BRPI1012635B1 - Composição imunogênica, vacina compreendendo dita composição imunogênica e uso da mesma para a fabricação de uma vacina para influenza em um mamífero - Google Patents

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA VÍRUS Composições imunogênicas compreendendo glicoproteínas virais parcialmente glicosilada para uso como vacinas contra vírus são fornecidas. Formulado com vacinas mono-di-ou tri-glicosilada glicoproteínas de superfície viral e polipeptídeos Proporcionar protecção potente e ampla contra vírus, mesmo entre cepas. Composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeos hemaglutinnina monoglicosilatada e vacinas gerado das mesmas e métodos de seu uso para a profilaxia ou tratamento de infecções virais são divulgados. Métodos e composições são divulgados para o vírus influenza HA, NA e M2 RSV proteínas F, G e SH, o vírus da dengue M ou glicoproteína E, vírus da hepatite C glicoproteína E1 ou E2 glicoproteínas gp120 e gp41 e HIV.

Description

Referência cruzada para Pedidos relacionados

[001]Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório de patente Série US No. 61/164,385, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMUNIZATION AGAINST INFLUENZA" depositado em 27 de março, 2009, pedido provisório de patente Série US No. 61/164, 387, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS" depositado em 28 de marco de 2009, pedido provisório de patentes Série US No. 61/164,388, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST FLAVIVIRUS" depositado em 28 de março de 2009, pedido provisório de patentes Série US No. 61/164,389, intitulado "METHODS FOR MANUFACTURING VACCINES AGAINST VIRAL INFECTION" depositado em 28 de março de 2009, pedido provisório de patentes Série US No. 61/313,676, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION AGAINST INFLUENZA" depositado em 12 de março de 2010, cujos conteúdos de todos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002]Este pedido inclui uma listagem de sequências. Uma cópia legível de computador da listagem de sequências é apresentada por EFS Web-to simultaneamente em anexo como arquivo ASCII criado em 24 de março de 2010, chamado SEQ_LIST_OPK50101_ST25, que é 42,952 bytes de tamanho. As informações contidas na listagem de sequências são incorporadas por referência em sua totalidade início.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[003]A invenção geralmente refere-se polipeptídeos virais parcialmente gli- cosilados que são úteis para a geração composições imunogênicas e potente am-plamente reativas eficazes contra o vírus. Em particular, a invenção se refere a vaci-nas geradas usando a hemaglutinina do vírus da gripe monoglicosilatada (HA) pep- tídeos, as vacinas exibindo a atividade potente contra vírus da gripe. A invenção re-fere-se a composições farmacêuticas compreendendo a glicoproteína e vacinas ge-radas destas, e métodos de usar os polipeptídeos HA deglicosilatados para a profi-laxia e tratamento de infecções por vírus influenza.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004]Em eucariotas, resíduos de açúcar são comumente ligados a quatro diferentes resíduos de aminoácidos. Estes resíduos de aminoácidos são classificados como O-ligados (serina, treonina e hidroxilisina) e N-ligados (asparagina). Os açúcares O-ligados são sintetizados no Golgi ou retículo endoplasmático rugoso (ER) a partir de açúcares de nucleotídeos. Os açúcares N-ligados são sintetizados a partir de um precursor comum, e processados posteriormente. Sabe-se que a adição de cadeias de N-ligadas de carboidratos é importante para a estabilização de enovelamento, prevenção da degradação no retículo endoplasmático, oligomerização, atividade biológica, e transporte de glicoproteínas. A adição de oligossacarídeos N- ligados a resíduos Asn específicos desempenha um papel importante na regulação da atividade, estabilidade ou antigenicidade de proteínas maduras de vírus (Opde- nakker G. et al FASEB Journal 7, 1330-1337, 1993). Portanto, foi sugerido que a gli- cosilação de N-ligado é necessária para enovelamento, transporte, expressão de superfície de célula, secreção de glicoproteínas (Helenius, A., Molecular Biology of the Cell 5, 253-265, 1994), proteção contra degradação proteolítica e aumento da solubilidade da glicoproteína (Doms et al., Virology 193, 545-562, 1993). Glicoproteí- nas de superfície viral não são apenas exigidas para o enovelamento correto de proteínas, mas também fornecem a proteção contra anticorpos neutralizantes como um "escudo glicano". Como resultado, a seleção específica do hospedeiro forte é fre- quentemente associada com as posições do códon de glicosilação N-ligada potencial. Consequentemente sítios de glicosilação N-ligada tendem a ser conservada entre as cepas e subtipos.

[005]Existem três tipos principais de vírus influenza: A, B e C. As cepas do tipo A do vírus da gripe pode causar doenças graves e são o único tipo causador das pandemias humanas. A cepa H5N1 é um vírus influenza do tipo A. Cepas do tipo B causam casos humanos esporádicos e pequenos focos. Cepas do tipo C apenas raramente causam infecção humana e não causaram grandes surtos. Do vírus influenza A, apenas subtipos H1, H2 e H3 foram transmitidos facilmente entre seres humanos.

[006]Surtos do vírus da gripe A continuam a causar morbidade e mortalidade generalizada no mundo. Nos Estados Unidos, 5 a 20% estimada da população está infectada pelo vírus influenza A, anualmente, causando cerca de 200.000 hospitalizações e 36.000 mortes. O estabelecimento de políticas de vacinação abrangente tem sido uma medida eficaz para limitar a morbidade da gripe. No entanto, a genética frequente deriva do vírus exige reformulação anual da vacina, podendo levar a uma incompatibilidade entre a cepa viral presente na vacina e sua circulação. Assim, as terapias antivirais contra o vírus influenza são ferramentas importantes para limitar tanto a gravidade da doença quanto a transmissão.

[007]O vírus influenza H5N1 altamente patogênico tem causado surtos em aves domésticas e aves selvagens desde 2003 (Li KS et al. (2004) Nature 430:209213). A partir de fevereiro de 2010, esses vírus infectaram não só espécies de aves, mas também cerca de 478 seres humanos, dos quais 286 casos revelaram-se fatais (www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/inde x.html). O H5N1 altamente patogênico e o vírus influenza A de origem suína (HlNl) de 2009 têm causado surtos a nível mundial e levantou uma grande preocupação que mais alterações nos vírus podem ocorrer para provocar uma pandemia mortal (Garten RJ, et al (2009). Science 325 :197-201, Neumann G, et al (2009). Nature 459:931-939). Há uma grande preocupação que um vírus da gripe poderia adquirir a capacidade de se espalhar de forma eficiente entre humanos, tornando-se assim uma ameaça pandêmica. Uma vacina contra a gripe deve, portanto, ser parte integrante de qualquer plano de preparação para uma pandemia.

[008]Os vírus da gripe são vírus de fita de RNA negativa segmentada e pertencem à família Orthomyxoviridae. O vírus influenza A consiste em 9 proteínas estruturais e códigos adicionalmente para uma proteína não-estrutural NS1 com funções reguladoras. A proteína NS1 não-estrutural é sintetizada em grandes quantidades durante o ciclo de reprodução e está localizada no citosol e no núcleo das células infectadas. A natureza segmentada do genoma viral permite que o mecanismo de rearranjo genético (troca de segmentos do genoma) ocorra durante a infecção mista de uma célula com diferentes cepas virais. O vírus influenza A pode ser classificado em vários subtipos dependendo das proteínas virais de hemaglutinina diferen-te (HA) e neuraminidase (NA) reveladas em sua superfície. Subtipos do vírus Influenza A são identificados por duas glicoproteínas de superfície viral, a hemaglutinina (HA ou H) e neuraminidase (NA ou N). Cada subtipo de vírus influenza é identificado por sua combinação de proteínas H e N. Existem 16 subtipos de HA conhecidas e 9 de subtipos de NA conhecidos. Vírus influenza do tipo A pode infectar pessoas, aves, porcos, cavalos e outros animais, mas as aves selvagens são os hospedeiros naturais para esses vírus. Apenas alguns subtipos de influenza A (isto é, H1N1, H1N2 e H3N2) estão atualmente em circulação entre as pessoas, mas todas as combinações dos subtipos de 16H e 9 de NA têm sido identificadas em espécies de aves, especialmente, em aves aquáticas selvagens e aves marinhas. Além disso, há crescentes evidências de que os vírus H5 e H7 da gripe também pode causar doença humana.

[009]A HA do vírus influenza A compreende duas regiões estruturalmente distintas, a saber, uma região da cabeça globular e uma região de haste. A região da cabeça globular contém um sítio de ligação ao receptor responsável pela ligação do vírus que é uma célula-alvo e participa da atividade da hemaglutinação HA. A região da haste contém um peptídeo de fusão que é necessário para a fusão da membrana entre o envelope viral e a membrana endossomal da célula e assim refere-se à ativi-dade de fusão (Wiley et al., Ann. Rev. Biochem., 56:365-394 (1987)).

[0010]As contribuições importantes para a compreensão de infecções da gripe têm vindo de estudos sobre a hemaglutinina (HA), uma glicoproteína viral revestida que se liga aos receptores específicos glicano sialilado no trato respiratório, permitindo que o vírus entre na célula (Kuiken T, et al (2006). Science 312:394-397; Maines TR, et al (2009) Science 325:484-487, Skehel JJ, Wiley DC (2000) Ann Rev Biochem 69:531-569, van Riel D, et al (2006). Science 312:399-399). Para cruzar a barreira das espécies e infectar a população humana, HA aviária deve mudar a sua preferência de ligação aos receptores de um terminal glicano sialilado que contém a2,3(aviária)-ligado à α2,6 (humano)-ligado ao padrão de ácido siálico (Connor RJ, et al (1994) Virology 205: 17-23), e essa opção pode ocorrer através de apenas duas mutações, como na pandemia de 1918 (Tumpey TM, et al (2007). Science 315:655659). Portanto, a compreensão dos fatores que afetam a ligação da gripe aos recep-tores glicano é fundamental para o desenvolvimento de métodos para controlar quaisquer cepas de influenza de cruzamento futuro que têm potencial pandemia.

[0011]Para atender à necessidade de fazer uma vacina contra a gripe candidata que poderia induzir anticorpos potencialmente neutralizantes contra cepas divergentes do vírus influenza H5N1, uma vacina baseada na sequência hemaglutini- na (HA) consenso H5N1 induziu anticorpos que neutralizaram um painel de virions que foram pseudoclassificado com o HA de diferentes clades H5N1. (Chen MW, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci EUA 105:13538-13543).

[0012]HA é uma proteína transmembrana homotrimérica com um ectodomí- nio composto por uma cabeça globular e uma região de haste (Kuiken T, et al. (2006) Science 312:394-397). Ambas as regiões carregam oligossacarídeos N- ligados (Keil W, et al (1985) EMBO J 4:2711-2720.), que afetam as propriedades funcionais de HA (ZY Chen, et al (2008) Vacina 26:361-371.; Ohuchi R, et al. (1997) J Virol 71:3719-3725). Entre diferentes subtipos de vírus influenza A, há uma variação extensa nos sítios de glicosilação da região da cabeça. Considerando que os oligossacarídeos-tronco são mais conservados e necessários para a atividade de fusão (Ohuchi R, et al. (1997) J Virol 71:3719-3725). Glicanos próximos aos epítopos peptídeos antigênicos interferem com o reconhecimento de anticorpos (Skehel JJ, et al. (1984) Proc Natl Acad Sci EUA 81:1779-1783), e glicanos perto do local de ativa-ção proteolítica de HA modular clivagem e influenciar a infectividade do vírus da in-fluenza (Deshpande KL, et al. (1987) Proc Natl Acad Sci EUA 84:36-40). Exclusão de mutações de sítios de glicosilação pode afetar a ligação no receptor viral HA (Gunther I, et al. (1993) Virus Res 27:147-160).

[0013]Mudanças na sequência do peptídeo em ou perto de sítios de glicosi- lação pode alterar a estrutura 3D HA, e de ligação aos receptores e especificidade Assim afinidade. Realmente, tem a partir de diferentes subtipos H5N1 têm diferentes padrões de glicano de ligação (Stevens J, et al (2008) J Biol MoI 381:1382 -. 1394). Mutagênese de sítios de glicosilação em Hl e H3 tem sido estudado em todo o sis- tema-viral (Chandrasekaran A, et al (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Deom CM, et al (1986) Proc Natl Acad Sci EUA 83:3771-3775). No entanto, não se sabe como as mudanças na glicosilação afetam a ligação aos receptores especificidade e afinidade, especialmente com relação à HA mais patogênico H5N1.

[0014]Vacinas contra a gripe, quando feitas, têm que ser trocada a cada ano, como as regiões menos altamente glicosilada ou não-glicosilada de hemaglutinina continuar a sofrer mutações para escapar do sistema imune do hospedeiro.

[0015]O objetivo da concepção de uma vacina contra patógenos heterogê- neo é identificar e design eficaz e amplamente antígenos protetores. No caso da in-fluenza, históricas consideráveis esforços têm ido para o teste empírico de sequên-cias lineares e regiões conservadas com pouco sucesso. Uma razão plausível para essas falhas é a falta de conhecimento que focou em respostas contra artigos de teste antigênico são real bona fide sítios produtivos para a neutralização de um antí- geno do patógeno no ambiente de uma infecção real.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0016]Especificamente, há uma necessidade de cross-neutralizando anticorpos monoclonais que podem ser usados no projeto e na validação dos processos de produção de vacinas que manter ou melhorar a qualidade de cross-epítopos neutra- lizantes e antigenicidade em vacinas atuais e futuras fabricado. Supondo-se que ligação de anticorpos à vacina é um reflexo da integridade estrutural e potencial anti- gênico, pode-se avaliar a ligação de anticorpos neutralizantes cruzados, tais como polipeptídeos HA deglicosilatada aos derivados como para uma avaliação quantitativa processo de vacina contra o seu potencial de neutralização cruzada. Para maximizar as respostas para essas universal epítopos seria criar derivativos para aumentar a imunogenicidade para esses epítopos universal.

[0017]De acordo com a invenção, uma vacina com estes princípios é divulgada. O antígeno é gerado por eliminação parcial açúcares da glicoproteína viral para expor os sítios de glicosilação (que são altamente conservadas e não sofrer mutação ou não se transformar de forma agressiva) e, ao mesmo tempo reter açúcares adequada para preservar a estrutura terciária da glicoproteína. As glicoproteínas parcialmente glicosiladas virais são geradas pelo deglicosilção parcial das glicopro- teínas tal que um site especial glicosilação mantém uma, duas ou três unidades de açúcar. Em alguns aspectos a glicoproteína parcialmente glicosilada pode ser gerado através de uma proteína ou polipeptídeo não-glicosilatado em um ou mais locais de glicosilação e conjugar um especial mono-, di- ou tri-sacarídeos aos locais de gli- cosilação.

[0018]A vacina é revelada, compreendendo pelo menos um HA parcialmente glicosilada, NA ou M2 e uma glicoproteína veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas implementações, o HA glicoproteína parcialmente glicosilada é selecionado do grupo consistindo de parcialmente glicosilada vírus influenza HI, H3 e H5. Em algumas implementações, a glicoproteína HA parcialmente glicosilada é glicosilada em resíduos de asparagina em um ou mais das posições 39, 127, 170, 181, 302, 495 e 500 da H5 HA. Em algumas implementações, o resíduo é asparagina na posição 177.

[0019]Um método é divulgado que compreende: Administrando a um assunto passível de gripe vacina que compreende pelo menos uma glicoproteína HA de- glicosilatada e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas implementações, a glicoproteína HA deglicosilatado é selecionado do grupo consistindo de HI, H3 e H5.

[0020]Em algumas implementações do deglicosilação deixa um monoglicosi- lação (um açúcar restante) em um ou mais sites de glicosilação na glicoproteína. Em algumas implementações do deglicosilação deixa uma glicoproteína (2 açúcares restantes) em pelo menos um sítio de glicosilação no. Em algumas implementações do triglicosilação deglicosilação deixa uma glicoproteína (3 açúcares restantes) em um ou mais sites na glicosilação. Em algumas implementações do deglicosilação glico- proteína deixa pelo menos um de um monoglicosilação, um diglicosilação e um trigli- cosilação em pelo menos um sítio de glicosilação no glicoproteína.

[0021]A invenção refere-se à composição imunogênica para elevar para a resposta imune a um patógeno de origem viral, bacteriana, fungos ou outros, a composição compreendendo: uma glicoproteína antigênica do patógeno de origem viral, bacteriana, fungos ou outros, onde o glicoproteína é parcialmente glicosilada.

[0022]Em alguns aspectos, o patógeno é um vírus do antígeno parcialmente glicosilada é um vírus, uma partícula virus-like, um peptídeo viral, uma proteína, um polipeptídeo, ou um fragmento do mesmo derivado do vírus, ou uma proteína de fu-são parcialmente composto por uma sequência de proteína do vírus.

