certas famílias de GH, incluindo, porém sem limitações, aquelas nas famílias de GH 1,3, 7, 9 ou 48, que catalisam a hidrólise de celobiose com a liberação de beta-D-glicose. A beta-glicosidase superexpressada pode ser de espécie igual ou diferente daquela da célula hospedeira. Notadamente, a beta- glicosidase superexpressada não precisa ser uma beta-glicosidase fúngica para ser expressada em uma célula fúngica.

[080] Em algumas modalidades, a beta-glicosidase pode ser produzida expressando um a gene que codifica beta-glicosidase. Por exemplo, a beta- glicosidase pode ser secretada dentro do espaço extracelular, por exemplo, por organismos gram-positivos (tais como Bacillus e Actinomycetes), ou hospedeiros eucarióticos (por exemplo, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces, e Pichia). Deve-se entender que em algumas modalidades, a beta-glicosidase pode ser superexpressada em um micro-organismo recombinante em relação aos níveis nativos. Em algumas modalidades, caso uma célula hospedeira seja empregada para a expressão da beta-glicosidase, a célula pode ser geneticamente modificada para reduzir a expressão de uma ou mais proteínas que são endógenas à célula. Em uma modalidade, a célula pode conter um ou mais genes nativos, particularmente genes que codificam proteínas secretadas que foram deletadas ou inativadas. Por exemplo, um ou mais genes que codificam proteases (por exemplo, um gene que codifica aspartil protease; vide Berka et al, Gene 86:153-162 (1990) e patente n° US 6.509.171) ou genes que codificam celulase podem ser deletados ou inativados, uma células hospedeira Trichoderma sp., por exemplo, uma célula hospedeira T. reesei, contém deleções inativadores nos genes cbh1, cbh2 e egl1, e egl2, como descrito no pedido de patente PCT n5 WO 05/001036. O ácido nucleico que codifica beta-glicosidase pode estar presente no genoma nuclear da célula hospedeira Trichoderma sp. ou pode estar presente em um plasmídeo que replica na célula hospedeira Trichoderma.

[081] Os exemplos de beta-glicosidases que que podem ser usadas incluem e beta-glicosidase de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., Gene 173:287-288 (1996)), Aspergillus kawachi (Iwashita etal., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65:5546-5553 (1999)), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Célulaulomonas biazotea (Wong et al., Gene 207:79-86 (1998)), Saccharomycopsis fibuligera (Machida et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54:3147-3155 (1988)), Schizosaccharomyces pombe (Wood et al., Nature 415:871-880 (2002)), beta-glicosidase 1 de Trichoderma reesei (patente no US 6.022.725), beta-glicosidase 3 de Trichoderma reesei (patente no US 6.982.159), beta-glicosidase 4 de Trichoderma reesei (patente no US 7.045.332), beta-glicosidade 5 de Trichoderma reesei (patente no US 7.005.289), beta-glicosidase 6 de Trichoderma reesei (USPN no 20060258554), e beta-glicosidase 7 de Trichoderma reesei (USPN no 20040102619).

[082] Em algumas modalidades, a(s) enzima(s) de interesse secretada(s) de forma extracelular pelas células microbianas são solúveis no meio de cultura extracelular e/ou no caldo com células exterminadas. Em algumas modalidades, a(s) enzima(s) de interesse secretada(s) de forma extracelular pelas células microbianas são insolúveis no meio de cultura extracelular e/ou no caldo com células exterminadas. Em algumas modalidades, o meio de cultura extracelular e/ou caldo com células exterminadas contém uma mistura de enzimas solúveis e insolúveis de interesse.

5.2,4 Ácidos orgânicos

[083] Os métodos da invenção incluem colocar células e um meio de cultura em contato com um ou mais ácidos orgânicos ou um ou mais sais deles em uma quantidade e sob condições como aqui descritas para inativar as células, por exemplo, em uma quantidade para efetuar um decréscimo de pelo menos 4 log, 5 log, 6 log, 7 log ou 8 log na quantidade de células viáveis.

[084] Em algumas modalidades, os métodos incluem colocar as células em contato com um primeiro ácido orgânico (ou seu sal) que contém 1 a 5 átomos de carbono em uma concentração de cerca de 0,1% a cerca de 15%, 0,2% a cerca de 1%, ou cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso e um segundo ácido orgânico (ou seu sal) que contém 6 ou mais átomos de carbono em uma concentração de cerca de 0,025% a 5% em peso, 0,04% a cerca de 0.3% em peso, ou cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso. Em várias modalidades, o primeiro ácido orgânico é usado em uma concentração de qualquer uma entre cerca de 0,2, 0,5, 0,3, 0,35, 0,4, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, ou 1% em peso, em combinação como o segundo ácido orgânico em uma concentração de qualquer uma entre cerca de 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, ou 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, ou 0,5% em peso. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso, ou cerca de 0,28% em peso, e o segundo ácido orgânico é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 0,06% , ou cerca de 0,044% em peso. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,28% em peso e o segundo ácido orgânico é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,22% em peso.

[085] Em algumas modalidades, o método inclui colocar as células em contato com um ácido orgânico (ou seu sal) que contém 6 ou mais átomos de carbono a cerca de 0,25% a cerca de 0,5% em peso. Em várias modalidades, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono é usado em uma concentração de qualquer uma de cerca de 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, ou 0,5% em peso. Em uma modalidade, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,5% em peso.

[086] Em algumas modalidades, o ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico (ou um seu sal), ou uma combinação deles. Em uma modalidade, o ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono é ácido acético.

[087] Em algumas modalidades, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4- metil-valérico, ácido adípico, ácido 3-metil-glutárico, ácido fenil-acético (ou um seu sal), ou uma combinação deles. Em uma modalidade, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono é ácido benzoico (ou um seu sal, tal como benzoato de sódio). Em algumas modalidades, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono contém 6 a 8 (isto é, 6, 7, ou 8) átomos de carbono. Em algumas modalidades, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono contém 1 ou 2 grupos funcionais ácido carboxílico. Em algumas modalidades, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono é um ácido orgânico aromático. Em algumas modalidades, o ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono contém 7 ou 8 carbonos e 1 grupo fenila.

5.3 Composições

[088] A invenção fornece composições resultantes dos métodos para exterminar células como aqui descrito. Em algumas modalidades, a composição é um caldo integral com células exterminadas, contendo ácido(s) orgânico(s) como aqui descrito, células exterminadas e/ou detritos de células, e meio de cultura. Em algumas modalidades, a composição contém ácido(s) orgânico(s) como aqui descrito, e opcionalmente outras células exterminadas e/ou detritos de células. Em uma modalidade, as células exterminadas e/ou detritos de células são removidos de um caldo integral com células exterminadas, como aqui descrito, para produzir uma composição que é isenta destes componentes. Um caldo ou composição com células exterminadas da invenção contém tipicamente pelo menos uma molécula de interesse (por exemplo, uma biomolécula, tal como uma proteína, por exemplo, uma enzima, e/ou uma substância orgânica) produzida pelas células microbianas que foram usadas para produzir o caldo ou composição com células exterminadas.

[089] Conservantes e/ou agentes antimicrobianos (por exemplo, bacteriostáticos) adicionais podem ser opcionalmente adicionados ao caldo ou composição com células exterminadas, incluindo, porém sem limitações, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio, e outros conhecidos nessas técnicas.

