BRPI1010679B1 - Cepa de vacina de mycoplasma hyopneumoniae sensível à temperatura e aplicações da mesma, composiçao de vacina, método de preparaçao e uso da mesma - Google Patents

Abstract

cepa de vacina de mycoplasma hyopneumoniae sensível à temperatura e aplicações da mesma. a presente invenção refere-se a uma cepa de vacina de mycoplasma hyopneumoniae com-preendendo uma mutação em no mínimo um dos genes listados ou conforme depositados junto ao national measurements lnstitute (australia) sob número de acesso nm04/41259, cuja cepa é sensível à temperatura e atenuada, uma vacina compreendendo as cepas referidas e métodos e aplicações das mesmas.

Description

CEPA DE VACINA DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE SENSÍVEL À TEMPERATURA E APLICAÇÕES DA MESMA, COMPOSIÇAO DE VACINA, MÉTODO DE PREPARAÇAO E USO DA MESMA Campo

[0001] A presente invenção refere-se a cepas de Mycoplasma hyopneumoniae, vacinas compreendendo as cepas referidas e aplicações de semelhantes vacinas para proteção contra pneumonia micoplásmica suína.

Antecedentes

[0002] Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico de pneumonia micoplásmica suína (também denominada pneumonia enzoótica (EP)). É uma das doenças respiratórias mais comuns e economicamente significativas afetando a produção mundial de suínos. A doença está associada com infecções secundárias, taxas de alta morbidez e baixa mortalidade, baixa conversão de ração e pode ser atribuída a perdas econômicas globais estimadas em cerca de 1 bilhão de dólares por ano.

[0003] Na pneumonia enzoótica, bactérias de Mycoplasma hyopneumoniae se prendem aos cílios de células epiteliais nos pulmões dos porcos destruindo os cílios saudáveis normais permitindo que organismos oportunistas se estabeleçam no tecido respiratório causando doença. Uma vez estabelecidos, M. hyopneumoniae causa lesões nos pulmões dos porcos.

[0004] A doença é altamente contagiosa e geralmente a transmissão é através de contato direto com secreções do trato respiratório infectado, por exemplo gotículas ejetadas pelo focinho ou pela boca ao espirrar ou tossir.

[0005] Existem atualmente várias vacinas contra M. hyopneumoniae. A maioria das vacinas correntes são proporcionadas por cerca de 10 empresas com 22 marcas de vacinas registradas quer como únicas ou como bi/multivalentes. Todas as preparações de M. hyopneumoniae morto ou inativado.

[0006] Exemplos de vacinas de M. hyopneumoniae inativado de células inteiras incluem RESPISURE™ e STELLAMUNE™ (Pfizer), SUVAXYN M. HYOTM (Fort Dodge), HYORESP™ (Meriel), M+PACTM (Schering-Plough) e PORCILIS™ (Intervet).

[0007] Apesar de algumas vacinas poderem reduzir a gravidade da pneumonia enzoótica, nenhuma das vacinas de células inteiras mortas ou inativadas disponíveis proporcionam plena proteção contra infecção por M. hyopneumoniae. Por conseguinte, existe a necessidade de uma vacina mais eficaz.

[0008] É um objetivo de uma modalidade preferencial da presente invenção proporcionar uma cepa viva de mycoplasma pneumoniae adequada para aplicação em vacinação para prevenir pneumonia enzoótica.

[0009] Todas as referências, incluindo quaisquer patentes ou requerimentos de patente, citadas neste relatório descritivo são por este incorporadas por meio de referência. Será claramente entendido que, embora uma série de publicações da técnica anterior sejam referidas aqui, neste requerimento de patente, esta referência não constitui uma admissão de que qualquer destes documentos forme parte do conhecimento geral comum na técnica.

Sumário

[00010] A invenção proporciona de modo geral uma cepa viva atenuada de Mycoplasma hyopneumoniae que pode ser usada para produzir uma vacina viva que é eficaz na proteção contra pneumonia enzoótica em porcos.

[00011] Um primeiro aspecto proporciona uma cepa de vacina atenuada de Mycoplasma hyopneumoniae compreendendo uma mutação em no mínimo um dos genes listados na Tabela 1.

[00012] Em uma modalidade a cepa de vacina compreende uma mutação em todos os genes listados na Tabela 1.

[00013] Em uma modalidade a cepa de vacina é sensível a temperatura.

[00014] Vacinas atenuadas são geralmente vantajosas porque apresentam todos os determinantes imunogênicos relevantes de um agente infeccioso em sua forma natural para o sistema imune do hospedeiro e a necessidade de quantidades relativamente pequenas do agente imunizante devido à capacidade do agente para multiplicar no hospedeiro vacinado. Métodos para atenuação incluem passagem de uma cepa virulenta múltiplas vezes ou exposição a irradiação ou produtos químicos. Presume-se que estes métodos introduzem mutações no genoma as quais tornam o microorganismo menos virulento mas ainda capaz de replicação.