[0023]O vírus é selecionado a partir do vírus influenza, vírus sincicial respiratório (RSV), clamídia, adenovirdiae, vírus mastadeno, Aviadenovirus, vírus herpes, herpes simplex virus 1, vírus herpes simplex 2, vírus herpes simplex 5, herpes simplex virus-6 Leviviridae, levi vírus, fase de Enterobactérias MS2, allolevirus, Poxviri- dae, Chordopoxvirinae, Parapoxvirus, Avipoxvirus, capripoxvirus, leporiipoxvirus, suipoxvirus, molluscipoxvirus, Entomopoxvirinae, Papovaviridae, poliomavírus, papi- lomavírus, Paramyxoviridae, paramixovírus, parainfluenza vírus 1, mobillivirus, vírus do sarampo, rubulavirus, o vírus da caxumba , pneumonovirinae, pneumovírus, me tapneumo vírus, pneumovírus aviário, metapneumovírus humano, Picornaviridae, enterovírus, rinovírus, Hepatovirus, hepatite humana Um vírus, cardio vírus, andap- tho vírus, Reoviridae, Orthoreovirus, orbi vírus, o rotavírus, cypovirus, fijivirus, phyto- reovirus, oryzavirus, Retroviridae , retrovírus tipo de mamíferos B, C retrovírus de mamíferos, tipo retrovirus C aviária tipo, grupo retrovírus,_BLV-HTLV retrovirus, len- tivírus, o vírus da imunodeficiência humana 1, o vírus-2 da imunodeficiência humana, HTLV-I e-II virus, SARS virus corona, herpes simplex virus, Epstein Barr virus, citomegalovirus, virus da hepatite (HCV, HAV, HBV, HDV, HEV virus), virus Toxoplasma gondii, Treponema virus globo pálido, o virus T-linfotrópico humano, virus da encefalite, West Nile, dengue, virus varicela zoster, rubéola, caxumba, rubéola, Spumavirus, Flaviviridae, virus da hepatite C, Hepadnaviridae, virus da hepatite B; Togaviridae, alfavirus virus Sindbis, Rubivirus, virus da rubéola, Rhabdoviridae, ve-siculovirus, Lyssavirus, ephemerovirus, cytorhabdo virus, necleorhabdo virus, Are- naviridae, arenavirus, virus da coriomeningite linfocitica, virus Ippy, Lassa virus, Co- ronaviridae, coronavirus e virus toro.

[0024]O peptideo viral, proteinas, polipeptideos, ou um fragmento dela é se- lecionado a partir do vírus da gripe neuraminidase, vírus da gripe hemaglutinina, vírus respiratório sincicial humano (RSV) - proteínas virais, glicoproteína RSV F, RSV glicoproteína G, vírus herpes simplex (HSV ) proteína viral, herpes simplex virus gli- coproteínas gB, gC, gD, gE e, clamídia MOMP e antígenos Por B, proteína do núcleo, a proteína matriz ou outras proteínas do vírus da dengue, vírus do sarampo hemaglutinina, herpes simplex vírus tipo 2 glicoproteína gB, poliovírus 1 VPL , glico- proteína do envelope do HIV-1, hepatite B antígeno de superfície, a toxina difteria, streptococcus 24M epítopo, gonocócica pilin, pseudo-vírus G50 (GPD), pseudo-vírus II (GPB), pseudo-vírus III (GPC), pseudo-vírus glicoproteína H, vírus pseudoraiva glicoproteína glicoproteína E, gastroenterite transmissível 195, proteína de matriz transmissíveis gastroenterite, glicoproteína rotavírus suíno 38, parvovirose suína proteína capsídeo, Serpulinahydodysenteriae antígeno protetor, glicoproteína da diarréia viral bovina de 55 anos, doença de Newcastle vírus hemaglutinina- neuraminidase, hemaglutinina da gripe suína, a gripe suína neuraminidase, pé e vírus da febre aftosa, porco colera vírus, vírus da gripe suína, vírus da febre suína Africano, liyopneutiioniae Mycoplasma, vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina, rino- traqueíte infecciosa bovina glicoproteína E do vírus, glicoproteína G, vírus da laringo- traqueíte infecciosa, laringotraqueíte infecciosa glicoproteína G do vírus ou glicopro- teína I, uma glicoproteína de La virus transversal ou cruzado, vírus da diarréia neonatal bezerro,._Encefalomielite equina venezuelana vírus, punta toro vírus, vírus da leucemia murina, mouse vírus do tumor mamário, hepatite B proteína do núcleo do vírus da hepatite B e antígeno de superfície do vírus ou um fragmento ou derivado, o antígeno do vírus da influenza equina ou herpesvirus equino, equinos, incluindo vírus da gripe tipo A / Alasca 91 neuraminidase, equinos vírus influenza typeA / Miami 63 neuraminidase, tipo de vírus influenza equina A / Kentucky 81 neuraminidase equine herpesvirus tipo B glicoproteína 1, e equine herpes vírus tipo 1 glicoproteína D, antígeno do vírus respiratório sincicial bovino ou parágrafo vírus da gripe, bovina proteína apego vírus sincicial respiratório (BRSV G), bovina proteína de fusão vírus sincicial respiratório (BRSV F), bovinos de proteína de nucleocapsídeo vírus sincicial respiratório (BRSVN), tipo de vírus bovinos parainfluenza 3 proteína de fusão, tipo de vírus bovinos parainfluenza 3 hemaglutinina neuraminidase , glicoproteína do vírus da Diarréia Viral bovina 48 e glicoproteína 53, de dengue glicoproteína e glico- proteína do vírus E1E2 de vírus humano e hepatite C.

[0025]Em alguns aspectos, o antígeno viral deglicosilatada é um mono-, di-, tri-hemaglutinina glicosilada ou vírus influenza. Em algumas modalidades, o antíge- no viral deglicosilatada é uma hemaglutinina mono-glicosilada selecionado do grupo consistindo de influenza vírus HI, H3 e H5. Em algumas modalidades, o mono- glicosilada hemaglutinina do vírus da gripe é composto por um site de N-glicosilação compreendendo uma sequência de aminoácidos de Xaa-serina e asparagina aspa- ragina-treonina-Xaa, onde Xaa é qualquer aminoácido, exceto prolina. Em alguns aspectos, a hemaglutinina monoglicosilatada compreendendo um açúcar único Glc- NAc em um local de glicosilação mostra afinidade maior especificidade, mas relaxado para HA de ligação aos receptores.

[0026]Em algumas modalidades, o antígeno viral deglicosilatada é um vírus da gripe hemaglutinina di-ou tri-glicosilada com N-acetilglicosamina (GlcNAc) e / ou manose. Em alguns aspectos, o antígeno viral deglicosilatada é um mono-glicosilada hemaglutinina do vírus da gripe glicosilada com N-acetilglicosamina (GlcNAc).

[0027]Em alguns aspectos, o mono-glicosilada hemaglutinina do vírus da gripe compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de consenso H5 HA (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o mono-glicosilada H5 sequência consenso HA (SEQ ID: 4) é glicosilada em resíduos de asparagina em um ou mais das posições 39, 170, 181, 302 e 495 Em outros aspectos, o mono-glicosilada he- maglutinina do vírus da gripe compreende um polipeptídeo sequência Hl selecionado do grupo consistindo de um NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) se- quência (SEQ ID NO: 6), um consenso Hl-A (SEQ ID: 8) e um consenso C-Hl (SEQ ID NO: 10) sequência. Em algumas modalidades, a sequência de HA é modificada para permitir a expressão em uma célula eucariótica adequado.

[0028]Em uma modalidade, o mono-glicosilada hemaglutinina do vírus da gripe sazonal compreende um Hl (Brisbane) polipeptídeo.

[0029]A invenção, portanto, diz respeito a uma vacina que compreende um polipeptídeo imunogênico que compreende uma glicoproteína viral deglicosilatada a um estado de mono-, di-ou glicosilação tri-e, se desejar, em adjuvante, em que a vacina é capaz de provocar resposta imune contra a um vírus respiratório. Em algumas modalidades, o vírus respiratório é um vírus da gripe e da glicoproteína viral é a hemaglutinina (HA).

[0030]Em alguns aspectos, o vírus influenza é selecionado do grupo que consiste de um vírus da gripe aviária e vírus da gripe sazonal. Em algumas modalidades, o vírus da gripe aviária é o H5N1. Em algumas modalidades, o vírus da gripe é vírus influenza A.

[0031]Em um aspecto, o vírus é o vírus sincicial respiratório (VSR), eo antí- geno viral parcialmente glicosilada é um mono-, di-hidrofóbicas, ou tri-glicosilada RSV F (fusão), G (anexo) da SH (pequeno) glicoproteína, ou fragmentos imunogêni- cos do mesmo. Em algumas modalidades, o mono-glicosilada RSV sequência da proteína G (SEQ ID NO: 12) é parcialmente glicosilada em resíduos de asparagina em um ou mais potenciais N-glicosilação sites indicados na Tabela 6.

[0032]Em um aspecto, o vírus é um flavivírus, e o antígeno viral parcialmente glicosilado é um mono-, di-ou tri-glicosilado vírus da dengue M glicoproteína do envelope, a glicoproteína E, ou fragmentos imunogênicos do mesmo. Em algumas modalidades, o mono-glicosilado vírus da dengue E glicoproteína do envelope (SEQ ID NO: 13) é parcialmente glicosilada em resíduos de asparagina em um ou mais N- glicosilação locais N67 e Nl 53 indicados na Tabela 7.

[0033]Em um aspecto, o vírus é um vírus da hepatite C, eo antígeno viral parcialmente glicosilada é um mono-, di-ou tri-glicosilada hepatite C envelope glico- proteína El, glicoproteína E2, ou fragmentos imunogênicos do mesmo. Em algumas modalidades, o mono-glicosilada hepatite C envelope glicoproteína El (SEQ ID: 14) é parcialmente glicosilada em resíduos de asparagina em um ou mais sites de N- glicosilação N196, N209, N234, N305, N325 e indicado na Tabela 8.

[0034]Em um aspecto, onde o vírus é um vírus da imunodeficiência humana (HIV), eo antígeno viral parcialmente glicosilada é um mono-, di-ou tri-glicosilada HIV glicoproteína do envelope gpl20, glicoproteína transmembrana gp41, ou fragmentos imunogênicos do mesmo em algumas modalidades.

[0035]O mono-glicosilada glicoproteína do envelope HIV gpl20 (SEQ ID NO: 15) é parcialmente glicosilada em resíduos de asparagina em um ou mais potenciais N-glicosilação sites indicados na Tabela 9.

[0036]A invenção, portanto, diz respeito a uma composição de vacina com-preendendo: uma gripe onde HA polipeptídeo, o HA influenza polipeptídeo é degli- cosilatada a um estado de mono-glicosilação, e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde, após a introdução da HA mono-glicosilada polipeptídeo em um assunto, o polipeptídeo induz o sujeito a produzir anticorpos que se ligam ao vírus influenza.

[0037]Em alguns aspectos, a introdução do HA mono-glicosilada polipeptí- deo sobre o assunto, induz o sujeito a produzir anticorpos que neutralizam os vírus da gripe sazonal e aviária.

[0038]Em uma modalidade, a hemaglutinina mono-glicosilada vírus da gripe sazonal compreende um Hl (Brisbane) e HA polipeptídeo relação à introdução do HA mono-glicosilada polipeptídeo em um assunto, o Hl (Brisbane) HA polipeptídeo induz o sujeito a produzir anticorpos que neutralizam NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) de vírus influenza.

[0039]Em uma outra modalidade, o mono-glicosilada hemaglutinina do vírus da gripe compreende um NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) e poli- peptídeo relação à introdução do HA mono-glicosilada polipeptídeo em um assunto, o NIBRG-121 (Pandemic 2009 Um polipeptídeo (HlNl) cepa vacinal) induz o sujeito a produzir anticorpos que neutralizam Hl sazonal (Brisbane), vírus da gripe HA.

[0040]Em alguns aspectos, a vacina ainda compreende a adjuvante, que podem ser selecionados a partir de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio tanto, adjuvante de Freund incompleto de (IFA), esqualeno, esqualano, alume, e MF59.

[0041]A invenção se refere a métodos de imunização de um mamífero contra uma infecção respiratória viral, o método compreendendo: Administrando para o mamífero suscetíveis à infecção pela vacina vírus respiratório que compreende um polipeptídeo imunogênico que compreende uma glicoproteína viral deglicosilatada um a um estado de mono-, di-ou tri-glicosilação, onde a vacina é capaz de provocar resposta imune contra o vírus respiratório em. Em algumas modalidades, o vírus respiratório é um vírus da gripe e da glicoproteína viral é a hemaglutinina (HA). A vacina pode ser administrada através da administração parenteral significa, inalação, por via intranasal, e às vezes profilaticamente.

[0042]Em alguns aspectos, a vacina provocar resposta imunológica contra as cepas do vírus da gripe que são diferentes da cepa do vírus influenza do qual a glicoproteína viral deglicosilatada é selecionado. Em algumas modalidades, a glico- proteína viral deglicosilatada é um mono-glicosilada gripe hemaglutinina (HA).

[0043]A presente invenção fornece vacinas eficazes contra o vírus influenza A. Em uma modalidade, a vacina compreende um peptídeo ou polipeptídeo funcionalmente imitando uma neutralização epítopo de uma molécula Descrito começar. Entrar em uma outra modalidade, a vacina é eficaz contra um antígeno viral funcionalmente compreende um peptídeo ou polipeptídeo imitando um epítopo de neutralização de uma molécula descrita. Em uma modalidade, o antígeno viral é de um ví- rus da gripe ou de HIV-I ou HIV-2 do vírus, ou um flavivírus, tais como vírus da dengue ou hepatite C.

[0044]Em uma outra modalidade, a vacina é uma vacina eficaz contra o vírus influenza A, compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo funcionalmente imitando uma neutralização epítopo de uma molécula Descrito começar. Em uma modalidade, a molécula é um anticorpo. Em outra encarnação antígeno, o anticorpo se liga a HA. Em uma personificação outro subtipo, o antígeno é um HA H5. Em uma personificação outro subtipo, o antígeno HA é uma Hl. Em uma modalidade, o antígeno é exibido na superfície do vírus influenza A. Em uma modalidade, o peptídeo ou polipeptí- deo compreende determinantes antigênicos que levantam anticorpos neutralizantes.

[0045]Estes e outros aspectos se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição da modalidade preferida tomada em conjunto com os desenhos a seguir, embora as variações e modificações podem ser afetados nele sem se afastar do espírito eo alcance dos novos conceitos da divulgação.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS

[0046]Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da divulgação atual, as invenções que podem ser melhor compreendidas por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de determinadas concretizações ora apresentadas.

[0047]Figuras IA-1C mostram visões esquemáticas e espectros de dicroísmo circular tem com glicosilação diferentes. (Fig. IA) Quatro variantes de proteínas HA com glicosilação diferentes: HAfg, HA (uma sequência consenso (MW Chen, et al (2008) Proc Natl Acad Sci EUA 105: 13.538-13.543) complexo expressa em HEK293 células com o típico tipo N-glicanos), HADS, nA-HA tratados, resultando em remoção de ácidos siálicos de HAfg, Hahm, HA expressa em GnTI-HEK293s células com o tipo de alta manose N-glicanos, e HAmg, Endo H-tratadas com HA GlcNAc apenas em seu N-glicosilação sites. (Fig. IB) Representação da Estrutura HAfg, HADS, Hahm e HAmg com diferentes N-glicano anexado em seu N-glicosilação sites.

[0048]As estruturas de proteínas são criadas com Protein Data Bank ID código 2FK0 (VietO4 HA), em cinza, e os glicanos N-ligados são exibidos em verde. Todos os N-glicanos são modelados por GlyProt (Bohne-Lang A, et al (2005) Ácidos Nucleicos Res 33: W214-W219), e os gráficos são gerados por PyMOL (www.pymol.org). (Fig. 1C) Circular espectros de dicroísmo HAfg, HADS, Hahm e HAmg Demonstrar que as estruturas secundárias das quatro proteínas HA com diferentes glicosilação são semelhantes.

[0049]As Figs. 2A-2B mostram glicano análise microarray de HA com diferentes glicosilação. (Fig. 2A) mostra glicano perfil microarray de variantes HA HAfg, HADS, Hahm e HAmg são. As ligações relacionadas da glicanos foram agrupados por cores, predominantemente 17 α2, 3 sialosides (amarelo) ou 7 α2, 6 sialosides (azul). As estruturas de glicanos no array são indicadas na Figura 2B. Constantes de associação de variantes HA HAfg, HADS, Hahm e HAmg são mostrados com valores de KA, variantes de surf da HA em resposta a α2, 3 sialosides 15/01.