[090] Em algumas modalidades, o caldo ou composição com células exterminadas pode ser suplementado com uma ou mais atividades de enzima que não são expressadas de forma endógena, ou expressadas em níveis relativamente baixos pelas células microbianas. Por exemplo, uma ou mais enzimas podem ser adicionadas para melhorar a degradação de um substrato celulósico, por exemplo, para açúcares fermentáveis tais como glicose ou açúcar de hemicelulose (por exemplo, xilose, arabinose, manose). A enzima ou enzimas suplementares podem ser adicionadas como um suplemento ao caldo ou composição com células exterminadas e a enzima ou enzimas podem ser um componente de um caldo de fermentação separado, ou podem ser purificadas, ou minimamente recuperadas e/ou purificadas. Os exemplos apropriados não limitativos de enzimas suplementares incluem celobio- hidrolases, endoglicanase, beta-glicosidase, endo-beta-1,3(4)-glicanase, glico-hidrolase, xiloglicanase, xilanase, xilosidase, arabinofuranosidase, alfa- glucuronidase, acetil xilano esterase, mananase, manosidase, alfa- galactosidase, manana acetil esterase, galactanase, arabinanase, pectato liase, pectinase liase, pectato liase, poligalacturonase, pectina acetil esterase, pectina metil esterase, beta-galactosidase, galactanase, arabinanase, alfa- arabinofuranosidase, ramnogalacturonase, ácido ferrúlico esterases ramnogalacturonana liase, ramnogalacturonana acetil esterase, xilogalacturonosidase, xilogalacturonase, ramnogalacturonana liase, lignina peroxidases, peroxidases dependentes de manganês, peroxidases híbridas, com propriedades combinadas de lignina peroxidases e peroxidases dependentes de manganês, glicoamilase, amilase, protease, e lacase.

[091] Em algumas modalidades, o caldo ou composição com células exterminadas inclui enzimas celolíticas incluindo, porém sem limitações: (i) endoglicanases (EG) ou 1,4--d-glicano-4-glicano-hidrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglicanases, including 1,4-d-glucano glucano-hidrolases (também conhecidas como celodextrinases) (EC 3.2.1.74) e 1,4--d-glicano celobio- hidrolases (exo-celobio-hidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91), e (iii) beta-glicosidase (BG) ou beta-glicosídeo glico-hidrolases (EC 3.2.1.21).

[092] Em algumas modalidades, o caldo integral ou composição com células exterminadas contém uma ou mais enzimas selecionadas entre exoglicanase, endoglicanase, hemicelulase, e beta-glicosidase. Em uma modalidade, to caldo integral ou composição com células exterminadas contém cerca de 1.000 a cerca de 2.000, cerca de 1.500 a cerca de 2.500, cerca de 2.200 a cerca de 2.800, ou cerca de 2.500 CMC U/g de atividade de endoglicanase e cerca de 450 ao cerca de 775, cerca de 525 a cerca de 775, cerca de 400 a cerca de 800, ou cerca de 650 pNPG U /g de atividade de beta- glicosidase. A atividade de carbóxi-metil-celulose (CMC) e a atividade de para- nitrofenil-B-D-glicopiranosídeo (pNPG) podem ser determinadas usando métodos conhecidos nessas técnicas (vide, por exemplo, Ghose, T. K., "Measurement of Cellulase Activities," Pure & Appl. Chem. 59:257-268 (1987); Chen, H., Hayn, M., Esterbauer, H. "Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei," Biochimica et Biophysica Acta, 1121:54-60 (1992)).

[093] Em algumas modalidades, o caldo integral ou composição com células exterminadas contém ácido acético em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 1%, cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,28% em peso e ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,22% em peso, em um pH de cerca de 3,9 a cerca de 4,3, cerca de 3,5 a cerca de 4,5, cerca de 4 a cerca de 5, cerca de 4,5 a cerca de 5,5, cerca de 4,8 a cerca de 5,2, ou cerca de 4.

[094] Em algumas modalidades, o caldo integral ou composição com células exterminadas contém teores não fracionados dos materiais da fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo integral ou composição com células exterminadas contém o meio de cultura gasto e os detritos celulares presentes depois que as células microbianas (por exemplo, células fúngicas filamentosas) são desenvolvidas até a saturação, incubadas sob condições limitadoras de carbonos para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão das enzimas celulase e/ou glicosidase). Em algumas modalidades, o caldo integral ou composição com células exterminadas contém o meio de cultura gasto, enzimas extracelulares, e células fúngicas filamentosas exterminadas. Em algumas modalidades, as células microbianas presentes no caldo integral ou composição com células exterminadas podem ser permeabilizadas e/ou lisadas usando métodos conhecidos nessas técnicas.

[095] A invenção fornece também uma composição reativa que contém uma mistura de um material celulósico, um caldo integral ou composição com células exterminadas, como aqui descrito, e um micro-organismo fermentador em um meio de cultura. Em algumas modalidades, a composição reativa é substancialmente isenta de uma fonte suplementar de nitrogênio. Em algumas modalidades, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico. Em algumas modalidades, a produção de uma substância orgânica na composição reativa é aumentada em pelo menos cerca de 50% em comparação com uma composição reativa que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico, a substância orgânica é etanol, e a produção de etanol na composição reativa é aumentada em pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com uma composição reativa que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso.

[096] Um caldo integral ou composição com células exterminadas, como aqui descrito, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células exterminadas, detritos celulares, componentes do meio de cultura, e/ou enzima ou enzimas insolúveis. Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para produzir uma composição líquida clarificada.

5.4 Métodos para Hidrolisar Material Celulósico

[097] A invenção fornece métodos para hidrolisar um material celulósico. O método inclui colocar um material celulósico em contato com um caldo integral ou composição com células exterminadas resultante de um método para exterminar células como aqui descrito, em uma quantidade suficiente para efetuar a hidrólise enzimática do material celulósico por uma ou mais enzimas no caldo integral ou composição com células exterminadas.

[098] Os exemplos apropriados não limitativos de substratos celulósicos incluem, porém sem limitações, biomassa, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, lixo municipal sólido, aparas de papel, e resíduos de polpa e papel. As formas comuns de substratos celulósicos para uso na presente invenção incluem, porém sem limitações, árvores, arbustos e gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, milho, folhelhos de milho, grãos de milho incluindo fibra de grãos, produtos e subprodutos da moagem de grãos tais como milho (incluindo moagem a úmido e moagem a seco), bem como lixo municipal sólido, aparas de papel e aterro sanitário. O substrato celulósico pode ser obtido a partir de "biomassa virgem" (tais como árvores, arbustos, gramíneas, frutos, flores, culturas herbáceas, madeiras de fibra curta e fibra longa), "biomassa não virgem" (tais como subprodutos agrícolas, lixo orgânico comercial, detritos de construção civil e demolição, lixo municipal sólido e aterros sanitários), ou "biomassa mesclada", que é uma mistura de biomassa virgem e não virgem.

[099] Em algumas modalidades, o substrato celulósico inclui madeira, pasta de madeira, borra da fabricação de papel, correntes de resíduos de pasta para papel, aglomerados de partículas, forragem de milho, fibra de milho, resíduo do processamento de arroz, papel e pasta para papel, plantas lenhosas e herbáceas, polpas de frutas, polpa de vegetais, pedra-pomes, grãos de destilarias, gramíneas, cascas de arroz, bagaço de cana-de-açúcar, algodão, juta, cânhamo, linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, grãos de destilarias, folhas, palha de trigo, pilosidades de coco, algas, capim Panicum virgatum, e misturas deles.