[00015] As desvantagens destas abordagens são que elas introduzem mutações aleatórias que não são caracterizadas no nível molecular. Além disso os métodos para selecionar a atenuação, tais como por seleção para sensibilidade a temperatura associada, frequentemente consomem muito tempo, produzem falsos resultados uma vez que uma cepa sensível à temperatura pode não ser atenuada e uma cepa atenuada não precisa ser sensível a temperatura, e requerem uma grande quantidade de tentativa e erro. Adicionalmente a cepa atenuada pode sofrer mutação posterior e reverter para virulência.

[00016] Com o objetivo de proporcionar uma vacina viva contra pneumonia micoplásmica os inventores submeteram um isolado de Mycoplasma hyopneumoniae a mutagênese química e selecionaram clones que eram sensíveis a temperatura. Os inventores secaram por congelamento as bactérias vivas mutantes e viram que as bactérias podem ser reconstituídas depois de uma semana e permanecem viáveis depois de passagem serial e portanto foram adequadas como uma cepa de vacina para Mycoplasma hyopneumoniae. A cepa de vacina e a cepa mestre foram sequenciadas e a comparação das sequências identificou genes que foram mutados na vacina, deste modo possibilitando caracterização genética da cepa atenuada.

[00017] Um segundo aspecto proporciona uma cepa de vacina de Mycoplasma hyopneumoniae atenuada conforme depositado junto ao National Measurements Institute (Austrália) sob número de acesso NM04/41259, cuja cepa é sensível à temperatura e atenuada.

[00018] Foi demonstrado que a cepa de vacina do segundo aspecto confere imunidade preventiva e não apresenta reversão para virulência apesar de passagem serial (dados não mostrados).

[00019] Um terceiro aspecto compreende um método de produzir a cepa de vacina do primeiro ou segundo aspecto, o método compreendendo submeter um isolado de partida adequado de Mycoplasma hyopneumoniae a mutagênese química e selecionar mutantes os quais conservam a viabilidade depois de passagem serial.

[00020] Em uma modalidade primeiro são selecionados mutantes com base na sensibilidade a temperatura.

[00021] Um quarto aspecto proporciona uma composição de vacina compreendendo a cepa de vacina de M. hyopneumoniae do primeiro ou segundo aspecto e um veículo, opcionalmente um adjuvante, e/ou opcionalmente no mínimo um agente infeccioso adicional, cuja vacina em uma quantidade imunizante é capaz de provocar imunidade preventiva contra uma doença causada por M. hyopneumonia. O agente infeccioso pode ser um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita,

[00022] Um quinto aspecto proporciona um método para proteção contra uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae em um animal porcino compreendendo administrar ao animal porcino uma quantidade imunizante da composição de vacina do quarto aspecto.

[00023] Um sexto aspecto proporciona a vacina do quarto aspecto para proteção contra uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae em um animal porcino.

[00024] Um sétimo aspecto proporciona um método de produzir uma vacina de acordo com o quarto aspecto compreendendo combinar a cepa de Mycoplasma hyopneumoniae do primeiro ou segundo aspecto com um veículo, opcionalmente um adjuvante e/ou opcionalmente no mínimo um agente infeccioso adicional. Um agente infeccioso pode ser um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita.

[00025] Um oitavo aspecto proporciona a aplicação da cepa de vacina de Mycoplasma hyopneumoniae do primeiro ou segundo aspecto na fabricação de um medicamento para proteger contra doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae em um animal porcino.

[00026] Em uma modalidade do quarto ao sétimo aspectos a "doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae" é pneumonia enzoótica ou pneumonia micoplásmica suína.

Breve Descrição das Figuras

[00027] Figura 1: Colonização nasal de cepa de vacina ts19 em porcos vacinados em alta overdose.

[00028] Figura 2: Colonização traqueal em 59 dias pós vacinação (DPV) em porcos vacinados em alta overdose com vacina ts19.

[00029] Figura 3: Colonização nasal em porcos vacinados com cepa de vacina ts19 em várias doses.

[00030] Figura 4: Pesos corporais totais diferenciais durante o período do estudo (105 dias).

[00031] Figura 5: Determinação da Mínima Dose Preventiva para ts19.

[00032] Figura 6: Índice de proteção de ts19 e vacina comercial com base na redução na gravidade das lesões pulmonares.

Descrição Detalhada

[00033] M. hyopneumoniae cepa "LKR" foi originalmente isolado de uma amostra de abatedouro (Lloyd and Etheridge 1981, J of Comp Path 91:77-83). O organismo foi reisolado a partir de porcos infectados experimentalmente antes de ser passado cerca de 10 vezes em meio acelular para atingir isolamento clonal (CSIRO, Victoria). O clone foi em seguida submetido à compilação de Mycoplasma da University of Adelaide, Sul da Austrália. O isolado de LKR foi em seguida obtido pelo Departamento de Ciência Veterinária (Grupo de Mycoplasma) da Universidade de Melbourne [University of Melbourne, Department of Veterinary Science (Mycoplasma Group)], onde foi submetido a 3 passagens in vitro em caldo Friss modificado, para armazenamento. Os frascos armazenados foram designados "LKR P3 29/5/97". Este clone representa a cepa parental.

