BRPI1010496A2 - Processo de obtenção de adjuvante para vacinas aviárias - Google Patents

Abstract

Processo de obtenção de adjuvante para vacinas aviárias. A presente invenção refere-se, de forma geral, ao uso da água de coco em pó (acp) ou desidratada como adjuvante para vacinas aviárias, particularmente para vacinas vivas aviárias aplicadas por diferentes vias.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Processo de Obtenção de Adjuvante para Vacinas Aviárias Campo da Invenção A presente invenção refere-se, de forma geral, ao uso da água de coco em pó (ACP) ou desidratada como adjuvante para vacinas aviárias, particularmente, para vacinas vivas aviárias aplicadas por diferentes vias. A presente invenção se situa no campo da biotecnologia.

Antecedentes da Invenção A produção avícola é um empreendimento que requer investimento razoável, cujo retorno é proporcional à habilidade do empresário em maximizar os ganhos e minimizar as fontes de perdas. Seu crescimento não seria possível sem a adoção de medidas preventivas contra microrganismos causadores de doenças como é o caso dos vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), da Doença de Newcastle (DN), da Doença de Gumboro (DIB), da Doença de Marek (DM), da Bouba Aviária, da Encefalomielite; das bactérias Mycoplasma gallisepticum e synoviae, dentre outras.

Desde que Edward Jenner’s descobriu a vacina contra a varíola, foi aberto um novo capítulo no combate aos agentes microbianos. A vacinação passou a ser o caminho mais viável e de melhor custo para prevenir, controlar e erradicar doenças infecciosas. A vacinação, em medicina veterinária, representa um fator fundamental para a melhoria do bem-estar animal, reduzindo o custo da produção do alimento de origem animal e diminuindo a incidência de zoonoses. Além disso, as vacinas veterinárias, especialmente as da área avícola, movimentam um mercado internacional crescente de cerca de US$ 3,1 bilhões (Kulcsar et ai, 2010).

Uma vez que problemas sanitários podem comprometer a exportação de produtos avícolas, essas medidas devem ser adotadas visando tanto à obtenção de melhores resultados zootécnicos, quanto ao compromisso com a produção regional e nacional. Sendo a vacinação a mais importante medida preventiva contra as enfermidades, as vacinas, vivas ou atenuadas, e as mortas ou inativadas (Alexander, 2009), tem sido constantemente inovadas, pois as empresas vêm adotando programas de vacinação variáveis, empregando diferentes amostras vacinais e utilizando equipamentos diversos, num constante processo de aperfeiçoamento.

Atualmente, as vacinações que utilizam vacinas com vírus vivo são aplicadas, de forma individual ou massal, nas aves após o nascimento. A vacinação individual pode ser realizada por via ocular ou injetada por via subcutânea, enquanto que as vacinações por via massal podem ser realizadas por via oral (ou água de bebida) ou por via spray (ou nebulização) (Degefa et ai, 2004).

Para cada via de aplicação, o vírus vacinai, ou simplesmente a vacina, deve ser primeiramente diluído, para então ser distribuído. As vacinas vivas comerciais para aves podem ter forma liofilizada ou congelada e apresentação em doses múltiplas para 1.000, 2.000, 5.000 e até 10.000 aves, podendo também ser simples, com um único tipo de vírus, ou combinada, com mais de um tipo de vírus. São conservadas em temperatura de geladeira, entre 2°C a 8°C (Gallili e Ben-Nathan, 1998), por um período que varia de 18 a 24 meses, de acordo com o estipulado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2006). Após o frasco aberto, inicia-se a perda vertiginosa dos títulos de vírus vacinai, culminando-se em perda total da capacidade da vacina em causar imunidade após cerca de uma a duas horas, dependendo do tipo de vírus da vacina. A utilização de substâncias adjuvantes auxilia a formação de uma resposta imune de maior intensidade, de maior duração e mais rápida com uma quantidade menor de antígeno, podendo assim diminuir custos na produção de vacinas. Em vacinas comerciais, os adjuvantes são usualmente de dois tipos: (a) adjuvantes veículos, que servem como matriz para os antígenos e também estimulam o sistema imunológico; ou (b) adjuvantes imuno-estimulantes, que estimulam o sistema imunológico, mas não realizam nenhuma função mecânica. Vários mecanismos são propostos para explicar a eficiência dos adjuvantes e como eles podem melhorar a resposta da vacina ao antígeno. Os adjuvantes podem induzir inflamação local, aumentando o contato do antígeno com células adicionais que são atraídas para o local; formar um depósito de antígeno liberando-os mais lentamente e prolongando assim sua interação com o macrófago; aumentar a velocidade e duração da resposta imune; modular a avidez, a especificidade, o isotipo e a distribuição de subclasses de anticorpos; estimular a imunidade mediada por células; induzir imunidade de mucosas e aumentar a resposta imunológica em indivíduos imunologicamente imaturos ou senis.

Segundo Rauw et aí. (2010), o desenvolvimento de adjuvantes seguros e resistentes é necessário para maximizar a eficácia da vacinação e o aumento da indução da resposta imune local em aves para novas e/ou vacinas vivas convencionais administradas através de vias que interajam com a mucosa. Neste contexto, a toxina da cólera, os oligodeoxinucleotídeos estimuladores de CpG, as citoquinas aviárias, a quitosina e outros adjuvantes têm sido investigados com sucesso para as vacinas vivas aviárias.

