BRPI1010868B1 - Composição compreendendo um virion de aav recombinante, e uso do referido vírion - Google Patents

Abstract

TERAPIA GÊNICA PARA DISTÚRBIOS NEURODEGENERATIVOS. A presente invenção refere-se a composições e a métodos para tratar distúrbios que afetam a função motora, tal como a função motora afetada por doença ou lesão no cérebro e/ou medula espinhal. Também são descritos um vetor de vírus adenoassociado autocomplementar para tratar doenças do neurônio motor tal como atrofia muscular espinhal, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal bulbar, ataxia espinocerebelar, esclerose lateral primária e lesão traumática da medula espinhal.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) dos Pedidos Provisórios Nos. 61.174/982, depositado em 2 de maio de 2009 e 61/268.059 depositado em 8 de junho de 2009, pedidos que são incorporados integralmente no presente por referência.

Campo da Técnica

[0002] A presente invenção refere-se geralmente a métodos de distribuição gênica. Em particular, a invenção refere-se a composições e métodos para tratar distúrbios que afetam a função motora, tal como a função motora afetada pela doença ou lesão no cérebro e/ou medula espinhal.

Descrição da Invenção

[0003] A terapia gênica é uma modalidade de tratamento de emergência para distúrbios que afetam o sistema nervoso central (SNC). A terapia gênica do SNC foi facilitada pelo desenvolvimento de vetores virais capazes de infectar efetivamente neurônios pós-mitóticos. O sistema nervoso central é constituído da medula espinhal e do cérebro. A medula espinhal conduz informação sensorial do sistema nervoso peri-férico ao cérebro e conduz informação motora do cérebro a vários efe- tores. Para uma revisão dos vetores virais para a distribuição gênica ao sistema nervoso central, ver Davidson e outros, Nature Rev. (2003) 4: 353 a 364.

[0004] Os vetores de vírus adenoassociado (AAV) são considerados úteis para a terapia gênica do SNC porque eles têm perfil de toxicidade e imunogenicidade favorável, são capazes de transduzir células neuronais, e são capazes de mediar a expressão em longo prazo no SNC (Kaplitt e outros, Nat. Genet. (1994) 8: 148 a 154; Bartlett e outros, Hum. Gene Ther. (1998) 9: 1181 a 1186; e Passini e outros, J. Neurosci. (2002) 22: 6437 a 6446).

[0005] Uma propriedade útil de vetores de AAV está na capacidade de alguns vetores de AAV passarem por transporte retrógrado e/ou anterógrado em células neuronais. Os neurônios em uma região do cérebro são interconectados por axônios a regiões distais do cérebro fornecendo desse modo um sistema de transporte para distribuição de vetor. Por exemplo, um vetor de AAV pode ser administrado nos ter-minais de axônio de neurônios ou próximo a eles. Os neurônios inter-nalizam o vetor de AAV e o transportam de uma maneira retrógrada ao longo do axônio ao corpo da célula. Propriedades similares de adeno-virus, HSV, e vírus da pseudorraiva revelaram distribuiçãor genes a estruturas distais dentro do cérebro (Soudas e outros, FSAEB J. (2001) 15: 2283 a 2285; Breakefield e outros, New Biol. (1991) 3: 203 a 218; e deFalco e outros, Science (2001) 291: 2608 a 2613).

[0006] Vários experimentos relataram que a transdução do cérebro por AAV sorotipo 2 (AAV2) é limitada ao sítio de injeção intracraniana (Kaplitt e outros, Nat. Genet. (1994) 8: 148 a 154; Passini e outros, J. Neurosci. (2002) 22: 6437 a 6466; e Chamberlin e outros, Brain Res. (1998) 793: 169 a 175). Há também evidência de que o transporte axonal retrógrado de vetores virais neurotróficos, incluindo vetores de AAV e lentivirais, pode também ocorrer em circuitos selecionados do cérebro de ratos normais (Kaspar e outros, Mol. Ther. (2002) 5: 50 a 56; Kasper e outros, Science (2003) 301: 839 a 842 e Azzouz e outros, Nature (2004) 429: 413 a 417. Roual e outros, Nat. Med. (2005) 11(4): 423 a 428 e Ralph e outros, Nat. Med. (2005) 11(4): 429 a 433 relatam que a injeção intramuscular de lentivírus expressando o início de doença retardada por RNA interferente de superóxido dismutase (SOD1) Cu/Zn humano silencioso de esclerose lateral amiotrófica (ALS) em um modelo de roedor terapeuticamente relevante de ALS.

[0007] As células transduzidas por vetores de AAV podem expres sar um produto transgênico terapêutico, tal como uma enzima ou um fator neurotrófico, para mediar efeitos benéficos intracelularmente. Essas células podem também secretar o produto transgênico terapêutico, que pode ser subsequentemente absorvido por células distais em que ele media seus efeitos benéficos. Esse processo foi descrito como correção cruzada (Neufeld e outros, Science (1970) 169: 141 a 146).

[0008] Uma propriedade dos vetores de AAV recombinante descritos acima é a exigência de que o genoma de AAV cm DNA de único filamento (ssDNA) precisa ser convertido em DNA de filamento duplo (dsDNA) antes da expressão do transgene codificado. Essa etapa pode ser evitada pelo uso de vetores autocomplementares que agrupam um genoma de repetições invertidas que se desdobra em dsDNA, sem exigir a síntese de DNA ou pareamento das bases entre múltiplos ge- nomas de vetor, aumentando desse modo a eficiência da transferência genica mediada por AAV. Para uma revisão de vetores de AAV auto-complementares, ver, por exemplo, McCarty, D. M. Molec. Ther. (2008) 16: 1648 a 1656.

[0009] A atrofia muscular espinhal (SMA) é um distúrbio neuromuscular autossômico recessivo causado por mutações no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1) e perda da proteína SMN codificada (Lefebvre e outros, Cell (1995) 80: 155 a 165). A ausência de SMN resulta em degeneração do neurônio motor no corno ventral (anterior) da medula espinhal, que leva ao enfraquecimento dos músculos proximais responsáveis pelo engatinhar, andar, controle do pescoço e pela deglutição, e dos músculos involuntários que controlam a respiração e a tosse (Summer C. J., NeuroRx (2006) 3: 235 a 245). Consequentemente, pacientes com SMA apresentam tendências au-mentadas à pneumonia e outros problemas pulmonares tal como doença restritiva do pulmão. O início da doença e o grau de severidade são determinados em parte pelo gene modificador fenotípico SMN2, que é capaz de fazer uma pequena quantidade de SMN (Monani e ou-tros, Hum. Mol. Genet. (1999) 8: 1177 a 1183; Lorson e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1999) 96: 6307 a 6311). Assim, os pacientes com um alto número de cópias de SMN2 (3 a 4 cópias) exibem uma forma menos severa da doença (referida como Tipos II ou III), em que 1 a 2 cópias de SMN2 tipicamente resultam na doença Tipo I mais severa (Campbell e outros, Am. J. Hum. Genet. (1997) 61: 40 a 50; Lefebvre e outros, Nat. Genet. (1997) 16: 265 a 269). Atualmente, não há terapias eficazes para SMA.

[00010] Uma estratégia fundamental para tratar esse distúrbio mo- nogênico é aumentar os níveis de SMN em pacientes com SMA. Uma abordagem para alcançar isso é modular o gene SMN2 endógeno com pequenas moléculas que ativam o promotor SMN2 ou corrigem o padrão de recomposição pré-nRNA de SMN2. A alteração da recomposição de SMN2 também pode ser realizada com oligonucleotídeos antis- senso e RNAs trans-recomposição. Entretanto, enquanto modular SMN2 in vitro aumentou os níveis de SMN e reconstituiu gemas nucleares em linhagens de células de SMA, estudos de eficácia com fárma- cos de pequenas moléculas não se traduziram em aprimoramentos mensuráveis na clínica (Oskoui e outros, Nerotherapeutics (2008), 5: 499 a 506).

Sumário da Invenção

[00011] A presente invenção é baseada na descoberta de que ambos os virions de AAV recombinante (rAAV) convencionais, bem como vetores de AAV autocomplementares recombinante (scAAV), são capazes de distribuiçãor genes ao SNC com expressão bem sucedida no SNC e tratamento de doença neurodegenerativa. Essa abordagem de terapia para a distribuição de genes codificando moléculas terapêuticas que resultam em correção ao menos parcial de neuropatologias fornece um método altamente desejável para tratar uma variedade de distúrbios neurodegenerativos, incluindo SMA.

[00012] Assim, em uma modalidade, a invenção é direcionada a um vetor de vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV) compreen-dendo um polinucleotídeo codificando uma proteína que modula a fun-ção motora em um indivíduo com uma doença do neurônio motor. Em certas modalidades, a doença do neurônio motor é selecionada a partir de atrofia muscular espinhal (SMA), esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular espinhal bulbar, ataxia espinocerebelar, esclerose lateral primária (PLS), ou lesão traumática da medula espinhal.

[00013] Em modalidades adicionais, o polinucleotídeo presente no vetor de scAAV codifica uma proteína da sobrevivência do neurônio motor (SMN). Em certas modalidades, a proteína SMN é SMN-1 humana. Em modalidades adicionais, a SMN-1 compreende uma sequência de aminoácido com ao menos 90% de identidade de sequência com a sequência representada na figura 9B. Em modalidades adicionais, o SMN-1 compreende uma sequência de aminoácido como representada na figura 9B.

[00014] Em ainda modalidades adicionais, a invenção é direcionada a um virion de AAV recombinante, compreendendo um vetor de scAAV como descrito acima.

[00015] Em modalidades adicionais, a invenção é direcionada a uma composição que compreende um vírion de AAV recombinante como acima e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00016] Em modalidades adicionais, a invenção é direcionada a um método para modular a função motora em um indivíduo com uma do-ença do neurônio motor compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição acima às células do indivíduo. Em certas modalidades, a composição é administrada às células in vitro para transduzir as células, e as células transduzidas são administradas ao indivíduo. Em modalidades alternativas, a composição é administrada às células in vivo.

[00017] Em modalidades adicionais, a invenção é direcionada a um método para fornecer uma proteína SMN a um indivíduo com atrofia muscular espinhal (SMA) compreendendo administrar um vírion de AAV recombinante compreendendo um vetor de AAV como descrito acima às células de um indivíduo em necessidade desse tratamento. Em certas modalidades, a composição é administrada às células in vitro para transduzir as células, e as células transduzidas são administradas ao indivíduo. Em modalidades alternativas, a composição é administrada às células in vivo.

[00018] Em cada um dos métodos acima, a composição pode ser administrada via injeção na medula espinhal. Em outras modalidades, a composição é administrada em um ventrículo lateral cerebral. Em certas modalidades, a composição é administrada em ambos os ventrículos laterais cerebrais. Em outras modalidades, a composição é administrada tanto via injeção intracerebroventricular quando via injeção direta na medula espinhal. Em modalidades adicionais, a composição é administrada por injeção intratecal.

[00019] Essas e outras modalidades da invenção ocorrerão prontamente aos versados na técnica em vista desta descrição.

Breve Descrição dos Desenhos

[00020] A figura 1 mostra a sobrevida de camundongos tratados com AAVhSMNI versus camundongos com SMA não tratados. O tratamento com AAVhSMNI aumentou a sobrevida de camundongos com SMA. Os camundongos com SMA não tratados (n = 34, círculos abertos) tiveram uma vida média de 15 dias. Os camundongos com SMA tratados em P0 com AAVhSMNI (n = 24, círculos fechados) tiveram uma vida média de 50 dias (p < 0,0001), que foi um aumento de +233% na longevidade.

[00021] As figuras 2A a 2C mostram o efeito do tratamento com te- rapia gênica em niveis de SMN na medula espinhal. São mostrados níveis de proteína hSMN em segmentos lombares (figura 2A), torácico (figura 2B) e cervicais (figura 2C) comparados a camundongos de ocorrência natural e com SMA não tratados. "Western blots” foram executados nos segmentos lombares, torácicos e cervicais da medula espinhal em 16, 58 a 66 e 120 a 220 dias após a injeção. Os "western blots” dos três segmentos foram quantificados e, para controlar os níveis de proteína, SMN foi normalizado para β-tubulina e plotados como uma porcentagem de camundongos de ocorrência natural de mesma idade. Abreviações (e valores n): SMA, camundongos modificados ge-neticamente não tratados (n = 5 em 16 dias); AAV, camundongos com SMA tratados AAV8-hSMN (n = 7 em 16 dias, n = 5 em 58 a 66 dias); scAAV, camundongos com SMA tratados com scAAV8-hSMN (n = 5 em cada ponto no tempo). Os valores representam a média ± SEM.

[00022] As figuras 3A a 3J mostram a distribuição subcelular de proteína hSMN e a expressão em neurônios motores na medula espinhal em camundongos com SMA tratados e não tratados. A proteína hSMN foi abundantemente detectada no citoplasma de células transduzidas (figu-ras 3A e 3B). Ademais, a proteína hSMN foi detectada no núcleo, como ilustrado pelo par de estruturas similares à gema (seta) aumentadas no inseto (figura 3A). A proteína hSMN foi também detectada nos dendritos (figuras 3B e 3C) e axônios (figura 3D) de neurônios. A proteína hSMN não foi detectada nas seções de tecido de camundongos com SMA não tratados (figura 3E). A colocalização da proteína hSMN (figura 3F) com ChAT de camundongos (figura 3G) mostrou que um subconjunto de células transduzidas foi neurônios motores (figuras 3H e 3I). A porcentagem de células ChAT que foram imunopositivas para proteína hSMN foi determinada em 16 (barras brancas) e 58 a 66 (barras pretas) dias (figura 3J). Os valores representam a média ± SEM.

[00023] A figura 4 mostra contagens de células de neurônios moto- res na medula espinhal em camundongos com SMA tratados e não tratados. São mostrados os números médios de neurônios imunoposi- tivos para a ChAT contados em seções de tecido de 10 μm para cada grupo. Os números representam contagens de cada décima seção a partir de diferentes níveis dos segmentos cervicais, torácicos e sacrais. Os valores representam a média ±SEM. Abreviações: *, p < 0,05; **, p <0,01;***, p< 0,001.

[00024] As figuras 5A a 5C mostram a área transversal das miofi- bras de grupos musculares em camundongos com SMA tratados e não tratados. A área transversal de miofibras de múltiplos grupos musculares foi aumentada com tratamento com AAVhSMNI. Os gráficos so-brepostos dos músculos dos quadriceps, gastrocnêmio e intercostais de 16 (figura 5A) e 58 a 66 (figura 5B) dias mostraram que a distribuição de tamanhos das miofibras foi similar entre os camundongos de ocorrência natural e com SMA tratados. A média geral em 16 dias mostrou que a área transversal das miofibras foi significativamente maior do que com tratamento (figura 5C). Ademais, em 58 a 66 dias, a área média foi estatisticamente similar entre camundongos com SMA tratados e os de ocorrência natural de mesma idade nos músculos gastrocnêmio e intercostal (figura 5C). Os valores representam a média ± SEM. Abreviações: WT, camundongos de ocorrência natural não tratados; HET, heterozigoto não tratado; SMA, camundongos modificados geneticamente não tratados; AAV, camundongos com SMA tratados com AAVhSMNI; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

[00025] As figuras 6A a 6F mostram a estrutura da NMJ em músculos em camundongos com SMA tratados e não tratados. A estrutura nos músculos dos quadriceps, grastrocnêmio e intercostais foi aprimorada com terapia gênica. São mostrados a junção neuromuscular (NMJ) dos quadriceps de SMA não tratada (figura 6A), camundongos com SMA tratados (figura 6B), a camundongos de ocorrência natural não tratados (figura 6C) em 16 dias, e de camundongos com SMA tra-tados (figura 6D) e camundongos de ocorrência natural não tratados (figura 6E) em 58 a 66 dias. A NMJ pré e pós-sináptica foi marcada com um anticorpo de neurofilamento (verde) e com coloração com a- bungarotoxina (vermelho), respectivamente. A seta no painel principal aponta para a NMJ que é destacada nos insetos abaixo. Ao menos 100 NMJs foram aleatoriamente pontuadas em cada músculo por animal. Uma NMJ normal foi definida como tendo um término pré- sináptico que não exibiu o acúmulo anormal de proteína de neurofilamento mostrado na figura 6A. Os valores na figura 6F representam a média ± SEM. Abreviações: WT, camundongos de ocorrência natural não tratados; HET, heterozigoto não tratado; SMA, camundongos modificados geneticamente não tratados; AAV, camundongos com SMA tratados com AAVhSMNI; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001. Barras de escala: 20 μm.

[00026] As figuras 7A a 7F mostram os resultados de testes compor- tamentais em camundongos com SMA tratados e não tratados. Os ca-mundongos com SMA tratados mostram aprimoramentos significativos nos testes comportamentais. Os camundongos com SMA tratados (aste-risco) e de ocorrência natural não tratados (WT) eram substancialmente mais saudáveis do que os camundongos com SMA não tratados (cha-mados ‘x’) em 16 dias (figura 7A). Os camundongos com SMA tratados eram também significativamente mais pesados do que os controles com SMA não tratados do dia 11 em diante (figura 7B). Os camundongos com SMA tratados obtiveram desempenho significativamente melhor do que os camundongos com SMA não tratados nos testes de reflexo postural (figura 7C), geotaxia negativa (figura 7D), força de agarrar (figura 7E) e atrofia nas patas traseiras (figura 7F). Os camundongos com SMA tratados foram estatisticamente idênticos aos camundongos de ocorrência natural e heterozigotos nos testes de reflexo postural e de geotaxia nega- tiva em 12 a 16 dias (figuras 7C e 7D). Os valores representam a média ± SEM. Abreviações: WT não tratado (círculo aberto), heterozigoto não tratado (triângulo aberto); SMA não tratado (quadrado aberto); camun-dongos com SMA tratados com AAVhSMNI (quadrado fechado); *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

[00027] A figura 8 mostra a sobrevida de camundongos não tratados e tratados com scAAVhSMNI. O tratamento com scAAVhSMNI aumentou a sobrevida em camundongos com SMA. Os camundongos com SMA tratados em P0 com scAAVhSMNI (n = 17, triângulos fechados) tiveram uma vida média de 157 dias (p < 0,0001), comparada a 16 dias em camundongos com SMA não tratados (n = 47, círculos abertos).

[00028] As figuras 9A a 9B (SEQ ID NOS: 1 e 2) mostraram a sequência de DNA de codificação (figura 9A) e a sequência de aminoá- cido correspondente (figura 9B) de um gene de sobrevivência de neurônio motor (SMN1) humano representativo.