[00034] LKR P3 29/5/97 foi passado in vitro e submetido a mutagênese por NTG (200 mg/mL) usando um método descrito previamente (Nonamura e Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775). Um sensível clone a temperatura ("ts-19") foi selecionado de uma lâmina de agar e cultivado em 3 mL de caldo Friss modificado. O número de passagens para este clone foi designado "P0" e em seguida foi submetido a um adicional de quatro passagens in vitro em diluição a 1:4 em v/v por passagem em caldo Friss modificado. O nível de passagem final foi designado "LKR ts-19 P4 MS".

[00035] LKR ts-19 P4 MS foi submetido a uma série de passagens de diluição in vitro em caldo Friss Modificado para atingir uma diluição de 3,2 x 10-21. O clone mutante final foi designado "LKR ts-19 3,2 x 1021"

[00036] LKR ts-19 3,2 x 10-21 foi secado por congelamento e submetido aos Laboratórios Analíticos do Governo Australiano (Australian Government Analytical Laboratories) (Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento Internacional do depósito de organismos para os fins de procedimento de patente) sob o número de acesso NM04/41259.

[00037] Os Mycoplasmas têm um tamanho de genoma altamente reduzido o qual reflete suas limitadas capacidades biossintéticas e sua dependência de seu hospedeiro semelhante a parasitas. À luz da limitada redundância em seus genomas, mutagênese por NTG de um componente em particular de um caminho pode ter um efeito significativo sobre a sobrevida de uma célula de Mycoplasma. Mutagênese por NTG resulta em mutações aleatórias (transições, transversões, eliminações ou inserções de nucleotídeos) dentro do genoma. Isto resultaria em uma população de genomas variantes cada um contendo quer uma ou mais mutações. Presumivelmente muitos dos genomas variantes não sobreviveriam devido a um gene ou genes críticos sendo tornados disfuncionais. Se as mutações não incorrerem em um efeito prejudicial sobre a capacidade dos organismos para crescer, então aqueles organismos variantes sobreviventes podem ser submetidos a seleção adicional (por exemplo, seleção de temperatura). No desenvolvimeno de ts19, a seleção se baseou na capacidade da cepa variante para crescer até alto título em uma temperatura de 33°C e a capacidade reduzida para crescer a 39,5°C. Com base na comparação da sequência do genoma inteiro entre a cepa de vacina de Mycoplasma hyopneumoniae ts19 e a da cepa parental (LKR), foram identificadas uma série de mutações (alterações de nucleotídeos) dentro do genoma de ts19. Estas mutações incluíram substituções de nucleotídeos (transições e transversões), bem como eliminações e inserções de nucleotídeos.

[00038] As mutações foram localizadas em todo o genoma e incluem uma gama de genes expressados bem como proteínas hipotéticas e sequências não-codificantes. A Tabela 1 lista os genes conhecidos que foram mutados por substituições, eliminações ou inserções de base. Os genes foram classificados de acordo com sua função principal. As pessoas versadas na técnica reconheceriam prontamente como detectar se uma cepa de M. hyo continha uma mutação em um dos genes listados na Tabela 1 determinando se há uma diferença entre a sequência de referência proporcionada (por exemplo, YP_278901.1) e a sequência da cepa atenuada. Ts19, conforme depositada como NM04/41259 é uma cepa atenuada compreendendo todas as mutações listadas na Tabela 1.

[00039] Em uma modalidade a cepa atenuada compreende no mínimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou todas as mutações listadas na Tabela 1. Em uma modalidade a cepa atenuada compreende uma mutação em um ou cada dos fatores de virulência, e/ou um ou cada dos genes envolvidos no metabolismo dos carboidratos, e/ou o gene envolvido no metabolismo dos fosfolipídeos, e/ou o gene envolvido no metabolismo de co-fatores, e/ou um ou cada dos genes envolvidos em transcrição ou translação, e/ou um ou cada dos genes envolvidos em transporte de membrana, e/ou um ou cada dos genes envolvidos em replicação, reparo ou metabolismo de DNA e/ou o gene transposase listados na Tabela 1.

[00040] Em uma modalidade a cepa atenuada compreende uma mutação em cada um dos fatores de virulência.
Tabela 1: Mutações Atenuantes dentro de genes da cepa de vacina ts19 de M. hyopneumoniae.

YP_número indica Sequência de Referência NCBI

[00041] A cepa bacteriana descrita aqui, neste requerimento de patente, é uma cepa viva sensível à temperatura e atenuada e pode ser usada em uma vacina viva.