[0050]A Figura 3 mostra análise da sequência de alinhamento de Hl Brisbane, California Hl, H3 e H5 tem de Hl recentes, H3, H5 e, desde 2000. HA gripe sazonal é de A/Brisbane/59/2007. HA pandemia de gripe vai de A / ornia/07/2009 Califórnia H5 é de A Vietname / / I 203/2004. H3 é de A Brisbane / / I 0 / 2007. Os sites de N-glicosilação na H5 HA são mostrados em uma caixa vermelha. A comparação revela semelhança entre Hl e H5 HAs em suas posições de N-glicosilação, ao passo que o H3 tem posições menos conservada glicosilação e difere de Hl e H5.

[0051]As Figs. 4A-4F mostram as contribuições energia de ligação a partir de açúcares ou modificações das interações glicano HA em resposta a tem com gli- cosilação diferentes. Estes valores foram obtidos pela subtração de valores da ΔG indicado referência glicano (destacados em caixas vermelhas, ver Tabela S3). (Fig. 4A) glicano 2, 3, 6 e 10/08 possuem a mesma espinha dorsal do glicano dissacarí- deo 1, mas só se diferenciam em terceiro o açúcar a partir do final nonreducing. Os valores são calculados de ΔΔG para demonstrar a diferença de energia de ligação, mudando os açúcares terceiros. (Fig. 4B) glicano 12/10 e 15 possuem a mesma espinha dorsal do glicano dissacarídeo 8, porém diferenciadas, quer por alongando a estrutura de açúcar, adicionando um açúcar de forma linear ou ramificada.

[0052]As Figs. 5A-5D mostra uma comparação de HAfg HAmg e como vacina. (5A) As ligações entre anti-soros de HAfg e HAmg, e vários tem são analisados por ELISA. Em comparação com HAfg anti-soro, anti-soro HAmg mostra melhor ligação a H5 (Vietnã e CHA5 1194/2004). Além disso, o anti-soro também se liga ao HAmg HI (07/2009 Califórnia e WSN). (Fig. 5B) microneutralização de H5N1 (NIBRG-14) AntiVirus com HAfg HAmg e anti-soros. Em comparação com HAfg anti- soro, anti-soro HAmg mostra melhor atividade neutralizadora contra a infecção pelo vírus da gripe às células MDCK (P <0,0001). (Fig. 5C) de proteção da vacina contra o desafio dose letal do vírus-H5N1. Camundongos BALB / c foram imunizados com duas injeções da vacina de proteína HA HAfg, HAmg e controle PBS._Os camundongos imunizados foram desafiados por via intranasal com uma dose letal do H5N1 (NIBRG-14) do vírus. Após o desafio, a sobrevivência foi registrada para 14 dias. (Fig. 5D) A ligação do anti-soro de coelho da HAmg com tem diferentes por ELISA. O anti-soro de coelho contra HAmg demonstrado forte ligação para H5 (CHA5 e Vi- etnam/1194). Além disso, as interações com H5 (Anhui e ID5/2005) e New Hl Cale- donia/1999) também são observados.

[0053]Figuras 6A-6C mostram a construção da proteína HA H5, purificação e filtração em gel-cromatografia. (6A) O DNA que codifica a ectodomínio de clivagem HA-site com alternância que clonado no vetor de expressão de mamífero, PTT (Du- rocher Y, et al (2002) Ácidos Nucleicos Res 30: E9), para permitir a secreção eficiente de HA proteínas de HEK293 culturas de células. O sítio de clivagem originais pro- tease do HA foi mutado para PQRERG para evitar o processamento da HAO em HAL e HA2. Para estabilizar a conformação trimérico da proteína HA, o "foldons" sequência, que é o fragmento bacteriófago trimerizing, que engenharia na construção de plasmídeos, e uma sua tag também foi adicionada no terminal COOH para fins de purificação._A expressão da proteína HA foi realizada por transfecção transiente com o vetor de expressão. (6B) As proteínas purificadas HA foram analisadas por SDS / PAGE.Mindicates marcador. Pista 1: HAfg, a HA 293e purificada a partir de células, pista 2: HADS, HAfg digerido pelo NA; faixa 3: Hahm, HA purificada a partir de células 293S (Reeves PJ, et al (2002) Proc Natl Acad Sci EUA 99: 1341913424); faixa 4: HAmg, Hahm digerida por Endo H (Fig. 6C) As proteínas HA- purificadas foram analisadas por gel-filtração cromatografia. O pico eluído mostrou a HAfg trímero> 200 kDa (linha vermelha), o HADS trímero> 200 kDa (linha preta), o Hahm trímero> 200 kDa (linha azul), e os HAmg trímero> 180 kDa após a filtração em gel (linha verde). A figura apresenta perfis de eluição das proteínas HA sobreposta sobrepostas com marcadores de proteína (linha pontilhada).

[0054]As Figs. 7A-7C mostram análise de espectrometria de massa de N- glicanos permetilatado de diferentes proteínas HA. MS análise de N-glicanos perme- tilatado de diferentes proteínas HA. (Fig. 7A) O perfil de MALDI-MS mostrou que o N-glicanos da HA expressa da HEK293 compreendem predominantemente núcleo fucosylated, biantennary, triantennary, complexos do tipo N e tetraantennary-glicano estruturas, como anotada para os picos principais detectados e listados na tabela Sl. Atribuição é baseado na composição, com apenas alguns poucos funcionários ainda verificada por MS / MS análise. Os vários graus de sialilação é uma característica principal. (Fig. 7B) NA Com o tratamento, todos os sinais atribuídos como sialylated N-glicanos (por exemplo, m / z 2605, 3054, 3503, 3864, 4226) já não eram detectados, concomitante com um aumento na intensidade do sinal para o nonsialitado estruturas triantennary e tetraantennary (m / z 2693, 3142), totalmente compatível com a completa remoção dos ácidos siálicos. (Fig. 7C) O perfil de MALDI-MS do N- glicanos derivado de HA expressa na cepa GnTLi deficientes mostraram predominantemente HEK293s um sinal correspondente a Man5GlcNAc2 em m / z 1579, juntamente com picos menores de incompleta aparadas alta-manose tipo N-glicanos (m / z 1783-2396; Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2) na via de glicosilação.

[0055]As Figs. 8A-8E mostram MALDI-TOF de variantes HA. As massas mo-leculares (8A) HAfg é de 75 186 343, (8B) é HADS 75290.023, (8C) e Hahm é 693 14 645 (Figura 8D) HAmg é 63314.761.

[0056]A Figura 9 mostra as atribuições dos principais íons moleculares observadas em espectros de MALDI permethylated N-glicanos de trímeros HA. ND indica não determinado.

[0057]A Figura 10 mostra as variantes ΔΔG glicosilada de HA em resposta a α2, 3 sialosides 1-15. Valores representam ΔΔG, kcal / mol. As entradas na coluna mais à esquerda foram obtidas por subtração dos valores -G da última HA a partir da anterior HA (por exemplo, ΔΔG (HAfg -> HADS) = ΔG (HADS) - ΔG (HAfg)). ND indica não determinado.

[0058]A Figura 11 mostra as diferenças na ligação mudanças de energia livre entre ligantes sialoside diferentes em resposta a variações HA. Valores representam ΔΔG, kcal / mol. As entradas na coluna mais à esquerda foram obtidas por subtração de valores ΔG da última HA a partir da anterior HA (por exemplo, ΔΔG (1 - > 2) = ΔG (2) - ΔG (1) ND não indica determinado.

[0059]A Figura 12 mostra a habilidade do anti-soro gerado a partir totalmente glicosilada, de alta manose e monoglicosilatada H5 HA, HA 1203 Vietnam para inibir a pseudo-transdução digitado vírus em HEK293 células. Tanto de alta manose glico- silada e mono-HA anti-soros de inibir a entrada de vírus, mas totalmente anti-soros HA glicosilada não.

[0060]As Figs. 13A-13B mostram os resultados de ensaio de hemaglutina- ção com anti-soros de coelho e HAfg HAmg. FIG 13 A mostra resultados com total-mente glicosilado consenso anti-soros HA H5 em ensaios de Hemaglutinação para Hl, H3 e H5. Figura 13 mostra os resultados com monoglicosilatada anti-soros HA H5. Os anti-soros HA H5 monoglicosilados não só mostram a atividade de Inibição da hemaglutinação boa para H5, mas também para H1. Hemaglutinação H3 não é afetada por quaisquer anti-soros.

[0061]A Figura 14 mostra que as estruturas de proteínas de H5 e Hl são mais semelhantes entre si (root mean desvio quadrado (RMSD) de 0,9 A), do que a H3 (root mean desvio quadrado (RMSD) de 2,5 A).

[0062]As Figs. 15A-15C mostram uma inibição da NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) usando antissoros gerada mono-glicosilada Hl (Brisbane) como antígeno HA. FIG 15 A inibição mostra da capacidade do NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) vírus para aglutinar as células vermelhas do sangue. Figura 15B mostra a inibição da capacidade do NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) de vírus para infectar as células MDCK. 15C figura mostra proteção de camundongos BALB / c contra a infecção por NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) de vírus influenza. Anti-soros utilizados que camundongos imunizados com a proteína HA Brisbane (5μg) e do vírus usado para desafiar o que NIBRG-121 (10Ox LD50).

[0063]As Figs. 16A-16C mostram uma inibição da WSN (HlNl) 1933 por antisoros gerados usando mono-glicosilada Hl (Brisbane) como antígeno HA. 16A mostra a inibição da capacidade do (HlNl) WSN 1933 vírus para aglutinar as células vermelhas do sangue. 16B mostra a inibição da capacidade do (HlNl) WSN 1933 vírus para infectar as células MDCK. Figura 16C mostra proteção de camundongos BALB / c contra a infecção pelo vírus da gripe WSN (HlNl) 1933. Anti-soros utilizados que camundongos imunizados com a proteína HA Brisbane (5μg) e do vírus usado para desafiar o que WSN (HlNl) 1933 (100x LD50).

[0064]As Figs. 17A-17C mostram uma inibição de A Puerto / Rico/8/34 (HlNl): PR8 gerados pela utilização de anti-soros mono-glicosilada Hl (Brisbane) como antígeno HA. 17A mostra a inibição da capacidade de o vírus PR8 a aglutinar as células vermelhas do sangue. FIG 17B mostra a inibição da capacidade de o vírus PR8 para infectar as células MDCK. Figura 17C mostra proteção de camundongos BALB / c contra a infecção pelo vírus PR8. Anti-soros utilizados que camundongos imunizados com a proteína HA Brisbane (5μg) e do vírus usado para desafiar o que PR8 (10Ox LD50).

[0065]AS Figs. 18A-18B mostram inibição da WSN (HlNl) por antissoros gerados usando mono-glicosilada Hl (A pandemia de 2009 (cepa HlNl) de vacina, como mostrado na figura California/2009) como antígeno HA. 18A mostra a inibição da capacidade de o vírus WSN (HlNl) para aglutinar as células vermelhas do sangue. 18B mostra a inibição da capacidade de o vírus WSN (HlNl) para infectar as células MDCK.

[0066]A Figura 19 mostra a comparação estrutural dos sítios de glicosilação da proteína HA Hl.

[0067]A Figura 20 mostra dengue tipo 3 do vírus envelope dímeros glicopro- teína E, na forma totalmente glicosilada (Fig. 20A) e mono-glicosilada forma (Fig. 20B). Os modelos foram criados a partir de IUZG código PDB, com quatro possíveis complexos do tipo N-glicanos com o servidor GlyProt.

[0068]A Figura 21 mostra gpl20 vírus da imunodeficiência humana triimers envelope glicoproteína sob forma totalmente glicosilada (Fig. 21A) e mono- glicosilada forma (Fig. 21B). Os modelos foram criados a partir de código PDB 2BFl, com 13 possíveis tipo complexo N-glicanos por monômero.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0069]Na seguinte descrição detalhada de concretização da presente divulgação, é feita referência aos desenhos que acompanham em que similares referên- cias indicam elementos semelhantes, e no qual é mostrado por meio de ilustração de concretizações específicas em que a presente divulgação pode ser praticada. Estes concretizações são descritas em detalhes suficientes para permitir que aqueles hábeis na arte de praticar a divulgação presente, e é para ser entendido que outras modalidades podem ser utilizadas e que lógico, as mudanças estruturais, funcionais, e outros podem ser feitas sem se afastar do âmbito da presente divulgação. A seguinte descrição detalhada não pode, portanto, ser tomada em um sentido de limitação.

[0070]A Hemaglutina (HA) do vírus da gripe é uma proteína transmembrana homotrimeric com um ectodomínio composto por uma cabeça globular e uma região de haste. Ambas as regiões realizar oligossacarídeos N-ligados, a biossíntese de que segue os caminhos geral de glicosilação N. As propriedades funcionais de HA são afetadas por glicosilação em locais específicos. Os epítopos antigênicos peptí- deos em torno dos carboidratos interfere com o acesso dos anticorpos, e esse efeito pode resultar em variação antigénica do vírus da gripe. Estudos anteriores sobre revelou também que as sequências de peptídeos são altamente conservadas com glicosilação, e a especificidade do receptor HA ligação foi afetado pela ausência de uma cadeia de glicano complexo perto do local de ligação ao receptor. Além disso, a ativação proteolítica de HA também foi modulada pela glicanos perto do sítio de cli-vagem para influenciar a infectividade do vírus da gripe. As variações extensas na estrutura e número de sítios de glicosilação na região da cabeça foram mostradas entre os diferentes subtipos do vírus influenza A, ao passo que os oligossacarídeos- tronco eram mais conservados e necessários para a atividade de fusão. Todos esses achados indicaram a importância da glicosilação HA sobre a sua atividade.

[0071] A transmissão viral começa com uma interação crítica entre a glico- proteína hemaglutinina (HA), presente no envelope viral da gripe (influenza), e os glicanos que contêm ácido siálico (SA), localizados na superfície das células hospe- deiras. Para elucidar o papel da glicosilação da HA nessa interação importante, diversas glicoformas definidas de HA foram preparadas, e sua afinidade e especificidade de ligação foram estudadas utilizando um microarranjo sintético de SA. A trun- cagem das estruturas de N-glicanos na HA aumentou as afinidades de ligação ao SA, ao mesmo tempo em que diminuiu a especificidade em relação a diferentes li- gantes de SA. A contribuição de cada monossacarídeo e grupo sulfato dentro das estruturas dos ligantes de SA para a energia de ligação da HA foi analisada quantitativamente. Descobriu-se que o grupo sulfato contribui com quase 100 vezes mais (2,04 kcal/mol) na energia de ligação à HA totalmente glicosilada, assim como o gli- cano biantenado contribui para a HA monoglicosilada. Anticorpos gerados contra a proteína HA contendo apenas um único GlcNAc ligado por N em cada sítio de glico- silação apresentaram melhor afinidade de ligação e atividade de neutralização contra subtipos de influenza do que aqueles induzidos pelas formas totalmente glicosi- ladas de HA. Assim, a remoção de glicanos estruturalmente não essenciais nas gli- coproteínas de superfície viral é uma abordagem muito eficaz e geral para o desenvolvimento de vacinas contra a gripe e outros vírus humanos.

[0072]A não ser que definido de outra forma, termos técnicos e científicos utilizados têm o mesmo significado como o início comumente compreendido por um de habilidade comum na arte a qual esta invenção pertence. Singleton et al., Dicionário de Microbiologia e Biologia Molecular 2 a ed, J. Wiley & Sons (Nova Iorque, NY, 1994), fornece um técnico no assunto com um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido.

[0073]Um hábil na arte vai reconhecer muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, que poderiam ser utilizados na prática das preocupações presente invenção. Na verdade, a presente invenção não é de forma limitada para os métodos e materiais descritos. Para efeitos da presente invenção diz respeito, os seguintes termos são definidos abaixo.

[0074]Os termos "influenza subtipo A" ou "influenza subtipo de vírus A" são usados como sinônimos, e referem-se a influenza A variantes de vírus que se caracterizam por uma proteína de superfície a hemaglutinina (H) viral, e, portanto, são marcados por número de H, como, por exemplo, Hl, H3 e H5. Além disso, os subti- pos podem ser ainda caracterizados por um neuraminidase (N) proteína de superfície, viral, indicada por um número N, como, por exemplo, Nl e N2. Como tal, um sub- tipo pode ser referido por ambos os números de H e N, como, por exemplo, HlNl, H5N1 e H5N2.