[00029] As figuras 10A a 10F mostram que a expressão de scA- AV8-hSMN aumenta as contagens de neurônio motor e aprimora a NMJ em camundongos com SMA. A figura 10A mostra a porcentagem de células imunopositivas para mChAT que estão colocalizadas com a expressão de hSMN na região torácica-lombar em 16 dias pós-injeção. As figuras 10B a 10F mostram os números médios de células imunopositivas para mChAT nos segmentos lombares (figura 10B), torácicos (figura 10C) e cervicais (figura 10D), e as porcentagens médias de NMJs contraídas nos quadriceps (figura 10E) e músculos intercostais (figura 10F) em 16, 58 a 66 e 214 a 269 dias. Como uma referência para as figuras 10E e 10F, 75 a 90% da NMJ nos quadriceps e músculos intercostais de camundongos com SMA não tratados continham uma estrutura contraída aberrante em 16 dias (ver figura 6F). Abreviações e valores n: SMA, camundongos modificados geneticamente não tratados (barras abertas, n = 8 em 16 dias), AAV, AAV8-hSMN (barras fechadas, n = 5 em cada ponto no tempo); WT, WT não tratados (barras quadriculadas, n = 8 em 16 dias, n = 5 cada em 58 a 66 dias e 216 a 269 dias). Os valores representam a média ± SEM. Comparações estatísticas foram executadas com múltiplos testes post hoc ANOVA de um fator e Bonferroni em 16 dias (figuras 10B a 10F). O teste t de Student bilateral não pareado comparou (1) os dois vetores entre si em 16 dias (figura 10A) e 58 a 66 dias (figuras 10B a 10D); (2) o número relativo de células ChAT em grupos de 58 a 66 dias e 214 a 269 dias com tratamento com scAAV8-hSMN (figuras 10B a 10D); (3) o número relativo de NMJs anormais entre os camundongos WT não tratados de mesma idade e camundongos com SMA tratados com scAAV8-hSMN em 214 a 269 dias (E, F); * p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Descrição Detalhada da Invenção

[00030] A prática da presente invenção empregará, a menos que de outra forma indicado, métodos convencionais de química, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e imunologia. Tais técnicas são expli-cadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, Fundamental Virology, 2a Edição, vol. I e II (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds); Hand-book of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T. E. Creighton, Pro-teins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Com-pany, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edição atual); Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1989); Methods In Enzymology (S. CoIowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

[00031] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados aqui, se acima ou abaixo, são incorporados integralmente por referência no presente.

1. Definições

[00032] Ao descrever a presente invenção, os seguintes termos serão empregados, e são destinados a serem definidos como indicado abaixo.

[00033] Deve-se notar que, como usado nesta especificação e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um”, "uma” e "o”, "a” incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo dite claramente de outra forma. Assim, por exemplo, referência a "receptor de interleuci- na” inclui uma mistura de dois ou mais tais receptores, e similares.

[00034] Os termos "polipeptídeo” e "proteína”, usados de forma in- tercambiável no presente, ou uma sequência de nucleotídeo codificando os mesmos, se referem a uma sequência de nucleotídeo ou proteína, respectivamente, que representa ou uma sequência nativa, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma. As proteínas de comprimento integral, com ou sem a sequência sinal, e fragmentos das mesmas, bem como as proteínas com modificações, tal como dele- ções, adições e substituições (ou conservativas ou não conservativas por natureza), à sequência nativa, são destinadas para uso no presente, contanto que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagênese sítio-dirigida, ou podem ser acidentais, tal como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação PCR. Consequentemente, as proteínas ativas substancialmente homólogas à sequência de origem, por exemplo, proteínas com 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99%, etc. de identidade que retém a atividade desejada da molécula nativa, são observadas para uso no presente.

[00035] Um polipeptídeo "nativo”, tal como um polipeptídeo da so-brevivência do neurônio motor (SMN), refere-se a um polipeptídeo que tem a mesma sequência de aminoácido da molécula correspondente derivada da natureza. Tais sequências nativas podem ser isoladas da natureza ou podem ser produzidas por meios recombinantes ou sinté ticos. O termo sequência "nativa” abrange especificamente formas se- cretadas ou truncadas ocorrendo naturalmente da molécula específica (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes ocorrendo naturalmente (por exemplo, formas alternativamente re-compostas) e variantes alélicas ocorrendo naturalmente do polipeptídeo. Em várias modalidades da invenção, as moléculas nativas descritas no presente são sequências maduras ou nativas de comprimento total compreendendo as sequências de aminoácido de comprimento total mostradas nas figuras em anexo. Entretanto, enquanto algumas das moléculas descritas nas figuras em anexo começam com resíduos de metionina designados como posição de aminoácido 1 nas figuras, outros resíduos de metionina localizados ou a montante ou a jusante da posição de aminoácido 1 nas figuras podem ser empregados como o resíduo de aminoácido de partida para a molécula particular. Alterna-tivamente, dependendo do sistema de expressão usado, as moléculas descritas no presente podem carecer de uma metionina N-terminal.

[00036] Por "variante” entende-se um polipeptídeo ativo como definido no presente tendo ao menos 80% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência nativa de comprimento total, um polipep-tídeo com ausência de peptideo sinal, um domínio extracelular de um polipeptídeo, com ou sem um peptideo sinal, ou qualquer outro frag-mento de uma sequência de polipeptídeo de comprimento total como descrito no presente. Tais variantes de polipeptídeo incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados, ou deletados, no terminal N e/ou C da sequência de aminoácido nativa de comprimento total. Normalmente, uma variante terá ao menos aproximadamente 80% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 81% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 82% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 83% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 84% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 85% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 86% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 87% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 88% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 89% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 90% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 91% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 92% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 93% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 94% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 95% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 96% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 97% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 98% de identidade de sequência de aminoácido, alternativamente ao menos aproximadamente 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência nativa de comprimento total correspondente. Normalmente, os po- lipeptídeos variantes têm ao menos aproximadamente 10 aminoácidos de comprimento, tal como ao menos aproximadamente 20 aminoácidos de comprimento, por exemplo, ao menos aproximadamente 30 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 40 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 50 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 60 aminoácidos de comprimento, alterna-tivamente ao menos aproximadamente 70 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 80 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 90 ami-noácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 100 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 1500 aminoácidos de comprimento, alternativamente ao menos aproximadamente 200 aminoácidos de comprimento, al-ternativamente ao menos aproximadamente 300 aminoácidos de com-primento, ou mais.

[00037] As variantes particularmente preferenciais incluem substituições que são conservativas por natureza, isto é, aquelas substituições que acontecem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Especificamente, os aminoáci-dos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos - aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina e histidina; (3) não polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados - glicina, asparagina, glutami- na, cisteína, serina, treonina, tirosina. A fenilalanina, triptofano, e tiro- sina são às vezes classificados como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina por isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição conservativa similar de um aminoácido por outro estruturalmente relacionado, não tenha um efeito maior na atividade biológica. Por exemplo, o polipeptídeo de interesse pode incluir até aproximadamente 5 a 10 substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas, ou mesmo até aproximadamente 15 a 25 ou 50 substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas, ou qualquer número entre 5 e 50, contanto que a função desejada da molécula permaneça intacta.

[00038] "Homologia” refere-se à identidade percentual entre duas porções de polinucleotídeo ou duas porções de polipeptídeo. Duas se-quências de DNA, ou duas sequências de polipeptídeo são "substan-cialmente homólogas” entre si quando as sequências exibem ao menos aproximadamente 50%, preferencial mente ao menos aproximadamente 75%, mais preferencial mente ao menos aproximadamente 80 a 85%, preferencialmente ao menos aproximadamente 90%, e mais preferencialmente ao menos aproximadamente 95% a 98% de identi-dade de sequência ao longo de um comprimento definido das molécu-las. Como usado aqui, "substancialmente homólogas” também se refere às sequências que mostram identidade completa com a sequência de DNA ou de polipeptídeo especificada.

[00039] Em geral, "identidade” refere-se a uma correspondência exata de nucleotídeo com nucleotídeo ou aminoácido com aminoácido de duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeos, respectivamente. A identidade percentual pode ser determinada por uma comparação direta da informação de sequência entre duas moléculas ali- nhando-se as sequências, contando-se o número exato de correspondências entre as duas sequências alinhadas, dividindo-se pelo comprimento da sequência mais curta, e multiplicando-se o resultado por 100. Os programas de computador prontamente disponíveis podem ser usados para ajudar na análise, tal como ALIGN, Dayhoff, M. O. em Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3: 353 a 358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Advances in Appl. Math. 2: 482 a 489, 1981, para a análise de pepti- deos. Os programas para determinar a identidade de sequência de nucleotídeo estão disponíveis no Pacote de Análise de Sequência de Wisconsin, Versão 8 (disponível a partir de Genetics Computer Group, Madison, Wl), por exemplo, os programas BESTFIT, FSATA e GAP, que também contam com o algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas são prontamente utilizados com os parâmetros padrão re-comendados pelo fabricante e descritos no Pacote de Análise de Se-quência de Wisconsin mencionado acima. Por exemplo, a identidade percentual de uma sequência de nucleotideo particular com uma se-quência de referência pode ser determinada usando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela de escore padrão e uma penalização de buracos de seis posições de nucleotideo.

[00040] Outro método para estabelecer a identidade percentual no contexto da presente invenção é usar o pacote MPSRCH de programas protegidos por direito de autor pela Universidade de Edinburgh, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir desse grupo de pa-cotes, o algoritmo de Smith-Waterman pode ser empregado em que os parâmetros padrão são usados para a tabela de escore (por exemplo, penalização de abertura de buraco de 12, penalização de extensão de buraco de um, e um buraco de seis). A partir desses dados gerados, o valor "Match” reflete a "identidade de sequência”. Outros programas adequados para calcular a identidade percentual ou similaridade entre as sequências são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLSAT, usado com parâmetros pa-drão. Por exemplo, BLSATN e BLSATP podem ser usados usando os seguintes parâmetros padrão: código genético = padrão; filtro = nenhum; filamento = ambos; limite = 60; esperado = 10; Matriz = BLO- SUM62; Descrições = 50 sequências; classificadas por = HIGH SCORE; Bancos de Dados = não redundantes, GenBank + EML + DDBJ + PDB + traduções das CDS do GenBank + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Os detalhes desses programas são bem conhecidos na técnica.

[00041] Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hi- bridização de polinucleotídeo sob condições que formam dúplexes estáveis entre regiões homólogas, seguida por digestão com nuclease(s) de filamento único específico, e determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. As sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições restritivas, como definido para esse sistema particular. Definir as condições de hibridização apropriadas está dentro da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook e outros, acima; DNA Cloning, acima; Nucleic Acid Hybridization, acima.

[00042] Pelo termo "variante degenerada” entende-se um polinucle-otídeo contendo mudanças em sua sequência de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo a partir do qual a variante degenerada é derivada.

[00043] Uma "sequência de codificação” ou uma sequência que "codifica” um polipeptídeo selecionado, é uma molécula de ácido nu-cleico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vivo quando localizado sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5’ (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3’ (carbóxi). Uma sequência de terminação de transcrição pode ser localizada 3’ para a sequência de codificação.

[00044] Por "vetor” entende-se qualquer elemento genético, tal como plasmideo, fago, transposon, cosmídeo, cromossomo, vírus, vírion, etc., que é capaz de replicação quando associado com os elementos de controle apropriados e que podem transferir sequências gênicas às células. Assim, o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vetores virais.

[00045] Por "vetor recombinante” entende-se um vetor que inclui uma sequência de ácido nucleico heterólogo que é capaz de expressão in vivo.

[00046] Por "vírus recombinante” entende-se um vírus que foi gene-ticamente alterado, por exemplo, pela adição ou inserção de um cons-truto de ácido nucleico heterólogo na partícula.

[00047] O termo "transgene” refere-se a um polinucleotídeo que é introduzido em uma célula e que é capaz de ser transcrito em RNA e opcionalmente, traduzido e/ou expresso sob condições apropriadas. Em um aspecto, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual ele foi introduzido, ou de outra forma, leva a um resultado terapêutico ou diagnóstico desejado.

[00048] Os termos "partículas de genoma (pg)” ou "equivalentes de genoma”, como usados em relação a uma titulação virai, referem-se ao número de virions contendo o genoma de DNA de AAV recombinante, independente da infectividade ou funcionalidade. O número de partículas de genoma em uma preparação de vetor particular pode ser medido por procedimentos tal como descritos nos Exemplos fornecidos no presente, ou, por exemplo, por Clark e outros, em Hum. Gene Ther. (1999) 10: 1031 a 1039; e por Veldwijk e outros, em Mol. Ther. (2002) 6: 272 a 278.

[00049] Os termos "unidade de infecção (ui)”, "partícula infecciosa” ou "unidade de replicação”, como usados em relação a uma titulação virai, referem-se ao número de partículas infecciosas de vetor de AAV recombinante se medido pelo ensaio de centro infeccioso, também co-nhecido como ensaio de centro de replicação, como descrito, por exemplo, por McLaughlin e outros, em J. Virol. (1988) 62: 1963 a 1973.

[00050] O termo "unidade de transdução (ut)”, como usado em relação a uma titulação virai, refere-se ao número de partículas infecciosas de vetor de AAV recombinante que resulta na produção de um produto transgênico funcional, se medido em ensaios funcionais como descritos nos Exemplos fornecidos no presente, ou, por exemplo, por Xiao e outros, em Exp. Neurobiol. (1997) 144: 113 a 124; ou por Fisher e outros, J. Virol. (1996) 70: 520 a 532 (ensaio LFU).

[00051] O termo "transfecção” é usado para se referir à absorção de DNA estrangeiro por uma célula, e uma célula foi "transfectada” quando DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são geralmente conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Graham e outros (1973) Virology, 52: 456, Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nova Iorque, Davis e outros (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, e Chu e outros (1981) Gene 13: 197. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais porções de DNA exógeno em células hospedeiras adequadas.

[00052] O termo "heterólogo”, quando se refere a sequências de ácido nucleico, tal como sequências de codificação e sequências de controle, denota sequências que não são normalmente unidas e/ou não são normalmente associadas com uma célula particular. Assim, uma região "heteróloga” de um construto de ácido nucleico ou de um vetor é um segmento de ácido nucleico dentro ou acoplado a outra molécula de ácido nucleico que não é encontrada na natureza em associação com a outra molécula. Por exemplo, uma região heteróloga de um construto de ácido nucleico poderia incluir uma sequência de codificação flanqueada por sequências não encontradas na natureza em associação com a sequência de codificação. Outro exemplo de uma sequência de codificação heteróloga é um construto em que a própria sequência de codificação não é encontrada na natureza (por exemplo, sequências sintéticas tendo códons diferentes do gene nativo). Similarmente, uma célula transformada com um construto que não está normalmente presente na célula seria considerada heteróloga para propósitos desta invenção. A variação alélica ou eventos mutacio- nais ocorrendo naturalmente não produzem DNA heterólogo, como usado aqui.

[00053] Uma sequência de "ácido nucleico” refere-se a uma sequência de DNA ou RNA. O termo captura sequências que incluem qualquer um dos análogos de base conhecidos de DNA e RNA tal como, mas não limitados a 4-acetilcitosina, 8-hidróxi-N6-rnetiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carbóxi-hidroxil-metil) uracila, 5- fluorouracila, 5-bromouracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracila, 5- carboximetil-aminometiluracila, di-hidrouracila, inosina, N6-isopente- niladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracila, 1-metilguanina, 1- metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-meti- laminometiluracila, 5-metóxi-amino-metil-2-tiouracila, beta-D-manosil- queosina, õ-metóxicarbonilmetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, metil éster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido ura- cil-5-oxi a cético, oxibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metil éster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, e 2,6-diaminopurina.

[00054] O termo "sequências de controle” de DNA refere-se coleti-vamente a sequências promotoras, sinais de poliadenilação, sequências de terminação de transcrição, domínios regulatórios a montante, origens de replicação, sítios internos de entrada no ribossomo ("SIER”), acentuadores, e similares, que fornecem coletivamente a replicação, transcrição e tradução de uma sequência de codificação em uma célula receptora. Nem todas essas sequências de controle precisam estar sempre presentes, contanto que a sequência de codificação selecionada é capaz de ser replicada, transcrita e traduzida em uma célula hospedeira apropriada.

[00055] O termo "promotor” é usado no presente em seu sentido normal para se referir a uma região de nucleotideo compreendendo uma sequência regulatória de DNA, em que a sequência regulatória é derivada de um gene que é capaz de ligar RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3’). Os promotores de transcrição podem incluir "promotores induzíveis” (em que a expressão de uma sequência de polinucleotídeo ligada de ma-neira funcional ao promotor é induzida por um analito, cofator, proteína regulatória, etc.), "promotores repressíveis” (em que a expressão de uma sequência de polinucleotídeo ligada de maneira funcional ao promotor é induzida por um analito, cofator, proteína regulatória, etc.), e "promotores constitutivos”.

[00056] O termo "ligados de maneira funcional” refere-se a um arranjo de elementos em que os componentes assim descritos são configurados de modo a executar sua função usual. Assim, as sequências de controle ligadas de maneira funcional a uma sequência de codificação são capazes de efetuar a expressão da sequência de codificação. As sequências de controle não precisam ser contíguas com a sequência de codificação, contanto que elas funcionem para direcionar a expressão das mesmas. Assim, por exemplo, sequências transcritas ainda não traduzidas intervenientes podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência de codificação e a sequência promotora pode ainda ser considerada "ligada de maneira funcional” à sequência de codificação.

[00057] O termo "sistema nervoso” inclui tanto o sistema nervoso central quanto o sistema nervoso periférico. O termo "sistema nervoso central” ou "SNC” inclui todas as células e tecidos do cérebro e medula espinhal de um vertebrado. O termo "sistema nervoso periférico” refere-se a todas as células e tecidos da parte do sistema nervoso fora do cérebro e medula espinhal. Assim, o termo "sistema nervoso” inclui, mas não está limitado a células neuronais, células gliais, astrócitos, células no fluido cerebroespinhal (FCE), células nos espaços interstici-ais, células nas coberturas protetoras da medula espinhal, células epi- durais (isto é, células fora da matéria dura), células em tecidos não neurais adjacentes ou em contato com o tecido neural ou inervadas pelo tecido neural, células no epinêurio, perinêurio, endonêurio, funícu- los, fascículos, e similares.

[00058] "Ativo” ou "atividade” para propósitos da presente invenção refere-se a formas de uma proteína terapêutica que retém uma atividade biológica do polipeptídeo nativo ou ocorrendo naturalmente cor-respondente. A atividade pode ser maior, igual, ou menor do que a ob-servada com o polipeptídeo nativo ou ocorrendo naturalmente corres-pondente.

[00059] Por "isolado”, quando se refere a uma sequência de nucleo-tídeo, entende-se que a molécula indicada está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. Assim, uma "molécula de ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo particular” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que está substancialmente livre de outras moléculas de ácido nucleico que não codificam a polipeptídeo em questão; entretanto, a molécula pode incluir algumas bases ou porções adicionais que não afetam prejudicialmente as características básicas da composição.

[00060] Com o propósito de descrever a posição relativa de sequências de nucleotídeo em uma molécula de ácido nucleico particular por todo o pedido, tal como quando uma sequência de nucleotídeo particular é descrita como estando situada "a montante”, "a jusante”, "3-prime (3’)” ou "5-prime (5’)” em relação à outra sequência, entende- se que é a posição das sequências no "senso” ou filamento de "codificação” de uma molécula de DNA a que está se referindo como é convencional na técnica.