[00042] Uma cepa viva e atenuada é uma cepa bacteriana viva que foi cultivada sob condições que reduzem ou "atenuam" suas propriedades virulentas. Vacinas vivas tipicamente provocam uma reação imunológica mais durável do que microorganismos inativados ou mortos.

[00043] A cepa de vacina de acordo com o primeiro aspecto pode ser produzida por mutação química de um isolado de Mycoplasma hyopneumoniae. A mutação química particularmente compreende mutagênese por tratamento com N-Metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) (Nonamura e Imada (1982), Avian Diseases 26; 763-775). Bactérias mutantes sensíveis a temperatura podem ser selecionadas por sua capacidade para crescer em uma temperatura permissiva (33oC) e por não serem capazes de crescer em uma temperatura não-permissiva (39,5oC). Para aplicação em uma vacina os mutantes sensíveis a temperatura são submetidos a passagem e diluição seriais.

[00044] A cepa de vacina bacteriana de Mycoplasma de acordo com o primeiro aspecto é viável (ou viva). Viabilidade significa em geral "capacidade para sobrevida" e é mais especificamente usada para indicar uma capacidade para viver, desenvolver, ou germinar sob condições favoráveis. Uma célula bacteriana é viável se for capaz de crescer quer em um caldo adequado ou em meio de agar.

[00045] A cepa bacteriana depositada segundo o Tratado de Budapeste como NM 04/41259 foi produzida por passagem in vitro três vezes (3x) a (1:4 v/v em caldo Friss modificado) de isolado LKR de Mycoplasma hyopneumonia Australiano (obtido da compilação de Mycoplasma da University of Adelaide pela Universidade de Melbourne (Mycoplasma Group) para produzir LKR P3. O isolado LKR P3 foi em seguida submetido a mutagênese por NTG. LKR P3 mutagenizado foi cultivado sobre agar a 33oC (uma temperatura permissiva) e a 39,5oC (temperatura não-permissiva). Foram selecionados clones mutantes que cresceram a 33oC mas não cresceram a 39,5oC. Os clones selecionados foram submetidos a várias rodadas de passagem e diluição serial in vitro. Na rodada final de passagem, um clone selecionado (ts19) foi depositado segundo o Tratado de Budapeste no National Measurements Institute (então denominado Australian Government Analytical Laboratories) como uma cultura seca congelada. As amostras foram reconstituídas depois de uma semana de armazenamento e foram consideradas viáveis.

[00046] O termo "passagem serial in vitro" se refere à prática de passagem repetida de bactérias em meio. Envolve inocular um meio de caldo com uma cultura bacteriana viva à qual em seguida se dá algum tempo para incubar na temperatura apropriada. Uma porção da cultura incubada é em seguida usada para inocular uma cultura estéril fresca à qual por sua vez se dá algum tempo para incubar. O ciclo continua para realizar o número desejado de passagens. Cada rodada de crescimento e re-inoculação é referida como uma única passagem.

[00047] O terceiro aspecto proporciona uma vacina compreendendo a cepa bacteriana do primeiro aspecto e um veículo tal como meio de crescimento de M. hyopneumoniae, água estéril ou salina isotônica estéril.

[00048] Uma vacina é uma preparação biológica que estabelece ou melhora a imunidade contra uma doença em particular. As vacinas podem ser profiláticas (por exemplo, para prevenir ou melhorar os efeitos de uma futura infecção pelo patógeno), ou terapêuticas (por exemplo, para tratar a infecção). A vacina do segundo aspecto é profilática para uma doença causada por Mycoplasma hyopneumonia.

[00049] O veículo apropriado será evidente para aqueles versados na ténica e dependerá em grande parte da via de administração. A vacina pode compreender adicionalmente um ou mais ingredientes adicionais incluindo, mas não limitados a, agentes de suspensão, estabilizantes, ou dispersantes. Ainda componentes adicionais que podem estar presentes na vacina são adjuvantes, preservantes, estabilizantes químicos, ou outras proteínas antigênicas. Tipicamente, estabilizantes, adjuvantes, e preservantes são otimizados para determinar a melhor formulação para eficácia no animal alvo. Exemplos de preservantes adequados incluem sorbato de potássio de clorobutanol, ácido sórbico, dióxido de enxofre, propil galato, os parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, e paraclorofenol. Ingredientes estabilizantes adequados os quais podem ser usados incluem, por exemplo, casaminoácidos, sacarose, gelatina, vermelho fenol, N-Z amina, monopotássio difosfato, lactose, hidrolisado de lactalbumina, e leite em pó. Um adjuvante convencional é usado para atrair leucócitos ou reforçar uma reação imune. Os adjuvantes referidos incluem, entre outros, MPL.TM. (monofosforil lipídeo A 3-O-deacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), óleo mineral e água, hidróxido de alumínio, Amphigen, Avridine, L121/esqualeno, D-lactida-polilactida / glicosídeo, plióis plurônicos, dipeptídeo muramil, Bordetella mortos, saponinas, tais como Quil A ou Stimulon.TM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.) e toxina do cólera (quer em uma forma selvagem ou mutante, por exemplo, em que o ácido glutâmico na posição do aminoácido 29 é substituído por outro aminoácido, preferencialmente uma histidina, de acordo com o Requerimento de Patente Internacional No. PCT/US99/22520).