Singh e 0’Hagan (2003) fizeram um levantamento dos adjuvantes atualmente utilizados para vacinas contra enfermidades em humanos e animais, assim definidos: • Sais Minerais: hidróxido de alumínio; fosfato de alumínio; fosfato de cálcio; • Adjuvantes Imuno-estimulantes: citoquinas (IL-2, IL-12, GM-CSF); saponinas; derivados de MDP; DNA bacteriano (CpG); LPS; MPL e derivados sintéticos; Lipopeptídeos; • Partículas Oleosas: emulsões em geral, como, p.ex.: emulsão de Freund; • Partículas Adjuvantes: micro partículas PLG; partículas virais; • Adjuvantes de Mucosa: enterotoxina; toxina colérica; quitosana.

Edelman (1997) lista um número de critérios que garantem a segurança de vacinas com adjuvantes. Além da segurança com respeito às reações locais, reações sistêmicas (toxicidade geral, pirogenicidade), doenças auto-imunes, reações de hipersensibilidade, carcinogênese, teratogênese, etc., um adjuvante ideal deve ser definido quimicamente de forma que possa ser fabricado constantemente. A preparação deve induzir uma resposta imunológica protetora a antígenos fracos com baixas doses de proteínas e com poucas aplicações. Deve ser efetivo em induzir uma resposta mais persistente e de alta qualidade, deve ser estável em consideração a sua capacidade adjuvante e à ausência de toxicidade não apresentando nenhuma interação com o antígeno.

Apesar de muitas vacinas utilizando adjuvantes tradicionalmente sejam aplicadas por injeção via subcutânea ou intramuscular, outras vias de aplicação têm sido avaliadas, oferecendo importantes vantagens, como facilidade de administração, redução de efeitos adversos e ativação de imunidade local. Imunização de mucosa por via oral ou intranasal, por exemplo, pode ser particularmente vantajosa de ser usada em granjas, onde o acesso aos cuidados veterinários é mais difícil. Entretanto, esta via apresenta a desvantagem de ser usada em vacinas com vírus vivo, devido ao efeito deletério dos ácidos estomacais e intestinais sobre o vírus vacinai, necessitando de um adjuvante eficaz para tal. Vários estudos com o uso de micro partículas como adjuvante imunizante de mucosa foram realizados: em bovinos, usando micro partículas de alginato administrado via oral e intranasal (Bowerstock e Martin, 1999; Rebelatto et al., 2001); em ratos, com micro partículas de polilactídeo co-glicolídeo para induzir imunidade sistêmica e de mucosa (Challacombe et al., 1992, 1997; Eldridge et al., 1990; 0’Hagan, 1994). Além destas, a imunização de mucosa com micro partículas utilizadas como adjuvantes, induziram proteção contra uma série de bactérias, como Bordetella pertussis, Chlamydia trachomatis e Salmonella typhimurium (Singh e 0’Hagan, 2003). Algumas toxinas bacterianas foram descritas como adjuvantes indutores de imunidade de mucosa, entretanto, em geral têm sido consideradas muito tóxicas para uso em humanos e, para uso veterinário, têm sido manipuladas geneticamente para reduzir a toxicidade (Giuliani etal., 1998).