[00061] O termo "aproximadamente”, particularmente em relação a uma dada quantidade, significa abranger desvios de mais ou menos cinco por cento.

[00062] Os termos "sujeito”, "indivíduo” ou "paciente” são usados de forma intercambiável no presente e referem-se a um vertebrado, prefe-rencialmente um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão li-mitados a murinos, roedores, simianos, seres humanos, animais de criação, animais de esporte e animais de estimação.

[00063] O termo "modular”, como usado aqui, significa variar a quantidade ou intensidade de um efeito ou resultado, por exemplo, in-tensificar, aumentar, diminuir, reduzir ou eliminar.

[00064] Como usado aqui, o termo "melhorar” é sinônimo de "aliviar” e significa reduzir ou diminuir. Por exemplo, um pode melhorar os sintomas de uma doença ou distúrbio tornando a doença ou sintomas menos severos da doença.

[00065] Os termos "terapêutica”, "quantidade eficaz” ou "quantidade terapeuticamente eficaz” de uma composição ou agente, como fornecido no presente, referem-se a uma quantidade suficiente da composição ou agente para fornecer a resposta desejada, tal como a prevenção, atraso do começo ou melhora dos sintomas em um indivíduo ou uma obtenção de um resultado biológico desejado, tal como a correção de neuropatologia, por exemplo, patologia celular associada com uma doença do neurônio motor tal como atrofia muscular espinhal (SMA). O termo "correção terapêutica” refere-se ao grau de correção que resulta na prevenção ou atraso do começo ou melhora dos sintomas em um indivíduo. A quantidade exata exigida variará de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade, e condição geral do indivíduo, a gravidade da condição que está sendo tratada, e a ma- cromolécula particular de interesse, modo de administração, e similares. Uma quantidade "eficaz” apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por um versado na técnica usando experimen- tação de rotina.

[00066] "Tratamento” ou "tratar” uma doença particular inclui: (1) prevenir a doença, isto é, prevenir o desenvolvimento da doença ou fazer com que a doença ocorra com menos intensidade em um indivíduo que pode ser exposto ou pré-disposto à doença, mas não experimenta ou exibe ainda os sintomas da doença, (2) inibir a doença, isto é, interromper o desenvolvimento ou reversão do estado da doença, ou (3) aliviar os sintomas da doença, isto é, diminuir o número de sintomas experimentados pelo indivíduo, bem como mudar a patologia celular associada com a doença.

2. Modos de Executar a Invenção

[00067] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, en- tende-se que esta invenção não está limitada a formulações particulares ou parâmetros de processo como tais podem, é claro, variar. Entende-se que a terminologia usada no presente com o propósito de descrever modalidades particulares da invenção somente, e não é destinada a ser limitante.

[00068] Embora vários métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferenciais são descritos no presente.

[00069] Central à presente invenção é a descoberta de que a distri-buição de virions de rAAV contendo o cDNA de sobrevivência do neu-rônio motor 1 humano (hSMN1) ao SNC de um modelo de camundongo agressivo de atrofia muscular espinhal (SMA) produziu expressão de SMN1 por toda a medula espinhal. Os camundongos com SMA tratados continham um número mais alto de neurônios motores comparados a mutantes não tratados de mesma idade. Em adição, a avaliação do ta-manho das miofibras demonstrou que o tamanho das miofibras indivi-duais de uma variedade de grupos de músculos nos camundongos com SMA tratados se aproximou dos observados em camundongos de ocor rência natural. Ademais, a estrutura da junção neuromuscular (NMJ) em camundongos com SMA tratados foi similar à de camundongos de ocor-rência natural, que era em contraste à de camundongos com SMA não tratados que mostrou acúmulo anormal de proteína de neurofilamento no terminal pré-sináptico. Os camundongos com SMA tratados também exibiram melhoras significativas em uma bateria de testes comporta- mentais sugerindo que a NMJ era funcional. De forma importante, os camundongos tratados com AAV recombinante tiveram uma vida útil significativamente aumentada se comparada a suas contrapartes não tratadas. Os camundongos com SMA tratados com um vetor de rAAV autocomplementar também exibiram uma melhora considerável na so-brevida média, mesmo se comparada ao tratamento com vetores de rAAV não autocomplementares convencionais.

[00070] Esses resultados demonstram que o aumento de gene de SMN1 mediado por AAV SNC-dirigido é altamente eficaz em abordar tanto as patologias neuronais quanto as patologias musculares de SMA e evidenciam a utilidade da terapia de gene virai como a estratégia terapêutica para tratar e prevenir patologias neuronais e musculares, tal com SMA, bem como outras doenças que afetam a função motora. As técnicas de terapia gênica descritas no presente podem ser usadas sozinhas, ou em conjunto com os fármacos tradicionais.

[00071] De modo a fornecer um entendimento adicional da invenção, uma discussão mais detalhada é fornecida abaixo com relação a patologias do neurônio motor e moléculas terapêuticas, bem como vá-rios métodos de distribuição gênica para uso com a presente invenção.

Patologias do Neurônio Motor e Moléculas Terapêuticas

[00072] A invenção em questão fornece composições e métodos para modular, corrigir ou aumentar a função motora em um indivíduo afligido com uma doença do neurônio motor ou com danos no neurônio motor. Com o propósito de ilustração somente, o indivíduo pode sofrer de um ou mais dentre atrofia muscular espinhal (SMA), esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular espinhal bulbar, ataxia espinocere- belar, esclerose lateral primária (PLS), ou lesão traumática da medula espinhal. Sem estar limitado por uma teoria particular, a patologia asso-ciada com os danos no neurônio motor pode incluir degeneração do neurônio motor, gliose, anormalidades do neurofilamento, perda de fi-bras mielinadas em tratos corticoespinhais e raízes ventrais. Por exem-plo, dois tipos de início foram reconhecidos - início bulbar, que afeta os neurônios motores superiores (neurônios motores do córtex e haste do cérebro), afeta os músculos faciais, a fala, e a deglutição; um início nos membros, que afeta os neurônios motores inferiores (neurônios motores da medula espinhal), é refletido por espasticidade, fraqueza generaliza-da, atrofia muscular, paralisia, e insuficiência respiratória. Em ALS, os indivíduos tiveram tanto início bulbar quanto início nos membros. Em PLS, os indivíduos somente tiveram início bulbar.

[00073] Assim, em certas modalidades, ao indivíduo são fornecidos construtos de rAAV que codificam uma molécula biologicamente ativa, a expressão da qual no SNC resulta em correção ao menos parcial de neuropatologia e/ou estabilização da progressão da doença, tal como a prevenção, atraso do início ou melhora dos sintomas em um indivíduo ou uma obtenção de um resultado biológico desejado, incluindo, por exemplo, uma mudança na patologia celular associada com uma doença do neurônio motor descrita acima.

[00074] A título de exemplo, o transgene presente no construto de rAAV pode ser, mas não está limitado, à proteína da sobrevivência do neurônio motor (via o gene SMN1 ou o gene SMN2), o fator de cres-cimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1), calbindina D28, parval- bumina, HIF1-alfa, SIRT-2, VEGF tal como VEGF165, CNTF (fator neurotrófico ciliar), sonic hedgehog (shh), eritropoietina (EPO), lisil oxi-dase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, angiogeni- na, e lactogênio placentário.

[00075] A base molecular de SMA, um distúrbio neuromuscular au- tossômico recessivo, é a perda homozigota do gene da sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1), que pode também ser conhecido como SMN Telomérico. Uma cópia quase idêntica do gene SMN1, chamada SMN2, que pode também ser conhecida como SMN Centromérico, é encontrada em humanos e modula a gravidade da doença. A expressão do gene de SMN1 normal resulta unicamente na expressão da proteína da sobrevivência do neurônio motor (SMN). A expressão do gene de SMN2 resulta em aproximadamente 10 a 20% da proteína SMN e 80 a 90% de uma proteína SNMdelta7 não funcional/instável. Somente 10% de transcritos de SMN2 codificam uma proteína de comprimento total funcional idêntica a SMN1. Essa diferença funcional entre ambos os genes resulta de uma mutação traducionalmente silenciosa que, entretanto, rompe um acentuador de recomposição exô- nica causando salto do éxon 7 na maioria dos transcritos de SMN2. A proteína de SMN executa uma função bem estabelecida na montagem do spliceossomo e pode também mediar o tráfego de mRNA no axônio e terminal nervoso dos neurônios.

[00076] As sequências de nucleotídeo e de aminoácido de várias moléculas de SMN1 e proteínas de SMN são conhecidas. Ver, por exemplo, figuras 9A e 9B; números de acesso NCBI NM_000344 (hu-mano), NP_000335 (humano), NM_011420 (camundongo), EU 791616 (porco), NM_00l 131470 (orangotango), NM_131191 (peixe zebra), BC062404 (rato), NM_001009328 (gato), NM_001003226 (cão), NM_175701 (vaca). Similarmente, várias sequências de SMN2 são conhecidas. Ver, por exemplo, números de acesso NCBI NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (todos humanos).

[00077] O fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) é uma proteína terapêutica para o tratamento de distúrbios neurode- generativos, incluindo doenças do neurônio motor, devido a suas muitas ações em diferentes níveis de neuraxia (ver Dore e outros, Trends Neurosci (1997) 20: 326 a 331). Por exemplo, no cérebro acredita-se que ele reduz tanto a apoptose neuronal quanto glial, protege os neurônios contra a toxicidade induzida por ferro, colchicina, desestabiliza- dores de cálcio, peróxidos, e citocinas. Ele também parece modular a liberação de neurotransmissores acetilcolina e glutamato e induzir a expressão de neurofilamento, tubulina, e proteína básica mielina. Na medula espinhal, acredita-se que o IGF-1 module a atividade de ChAT e atenue a perda de fenótipo colinérgico, acentue o brotamento do neurônio motor, aumente a mielinização, inibe a desmielinização, estimule a proliferação do neurônio motor e a diferenciação a partir de células precursoras, e promove a divisão, maturação e crescimento de células de Schwann. Nos músculos, o IGF-1 parece induzir a formação de grupos de receptor de acetilcolina na junção neuromuscular e aumentar a função neuromuscular e a resistência muscular.

[00078] O gene IGF-1 tem uma estrutura complexa, que é bem co-nhecida na técnica. Ele tem ao menos dois produtos de mRNA alterna-tivamente recompostos originando-se do transcrito de gene. Há um peptideo de 153 aminoácidos, conhecido por vários nomes incluindo IGF-IA ou IGF-lEa, e um peptideo de 195 aminoácidos, conhecido por vários nomes incluindo IGF-IB ou IGF-lEb. A forma Eb é também co-nhecida como Ec em seres humanos. A forma madura de IGF-I é um polipeptídeo de 70 aminoácidos. Tanto IGF-lEa quando IGF-lEb contêm o peptideo maduro de 70 aminoácidos, mas diferem na sequência e comprimento de suas extensões no terminal carboxila. As proteínas IGF-1, bem como as sequências de peptideo de IGF-lEa e IGF-lEb, são conhecidas e descritas, por exemplo, na Publicação Internacional No. WO 2007/146046, incorporada inteiramente no presente por refe rência. Os cDNAs genômicos e funcionais de IGF-I humano, bem como informação adicional com relação ao gene IGF-I e seus produtos, estão disponíveis em Unigene No. Acesso NM_000618.

[00079] Calbindina D28K (também chamada calbindina D28) e par- valbumina são proteínas de ligação ao cálcio, que se acredita, estarem envolvidas na tamponamento do cálcio. Sem estar limitado por uma teo-ria particular, a homeostase de cálcio parece ser alterada em indivíduos com doenças do neurônio motor (por exemplo, ALS) e baixos níveis de calbinidina-D28K e/ou parvalbumina podem aumentar a vulnerabilidade dos neurônios motores reduzindo sua capacidade de manusear uma carga de cálcio aumentada. Essa redução pode levar a lesões nas célu-las e eventual morte de neurônios motores. Mais evidência sugere que neurônios ricos em proteínas de ligação ao cálcio, tal como calbindina D28K e parvalbumina, são resistentes à degeneração.

[00080] HIF-I é uma proteína heterodimérica composta de duas su- bunidades: (i) uma subunidade β constitutivamente expressa também conhecida como proteína nuclear translocadora de receptor de hidro-carboneto de arila (ARNT) (que é compartilhado por outros fatores de transcrição relacionados (por exemplo, receptor de hidrocarboneto de dioxina/arila (DR/AhR)); e (ii) uma subunidade α (ver, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 96/39426, descrevendo a recente purificação de afinidade e clonagem molecular de HIF-la. Ambas as subunidades são membros da família hélice básica-laço-hélice (bHLH)-PSA de fatores de transcrição. Esses domínios regulam a ligação ao DNA e a dimerização. O domínio de transativação reside no terminal C da proteína. A região básica consiste de aproximadamente 15 aminoácidos predominantemente básicos responsáveis por ligação direta ao DNA. Essa região é adjacente a duas hélices α anfipáticas, separadas por um laço de comprimento variável, que forma a interface de dimerização primária entre os membros da família (Moore e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 10436 a 10441). O dominio PSA abrange 200 a 300 aminoácidos contendo duas regiões amplamente hidrofóbicas e livremente conservadas de aproximadamente 50 ami-noácidos, chamadas PSA A e PSA B. A subunidade HIF-la é instável durante condições normóxicas, a superexpressão dessa subunidade em células cultivadas sob níveis normais de oxigênio é capaz de induzir a expressão de genes normalmente induzidos por hipóxia. A substituição da região C terminal (ou transativação) da proteína de fator in- duzível por hipóxia com um forte domínio de transativação a partir de uma proteína de ativação transcricional tal como, por exemplo, VP16 do vírus do Herpes Simples (HSV), NFxB ou fatores de transcrição de levedura GAL4 e GCN4, é projetada para estabilizar a proteína sob condições normóxicas e fornece forte ativação transcricional constitutiva. Ver, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 2008/042420 para uma descrição e sequência de uma proteína de fator induzível por hipóxia estabilizada representativa que é uma proteína de fusão híbrida/quimérica consistindo dos domínios de ligação ao DNA e dime- rização a partir de HIF-1α e do domínio de transativação a partir da proteína VP16 de HSV, incorporada inteiramente no presente por refe-rência. Ver também as Patentes US Nos. 6.432.927 e 7.053.062 para uma descrição de um HIF-la híbrido constitutivamente estável, ambas incorporadas inteiramente no presente por referência.

[00081] Os membros da família de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) estão dentre os moduladores mais poderosos da bio-logia vascular. Eles regulam a vasculogênese, angiogênese e a manu-tenção vascular. Quatro variantes moleculares diferentes de VEGF fo-ram descritas. A variante de 165 aminoácidos é a forma molecular predominante encontrada em tecidos e células normais. Uma forma mais curta menos abundante com uma deleção de 44 aminoácidos entre as posições 116 e 159 (VEGF121), uma forma mais longa com uma inserção de 24 resíduos básicos na posição 116 (VEGFiβθ), e outra forma mais longa com uma inserção de 41 aminoácidos (VEGF206) que inclui a inserção de 24 aminoácidos encontrada em VEGF189, são também conhecidas. VEGF121 e VEGFies são proteínas solúveis. VEGFiβθ e VEGF206 parecem ser geralmente associadas a células. Todas as versões de VEGF são biologicamente ativas. Ver, por exem-plo, Tischer e outros, J. Biol. Chem. (1991) 266: 11947 a 11954, des-crevendo a sequência de VEGFies (ver também GenBank No. Acesso AB021221), VEGF121 (ver também GenBank No. Acesso AF214570) e VEGF189; e Houck e outros, Mol. Endocrinol. (1991) 5: 1806 a 1814, descrevendo a sequência de VEGF206.

[00082] CNTF (fator neurotrófico ciliar) é uma neurocitocina expressa por células gliais em nervos periféricos e no sistema nervoso central. O CNTF é geralmente reconhecido por sua função em suporte e sobrevida de tipos de células neuronais e não neuronais. Ver, por exemplo, Verga-ra, C e Ramirez, B; Brain Res. Rev. (2004) 47:161 a 173.

[00083] O Sonic hedgehog (Shh) controla processos importantes do desenvolvimento, incluindo a sobrevivência de células gliais e neuronais.

[00084] A eritropoietina (EPO) é um regulador principal de células progenitoras eritroides. Entretanto, ela é funcionalmente expressão no sistema nervoso central e foi relatada como tendo efeitos neuroproteto- res. Ver, por exemplo, Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26: 923 a 928. Genes codificando EPO humano e de outros mamíferos foram clo-nados, sequenciados e expressos, e mostram um alto grau de homologia de sequência na região de codificação através da espécie. Wen e outros, Blood (1993) 82: 1507 a 1516. A sequência do gene codificando EPO humano nativo, bem como métodos para obter a mesma, é descrita, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4.954.437 e 4.703.008, incorporadas integralmente no presente por referência, bem como em Jacobs e outros (1985) Nature 313: 806 a 810; Lin e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7580; Publicação Internacional Número WO 85/02610; e Publi-cação de Patente Europeia Número 232.034 B1. Em adição, as sequên-cias dos genes codificando EPO de suínos, caninos e felinos são bem conhecidas e prontamente disponíveis (GenBank Nos. Acesso L10606; L13027 e L10607, respectivamente), e a sequência do gene codificando EPO de macaco (Macaca mulatta) é também conhecida e disponível (GenBank No. Acesso L10609).

[00085] A lisil oxidase (LOX) oxida a cadeia lateral de peptidil lisina convertendo, desse modo, certos resíduos de lisina em alfa- aminoadípico-delta-semialdeído. Essa é uma mudança pós-traducional que, por exemplo, possibilita a reticulação covalente das cadeias de componentes de colágeno e elastina. Ela estabiliza os depósitos fibro-sos dessas proteínas na matriz extracelular. LOX pode também oxidar a lisina dentro de uma variedade de proteínas catiônicas, que sugere que suas funções são mais amplas do que a estabilização ou a matriz extracelular. LOX é sintetizada como uma pré-proteína; ela emerge da célula como proLOX e é processada proteoliticamente na enzima ativa. Ver, por exemplo, Lucero, HÁ e Kagan, HM, Cell Mol. Life Sei. (2006) 63: 2304 a 2316.

[00086] A progranulina (PGRN) é uma proteína pleitrópica. As mutações no gene causam degeneração lobar frontotemporal. A PGRN no SNC é expressa por microglias e neurônios e desempenha uma função no desenvolvimento cerebral. A PGRN está também envolvida em múltiplos processos de "modelagem de tecido” incluindo desenvolvimento, reparo de ferida e tumorogênese. A PGRN é convertida em Granulina (GRN) por enzimas elastase. Enquanto a progranulina tem propriedades tróficas, as GRNs são mais parecidas com mediadores inflamatórios. Estudos de expressão gênica de modelos animais de doença do SNC mostram um aumento diferencial na PGRN combinada com ativação e inflamação microglial. O aumento na expressão de PGRN pode estar intimamente relacionado à ativação microglial e neu- roinflamação. Ademais, a expressão de PGRN é aumentada em mi-croglias ativadas em muitas doenças neurodegenerativas incluindo doença do neurônio motor e doença de Alzheimer. Estudos identificaram mutações na PGRN como uma causa de doença neurodegenera- tiva e indicam a importância da função de PGRN para sobrevivência neuronal.