[00050] Em uma modalidade, a vacina, caso injetada, tem pouca ou nenhuma reação adversa ou indesejada no local da injeção, por exemplo, irritação da pele, tumefação, rash, necrose, sensibilização da pele.

[00051] A invenção em um quarto aspecto se refere a proteção contra doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae. A vacina do terceiro aspecto é profilática para uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae.

[00052] "Profilaxia" ou terapia "profilática" ou "preventiva" ou "proteção contra" conforme referido aqui, neste requerimento de patente, inclui evitar que a infecção ocorra ou impedir ou defender ou proteger contra a ocorrência ou gravidade de uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae, incluindo prevenir, proteger ou reduzir a gravidade de um sintoma ou característica da doença em um sujeito que pode ser predisposto à doença, mas ainda não tenha sido diagnosticado como tendo a doença. Também inclui reduzir o período de infecção ou incidência de sintomas e reduzir o tamanho de quaisquer lesões.

[00053] "Profilaxia" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, cobre prevenção total da doença ou uma redução na extensão ou nos sintomas da doença. Também se refere à redução ou inibição da transmissão de Mycoplasma hyopnemonia ou evitar que as bactérias se estabeleçam no hospedeiro ou proteção contra infecção secundária com outras cepas de Mycoplasma hyopnemonia ou outros agentes infecciosos.

[00054] A vacina do terceiro aspecto pode ser preparada para administração a porcos sob a forma de, por exemplo, líquidos, pós, aerosóis, comprimidos, cápsulas, cápsulas ou comprimidos com revestimento entérico, ou supositórios. As vias de administração incluem, sem limitação, administração parenteral, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intradérmica, administração oral, administração tópica, administração intranasal, administração intra-pulmonar, administração retal, administração vaginal, e semelhantes.

[00055] Em uma modalidade preferencial a vacina é formulada para administração no trato respiratório, por exemplo por administração intranasal, administração por aerossol ou administração por inalação pela boca ou focinho. Esta via de administração é preferencial porque a natureza da imunidade preventiva para M. hyopneumoniae pode ser imunidade local (pulmonar) e imunidade mediada por células em prevenção da doença ao invés de anticorpos circulantes. A apresentação da vacina ao trato respiratório pode estimular uma reação imune local. Portanto pode ser mais eficaz a administração localizada da vacina. Além disso, administrar a vacina em um espaço ou celeiro fechado (administração em massa por pulverização de gota grossa) e deixar que os porcos a inalem, reduz a mão-de-obra envolvida na vacinação de grandes números de animais. Atualmente vacinação por aerossol (ou vacinação por pulverização) é usada em bases comerciais para vacinar de modo eficaz aves domésticas contra algumas doenças e foi demonstrado em nossos exemplos que é adequada para vacinação de porcos.

[00056] Administração intranasal cobre qualquer administração através das passagens nasais ou focinho. A vacina pode ser aplicada à cavidade nasal como uma solução, suspensão ou pó seco. Soluções e suspensões podem ser administradas por via intranasal usando, por exemplo, uma pipeta, um conta-gotas ou um spray, opcionalmente um spray de aerossol. Pós secos podem ser administrados por via intranasal por inalação.

[00057] Administração por aerossol se refere a administração da vacina como uma suspensão de partículas sólidas finas ou gotículas líquidas em um gás.

[00058] Inalação (também conhecida como inspiração) é o movimento de ar a partir do ambiente externo, através das vias aéreas, para dentro dos alvéolos nos pulmões.

[00059] Uma dose eficaz de vacina a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, dos objetivos terapêuticos, da via de administração, e da condição do porco.

[00060] Os níveis de dosagem para a vacina geralmente serão da ordem de cerca de 104 a 108 unidades de mudança de cor (CCU) por mL por dose, e preferencialmente cerca de 105 a 107 CCU por mL por dose.

[00061] No entanto, será entendido que o nível de dose específico para qualquer animal porcino em particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo, a dieta, a hora de administração e a via de administração.

[00062] A seleção e o ajuste para cima ou para baixo da dose eficaz estarão dentro do conhecimento da técnica.

[00063] Em uma modalidade preferencial a vacina é administrada por via intranasal, por aerossol ou por inalação.

[00064] Os termos "porco" e "suíno" são usados aqui, neste requerimento de patente, de modo intercambiável e se referem a leitões, porcas, leitoas, suínos mchos castrados, javalis e membros da família Suidae.