[0100] O substrato celulósico pode ser usado como está ou pode ser submetido a um pré-tratamento usando métodos convencionais conhecidos nessas técnicas. Tais pré-tratamentos incluem pré-tratamento químico, físico e biológico. Por exemplo, as técnicas de pré-tratamento físico podem incluir, sem limitações, vários tipos de moagem, trituração, exposição a vapor de água, irradiação e hidrotermólise. As técnicas de pré-tratamento químico podem incluir, sem limitações, ácido diluído, alcalino, solvente orgânico, amoníaco, dióxido de enxofre, dióxido de carbono, e hidrotermólise com pH controlado. As técnicas de pré-tratamento biológico podem incluir, sem limitações, aplicar micro-organismos solubilizadores de lignina.

5.5 Métodos para Produzir Substâncias Orgânicas em Micro-organismos

[0101] A invenção fornece métodos para produzir substâncias orgânicas em micro-organismos, por exemplo, micro-organismos fermentadores. Os métodos incluem produzir material celulósico hidrolisado com um caldo integral ou composição com células exterminadas,como descrito acima, e desenvolver um micro-organismo fermentador na presença do material celulósico hidrolisado sob condições apropriadas para que o micro-organismo fermentador produza uma ou mais substâncias orgânicas de interesse. Em algumas modalidades, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico e o método é usado para produzir etanol. Em algumas modalidades, um material celulósico pré-tratado é usado.

[0102] A hidrólise do material celulósico e a fermentação do micro- organismo fermentador para produzir uma substância orgânica podem ocorrer simultaneamente ou sequencialmente.

[0103] Em algumas modalidades, o uso de um caldo integral ou composição com células exterminadas aqui descrita aumenta a produção de uma substância orgânica em pelo menos cerca de 50% em comparação com um método no qual o material celulósico sobre o qual o micro-organismo fermentador é desenvolvido é hidrolisado com uma composição que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em algumas modalidades, a produção de uma substância orgânica (por exemplo, etanol ou outra molécula orgânica) é aumentada pelo menos cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes em comparação com um método no qual o material celulósico sobre o qual o micro-organismo fermentador é hidrolisado com uma composição que contém 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso.

[0104] Os micro-organismos fermentadores apropriados são capazes de fermentar ou converter açúcares, tais como glicose, xilose, galactose, arabinose, manose, ou oligossacarídeos, no produto ou produtos da fermentação desejados. Os exemplos apropriados não limitativos de micro- organismos fermentadores incluem organismos fúngicos, tais como leveduras e bactérias.

[0105] Em algumas modalidades, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico, tal como um micro-organismo etanologênico de ocorrência natural, um organismo etanologênico com mutações de ocorrência natural ou induzidas, ou um organismo etanologênico que foi geneticamente modificado.

[0106] Em algumas modalidades, o micro-organismo etanologênico é uma célula de levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum, Kluyveromyces fagilis, Candida pseudotropicalis, and Pachysolen tannophilus, que podem fermentar eficientemente glicose para dar etanol. As cepas apropriadas incluem, porém sem limitações, S. cerevisiae D5A (ATCC200062), S. cerevisiae Y567 (ATCC24858), ACA 174 (ATCC 60868), MY91 (ATCC 201301), MY138 (ATCC 201302), C5 (ATCC 201298), ET7 (ATCC 201299), LA6 (ATCC 201300), OSB21 (ATCC 201303), F23 (S. globosus ATCC 90920), ACA 174 (ATCC 60868), A54 (ATCC 90921), NRCC 202036 (ATCC 46534), ATCC 24858, ATCC 24858, G 3706 (ATCC 42594), NRRL, Y-265 (ATCC 60593), Sa28 (ATCC 26603), e ATCC 24845-ATCC 24860. Outras cepas de leveduras diferentes de S. cerevisiae apropriadas para uso na presente invenção incluem Pichia pastoris (tozony ID 4922), S. pastorianus SA 23 (S. carlsbergensis ATCC 26602), S. pastorianus (S. carlsbergensis ATCC 2345), Candida acidothermophilum (Issatchenkia orientalis, ATCC 20381). Em algumas modalidades, o micro-organismo etanologênico é uma cepa de levedura recombinante. A levedura recombinante apropriada pode conter genes que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e/ou xilulocinase (vide, por exemplo, USPN 5,789,210).

[0107] Em algumas modalidades, o micro-organismo etanologênico é uma célula bacteriana, por exemplo, uma célula bacteriana gram-negativa, facultativamente anaeróbica, tal como uma célula bacteriana da família Enterobacteriaceae. Em algumas modalidades, o micro-organismo etanologênico é do gênero Escherichia ou Klebsiella e, por exemplo, E. coli B, E. coli DH5α, E. coli KO4 (ATCC 55123), E. coli KO11 (ATCC 55124), E. coli KO12 (ATCC 55125), E. coli LY01, K. oxytoca M5A1, ou K. oxytoca P2 (ATCC 55307). Em algumas modalidades, o micro-organismo etanologênico é uma espécie Zymomonas, ou derivada de Zymomonas mobilis (ATCC31821). Em algumas modalidades, uma cepa de Zymomonas recomobinante pode conter genes que codificam xilose isomerase, xilulocinase, transaldolase e transcetolase, por exemplo.

[0108] Embora a hidrólise do material celulósico para dar glicose e outros sacarídeos pequenos seja uma etapa importante, a sacrificação e fermentação simultâneas (SSF) se baseiam em uma cultura viva de um micro-organismo etanologênico para transformar estes açúcares em etanol.

[0109] Os micro-organismos fermentadores são adicionados tipicamente ao hidrolisado e a fermentação é deixada prosseguir por 12-96 horas, tal como 30-80 horas. A temperatura é tipicamente 26-40°C, por exemplo, cerca de 32°C, e o pH é tipicamente 3-6.

[0110] Depois da fermentação, a substância orgânica de interesse é recuperada por qualquer método conhecido nessas técnicas. Tais métodos incluem, porém sem limitações, destilação, extração, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, e solubilidade diferencial. Por exemplo, em uma fermentação de etanol, o álcool pode ser separado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol obtido de acordo com o processo da invenção pode ser usado como etanol combustível, etanol potável ou como etanol industrial.

[0111] Embora não desejando se atar a uma teoria da invenção, acredita- se que o caldo integral não clarificado com células exterminadas fornece nutrientes residuais para o micro-organismo etanologênico. Isto pode levar a uma fermentação mais rápida do etanol e melhorar os rendimentos de etanol. A capacidade para eliminar a necessidade de prover um caldo nutriente, ou reduzir a quantidade de nutrientes suplementares, para o micro-organismo etanologênico além de celulose sacarificada, resulta em custo reduzido de matérias-primas para o processo de fermentação de etanol.

[0112] Em algumas modalidades, usar o caldo integral ou composição com células exterminadas como aqui descrito em um método para a produção de uma substância orgânica em um micro-organismo fermentador pode reduzir a quantidade e/ou tipo de fonte de nitrogênio suplementar para o micro-organismo fermentador. Em algumas modalidades, os métodos e composições da presente invenção podem reduzir a quantidade de extrato de levedura, peptona e/ou ureia necessária para o crescimento do micro-organismo fermentador.

[0113] Em algumas modalidades, um método para produzir uma substância orgânica em um micro-organismo fermentador como aqui descrito é isento ou substancialmente isento de fonte de nitrogênio e/ou nutriente suplementar para o micro-organismo fermentador. Em algumas modalidades, os métodos e composições são isentos ou substancialmente isentos de extrato de levedura, peptona e/ou ureia. Os versados nessas técnicas devem entender que os métodos e composições da invenção podem ser isentos ou substancialmente isentos de fonte suplementar de nitrogênio, entretanto, quantidades muito pequenas de fonte de nitrogênio e/ou nutriente podem estar presentes como impurezas ou adicionadas em uma quantidade tal que não aumentaria substancialmente o valor nutritivo do caldo de fermentação global para o micro-organismo fermentador.