[00087] Os oligodendrócitos, as células de mielinização do SNC, con-tinuam a ser gerados por células precursoras de oligodendrócito (OPCs) por toda a fase adulta e são exigidas para o reparo intrínseco de danos à mieloma no SNC adulto. Os eventos fisiológicos que modulam a proliferação de OPC e a geração de novos oligodendrócitos de mielinização no SNC adulto são amplamente conhecidos. Recentemente, relatou-se que pacientes com Esclerose Múltipla (EM), uma doença desmielinizante, têm uma taxa de recidiva reduzida durante o terceiro trimestre da gravidez sugerindo que os hormônios influenciam na geração de oligodendrócito. A remissão em pacientes com EM está correlacionada com uma diminuição no número e tamanho de lesões de matéria branca ativa/ A gravidez em camundongos resulta em um aumento na geração de novos oligodendrócitos e no número de axônios mielinizados dentro do SNC materno (Gregg e outros, J. Neurosci. (2007) 27: 1812 a 1823). Prolacti- na, um hormônio que aumenta durante o estágio final da gravidez, mostrou regular a proliferação de OPC durante a gravidez e promove reparo de matéria branca em camundongos fêmeas virgens (Gregg e outros, J. Neurosci. (2007) 27: 1812 a 1823).

[00088] O lactogênio da placenta humana (hPL), um hormônio que também aumenta durante o terceiro trimestre da gravidez pode ter uma influência similar na geração de oligodendrócitos. O hPL tem várias atividades biológicas que são qualitativamente similares ao hormônio do crescimento humano (hGH) e prolactina e parece ser um principal regulador da produção de IGF-I. Tanto hGH quanto IGF-I mostraram-se estimuladores de mielinização no SNC adulto (Carson e outros, Neuron (1993) 10: 729 a 740; Peltwon e outros, Neurology (1997) 27: 282 a 288). Então, o tratamento de doenças do SNC envol-vendo desmielinização tal como EM, ALS, derrame e lesão na medula espinhal pode se beneficiar a partir de terapias baseadas em PRL ou hPL, tal como pela injeção intraventricular de um vetor virai expressando rhPPL ou hPL.

[00089] A grelina é um hormônio gástrico que é um mediador da liberação do hormônio do crescimento. Ver, por exemplo, Wu e outros, Ann. Surg. (2004) 239: 464.

[00090] A neuroserpina é um membro da família do inibidor de seri- no protease. Em certas condições do SNC, a neuroserpina pode de-sempenhar uma função neuroprotetora potencialmente através do blo-queio dos efeitos de tPA. Ver, por exemplo, Galliciotti, G. e Sonde- regger, P., Front Biosci. (2006) 11: 33; Simonin e outros (2006) 26: 10614; Miranda, E. e Lomas, DA., Cell Mol. Life Sci. (2006) 63: 709.

[00091] A angiogenina é um membro da superfamília RNAse. Ela é um constituinte normal de circulação, mas também foi implicada como um fator de risco nas doenças do neurônio motor.

[00092] Em certas composições e métodos da invenção, mais de um transgene codificando mais de um dos módulos terapêuticos descritos acima pode ser distribuído, em que cada transgene é ligado de maneira funcional a um promotor para habilitar a expressão dos trans- genes a partir de um único vetor de AAV. Em métodos adicionais, os transgenes podem ser ligados de maneira funcional ao mesmo promotor. Cada transgene codifica uma molécula biologicamente ativa, cuja expressão no SNC resulta em ao menos correção parcial de neuropa- tologia. Adicionalmente, em casos em que mais de um transgene é distribuída, os transgenes podem ser distribuídos via mais de um vetor de AAV, em que cada vetor de AAV compreende um transgene ligado de maneira funcional a um promotor.

[00093] As moléculas nativas, bem como os fragmentos ativos e análogos das mesmas, que retêm a atividade biológica desejada, se medida em qualquer um dos vários ensaios e modelos animais incluindo os descritos no presente, são destinadas para uso com a presente invenção.

[00094] Os polinucleotídeos codificando a proteína desejada para uso com a presente invenção podem ser produzidos usando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, as sequências de polinucleotídeo codificando para as moléculas descritas acima podem ser obtidas usando métodos recombinantes, tal como triagem de bibliotecas genômicas e de cDNA a partir de células expressando o gene, ou derivando o gene a partir de um vetor conhecido por incluir o mesmo. O gene de interesse pode também ser produzido sinteticamente, ao invés de clonado, com base nas sequências conhecidas. As moléculas podem ser projetadas com códons apropriados para a sequência particular. A sequência completa é então montada a partir de oligonucleotí- deos sobrepostos preparados por métodos padrão e montados em uma sequência de codificação completa. Ver, por exemplo, Edge, Nature (1981) 292: 756; Nambair e outros, Science (1984) 223: 1299; e Jaye outros, J. Biol. Chem. (1984) 259: 6311.

[00095] Assim, as sequências de nucleotideo particulares podem ser obtidas a partir de vetores abrigando as sequências desejadas ou sinte-tizadas completamente ou em parte usando várias técnicas de síntese de oligonucleotídeo conhecidas na área, tal como técnicas de mutagê- nese sítio-dirigida e de reação em cadeia da polimerase (PCR), quando apropriado. Ver, por exemplo, Sambrook, acima. Um método para obter sequências de nucleotideo codificando as sequências desejadas é por conjuntos complementares de anelamento de oligonucleotídeos sintéti- cos sobrepostos produzidos em um sintetizador de polinucleotídeo con-vencional automático seguido por ligação com uma DNA ligase apropri-ada e amplificação da sequência de nucleotídeo ligada via PCR. Ver, por exemplo, Jayaraman e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88: 4084 a 4088. Adicionalmente, a síntese de oligonucleotídeo-dirigida (Jones e outros, Nature (1986) 54: 75 a 82), mutagênese oligonucleotí-deo-dirigida de regiões de nucleotídeo pré-existentes (Riechmann e ou-tros, Nature (1988) 332: 323 a 327 e Verhoeyen e outros, Science (1988) 239: 1534 a 1536), e preenchimento de oligonucleotídeos in-completos usando DNA polimerase T4 (Queen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989) 86: 10029 a 10033) podem ser usados para for-necer moléculas para uso nos métodos em questão.

[00096] Uma vez produzidos, os construtos são distribuídos usando vetores virais recombinantes como descritos abaixo.

Técnicas de Distribuição Gênica de AAV

[00097] Os construtos descritos acima são distribuídos ao indivíduo em questão usando qualquer das várias técnicas de distribuição de gene de rAAV. Vários métodos mediados por AAV para distribuição gênica são conhecidos na técnica. Como descrito ainda abaixo, os genes podem ser distribuídos ou diretamente ao indivíduo, ou alternativamente, distribuídos ex vivo, às células apropriadas, tal como células derivadas do indivíduo, e as células reimplantadas no indivíduo.

[00098] Vários sistemas de vetor de AAV foram desenvolvidos para distribuição gênica. Os vetores de AAV podem ser prontamente construídos usando técnicas bem conhecidas na área. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 5.173.414 e 5.139.941; Publicação Internacional Nos. WO 92/01070 (publicada em 23 de janeiro de 1992) e WO 93/03769 (publicada em 4 de março de 1993); Lebkowski e outros, Molec. Cell Biol. (1988) 8: 3988 a 3996; Vincent e outros, Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter. B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3: 533 a 539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. And Im-munol. (1992) 158: 97 a 129; Kotin. R. M. Human Gene Therapy (1994) 5: 793 a 801; Shelling e Smith, Gene Therapy (1994) 1: 165 a 169; e Zhou e outros, J. Exp. Med. (1994) 179: 1867 a 1875. Os sistemas de vetor de AAV são também descritos em mais detalhes abaixo.

[00099] O genoma de AAV é uma molécula de DNA de único filamento linear contendo aproximadamente 4681 nucleotideos. O genoma de AAV geralmente compreende um genoma não repetitivo interno flanqueado em cada extremidade por repetições terminais invertidas (ITRs). As ITRs têm aproximadamente 145 pares de bases (pb) de comprimento. As ITRs têm múltiplas funções, incluindo fornecer origens de replicação de DNA, e empacotar sinais para o genoma viral. A porção interna não repetida do genoma inclui dois grandes quadros de leitura aberta, conhecidos como os genes de replicação de AAV (rep) e de capsídeo (cap). Os genes rep e cap codificam para proteínas virais que permitem que o vírus replique e empacote em um vírion. Em particular, uma família de ao menos quatro proteínas virais é expressa a partir da região rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52, e Rep 40, chamada de acordo com seu peso molecular aparente. A região cap de AAV codifica ao menos três proteínas, VPI, VP2 e VP3.

[000100] AAV foi elaborado para distribuir genes de interesse dele- tando a porção interna não repetida do genoma de AAV (isto é, os ge-nes rep e cap) e inserindo um gene heterólogo entre as ITRs. O gene heterólogo é tipicamente funcionalmente ligado a um promotor heteró-logo (constitutivo, célula-específico, ou induzível) capaz de dirigir a ex-pressão gênica nas células alvo do paciente sob condições apropriadas. Exemplos de cada tipo de promotor são bem conhecidos na técnica. Os sinais de terminação, tal como sítios de poliadenilação, podem também ser incluídos.

[000101] AAV é um vírus dependente de vírus auxiliar; isto é, ele exige a coinfecção com um vírus auxiliar (por exemplo, adenovirus, vírus da herpes, ou varíola), de modo a formar virions de AAV. Na ausência de coinfecção com um vírus auxiliar, AAV estabelece um estado latente no qual o genoma virai insere em um cromossomo de célula hospedeira, mas virions infecciosos não são produzidos. A infecção subsequente por um vírus auxiliar "resgata” o genoma integrado, permitindo a ele replicar e empacotar seu genoma em um vírion de AAV infeccioso. Enquanto o AAV pode infectar células a partir de espécies diferentes, o vírus auxiliar precisa ser da mesma espécie da célula hospedeira. Assim, por exemplo, AAV humano replicará em células caninas coinfectadas com um adenovirus canino.

[000102] Os virions de AAV recombinante compreendendo o gene de interesse podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas re-conhecidas na área descritas mais completamente abaixo. Os vírus AAV de ocorrência natural e os vírus auxiliares podem ser usados para fornecer as funções replicativas necessárias para produzir virions de rAAV (ver, por exemplo, Patente US No. 5.139.941, incorporada integralmente no presente por referência). Alternativamente, um plasmideo, contendo genes de função auxiliar, em combinação com infecção por um dos vírus auxiliares bem conhecidos pode ser usado como a fonte de funções replicativas (ver, por exemplo, Patente US No. 5.622.856 e Patente US No. 5.139.941, ambas incorporadas integralmente no presente por referência). Similarmente, um plasmideo, contendo genes de função acessória pode ser usado em combinação com infecção por AAV de ocorrência natural, para fornecer as funções replicativas necessárias. Essas três abordagens, quando usadas em combinação com um vetor rAAV, são suficientes para produzir virions de rAAV. Outras abordagens, bem conhecidas na técnica, podem também ser empregadas pelo versado na técnica para produzir virions de rAAV.

[000103] Em uma modalidade da presente invenção, um método de transfecção tripla (descrito em detalhes na Patente US No. 6.001.650, incorporada integralmente no presente por referência) é usado para produzir virions de rAAV porque esse método não exige o uso de um vírus auxiliar infeccioso, possibilitando que os virions de rAAV sejam produzidos sem qualquer vírus auxiliar detectável presente. Isso é alcançado pelo uso de três vetores para a produção de vírion de rAAV: um vetor de função auxiliar de AAV, um vetor de função acessória, e um vetor de expressão de rAAV. Um versado na técnica apreciará, entretanto, que as sequências de ácido nucleico codificadas por esses vetores podem ser produzidas em dois ou mais vetores em várias combinações.

[000104] Como explicado aqui, o vetor de função auxiliar de AAV co-difica as sequências de "função auxiliar de AAV” (isto é, rep e cap), que funcionam em trans para replicação e encapsidação de AAV produtivas. Preferencialmente, o vetor de função auxiliar de AAV suporta a produção eficiente de vetor de AAV sem gerar quaisquer virions de AAV detectáveis (isto é, virions de AAV contendo genes funcionais rep e cap). Um exemplo de tal vetor, pHLP19, é descrito na Patente US No. 6.001.650, incorporada integralmente no presente por referência. Os genes rep e cap do vetor de função auxiliar de AAV podem ser de-rivados de quaisquer dos sorotipos de AAV conhecidos, como explicado acima. Por exemplo, o vetor de função auxiliar de AAV pode ter um gene rep derivado de AAV-2 e um gene cap derivado de AAV-6; um versado na técnica reconhecerá que outras combinações de genes rep e cap são possíveis, a característica de definição sendo a capacidade de suportar a produção de vírion de rAAV.

[000105] O vetor de função acessória codifica sequências de nucleo-tídeo para as funções celulares e/ou virais não derivadas de AAV me-diante as quais o AAV é dependente para replicação (isto é, "funções acessórias”). As funções acessórias incluem aquelas funções exigidas para a replicação de AAV, incluindo, sem limitação, aquelas porções envolvidas na ativação de transcrição de gene de AAV, recomposição de mRNA de AAV estágio-específico, replicação de DNA de AAV, sín-tese de produtos de expressão de cap, e conjunto de capsídeos de AAV. As funções acessórias baseadas em vírus podem ser derivadas de quaisquer vírus auxiliares bem conhecidos tal como adenovirus, vírus do herpes, e vírus da varíola. Em uma modalidade, o plasmideo de função acessória pLadenoõ é usado (detalhes com relação a pLadenoõ são descritos na Patente US No. 6.004.797, incorporada integralmente no presente por referência). Esse plasmideo fornece um conjunto completo de funções acessórias de adenovirus para a produção de vetor de AAV, mas carece dos componentes necessários para formar adenovirus competentes de replicação.

[000106] De modo a fornecer um melhor entendimento de AAV, uma discussão mais detalhada é fornecida abaixo com relação a vetores de expressão de AAV recombinante e funções acessórias e auxiliares de AAV.

Vetores de Expressão de AAV Recombinante

[000107] Os vetores de expressão de AAV recombinante (rAAV) são construídos usando técnicas conhecidas para ao menos fornecer componentes ligados de maneira funcional na direção de transcrição, elementos de controle incluindo uma região de iniciação transcricional, o polinucleotídeo de interesse e uma região de terminação transcricional. Os elementos de controle são selecionados como sendo funcionais na célula de interesse, tal como em uma célula de mamífero. O construto resultante que contém os componentes ligados de maneira funcional é ligado (5’ e 3’) com sequências ITR de AAV funcionais.

[000108] As sequências de nucleotídeo de regiões ITR de AAV são conhecidas. Ver, por exemplo, Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793 a 801; Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication” in Fundamental Virology, 2a Edição (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds.) para a sequência AAV-2. As ITRs de AAV usadas nos vetores da invenção não precisam ter uma sequência de nucleotideo de ocorrência natural, e podem ser alteradas, por exemplo, pela inserção, deleção ou substituição de nucleotideos. Adicionalmente, as ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer dos vários sorotipos de AAV, incluindo sem limitação AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, etc. Ademais, as ITRs 5’ e 3’ que flanqueiam uma sequência de nucleotideo selecionada em um vetor de expressão de AAV não precisam ser idênticas ou derivadas do mesmo sorotipo de AAV ou isoladas, contanto que elas funcionem como pretendido, isto é, para permitir a excisão e resgate da sequência de interesse de um genoma ou vetor de célula hospedeira, e para permitir a integração da molécula de DNA no genoma da célula receptora quando os produtos gênicos Rep de AAV estão presentes na célula.

[000109] As moléculas de polinucleotídeo adequadas para uso em vetores de AAV tradicionais terão tamanho menor ou aproximadamente 5 quilobases (kb). A sequência de polinucleotídeo selecionada é ligada de maneira funcional a elementos de controle que dirigem a transcrição ou expressão dessa no indivíduo in vivo. Tais elementos de controle compreendem sequências de controle normalmente associadas com o gene selecionado. Alternativamente, as sequências de controle heterólogas podem ser empregadas. As sequências de controle heterólogas úteis geralmente incluem aquelas derivadas de sequências codificando genes de mamíferos ou virais. Exemplos não li- mitantes de promotores incluem, mas não estão limitados ao promotor de citomegalovírus (CMV) (Kaplitt e outros, Nat. Genet. (1994) 8: 148 a 154), promotor de β3-globina humana/CMV (Mandei e outros, J. Neu-rosci. (1998) 18: 4271 a 4284), promotor GFAP (Xu e outros, Gene Ther. (2001) 8: 1323 a 1332), o promotor de enolase neurônio- específica de 1,8 kb (NSE) (Klein e outros, Exp. Neurol. (1998) 150: 183 a 194), promotor de beta actina de galinhas (CBA) (Miyazaki, Gene (1989) 79: 269 a 277), o promotor de β-glucuronidase (GUSB) (Shipley e outros, Genetics (1991) 10: 1009 a 1018), promotores de ubi- quitina tal como aqueles isolados da ubiquitina humana A, ubiquitina humana B, e ubiquitina humana C, como descrito na Patente US No. 6.667.174, incorporada integralmente no presente por referência. Para prolongar a expressão, outros elementos regulatórios podem ser adicionalmente ligados de maneira funcional ao transgene, tal como, por exemplo, o Elemento Pós-Regulatório do Vírus da Hepatite Woodchuck (WPRE) (Donello e outros, J. Virol. (1998) 72: 5085 a 5092) ou o sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH). Em adição, as sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotioneína de murinos, também encontrarão uso no presente. Tais sequências promotoras estão comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, de Stratagene (San Diego, CA).

[000110] Para algumas aplicações de terapia gênica do SNC, pode ser necessário controlar a atividade transcricional. Para esse fim, a regulação farmacológica da expressão gênica com vetores virais pode ser obtida incluindo vários elementos regulatórios e promotores res- ponsivos a fármacos como descrito, por exemplo, em Haberma e outros, Gene Ther. (1998) 5: 1604 a 16011; e Ye e outros, Science (1995) 283: 88 a 91.

[000111] O vetor de expressão de AAV que hospeda a molécula de polinucleotídeo de interesse limitada pelas ITRs de AAV, pode ser construído inserindo-se diretamente a sequência(s) selecionada em um genoma de AAV que teve os principais quadros de leitura aberta ("ORFs”) de AAV excisados dela. Outras partes do genoma de AAV podem também ser deletadas, contanto que uma parte suficiente das ITRs permaneça para permitir as funções de replicação e empacota mento. Tais construtos podem ser projetados usando técnicas bem conhecidas na área. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 5.173.414 e 5.139.941; Publicação Internacional Nos. WO 92/01070 (publicada em 23 de janeiro de 1992) e WO 93/03769 (publicada em 4 de março de 1993); Lebkowski e outros (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988 a 3996; Vincent e outros (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533 a 539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158: 97 a 129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793 a 801; Shelling e Smith (1994) Gene Therapy 1: 165 a 169; e Zhou e outros (1994) J. Exp. Med. 179: 1867 a 1875.