[00065] Do início ao fim deste relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de modo diverso, a palavra "compreendem", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida implicando a inclusão de um elemento ou inteiro determinado ou grupo de elementos ou inteiros mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou inteiro ou grupo de elementos ou inteiros.

[00066] Também deve ser observado que, conforme usado na especificação em questão, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem aspectos plurais a menos que o contexto claramente determine de modo diverso.

[00067] Será evidente para as pessoas versadas na técnica que apesar da invenção ter sido descrita em alguns detalhes para os fins de clareza e entendimento, várias modificações e alterações às modalidades e aos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, podem ser feitas sem se afastar do âmbito do conceito da invenção revelado nesta especificação.

[00068] A invenção é agora adicionalmente descrita em detalhes por meio de referência ao seguinte exemplo. O exemplo é proporcionado para fins de ilustração somente, e não se pretende que seja limitante a menos que especificado de modo diverso. Portanto, a invenção engloba quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes em consequência do ensinamento proporcionado aqui, neste requerimento de patente.

Exemplo 1: Preparação da Cepa de Vacina

[00069] O isolado LKR de Mycoplasma hyopneumoniae Australiano é uma amostra de abatedouro de pulmão de porco apresentando doença pneumonia enzoótica típica (Lloyd e Etheridge (1981), J. Comp. Path. 91:77-83). O isolado foi cultivado e armazenado na compilação de cultura de referência de Mycoplasma na University of Adelaide, Sul da Austrália. Uma cultura deste isolado foi em seguida obtida pelo grupo do Mycoplasma na University of Melbourne, Victoria.

[00070] A cultura foi passada in vitro três vezes antes de ser submetida a mutagênese usando N-Metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) a 200mg/mL usando um método descrito previamente (Nonamura e Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775). Em resumo, uma cultura de cepa LKR de M. hyopneumoniae foi cultivada até fase de log final e peletizada por centrifugação. As células foram lavadas em salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a NTG. As células foram peletizadas e ressuspendidas em meio Friis modificado (Friis, N.F. 1975) e incubados a 33°C por 4 h. A cultura foi em seguida passada através de um filtro de 0,45 µm, foram feitas diluições apropriadas e alíquotas foram colocadas sobre lâminas de agar e incubadas a 33°C. Colônias que cresceram foram clonadas em 3 mL de caldo e incubadas a 33°C. Ampolas dos clones foram armazenadas a -70°C e a sensibilidade à temperatura de cada clone foi determinada.

[00071] A sensibilidade à temperatura de ts19 foi determinada realizando uma titulação em duplicata e incubação a 33°C e 39,5°C. O título é tipicamente >1 x 108 CCU/mL a 33°C e <1 x 102 CCU/mL a 39,5°C.

[00072] A cepa ts19 foi depositada segundo o Tratado de Budapeste como NM 04/41259.

[00073] A cepa ts19 e a cepa LKR foram sequenciadas usando técnicas de rotina, deste modo possibilitando que a cepa atenuada fosse caracterizada geneticamente. Foi visto que a cepa ts19 continha uma série de mutações genéticas comparada com sua cepa mestre e os genes contendo estas mutações estão identificados na Tabela 1.

Exemplo 2: Preparação da Vacina

[00074] Para preparar uma vacina, uma cultura de ts19 foi cultivada a 33°C em meio Friis modificado contendo vermelho fenol (indicador de pH) até ser observada uma mudança da cor do ácido. A vacina foi titulada em meio Friis modificado usando uma lâmina de microtítulo de 96 cavidades. Uma série de dez vezes de diluições foi realizada através das primeiras 10 das 12 colunas da lâmina de microtítulo. As últimas duas alamedas permaneceram não inoculadas e serviram como um controle de meio somente (negativo). Foram usadas até seis lâminas de microtítulo em cada titulação.

[00075] Depois de incubação até 3 semanas as lâminas foram classificadas por mudança de cor e o título médio foi determinado usando o número mais provável (NMP). O título médio final é expressado como unidades de mudança de cor (CCU) por mL.

[00076] A cultura de vacina ts19 foi mantida em armazenamento de longo prazo como um formato "congelado a úmido" em -70°C a -80°C. Alternativamente, a cultura de vacina ts19 foi liofilizada (secada por congelamento) e mantida em armazenamento de longo prazo a -20°C.

Exemplo 3: Estudo de de segurança da Vacina e colonização

[00077] Foi conduzido um estudo de modo a avaliar o perfil de segurança da cepa de vacina ts19. O esquema do estudo acarretou o uso de porcos de 6 semanas de idade obtidos de uma vara de porcos livre de Mycoplasma. O estudo foi conduzido segundo o nível de biossegurança PC2 na CSIRO (Commonwealth Serum Industry Research Organisation), Werribee, Victoria, Austrália. Um total de 20 porcos foram atribuídos aleatoriamente a dois grupos de 10 porcos cada (vide a Tabela 2).
Tabela 2: Estudo da segurança em cepa de vacina ts19.