Vale ressaltar, que apesar de todos os benefícios levantados para o uso de adjuvantes, muitos dos candidatos a adjuvantes nunca serão aceitos para uso em vacinações de rotina humana ou animal, devido a fatores relacionados à segurança, devendo-se ter uma atitude concreta entre o risco e o benefício, enfatizando sempre a segurança acima da eficácia, quando a vacina é aplicada em indivíduos saudáveis. O mecanismo de ação e a resposta inflamatória induzida pelos adjuvantes são, atualmente, pouco entendidos. Nos processos de imunização deve haver, obrigatoriamente, uma resposta inflamatória, para que haja ativação dos mecanismos de imunidade específica (linfócitos B e T). A imunização deve ser direcionada para este fim. Portanto, a adição de adjuvantes pode ativar vários mecanismos de ação da resposta imunológica, porém apenas alguns são relevantes para o estabelecimento de respostas antígeno-específicas eficientes. Desta forma, o estudo das características inflamatórias dos adjuvantes é importante na interpretação de sua capacidade de indução imunogênica e no entendimento dos efeitos colaterais associados ao seu uso. Várias questões recentes têm servido para realçar a necessidade urgente para o desenvolvimento de vacinas novas e melhoradas para uso da avicultura industrial. Estes problemas são: a emergência de novas doenças, ressurgimento de infecções antigas e disseminação contínua de bactérias resistentes aos antibióticos. O desenvolvimento de adjuvantes também deve ser conduzido a favor da redução de custos do processo de imunização das aves. Particularmente no campo da veterinária, um custo significativamente mais baixo por animal seria necessário, em comparação com vacinas humanas. Até agora, os adjuvantes utilizados extensivamente no campo veterinário, são as emulsões de óleo mineral ou hidróxido de alumínio como compostos adicionais para imunopotencialização. No entanto, o desenvolvimento de novos adjuvantes deverá ser conduzido para uma melhor compreensão do mecanismo de ação dos adjuvantes para as vacinas aviárias atualmente disponíveis no mercado e esta é uma área de pesquisa que requer ainda muito trabalho. A Publicação PCT n° WO 99/21579 atribuída a RP SCHERER CORP, divulga uma “rápida” dispersão na composição de uma vacina liofilizada avícola contra Doença de Newcastle, como se estivesse “levemente compactado”. A apresentação é dada como uma “rede de matriz aberta”, como se fosse uma “espuma sólida”, referenciada pela Patente US n° 4,371,516 (equivalente a Patente UK N° 1548022), como oposição a uma forma de comprimido. Além disso, as vacinas são direcionadas para administração oral, e orientada para retenção na mucosa. Adjuvantes servem para dar tempo suficiente para a distribuição da vacina e consequente absorção. A formulação da vacina divulgada não prevê a preparação de uma dose imunizante, nem de um meio estável. A água de coco ou líquido endospérmico proveniente do fruto do coqueiro (Cocos nucifera L.), pertence à subfamília Cocosidea da família Palmea, sendo uma solução natural e estéril, ligeiramente ácida, apresentando um valor de pH na faixa de 4.0 a 5.6, que é função, principalmente, da variedade e grau de maturação (Campos et ai, 1996). O coqueiro é considerado o terceiro cultivar de frutas em área plantada no Brasil, estando presente em 280 mil hectares e com 1,92 milhão de frutos produzidos. O maior produtor do Brasil é a Bahia, com 709.000 frutos, vindo depois o Pará (250.000), o Ceará (244.000), o Espírito Santo (180.000) e Pernambuco (134.000) (BRASIL/MAPA, 2005). É considerada como uma das principais frutas da pauta nacional de exportações (Pinheiro et al., 2005). O coco verde contém em torno de 400 mL de água, cerca de 25% do peso do fruto, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, fatores de crescimento (fitohormônios) (Anurag e Rajamohan, 2003). É pobre em fosfolipídios (Laguna, 1996), possuindo ainda indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, que lhe confere densidade e pH compatíveis com o plasma sanguíneo (Blume e Marques Jr., 1994). É considerado como um repositor de sais e algumas de suas aplicações terapêuticas, como utilização na forma de soro oral ou intravenoso, nos casos de cólera, problemas intestinais e estomacais tem sido citadas na literatura (Magalhães et al., 2005; Anurag e Rajamohan, 2003). A presença, na água de coco, de alcoóis, cetonas, lactonas, aldeídos e ésteres, todos com cadeia curta de carbono, são provavelmente responsáveis, em parte, por seu aroma, enquanto que o éster n-propiletanoato, por seu sabor. Entretanto, estes produtos despertam o interesse pela ação antioxidante, como um potencial aditivo alimentício antioxidante natural (Fonseca et ai, 2009).

Dos componentes mais importantes da água de coco podem ser mencionados os açúcares que, no início da maturação, apresentam-se na forma de açúcares redutores (glicose e frutose), cujas concentrações alcançam níveis máximos de 5% próximo ao sexto e sétimo mês, período em que a quantidade de água também é maior. Com a maturação, a concentração de açúcares redutores diminui em até 1%, porém são formados açúcares não-redutores (sacarose), sendo, ao final da maturação, o teor de açúcares totais de, aproximadamente, 2% (Jayalekshmy et ai, 1984; Carvalho et ai, 2006).

Existem outros componentes na água de coco que mostram atividades semelhantes à das citocininas (Nunes e Salles, 1993), modulando atividades fisiológicas como a floração, expressão sexual e formação de frutos, consideradas excelentes para as células (Nunes e Salgueiro, 1999). Na índia, foram isoladas e identificadas, na água de coco, substâncias promotoras de crescimento, como citocinas endógenas e ainda traços de zeatinina ribozídeo. A zeatinina é a citocina natural mais ativa, sendo dez vezes mais potente que a cinetina. Além das funções relacionadas com a planta, verificou-se que algumas citocininas e alguns de seus derivados poderíam ser utilizados em aplicações médicas, como a supressão de crescimento de tumores em mamíferos, prevenção de formação de coágulos no sangue e retardo no envelhecimento do fibroblasto humano (Ge et ai, 2006). A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses (variedade verde da praia ou anão maduro) apresenta uma osmolaridade em tomo de 500 mOsmol/KgHaO e um pH entre 4.5 e 5.0. No entanto, a utilização da água de coco como diluente se depara com algumas dificuldades de ordem prática, tais como a disponibilidade de frutos com características ideais e a impossibilidade de armazenamento do produto (Uchoa, 2004), pois o tempo de estocagem é altamente dependente dos métodos de conservação aplicados. Esses métodos devem objetivar a inibição da atividade enzimática e a garantia da qualidade microbiológica após a abertura do fruto, observando-se a manutenção, o máximo possível, das características sensoriais originais (Magalhães et ai, 2005).