[000112] Alternativamente, as ITRs de AAV podem ser excisadas do genoma viral ou de um vetor de AAV contendo os mesmos 5’ e 3’ fun-didos de urn construto de ácido nucleico selecionado que está presente em outro vetor usando técnicas de ligação padrão, tal como aquelas descritas em Sambrook e outros, acima. Por exemplo, as ligações po-dem ser alcançadas em 20 mM Tris-CI pH 7,5, 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM a 50 mM NaCI, e ou 40 μM ATP, 0,01 a 0,02 (Weiss) unidades T4 DNA ligase a 0° C (para ligação de "extre-midade pegajosa”) ou 1 mM ATP, 0,3 a 0,6 (Weiss) unidades T4 DNA ligase a 14° C (para ligação de "extremidade blunt”). As ligações in- termoleculares de "extremidade pegajosa” são geralmente executadas a 30 a 100 μg/ml de concentrações de DNA total (5 a 100 nM de con-centração em extremidade total). Os vetores de AAV que contêm ITRs foram descritos, por exemplo, na Patente US No. 5.139.941. Em parti-cular, vários vetores de AAV que são descritos estão disponíveis a partir da Coleção Americana de Cultura de Tipos ("ATCC”) sob os Números de Acesso 53222, 53223, 53224, 53225 e 53226.

[000113] Em certas modalidades, os vetores de expressão de rAAV são fornecidos como construtos de rAAV autocomplementares. Tipi- camente, o DNA de rAAV é empacotado no capsideo viral como uma molécula de DNA de único filamento (ssDNA) de aproximadamente 4600 nucleotideos de comprimento. Após a injeção da célula pelo vírus, o filamento de DNA único é convertido em um DNA de filamento duplo (dsDNA). Somente o dsDNA é útil a proteínas da célula que transcrevem o gene ou genes contidos no RNA. Assim, o esquema de replicação convencional de AAV exige a síntese de novo de um fila-mento de DNA complementar. Essa etapa de converter o genoma de AAV de ssDNA no dsDNA antes da expressão pode ser driblada pelo uso de vetores autocomplementares (sc).

[000114] Os vetores autocomplementares são produzidos por filamentos complementares de pareamento de base a partir de dois vírus infec-ciosos, que não exige síntese de DNA (ver, por exemplo, Nakai e outros, J. Virol. (2000) 74: 9451 a 9463). Esse pareamento de bases interfila- mentos, ou anelamento de filamentos (SA), é possível por causa de pa-cotes de AAV ou o filamento de filamento de DNA mais ou menos com igual eficiência (Berns, K. I., Microbiol. Rev. (1990) 54: 316 a 329).

[000115] Assim e sem estar limitado à teoria, a necessidade por con-versão de dsDNA, ou por síntese de SA ou de DNA, pode ser inteira-mente burlada empacotando-se ambos os filamentos como uma única molécula. Isso pode ser alcançado tirando vantagem da tendência de AAV produzir genomas diméricos de repetição invertida durante o ciclo de replicação de AAV. Se esses dímeros são pequenos o bastante, eles podem ser empacotados da mesma maneira que os genomas de AAV convencionais, e as duas metades da molécula de ssDNA podem se dobrar e parear as bases para formar uma molécula de dsDNA de metade do comprimento. A conversão de dsDNA é independente da síntese de DNA da célula hospedeira e da concentração de vetor (McCarty e outros, Gene Ther. (2001) 8: 1248 a 1254).

[000116] Os construtos virais de scAAV incluem aproximadamente 4,6 kb e são capazes de serem empacotados no capsídeo de AAV normal. Cada um dos sorotipos de AAV conhecidos é capaz de empacotar os genomas de scAAV com eficiência similar (ver, por exemplo, Sipo e outros, Gene Ther. (2007) 14: 1319 a 1329). Assim, em certas modalidades da presente invenção, o vetor de scAAV compreende proteínas de cap- dsídeo de sorotipos selecionados a partir de sorotipos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 ou AW9. Entretanto, um vetor de scAAV pode compreender proteínas de capsídeo de qualquer um dos sorotipos conhecidos ou proteínas de capsídeo modificadas conhecidas na técnica. Esses vetores de scAAV podem também ser vetores pseudo- tipados compreendendo os que contêm o genoma de um sorotipo de AAV no capsídeo de um segundo sorotipo de AAV. Tais vetores podem compreender, por exemplo, um vetor de AAV que contém o capsídeo de AAV2 e o genoma de AAV1 ou um vetor de AAV que contém o capsídeo de AAV5 e o genoma de AAV2 (Auricchio e outros (2001) Hum. Mol. Genet, 10(26): 3075 a 3081).

[000117] Inicialmente, acredita-se que a sequência de transgene em um vetor de scAAV poderia somente compreender aproximadamente 2,2 kb. Entretanto, parece que há maior latitude na capacidade de empaco-tamento do que acreditava-se anteriormente. Por exemplo, Wu e outros, Human Gene Ther. (2007) 18:171 a 182, empacotou com sucesso cons-trutos de scAAV-2 excedendo 3.300 bp e demonstrou genomas diméri- cos de repetição invertida que eram completamente resistentes a DNase. Esses vetores produziram aumentos esperados na eficiência da transdu- ção sobre ssAAV quando testados em células cultivadas.

[000118] Os vetores de scAAV podem ser produzidos ou por geração de plasmideos de vetor que são aproximadamente metade do tamanho do genoma convencional combinados com a purificação seletiva da forma infecciosa de filamento duplo, ou através do uso de plasmideos de vetor de aproximadamente meio genoma com uma mutação em uma das sequências de resolução terminal do virus AAV que fornece a síntese de vírus de filamento duplo. Ambas as estratégias geram genomas virais de filamento + e - que são covalentemente ligados em uma repetição terminal.

[000119] Em particular, a geração de genomas de AAV monoméricos normais conta com a resolução eficiente das duas ITRs uma a uma, com cada volta da síntese de DNA. Essa reação é mediada pela atividade de endonuclease de ssDNA das duas isoformas maiores do Rep de AAV. O cruzamento da ITR no sítio de resolução terminal é seguido por alongamento de DNA a partir do cruzamento por DNA polimerase hospedeira. Os genomas diméricos são formados quando Rep falha em cruzar o sítio de resolução terminal antes de ser alcançado pelo complexo de replicação iniciado na outra extremidade.

[000120] O rendimento de genomas diméricos em um scAAV prep. pode ser aumentado drasticamente inibindo a resolução em uma repetição terminal. Isso é prontamente alcançado deletando-se a sequência de sítio de resolução terminal de uma ITR, tal que a proteína Rep não possa gerar o cruzamento ssDNA essencial (ver, por exemplo, McCarty e ouros, Gene Ther. (2003) 10: 2112 a 2118 e Wang e outros, Gene Ther. (2003) 10: 2015 a 2111). O complexo de replicação iniciado na outra ITR então copia através de "hairpin” e de volta em direção à extremidade de início. A replicação prossegue para a extremidade da molécula modelo, deixando uma repetição invertida de dsDNA com uma ITR de ocorrência natural em cada extremidade e a ITR mutada no meio. Essa repetição invertida dimérica pode então passar por ciclos normais de replicação a partir das duas extremidades de ITR de ocorrência natural. Cada filamento filho deslocado compreende repeti-ção invertida de ssDNA com uma ITR completa em cada extremidade e uma ITR mutada no meio. O empacotamento no capsídeo de AAV começa na extremidade 3’ do filamento deslocado. A produção de scAAV de construtos com uma ITR mutada tipicamente produz mais de 90% de genomas diméricos.

[000121] A produção e a purificação de vetor de scAAV a partir de construtos de ITR mutados são as mesmas do ssAAV convencional, como descrito abaixo. Entretanto, se é usado "dot blot” ou "Southern blot”, o DNA do vetor é preferencialmente aplicado a membranas de hibridização sob condições alcalinas para impedir o reanelamento dos filamentos complementares. Adicionalmente, é possível que um sítio de cruzamento Rep artificial seja produzido próximo o bastante à ITR mutada para permitir a resolução terminal e a geração de genomas monômeros. Isso pode tipicamente ser evitado girando o cassete de transgene em torno com relação às repetições de terminal mutantes e de ocorrência natural.

[000122] Ver, por exemplo, McCarty, D. M., Molec. Ther. (2008) 16: 1648 a 1656; McCarty e outros, Gene Ther. (2001) 8: 1248 a 1254; McCarty e outros, Gene Ther. (2003) 10: 2112 a 2118; Wang e outros, Gene Ther. (2003) 10: 2105 a 2111; Wu e outros, Human Gene Ther. (2007) 18: 171 a 182; Publicação de Patente US Nos. 2007/0243168 e 2007/0253936, incorporadas integralmente no presente por referência; bem como os exemplos fornecidos no presente, para métodos de pro-duzir construtos de scAAV.

[000123] Para os propósitos da invenção, as células hospedeiras adequadas para produzir virions de rAAV a partir dos vetores de ex-pressão de AAV (ou convencionais ou vetores sc) incluem micro-organismos, células de levedura, células de inseto, e células de mamí-feros, que podem ser, ou que foram usados como receptores de uma molécula de DNA heteróloga e que são capazes de serem cultivadas, por exemplo, em cultura de suspensão, em um biorreator, ou similares. O termo inclui a progénie da célula original que foi transfectada. Assim, uma "célula hospedeira”, como usada no presente, geralmente se refe- re a uma célula que fol transfectada com uma sequência de DNA exó-gena. As células da linhagem de células humanas estável, 293 (pron-tamente disponível através, por exemplo, da Coleção Americana de Culturas de Tipos sob o número de acesso ATCC CRL1573) são pre-ferenciais na prática da presente invenção. Particularmente, a linhagem de células humanas 293 é uma linhagem de células embrionárias humanas do rim que foi transformada com fragmentos de DNA de adenovirus tipo 5 (Graham e outros (1977) J. Gen. Virol. 36: 59), e ex-pressam os genes E1a e E1b adenovirais (Aiello e outros (1979) Viro-logy 94: 460). A linhagem de célula 293 é prontamente transfectada, e fornece uma plataforma particularmente conveniente na qual se produz virions de rAAV.

Funções Auxiliares de AAV

[000124] As células hospedeiras contendo os vetores de expressão de AAV descritos acima precisam ser capazes de fornecer funções auxilia-res de AAV de modo a replicar e encapsidar as sequências de nucleotí-deo flanqueadas pelas ITRs de AAV para produzir virions de rAAV. As funções auxiliares de AAV são geralmente sequências de codificação derivadas de AAV que podem ser expressas para fornecer produtos gê- nicos de AAV que, por sua vez, funcionam em trans para replicação de AAV produtiva. As funções auxiliares de AAV são usadas no presente para complementar as funções de AAV necessárias que são perdidas dos vetores de expressão de AAV. Assim, as funções auxiliares de AAV incluem uma, ou ambas as principais ORFs de AAV, chamadas regiões de codificação rep e cap, ou homólogos funcionais dessas.

[000125] Por "região de codificação rep de AAV” entende-se a região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de replicação Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40. Esses produtos de expressão de Rep mostraram possuir muitas funções, incluindo reco-nhecimento, ligação e cruzamento da origem de AAV de replicação de DNA, atividade de DNA helicase e modulação da transcrição a partir de promotores de AAV (ou outros heterólogos). Os produtos de expressão de Rep são coletivamente exigidos para replicar o genoma de AAV. Para uma descrição da região de codificação rep de AAV, ver, por exemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158: 97 a 129; e kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793 a 801. Os homólogos adequados da região de codificação rep de AAV incluem o gene rep do virus da herpes humana 6 (HHV-6) que é também conhecido por mediar a replicação de DNA de AAV-2 (Thomson e outros (1994) Virology 204: 304 a 311).

[000126] Por "região de codificação cap de AAV” entende-se a região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3, ou homólogos funcionais das mesmas. Esses produtos de expressão de Cap fornecem as funções de empa-cotamento que são coletivamente exigidas para empacotar o genoma virai. Para uma descrição da região de codificação cap de AAV, ver, por exemplo, Muzyczka, N. e Kotin, R. M. (acima).

[000127] As funções auxiliares de AAV são introduzidas na célula hos-pedeira transfectando-se a célula hospedeira com um construto auxiliar de AAV ou antes, ou simultaneamente com a transfecção do vetor de expressão de AAV. Os construtos auxiliares de AAV são assim usados para fornecer ao menos expressão transiente de genes rep e/ou cap de AAV para complementar as funções de AAV perdidas que são necessá-rias para a infecção de AAV produtiva. Os construtos auxiliares de AAV carecem de ITRs de AAV e nem podem se replicar nem se empacotar.

[000128] Esses construtos podem estar na forma de um plasmideo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou vírion. Um número de construtos auxiliares de AAV foi descrito, tal como os plasmídeos geralmente usados pAAV/Ad e plM29+45 que codificam tanto os produtos de ex-pressão de Rep quanto de Cap. Ver, por exemplo, Samulski e outros (1989) J. Virol. 63: 3822 a 3828; e McCarty e outros (1991) J. Virol. 65: 2936 a 2945. Um número de outros vetores foi descrito, os quais codi-ficam produtos de expressão de Rep e/ou Cap. Ver, por exemplo, Pa-tente US No. 5.139.941.Funções Acessórias de AAV

[000129] A célula hospedeira (ou célula de empacotamento) precisa também ser capaz de fornecer funções não derivadas de AAV, ou "funções acessórias”, de modo a produzir virions de rAAV. As funções acessórias não são derivadas de AAV e/ou funções celulares mediante as quais AAV é dependente para sua replicação. Assim, as funções acessórias incluem ao menos aquelas proteínas não AAV e RNAs que são exigidos na replicação de AAV, incluindo aqueles envolvidos na ativação de transcrição de gene de AAV, recomposição de mRNA de AAV estágio-específica, replicação de DNA de AAV, síntese de produ-tos de expressão de Cap e conjunto de capsídeos de AAV. As funções acessórias de base virai podem ser derivadas de qualquer dos vírus auxiliares conhecidos.

[000130] Em particular, as funções acessórias podem ser introduzidas e então expressar em células hospedeiras usando métodos conhecidos na técnica. Tipicamente, as funções acessórias são fornecidas por infecção das células hospedeiras com um vírus auxiliar não relacionado. Um número de vírus auxiliares adequados é conhecido, incluindo adenovirus, vírus da herpes tal como o vírus da herpes simples tipos 1 e 2; e vírus da varíola. As funções acessórias não virais também encontrarão uso no presente, tal como aquelas fornecidas por sincronização celular usando quaisquer dos vários agentes conhecidos. Ver, por exemplo, Buller e outros (1981) J. Virol. 40: 241 a 247; McPherson e outros (1985) Virology 147: 217 a 222; Schlehofer e outros (1986) Virology 152: 110 a 117.

[000131] Alternativamente, as funções acessórias podem ser forne cidas usando um vetor de função acessória como definido acima. Ver, por exemplo, Patente US No. 6.004.797 e Publicação Internacional No. WO 01/83797, incorporada integralmente no presente por referência. As sequências de ácido nucleico fornecendo as funções acessórias podem ser obtidas a partir de fontes naturais, tal como a partir do genoma de uma partícula de adenovirus, ou construídas usando métodos recombinantes ou sintéticos conhecidos na técnica. Como explicado acima, demonstrou-se que o complemento completo de genes de adenovirus não é exigido para funções auxiliares acessórias. Em particular, os adenovirus mutantes incapazes de replicação de DNA e de síntese de genes posterior mostraram-se permissivos para replicação de AAV. Ito e outros (1970) J. Gen. Virol. 9: 243; Ishibashi e outros (1971) Virology 45: 317. Similarmente, os mutantes dentro das regiões E2B e E3 mostraram suportar replicação de AAV, indicando que as regiões E2B e E3 provavelmente não estão envolvidas em fornecer funções acessórias. Carter e outros (1983) Virology 126: 505. Entretanto, os adenovirus com defeito na região E1, ou tendo uma região E4 deletada, são incapazes de suportar a replicação de AAV. Assim, as regiões E1A e E4 são igualmente exigidas para replicação de AAV, ou direta ou indiretamente. Laughlin e outros, (1982) J. Virol. 41: 868; Janik e outros, (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1925; Carter e outros, (1983) Virology 126: 505. Outros mutantes Ad caracterizados incluem: E1B (Laughlin e outros (1982), acima; Janik e outros (1981), acima; Ostrove e outros, (1980) Virology 104: 502); E2A (Handa e ou-tros, (1975) J. Gen. Virai. 29: 239; Strauss e outros, (1976) J. Virol. 17: 140; Myers e outros, (1980) J. Virol. 35: 665; Jay e outros, (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2927; Myers e outros, (1981) J. Biol. Chem. 256: 567); E2B (Carter, Adenoassociated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter e outros, (1983), acima); e E4 (Carter e outros (1983), acima; Carter (1995)). Embora estudos das funções acessórias fornecidas por ade-novirus tendo mutações na região de codificação E1B tenham produzido resultados conflitantes, Samulski e outros, (1988) J. Virol. 62: 206 a 210, relatou que E1B55k é exigido para a produção de vírion de AAV, enquanto E1B19k não é. Em adição, a Publicação Internacional WO 97/17458 e Matshushita e outros, (1998) Gene Therapy 5: 938 a 945, descrevem vetores de função acessória codificando vários genes Ad. Particularmente, os vetores de função acessória preferenciais compreendem uma região de codificação de RNA de adenovirus VA, uma região de codificação de ORF6 de adenovirus E4, uma região de codificação de 72 kD de adenovirus E2A, uma região de codificação de adenovirus E1A, e uma região de adenovirus E1B carecendo de uma região de codificação E1B55k intacta. Tais vetores são descritos na Publicação Internacional No. WO 01/83797.

[000132] Como uma consequência da infecção da célula hospedeira com um vírus auxiliar, ou a transfecção da célula hospedeira com um vetor de função acessória, as funções acessórias que são expressas transativam o construto auxiliar de AAV para produzir proteínas Rep e/ou Cap de AAV. Os produtos de expressão de Rep excisam o DNA recombinante (incluindo o DNA de interesse) do vetor de expressão de AAV. As proteínas Rep também servem para duplicar o genoma de AAV. As proteínas Cap expressas reúnem-se em capsídeos, e o ge-noma de AAV recombinante é empacotado nos capsídeos. Assim, se-gue-se a replicação de AAV produtiva, e o DNA é empacotado em vi-rions de rAAV. Um "vírion de AAV recombinante” ou "vírion de rAAV” é definido no presente como um vírus infeccioso de replicação defeituosa incluindo um invólucro de proteína de AAV, encapsidando uma sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse que é flanqueada em ambos os lados por ITRs de AAV.