[0114] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma substância orgânica por sacarificação e fermentação simultâneas. O método inclui combinar, na ausência de uma fonte suplementar de nitrogênio, um material celulósico (por exemplo, um material celulósico pré-tratado), um caldo integral ou composição com células exterminadas como descrito acima que contém uma ou mais enzimas capazes de hidrolisar o material celulósico (por exemplo, exoglicanase, endoglicanse, hemicelulase, e/ou beta-glicosidase), e um micro-organismo fermentador. O material celulósico, o caldo integral ou composição com células exterminadas, e o micro-organismo fermentador são incubados sob condições que levam à hidrólise de celulose para dar glicose e/ou açúcar de hemi-celulose (por exemplo, xilose, arabinose, e/ou manose) e à conversão de glicose e/ou do açúcar de hemi-celulose na substância orgânica. Em algumas modalidades, a produção de uma substância orgânica é aumentada em pelo menos cerca de 50% em comparação com um método no qual um caldo integral ou composição com células exterminadas é usado que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico, a substância orgânica é etanol, e a produção de etanol é aumentada em pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com um método no qual é usado um caldo integral ou composição com células exterminadas que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, é usado um caldo com células exterminadas que contém cerca de 1.000 a cerca de 2.000, cerca de 1.500 a cerca de 2.500, cerca de 2.200 a cerca de 2.800, ou cerca de 2.500 CMC U/g de atividade de endoglicanase e cerca de 450 a cerca de 775, cerca de 525 a cerca de 775, cerca de 400 a cerca de 800, ou cerca de 650 pNPG U/g de atividade de beta-glicosidase, cerca de 0,2% a cerca de 1%, cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,28% de ácido acético em peso, cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso (ou cerca de 0,26% de benzoato de sódio), em um pH de cerca de 3,9 a cerca de 4,3, cerca de 3,5 a cerca de 4,5, cerca de 4 a cerca de 5, cerca de 4,5 a cerca de 5,5, cerca de 4,8 a cerca de 4,2, ou cerca de 4.

5.6 Kits

[0115] A invenção fornece também kits. Os kits da invenção contêm um caldo integral ou composição com células exterminadas contendo uma combinação de ácidos orgânicos como aqui descrito. Uma embalagem apropriada é fornecida. Como aqui utilizado, o termo "embalagem" refere-se a uma matriz sólida, material, ou recipiente usado costumeiramente em um sistema e capaz de manter dentro de limites fixos os componentes de um kit como aqui descrito.

[0116] Um kit pode conter também instruções para uso do caldo integral ou composição com células exterminadas. Por exemplo, as instruções podem ser fornecidas para uso do caldo integral ou composição com células exterminadas em um método para hidrólise de um substrato celulósico ou instruções para uso em um método para produzir uma substância orgânica em um micro-organismo fermentador, como aqui descrito. As instruções podem ser fornecidas na forma impressa ou na forma de um meio eletrônico tal como um disquete, CD, ou DVD, ou na forme de um endereço de website onde tais instruções podem ser obtidas.

5.7 Modalidades Específicas

[0117] Em um aspecto, a invenção fornece um método para exterminar células em uma cultura de fermentação. O método inclui colocar uma cultura de fermentação que contém as células em um meio de cultura em contato com um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal e um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal. Em uma modalidade, a concentração do primeiro ácido orgânico é cerca de 0,2% a cerca de 1% em peso e a concentração do segundo ácido orgânico é cerca de 0,04% a cerca de 0,3% em peso. Em uma modalidade, a concentração do primeiro ácido orgânico é cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso e a concentração do segundo ácido orgânico é cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso. O método prossegue por um período de tempo e em uma temperatura e pH suficientes para efetuar a exterminação substanciamente completa de células, produzindo desta forma um caldo integral com células exterminadas. Em algumas modalidades, o período de tempo é cerca de 8 a cerca de 24 horas, a temperatura é cerca de 30°C a cerca de 40°C, e o pH é cerca de 3,5 a cerca de 4,5, cerca de 3,9 a cerca de 4,2, ou cerca de 4 a cerca de 4,4. Em uma modalidade, o período de tempo é cerca de 24 horas, a temperatura é cerca de 40°C, e o pH é cerca de 4. Uma exterminação substancialmente completa de células envolve tipicamente um decréscimo de pelo menos cerca de 4 log, 5 log, 6 log, 7 log, ou 8 log em células viáveis.

[0118] Em algumas modalidades do método de exterminar células, as células são células microbianas (isto é, fúngicas ou bacterianas). Em algumas modalidades, as células são células fúngicas, por exemplo, células fúngicas filamentosas. Em algumas modalidades, as células fúngicas filamentosas são selecionadas entre Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium, e Neurospora.

[0119] Em algumas modalidades do método de exterminar células, o primeiro ácido orgânico é selecionado entre ácido acético, ácido fórmico, ou ácido propiônico. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético. Em algumas modalidades, o segundo ácido orgânico é selecionado entre ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metil-valérico, e ácido fenil-acético. Em uma modalidade, o segundo ácido orgânico é ácido benzoico. Em algumas modalidades, um sal de um ácido orgânico é usado, por exemplo, benzoato de sódio. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético em uma concentração de cerca de 0,28% em peso e o segundo ácido orgânico é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,044% em peso (ou benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,052% em peso). Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético em uma concentração de cerca de 0,28% em peso e o segundo ácido orgânico é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,22% em peso (ou benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,26% em peso).

[0120] Em algumas modalidades do método de exterminar células, as células secretam pelo menos uma enzima de interesse de forma extracelular dentro do meio de cultura. Em algumas modalidades, e enzima de interesse é expressada de forma recombinante. Em algumas modalidades, as células secretam pelo menos uma enzima de interesse selecionada entre exoglicanase, endoglicanase, hemicelulase, e beta-glicosidase.

[0121] Em outro aspecto, a invenção fornece um caldo integral com células exterminadas produzido por qualquer um dos métodos para exterminar células aqui descritos. Em uma modalidade, o caldo integral com células exterminadas contém uma ou mais enzimas que foram secretadas pelas células dentro do meio de cultura extracelular antes de exterminar as células. Em algumas modalidades, o caldo integral com células exterminadas contém pelo menos uma enzima selecionada entre exoglicanase, endoglicanase, hemicelulase, e beta-glicosidase no meio de cultura extracelular. Em algumas modalidades, o caldo com células exterminadas contém cerca de 1.000 a cerca de 2.000, cerca de 1.500 a cerca de 2.500, cerca de 2.200 a cerca de 2.800, ou cerca de 2.500 CMC U/g de atividade de endoglicanase e cerca de 450 a cerca de 775, cerca de 525 a cerca de 775, cerca de 400 a cerca de 800, ou cerca de 650 pNPG U/g de atividade de beta- glicosidase. Em uma modalidade, a composição contém cerca de 2.200 a cerca de 2.800 CMC U/g de atividade de endoglicanase e cerca de 450 a cerca de 775 pNPG U/g de atividade de beta-glicosidase em um pH de cerca de 3,9 a cerca de 4,3.

[0122] Em algumas modalidades, a produção de uma substância orgânica por um micro-organismo fermentador é aumentada pelo menos cerca de 50% na presença do um caldo integral com células exterminadas em comparação com um método no qual é usado um caldo integral com células exterminadas que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico. Em uma modalidade, a produção de etanol por um organismo fermentador etanologênico é aumentada em pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com um método no qual é usado um caldo integral com células exterminada que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso.