[0075]Os termos incluem especificamente todas as cepas (incluindo cepas extinta) dentro de cada subtipo, que normalmente resultam de mutações patogênicas diferentes e perfis show. Cepas de busca, então, ser referido como vários "isola" de um subtipo viral, incluindo todo o passado, os isolados presente e futuro. Assim, neste contexto, os termos "tensão" e "isolar" são usados alternadamente. Subtipos baseado em antígenos para conter vírus influenza A. Os antígenos podem ser baseados em uma proteína hemaglutinina viral superfície e pode ser designado como "HA antígeno". Em alguns casos, esses antígenos são baseados na proteína de um subtipo específico, como, por exemplo, no subtipo H5 e Hl o subtipo, o que pode ser designado para antígeno e antígeno-Hl para H5, respectivamente

[0076]Como usado na divulgação presente, o termo "deglicosilatada" ou "parcialmente glicosilada" denota uma proteína que tem um ou mais açúcares remo- vido(s) da estrutura glicano de uma instância totalmente glicosilada da proteína e em que a proteína substancialmente retém sua conformação nativa / dobradura. Uma proteína "deglicosilatada" inclui uma proteína parcialmente glicosilada em que o processo de deglicosilação deixa uma monoglicosilação, uma digliosilação ou um trigli- cosilação em um ou mais locais de glicosilação presentes

[0077]Uma proteína "parcialmente glicosilada" inclui uma proteína "deglicosila- tada", no qual um ou mais açúcares são retidos em cada local de glicosilação, e cada local de glicosilação parcial contém uma estrutura menor glicano (contendo menos unidades de açúcar), em comparação com o site em uma instância totalmente glicosi- lada da glicoproteína, ea proteína parcialmente glicosilada substancialmente mantém a sua conformação nativa / dobrada.

[0078]Uma proteína "parcialmente glicosilada" é gerada pelo deglicosilação parcial da estrutura glicano de pelo menos um sítio de glicosilação de uma instância totalmente glicosilada da glicoproteína. Uma proteína "parcialmente glicosilada" é glicoproteína é também gerada através da introdução de glicosilação em um site de unglycosylated de uma proteína de tal forma que a sequência de glicosilação adicionado é menor do que a estrutura glicano naquele local em uma instância totalmente glicosilada da glicoproteína. Uma protéina "parcialmente glicosilada" é também gerada por sintetizar uma sequência da glicoproteína viral, ou fragmento dele, introduzindo unidades de aminoácidos glicosilada (por exemplo, porções GlcNAc-Arginina) em locais de glicosilação da sequência, de modo que a estrutura glicano adicionado é menor do que o glicano estrutura naquele local em uma instância totalmente glico- silada da glicoproteína.

[0079]Os termos "ácido nucléico" e "polinucleotídeo" são usados indistintamente para se referir a começar RNA simples ou double-stranded, DNA, ou polímeros mistos. Polinucleotídeos pode incluir sequências genômicas, sequências genô- micas e extra-plasmídeo, e menores segmentos engenharia genética que expressam, ou pode ser adaptado para expressar polipeptídeos.

[0080]Um "ácido nucléico isolado" é um ácido nucléico que é separado do DNA do genoma outras sequências substancialmente, bem como proteínas ou complexos, como os ribossomos e polimerases, que, naturalmente, acompanhar uma sequência nativa. O termo abrange uma sequência de ácido nucléico que foi removido de seu ambiente natural, e inclui isola DNA recombinante ou clonados e análogos de síntese química ou análogos biologicamente sintetizadas por sistemas hete- rólogos.

[0081]Um ácido nucléico essencialmente puro inclui formas isoladas do ácido nucleico. Claro, isso se refere ao ácido nucléico, como originalmente isoladas e não exclui genes ou sequências mais tarde acrescentou ao ácido nucléico isolado pela mão do homem.

[0082]O termo "polipeptídeo" é usado em seu sentido convencional, ou seja, como uma sequência de aminoácidos. Os polipeptídeos não estão limitados a um período específico do produto. Peptídeos, oligopeptídeos e proteínas estão incluídas na definição de polipeptídeo, e esses termos podem ser usados como sinônimos, a menos que especificamente indicado de outra forma vir. Assim, este termo não se refere a ou excluir pós-expressão modificações do polipeptídeo, por exemplo, glico- silação, fosforilação acetilação, e similares, bem como outras modificações conhecidas na arte, tanto de ocorrência natural e não natural. Um polipeptídeo pode ser uma proteína completa, ou uma subsequência do mesmo. Polipeptídeos de interesse particular no contexto deste preocupações invenção são subsequências de ami- noácidos compreendendo CDRs e sendo capazes de se ligar ao antígeno ou células infectadas pelo HIV.

[0083]Um "isolado polipeptídeo" é aquele que tem sido identificados e separados e / ou recuperados de um componente do seu ambiente natural. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo isolado será purificado (1) para mais de 95% em peso de polipeptídeo, conforme determinado pelo método de Lowry, e mais onde os mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou uma sequência de ácido amino interna pelo uso de um copo se- quenator fiação, ou (3) a homogeneidade por SDS-PAGE em reduzir ou não reduzir as condições usando Coomassie azul ou, onde a prata, mancha. Polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ no interior das células recombinantes desde pelo menos um componente do polipeptídeo do ambiente natural não vai estar presente. Ordina- riamente, no entanto, isolado polipeptídeo será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0084]Um polinucleotídeo de "sequência nativa" é aquele que tem a mesma sequência de nucleotídeos como um polinucleotídeo derivado da natureza. Um poli- peptídeo "sequência nativa" é um que tem a mesma sequência de aminoácidos como um polipeptídeo (por exemplo, anticorpos) derivado da natureza (por exemplo, de qualquer espécie). Tais polipeptídeos e polinucleotídeos de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meio recombinante ou sintético.

[0085]Um polinucleotídeo "variante”, como o termo é usado em, é tipicamente um polinucleotídeo que difere de um polinucleotídeo especificamente divulgados a partir de uma ou mais substituições, supressões, acréscimos e / ou inserções. Tais variantes podem ser de ocorrência natural ou podem ser gerados sinteticamente, por exemplo, ao modificar uma ou mais das sequências de polinucleotídeos da invenção e avaliar uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo codificado como descrito início e / ou uso de qualquer de uma série de técnicas bem conhecidas na arte.

[0086]Um polipeptídeo "variante", como o termo é usado em, é um polipeptí- deo que normalmente difere de um início polipeptídeo especificamente divulgados em uma ou mais substituições, supressões, acréscimos e / ou inserções. Tais variantes podem ser de ocorrência natural ou podem ser gerados sinteticamentes, por exemplo, ao modificar uma ou mais das sequências acima de polipeptídeos da invenção e avaliação de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo como Descrito dentro e / ou utilizar qualquer um de uma série de técnicas bem conhecidas na arte.

[0087]As modificações podem ser feitas na estrutura do Polinucleotídeos e polipeptídeos das preocupações presente invenção e ainda obter uma molécula funcional que codifica uma variante ou um derivado de polipeptídeo com características desejáveis. Quando crio se deseja alterar a sequência de aminoácidos de um polipep- tídeo de equivalente, ou mesmo uma variante melhorada ou parte de um polipeptídeo das preocupações invenção, um técnico no assunto, normalmente alterar um ou mais dos códons da codificação DNA sequência.

[0088]Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda significativa de sua capacidade de se ligar polipeptídeos outros {por exemplo, antígenos) ou células. Uma vez que é a capacidade de ligação e da natureza de uma proteína que define a atividade biológica de que a proteína é funcional, certas substituições sequência de aminoáci- dos pode ser feita em uma sequência de proteína, e, sua sequência de DNA de codificação subjacentes, e, no entanto, obter uma proteína com propriedades similares. Assim, é contemplado que várias mudanças podem ser feitas nas sequências peptí- dicas das composições divulgado, ou sequências de DNA correspondentes que codificam peptídeos disse, sem perda significativa de sua utilidade biológica ou atividade.

[0089]Ao fazer tais mudanças, o índice termal de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de ácido amino termal em conferir função biológica interativo em uma proteína é geralmente entendido na arte (Kyte e Doolittle, 1982). Aceita-se que o caráter relativo termal de aminoácido contribuir para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e assim por diante. Cada aminoácido foi atribuído um índice termal com base na sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, 1982).

[0090]Estes valores são: isoleucina (4,5), valina (4,2), leucina (3,8), fenilala- nina (2,8), cisteína / cistina (2,5), metionina (1,9), alanina (1,8), glicina (-0,4), treoni- na (-0,7) serina, (-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6) histidina, (-3,2), o glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (- 3,9) e arginina (-4,5). Sabe-se na arte que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice semelhante termal ou pontuação e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica semelhante, ou seja, silenciosa obter uma proteína funcionalmente equivalente biológico. Ao fazer tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices termais são de ± 2 é o preferido, aqueles ± 1 são particularmente preferida, e aqueles dentro de ± 0,5 são ainda mais Particularmente preferido.

[0091]É também entendido na arte que a substituição de aminoácidos similares pode ser feita de forma eficaz com base em hidrofilicidade. U. S. 4.554.101 afirma que a hidrofilicidade maior média local de uma proteína-proteína, que são regidas pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica do. Conforme detalhado na U. S. Patent 4.554.101, os valores hidrofilicidade após ter sido designado para resíduos de aminoácidos: arginina (3,0), lisina (3,0), aspartato (3,0 ± 1), o glutamato (3,0 ± 1), serina (+ 0,3), asparagina (0,2), glutamina (0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 ± 1), alanina (-0,5), histidina (- cisteína 0,5), (-1,0 ), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tiro- sina (-2,3), fenilalanina (-2,5), triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro com um valor semelhante hidrofilicidade e ainda obter uma proteína biologicamente equivalente, e em particular, sobre imunologicamente equivalente. Em tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicida- de estão dentro de ± 2 é o preferido, aqueles ± 1 são particularmente preferidos, e aqueles dentro de ± 0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

[0092]Como descrito acima, substituições de aminoácidos são, regra geral, com base na similaridade relativa do aminoácido de cadeia lateral substituintes, por exemplo, a hidrofobicidade, hidrofilicidade carga, tamanho, etc. Substituições exemplar que tomar várias das características acima em consideração são bem conhecidos os de habilidade na arte e incluem: arginina e lisina, glutamato e aspartato, seri- na e glutamina treonina e asparagina, e valina, leucina e isoleucina.

[0093]Polipeptídeos podem compreender um sinal (ou líder) sequência no final N-terminal da proteína, co-traducionalmente proteína que ou pós- traducionalmente dirige a transferência do arquivo. O polipeptídeo também pode ser conjugado a uma sequência de esquerda ou outros para facilitar a síntese, purificação e identificação (por exemplo, poli-His), para apoiar ou reforçar a ligação do poli- peptídeo para um sólido. Do polipeptídeo.

[0094]Glicosilação de polipeptídeos que costuma ser ou N-ligado ou O- ligado. N-ligado refere-se à penhora da fração de carboidratos para a cadeia lateral de um resíduo asparagina. A "sequons" é uma sequência de três períodos consecutivos de aminoácidos em uma proteína que pode servir como local de ligação para um polissacarídeo (açúcar) chamado N-linked glicano. Este é um polissacarídeo ligado à proteína através do átomo de nitrogênio na cadeia lateral de asparagina (Asn). A sequons é ou Asn-Xaa-Ser ou Asn-Xaa-Thr, onde X33 é qualquer aminoá- cido, exceto prolina.

[0095]Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídeo em um polipeptídeo cria um site glicosilação potencial. Gllicosilação O-ligada refere-se a penhora de um dos açúcares N-aceylgalactosamine, galactose ou xilose em um ácido hydroxyamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5 - hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também pode ser usado. Enquanto o Asn-X-Ser/Thr sequons é absolutamente necessário para a fixação de oligossacarídeos N-ligados a uma glicoprote- ína (Marshall RD, Simpósios Sociedade Bioquímica 40, 17-26, 1974), sua presença nem sempre resulta em glicosilação e alguns sequons nas glicoproteínas pode permanecer unglycosylated. (Curling EM, et al, Jornal Bioquímica 111, 333-337, 1990).

[0096]O glicano microarray é uma ferramenta poderosa para a investigação de interações carboidrato-proteína e fornece uma nova plataforma para o vírus influenza subtipagem (Blixt O, et al (2004) Proc Natl Acad Sci EUA 101: 17033-17038, Chandrasekaran A, et al . (2008) Nat Biotechnol 26:107-113; Liang PH, et al (2007) J Am Soc Chem 129:11177-11184; Stevens J, et al (2008) J Biol MoI 381:1382-1394). Eles imitam os glicanos na superfície da célula para exibir interações multivalentes com alta afinidade e especificidade. Usando essa tecnologia, a caracterização da especificidade do receptor de várias HAs nativas e mutantes fornecendo uma nova plataforma para diferenciar os subtipos do vírus influenza foi realizada.

[0097]Apesar de um poderoso método, a compreensão HA-glicano interações glicano por análise de matriz tem sido complicada por duas questões: primeiro, a especificidade de ligação HA é afetada pelo arranjo espacial e composição dos glicanos vestiu e método de detecção de ligação utilizado (Srinivasan A, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci EUA 105:2800-2805). Segundo, as mudanças na sequência do peptídeo em ou perto de sítios de glicosilação pode alterar a estrutura 3D HA, e de ligação aos receptores e especificidade Assim afinidade. Realmente, tem a partir de diferentes subtipos H5N1 têm diferentes padrões de glicano de ligação (Stevens J, et al (2008) J MoI Biol 381: 1382-1394). Mutagênese de sítios de glicosilação em Hl e H3 tem sido estudado em todo o sistema-viral (Chandrasekaran A, et al (2008) Nat Biotechnol 26: 107-113; Deom CM, et al (1986) Proc Natl Acad Sci EUA 83 :3771- 3775). No entanto, não se sabe como as mudanças na glicosilação afeta de ligação aos receptores especificidade e afinidade, especialmente com relação à HA mais patogênico H5N1. Para tratar dessas questões, um método quantitativo de análise de microarray glicano foi desenvolvido para superar as limitações de experimentos tradicionais HA vinculativo.

[0098]Estudos anteriores usaram HA a partir da expressão de células de inseto (Chandrasekaran A, et al. (2008) Nat Biotechnol 26:107-113). No entanto, glico- silação em células de inseto difere de células de mamíferos, com uma diferença marcante é que tipo complexo N-glicano terminando em ácido siálico e galactose não são produzidos em células de insetos. variantes HA glicosiladas expressa a partir de células humanas

[0099]Para abordar como as mudanças na glicosilação afetam a ligação aos receptores especificidade e afinidade em células humanas, um microarray glicano compreendendo extensa análogos estruturais do ligante HA-binding, e vários glycoforms definido de HA foram preparados usando a sequência consenso de influenza H5N1 HA (Chen MW, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci EUA 105:13538-13543) para análise quantitativa de ligação.

[00100]Os códons foram otimizados para expressão de CHA5 usando có- dons humana. Como mostrado na Tabela 1, o original viral protease clivagem local PQRERRRKKRG (SEQ ID NO: 1) foi mutado para PQRERG (SEQ ID NO: 2), a fim de proteínas evitáveis da clivagem enzimática para formar Hal e HA2. A região transmembrana (resíduos: 533-555) foi substituído com os resíduos adicionais LVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) no terminal C do constructo HA, onde o local de clivagem da trombina é em itálico, o bacteriófago T4 fibritin sequência trimerização foldons é sublinhado, e as His-tag está em negrito (Stevens, J. et al. (2006) Ciência 312:404-410).Tabela 1 - Sequência de hemaglutinina H5 consenso

[00101]A sequência de consenso H5 foi usada para gerar variantes glicosi- ladas por HA expressas a partir de células humanas HEK293. Para gerar glicosila- ção com alto teor de manose (HAhm), foram utilizadas células HEK293S, que são deficientes em N-acetilglucosaminiltransferase I (GnTI-). Para abordar ainda mais o efeito da glicosilação da HA na afinidade e especificidade de ligação ao receptor, os açúcares no AH foram sistematicamente removidos dos glicanos do complexo N do tipo nativo (Fig. IA). Os resíduos de ácido siálico foram removidos do HAfg por tratamento com neuraminidase (NA) para produzir HA dessialilada (HAdS). A endoglico- sidase H (Endo H) foi usada para truncar todas as estruturas de glicano até um único resíduo GIcNAc para produzir HA monoglicossilada (HAmg). Assim, um total de quatro glicoformas de HA foram geradas: HAfg: HA totalmente glicosilada de células humanas HEK293E; HAds HA desialilada de neuraminidase (NA) tratamento de HAfg; HAhm: HA com alto teor de manose de células humanas com deficiência de N-acetilglucosaminil transferase I (GnTI-) HEK293S e HAmg: HA com um único resíduo de N-acetil glucosamina em seus locais de glicosilação no tratado de Endoglu cosidase H (Endo H) tratamento de HAhm (Fig. 1A e Fig. 6). As estruturas do glicano são verificadas por análise espectral de massa (Figs. 7, 8, 9). O dicroísmo circular das variantes confirmou que suas estruturas secundárias são semelhantes (Fig. 1C). O único efeito dos N-glicanos no AH de diferentes glicoformas foi então estudado, assumindo que as estruturas 3D da proteína dessas amostras E são semelhantes e não causam viés na análise (Fig. IB). Note-se que uma tentativa de expressar HA funcional em Escherichia coli falhou devido à falta de glicosilação.