[000133] Após a replicação de AAV recombinante, os virions de rA- AV podem ser purificados a partir da célula hospedeira usando uma variedade de métodos de purificação convencionais, tal como croma- tografia em coluna, gradientes CsCI, e similares. Por exemplo, uma pluralidade de etapas de purificação em coluna pode ser usada, tal como purificação sobre uma coluna de troca aniônica, uma coluna de afinidade e/ou uma coluna de troca catiônica. Ver, por exemplo, Publi-cação Internacional No. WO 02/12455. Ademais, se a infecção é em-pregada para expressar as funções acessórias, o vírus auxiliar residual pode ser inativado, usando métodos conhecidos. Por exemplo, os adenovirus podem ser inativados aquecendo-os a temperaturas de aproximadamente 60° C, por exemplo, por 20 minutos ou mais. Esse tratamento inativa efetivamente somente o vírus auxiliar desde que o AAV é extremamente estável ao calor enquanto o adenovirus auxiliar é lábil ao calor.

[000134] Os virions de rAAV resultantes contendo a sequência de nucleotídeo de interesse podem então ser usados para distribuição gênica usando as técnicas descritas abaixo.

Composições e Distribuição A. Composições

[000135] Uma vez produzidos, os virions de rAAV codificando o gene de interesse, serão formulados em composições adequadas para distri-buição. As composições compreenderão material genético suficiente para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz do gene de inte-resse, isto é, uma quantidade suficiente para (1) impedir o desenvolvi-mento da doença ou fazer com que a doença ocorra com menos inten-sidade em um indivíduo que pode ser exposto ou predisposto à doença, mas que não experimentou ainda ou exibiu sintomas da doença, (2) ini-bir a doença, isto é, interromper o desenvolvimento do estado da doença ou reverter o estado da doença, ou (3) aliviar os sintomas da doença, isto é, diminuir o número de sintomas experimentados pelo indivíduo, bem como mudar a patologia celular associada com a doença.

[000136] As doses apropriadas também dependerão do mamífero que está sendo tratado (por exemplo, humano ou primata não humano ou outro mamífero), idade e condição geral do indivíduo a ser tratado, a gravidade da condição que está sendo tratada, o modo de adminis-tração, entre outros fatores. Uma quantidade eficaz apropriada pode ser prontamente determinada por um versado na técnica e quantidades representativas são fornecidas abaixo.

[000137] As composições também conterão um excipiente farmaceu-ticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farma-cêutico que não induz a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que está recebendo a composição, e que podem ser administrados sem toxicidade indevida. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sorbitol, qualquer um dos vários compostos TWEEN, e líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos nes-tes, por exemplo, sais de ácido mineral tal como cloridratos, bromidra- tos, fosfatos, sulfatos, e similares; e os sais de ácidos orgânicos tal co-mo acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e similares. Adicio-nalmente, substâncias auxiliares, tal como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias de tamponamento de pH, e similares, po-dem estar presentes em tais veículos. Uma discussão completa de ex-cipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMING-TON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

[000138] As formulações podem ser líquidas ou sólidas, por exemplo, liofilizadas. As formulações podem também ser administradas como aerossóis.

[000139] Uma formulação particularmente útil compreende o vírion de rAAV de interesse em combinação com um ou mais álcoois di- hídricos ou poli-hídricos, e, opcionalmente, um detergente, tal como éster de sorbitano. Ver, por exemplo, Patente US No. 6.764.845, in-corporada integralmente no presente por referência.

B. Distribuição

[000140] Geralmente, os virions recombinantes são introduzidos no indivíduo usando ou técnicas de transdução in vivo ou in vitro. Se tran- duzidos in vitro, a célula receptora desejada será removida do indivíduo, transduzida com o vetor recombinante e reintroduzida no indivíduo. Alternativamente, células singênicas ou xenogênicas podem ser usadas em que aquelas células não gerarão uma resposta imune ina- propriada no indivíduo. As células adequadas para distribuição a animais hospedeiros mamíferos incluem tipos de células de mamíferos de órgãos, tumores ou linhagens de células. Por exemplo, células huma-nas, murinas, de cabras, ovinas, bovinas, caninas, felinas e porcinas podem ser usadas. Os tipos de células adequados para uso incluem sem limitação, fibroblastos, hepatócitos, células endoteliais, queratinó- citos, células hematopoiéticas, células epiteliais, miócitos, células neu-ronais, e células tronco. Adicionalmente, as células progenitoras neu- rais podem ser transduzidas in vitro e então distribuídas ao SNC.

[000141] As células podem ser transduzidas in vitro combinando-se virions recombinantes com a célula desejada em meios apropriados, e as células podem ser triadas quanto aquelas células hospedando o DNA de interesse usando técnicas convencionais tal como Southern blots e/ou PCR, ou usando marcadores selecionáveis. As células transduzidas podem então ser formuladas em composições farmacêu-ticas, como descrito acima, e a composição introduzida no indivíduo por várias técnicas como descrito abaixo, em uma ou mais doses.

[000142] Para distribuição in vivo, os virions recombinantes serão formulados em composições farmacêuticas e uma ou mais dosagens podem ser administradas diretamente da maneira indicada. Para iden-tificação de estruturas no cérebro humano, ver, por exemplo, Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2a Ed., eds. Deuteron e outros, Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai e outros, Academic Press; 1997; e Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack e outros, Thyme Medical Pub., 1988. Para a identificação de estruturas no cérebro de camundongos, ver, por exemplo, The Mouse Brain in Stero-taxic Coordinates, 2a Ed., Academic Press, 2000. Se desejado, a estru-tura do cérebro humano pode estar correlacionada com estruturas si-milares no cérebro de outro mamífero. Por exemplo, a maior parte dos mamíferos, incluindo humanos e roedores, mostra uma organização topográfica das projeções entorrinal-hipocampo, com neurônios na parte lateral tanto do córtex entorrinal lateral quando do córtex medial se projetando na parte dorsal ou polo septal do hipocampo, em que a projeção no hipocampo ventral se origina principalmente dos neurônios em partes medianas do córtex entorrinal (Principles of Neural Science, 4a Ed., eds. Kandel e outros, McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2a Ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Ademais, as células da camada II do córtex entorrinal se projetam para o giro den-teado, e elas terminam nos dois terços externos da camada molecular do giro denteado. Os axônios das células da camada III se projetam bilateral mente nas áreas de cornu ammonis CA1 e CA3 do hipocampo, terminando na camada molecular statum lacunose.

[000143] Para distribuir o vetor especificamente a uma região particular do sistema nervoso central, especialmente a uma região particular do cérebro, ele pode ser administrado por microinjeção estereotáxi- ca. Por exemplo, no dia da cirurgia, os pacientes que têm base de quadro estereotáxico fixa no local (aparafusada no crânio). O cérebro com base de quadro estereotáxico (MRI-compatível com marcações fiduciárias) será submetido à imagiologia usando MRI de alta resolu- ção. As imagens MRI serão então transferidas para um computador que executa software estereotáxico. Uma série de imagens coronais, sagitais e axiais será usada para determinar o sítio alvo de injeção de vetor, e trajetória. O software traduz diretamente a trajetória em coor-denadas tridimensionais apropriadas para o quadro estereotáxico. Ori-fícios de trepanação são perfurados acima do sítio de entrada e o apa-relho estereotáxico localizado com a agulha implantada na dada pro-fundidade. O vetor em um carreador farmaceuticamente aceitável será então injetado. O vetor é então administrado por injeção direta no sítio alvo primário e retrogradamente transportado para sítios alvo distais via axônios. As vias adicionais de administração podem ser usadas, por exemplo, aplicação cortical superficial sob visualização direta, ou outra aplicação não estereotáxica.

[000144] AAV recombinante de qualquer sorotipo pode ser usado na presente invenção, em que o AAV recombinante pode ser ou um AAV autocomplementar ou um AAV não autocomplementar. O sorotipo do vetor virai usado em certas modalidades da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, e AAV9 (ver, por exemplo, Gao e outros (2002) PNAS, 99: 11854 a 11859; e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Outro sorotipo além dos listados aqui podem ser usados. Ademais, vetores de AAV pseudotipados podem também ser utilizados nos métodos descritos aqui. Os vetores de AAV pseudotipados são aqueles que contêm o genoma de um sorotipo de AAV no capsídeo de um segundo sorotipo de AAV; por exemplo, um vetor de AAV que contém o capsídeo de AV2 e o genoma de AAV1 ou um vetor de AAV que contém o capsídeo de AAV5 e o genoma de AAV2 (Auricchio e outros, (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26): 3075 a 3081).

[000145] Os virions recombinantes ou células transduzidas in vitro podem ser distribuídos diretamente ao tecido neural tal como nervos periféricos, a retina, gânglios da raiz dorsal, junção neuromuscular, bem como o SNC, por injeção, por exemplo, na região ventricular, tal como um ou ambos os ventrículos laterais, bem como o estriado (por exemplo, o núcleo caudado ou putâmen do estriado), o cerebelo, medula espinhal, e junção neuromuscular, com uma agulha, cateter ou dispositivo relacionado, usando técnicas neurocirúrgicas conhecidas na técnica, tal como por injeção estereotáxica (ver, por exemplo, Stein e outros, J. Virol. 73: 3424 a 3429, 1999; Davidson e outros, PNSA 97: 3428 a 3432, 2000; Davidson e outros, Nat Genet. 3: 219 a 223, 1993; e Alisky e Davidson, Hum. Gene Ther. 11: 2315 a 2329, 2000). Em uma modalidade ilustrativa, a distribuição é executada por injeção direta de uma solução de vetor em alta titulação na medula espinhal de um indivíduo ou paciente.

[000146] Em outra modalidade ilustrativa, um método para distribuir um transgene à medula espinhal e/ou à região da haste do cérebro de um indivíduo administrando um vetor de AAV recombinante contendo o transgene a ao menos uma região do núcleo cerebelar profundo (NCP) do cerebelo do cérebro do indivíduo. Dentro do cerebelo está matéria cinzenta chamada de núcleo cerebelar profundo chamado núcleo medial (fastigial), o núcleo interposto (interpósito) e o núcleo lateral (dentado). Como usado aqui, o termo "núcleo cerebelar profundo” refere-se coletivamente a essas três regiões, em que uma ou mais dessas três regiões podem ser alvo. A distribuição virai está sob condições que favorecem a expressão do transgene na medula espinhal e/ou na região da haste do cérebro, em ao menos uma subdivisão da medula espinhal do indivíduo. Essas subdivisões incluem um ou mais dentre cervical, torácica, lombar ou sacral.

[000147] Sem estar limitada à teoria, uma modalidade da invenção está na capacidade de fornecer uma molécula terapêutica (por exem- pio, uma proteína ou peptideo) a cada divisão da medula espinhal. Isso pode ser executado injetando-se um vetor de AAV, incluindo um vetor de scAAV no DCN. Ademais, pode ser importante que o alvo seja uma lâmina individual dentro de cada divisão da medula espinhal. As lâminas são sub-regiões específicas dentro de regiões do cérebro e medula espinhal. Pode ser desejável em certas modalidades ter como alvo lâminas específicas dentro de uma certa divisão da medula espinhal. Como podem ocorrer danos ao neurônio motor dentro dos neurônios motores superiores também, pode ser desejável fornecer uma molécula terapêutica (por exemplo, uma proteína ou peptideo) às divisões da haste do cérebro. Em uma modalidade, pode ser desejável fornecer a molécula terapêutica tanto à medula espinhal, incluindo algumas ou todas as subdivisões, como também à haste do cérebro, incluindo algumas ou todas as subdivisões. A presente invenção usa a introdução de um vetor de AAV no DCN para alcançar a distribuição descrita acima de uma molécula terapêutica à região da medula espinhal e/ou haste do cérebro.

[000148] Outro método para ter como alvo a medula espinhal (por exemplo, glia) é por distribuição intratecal, ao invés de no próprio tecido da medula espinhal. Tal distribuição apresenta muitas vantagens. A proteína alvo é liberada ao CSF circundante e diferentes vírus, proteínas liberadas podem penetrar no parênquima da medula espinhal, exatamente como fazem após injeções intratecais agudas. De fato, a distribuição intratecal de vetores virais pode manter a expressão local. Uma vantagem adicional de terapia gênica intratecal é que a via intra-tecal simula a administração de punção lombar (isto é, punção lombar) já em uso de rotina em humanos.

[000149] Outro método para administrar os vetores recombinantes ou células transduzidas é pela distribuição de neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG), por exemplo, por injeção no espaço epidural com subsequente difusão aos DRG. Por exemplo, os vetores recombinantes ou células transduzidas podem ser distribuídos via canulação intra- tecal sob condições em que a proteína é difundida aos DRG. Ver, por exemplo, Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38: 31 a 36; Jain, K. K., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9: 2403 a 2410.

[000150] Ainda outro modo de administração ao SNC usa um sistema de distribuição aprimorado por convecção (CED), que é qualquer distribuição não manual do vetor. Em uma modalidade do CED, um gradiente de pressão é criado via o uso de um sistema de distribuição não manual. Usando o CED, os vetores recombinantes podem ser dis-tribuídos a muitas células sobre grandes áreas do SNC. Ademais, os vetores distribuídos expressam eficazmente os transgenes em células do SNC (por exemplo, células gliais). Qualquer dispositivo de distribui-ção aprimorado por convecção pode ser apropriado para distribuição de vetores recombinantes. Em uma modalidade preferencial, o dispositivo é uma bomba osmótica ou uma bomba de infusão. Tanto as bombas osmóticas quanto as bombas de infusão estão comercialmente disponíveis a partir de uma variedade de fornecedores, por exemplo, Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Paio Alto, Califórnia. Tipicamente, um vetor recombinante é distribuído via dispositivos CED como segue. Um cateter, uma cânula ou outro dispositivo de injeção é inserido no tecido do SNC no indivíduo escolhido. Mapas este- reotáticos e dispositivos de posicionamento estão disponíveis, por exemplo, a partir da ASI Instruments, Warren, Ml. O posicionamento pode também ser conduzido usando mapas anatômicos obtidos por CT e/ou imagiologia MRI para ajudar a guiar o dispositivo de injeção ao alvo escolhido. Ademais, como os métodos descritos no presente podem ser praticados de modo que áreas relativamente grandes do indivíduo absorvam os vetores recombinantes, menos cânulas de infusão são necessárias. Como complicações cirúrgicas estão frequente mente relacionadas ao número de penetrações, esse modo de distri-buição serve para reduzir os efeitos colaterais vistos com técnicas de distribuição convencionais. Para uma descrição detalhada considerando a distribuição CED, ver a Patente US No. 6.309.634, incorporada integralmente no presente por referência.

[000151] A distribuição intracerebroventricular, ou intraventricular de um vetor de AAV recombinante pode ser executada em qualquer um ou mais dos ventrículos do cérebro, que são preenchidos com fluido cérebro-espinhal (CSF). O CSF é um fluido claro que preenche os ven-trículos, está presente no espaço subaracnoide, e circunda o cérebro e a medula espinhal. O CSF é produzido pelos plexos coroides e via se-gregação ou transmissão de fluido de tecido pelo cérebro para os ven-trículos. O plexo coroide é uma estrutura revestindo o piso do ventrículo lateral e o teto do terceiro e quarto ventrículos. Certos estudos indicaram que essas estruturas são capazes de produzir 400 a 600 ccs de fluido por dia consistente com uma quantidade para preencher os espaços nervosos centrais quatro vezes por dia. Em humanos adultos, o volume desse fluido foi calculado como sendo de 125 a 150 ml (4 a 5 oz). O CSF está em formação contínua, circulação e absorção. Certos estudos indicaram que aproximadamente 430 a 450 ml (quase 2 xícaras) de CSF podem ser produzidos a cada dia. Certos cálculos estimam que a produção é igual a aproximadamente 0,35 ml por minuto em adultos e 0,15 por minuto em crianças. Os plexos coroides dos ventrículos laterais produzem a maior parte do CSF. Ele flui através do forame de Monro para o terceiro ventrículo em que ele é adicionado por produção a partir do terceiro ventrículo e continua para baixo através do aqueduto de Sylvius até o quarto ventrículo. O quarto ventrículo adiciona mais CSF; o fluido então viaja para o espaço subaracnoide através do forame de Magendie e Luschka. Ele então circula por toda a base do cérebro, para baixo em torno da medula espinhal e para ci- ma sobre os hemisférios cerebrais. O CSF se esvazia no sangue via as vilosidades aracnoides e sinus vasculares intracranianos.

[000152] Em um aspecto, os métodos descritos incluem administrar ao SNC de um indivíduo afligido um vírion de rAAV carregando um transgene codificando um produto terapêutico e permitir que o trans- gene seja expresso dentro do SNC próximo ao sítio de administração em um nível suficiente para exercer um efeito terapêutico à medida que a proteína expressa é transportada via o CSF por todo o SNC. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de uma composição de vírion em alta titulação carregando um transgene terapêutico de modo que o produto transgênico seja expresso em um nível terapêutico em um primeiro sítio dentro do SNC distai ao sítio final de ação do produto expresso.

[000153] Em camundongos experimentais, o volume total de solução de AAV injetada está, por exemplo, entre 1 e 20 μL Para outros mamíferos, incluindo o humano, os volumes e taxas de distribuição são aproximadamente escalonados. O tratamento pode consistir de uma única injeção por sítio alvo, ou pode ser repetido em um ou mais sítios. Múltiplos sítios de injeção podem ser usados. Por exemplo, em algumas modalidades, em adição ao primeiro sítio de administração, uma composição contendo um vetor virai carregando um transgene é admi-nistrada a outro sítio que pode ser contralateral ou ipsilateral ao primeiro sítio de administração. As injeções podem ser únicas ou múltiplas, unilaterais ou bilaterais.

[000154] O tratamento de dosagem pode ser um único horário de administração de dose, contínua ou intermitentemente, ou múltiplos horários de administração das doses. Ademais, o indivíduo pode ser administrado como muitas doses como apropriado. Se múltiplas doses são administradas, a primeira formulação administrada pode ser igual ou diferente das formulações subsequentes. Assim, por exemplo, a primeira administração pode estar na forma de um vetor de AAV e a segunda administração na forma de um vetor de adenovirus, DNA de plasmideo, uma composição de proteína, ou similar. Ademais, a distri-buição subsequente pode também ser igual ou diferente do segundo modo de distribuição.

[000155] Em adição, o indivíduo pode receber o vetor de rAAV da presente invenção por uma combinação dos métodos de distribuição descritos aqui. Assim, um indivíduo pode receber injeções de um vetor de AAV em ao menos dois sítios de injeção selecionados a partir do grupo que consiste de injeções intracerebroventriculares, injeções dire-tas na medula espinhal, injeções intratecais, e injeções intraparenqui- mais no cérebro (por exemplo, o estriado, o cerebelo, incluindo o núcleo cerebelar profundo). Em uma modalidade, o indivíduo pode receber o vetor de rAAV via (1) ao menos uma injeção intracerebroventri- cular, e ao menos uma injeção direta na medula espinhal ou (2) ao menos uma injeção intracerebroventricular e ao menos uma injeção intratecal ou (3) ao menos uma injeção intracerebroventricular e ao menos uma injeção intraparenquimal no cérebro ou (4) ao menos uma injeção direta na medula espinhal e ao menos uma injeção intratecal ou (5) ao menos uma injeção direta na medula espinhal e ao menos uma injeção intraparenquimal no cérebro ou (6) ao menos uma injeção intratecal e ao menos uma injeção intraparenquimal no cérebro.