[0123] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, e um segundo ácido orgânicoque contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, e uma enzima de interesse. Em algumas modalidades, a composição contém também células exterminadas e meio de cultura, onde as células foram desenvolvidas no meio de cultura e produziram a enzima de interesse antes de entrar em contato com o primeiro e and segundo ácidos orgânicos. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico está presente na composição em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 1 % em peso, e o segundo ácido orgânico está presente em uma concentração de cerca de 0,04% a cerca de 0,3% em peso. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico está presente na composição em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso, e o segundo ácido orgânico está presente em uma concentração de cerca de 0,2% a cerca de 0,5% em peso. Em algumas modalidades, o primeiro ácido orgânico é selecionado entre ácido acético, ácido fórmico, ou ácido propiônico. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético. Em algumas modalidades, o segundo ácido orgânico é selecionado entre ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4- metil-valérico, e ácido fenil-acético. Em uma modalidade, o segundo ácido orgânico é ácido benzoico. Em algumas modalidades, um sal de um ácido orgânico é usado, por exemplo, benzoato de sódio. Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético em uma concentração de cerca de 0,28% em peso e o segundo ácido orgânico é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,044% em peso (ou benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,052% em peso). Em uma modalidade, o primeiro ácido orgânico é ácido acético em uma concentração de cerca de 0,28% em peso e o segundo ácido orgânico é ácido benzoico em uma concentração de cerca de 0,22% em peso (ou benzoato de sódio em uma concentração de cerca de 0,26% em peso). Em algumas modalidades, a composição contém uma ou mais enzimas selecionadas entre exoglicanase, endoglicanase, hemicelulase, e beta-glicosidase. Em uma modalidade, a composição contém cerca de 1.000 a cerca de 2.000, cerca de 1.500 a cerca de 2.500, cerca de 2.200 a cerca de 2.800, ou cerca de 2.500 CMC U/g de atividade de endoglicanase e cerca de 450 a cerca de 775, cerca de 525 a cerca de 775, cerca de 400 a cerca de 800, ou cerca de 650 pNPG U/g de atividade de beta- glicosidase. Em algumas modalidades, o pH é cerca de 3,9 a cerca de 4,3, cerca de 3,5 a cerca de 4,5, cerca de 4 a cerca de 5, cerca de 4,5 a cerca de 5,5, cerca de 4,8 a cerca de 5,2, ou cerca de 4. Em uma modalidade, a composição contem cerca de 2.200 a cerca de 2.800 CMC U/g de atividade de endoglicanase e cerca de 450 a cerca de 775 pNPG U/g de atividade de beta-glicosidase em um pH de cerca de 3,9 a cerca de 4,3.

[0124] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para hidrolisar um material celulósico, que inclui colocar o material celulósico em contato com um caldo integral com células exterminadas produzido por um método de exterminar células como aqui descrito ou uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, e pelo menos uma enzima de interesse como aqui descrito em uma quantidade eficaz para causar a hidrólise enzimática do material celulósico por uma ou mais enzimas no caldo integral ou composição com células exterminadas. Em algumas modalidades, é usada uma composição que inclui ainda um meio de cultura e células exterminadas, onde as células foram desenvolvidas no meio de cultura e produziram a enzima de interesse antes de entrarem contato com o primeiro e segundo ácidos orgânicos. Em algumas modalidades, o material celulósico é um material de biomassa vegetal. Em uma modalidade, o material celulósico é um material lignocelulósico. Em algumas modalidades, o material lignocelulósico pré-tratado para intensificar a hidrólise enzimática. A invenção fornece também um material celulósico hidrolisado produzido pela hidrólise com um caldo integral com células exterminadas produzido por um método de exterminar células como aqui descrito ou uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, pelo menos uma enzima de interesse, e opcionalmente um meio de cultura de fermentação e células exterminadas, como aqui descrito.

[0125] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma substância orgânica. O método inclui fermentar um micro-organismo que produz uma substância orgânica em um meio de cultura na presença de um material celulósico hidrolisado produzido por hidrólise com um caldo integral com células exterminadas produzido por um método de exterminar células como aqui descrito ou uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, pelo menos uma enzima de interesse, e opcionalmente um meio de cultura de fermentação e células exterminadas como aqui descrito, sob condições apropriadas para o micro-organismo produzir a substância orgânica. Em uma modalidade, o micro-organismo é um micro-organismo etanologênico e a substância orgânica é etanol. Em uma modalidade, a concentração da substância orgânica no meio de cultura é aumentada em pelo menos cerca de 50% em comparação com um método no qual o material celulósico é hidrolisado com um caldo integral ou composição com células exterminadas que contém componentes similares, substancial mente idênticos, ou idênticos ao caldo integral ou composição com células exterminadas usado no método com a exceção que o caldo integral ou composição com células exterminadas contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, a produção de etanol por um organismo fermentador etanologênico é aumentada em pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com um método no qual é usado um caldo integral ou composição com células exterminadas que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso.

[0126] Em algumas modalidades, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação do micro-organismo ocorrem simultaneamente. Em outras modalidades, a hidrólise enzimática do material celulósico ocorre antes da fermentação do micro-organismo.

[0127] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma substância orgânica pela sacarificação e fermentação simultâneas. O método inclui (a) combinar, na ausência de uma fonte suplementar de nitrogênio, um substrato celulósico, um caldo integral com células exterminadas produzidopor um método para exterminar células como aqui descrito ou uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, pelo menos uma enzima de interesse, e opcionalmente um meio de cultura de fermentação e células exterminadas como aqui descrito, e um micro-organismo fermentador; e incubando o substrato celulósico, o caldo integral ou composição de fermentação com células exterminadas, e o micro-organismo fermentador em um meio de cultura sob condições que levam à hidrólise de celulose para glicose e/ou açúcar de hemicelulose (por exemplo, xilose, arabinose, e/ou manose) e também à conversão de glicose e/ou hemicelulose na substância orgânica, onde a concentração da substância orgânica no meio de cultura é aumentada em pelo menos cerca de 50% em comparação com um método no qual o material celulósico é hidrolisado com um caldo integral ou composição com células exterminadas que contém componentes similares, substancialmente idênticos, ou idênticos ao caldo integral ou composição com células exterminadas usado no método com a exceção que o caldo integral ou composição com células exterminadas contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo fermentador etanologênico e a substância orgânica é etanol. Em uma modalidade, a produção de etanol por um organismo fermentador etanologênico é aumentada em pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com um método no qual é usado um caldo integral ou composição com células exterminadas que contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso.

[0128] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição reativa para a produção de uma substância orgânica. A composição reativa contém uma mistura de um substrato celulósico, um caldo integral com células exterminadas produzido por um método de exterminar células como aqui descrito ou uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, pelo menos uma enzima de interesse, e opcionalmente um meio de cultura de fermentação e células exterminadas como aqui descrito, e um micro-organismo fermentador em um meio de cultura. A composição reativa é substancialmente isenta de fonte suplementar de nitrogênio, e a concentração da substância orgânica no meio de cultura é aumentada em pelo menos cerca de 50% em comparação com um método no qual o material celulósico é hidrolisado com um caldo integral ou composição com células exterminadas que contém componentes similares, substancialmente idênticos, ou idênticos ao caldo integral ou composição com células exterminadas usado no método com a exceção que o caldo integral ou composição com células exterminadas contém cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso. Em uma modalidade, o micro-organismo fermentador é um micro-organismo etanologênico e a substância orgânica é etanol. Em uma modalidade, a produção de etanol por um organismo fermentador etanologênico é aumentada em pelo menos cerca de 10 vezes em comparação com uma composição que contém um caldo integral ou composição com células exterminadas com cerca de 1,4% de ácido acético e cerca de 0,22% de ácido benzoico em peso.