Desse modo, Salgueiro et al. (2002) desenvolveram um diluente à base de água de coco, sendo este padronizado na forma de pó, permitindo a conservação das suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões onde não se disponham do fruto. A água de coco de frutos jovens contém substâncias promotoras de crescimento ainda não identificadas (De Martin, 1980). A água de coco tem sido muito utilizada em biotecnologias relacionadas à reprodução animal. Excelentes resultados têm sido obtidos com a utilização da água de coco como diluente e conservante de sêmen de animais em geral, aumentando a vida útil e a motilidade dos espermatozóides. Estudos vêm sendo utilizados na preservação do sêmen de espécies como caprinos (Freitas, 1988; Toniolli, 1989a, Araújo, 1990; Salles, 1989; Rodrigues et al., 1994), ovinos (Freitas, 1992; Cruz, 1994; Sousa et al., 1994), suínos (Toniolli, 1989b; Toniolli e Mesquita, 1990), canídeos (Montezuma Jr. et al., 1994; Uchoa et al., 2002; Uchoa, 2004; Cardoso et al., 2006), peixe de água doce como o Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier, 1818) (Farias et al., 1999) e abelhas (Almeida e Soares, 2002).

Segundo Anurag e Rajamohan (2003), a água de coco verde tem capacidade de reduzir o risco de doenças coronarianas, devido à grande quantidade de potássio, cálcio e magnésio e do aminoácido arginina; com este propósito, estudaram o efeito cardioprotetor da água de coco verde em infartes do miocárdio induzidos experimentalmente em ratos, obtendo resultados satisfatórios.

Na química orgânica sintética, a água de coco vem sendo estudada, com excelentes resultados, como biocatalizador em processos de redução e reações hidrolíticas (Fonseca et ai, 2009).

Nogueira e Vasconcelos (2000) utilizaram água de coco como meio de cultura em conservante de córnea de coelhos. O conservante água de coco não apresentou qualquer alteração em olhos de coelho após uso demorado, comprovada sua higidez frente aos exames biomicroscópico (in vivo) e histopatológico. Demonstrou in vitro ter propriedades de manutenção da deturgência e na conservação do epitélio e endotélio. A água de coco foi utilizada por Gopikrishna et al. (2008), como meio de conservação para dentes destinados à implante. A água de coco foi comparada com um meio de conservação tradicional, o HBSS, e com o leite, para se observar a manutenção da viabilidade das células do ligamento periodontai, usando a prova de colagenase-dispase. Todos os resultados obtidos com a água de coco neste estudo foram significativamente superiores aos do meio HBSS e ao leite. Outros estudos com água de coco como meio de conservação para dentes destinados a implantes foram realizados por Moreira-Neto et ai (2009), avaliando a viabilidade dos fibroblastos. O problema consiste no fato de que a água de coco é um produto oriundo de vegetações tipicamente tropicais, o que limita a sua difusão em trabalhos em regiões de clima temperado. Por ser rica em nutrientes, a água de coco é suscetível à contaminação e, por isso, de difícil conservação. O caráter estéril da água de coco só é mantido no interior do fruto íntegro, estando susceptível a contaminação microbiana quando exposta ao ambiente por conta da abertura do fruto. A presença de fungos contaminantes, causadores de deteriorização do coco, ocorre próximo ao olho e ao pedúnculo (Jangchud et ai, 2007), podendo ser carreado para o interior do fruto no momento de sua abertura. A contaminação bacteriana, além de comprometer sua estabilidade, pode levar à deteriorização em apenas um dia após a extração (Matsui et ai, 2008). Além do mais, poucas são as pessoas aptas a identificar exatamente o estágio de frutificação ideal para uso como conservante celular. A popularização do uso da água de coco está limitada, em primeiro lugar, à inexistência de padronização deste insumo tão importante. Uma revisão bibliográfica sugere ter havido usos inadequados. Uma série de fatores como variedade, tipo de cultivar, idade, sanidade e fatores ambientais, influencia substancialmente sua complexa composição. Sua labilidade tem, inclusive, dificultado os esforços de inúmeros pesquisadores, muitos deles ligados à indústria, de obter na prateleira, a água de coco in natura, sob forma estável e duradoura (Neves et ai, 2005). Até mesmo o índice de poluição do solo e do ambiente influencia sua composição (Petroianu et ai, 2004).

Em 1997 iniciou-se, no Estado do Ceará, um estudo que levou à padronização do fruto que seria o ideal para a utilização em processos biotecnológicos. Uma vez selecionado o fruto ideal, buscou-se a estabilização da água de coco, fato logrado no início de 2002.

Com base nos primeiros resultados obtidos com a água de coco in natura, a padronização e estabilização da água de coco na forma de pó (ACP), em não perdendo suas características físico-químicas, garante a simplificação de sua utilização, podendo representar uma alternativa para a difusão de várias biotecnologias. Tal fato propiciou a padronização dos meios de conservação até então em estudo, não só para sêmen como para outros tipos celulares. Esses meios de conservação devem levar em conta as características de pH, osmolaridade e composição que possam influenciar diretamente na capacidade de manter as células viáveis após certo tempo. Em relação ao pH e osmolaridade, quanto mais próxima às condições fisiológicas (300 mOsm/Kg H2O e pH 7.0), melhor a capacidade do meio para preservar a vitalidade da células (Moreira-Neto et ai, 2009). Já que as amostras são diretamente secas e transformadas em pó, as reações são inibidas pela mudança de fase e, portanto, mantêm inalterada todas as suas qualidades.