[00102]Além disso, análises de espectrometria de massa confirmaram que (a) HAfg contém predominantemente N-glicanos do tipo complexo (Fig. 7A), (b) os ácidos siálicos ter sido removido do tipo complexo N-glicano na HADS (Fig. 7B ), (c) Hahm contém predominantemente do tipo alta manose N-glicanos (Fig. 7C), e (d) HAmg mostrou apenas a amina N-acetilglicosamina (GlcNAc) em HA (Fig. 1 e Fig. 8).

Perfil de micro arranjo de glicano de variantes glicosilada HA

[00103]O perfil de microarranjo de glicano de variantes glicosilada HAfg HA, HADS, Hahm, andHAmg foi examinadoo usando o método tradicional sanduíche. O sintético de ácido siálico série glicano consistiu de 17 dos α2, 3 (glicanos 1-17) e 7 do α2, 6 (glicanos 21-27) sialosides projetados para explorar a especificidade glicano de vírus influenza (ver Fig. 4). O sialosides sintéticos com um ligando de cinco carbonos terminados com amina foram preparados e covalentemente ligados em lâminas de vidro revestidas NHS-formando ligação amida, em meio aquoso para a temperatura ambiente. O procedimento de impressão foi baseado na tecnologia de impressão robótico microarray padrão, conforme relatado anteriormente (Blixt O, et al (2004) Proc Natl Acad Sci EUA 101 :17033-17 038; Wang CC, et al (2008) Proc Natl Acad Sci. EUA 105:11661-11666). HA variantes foram aplicados aos diapositivos ácido siálico e hibridizado com o anticorpo primário, seguido por detecção com um anticorpo secundário conjugado com Cy3. Esta análise indicou que a sequência consenso HA H5N1 se liga especificamente ao α2,3 sialosides mas não α2, 6 sialosides (2A) De acordo com estudos anteriores (Chandrasekaran A, et al. (2008) Nat Biotechnol 26:107-113;. Stevens J, et al (2008) J Biol MoI 381:1382-1394). Surpreendentemente, a força de ligação com α2, 3 sialosides cresceu sucessivamente mais forte da HAfg, HADS e Hahm, para HAmg (Fig. 2A), ligando via qualitativa intensidade de fluorescência relativa._ [0098] tem foram contactados com uma matriz de glicano sintéticas contendo 17 α2-3 (glicano 1-17) e 7 α2-6 (glicano 21-27) sialosides projetado para o vírus influenza (Fig. 4), e então a proteína HA foram hibridi- zados com principal unlabeled seguida de detecção por anticorpos Cy3 tag secundário. A análise indicou que a gripe hemaglutinina H5NI da sequência de consenso pode se ligam especificamente a α2-3, mas não sialosides α2-6 sialosides (Fig 2A). Surpreendentemente, a ligação com α2-3 sialosides sucessivamente mais forte do que HAfg, HADS, Hahm, para HAmg (Fig 2A) na comparação de perfis de intensidade de matriz de glicano.

Microarranjo de glicano quantitativo

[00104]A perfilação de arranjo de glicano tem sido limitada à natureza qualitativa dos eventos de ligação na investigação porque ela só fornece a intensidade relativa de fluorescência, e os usuários não conseguem diferenciar a afinidade de ligação aos receptores das experiências separadas. A fim de precisamente determinar os efeitos de ligação, esta plataforma de microarray foi estendida para as constantes de dissociação de interações HA-glicano quantitativamente.

[00105]Uma matriz quantitativa foi projetada para a superfície constantes de dissociação DetermineApplicationTrust (Liang PH, em el (2007) J Am Soc Chem 129: 11.177-11.184). Para evitar qualquer distorção por anticorpos camadas, HA foi diretamente identificado com o corante fluorescente Cy3 (Srinivasan A, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci EUA 105:2800-2805). Ensaios de ligação direta foram realizados por diluição em série de Cy3 marcado tem que estabelecer as intensidades relativas de ligação. As constantes de dissociação na superfície foram determinadas através da representação gráfica das concentrações contra a HA intensidade de fluorescência para cada uma das 24 sialosides impressa na lâmina de vidro. Os valores da constante de dissociação foram calculados com base KD,surf as isotermas de Langmuir (ver Fig. 2B). A ligação sialoside monovalente HA é fraco, apresentando constantes de dissociação na faixa milimolar (KD = 2,5 x 10-3 M) (Sauter NK, et al (1989) Bioquímica 28:8388-8396), no entanto, HA está envolvido em interações multivalentes com o anfitrião sialosides superfície celular ligado, que pode ser visto na matriz de perfil quantitativo (Tabela 2). O KD valores, surf diminuiu globalmente e substancialmente como o comprimento de N-glicanos sobre diminuiu (Fig. 2B).

[00106]Todos os receptores glcoformes HA mostraram forte ligação para gli- canos com um grupo sulfato na posição 6 do resíduo terceiro GlcNAc a partir do final nonreducing (glicanos 4 e 7). Esse grupo de sulfato é importante para a ligação com H5 HA (Chandrasekaran A, et al (2008) Nat Biotechnol 26:107-113, Stevens J, et al (2008) J MoI Biol 381: 1382-1394). Além disso, observou-se que glicano 4 é o melhor ligante para HAfg, ao passo que glicanos 13-15 são melhores ligantes que gli- cano 6 para HAmg, indicando uma possível interação multivalentes dentro do site de fixação do ligando, ou a exposição de mais de ligação aos receptores domínios para maiores sialosides biantennary (glicanos 13 e 14). Curiosamente, ligação HA aumenta substancialmente à medida que estruturas de N-glicano tornam-se menos complexas (Fig. 2B).

[00107]No entanto, embora os valores de KD,surf para HAmg mostram forte ligação e semelhante a um glicanos poucos SA, as variantes HA outras exibem mais fracos e mais específicos de ligação a ligantes glicano (Figs. 2B e 10). Assim, a especificidade de ligação e afinidade de ligação pode ter uma relação inversa que é modulada pela estrutura glicano. Essa modulação pode ter significado biológico importante, na medida em que os hidratos de carbono na HA podem sintonizar o seu reconhecimento de receptores glicano nas células epiteliais do pulmão.

Contribuição da Energia de Ligação a partir do Receptor Sialosides

[00108]Parâmetros cinéticos podem ser aplicados a parâmetros termodinâmicos para ilustrar os acontecimentos em detalhes a interação molecular. A constante de dissociação (KD,surf) de interações de HA-glicano pode ser usada para calcular a variação de energia livre de Gibbs de ligação (ΔGmulti). Valores para ΔGmuiti representam uma medida quantitativa de estabilizar a energia de HA-glicano interações. A diminuição sucessiva no ΔGmuiti correlacionou com a redução sistemática na complexidade / truncamento das estruturas N-glicano de HA (Tabela 2).Tabela 2 Constantes de dissociação (KD,surf) e mudanças de energia livre (ΔG) de HA ligação com variantes glicosilada quando α2,3 sialosides 1-15

[00109]A Tabela 2 mostra os parâmetros termodinâmicos de HA com glicosi- lação diferentes em resposta a α2, 3 sialosides 1-15. Mudanças de energia livre (ΔG) e KD,surf de HA-glicano interações são mostrados em resposta a α2, 3 sialosides 1-15. ΔG valores podem ser derivadas de valores KD,surf usando a equação ΔGmulti = - RT ln(KD,surf-1). Os valores de ΔG foram calculados de acordo com os valores KD,surf para obter mudanças de energia livre em HA-glicano de ligação. ΔG (HAfg) de glicanos 5 e 9 não é determinado. ND indica não determinado. (* A partir do conjunto de 15 identificados HA-binding sialosides, diferenças estatisticamente significativas de valores KD,surf entre quatro glycoforms HA são mostrados através de um one-way ANOVA (P <0,05 é considerado significativo)).

[00110]As diferenças na mudança de energia livre (ΔΔG) entre variantes HA são causados por estruturas glicano única (Figura 10), ea maior diferença é entre HAfg e HAmg (ΔΔG HAfg -> HAmg, ver Figura 10), o que é consistente com a maior diferença na energia de ligação resultante de corte a maior parte do N-glicano para baixo a uma única GlcNAc. Note-se que os valores de ΔΔG são semelhantes, exceto para glicanos 4 e 7 (Figura 10), indicando que glicanos em HA não afetam significativamente a afinidade de ligação com sulfatados α2, 3 trissacarídeos (Chandraseka- ran A, et al. (2008) Nat Biotechnol 26: 107-113).

Ligação Receptor HA

[00111]Os detalhes moleculares do receptor de HA vinculativo (isto é, a con-tribuição de cada componente estrutural compreendendo um receptor glicano) podem ser abordadas, comparando as diferenças na mudança de energia livre (ΔΔG valores) entre sialosides receptor diferentes (Figs. 4 e 11). Dissecando a contribuição de energia do receptor responsável pela ligação sialosides HA revelar pontos- chave de especificidade que são usados para projetar novos inibidores da HA. Sialosides α2, 3 ligada à galactose resíduos com βl, 4 (Galβl-4) possuem vínculos de afinidade de ligação melhor do que aqueles com Galβl-3 ligações (Stevens J, et al. (2008) J Biol MoI 381:1382-1394).

[00112]Isso se reflete na comparação do Neu5Ac-α2 backbone dissacarí- deo,3-galactose (Neu5Acα2,3Gal) (Fig. 4 A, glicano 1, destaque caixa vermelha), onde trissacarídeo 3 e 6 apenas diferem na ligação entre Gal e GlcNAc. Aqui, o ΔΔG (1 ^ 3) para todas as variantes HA é negativo (estabilização HA receptor de interação), enquanto o ΔΔG (1 ^ 6) para todas as variantes HA é positivo (desestabili- zando interação HA-receptor;. Figs 4A e 11). Esta observação indica que Neu5Ac - α2, 3Galβl 4Glc/GlcNAc-glycan é o componente central interagindo com o bolso HA- vinculativo. Além disso, o valor de ΔΔG (1 -> 9) para todas as variantes HA é positivo, indicando uma perturbação negativa causada pela manose β6-linked na terceira posição (Figs. 4A e 11). Assim, energia de ligação é afetado por resíduos internos do açúcar e seus padrões de vinculação à Neu5Ac distal - α2, 3Gal ligante dissaca- rídeo (Fig. 4A).

[00113]Esta análise mostra que um resíduo GlcNAc na terceira posição é favorecido por todas as variantes HA. No entanto, na comparação de valores ΔΔG para glicanos 13 e 14 (Figs. 4E e 11) para glicano 6, interações multivalentes no sítio de ligação com o sialoside biantennary são aparentes, e para HAmg, esta avidez intra-molecular é mais significativo para a condução de ligação do que a efeito estrutural exercida pelo açúcar terceiros.

[00114]Seguinte, glicanos receptores 10, 11, 12 e 15 foram comparados. Estes têm a estrutura mesmo núcleo básico (8 glicano trissacarídeos), mas diferem por alongamento (glicanos 11 e 12) ou adição de um α2, 6 ácido siálico na terceira posição (15 glicano; 4B). É interessante que o sialoside com o ácido siálico α2, 6 ramificada aumentou grandemente a avidez de HA, ao passo que a mais α2, 3 sialoside estendendo-se desde glicano 8resultou em uma fraca ligação por HAs (ΔΔG (8 -> 15)> ΔΔG (8 → 11) ~ ΔΔG (8 → 10)> ΔΔG (8 → 12), Fig. 4B e 11).

[00115]Os glicanos 3-5 e 6-7 compartilham a mesma cadeia mas diferem trissacarídeos pela adição de um grupo sulfato (glicano 4) ou resíduo de fucose (gli- cano 5) no terceiro GlcNAc a partir do final nonreducing. O grupo sulfato pode estabilizar a interação do receptor HA-glicano até 2044 kcal / mol (ΔΔG (6 ^ 7)), o maior gap de energia entre dois sialosides receptor. Entre todas as variantes HA, a variante totalmente glicosilada mostrou as diferenças mais significativas mudanças na energia livre, com valores de ΔΔG (3 ^ 4) HAfg (-1.653 kcal / mol) e ΔΔG (6 ^ 7) HAfg (-2.044 kcal / mol), eo tamanho do ganho de energia livre diminuíram enquanto a estrutura glicano tornou-se mais simplificado, ou seja, HAfg> HADS> Hahm> HAmg.

[00116]Assim, glicanos sulfatados aumentam dramaticamente HA vinculativa, e HA totalmente glicosilada maximiza este efeito (Figs. 4C e D), que é importante para a patogênese H5N1. Por outro lado, os análogos receptores fucosilados muito desestabilizam HA vinculativo, variantes HA glicosilada com todos mostrando um ΔΔG positivas (3 -> 5) (Fig. 4C). Essas grandes diferenças na ΔΔG (3 -> 4) e ΔΔG (3 -> 5) são provavelmente causada por uma interação importante ligação no bolso de ligação aos receptores, o que maximiza o grupo sulfato ea fucose estericamente blocos. A ligação fraca de HAfg é improvável devido à concorrência de seus sialyl- glycans, pois a remoção do ácido siálico tem um efeito pequeno sobre a ligação, e HAfg ainda apresenta uma forte afinidade para alguns sialilglicanos específicos.

Projeção de Vacina Usando Monoglicosilatado HA

[00117]A HAmg hemaglutinina monoglicosilatada mostra uma estrutura semelhante secundário e melhor afinidade de ligação para hospedar os receptores, em comparação ao seu homólogo totalmente glicosilada. Estudos recentes também indicam que um resíduo GlcNAc único Asn é o componente mínimo da N-glicano necessários para dobrar glicoproteína e estabilização (Hanson SR, et al (2009). Proc Natl Acad Sci EUA 106:3131-3136). Porque as proteínas são imunógeno superior a glicanos, a proteína HA monoglicosilatada foi testado como uma vacina contra vírus influenza.

[00118]Anti-soros de HAfg HAmg e imunizações foram comparados em relação à sua capacidade de se ligar e neutralizar vírus H5 nativo (Fig. 5). Na verdade, em contraste com HAfg, o anti-soro mostrou mais forte HAmg neutralização do vírus. O anti-soro também se liga ao HAmg Hl (New Caledonia/1999), para além dos subti- pos H5 Vietnam/1194, H5 (Anhui), e H5 (ID5/2005) (Fig. 5D). Nomeadamente, a vacina foi HAmg muito mais proteção do que HAfg a vacina em um estudo desafio (Fig. 5C).

[00119]As sequências de aminoácidos de Hl, H3, H5 e isoladas de humanos foram comparadas I FIG. 3. Ao comparar HI vs. H3 e H3 vs. H5, as diferenças nas sequências de aminoácidos gerais, bem como aquelas perto de locais de N- glicosilação são observadas. Hl e H5 apresentam maior similaridades na sequência de aminoácidos geral e as sequências próximas aos locais de N-glicosilação são mais conservadas. Cepas Hl Sazonal (A/Brisbane/59/2007) e Pandemic (A/California/07/2009) mostram cerca de 79% identidade de sequência. A identidade sequência geral foi de cerca de 63% entre Hl e H5, e cerca de 40% entre os dois H3 e H5, e Hl e H3. Além disso, os locais de N-glicosilação (mostrado dentro de caixas de vermelho na Figura 3) e as sequências de peptídeo subjacentes são mais con-servadas entre Hl e H5 que entre H1/H3 e H5.

[00120]A presente invenção mostra que a simplificação sistemática de N- glicanos em resultados HA em um aumento sucessivo na ligação para α2, 3 sialosides mas não para α2, 6 sialosides. Os inventores, pela primeira vez, mostram o efeito da HA do exterior e interior-glicanos na ligação do receptor e quantitativamente dissecar a afinidade de ligação e as contribuições energéticas de HA-receptor interações.

[00121]A glicosilação HA afeta a função da gripe HA (Wagner R, et al. (2002) J Gen Virol 83:601-609). Curiosamente, como o nível de glicosilação sobre a gripe H3N2 aumentou desde 1968, a morbidade, mortalidade e títulos viral têm diminuído desenvolvimento (Vigerust DJ, et al (2007) J Virol 81:8593-8600).