[000156] Dever-se-ia entender que mais de um transgene pode ser expressão pelo vírion recombinante distribuído. Alternativamente, veto-res separados, cada um expressando um ou mais transgenes diferentes, podem também ser distribuídos ao indivíduo como descrito aqui. Assim, múltiplos transgenes podem ser distribuídos simultânea ou se-quencialmente. Ademais, pretende-se também que os vetores distribu-ídos pelos métodos da presente invenção sejam combinados com outras composições e terapias adequadas. Adicionalmente, combinações de tratamento com proteína e ácido nucleico podem ser usadas.

[000157] Os métodos para determinar o meio mais eficaz de admi-nistração e as dosagens terapeuticamente eficazes são bem conhecidos pelos versados na técnica e variarão com o vetor, a composição da terapia, as células alvo, e o indivíduo sendo tratado. As doses tera-peuticamente eficazes podem ser prontamente determinadas usando, por exemplo, um ou mais modelos animais da doença particular em questão. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz” estará em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de exames clínicos. Por exemplo, para uma injeção in vivo de virions de rAAV, uma dose estará na ordem de aproximadamente 106 a 1015 partículas de genoma do vírus recombinante, mais preferencialmente 108a 1014 partículas de genoma do vírus recombinante, ou qualquer dose dentro dessas faixas que é suficiente para fornecer o efeito desejado. Em certas modalidades, a concentração ou titulação do vetor na composição é ao menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 109 tu/ml); ou (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 1010 iu/ml).

[000158] Para a transdução in vitro, uma quantidade eficaz de virions de rAAV a ser distribuída às células estará na ordem de 108 a 1013 do vírus recombinante. A quantidade de células transduzidas nas composições farmacêuticas, por sua vez, estará entre aproximadamente 104 a 1010 células, mais preferencial mente 105 e 108 células. Outras dosagens eficazes podem ser prontamente estabelecidas por um versado na técni-ca através de exames de rotina estabelecendo as curvas dose-resposta.

[000159] Geralmente, de 1 μl a 1 ml de composição será distribuído, tal como de 0,01 a aproximadamente 0,5 ml, por exemplo, aproximadamen-te 0,05 a aproximadamente 0,3 ml, tal como 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, etc. e qualquer número dentro dessas faixas, de composição será distribuído.

Modelos Animais

[000160] A eficácia terapêutica e a segurança usando os virions de AAV incluindo transgenes, como descritos acima, podem ser testadas em um modelo animal apropriado. Por exemplo, os modelos animais que parecem mais similares às doenças humanas incluem espécies animais que ou desenvolvem espontaneamente uma alta incidência da doença particular ou os que foram induzidos a isso.

[000161] Em particular, vários modelos animais para SMA são co-nhecidos e foram gerados. Ver, por exemplo, Summer C. J., NeuroRx (2006) 3: 235 a 245; Schmid e outros, J. Child Neurol. (2007) 22: 1004 a 1012. Como explicado acima, a base molecular de SMA, um distúrbio neuromuscular autossômico recessivo, é a perda homozigota do gene 1 de sobrevivência do neurônio motor (SMN1). Uma cópia quase idêntica do gene SMN1, chamada SMN2, é encontrada em humanos e modula a gravidade da doença. Em contraste aos humanos, os camundongos têm um único gene (SMN) que é equivalente ao SMN1. A perda homozigota desse gene é letal a embriões e resulta em morte celular massiva, que indica que o produto gênico SMN é necessário para a sobrevivência e função celular. A introdução de 2 cópias de SMN2 em camundongos carentes de SMN resgata a letalidade embrionária, resultando em camundongos com o fenótipo de SMA (Monani e outros, Hum. Mol. Genet. (2000) 9: 333 a 339. Um alto número de cópias de SMN2 resgata os camundongos porque proteína SMN suficiente é produzida nos neurônios motores. Ver, também, Hsieh-Li e outros, Nat. Genet. (2000) 24: 66 a 70, relatando a produção de linhas de camundongos transgênicos que expressam SMN2 humana. Em particular, os camundongos transgênicos hospedando SMN2 no fundo SMN-/- mostram mudanças patológicas na medula espinhal e em músculos esqueléticos similares às de pacientes com SMA. A gravidade das mudanças patológicas nesses camundongos está correlacionada com a quantidade de proteína SMN que continha a região codifi- cada pelo éxon 7. Os fenótipos nesse modelo de camundongo incluem perda de células do neurônio motor, atrofia dos músculos esqueléticos, junções neuromusculares aberrantes (NMJ), déficits comportamentais, paralisia, e uma vida reduzida de aproximadamente duas semanas. Le e outros, Hum. Mol. Genet. (2005) 14: 845 a 857.

[000162] Similarmente, os modelos animais para ALS são conhecidos. A ALS é uma doença neurodegenerativa fatal que é caracterizada por uma perda seletiva de neurônios motores no córtex, haste do cérebro e medula espinhal. A progressão da doença pode levar à atrofia do mem-bro, músculos axiais e respiratórios. A morte de células dos neurônios motores é acompanhada por gliose reativa, anormalidades no neurofila- mento, e uma perda significativa de grandes fibras mielinizadas nos tra-tos córtico-espinhais e raízes ventrais. Embora a etiologia de ALS seja pouco entendida, a evidência acumulada indica que ALS esporádica (ALSE) e familiar (ALSF) compartilham muitas características patológicas similares; assim, fornecendo uma esperança de que o estudo de qualquer forma levará a um tratamento comum. A ALSF representa aproximadamente 10% dos casos diagnosticados, dos quais 20% estão associados com mutações dominantemente herdadas em Cu/Zn superóxido dismutase (SOD1). Os camundongos transgênicos que expressam a proteína SOD1 humana mutante (por exemplo, camundongos SOD1G93A) recapitulam muitas características patológicas de ALS e são um modelo animal disponível para estudar ALS. Para ALSE, uma miríade de mecanismos patológicos foi implicada como a causa subjacente, incluindo ex- citotoxicidade induzida por glutamato, exposição à toxina, disfunção de proteossomo, danos mitocondriais, desorganização de neurofilamentos e perda de suporte neurotrófico.

[000163] A Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), também chamada de Encefalomielite Alérgica Experimental, fornece um modelo animal para EM. EAE lembra as várias formas e estágios de EM muito intimamente. EAE é uma doença autoimune desmielinizante e inflamatória, adquirida, aguda ou crônica. De modo a criar uma doença, os animais são injetados com proteínas que constituem mielina, a bainha isolante que circunda os neurônios. Essas proteínas induzem uma resposta autoimune nos animais injetados que desenvolvem um processo de doença que lembra muito a EM em humanos. EAE foi in-duzida em um número de diferentes espécies animais incluindo ca-mundongos, ratos, porquinhos da índia, coelhos, macacos, macacos rhesus e micos.

[000164] A atrofia muscular bulbar e espinhal (AMBE) é uma doença dos neurônios motores de início em adultos, causada pela expansão de uma repetição de trinucleotídeo (TNR) no éxon 1 do gene receptor de androgênio (RA). Esse distúrbio é caracterizado pela degeneração de neurônios motores e sensoriais, atrofia muscular proximal, e anor-malidades endócrinas, tal como ginecomastia e fertilidade reduzida. Somente os machos desenvolvem os sintomas, enquanto as fêmeas geralmente são assintomáticas. A base molecular de AMBE é a ex-pansão de uma repetição de CAG de trinucleotídeo, que codifica o trato de poliglutamina (poliQ), no primeiro éxon do gene do receptor de androgênio (RA). A característica patológica é inclusões nucleares (INs) contendo o mutante e RA truncado com poliQ expandida nos neurônios motores residuais na haste do cérebro e na medula espinhal, bem como em alguns outros órgãos viscerais. Vários modelos de camundongos transgênicos foram criados para estudar a patogênese de AMBE. Ver, por exemplo, Katsuno e outro, Cytogen. and Genome Res. (2003) 100: 243 a 251. Por exemplo, um modelo de camundongo transgênico carregando 239 CAGs puros sob promotor de RA humano e outro modelo carregando RA truncado com CAGs expandidos mostram insuficiência motora e Nls nucleares nos neurônios motores espinhais. Os camundongos transgênicos carregando RA humano de comprimento total com poliQ expandido demonstram insuficiência mo-tora progressiva e patologia neurogênica, bem como diferença sexual de fenótipos. Esses modelos recapitulam a expressão fenotípica observada em AMBE.

[000165] A Doença de Machado-Joseph (DMJ), também chamada de ataxia espinocerebelar tipo 3, é causada por ataxina-3 mutante com uma expansão de poliglutamina. Os modelos de camundongos de DMJ, bem como outras ataxias espinocerebelares por expansão de poliglutamina foram geradas. Para uma revisão desses modelos, ver, por exemplo, Gould, V. F. C. NeuroRX (2005) 2: 480 a 483.

[000166] Consequentemente, os modelos animais padrão na técnica estão disponíveis para a triagem e/ou avaliação quanto à atividade e/ou eficácia dos métodos e composições da invenção para o tratamento de doenças do neurônio motor.

Kits da Invenção

[000167] A invenção também fornece kits. Em certas modalidades, os kits da invenção compreendem um ou mais recipientes compreendendo vetores recombinantes codificando a proteína de interesse. Os kits podem ainda compreender um conjunto adequado de instruções, geralmente instruções escritas, com relação ao uso dos vetores para qualquer um dos métodos descritos no presente.

[000168] Os kits podem compreender os componentes em qualquer embalagem apropriada conveniente. Por exemplo, se os vetores re-combinantes são fornecidos como uma formulação seca (por exemplo, liofilizada ou um pó seco), um frasco com uma tampa resiliente é nor-malmente usado, de modo que os vetores possam ser facilmente res- suspensos injetando-se fluido através da tampa resiliente. Ampolas com tampas removíveis não resilientes (por exemplo, de vidro vedadas) ou com tampas resilientes são mais convenientemente usadas para formulações líquidas. Também observa-se embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como uma seringa ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba.

[000169] As instruções com relação ao uso ou aos vetores recombi-nantes geralmente incluem informação tal como dosagem, horário de dosagem, e via de administração para o método de uso pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens com múltiplas doses) ou doses subunitárias. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou inserção na embalagem (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções carregadas em um disco de armazenamento óptico ou magnético) são também aceitáveis.

2. Experimental

[000170] Em seguida apresentam-se exemplos de modalidades es-pecíficas para executar a presente invenção. Os exemplos são ofere-cidos para propósitos ilustrativos somente, e não são destinados a li-mitar o escopo da presente invenção de forma alguma.

[000171] Esforços foram feitos para assegurar a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro experimental e desvio deveriam, é claro, ser permitidos.

Materiais e Métodos

[000172] Vetores AAV. O quadro de leitura aberto de um gene SMN1 humano exemplificado (a sequência de quadro de leitura aberto é mostrada na figura 9A; a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na figura 9B; a sequência de nucleotídeo completa é encon-trada no GenBank número de acesso NM_000344) foi clonado em um plasmideo tipo ponte contendo ou as repetições terminais invertidas de AAV2 (ITR) e o promotor de β-actina de galinha (CBA) /acentuador de citomegalovírus 1,6 kb ou a ITR de scAAV2 e o promotor de β- glucuronidase humana 0,4 kb (GUSB). A restrição de tamanho do ge-noma recombinante na reação de empacotamento de scAAV exigiu o uso de um pequeno promotor (McCarty, D. M. Molec. Ther. (2008) 16: 1648 a 1656). Assim, o promotor GUSB de 0,4 kb foi escolhido porque ele é expresso de forma ubíqua por todo o SNC incluindo neurônios motores da medula espinhal (Passini e outros, J. Virol. (2001) 75: 12382 a 12392). Os plasmideos recombinantes foram cada um empacotado em um capsídeo de sorotipo 8 de AAV por cotransfecção de plasmideo triplo de células 293 humanas (ver, por exemplo, Patente US No. 6.001.650, incorporada integralmente no presente por referência) e virions foram purificados por coluna como relatado anteriormente (O’Riordan e outros, J. Gene Med. (2000) 2: 444 a 454). Os vetores resultantes AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) e scAAV2/8-GUSB- hSMN1 (scAAV-hSMN1) possuíam titulações de 8,3 e 12 e 2,8 e 12 cópias de genoma por ml, respectivamente.

[000173] Animais e Procedimentos. Pares de cruzamento heterozigo- tos (SMN+A, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+) foram acasalados e, no dia do nasci-mento (P0), os filhotes recém-nascidos receberam 3 injeções totais de 2 μl cada nos ventrículos laterais cerebrais de ambos os hemisférios e na medula espinhal lombar superior. As doses totais de vetores virais foram 5,0 e 10 e 1,7 e 10 cópias de genoma para AAV-hSMN1 e scAAV- hSMN1, respectivamente. Todas as injeções foram aplicadas com uma agulha de micropipeta de vidro finamente formada como descrito (Passini e outros, J. Virol. (2001) 75: 12382 a 12392). Após as injeções, os filhotes tiveram a parte da frente das patas pregadas e genotipados (Le e outros, Hum. Mol. Genet. (2005) 14: 845 a 857) para identificar camundongos com SMA (SMN-/-, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+), heterozigotos, e de ocorrência natural (SMN+/+, hSMN2+/+, SMNΔ7+/+). Todas as ninhadas foram escolhidas para 7 filhotes para controlar o tamanho da ninhada na sobrevida. Alguns da ninhada não foram injetados de modo a gerar gru- pos de controle não tratados.

[000174] Western Blots. Para a análise bioquímica, camundongos tratados e não tratados foram mortos em 16 e 58 a 66 dias, foram as-pergidos com solução salina tamponada com fosfato (PBS), as medulas espinhais foram dessecadas e separadas nos segmentos lombar, torácico e cervical, e congeladas em nitrogênio líquido. Os tecidos foram homogeneizados em uma concentração de 50 mg/ml usando tampão de lise T-Per e coquetel inibidor de protease (Pierce, Rockford, IL). Os homogenados foram clareados por centrifugação em 10.000 RCF por 6 minutos e a concentração de proteína foi medida por ensaio BOA (Pierce, Rockford, IL). 10 a 20 μg de proteina homogenada foram redissolvidos em um SDS-PAGE a 4 a 12%, transferidos para mem-brana de nitrocelulose, e sondados com um anticorpo anti-SMN mono-clonal de camundongo (1:5.000, BD Biosciences, San Jose, CA) e um anticorpo anti-β-tubulina policlonal de coelho (1:750, Santa Cruz Bio-technology, Santa Cruz, CA). As membranas foram incubadas com anticorpos secundários infravermelhos (1:20.000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB), e faixas de proteínas foram visualizadas por fluorescência quantitativa usando Odyssey (LI-COR Biosciences). Os marcadores de peso molecular confirmaram os tamanhos das faixas.

[000175] Imuno-histoquímica. Para análise histológica, camundongos tratados e não tratados foram mortos em 16 e 58 a 66 dias, foram as-pergidos com paraformaldeído a 4% (pH 7,4), as medulas espinhais foram removidas e colocadas em sacarose a 30% por 48 a 72 horas, embebidas em OCT e cortadas em seções congeladas de 10 μm por um criostato. As seções de medula espinhal foram bloqueadas por 1 hora em temperatura ambiente (RT) e então incubadas com ou um anticorpo monoclonal anti-SMN de camundongo (diluição de 1:200) para identificar expressão de hSMN derivada de AAV, ou um anticorpo policlonal anti-colina acetil transferase (ChAT) de cabra (Millipore, Burling- ton, MA; diluição de 1:100) para identificar neurônios motores de lâmina 8 e 9 (corno ventral) da medula espinhal ou um anticorpo policlonal anti-proteína fibrilar glial ácida de coelho (GFAP) (Sigma-Aldrich, diluição de 1:2.500) para detectar astrócitos. Os anticorpos primários foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente seguida por uma incubação de um dia para o outro a 4o C em uma câmara umidificada. As seções de medula espinhal foram então incubadas por 1 hora em temperatura ambiente ou com um anticorpo secundário anticoelho conjugado à FITC ou um anticorpo secundário anticabra conjugado à Cy3 (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; diluição de 1:250). Para aumentar o sinal imunopositivo para SMN e ChAT, um kit de am-plificação de sinal TSA (Perkin Elmer; Waltham, MA) ou um protocolo de recuperação de antígeno de ácido cítrico (Vector Labs; Burlingame, CA) foram executados de acordo com a instrução do fabricante, res-pectivamente. As seções foram cobertas com lamela com meio de montagem Vectashield (Vector Labs; Burlingame, CA).

[000176] Contagem de Neurônios Motores. O número de células imu- nopositivas ChAT foi contado nos segmentos cervical, torácico e lombar. As contagens bilaterais foram executadas em aumento de 100x nos cor-nos ventrais ao longo do eixo rostrocaudal dos três segmentos da medu-la espinhal. As seções adjacentes estavam ao menos 100 microns afas-tadas para impedir contagem dupla da mesma célula. Cuidado especial foi tomado para comparar seções anatomicamente correspondentes en-tre diferentes animais, e todas as contagens de células foram avaliadas às cegas por um único observador. As células localizadas na lamina 8 e 9 da medula espinhal exibindo um sinal de ChAT fluorescente marcada- mente acima do fundo foram consideradas neurônios motores.

[000177] Tamanho das Miofibras. Para análise histológica da periferia, os músculos dos quadriceps fixados, gastrocnêmio e músculos in-tercostais do lado direito de cada camundongo foram processados por parafina e coloridos com hematoxilina-eosina para determinar o tamanho das miofibras como relatado por Avila e outros, J. Clin. Invest (2007) 117: 659 a 671. Aproximadamente 500 miofibras não sobrepostas de cada músculo por animal foram aleatoriamente selecionadas e fotografadas em 60x de aumento. As áreas transversais de cada mio- fibra foram medidas usando um software Metamorph (Molecular Devi-ces, Sunnyvale, CA).

[000178] Coloração de Junção Neuromuscular (NMJ). Os grupos de músculos fixados a partir do lado esquerdo de cada camundongo foram armazenados em PBS para análise da NMJ. A coloração "in toto” em fibras de músculos teased dos quadriceps, gastrocnêmio e músculos intercostais foi executada como relatado por Lesbordes e outros, Hum. Mol. Genet. (2003) 12: 1233 a 1239. Os terminais nervosos pré- sinápticos foram marcados por incubação de um dia para o outro a 4o C com um anticorpo policlonal de coelho contra a isoforma de neurofila- mento de 150 kD (NF-M, Millipore, Billerica, MA, diluição de 1:200), se-guida por um anticorpo secundário anti-coelho biotinilado (Jackson ImmunoResearch, diluição de 1:200). Os receptores de acetilcolina nas placas terminais dos músculos foram marcados com a-bungarotoxina conjugada à Alexa 555 (Molecular Probes, Eugene, OR) a 1:5.000 por 3 horas em temperatura ambiente. As fibras musculares coloridas foram montadas em lâminas, cobertas com lamela com Vectashield, e visuali-zadas sob epifluorescência. Para quantificação de NMJ, um mínimo de 100 NMJs a partir de cada músculo por animal foi aleatoriamente sele-cionado e avaliado por microscópio. Imagens confocais foram captura-das usando um microscópio Zeiss LSM 510-META.