[00078] A vacina foi liberada por via intranasal deste modo somente testando a segurança para apresentação mucosa da vacina. O Grupo 1 (controle não vacinado) e o Grupo 2 (porcos vacinados com alta overdose) foram mantidos por 59 dias para observação clínica (Tabela 2).

[00079] Todos os porcos neste estudo de segurança foram monitorados duas vezes ao dia para temperatura corporal retal iniciando um dia pré-vacinação assim como quatro dias pós-vacinação. Todos os porcos também foram monitorados para sinais respiratórios incluindo tosse, espirros, dispnéia e taquipnéia. Todos os porcos foram avaliados para lesões pulmonares microscópicas e macroscópicas. Lesões pulmonares macroscópicas foram avaliadas usando o método de Hannan et al, 1982. Além disso, amostras de esfregaços foram colhidas do focinho, pulmão e traquéia para fins de análise por PCR.

[00080] Porcos de cada grupo também foram testados 3 semanas pós vacinação para a presença de M. hyopneumoniae em suas cavidades nasais usando uma técnica de PCR. Finalmente, os porcos foram monitorados para ganho de peso durante o período do estudo.Os resultados mostraram que não foram observados sinais clínicos em quaisquer dos porcos. Não houve nenhum aumento significativo na temperatura detectado entre os grupos vacinados e o grupo controle não vacinado. Além disso, não foram vistas diferenças significativas no ganho de peso corporal entre os grupos vacinados e o grupo controle não vacinado. Na necrópsia, dois porcos de dez do gurpo de alta overdose tinha cada uma pequena lesão macroscópica típica de pneumonia enzoótica. Não foram observadas lesões adicionais por análise microscópica do tecido pulmonar. Sobretudo, a cepa de vacina sensível à temperatura ts19 se mostrou segura em mesmo em uma alta overdose.

[00081] Análise por PCR (usando primers específicos para M. hyopneumoniae) mostrou a presença de M. hyopneumoniae nas passagens nasais de porcos vacinados em 3 semanas e 8 semanas pós vacinação (vide a Figura 1). Estudos de colonização por M. hyopnuemoniae usando análise por PCR tamém mostraram a presença de M. hyopnuemoniae na traquéia (tanto nas regiões superior, média quanto inferior) e coletivamente em no mínimo 60% da traquéia dos porcos vacinados (vide a Figura 2). Estes resultados indicam colonização da cepa de vacina ts19 nas passagens nasais e traqueais.

Exemplo 4: Estudo da Eficácia da Vacina e Modelo de Estímulo -indicam proteção

[00082] Foi conduzido um estudo de modo a avaliar a eficácia da cepa de vacina ts19. O esquema do estudo acarretou o uso de porcos de 6 semanas de idade obtidos de uma vara de porcos livre de Mycoplasma. O estudo foi conduzido segundo o nível de biossegurança PC2 na CSIRO (Commonwealth Serum Industry Research Organisation), Werribee, Victoria, Austrália. Um total de 56 porcos foram atribuídos aleatoriamente a três grupos de 12 porcos para cada grupo vacinado e 10 porcos para cada um dos grupos de controle (vide a Tabela 3).

[00083] A vacina foi liberada por via intranasal deste modo somente testando a eficácia para apresentação mucosa da vacina. Todos os grupos exceto o grupo não estimulado, não vacinado, negativo, foram estimulados em 22 dias pós vacinação por administração intranasal de um isolado de campo Australiano de M. hyopneumoniae. Foram conduzidos exames post-mortem durante 3 dias (dias 57, 58 e 59 pós vacinação). Do início ao fim do estudo todos os grupos foram monitorados diariamente para sinais clínicos incluindo tosse, espirros, dispnéia e taquipnéia. Foram feitas medições do peso corporal no início e no fim do estudo.Em 22 dias pós vacinação (e antes do estímulo) esfregaços nasais foram colhidos para análise por PCR para determinar a presença de M. hyopneumoniae de cada grupo.

[00084] Os resultados msotraram que não foram observados sinais clínicos nem nenhuma diferença significativa no peso corporal em todos os grupos testados. Análise dos esfregaços nasais mostrou a presença de M. hyopneumoniae em 22 dias pós vacinação em 60 a 70% dos porcos vacinados pré-estímulo (vide a Figura 3). Todos os porcos controle pseudo -vacinados foram negativos para M. hyopneumoniae por análise por PCR. Na necrópsia, análise de lesões macroscópicas (Hannan et al., 1982) indicou a ausência de lesões no grupo controle pseudo -vacinado bem como no grupo vacinado a 106 e 107 CCU/mL/dose. Um de 10 porcos vacinados em uma dose de 108 CCU/mL/dose mostrou a presença de uma pequena lesão macroscópica. No entanto, 4 de 10 porcos os quais eram não vacinados porém estimulados apresentaram sinais clínicos de tosse e espirros. Na necrópsia, o exame dos pulmões dos quatro porcos apresentou lesões pulmonares macroscópicas típicas de infecção por M. hyopneumoniae.