[00122]Sem ser vinculado a teoria, a constatação de que HA com uma única GlcNAc anexado aos locais de glicosilação mostra afinidade maior especificidade, mas relaxado para α2, 3 sialosides sugere que o N-glicanos no HA pode causar impedimento estérico perto do receptor HA domínio de ligação. A alta especificidade para o receptor pode sialosides preventDefault o vírus de se ligar a alguns glicanos outras específicas sobre a superfície da célula humana epiteliais do pulmão. Por outro lado, HA com glicanos truncado pode reconhecer α2, 3 sialosides receptor com maior afinidade de ligação e menor especificidade, sugerindo que a redução do comprimento de glicanos em HA pode aumentar o risco de infecção por gripe aviária. É, no entanto, não está claro como as mudanças de HA receptor interação via glicosilação afetar a infectividade do vírus e da atividade NA no ciclo de vida viral.

[00123]HA com uma única GlcNAc é um candidato promissor para vacina contra a gripe porque tal construir um Mantém a estrutura intacta de HA e pode ser facilmente preparado (por exemplo, através de levedura). Ele também pode expor epitopos conservados escondido por glicanos grande para provocar resposta imuno- lógica a que reconhece variantes HA em títulos mais altos. Esta estratégia abre uma nova direção para o projeto da vacina e, juntamente com outras estratégias vacinais diferentes (Hoffman E, et al.(2005) Proc Natl Acad Sci EUA 102: 12915-12920; Hu- leatt JW, et al (2008) Vacina 26:201-214; Scanlan CN, et al (2007) J Biol MoI 372:1622, Yang ZY, et al. (2007) Ciência 317:825-828) e descobertas recentes de anticorpos HÁ-neutralizantes (Ekiert DC, et al (2009), Science 324:246-251, Kashyap AK, et al (2008) Proc Natl. Acad Sci EUA 105:5986-5991; Scheid JF, et al (2009) Nature 458:636-640; Stevens J, et al (2006) Ciência 312:404-410; Sui JH, et al (2009). Nat Struct MoI Biol 16:265-273), deve facilitar o desenvolvimento de vacinas contra vírus como o influenza, vírus da hepatite C e HIV.

[00124]Portanto, se HA com uma única GlcNAc pode ser um candidato promissor para vacina contra a gripe foi testado. Para os benefícios de sua forte ligação com 0,2-3 sialosides, HA com uma única GlcNAc pode provocar resposta imune que reconhece a região próxima ao RBD com títulos mais altos, indicando que a adição de oligossacarídeos pode ser um meio eficaz de evasão imune através da modificação ou mascaramento dos epítopos antigênicos do vírus. Portanto, a estratégia de remoção da maioria dos glicanos, mas com pelo menos uma única retenção de GIuNAc abre uma nova direção para o projeto de futuras vacinas, e este conceito fornece sugestões sobre projetos de outra vacina anti-vírus, tais como HCV, HBV e HIV. Outras iterações têm dois, três, ou mais glicanos da cadeia de glicano original remanescente.

Glicoproteinas de superfície de célula parcialmente glicosilatada

[00125]As glicoproteínas de superfície celular de vírus são bons alvos para o desenvolvimento de vacinas. No entanto, proteínas de superfície, tais são muitas vezes altamente glicosilada pelo anfitrião para proteger do vírus do sistema imune do hospedeiro Além disso, as sequências de proteína viral em torno dos locais de glicosilação são muitas vezes altamente conservada e, portanto, são bons para o antígeno de concepção de uma vacina, porém, esses regiões altamente conservadas não são prontamente disponíveis para o sistema imune do hospedeiro ao menos em parte devido à quantidade de glicosilação bloqueio ou que abrange as regiões. Por exemplo, uma das razões para o sucesso limitado na preparação de vacinas contra o HIV está intacta porque a superfície viral é altamente glicosilada gpl20.

[00126]A nova vacina é mais imunogênica e a neutralização de anticorpos induzida é esperada para ter uma melhor atividade contra a glicoproteína intactas, o que é feito pelo vírus e do hospedeiro. O anticorpo é capaz de atacar tanto a região menos ou não-glicosilada (s) que é mais provável de mutação e da região altamente glicosilada Qual é conservada, menos propensos a sofrer mutações e / ou sensíveis a mutação. Um anticorpo gerado desta forma irá interagir fortemente com a parte protéica do alvo, tais como anticorpos tem alta afinidade por proteínas do que carboidratos e, portanto, termodinamicamente ele vai empurrar a cadeia de glicano de distância para as regiões altamente conservadas ligam ao redor dos locais de glico- silação.

[00127]Nas glicoproteínas O- e N-ligados, o primeiro açúcar (N- acetilglicosamina para N-glicoproteína e N-acetilglicosamina ou N- acetilgalactosamina para O-glicoproteína) é essencial para preservar a estrutura terciária da glicoproteína enquanto o resto dos açúcares não são importantes. Tratamento das N-glicoproteínas com o endoglycosidase (Endoh) quer remover a corrente e manter o açúcar N-acetil-glucosamina ligados à proteína. Manosidase também pode ser usado para clivar N-glicoproteínas para di-ou triglycans, Quais vêm expres-samente previstas como vacinas possível devido à capacidade do sistema imunoló- gico para acessar os sítios de glicosilação conservado na proteína, mesmo com di-, tri-e maior proteínas deglicosilatada. Outras glicosidases também estão disponíveis para remover a cadeia de açúcar a partir de O-glicoproteínas e manter o primeiro açúcar anexado à proteína.

[00128]Quando uma hemaglutinina totalmente glicosilada (HA) de gripe aviária (H5), expressa em células humanas é tratada com Endoh para reduzir glicosila- ção a um estado monoglicosilatada e utilizado na imunização de coelho, o anti-soro gerado tem um maior título que o anti-soro gerada a partir da hemaglutinina totalmente glicosilada. (Figs. 13A-13B). É, portanto, capaz de neutralizar a hemaglutinina de outras cepas de gripe aviária e da hemaglutinina Hl da gripe humana, enquanto o anti-soro dos HA totalmente glicosilada não pode neutralizar Hl e é mais específico para a cepa da gripe aviária.

[00129]O padrão de glicosilação de similaridade e estrutura da proteína entre Hl e H5 fornece uma possível razão por que a mono-glicosilada H5 cruzada anti- soro reage com St. Os dados foram obtidos utilizando anti-soros de coelho. (Fig. 13). Como mostrado nas Figs. 12-14, a hemaglutinina de H3 não tem o mesmo grau de homologia como H5 HA HA faz com Hl. Assim, anti-soro gerados a partir de Hl e H5 NÃO neutralizar H3. No entanto, porque outras partes H3 homologia nas regiões conservadas com Hl e anti-soro H5 gerados a partir deglicosilatada hemaglutinina H3 H5 hemaglutinina e neutralizante Hl hemaglutinina, além de H3 hemaglutinina.

[00130]Para preparar a hemaglutinina monoglicosilatada, não é necessário fazer a glicoproteína de cultura de células humanas como a glicoproteína com os primeiros três açúcares (manose - N-acetilglicosamina - aminas N-ace tylglucos) ou apenas o monossacarídeo (N-acetilglicosamina aminas) ligado à proteína (isto é, N- acetilglicosamina - proteína) é altamente conservada em eucariotos. Assim, pode-se fazer a glicoproteína em leveduras, baculovírus, ou outros hosts eucarióticas e tratar a mistura com a glicoproteína glicosidase adequados, tais como Endoh ou manosi- dase para N-linked glicoproteínas, para preparar a proteína homogênea monoglicosi- latada para uso como vacina.

[00131]Sem ser vinculado a teoria, postula-se que glicano N-ligado é muito maior do que o glicano O-ligado e é o glicano N-ligado que precisa ser cortado para remover os resíduos de cadeias de açúcar. Portanto, o glicano O-ligado não irá causar um problema, mesmo se ele está intacto.

[00132]A glicoproteína nativa que é exposta ao sistema imunológico tem uma glicoproteína ramificada N-ligada. Por causa da glicosilação, a região altamente conservada é inacessível para o sistema imunológico. Assim, o sistema imunológico pode ter como alvo apenas as regiões altamente variável, reduzindo assim o assunto suscetível a várias infecções virais como as regiões variável. Se o sistema imuno- lógico é capaz de acessar as regiões altamente conservadas, então anticorpos dirigidos a estas sequências, que não variam ao longo do tempo Fornecer uma rota para a inoculação contra vírus que quer ter regiões variáveis que sofrer mutação e tornar Assim anticorpos existentes contra as glicoproteínas são ineficazes ou dom gli- cosilada grossa a ser inacessíveis para o sistema imunológico substancialmente.

[00133]Portanto, para fazer a proteína acessíveis ao sistema imunológico através de uma vacina, a glicosilação é removido, expondo assim a proteína nativa viral ao sistema imunológico importante, a remoção completa dos açúcares a partir da proteína tem sido mostrado para causar a proteína para desnaturado, e em muitas glicoproteínas glicoproteína viral, glicosilação é um componente chave para a estrutura terciária da glicoproteína.

[00134]Os açúcares são removidos, expondo a proteína nativa isoladas gli- cosilada a um N-glicosidase, por exemplo, ou Endoh manosidase, que irá unir todos, mas o primeiro, dois ou três açúcares da glicoproteína, sem causar a proteína para perder sua estrutura terciária. As proteínas deglicosilatada são então formuladas com um portador adequado farmacêutica e administrada como uma vacina para um assunto. Porque as regiões altamente conservadas glicosilação estão agora expostos ao sistema imunológico e, assim, deglicosilatada, os anticorpos são gerados contra as regiões altamente conservadas.

[00135]Quando os indivíduos imunizados estão infectados com o vírus e as glicoproteínas virais são expostas ao sistema imune, os anticorpos que são direcionados para as regiões altamente conservadas da proteína estão presentes no sis- tema do sujeito Assim, mutações em regiões variáveis torna-se irrelevante porque existem anticorpos tranquila dirigido às regiões não-mutante conservada da glicopro- teína.

[00136]Além disso, glicosilação não impede de ligação dos anticorpos para as regiões altamente conservadas porque os anticorpos são termodinamicamente inclinado a se ligam a proteína e "empurrar" os açúcares fora do caminho para a ligação dos anticorpos para as regiões altamente conservadas. Importante, em proteínas virais, como gpl20 do HIV, esta estratégia fornece um método e composição para a inoculação, onde o sistema imunológico não iria produzir títulos de anticorpos para grande o suficiente para efetivamente combater a infecção.

[00137]De acordo com implementações incorporando estes princípios, uma vacina que compreende pelo menos uma hemaglutinina farmaceuticamente aceitável deglicosilatada e um transportador é contemplado. A vacina pode ser feita usando qualquer sistema que expressa as proteínas glicosiladas, tais como leveduras e baculovírus. Uma vez que as proteínas são feitas, elas são isoladas utilizando um método adequado, como eletroforese em gel, cromatografia ou outros métodos capazes de isolar proteínas.

[00138]O padrão de glicosilação no local de glicosilação é conservado em quase todos os eucariontes (GlcNAc-GlcNAc-Man). Assim, não importa o que o padrão de glicosilação a jusante, desde que o primeiro 1-3 (potencialmente mais dependendo do organismo ser inoculado e do organismo de produzir a proteína) açúcares permanecem. Assim, para uma vacina humana, leveduras podem ser usadas para produzir a proteína usada em uma vacinação humana, porque uma vez que todos, mas o primeiro 1-3 açúcares são clivadas, o padrão é idêntico ao primeiro 02:59 açúcares na versão humana a glicoproteína. Portanto, a presente divulgação proporciona uma plataforma única para a produção elevada, a produção de alta produção de vacinas contra o vírus influenza, tais como HIV, e flavivirus.

[00139]Para gerar as vacinas, as proteínas glicosiladas são isoladas e, em seguida (parcialmente) deglicosilatada usando uma glicosidase, ou de outra enzima que digere o método seletivamente ou hidratos de carbono que formam a glicosila- ção. No entanto, qualquer método é usado para clivar as cadeias de açúcar não deve afetar a estrutura terciária da proteína subjacente.

[00140]As glicoproteínas parcialmente glicosiladas, ou fragmentos dos mesmos, também pode ser preparado sinteticamente. Há duas estratégias para a síntese de glicopeptídeos. (I) método Stepwise: ácidos glycosylamino são usados como um bloco de construção para a síntese em fase sólida. A vantagem dessa abordagem é o "uso amplo" para a produção de glicopeptídeos vários. Esta abordagem permite a preparação de glicopeptídeos ter algumas metades de oligossacarí- deos, (ii) o método convergente: a molécula de oligossacarídeos e uma molécula de peptídeo são preparados separadamente, em seguida, juntamente com o outro. Comumente, essa abordagem é usada para a produção de N-glicopeptídeos. Essa abordagem requer um grupo especial de cadeia lateral ortogonais para proteger o "ponto de glicosilação" na porção de peptídeo.

[00141]Em uma modalidade, N-acetilglicosamina (GlcNAc) ligado ao resíduo de asparagina do peptídeo pode ser sintetizado através de um método tioéster para construir o segmento polipeptídeo (RB Merrifield, J. Am Chem. Soc. 85:2149 (1983)) e um método dimethylphosphinothioic anhyride mista (MPT-MA) para a incorporação da metade glicopeptídeo (Guo, ZW, et al. (1997). Angew. Ed. Engl 36, 1464-1466). Vacinas para Gripe de Reação Cruzada produzidas a partir de proteinas HA mono- glicosilatadas

(A) Vacinação com proteina HA mono-glicosilatada sasonal H1 (Brisbane).

[00142]Um ensaio de inibição da Hemaglutinação foi usado para detectar se anti-soros de Hl vacinação (Brisbane) pode inibir NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) a capacidade do vírus de aglutinar as células vermelhas do san- gue. Conforme mostrado na Figura 15A, anti-soros de vacinação com mono- glicosilada HA (HAmg) de Hl (Brisbane) demonstraram melhor capacidade de inibir a NIBRG-121 (H1N1/2009) a capacidade do vírus de aglutinar células vermelhas do sangue do que HA totalmente glicosilada (HAfg) e unglicosilatada HA (Haug).

[00143]Um ensaio microneutralização foi usado para detectar se anti-soros de Hl (Brisbane) a vacinação pode neutralizar NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) a capacidade do vírus para infectar as células MDCK. Conforme mostrado na Figura 15B, mono-glicosilada HA (HAmg) de Hl (Brisbane) demonstraram melhor capacidade de neutralizar NIBRG-121 (H1N1/2009) a capacidade do vírus para infectar as células MDCK de HA totalmente glicosilada (HAfg) e HA unglycosylated (Haugen) . 0134] Um experimento desafio vírus foi realizado para demonstrar a vacinação com mono-glicosilada HA de Hl (Brisbane) pode proteger NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) desafio vírus. Conforme mostrado na Figura 15C, mono-glicosilada HA (Brisbane) como uma vacina protege camundongos BALB / c de NIBRG-121 (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) desafio vírus. Em contraste, HA totalmente glicosilada, que está presente em vacinas contra a gripe tradicional, feito a partir de vírus inativados, não revela capacidade de cross- protetor contra HlNl (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) infecção por vírus.

[00144]As Figs. 16A-16C mostram uma inibição da WSN (HlNl) 1933 por anti-soros gerados usando mono-glicosilada Hl (Brisbane) como antígeno HA. 16A mostra a inibição da capacidade do (HlNl) WSN 1933 vírus para aglutinar as células vermelhas do sangue. 16B mostra a inibição da capacidade do (HlNl) WSN 1933 vírus para infectar as células MDCK. Figura 16C mostra proteção de camundongos BALB / c contra a infecção pelo vírus da gripe WSN (HlNl) 1933. Anti-soros utilizados que camundongos imunizados com a proteína HA Brisbane (5μg) e do vírus usado para desafiar o que WSN (HlNl) 1933 (10Ox LD50).

[00145]Como mostrado na Figura 16a, anti-soros de vacinação com mono- glicosilada HA (HAmg) de Hl (Brisbane) demonstraram melhor capacidade de inibir a capacidade da WSN (HlNl) 1933 vírus de aglutinar células vermelhas do sangue do que HA totalmente glicosilada (HAfg) e unglycosylated HA (Haug). Conforme mos-trado na Figura 16B, mono-glicosilada HA (HAmg) de Hl (Brisbane) demonstraram melhor capacidade de neutralizar a capacidade WSN (HlNl) 1933 vírus para infectar as células MDCK de HA totalmente glicosilada (HAf6) e HA unglycosylated (HA116). Conforme mostrado na Figura 16C, mono-glicosilada HA (Brisbane) como uma vacina protege camundongos BALB / c de WSN desafio vírus (HlNl) 1933. Em contraste, HA totalmente glicosilada, que está presente em vacinas contra a gripe tradicional, feito a partir de vírus inativados, não revela a capacidade de proteção cruzada contra infecção por vírus WSN (HlNl) 1933.