[000179] Testes de Comportamento. No reflexo postural, cada ca-mundongo foi colocado em uma posição de supino e o tempo levado para o camundongo se reposicionar em todas as quatro patas foi me-dido. O procedimento foi repetido três vezes para cada animal, e a média dos três escores foi designada o reflexo postural. Se o camun-dongo não respondesse dentro de 60 segundos, o teste foi terminado. Na geotaxia negativa, cada camundongo foi colocado em uma plata-forma de 45° voltados para baixo. O teste foi considerado bem sucedido se o camundongo girasse 180° para a posição de "cabeça para cima”. A cada camundongo foram dadas três tentativas de completar a tarefa em 180 segundos ou menos. Na força de agarrar, os membros dianteiros e os membros traseiros foram colocados juntos em uma grade aramada e arrastando gentil mente horizontal mente ao longo da malha. A resistência foi registrada em gramas por um transdutor de força. No teste de abertura dos membros traseiros, cada camundongo foi suspenso por sua cauda por 5 segundos e a abertura resultante foi classificada com base em um sistema arbitrário. A uma abertura sau-dável de ambos os membros traseiros similar à observada em camun-dongos de ocorrência natural foi dado um escore de 4. A um ângulo agudo de abertura ou "abertura fraca” de ambos os membros traseiros foi dado um escore de 3. À abertura de uma única abertura foi atribuído um escore de 2. Um camundongo que não exibiu abertura foi dado um escore de 1. Finalmente, um escore de 0 ocorreu quando o filhote puxou ambos os membros traseiros juntos, cruzando-os um sobre o outro eficazmente.

[000180] Estatística. Os testes comportamentais, o número de neurônios motores, as áreas transversais das miofibras, e a NMJ foram analisados com múltiplos testes post hoc ANOVA de um fator e Bonferroni e com testes t de Student bilaterais não pareados. A curva de sobrevida de Kaplan-Meier foi analisada com o teste de Log-Rank equivalente ao teste Mantel-Haenszel. Todas as análises estatísticas foram executadas com GraphPad Prism v4.0 (Software GraphPad, San Diego, CA). Os valores com p < 0,05 foram considerados significativos.

Exemplo 1

[000181] Aumento significativo na sobrevida com tratamento usando distribuição de SMN1 mediada por AAV

[000182] Camundongos com SMA no dia 0 pós-natal (P0) foram inje-tados de forma intracerebroventricular com AAV-hSMN1 em ambos os ventrículos laterais cerebrais e por injeção direta na medula espinhal na medula espinhal lombar superior para uma dose total de 5,0 e 10 cópias de genoma por camundongos. Os camundongos com SMA tratados e não tratados foram aleatoriamente separados ou em grupo de sobrevivência no qual todos os camundongos foram deixados intactos e sacrificados em um abate humanizado, ou em um grupo de mesma idade no qual todos os camundongos foram sacrificados em 16 dias para comparações de idade com camundongos com SMA não tratados em estágio final.

[000183] No grupo de sobrevivência, os camundongos com SMA tra-tados com AAV-hSMN1 mostraram um aumento significativo na vida útil média para 50 dias (p < 0,0001), comparada a 15 dias em controles com SMA não tratados (figura 1). Todos os camundongos com SMA tratados estavam vivos em 15 dias, e 87,5% dos camundongos com SMA tratados estavam vivos em 19 dias comparados a 0% em SMA não tratada. A curva de Kaplan-Meier mostrou uma distribuição de sobrevida bimodal com tratamento, no qual o primeiro grupo morreu em 17 a 27 dias e o segundo grupo em 58 a 66 dias (figura 1). No primeiro grupo, a maioria dos camundongos com SMA tratados mostrou deambulação, mas os camundongos tiveram o crescimento atrasado e foram, por fim, encontrados mortos na gaiola. O segundo grupo de camundongos com SMA tratados em 58 a 66 dias mostrou deambulação e ganho de peso, mas eventualmente desenvolveu várias necroses nos membros traseiros que resultaram em eutanásia do animal. Como tal, os camundongos de 58 a 66 dias foram analisados em paralelo com o grupo de mesma idade de 16 dias.

Exemplo 2

[000184] Expressão Mediada por AAV de SMN na Medula Espinhal e Contagens de Neurônios Motores

[000185] Os níveis de proteína hSMN aumentaram por toda a medula espinhal após a administração no SNC de AAV-hSMN1. Em camun-dongos com SMA tratados com AAV em 16 dias, houve um aumento aproximado de 34,0 e 3,6 vezes nos níveis de proteína hSMN no seg-mento lombar injetado comparado a camundongos com SMA não tra-tados e camundongos de ocorrência natural, respectivamente (figura 2A). O aumento na expressão de proteína hSMN se estendeu para os outros segmentos, que incluíram um aumento de > 2,0 vezes acima dos níveis de ocorrência natural na medula espinhal torácica e cervical em 16 dias (figuras 2B e 2C). No segundo grupo, a expressão de proteína hSMN foi sustentada em camundongos com SMA tratados com AAV em 58 a 66 dias. A região lombar injetada e as regiões torácica e cervical vizinhas foram aproximadamente 2,5 vezes, 2,2 e 1,2 vezes maior do que os controles de ocorrência natural de mesma idade, res-pectivamente.

[000186] A imunocoloração de seções de tecido mostrou a proteína hSMN nos cornos dorsal e ventral da medula espinhal em camundongos com SMA tratados em 16 e 58 a 66 dias (figura 3). Mediante um exame mais próximo das células transduzidas, a expressão de hSMN derivada de vetor foi detectada em um padrão pontilhado por todo o citosol, e em estruturas do tipo gema no núcleo (figura 3A). Ademais, a proteína hSMN foi localizada para neuritos em estruturas tipo grânulo distintas que poderiam ser vistas atravessando o comprimento de dendritos e axônios (figuras 3B a 3D). O nível muito baixo de proteína hSMN endógena em camundongos com SMA estava abaixo do limite de imunodetecção em células (figura 3E).

[000187] A colocalização com ChAT e hSMN confirmou que um sub- conjunto das células transduzidas era, de fato, neurônios motores (figuras 3F a 31). Em 16 dias, aproximadamente 18 a 42% de células ChAT-positivas nos segmentos lombar, torácico e cervical da medula espinhal foram transduzidas por AAV-hSMN1 (figura 3J). Essa porcentagem foi maior em 58 a 66 dias, na qual 60 a 70% dos neurônios motores expressaram hSMN exógena nos três segmentos da medula espinhal (figura 3J). Houve um aumento geral no número de neurônios motores em camundongos com SMA tratados comparados a mutantes não tratados (figura 4). Entretanto, houve significativamente menos neurônios motores em camundongos com SMA tratados comparados a camundongos de ocorrência natural em 16 e 58 a 66 dias (figura 4).

[000188] A imunocoloração com hSMN de seções de tecido cervical de camundongos heterozigotos injetados somente na lombar, injetados somente intracerebroventricular (ICV), não tratados foi executada. As injeções ICV sozinhas não contribuíram para padrões de transdu- ção de AAV apreciáveis no cérebro, mas, no entanto, geraram direcio-namento substancial da medula espinhal cervical que não foi alcançável com injeções somente na lombar. Em particular, as injeções somente ICV resultaram na expressão na medula espinhal cervical de hSMN. Isso ocorreu em contraste à injeção intraparenquimal do segmento lombar que mostrou muito pouca transdução da medula espinhal cervical, presumidamente devido à proximidade distal com o sítio de injeção. Ocasionalmente, o sinal imunopositivo de SMN que possuía aparência similar a uma gema foi observado no núcleo de camundongos heterozigotos não tratados e de ocorrência natural. Entretanto, esse padrão de imunocoloração não foi observado no núcleo de ca-mundongos com SMA não tratados.

[000189] Assim, a combinação de injeções ICV e lombares em ca-mundongos P0 forneceu transdução amplamente difundida da medula espinhal. As injeções ICV de AAV8-hSMN foi direcionada à medula espinhal cervical para transdução.

Exemplo 3

[000190] Efeitos do Tratamento com AAV no Tamanho das Miofibras, na NMJ, e no Comportamento

[000191] Os músculos dos quadris (proximais), do gastrocnêmio (distais) e os músculos intercostais (respiratórios) foram escolhidos para análise porque eles mostram degeneração acentuada. Em camundongos com SMA não tratados em 16 dias, as miofibras eram pequenas e a maioria das células individuais continha uma área transversal de < 100 um2 (figura 5A). Menos de 10% das miofibras dos camundongos com SMA não tratados continha uma área transversal de mais de 200 um2. Em contraste, a distribuição dos tamanhos de miofibras em camundongos com SMA tratados com AAV-hSMN1 foi similar à dos camundongos de ocorrência natural, e muitas células possuem uma área transversal de mais de 200 e mais de 400 μm2 em 16 e 58 a 66 dias, respectivamente (figuras 5A e 5B). A média geral em 16 dias mostrou que as miofibras de camundongos com SMA tratados foram mais do que 2 vezes maior do que as de camundongos com SMA não tratados (figura 5C). Ademais, a área transversal média de miofibras em camundongos com SMA tratados em 58 a 66 dias foi 67%, 76% e 82% da área de miofibras de camundongos de ocorrência natural nos músculos dos quadriceps, gastrocnêmio e músculos intercostais, respectivamente (figura 5C).

[000192] A análise da junção neuromuscular (NMJ) de camundongos com SMA não tratados em 16 dias mostrou acúmulo anormal de prote-ína de neurofilamento no terminal pré-sináptico (figura 6A). Aproxima-damente 75 a 90% do término pré-sináptico dos quadriceps, gastroc-nêmio e músculos intercostais mostraram essa patologia característica em camundongos com SMA não tratados (figura 6F). Em contraste, a maioria do terminal pré-sináptico de camundongos com SMA tratados com AAV-hSMN1 não continha essa estrutura contraída (figura 6B, 6D). Somente 10 a 25% e 5% do terminal pré-sináptico de camundongos com SMA tratados mostraram essa patologia característica em 16 e 58 a 66 dias, respectivamente (figura 6F). Entretanto, o tratamento resultou em mais ramificação no terminal pré-sináptico comparado à ocorrência natural (figura 6B a 6E). Na NMJ pós-sináptica de camundongos com SMA tratados e camundongos de ocorrência natural, a coloração com a-bungarotoxina produziu uma estrutura ‘tipo pretzel’ que foi indicativa de uma rede funcional de receptores de acetilcolina (figura 6B a 6E).

[000193] Os camundongos tratados e não tratados foram submetidos a testes comportamentais periódicos que foram validados para esse modelo animal (Butchbach e outros, Neurobiol. Dis. (2007) 27: 207 a 219; El-Khodar e outros, Exp. Neurol. (2008) 212: 29 a 43). Os ca-mundongos com SMA tratados tiveram bons escores corporais e habi-lidades deambulatórias, sendo que os camundongos com SMA não tratados foram emancipados e paralisados (figura 7A). Os camundongos com SMA tratados foram significativamente mais pesados do que os controles com SMA não tratados, embora eles nunca tenham alcançado o tamanho de ocorrência natural (figura 7B). Os camundongos com SMA tratados mostraram um aprimoramento significativo na latência postural (figura 7C). Houve também um aprimoramento significativo no camundongo com SMA tratado para completar o teste de geotaxia negativa, que mede o comportamento locomotor espacial (figura 7D). Ademais, os camundongos com SMA tratados mostraram aprimoramentos significativos na força de agarrar e na capacidade de abrir seus membros posteriores (figura 7E, 7F).

Exemplo 4

[000194] Efeitos na longevidade usando AAV autocomplementar

[000195] Sem estar limitado à teoria, os vetores de AAV autocom- plementar (scAAV) são preditos como tendo cinética de expressão mais rápida devido ao genoma recombinante de filamento duplo (revisado por McCarty, D. M. Molec. Ther. (2008) 16: 1648 a 1656). Esse aumento rápido na expressão pode ser benéfico em doenças ou condições altamente agressivas em que a janela temporal de intervenção é pequena. Assim, para determinar se a expressão mais precoce poderia aprimorar a eficácia, um vetor de scAAV (scAAV-hSMN1) foi elaborado e testado. Usando o mesmo sítio de injeções como no Exemplo 1, uma dose de 1,7 e 10 cópias de genoma de scAAV-hSMN1 foi administrada em camundongos com SMA PO.

[000196] O tratamento com scAAV-hSMN1 resultou em um ataque e aprimoramento consideráveis na sobrevida média de 157 dias (p < 0,00001), que foi um aumento de + 214% e + 881% comparado a ca-mundongos com SMA tratados com AAV-hSMN1 e não tratados, respectivamente (figura 8). Aproximadamente 42% dos camundongos tratados com scAAV possuíram um aumento de mais de 1000% (aumento logarítmico) na sobrevida média. Ademais, o tratamento com scAAV2/8- GUSB-hSMN1 resultou em 88% dos camundongos com SMA vivendo além de 66 dias, em contraste a 0% com AAV2/8-CBA-hSMN1. Os camundongos com SMA tratados com scAAV possuiu escores corporais saudáveis, foram bem tratados, ganharam peso, e mantiveram a deambulação por toda a sua vida. Curiosamente, os camundongos com SMA tratados com scAAV desenvolveram somente necrose branda dos membros posteriores que nunca progrediu para um fenótipo severo. A maioria dos camundongos com SMA tratados com scAAV foi sacrificada devido a uma aparição inesperada e repentina de angústia respiratória, que incluiu respiração ofegante audível e uma taxa diminuída de respiração.

[000197] Para entender melhor a base para o aumento observado na sobrevida com scAAV8-hSMN, camundongos com SMA adicionais fo-ram tratados em P0 e sacrificados em 16 ou 64 dias (58 a 66 dias) pós-injeção, e analisados com os camundongos tratados com scAAV8 de vida longa a partir da curva de sobrevida (figura 8). Em 16 dias, os níveis de expressão de SMN a partir do grupo com scAAV8-hSMN fo-ram aproximadamente 60 a 90% dos observados em animais de ocor-rência natural. Esses níveis foram substancialmente menores do que aqueles alcançados com o tratamento com AAV8-hSMN nesse ponto no tempo. Nos camundongos com SMA tratados com scAAV8-hSMN, os níveis de SMN tanto nos segmentos lombares quanto nos segmentos torácicos estavam acima ou em níveis de ocorrência natural em 58 a 66 e 120 a 220 dias, respectivamente (figuras 2A e 2B). Em contraste, os níveis de SMN na medula espinhal cervical permaneceram rela-tivamente baixos em todos os pontos no tempo.

[000198] A comparação de tropismo de vetor de AAV na medula es-pinhal lombar foi examinada usando imunocoloração com hSMN em seções de tecido congeladas a partir de camundongos com SMA não tratados, camundongos com SMA tratados com AAV8-hSMN, e ca-mundongos com SMA tratados com scAAV8-hSMN em 16 dias e 157 dias pós-injeção. Um padrão de imunocoloração difuso com hSMN consistente com a morfologia de células gliais foi observado em 16 dias com AAV8-hSMN. A imunomarcação dupla de hSMN e mGFAP confirmou que um subconjunto das células transduzidas por AAV8- hSMN era astrócitos. Em contraste, o tratamento com scAAV8 resultou em expressão de hSMN somente em corpos celulares distintos com morfologia neuronal, que não colocalizou com GFAP. A imunomarcação dupla de hSMN e o marcador de neurônio motor mChAT confirmou que um subconjunto de células transduzidas por scAAV8-hSMN e AAV8-hSMN foi neurônios motores. A expressão de hSMN foi também observada nas camadas de células interneuronais da medula espinhal com ambos os vetores virais, como exemplificado por scAAV8-hSMN em 157 dias. Assim, em contraste ao AAV8-hSMN, a análise histológi- ca de camundongos com SMA tratados com scAAV8-hSMN mostrou que a expressão de hSMN foi amplamente restrita aos neurônios.

[000199] Ademais, a imunocoloração dupla com hSMN e mChAT mos-trou um aumento significativo na porcentagem de neurônios motores transduzidos com scAAV8-hSMN comparado a AAV8-hSMN (figura 10A). O direcionamento mais eficiente de neurônios motores com scAAV está correlacionado com um aumento significativo no número de células ChAT-positivas (figura 10B a 10D). A análise da NMJ nos músculos do quadriceps e intercostais em 16 dias também mostrou uma diminuição significativa no número de estruturas contraídas com scAAV-hSMN comparado a AAV8-hSMN (figuras 10E e 10F). Entretanto, houve um aumento no número de NMJs aberrantes em 216 a 269 dias que foi concomitante com a redução de contagens de células de neurônios motores no grupo tratado com scAAV-hSMN (figuras 10B a 10F).

[000200] Para resumir, a injeção de AAV8-hSMN no nascimento no SNC de um modelo de camundongo de SMA resultou em expressão difundida de SMN por toda a medula espinhal que se traduziu em um aprimoramento robusto na fisiologia dos músculos esqueléticos. Os animais com SMA tratados também exibiram aprimoramentos signifi-cativos nos testes comportamentais indicando que a junção neuro-muscular foi funcional. De forma importante, o tratamento com AAV8- hSMN aumentou a vida útil média dos camundongos com SMA para 50 dias comparado a 15 dias para controles não tratados. Ademais, os camundongos com SMA injetados com um vetor de AAV autocomple- mentar resultaram em eficácia aumentada incluindo uma extensão significativa na sobrevida média para 157 dias. Esses dados evidenciam que o aumento na SMN mediada por AAV SNC-direcionada é altamente eficaz em abordar tanto patologias neuronais quanto musculares de um modelo de camundongo grave de SMA.

[000201] Assim, as composições e os métodos para tratar doenças na medula espinhal são descritos. Embora as modalidades preferenciais da invenção em questão tenham sido descritas em alguns detalhes, entende-se que variações óbvias podem ser feitas sem abandonar o espírito e o escopo da invenção como definido no presente.

Claims (2)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vírion de AAV recombinante que compreende um vetor de vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV) compreendendo um poli-nucleotídeo que codifica uma proteína de sobrevivência do neurônio motor (SMN) que modula a função motora em um indivíduo com atrofia muscular espinhal, em que a proteína SMN consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e um excipiente farmaceuticamente aceitável;em que a referida composição é formulada para (i) adminis-tração em pelo menos uma região dos núcleos cerebelares profundos do cerebelo, (ii) administração via injeção direta na medula espinhal, (iii) administração via injeção intracerebroventricular, e/ou (iv) administração via injeção intratecal;em que o vírion de AAV compreende proteínas do capsídeo do sorotipo AAV8 ou AAV9.

2. Uso de um vírion de AAV recombinante, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição, como definida na reivindicação 1, para tratar atrofia muscular espinhal.