[00085] Sobretudo, a cepa de vacina sensível à temperatura ts19 se mostrou eficaz na proteção contra infecção por M. hyopneumoniae.

Exemplo 5: Eficácia da Vacina em diferentes doses e comparação com uma vacina morta comercial.

[00086] Um estudo foi conduzido de modo a avaliar a eficácia da cepa de vacina ts19 em quatro doses diferentes. O esquema do estudo acarretou o uso de porcos spf de 3 a 4 semanas de idade. O estudo foi conduzido em uma instalação PC2 no Centro de Nacional de Servicios de Diagnostico en Salud Animal (CENASA) - uma instalação de testes governamentais em Tecamac, México. Um total de 70 porcos foram atribuídos aleatoriamente a sete grupos, cada um contendo 10 porcos (Tabela 4).

a A vacina foi liberada por spray intranasal b A vacina foi liberada por administração intramuscular

[00087] Quatro doses diferentes de vacina ts19 (103, 104, 105, 106 CCU/mL) foram liberadas para quatro grupos de porcos separados por via intranasal. Um quinto grupo recebeu 2 mL de uma vacina inativada comercial liberada por via intramuscular. Também foram incluídos grupos positivos (não vacinados porém estimulados) e negativos (não vacinados, não estimulados) neste estudo. Todos os grupos exceto o grupo de controle negativo foram estimulados em dois momentos. O primeiro estímulo foi conduzido em 22 dias pós vacinação por administração intranasal usando um isolado americano de M. hyopneumoniae (IOWA cepa 194). O segundo estímulo foi conduzido em 84 dias pós vacinação usando a mesma cepa de estímulo. Do início ao fim do estudo todos os grupos foram monitorados diariamente para clínicos incluindo tosse, espirros, dispnéia e taquipnéia. Foram tomadas medições do peso corporal no início e no fim do estudo.

[00088] Os resultados não mostraram sinais clínicos durante todo o período de teste de 105 dias. Análise da variância para performance de peso entre o grupo controle positivo e cada um dos grupos vacinados indicou que ts19 em doses de 105 e 106 CCU/mL apresentou significativo ganho de peso corporal comparado com o grupo controle positivo (Figura 4). O grupo vacinado com a vacina comercial não apresentou qualquer diferença significativa em ganho de peso comparado com o grupo controle positivo (Figura 4, Tabela 5). Na necrópsia, foi realizada análise das lesões macroscópicas para cada grupo. O critério para determinação da mínima dose preventiva foi baseado em um índice de proteção de >70% com respeito à redução na gravidade das lesões pulmonares. A mínima dose preventiva para ts19 foi determinada como 104 CCU/mL uma vez que um índice de proteção de 70% foi obtido nesta dose com respeito à redução na gravidade das lesões pulmonares (Figura 5). Maiores doses de ts19 (105 e 106 CCU/mL) também foram testadas e foi visto que proporcionam PIs de 83% e 88% respectivamente relativos a redução na gravidade das lesões pulmonares (Figura 6). A vacina inativada comercial atingiu um PI de somente 37% o qual é bem abaixo da menor dose de ts19 usada (103 CCU/mL que atingiu um PI de 60%). Tabela 5: Análise da Variância do ganho de peso médio de grupos vacinados comparados com o grupo controle positivo em DPV-104/105

[00089] Doses de ts19 (ccu/mL). Nenhuma diferença significativa (P>0,05), diferença significativa (P<0,05).

Claims (10)

1. Cepa de vacina de Mycoplasma hyopneumoniae, caracterizada pelo fato de que é tal como depositada no Instituto Nacional de Medidas (National Measurements Institute - Australia), sob o número de acesso NM04/41259, a referida cepa sendo sensível à temperatura e atenuada.
2. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a cepa de Mycoplasma hyopneumoniae como definida na reivindicação 1 e um veículo, opcionalmente um adjuvante, e/ou opcionalmente no mínimo um agente infeccioso adicional, a dita vacina em uma quantidade imunizante é capaz de provocar imunidade preventiva contra uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae.
3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o agente infeccioso é um vírus, uma bactéria, um fungo ou um parasita.
4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3 formulada para administração no trato respiratório.
5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3 em formulação de aerossol.
6. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção uma doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae em um animal porcino.
7. Vacina para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é administrada por inalação, por via intranasal ou através de um aerossol.
8. Método de produzir a vacina como definida na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende combinar a cepa de Mycoplasma hyopneumoniae como definida na reivindicação 1 com um veículo, opcionalmente um adjuvante e/ou opcionalmente no mínimo um agente infeccioso adicional.
9. Uso da cepa de Mycoplasma hyopneumoniae como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para prevenir doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae em um animal porcino.
10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, ou uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae é pneumonia enzoótica ou pneumonia micoplásmica suína.

Images