[0129] Em outro aspecto, a invenção fornece kits que contêm um caldo integral com células exterminadas produzido por um método para exterminar células como aqui descrito ou uma composição que contém um primeiro ácido orgânico que contém 1 a 5 átomos de carbono ou um seu sal, um segundo ácido orgânico que contém 6 ou mais átomos de carbono ou um seu sal, pelo menos uma enzima de interesse, e opcionalmente um meio de cultura de fermentação e células exterminadas como aqui descrito, em uma embalagem. Em algumas modalidades, o kit contém ainda instruções para uso em um método para produzir uma substância orgânica com um micro-organismo fermentador, por exemplo, instruções para uso em um método para produzir etanol com um micro-organismo etanologênico e um substrato celulósico hidrolisado com o caldo integral ou composição com células exterminadas no kit.

[0130] Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar, porém não limitar, a invenção.

6. EXEMPLOS Exemplo 1 Condições de Exterminação de Células Determinação da Contagem de Células Fúngicas

[0131] Uma fração de uma fermentação de 150 horas de Trichoderma reesei foi diluída serialmente com água esterilizada até um fator de diluição de 103. Uma amostra de 100 μL da diluição foi então espalhada sobre uma placa com ágar de dextrose de batata (PDA) adquirido na Difco™ (No de Referência 213200) e incubada a 25°C. A placa com PDA incubada foi então contada quanto a unidades formadoras de colônias (CFU) depois de 3 dias de incubação. Uma CFU é caracterizada por um agregado individual separado de células em crescimento presentes sobre o ágar, e o número destas CFU presente sobre o ágar multiplicado pelo grau da diluição plaqueada é o número de CFU presente na amostra original.

[0132] Suspensões de esporos separados de Aspergillus niger e Penicillium funiculosum foram espalhadas sobre uma placa com PDA adquirido na Difco™(Número de Referência 213200) e incubadas a 25°C por 3 dias. Seções separadas do PDA contendo colônias de A. niger e P. funiculosum foram então removidas de forma asséptica e colocadas em frascos vascolejantes separados contendo meio de glicose e extrato de levedura (YEG) consistindo em 5 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de glicose. Os frascos vascolejantes foram então incubados em uma batedeira rotativa ajustada em 200 rpm e 33°C por 3 dias. Amostras das culturas de crescimento foram removidas e diluídas serialmente com água esterilizada até um fator de diluição de 104. Uma amostra de 100 μL da diluição foi então espalhada sobre uma placa com PDA e incubada a 25°C. As placas de PDA incubadas foram então contadas quanto a CFU.

Exterminação de Células de T. reesei com Ácido Acético e Benzoato de Sódio em Diferentes Temperaturas

[0133] O caldo de fermentação de Trichoderma reesei foi separado em 5 frações e formulado como descrito na Tabela 1 abaixo. O caldo formuado teve então seu pH ajustado para 4,0 usando ácido sulfúrico a 10% (p/p). Cada formulação foi então separada adicionalmente em 3 frações sendo que uma fração foi incubada a 10°C, outra fração foi incubada a 25°C, e a terceira fração foi incubada a 40°C. Depois de 24 horas de incubação todas as frações tiveram seu pH ajustado para 4,8 usando hidróxido de sódio a 10% (p/p). Cada fração foi então diluída serialmente com água esterilizada, espalhada sobre placa com PDA, e incubada a 25°C. As placas com PDA incubadas foram então contadas quanto a CFU.Tabela 1Descrição das formulações do caldo de fermentação de T. reesei

[0134] A exterminação completa de células foi atingida em uma temperatura de 40°C para todas as formulações. O kit de células de T. reesei pôde ser conseguido em temperaturas inferiores, mas requereu concentrações mais altas dos ácidos orgânicos. A Figura 1 é um gráfico que ilustra os efeitos da temperatura e concentração química das formulações sobre a exterminação de células de T. reesei.

Efeito de Benzoato de sódio

[0135] Benzoato de sódio foi adicionado a frações separadas de T. reesei até uma concentração final de 2,5 g/L de benzoato de sódio ou 5 g/L de benzoato de sódio. As frações então tiveram seu pH ajustado para 4 e incubadas por 24 horas a 40°C. Depois de 24 horas de incubação todas as frações tiveram seu pH ajustado para 4,8 usando hidróxido de sódio a 10% (p/p). Cada fração foi então diluída serialmente com água esterilizada, espalhadas sobre placas contendo PDA, e incubadas a 25°C. As placas com PDA incubadas foram então contadas quanto a CFU. Os resultados estão ilustrados na Figura 2.

[0136] T. reesei formulado com 2,5 g/L de benzoato de sódio, pH 4, experimentou uma redução de 5 log de células viáveis depois de 24 horas de incubação a 40°C, enquanto que uma formulação de T. reesei com 5 g/L de benzoato de sódio, pH 4, experimentou uma redução de 7 log com menos do que 10 CFU presentes depois de 24 horas de incubação a 40°C.

Aplicação de Condições de Exterminação de Células a Culturas de A. nigere P. funiculosum

[0137] Ácido acético e benzoato de sódio foram adicionados a frações separadas de culturas de crescimento de T. reesei, A. nigere P. funiculosum até concentrações finais de 2,8 g/L e 2,6 g/L, respectivamente. As frações então tiveram seu pH ajustado para 4 e incubadas por 24 horas a 40°C. Depois de 24 horas de incubação todas as frações tiveram seu pH ajustado para 4,8 usando hidróxido de sódio a 10% (p/p). Cada fração foi então diluída serialmente com água esterilizada, espalhada sobre placas com PDA, e incubada a 25°C. As placas com PDA incubadas foram então contadas quanto a CFU. Os resultados estão ilustrados na Figura 3.

[0138] Depois de 24 horas de exposição às condições de exterminação de células nenhuma célula viável estava presente a partir de T. reesei, A. niger e P. funiculosum.

Exterminação de Células com Ácidos Orgânicos que Têm Seis ou Mais Carbonos

[0139] Uma fração não formulada separada do caldo de fermentação de T. reesei foi dividida adicionalmente em 10 frações e formuladas com ácidos orgânicos que têm 6 ou mais carbonos como descrito na Tabela 2 abaixo. As estruturas químicas e pKa’s dos ácidos orgânicos estão ilustradas na Figura 4.Tabela 2Formulação de Caldo de Fermentação de T. reesei com Ácidos Orgânicos que Têm Seis ou Mais Átomos de Carbono

[0140] As culturas formuladas tiveram então seu pH ajustado para 4,0 usando ácido sulfúrico a 10% (p/p). As culturas formuladas foram então incubadas a 40°C. Depois de 2 e 4 horas de incubação, o pH das culturas formuladas foi medido culture ajustado para 4,0 com ácido sulfúrico a 10% (p/p) e devolvidas para incubação a 40°C. Depois de 24 horas de incubação as culturas formuladas foram removidas e 100 μL da cultura formulada foram então espalhados sobre placas em diluições de 10°, 101,102e 103 sobre PDA e incubados a 25°C. As placas com PDA incubadas foram então contadas quanto a CFU. Os resultados estão ilustrados na Figura 5.