[00146]As Figs. 17A-17C mostram uma inibição de A Puerto / Rico/8/34 (HlNl): PR8 gerados pela utilização de anti-soros mono-glicosilada Hl (Brisbane) como antígeno HA. 17A mostra a inibição da capacidade de o vírus PR8 a aglutinar as células vermelhas do sangue. FIG 17B mostra a inibição da capacidade de o vírus PR8 para infectar as células MDCK. Figura 17C mostra proteção de camundongos BALB / c contra a infecção pelo vírus PR8. Anti-soros utilizados que camundongos imunizados com a proteína HA Brisbane (5μg) e do vírus usado para desafiar o que PR8 (10Ox LD50).

[00147]Como mostrado na Figura 17 A, anti-soros de vacinação com mono- glicosilada HA (HAmg) de Hl (Brisbane) demonstraram melhor capacidade de inibir a capacidade do vírus PR8 'para aglutinar células vermelhas do sangue do que HA totalmente glicosilada (HAf6) e unglycosylated HA (HA116). Conforme mostrado na Figura 17B, mono-glicosilada HA (HAmg) de Hl (Brisbane) demonstraram melhor capacidade de neutralizar a capacidade PR8 vírus para infectar as células MDCK de HA totalmente glicosilada (HAf6) e HA unglicosilatado (HA116). Conforme mostrado na Figura 17C, mono-glicosilada HA (Brisbane) como uma vacina protege camun- dongos BALB / c de PR8virus desafio. Em contraste, HA totalmente glicosilada, que está presente em vacinas contra a gripe tradicional, feito a partir de vírus inativados, não revela a capacidade de proteção cruzada contra infecção por vírus PR8.

(B) Vacinação com a nova proteina mono-glicosilatada H1 (cepa de vacina Pande- monica 2009 A(H1N1).

[00148]O Hl influenza (A cepa da vacina pandémica 2009 (HlNl)) HA sequência de codificação foi isolado e modificado para a expressão Conforme descrito no Exemplo 1 A Tabela 3 mostra a sequência da Pandemic modificada 2009 A cepa vacinal (HlNl) HI / HA del-TM-FH6 onde a sequência peptídeo sinal é sublinhado e em negrito, local de clivagem da trombina é em itálico, o bacteriófago T4 fibritin sequência trimerização foldons ea Sua tag é sublinhado, e na sequência ligante está em negrito e sublinhado.Tabela 3 - Sequência de hemaglutinina da influenza Hl (pandemia 2009 A(HlNl) da vacina)

[00149]Um ensaio de inibição da hemaglutinação foi usado para detectar se anti-soros de Hl (A pandemia de 2009 (HlNl) cepa vacinal) a vacinação pode inibir a capacidade WSN vírus (HlNl) para aglutinar as células vermelhas do sangue. Conforme mostrado na Figura 18 A, anti-soros de vacinação com mono-glicosilada HA (HAmg) de Hl (Pandemic 2009 A cepa vacinal (HlNl)) demonstraram melhor capacidade de inibir a capacidade da WSN vírus (HlNl) para aglutinar células vermelhas do sangue do que totalmente glicosilada HA (HAfg) e unglycosylated HA (Haug).

[00150]Um ensaio microneutralização foi usado para detectar se anti-soros de Hl (A pandemia de 2009 (HlNl) cepa vacinal) a vacinação pode neutralizar a capacidade WSN vírus (HlNl) para infectar as células MDCK. Conforme mostrado na Figura 18B, mono-glicosilada HA (HAmg) de Hl (Pandemic 2009 A cepa vacinal (HlNl)) demonstraram melhor capacidade de neutralizar a capacidade WSN vírus (HlNl) para infectar as células MDCK de HA totalmente glicosilada (HAfg) e HA unglycosylated (Haug).

[00151]Um experimento desafio de vírus é utilizado para demonstrar a vacinação com mono-glicosilada HA de Hl (A pandemia de 2009 (HlNl) cepa vacinal) pode proteger da WSN (HlNl) 1933 ou A Puerto / Rico/8/34 (HlNl): PR8 desafio vírus. Mono-glicosilada HA (2009 Pandemic A cepa vacinal (HlNl)) como uma vacina protege camundongos BALB / c de WSN (HlNl) ou PR8 desafio vírus. Em contraste, HA totalmente glicosilada, que está presente em vacinas contra a gripe tradicional, feito a partir de vírus inativados, não revela capacidade de cross-protetor contra a WSN (HlNl) ou PR8 infecção por vírus.

[00152]HA parcialmente glicosilada (por exemplo, mono-glicosilada) de outras cepas de vírus da gripe também pode ser usada para formular vacinas potentes ativos na prevenção ou redução de infecções por uma ou mais cepas ou subtipos de vírus influenza. A sequência de codificação HA influenza pode ser isolada a partir de qualquer número e modificada para a expressão conforme descrita no Exemplo 1. A HA é então clonada e expressa em sistema de expressão eucariótico e depois para submetida à deglicosilação para reter 1 a 3 glicosilações (preferivelmente mono- glicosilada) em um local de glicosilação.

[00153]A Tabela 4 mostra a sequência consenso do Hl modificada Um del- TM-FH6 onde a sequência peptídeo sinal é sublinhado e em negrito, local de clivagem da trombina é em itálico, o bacteriófago T4 fibritin sequência trimerização fol- dons ea sua tag-é sublinhado, e na sequência linker está em negrito e sublinhado.Tabela 4 - Sequência de hemaglutinina del-TM-FH6 consenso Hl A

[00154]Tabela 5 mostra a sequência consenso do Hl-C modificado del-TM-FH6 onde a sequência peptídeo sinal é sublinhado e em negrito, local de clivagem da trombina é em itálico, o bacteriófago T4 fibritin sequência trimerização foldon e-His tag é sublinhado, e na sequência linker está em negrito e sublinhado.Tabela 5 - Sequência de hemaglutinina de consenso Hl-C del-TM-FH6

[00155]Vacinas geradas a partir de peptídeos HA deglicosilatada da presente divulgação exibem exibem atividade antiviral contra vírus respiratório, incluindo vírus sincicial respiratório (RSV) e vários tipos de influenza, tais como influenza A e influenza B. Vantajosamente, os peptídeos antivirais da presente divulgação exibem atividade antiviral contra as cepas de gripe numerosos, incluindo sazonal, aviária (por exemplo, cepas H5N1), e gripe suína. Doenças resultantes de infecções por estes vírus também podem ser prevenidas ou tratadas de acordo com alguns dos métodos divulgados.

(C) Locais de glicosilação na proteina Hl/HA

[00156]As moleculas da gripe Hl HA tem quatro sítios antigênicos distintos: Sa, Sb, Ca e Cb (Luoh SM, et al (1992) J Virol 66:. 1066-1073). Estes locais consistem na maioria dos ácidos variável amino na molécula de HA do vírus sazonal humana HlNl que têm sido submetidos a mediada por anticorpos pressão imune desde o seu surgimento em 1918.

[00157]Usando ensaios de inibição da hemaglutinação (HI) e estudos de va- cinação/desafio, foi demonstrado que o vírus pandêmico 2009 HlNl é antigenicamen- te similar ao vírus humano HlNl que circulou de 1918-1943 e suína clássica vírus HlNl. Anticorpos contra 1918-like ou suína clássica vacinas HlNl foram encontrados para proteger completamente C57B / 6 ratos um desafio letal com o vírus da gripe A/Netherlands/602/2009 isolar. Imunização passiva com reação cruzada de anticorpos monoclonais (mAbs) levantaram contra proteínas ou 1918 ou A/CALIFORNIA/04/2009 HA foram encontrados para oferecer proteção total contra a morte. Análise de mutantes de anticorpos mAb escape, gerada pela seleção de 2009 com esses vírus HlNl mAbs, indicam que o local antigénico Sa é uma das conservada cross-protetora epitopos. (Manicassamy B., et al. PLoS Pathogens janeiro 2010 Volume I 6 I Edição 1 eu el000745).

[00158]De modelagem de homologia da estrutura HA, foi demonstrado que de 2009 HlNl e 1918 partes vírus pandêmico um número significativo de resíduos de aminoácidos nos locais antigênicos conhecidos, sugerindo a existência de epítopos comuns de anticorpos neutralizantes de reação cruzada para ambos tem. (Igarashi M. et al. PLoS ONE Janeiro de 2010, Volume 5, Issue 1, e8553). Um local de glicosi- lação potencial existe no resíduo Asnl77 em HA, que está dentro da região Sa anti- genicamente conservada. (Veja a fig. 19). Proteínas carregando uma mutação no sítio de glicosilação Asnl77 dentro da HA de Brisbane Hl são usados para imunizar camundongos. Proteção cruzada contra NIBRG-121 é medido.

[00159]Soros de vacinação com mono-glicosilada HA (HAmg) carregando uma mutação na Asnl77 de Hl (Brisbane) demonstra uma melhor capacidade de inibir a capacidade do vírus NIBRG-121 'para aglutinar células vermelhas do sangue do que HA totalmente glicosilada (HAfg) carregando uma mutação em Asnl77 e unglycosylated HA (Haug) carregando uma mutação na Asnl77. Mono-glicosilada HA (HAmg) carregando uma mutação na Asnl77 de Hl (Brisbane) demonstra uma melhor capacidade de neutralizar a capacidade NIBRG-121 vírus para infectar as células MDCK de HA totalmente glicosilada (HAfg) carregando uma mutação na Asnl77 e HA unglycosylated (Haug) carregando uma mutação na Asnl77. Mono-glicosilada HA (Brisbane) como uma vacina protege camundongos BALB / c de NIBRG-121 desafio vírus. Em contraste, HA totalmente glicosilada carregando uma mutação na Asnl77 revela pouca ou nenhuma capacidade de proteção cuzada NIBRG-121 contra infecção por vírus.

[00160]Como usado aqui, "atividade terapêutica" ou "atividade" pode se referir a uma atividade cujo efeito é consistente com um resultado desejável terapêutica em humanos, ou efeitos desejados em mamíferos não humanos ou outras espécies ou organismos. Atividade terapêutica pode ser medido in vivo ou in vitro. Por exemplo, um efeito desejável pode ser testado em cultura de células.

[00161]A "atividade antiviral" de uma vacina de acordo com a divulgação presentes denota a capacidade da vacina para gerar uma resposta imune em um sujeito a quem a vacina é administrada em que a resposta imunológica é suficiente para prevenir ou tratar ou melhorar viral completo soprado infecção e / ou sintomas associados à infecção por um vírus, tal como um vírus da gripe. Vantajosamente, vacinas geradas a partir dos peptídeos HA deglicosilatada da divulgação instantânea pode demonstrar a atividade antiviral significativa contra o vírus influenza. Como usado aqui, "uma actividade significativa antiviral" pode ser medida pela capacidade da vacina para inibir a hemaglutinação viral por pelo menos cerca de 50%, em comparação a zombar amostras tratadas do vírus. Em certas modalidades, o peptídeo antiviral inibe hemaglutinação viral por pelo menos cerca de 60%, mais preferivel-mente pelo menos cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% e mais de preferência pelo menos cerca de 95%, em comparação a zombar amostras tratadas do vírus.

[00162]Métodos para demonstrar o efeito inibitório de composições antivirais na replicação viral são bem conhecidas na arte. A eficácia terapêutica das vacinas da presente invenção como agentes antivirais pode ser demonstrado em animais de laboratório, por exemplo, usando um modelo murino. (Ver, por exemplo, Jones, et al., J. Virol, 2006, vol. 80, No. 24, pp 11960-11967). Além disso, o efeito terapêutico dos peptídeos farmacologicamente ativos da presente invenção pode ser demonstrado em humanos através de técnicas conhecidas na arte.

[00163]Os anticorpos neutralizantes da presente invenção pode ser ainda utilizado como uma ferramenta para o mapeamento de epítopos de determinantes antigênicos do vírus influenza A, e são úteis no desenvolvimento de vacinas. De fato, como mostrado nos exemplos abaixo, os inventores aqui identificaram vários largamente reactivo anticorpos neutralizantes que podem ser usados como guias para a concepção de uma vacina.

[00164]Assim, os anticorpos neutralizantes da presente invenção pode ser usada para selecionar peptídeos ou polipeptídeos, que funcionalmente imitar os epí- topos de neutralização para o qual o bind anticorpos, que, por sua vez, pode ser desenvolvida em vacinas contra a influenza A infecção pelo vírus. Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma vacina eficaz contra um vírus influenza A compreendendo um. Peptídeo ou polipeptídeo que imita um epítopo de neutralização funcionalmente ligados por um anticorpo aqui descritos Em uma modalidade, a vacina compreende um peptídeo ou polipeptídeo funcionalmente imitando epítopo uma neutralização vinculado por um anticorpo que se liga a um antígeno de hemaglutini- na (HA).

[00165]Em outra modalidade, a vacina pode ser sintética. Em outras modalidades, a vacina pode incluir (i) um vírus atenuado de influenza A, ou parte dele, ou (ii) um vírus morto de influenza A, ou parte dele. Em uma modalidade outras, a vacina compreende um peptídeo ou polipeptídeo funcionalmente imitando um epítopo de neutralização vinculado por um anticorpo que se liga a um antígeno de hemaglutini- na (HA). O antígeno HA pode ser um subtipo H5 ou um subtipo Hl. Em algumas modalidades, o antígeno HA é exibido na superfície do vírus influenza A.

Vacina Contra virus da Gripe

[00166]As sequências do local de N-glicosilação de influenza H5 HA são altamente conservadas. A HA H5 tem 15 locais de N-glicosilação total com a sequência de protótipo N-X-(S/T). Cada monômero tem 5 locais de N-glicosilação em posições N27, N39, N170, N181 e N500. Ligação ao receptor do hospedeiro é afetada por glicanos na estrutura HA. HA H5 tem locais de glicosilação em posições 39, 127, 170, 181 e 500.

[00167]As vacinas da invenção podem ser geradas usando versões parcialmente glicosiladas de qualquer proteína de superfície do vírus da gripe, incluindo HA, NA e M2. O vírus influenza A neuraminidase (NA) proteínas são exibidos em sua superfície. A influenza A proteína do vírus M2 é uma proteína integral de membrana de 97 aminoácidos que se expressa na superfície das células infectadas com um domínio N-terminal extracelular de 18 a 23 resíduos de aminoácidos, um domínio hidrofóbico interno de cerca de 19 resíduos, e uma C-terminal citoplasmática de domínio de 54 resíduos. (Zebedeu SL, et al J. Virol agosto 1988; 62 (8) :2762-2772).

[00168]Além disso, as proteínas influenza parcialmente glicosiladas podem ser geradas por alterar o padrão de glicosilação em N-ou O-glicosilação locais da proteína utilizada como antígeno.

[00169]Em uma outra modalidade, os peptídeos ou polipeptídeos da vacina contêm determinantes antigênicos que levantam influenza A anticorpos contra o vírus neutralização.

[00170]Em um aspecto mais geral, as moléculas de neutralização, incluindo mas não limitado a anticorpos, são úteis para tratar ou prevenir infecções virais. Assim, as moléculas de neutralização da presente invenção são úteis na imunoterapia, tais como a imunização passiva usando um ou mais tais moléculas, bem como no desenvolvimento de vacinas dirigidas para o alvo antigênico viral (s).

[00171]O presente fornece composições de vacina para a prevenção e tratamento de infecções causadas pelo vírus da gripe aviária neutralizado. Embora tenha sido conhecido por mais de 80 anos que a administração passiva de soros imunes pode prevenir a infecção Lucas, TC et al. Kilbane EM, Jackson JL, SL & Hoffman (2006) Ann Intern Med. 145, 599-609), estudos mais recentes com anticorpos monoclonais também oferecer incentivo (Hanson, BJ et al (2006) Respir Res 7, 126; Huang, CC et al (2004) Proc Nat Acad Sci 101, 2706-2711;..; Simmons C. P. et al. (2007) PLoS Med 4, el78). Por exemplo, Hanson et al. mostrou que um anticorpo monoclonal para o vírus H5N1 foi protetora contra infecção letal, mesmo quando administrado três dias após a inoculação em camundongos (Hanson, BJ et al (2006). Respir Res 7, 126).