Os cálculos de rendimento permitem restituir, quando de sua reconstituição em água destilada, os parâmetros originais do líquido endospérmico exigidos na manutenção de suas propriedades (Nunes et a!., 2005). O processo de produção de água de coco em pó, o qual já possui pedido de patente, se baseia numa sequência de procedimentos. Conforme a finalidade do produto, o fruto é selecionado em função de suas propriedades físico-químicas, como: volume, peso, diâmetro do albúmen, pH, osmolaridade, teor de carboidratos, teor de aminoácidos, teor de minerais, dentre outros. A obtenção do fruto é iniciada pela rigorosa seleção e higienização do mesmo, seguida de colheita do líquido endospérmico do coco (água de coco), sob forma asséptica, realizada amostragem após a fiítração. O líquido filtrado é homogeneizado e bombeado para o sistema de secagem. Submetidas a um tratamento térmico, a mostra é seca e transformada em um pó, destituído de água livre, com alta solubilidade (Nunes ef a/., 2005).

Tal processo está baseado na padronização e estabilização da água de coco na forma de pó (ACP) e na subsequente formulação dos meios de conservação, onde são acrescentados aditivos específicos, dependendo do tipo de material biológico a ser conservado. Referidos meios poderão ser utilizados para a conservação celular de todas as espécies animais, incluindo o homem (Nunes e Salgueiro, 2005a). O produto básico (líquido endospérmico do coco), em sua forma processada, confere estabilidade e longevidade de prateleira, sem problemas de acondicionamento, e supera as tecnologias de conservação conhecidas, uma vez que mantém as propriedades inerentes do produto original. A uniformidade do produto, obtida mediante rigoroso controle de processamento, em condições específicas, leva à manutenção dos valores agregados do endosperma líquido do coco (Nunes e Salgueiro, 2005b).

Nunes et al. (2005) descrevem alguns produtos à base de água de coco em pó que já se encontram em fase experimental: meio para desenvolvimento de células germinais; meio de manutenção, crescimento e maturação celular; meio de capacitação espermática; meio de lavagem celular; meio de coleta, lavagem, cultivo, manutenção e criopreservação para embriões; meio de criopreservação espermática; meio de criopreservação de ovócitos; meio de conservação e criopreservação de tecidos; meio de conservação e criopreservação de órgãos para transplante; meios de cultivo de microrganismos (fungos, bactérias, vírus), protozoários e insetos; geles associados a biopolímeros para uso médico e veterinário na elaboração de membranas de hidrogel substitutivas; produtos cerâmicos para próteses ósseas e dentárias; como biomaterial; produtos de confeitaria; bebidas isotônicas, repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais para pacientes hospitalares; produtos cosméticos; juntamente com frutas e/ou verduras naturais, produtos de confeitaria, bebidas isotônicas, repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais para pacientes hospitalares e de produtos cosméticos (ou seja, antes de ser transformada em pó, a água de coco é acrescida de proporções variáveis de frutos e/ou verduras naturais, fazendo com que os valores nutricionais desses produtos sejam agregados aos da água de coco).

Neste contexto, Salgueiro et ai (2002) desenvolveram a água de coco estabilizada e padronizada na forma de pó, permitindo a conservação das suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões onde não se disponham do fruto.

No âmbito patentário, foram localizados alguns documentos relevantes que serão descritos a seguir. O documento WO 2007/020017 revela uma composição de vacina para aves com administração via aerosol compreendendo partículas semelhantes a vírus. A presente invenção difere deste documento por o adjuvante ser composto por a água de coco em pó. O documento CN 101690810 revela um adjuvante de vacina contra doença de Newcastle, bronquite infecciosa, síndrome da queda de ovos e gripe aviaria que é composto principalmente de poiissacarídeos e saponinas medicinais chineses. A presente invenção difere deste documento por ser composta principalmente de a água de coco em pó. O documento US 4,073,743 revela um processo de preparação de uma emulsão água em óleo para o uso como adjuvante de vacina podendo ser usado óleo de coco. A presente invenção difere deste documento por o adjuvante ser composto de a água de coco em pó.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta ao olhar dos inventores possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de água de coco desidratada como adjuvante para vacinas aviárias. A novidade da presente invenção está centrada no fato de que se utiliza de um composto recentemente desenvolvido, a água de coco desidratada, como adjuvante de vacinas aviárias, dada suas vantagens quanto à durabilidade, quando comparada à água de coco in natura e a outros diluentes e adjuvantes convencionais. É, portanto, um objeto da presente invenção o processo de obtenção de adjuvante para vacinas aviárias compreendendo as etapas de: a) obter de 60% a 100% a água de coco em pó; b) suplementar a água de coco em pó com reguladores de pH; c) diluir em água ultra pura ou bidestilada ou destilada ou potável;

Em uma realização preferencial, para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via spray é obtida preferencialmente 70% a 98% de água de coco em pó mais preferencialmente 93,68%.

Em uma realização preferencial, para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via água de beber é obtida preferencialmente 80% a 100% de água de coco em pó mais preferencialmente 100%.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó é suplementada preferencialmente com 2 a 12% de reguladores de pH, mais preferencialmente 6,36%.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó é diluída preferencialmente em água ultra pura.

Em uma realização preferencial, para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via spray é suplementada preferencialmente com 1% a 30% de glicerol, mais preferencialmente 10%. É um objeto adicional da presente invenção o adjuvante de vacinas aviárias obtido pelo processo descrito acima.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Descrição Detalhada da Invenção Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.