Exemplo 2 Efeito de Caldo Integral com Células Exterminadas sobre a Produção de Substâncias Orgânicas em Micro-organismos

[0141] Um caldo integral com células exterminadas foi preparado a partir de uma cultura de fermentação de células de T. reesei que secretam as enzimas exoglicanase, endoglicanase, hemicelulase, e beta-glicosidase dentro do meio extracelular. A cultura de fermentação foi tratada com 0,28% de ácido acético e 0,052% de benzoato de sódio em peso em pH 4 e 40°C por 24 horas como descrito no Exemplo 1 ("Caldo A") ou 1,4% de ácido acético, 0,26% de benzoato de sódio, e 0,5% de sorbato de potássio em peso em pH 4 e 10°C por 24 horas ("Caldo B"). Os efeitos destes dois caldos sobre a fermentação de um micro-organismo para produzir uma substância orgânica foram investigados. Os caldos foram usados para hidrolisar um substrato celulósico para produzir um hidrolisado de glicanos para uso como fonte de carbono para o crescimento do micro-organismo. A produção de substâncias orgânicas por micro-organismos desenvolvidos em hidrolisado de glicanos foi avaliada.

Geração de Hidrolisado

[0142] Bagaço pré-tratado foi obtido no National Renewable Energy Laboratory (NREL). O bagaço foi pré-tratado com ácido sulfúrico diluído e temperatura crescente pelo NREL (Schell et al. Bioresource Technology 91:179-188 (2004)). O bagaço pré-tratado com ácido foi então lavado com água desmineralizada até que o pH fosse maior do que 4,2, após o que água residual foi removida por filtração a vácuo. O bagaço pré-tratado com ácido e lavado (wAPB) passou então por uma autoclave por 20 minutos a 121 °C para remover qualquer contaminantes microbianos do susbtrato de wAPBe. Um hidrolisado de glicanos a 13% (p/p) foi então gerado para partir do wAPB depois da autoclave usando uma dose de proteína de 80 mg do Caldo A ou Caldo B por grama de glicano do substrato. Cada hidrolisado foi gerado sob condições de sacarificação que consistem em 5 dias de incubação a 50°C em uma batedeira rotativa ajustada em 200 rpm. A concentração de glucose em cada hidrolisado foi então analisada seguindo o procedimento delineado abaixo na seção de ensaio por HPLC. Depois da sacarificação do wAPB, cada hidrolisado foi separado em 3 frascos e diluído com tampão de citrato de sódio 50 mM filtrado sob condições estéreis (pH 4,8) para criar misturas de hidrolisados de glicanos a 1% (p/p), glicanos a 7% (p/p) glucan, e glicanos a 13% (p/p).

Preparação de Culturas de Lactobacillus rhamnosus

[0143] Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469) liofilizado foi obtido na American Type Culture Collection (ATCC) e foi reidratado com água esterilizada. O L. rhamnosus reidratado foi então espalhado sobre placas de Ágarcom Lactobacilli MRS Agar adquiridas na Difco™ (Número de Referência 288210) e incubado por 2 dias a 37°C para obter colônias de L. rhamnosus colonies. As colônias de L. rhamnosus foram então adicionadas de forma asséptica a um frasco vascolejante contendo Caldo de Lactobacilli MRS adquirido na Difco™ (Número de Referência 288130). O frasco vascolejante com L. rhamnosus foi então incubado em uma batedeira rotativa ajustada em 33°C e 150 rpm por 1 dia para obter uma cultura de crescimento.

Fermentação de Hidrolisado de L. rhamnosus

[0144] Uma cultura de crescimento de L. rhamnosus foi inoculada em uma concentração de 3% (v/p) em frascos separados de hidrolisados com wAPB a 7% (p/p) de glicano produzido com os Caldos A e B. Os frascos de L rhamnosus inoculados foram fermentados sob condições anaeróbicas em uma batedeira rotativa ajustada em 37°C e 150 rpm por 5 dias. As misturas da fermentação foram amostradas depois de 1,2, 3, e 5 dias de incubação e analisadas quanto às concentrações de ácido lático e glicose seguindo o procedimento delineado abaixo na seção do ensaio por HPLC. Os resultados estão ilustrados na Figura 6.

Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SSF) da Levedura Thermosacc®

[0145] O bagaço pré-tratado com ácido e lavado, tampão de citrato de sódio 50 mM (pH 4,8), e Caldo A ou B foram adicionados a frascos separados em uma concentração de 80 mg de proteína por grama de glicano do substrato. Cada frasco foi então inoculado com 1% (v/p) da levedura Thermosacc® reidratada, e depois inoculado com 1% (v/p) de nutrientes de leveduras que consistem em 10% (p/p) de extrato de levedura, 10% (p/p) de peptona, e 1% (p/p) de glicose. Cada frasco foi então incubado em uma batedeira rotativa ajustada em 38°C e 150 rpm. As misturas da fermentação foram amostradas depois de 2, 3, 4, e 5 dias de incubação e analisadas quanto às concentrações de etanol e glicose seguindo o procedimento delineado abaixo na seção do ensaio por HPLC. Os resultados estão ilustrados nas Figuras 7 e 8.

Ensaio por HPLC

[0146] Todas as amostras para análise por HPLC foram diluídas 10x em ácido sulfúrico 5 mM e filtradas através de um filtro de 0,2 μm antes da injeção na HPLC. A análise por HPLC foi realizada usando uma coluna por exclusão de ions BioRad Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm).

Resultados

[0147] Os hidrolisados gerados pelos Caldos A e B produziram ambos mais de 130 g/L de glicose, com conversão percentual de glicose de 90,4% e 92,6%, respectivamente. Ácido lático não foi detectado em qualquer um dos dois hidrolisados.

[0148] A concentração de ácido lático produzido partir de L. rhamnosus aumenta com concentrações mais baixas de cargas de glicanos de wAPB, sugerindo um forte efeito inibidor a partir do substrat. Em uma carga de 13% de glicanos de wAPB dos hidrolisados gerados pelos Caldos A e B o nível de ácido lático produzido não foi significativamente diferente entre si. A produção de ácido lático a partir de L. rhamnosus em carga de 7% de glicanos de wAPB gerado a partir do Caldo A foi 1,5 vez maior do que a produção de ácido lático a partir do hidrolisado gerado pelo Caldo B. A Figura 6 é um gráfico que compara a produção de ácido lático a partir de L. rhamnosus em hidrolisado de wAPB produzido a partir dos Caldos A e B.

[0149] A produção de etanol a partir da levedura Thermosacc® em 13% de glicano do hidrolisado de wAPB gerado a partir do Caldo A foi 12,5 vezes maior do que o hidrolisado produzido a partirdo Caldo B (Figura 7). A Figura 7 é um gráfico que compara a produção de etanol a partir da levedura Thermosacc em 13% de glicano do hidrolisado de wAPB gerado a partir dos Caldos A e B. Depois de 5 dias de fermentação da levedura Thermosacc, a acumulação de glicose residual a partir do hidrolisado gerado a partir do Caldo B foi 4 vezes maior do que do hidrolisado gerado pelo Caldo A. A Figura 8 é um gráfico que compara a acumulação de glicose durante a fermentação da levedura Thermosacc do hidrolisado produzido a partir dos Caldos A e B.

[0150] Embora a invenção precedente tenha sido descrita com algum detalhe a título ilustrativo e exemplificativo com propósito de clareza de entendimento, deve ficar evidente para os versados nessas técncas que certas mudanças e modificações podem ser praticadas sem fugir do espírito e âmbito da invenção. Portanto, a descrição não deve ser interpretada como limitativa do âmbito da invenção.

[0151] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados como referência em sua totalidade para todos os propósitos e até o mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especifica e individualmente indicada para ser assim incorporada como referência.