Processo de Obtenção de Adiuvantes para Vacinas Aviárias Em um aspecto, a presente invenção proporciona o processo de obtenção de adjuvante para vacinas aviárias compreendendo as etapas de: a) obter de 60% a 100% a água de coco em pó; b) suplementar a água de coco em pó com reguladores de pH; c) diluir em água ultra pura ou bidestilada ou destilada ou potável; Em uma realização preferencial, para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via spray é obtida preferencialmente 70% a 98% de água de coco em pó mais preferencialmente 93,68%.

Em uma realização preferencial, para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via água de beber é obtida preferencialmente 80% a 100% de água de coco em pó mais preferencialmente 100%.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó é suplementada preferencialmente com 2 a 12% de reguladores de pH, mais preferencialmente 6,36%.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó é diluída preferencialmente em água ultra pura.

Em uma realização preferencial, para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via spray é suplementada preferencialmente com 1% a 30% de glicerol, mais preferencialmente 10%.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via spray, o pH da composição é mensurado obtendo-se preferencialmente valores entre 7,0 e 7,8, mais preferencialmente 7,4.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via água de beber, o pH da composição é mensurado obtendo-se preferencialmente valores entre 6,0 e 7,0, mais preferencialmente 6,7.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via spray, a osmolaridade da composição é mensurada obtendo-se preferencialmente valores entre 280 mOsm/Kg H20 a 320 mOsm/Kg H20, mais preferencialmente 294 mOsm/Kg H20.

Em uma realização preferencial para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias à base de água de coco em pó aplicada via água de beber, a osmolaridade da composição é mensurada obtendo-se preferencialmente valores entre 1 mOsm/Kg H20 a 20 mOsm/Kg H20, mais preferencialmente 10 mOsm/Kg H20. Água de Coco Desidratada (em Pó) Tendo a água de coco desidratada (ou em pó) uma composição rica e balanceada, promove condições fisiológicas para manutenção do antígeno vacinai, além de pH e pressão osmótica ajustados e viabilidade metabólica ideal. Os minerais contidos na sua composição, como o sódio e o potássio, são fundamentais para a viabilidade do antígeno; os açúcares (frutose e glicose) como fonte energética, e os aminoácidos promovem sua manutenção. Além disso, é um produto atóxico e inócuo e não interage com o antígeno. Todas estas condições fazem da ACP um produto para ser utilizado como adjuvante de vacinas aviárias.

Adiuvante para Vacina Um adjuvante é qualquer substância que faz melhorar, modificar, acelerar ou prolongar a resposta imunológica aos antígenos da vacina (Lima et ai, 2004). Os adjuvantes promovem o desenvolvimento de uma poderosa e duradoura resposta imunológica. Qualquer material, natural ou sintético, que aumente ou ocasione resposta imune a um antígeno é considerado um adjuvante (Resende, 2004).

Por sua capacidade de manutenção celular, o produto manterá viável o vírus vivo vacinai por um período superior a duas horas, após a vacina ter sido diluída, minimizando prováveis falhas no manejo de vacinação relacionadas ao tempo de distribuição da vacina para as aves e conservação da mesma, proporcionando resultados para a vacinação mais seguros e estáveis, com produção de anticorpos em títulos de proteção e com uniformidade.

No caso do vírus vacinai inativado, em aplicação endógena, o produto utilizado como adjuvante, devido a sua alta concentração de açúcares e minerais, promoverá um aumento da reação inflamatória local, com migração de células indutoras de imunidade, com a grande vantagem de ocasionar uma menor reação local, quando comparado às soluções oleosas utilizados na rotina. Sendo um produto natural, com custo de produção inferior aos similares industriais existentes, com estabilidade de armazenamento em prateleira e de fácil manipulação, atingirá todo o mercado nacional e internacional tanto da avicultura industrial quanto da criação de aves caipiras, silvestres e exóticas. A invenção será utilizada também como adjuvante de vacina utilizada em aves, sem se limitar apenas a aves, compreendendo frangos de corte, poedeiras comerciais, aves reprodutoras, perus, codornas e avestruzes, aves caipiras, exóticas e silvestres de qualquer raça, em qualquer idade, momento da criação, clima e em qualquer lugar do mundo. O adjuvante será individual para cada tipo de vírus ou combinação deles, aplicados de forma massal por via água de bebida (oral) ou nebulização (spray), e na forma individual, pelas vias ocular e injetável podendo ser adaptado para os agentes da Doença de Newcastle, Bronquite Infecciosa das Galinhas, Doença de Gumboro, Encefalomielite Aviária, Bouba Aviária, Doença de Marek, Influenza Aviária, Rinotraqueíte dos Perus, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Laringotraqueíte Aviária, ou qualquer outro vírus ou bactéria que causar enfermidade em aves e que não esteja aqui descrito.

Podendo também o adjuvante ser para vacinas com antígenos vivos ou inativados; com apenas um vírus vacinai ou em associação com mais vírus, bem como em vacinas recombinantes, sem excluir nenhuma outra forma de vacina, atuando como adjuvantes imunoestimulante e/ou adjuvante de mucosa.

Tais produtos podem conter veículos, excipientes e quaisquer ingredientes adequados à finalidade visada. Tais ingredientes são, em si, conhecidos pelo homem da técnica, e não são como tais, de forma individual, objeto de proteção aqui reivindicada. Os ingredientes que podem ser utilizados, não excluindo a utilização de nenhum outro, são: antibióticos, antifúngicos, antioxidantes, glícerol, corantes alimentícios, surfactantes, vitaminas, minerais, citoquinas, saponinas, lipopeptídeos, emulsões, quitosana, etc.

Formas aceitáveis para a composição da invenção, sem excluir quaisquer outras, são, por exemplo, suspensão, emulsão, dispersão, solução, gel, óleo, pó, cápsula, tablete, líquido injetável, aerossol, liofilizada, etc. É um objeto adicional da presente invenção o adjuvante de vacinas aviárias obtido pelo processo descrito acima.

Exemplo 1. Realização Preferencial A metodologia aplicada esteve de acordo com o REGULAMENTO TÉCNICO PARA A PRODUÇÃO, O CONTROLE E O USO DE VACINAS E DILUENTES PARA A AVICULTURA, Instrução Normativa MAPA n°07, de 10 de Março de 2005. Dou 20/03/2006.

Vacinas Foram utilizadas as vacinas comerciais contra a Doença de Newcastle (DN) e contra Bronquite Infecciosa (BIG), cepas HB1 e Mass H120, respectivamente. A escolha desses vírus vacinais deveu-se ao fato de serem considerados os mais lábeis e sensíveis dentre os muitos já apresentados. Devido a este fator, pode-se extrapolar os resultados obtidos para os demais. Titulação das vacinas contra DN e BIG associadas com os adiuvantes à base de água de coco em pó (ACP) Cada tipo de vacina foi diluído em PBS (Phosphate-Buffer Saline) e em ACP, em cinco diluições, sendo inoculadas em grupos de cinco ovos, com idade entre 09 a 11 dias de incubação. Para cada grupo houve um grupo controle negativo, inoculado com solução salina estéril.

As vacinas contra BIG foram inoculadas nos ovos SPF (ovos livres de patógenos específicos) imediatamente após a diluição nos respectivos meios, enquanto que as vacinas contra DN foram diluídas e mantidas em temperatura ambiente (25°C) durante quatro horas, sendo então inoculadas. O título da vacina foi calculado a partir da proporção de indivíduos infectados (positivos) dentre um universo de indivíduos inoculados e corresponde à recíproca da maior diluição onde sejam observados sinais específicos de infecção em 50% dos substratos inoculados. O título das vacinas foi calculado pelo método de Reed x Muench, e dado em DIE 50%/dose inoculada. A tabela 1 mostra os títulos das vacinas encontradas, após diluição com os produtos à base de água de coco em pó, bem como dos produtos comerciais disponíveis, o tempo de exposição após a diluição e os títulos vacinais preconizados como aceitáveis pelo MAPA, para cada um dos vírus vacinais.

Tabela 1. Título das vacinas contra Doença de Newcastle e Bronquite Infecciosa das Galinhas, segundo o diluente utilizado e o início da inoculação das vacinas.

Os resultados demonstram títulos protetivos em todos os experimentos, dentro do preconizado pelo MAPA.

Inocuidade da ACP pelas vias ocular, oral e spray em frangos de corte Foi inoculado o equivalente a 10 (dez) doses por ave em cada uma das vias testadas, com oito dias de idade, para cada uma das vacinas. As aves foram mantidas em observação por 21 dias. No final deste período, não foi observada nenhum tipo de lesão, em nenhuma das vias utilizadas, nem qualquer outro sinal que denote que o produto seja agressivo ao animal. Sorologia Foi testada a capacidade da ACP em promover a formação de anticorpos protetivos, contra os vírus da Doença de Newcastle e da Bronquite Infecciosa das Galinhas. As supracitadas vacinas foram diluídas em ACP ou em diluentes comerciais disponíveis. As vacinações foram realizadas em frangos de corte, em situação semelhante à encontrada nas criações de campo.

Foram alojados 800 pintos de corte de um dia de idade, não vacinados, em dois galpões experimentais da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará. Os mesmos foram criados numa densidade de 10 aves/m2 e temperatura ambiente controlada por ventiladores, recebendo ração balanceada e água ad libitum, até os 50 dias de idade, quando foram descartados para a venda.

Uma parte destas aves, 200 delas, foi alojada em outro galpão, não recebendo nenhuma vacina, sendo considerado como galpão controle. As demais aves foram divididas igualmente e aleatoriamente em vários grupos, onde cada grupo recebeu uma vacina com uma via de aplicação diferente e sempre um grupo utilizou a ACP, enquanto seu grupo espelho recebeu o diluente comercial. Todas as aves foram vacinadas com oito dias de idade.

Para obtenção de soro destinado às provas sorológicas, foram coletadas amostras de sangue, por punção da veia braquial, em 20 aves de cada um dos tratamentos, escolhidas aleatoriamente, e sempre nas mesmas idades. Os soros obtidos foram devidamente identificados e armazenados em refrigerador a -18°C, até o momento da realização das provas sorológicas indicadas para cada uma das vacinas utilizada.

Para mensurar a proteção contra a Doença de Newcastle, foi utilizada a prova sorológica denominada Inibição de Hemoaglutinação, e para a Bronquite Infecciosa das Galinhas, o Teste de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbert Assay). Os resultados demonstraram não haverem diferenças estatísticas entre os grupos, com os grupos onde se utilizou ACP apresentando títulos numericamente mais uniformes.