Claims (46)

1. Método para fabricar uma formulação de caldo de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(1) preparando uma primeira mistura que compreende:um ou mais caldos de fermentação,um primeiro componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 1 a 5 carbonos e/ou um sal do mesmo em uma quantidade de 0,1% a 15% em peso da dita mistura eum segundo componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um sal em uma quantidade entre 0,025% e 5% em peso da dita mistura,(2) incubando a primeira mistura por um período de de 8 a 36 horas, e sob condições de temperatura de 20 °C a 50 °C, e pH de 3,5 a 5, que resultam em pelo menos um decréscimo de 4 log em células viáveis no dito um ou mais caldos de fermentação, fabricando desta forma uma formulação de caldo de fermentação,em que o segundo componente ácido orgânico é o ácido benzoico, um sal do ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, um sal do ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metil-valérico, um sal do ácido 4-metil- valérico, ácido fenil-acético, um sal do ácido fenil-acético, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito período de tempo é de 20 horas a 28 horas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas condições incluem uma temperatura de 25°C a 40°C ou 28°C a 33°C.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as ditas condições incluem um pH de 4 a 4,7 ou 4,2 a 4,5.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita incubação é por um período de tempo e sob condições que resultam em pelo menos um decréscimo de 5 log, um decréscimo de 6 log, um decréscimo de 7 log ou um decréscimo de 8 log no número de células viáveis no dito um ou mais caldos de fermentação.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o decréscimo em células viáveis é pelo menos 0,5 vez, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que para uma segunda mistura submetida às ditas condições, sendo que a dita segunda mistura contém apenas um entre o dito primeiro componente ácido orgânico e o dito segundo componente ácido orgânico, em uma quantidade de até as porcentagens ponderais totais do primeiro e segundo componentes ácidos orgânicos na dita primeira mistura.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as ditas células são células fúngicas filamentosas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células fúngicas filamentosas são dos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium, ou Neurospora.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético, um sal do ácido acético, ácido fórmico, um sal do ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do ácido propiônico, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético e/ou um sal do mesmo.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio do dito ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou onde o dito segundo componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio do dito ácido orgânico com 6 ou mais carbonos.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro componente ácido orgânico compreende ácido acético em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso e o segundo componente ácido orgânico compreende benzoato de sódio em uma concentração de 0,2%-0.4% em peso.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito período de tempo é 24 horas, as ditas condições incluem uma temperatura de 40°C, e o dito pH entre 4 e 4,6.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais caldos de fermentação contém uma ou mais proteínas secretadas pelas ditas células.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma das ditas uma ou mais proteínas é expressa de forma recombinante pelas ditas células.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ditas uma ou mais proteínas é uma enzima, que é uma exoglicanase, uma endoglicanase, uma hemicelulase ou uma β-glicosidase.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais caldos de fermentação contém uma pluralidade de enzimas, as quais são cada uma, uma exoglicanase, uma endoglicanase, uma hemicelulase ou uma β-glicosidase expressadas de forma recombinante e secretadas pelas células.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que as ditas condições resultam em uma formulação de caldo de fermentação que tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% da atividade enzimática do dito um ou mais caldos de fermentação.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que as proteínas constituem 5 a 15% em peso da dita primeira mistura.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de adicionar um agente para ajuste do pH à dita primeira mistura durante o dito período de incubação.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito agente para ajuste do pH é ácido fosfórico, ácido sulfúrico ou hidróxido de sódio.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a dita primeira mistura compreende ainda um ou mais agentes antimicrobianos.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais agentes antimicrobianos estão em uma quantidade de 0,0005 a 0,05% ou de 0,001 a 0,025% em peso da dita primeira mistura.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o agente antimicrobiano compreende extrato de lúpulo contendo iso-alfa-ácidos, tetra-iso-alfa-ácidos, e/ou beta-ácidos.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda fabricar a dita primeira mistura antes da dita etapa de incubação.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais outros reagentes compreendem um agente para ajuste do pH e/ou um agente antimicrobiano.

27. Formulação de caldo de fermentação obtida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais enzimas extracelulares selecionadas de uma exoglicanase, uma endoglicanase, uma hemicelulase, e uma β- glicosidase.

28. Formulação de caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que possui 2.200 a 2.800 CMC U/g de atividade de endoglicanase e 525 a 775 pNPG U/g de atividade de β- glicosidase.

29. Formulação de caldo de fermentação, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que possui2.200 a 3.200 CMC U/g de atividade de endoglicanase, 300 a 800 pNPG U/g de atividade de β- glicosidase e 2.000 a 5.000 ABX U/g de atividade de xilanase.

30. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende (a) um ou mais caldos de fermentação que compreendem células; (b) um primeiro componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um sal do mesmo em uma quantidade de 0,2% a 1,5%, 0,2% e 1%, entre 0,2% e 0,5%, entre 0,1% e 10%, entre 0,25% e 5% ou entre 0,3% e 3% em peso da dita composição, (c) um segundo componente ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um sal do mesmo em uma quantidade de 0,04% a 0,6%, 0,04% e 3%, entre 0,2% e 0,5%, entre 0,1% e 1%, entre 0,25% e 5% ou entre 0,3% e 3% em peso da dita composição, em que o dito segundo componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido benzoico, um sal de ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, um sal de ácido ciclo- hexanocarboxílico, ácido 4-metil-valérico, um sal de ácido 4-metil-valérico, ácido fenil-acético, um sal de ácido fenil-acético, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que as ditas células são predominantemente ou completamente células não-viáveis.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende predominantemente células não-viáveis em que caso as células viáveis estejam presentes na dita composição, então a razão de células não-viáveis para células viáveis na dita composição é de pelo menos 10:1, pelo menos 50:1, pelo menos 100:1, pelo menos 1.000:1, pelo menos 10.000:1, pelo menos 100.000:1 ou pelo menos 1.000.000:1.

33. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizada pelo fato de que possui um pH de 3,5 a 5, ou de 4 a 4,7 ou de 4,2 a 4,5.

34. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que as ditas células compreendem células fúngicas filamentosas.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que as ditas células fúngicas filamentosas são dos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium, ou Neurospora.

36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético, um sal de ácido acético, ácido fórmico, um sal de ácido fórmico, ácido propiônico, um sal de ácido propiônico, ou uma mistura de dois ou mais dos precedentes.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro componente ácido orgânico compreende ou consiste em ácido acético e/ou um sal do mesmo.

38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio do dito ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou onde o dito segundo componente ácido orgânico compreende um sal de sódio, potássio, cálcio ou magnésio do dito ácido orgânico com 6 ou mais carbonos.

39. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro componente ácido orgânico compreende ácido acético em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso e o segundo componente ácido orgânico compreende benzoato de sódio em uma concentração de 0,2%-0,4% em peso.

40. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais proteínas secretadas pelas ditas células.

41. Composição, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que as ditas pelo menos uma ou mais proteínas são enzimas selecionadas de exoglicanase, uma endoglicanase, uma hemicelulase ou uma β-glicosidase expressadas de forma recombinante pelas ditas células.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que contém uma pluralidade de enzimas, em que tal pluralidade de enzimas é selecionada de uma exoglicanase, uma endoglicanase, uma hemicelulase ou uma β-glicosidase que são expressadas de forma recombinante e secretadas pelas células.

43. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 42, caracterizada pelo fato de que as proteínas constituem 5 a 15 % em peso da dita composição.

44. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 43, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes antimicrobianos em uma quantidade de 0,0005 a 0,05% ou 0,001 a 0,025% em peso da dita composição.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o agente antimicrobiano compreende extrato de lúpulo que contém iso-alfa-ácidos, tetra-iso-alfa-ácidos, e/ou beta-ácidos.

46. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma embalagem, e (b) a formulação de caldo de fermentação como definido em qualquer uma das reivindicações 27 a 29 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 33 e 35 a 45.