Desafio Viral - Potência Para avaliar a capacidade do vírus estabilizado com ACP em conferir proteção contra BIG, foi realizado desafio viral em 105 aves SPF alojadas em sete gaiolas isoladoras para desafios virais, recebendo ração balanceada e água ad libitum.

As aves de cada grupo (n=15) foram vacinadas através da via spray e água de bebida, com as vacinas contra BIG adicionadas de ACP ou do equivalente comercial disponível, no 8o dia de idade, com exceção do grupo 4 (Controle Positivo). No 28° dia de vida, receberam inoculação do vírus patogênico, com exceção do grupo 7 (Controle Negativo).

Após a inoculação, o aparecimento de sinais clínicos e a mortalidade foram avaliados em cada um dos experimentos, por um período de cinco dias, momento em que as aves foram retiradas dos isoladores, sacrificadas e coletados “swabs” traqueais para isolamento viral, e traquéias para exames histopatológicos, onde foram observadas as lesões, mensuradas em escores.

Também foram coletadas amostras de sangue de dez aves em cada grupo, 16 dias após a vacinação e no dia do descarte, para avaliação da presença de anticorpos, através do teste de ELISA. A tabela 2 demonstra os grupos, a vacinação contra BIG utilizando a amostra H-120, o tipo de diluente utilizado, a via de vacinação e a realização ou não do desafio viral.

Tabela 2. Desafio viral para Bronquite Infecciosa das Galinhas, com 0,03 mL, via ocular, da amostra de referência M41, com dose cheia na DIE 50% obtida na titulação. ο Tabela 4. Resultado qualitativo do teste Elisa para Bronquite Infecciosa das Galinhas.

Tabela 5. Avaliação do desafio do vírus da BIG, através da colheita de suabes traqueais de cada ave e de cada grupo. O resultado da análise histológica das traquéias coletadas no momento do descarte das aves está resumido abaixo: a. As traquéias dos grupos 03, 06 e 07 não apresentaram alterações importantes em todas as amostras analisadas; b. As traquéias dos grupos 01, 02, 04 e 05 apresentaram lesões severas, compatíveis com desafio viral respiratório. As lesões apresentaram características de infecção subaguda a crônica.

Teste de Esterilidade Os produtos finais foram testados quanto à sua esterilidade para bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e fungos, utilizando meios de cultura apropriados como o Meio de Caseína de Soja Digerida, Infusão de Cérebro-Coração (BHI), Meio Fluido Tioglicolato e Sabouraud Líquido, visando flora aeróbica, anaeróbica e fungos. A sensibilidade dos meios utilizados foi testada antes do início do experimento. Foram testadas 10 amostras de cada um dos adjuvantes, devidamente re-hidratados em água bidestilada estéril. a) Pesquisa de bactérias da flora aeróbica: Foram inoculados 0,2 mL do adjuvante, equivalente a cada amostra a ser testada, em dois tubos contendo 40 mL de meio fluido de caseína de soja digerida ou BHI. Um tubo foi incubado a 32°C e outro a 22°C, sendo a leitura realizada após 14 dias. b) Pesquisa de flora anaeróbica: Foram inoculados, em profundidade, 0,1 mL do adjuvante, equivalente a cada amostra a ser testada, em tubo para eliminação do oxigênio. A incubação foi realizada em anaerobiose estrita a 37°C por 14 dias, em meio Fluido Tioglicolato. c) Pesquisa de fungos: Foram inoculados 0,2 mL do adjuvante de cada partida, em um frasco individual contendo 40 mL de meio Sabouraud, incubados a 22°C por 14 dias.

Após 14 dias em cultivo em temperaturas adequadas para cada tipo de meio utilizado, não foi identificado crescimento bacteriano nem de fungos, em nenhuma das 10 amostras inoculadas.

Reivindicações Processo de Obtenção de Adjuvante para Vacinas Aviárias

Claims (13)

1. Processo de obtenção de adjuvante para vacinas aviárias compreendendo as etapas de: a) obter de 60% a 100% a água de coco em pó; b) suplementar a água de coco em pó com reguladores de pH; c) diluir em água ultra pura ou bidestilada ou destilada ou potável;

2. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa a) compreender a obtenção de 70% a 98% de água de coco em pó.

3. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela vacina ser aplicada via spray.

4. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela etapa a) compreender a obtenção de cerca de 93,68% de água de coco em pó.

5. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela composição final ser suplementada com 1% a 30% de glicerol.

6. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela composição final ser suplementada com cerca de 10% de glicerol.

7. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa a) compreender a obtenção de 80% a 100% de água de coco em pó.

8. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela vacina ser aplicada via água de beber.

9. Processo para obtenção de adjuvante para vacinas aviárias aplicadas via água de beber, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela etapa a) compreender a obtenção de cerca de 100% de água de coco em pó.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa b) compreender a suplementação com 2 a 12% de reguladores de pH.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela etapa b) compreender a suplementação com cerca de 6,36% de reguladores de pH.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa c) compreender a diluição em água ultra pura.

13. Adjuvante para vacinas aviárias caracterizado por ser obtido pelo processo de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 12.