[00172]Dada a possibilidade de uma epidemia catastrófica, tem sido sugerido que os governos devem manter as unidades populacionais de anticorpos neutra- lizantes, como os aqui relatados. Os fatos que os anticorpos são totalmente humanos e têm sido isoladas de indivíduos que combater com êxito a infecção viral pode oferecer vantagens. No entanto, mesmo se tais anticorpos são armazenadas, se o gene que codifica o epítopo a que o anticorpo liga-se a mutação foram, em seguida, o anticorpo pode ser menos eficaz. Além disso, há algumas evidências de que a imunidade celular aumenta a clarifcação do vírus.Vacinas Contra virus Sincitial Respiratorio (RSV)

[00173]Human vírus respiratório sincicial (VRS) é um vírus que causa infecções do trato respiratório. É a principal causa de infecção do trato respiratório inferior e visitas ao hospital durante a infância. VSR é um vírus RNA envolta da família Pa- ramyxoviridae e do Pneumovírus gênero. Não há vacina.

[00174]O virion RSV é composto por três glicoproteínas de superfície, três glicoproteínas de superfície, F, G e SH (hidrofóbicas pequenas). F proteínas na superfície do vírus causa as membranas celulares das células vizinhas a se fundir, formando sincícios. F (fusão) e G (anexo) glicoproteínas são necessários para a entrada do vírus nas células e também determinar a resposta de anticorpos. A estrutura e composição da RSV foi elucidada e é descrito em detalhes no livro "Fields Virology", ed. Knipe, DM et al. Lippincott Williams & Wilkins, NY (2001), em particular, capítulo 45, pp 1443 -1485, "Vírus Respiratório Sincicial" por Collins, P., Chanock, RM e Murphy, B. R.

[00175]RSV proteína G, que é de 33 kDa unglycosylated, corre a cerca de 90 kDa quando totalmente glicosilada (ambos N-e O-ligados glicosilaçãos). F e proteínas G existe como um complexo de proteínas na superfície das células infectadas pelo VSR. (KW Low et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 366 (2) 2008, 308-313).

[00176]Tabela 6 indica a sequência da glicoproteína G RSV com potencial glicosilação N-sites sublinhado.Table 6. RSV glycoprotein G polypeptide sequence.

[00177]Glicoproteínas parcialmente deglicosilatadas RSV F e G podem ser útil como vacinas mais eficazes RSV.Vacinas Flavirus

[00178]Flavivirus é um gênero da família Flaviviridae. Flavivírus são pequenos, vírus envelopados RNA que utilizam artrópodes como mosquitos para a transmissão para os hospedeiros vertebrados, e incluem vírus da febre amarela (YFV), vírus do Nilo Ocidental (WNV), Tick-borne vírus da encefalite, vírus da encefalite japonesa (JE) e Dengue vírus 2 vírus (Weaver SC, AD Nat Barrett. Rev. Microbiol. 2 789-801 2004). Flavivírus consistem em três proteínas estruturais: o núcleo da proteína C nucleocapsídeo eo envelope glicoproteínas M e E. E glicoproteína é uma proteína de fusão de classe II viral que medeia a fusão ambos vinculativos e receptor. Classe II proteínas de fusão viral são encontrados em flavivírus e alfavírus.

[00179] Glicoproteína E é composta por três domínios: domínio I (domínio dimerização) é um 8 - barril beta preso, domínio II (central de domínio) é um domínio alongada composta de doze cordas beta e duas hélices alfa eo domínio III (imuno- globulina -como de domínio) é um módulo de IgG-like com dez fitas beta. Domínios I e II estão interligados.

[00180] Os 495 AA dímeros glicoproteína E na superfície viral re-cluster de forma irreversível a fusão-competente trímeros após a exposição a pH baixo, como se encontra no ambiente ácido do endossomo. A formação de trímeros resultados em uma mudança conformacional que resulta na exposição de um ciclo peptídeo de fusão na ponta do domínio II, que é exigido na etapa de fusão para conduzir as membranas celulares e virais em conjunto pela inserção na membrana (Modis Y et al., Proc. Natl. Acad. LSg EUA 100 6986-91 2003).

[00181]Proteína do envelope do vírus da dengue (E) contém dois principais sites de N-glicosilação ligados, em Asn-67 e Asn-153. O site glicosilação na posição 153 é conservada na maioria dos flavivírus, enquanto o site na posição 67 é pensado para ser exclusivo para os vírus dengue. N-linked cadeias laterais de oligossaca- rídeos de proteínas E flavivírus foram associados com morfogênese viral, infectivi- dade e tropismo. Vírus da dengue sem N-glicosilação na posição infecção mostram 67 reduzido de células humanas. (Mondotte JA, et al. /. Virol. 81 (3) :7136-7148 (2007).

[00182]A Tabela 7 indica a sequência da glicoproteina do virus da Dengue E com potenciais locais de Ni-glicosilação em N-67 e N- 153 sublinhadosTabela 7. Sequência de Polipetideo E da glicoroteina do vírus da Dengue

[00183]Assim, deglicosilação parcial do vírus da dengue glicoproteína E pode ser usado para gerar vacinas mais eficazes e abrangentes contra flavivírus. O resultado da deglicosilação parcial do tipo 3 do vírus dengue dímeros da proteína E é mostrado no modelo descrito na Figura 2 IA-B. Figura 21 B mostra proteína E da dengue monoglicosilatada.

[00184]Vírus da hepatite C (HCV) é o principal agente etiológico da infecção pós-transfusional humano e adquirida na comunidade não-A, a hepatite não-B, provavelmente infectar 1% da população mundial. HCV é um membro da família Flavi- viridae, que inclui o flavivírus e os pestivírus (Miller & RH RH Purcell, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA 87, 2057-2061, 1990).

[00185]O vírus da hepatite C genoma (HCV) codifica duas glicoproteínas de membrana-associados envelope (El e E2), que interagem para formar um complexo heterodimérica noncovalent. Glicoproteínas HCV, El e E2, são fortemente modificadas por N-glicosilação ligados. A proteína El consiste de 192 aminoácidos e contém 5-6 N-glicosilação sites, dependendo do genótipo do HCV. A proteína E2 é composto por 363-370 aminoácidos e contém 9-11 N-glicosilação sites, dependendo do ge- nótipo do HCV. (Maertens G. e L. Os genótipos Stuyver ea variação genética do vírus da hepatite C em: A medicina molecular das hepatites virais Ed: Harrison TJ e Zuckerman AJ 1997).

[00186]Um estudo recente revelou que após a deglicosilação parcial com endoglycosidase H apenas quatro dos cinco sítios de glicosilação potencial nas posições de aminoácidos 196, 209, 234, 305 e 325, respectivamente, do HCV glicopro- teína El são utilizados. Mutações nas posições N2 (196) e N3 (234) têm efeitos ape- nas pequenas no conjunto do complexo E1E2, enquanto que uma mutação na posição Nl (196) e, predominantemente, na posição N4 (305) reduz drasticamente a eficiência da formação de noncovalent E1E2 complexos. (Meunier JC. Et ah, J. Gen. Virol. (1999), 80, 887-896.)

[00187]A Tabela 8 indica a sequência do vírus da Hepatite C isolar HC-J6 envelope glicoproteína El (Okamoto, H., et al., J. Gen. Virol. 72 (11), 2697-2704 (1991)) com potenciais locais N-glicosilação nas posições 196, 209, 234, 305 e 325 sublinhados.Tabela 8. Seqauencia de polipeptideo E1 do envelope de glicoproteina do virus da Hepatite C

[00188]Assim, deglicosilação parcial de glicoproteínas HCV El e E2 pode ser usada para gerar vacinas mais eficazes e amplas contra o HCV.

Vacinas do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

[00189]Os vírus da imunodeficiência humana HIV-1 e HIV-2 e os vírus da imunodeficiência símia relacionados (SIV) causam a destruição dos linfócitos CD4 + em seus respectivos hosts, resultando no desenvolvimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). A entrada do HIV nas células hospedeiras é mediada pelas glicoproteínas do envelope viral, que são organizadas em oligomérica, picos provavelmente trimérico exibido na superfície do vírion. Estes complexos envelope estão ancorados na membrana viral pela glicoproteína do envelope gp41 transmem- brana. A superfície da espiga é composta principalmente da glicoproteína do envelope exterior, gpl20, associadas por interações não covalentes com cada subunidade do complexo da glicoproteína gp41 trimérico.

[00190]A adição de asparagina (N)-ligada cadeias de polissacarídeos (ie, glicanos) ao gpl20 e gp41 glicoproteínas do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-I) do envelope não só é necessária para o dobramento de proteínas correta, mas também pode fornecer proteção contra anticorpos neutralizantes como um "escudo glicano." (X Wei et al, Nature 422: 307-312, 2003). A glicoproteína de superfície (gpl20) do tipo de vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-I) envelope, o que representa a principal interface entre o vírus e o ambiente de acolhimento, é uma das proteínas mais fortemente glicosiladas conhecidas até hoje, com quase metade de seu peso molecular, devido à adição de N-glicanos ligados. (Allan JS, et al Ciência 228: 1091-1094, 1985). A glicoproteína transmembrana (gp41) do envelope HIV-I também é glicosilada, mas em menor grau. A adição de N-glicanos ligados é essencial para o HIV-I gpl20 a dobrar para a conformação adequada para se ligar ao receptor CD4, e influencia a ligação do co-receptores CXCR4 alternativa e CCR5, os efeitos combinados mediando a fusão e entrada do HIV-I na célula hospedeira.

[00191]Como muitos N-glicanos ligados são componentes altamente conservados do envelope HIV-I, podem-se fornecer um alvo promissor para anticorpos neutralizantes. A neutralização de anticorpos humanos monoclonais 2GL 2 liga-se a um epítopo compreendendo N-glicanos ligados que estão ligados à glicoproteína gpl20. (Trloka A et al, J Virol 70: 1100-1108, 1996). Cepas de HIV-I em que os sites ligados N-glicosilação foram excluídas ou modificadas experimentalmente pode tornar-se mais sensível à neutralização (Koch et al, 2003 Virology 313: 387-400).

[00192]O gpl20 maduro contém 24 sítios potenciais para N-glicosilação, como reconhecido pelo Asn-Xaa-Ser/Thr sequência. (Kornfeld e Kornfeld, Ann Rev. Biochem 54: 631-664, 1985). Tabela 9 indica os 24 locais na sequência HXB2 HIV-I. Potencial glicosilação N-sites estão sublinhados.Tabela 9. Sequência de polipeptideo HIV gpl20

[00193]Na glicoproteína gp41 HIV-I transmembrana, os sítios de glicosilação conservados estão em Asn621, Asn630 e Asn642.

[00194]Assim, deglicosilação parcial da proteína do invólucro do HIV gpl20, ou gp41 proteína transmembrana pode ser usado para gerar vacinas mais eficazes e abrangentes contra flavivírus. O resultado da deglicosilação parcial do gpl20 HIV trímeros proteína é mostrado no modelo descrito nas Figuras 20A-B. Figura 2OB mostra monoglicosilatada HIV gpl20 trímeros proteína.Metodos para Fabricação de Glicoproteínas de Superficie Celula parcialmente glico- silatada

[00195]Polinucleotídeos da presente invenção, ou fragmentos ou variantes dos mesmos, são facilmente preparados, por exemplo, diretamente sintetizar o fragmento por meios químicos, como é comumente praticada através de um sintetiza- dor de oligonucleotídeos automatizado. Além disso, os fragmentos são obtidos pela aplicação da tecnologia de reprodução de ácido nucléico, como a PCR ™ tecnologia de patentes dos EUA 4.683.202, através da introdução de sequências selecionadas em vetores recombinantes para a produção recombinante, e por outras técnicas de DNA recombinante, geralmente conhecido por aqueles de habilidade na arte da biologia molecular.

[00196]A invenção fornece vetores e células hospedeiras compreendendo um ácido nucléico da presente invenção, bem como técnicas recombinantes para a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Vetores da invenção incluem aqueles capazes de replicação em qualquer tipo de célula ou organismo, incluindo, por exemplo, plasmídeos, fago, cosmídeos, e cromossomos mini. Em modalidades diversas, vetores compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção são vetores adequados para reprodução ou replicação do polinucleotídeo, ou vetores adequados para expressar um polipeptídeo da presente invenção. Vetores como são conhecidos na arte e disponíveis comercialmente.

[00197]Polinucleotídeos da presente invenção podem ser sintetizados, inteiros ou em partes que são então combinados, e inserido em um vetor usando rotina técnicas de biologia molecular e celular, incluindo, por exemplo, o polinucleotídeo subclonagem em um vetor linearizado usando sites de restrição apropriada e restrição enzimas. Polinucleotídeos da presente invenção são amplificados pela reação em cadeia da polimerase utilizando primers complementares a cada vertente do po- linucleotídeo. Estes primers também incluem sítios de restrição da enzima de clivagem para facilitar a subclonagem em um vetor. Os componentes do vetor replicáveis em geral incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinais, uma origem de replicação, e um ou mais genes ou marcador se- lecionável.

[00198]A fim de expressar um polipeptídeo da presente invenção, as sequências de nucleotídeo que codificam o polipeptídio equivalentes, ou funcional, são inseridas em um vetor de expressão adequado, ou seja, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução do código introduzido sequência. Métodos conhecidos para aqueles hábeis na arte são usadas para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação de um polipeptídeo de interesse e apropriado elementos de controle transcricional e translacional. Estes métodos incluem em técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e na re- combinação genética vivo. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook, J., et al. (1989) Clonagem Molecular, um manual de laboratório, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, e Ausubel, FM et al. (1989) Os protocolos atuais em Biologia Molecular, John Wiley & Sons, New York. N. Y.

[00199]Uma variedade de sistemas hospedeiro/vetor expressão são utilizadas para conter e expressar sequências de polinucleotídeo. Estes incluem, mas não estão limitados a, os microorganismos, como bactérias transformadas com bacterió- fago recombinante, plasmídeos ou vetores de expressão cosmid DNA; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de inseto infectadas com o vírus vetores de expressão (por exemplo, baculovírus); sistemas de célula de planta transformada com vetores de vírus de expressão (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, Ti ou plasmídeos pBR322), ou sistemas de célula animal.

[00200]Várias sequências promotoras são conhecidas por qualquer eucario- tos e são utilizados de acordo com a presente invenção. Praticamente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizado a cerca de 25-30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70-80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3 'da maioria dos genes eu- carióticos é uma sequência AATAAA que pode ser o sinal de adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucariótica.

[00201]Nos sistemas de células de mamíferos, os promotores de genes de mamíferos, ou de vírus de mamíferos são geralmente preferidos. Expressão de poli- peptídeos de vetores em células hospedeiras de mamíferos aer controlada, por exemplo, pelos promotores obtidos a partir do genoma de vírus como o polyoma vírus, vírus da bouba, adenovírus (por exemplo, Adenovirus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviária, citomegalovírus (CMV) , um retrovírus, o vírus da he- patite-B e vírus mais preferivelmente Simian 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobuli- na, e de choque térmico promotores, desde promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira . Se for necessário para gerar uma linhagem de células que contém várias cópias da sequência de codificação de um polipeptídeo, vetores com base em SV40 ou EBV pode ser vantajosamente usado com um marcador apropriado selecionáveis. Um exemplo de um vetor de expressão adequado é pcD- NA-3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que inclui um promotor CMV.

[00202]Um número de sistemas expressão baseados em viral estão disponíveis para a expressão de mamíferos de polipeptídeos. Por exemplo, nos casos em que um adenovírus é usado como um vetor de expressão, as sequências de codificação de um polipeptídeo de interesse podem ser ligadas em um adenovírus complexo de transcrição / tradução que consiste na sequência de promotor de tarde e líder tripartite. Inserção em uma região de El E3 ou não-essencial do genoma viral pode ser usado para obter um vírus viável que é capaz de expressar o polipeptídeo em células hospedeiras infectadas (Logan, J. e Shenk, T. Proc (1984). Natl. Acad. Sci. 81 :3655-3659). Além disso, potenciadores de transcrição, como o sarcoma de Rous vírus (RSV) enhancer, pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.

[00203]Em sistemas bacterianos, qualquer um de uma série de vetores de expressão são selecionados, dependendo do uso pretendido para o polipeptídeo expressa. Por exemplo, quando grandes quantidades são desejadas, os vetores que a expressão direta nível elevado de proteínas de fusão que são prontamente purificada são usados. Vetores incluem, mas não estão limitados a, a clonagem coli E. multifuncional e vetores de expressão, como BLUESCRIPT (Stratagene), no qual a sequência que codifica o polipeptídio de interesse pode ser ligado no vetor no quadro com sequências de amino-terminal Met ea subsequente 7 resíduos de β- galactosidase, para que uma proteína híbrida é produzida; vetores PIN (Van Heeke, G. e SM Schuster (1989) J. Biol Chem 264:5503-5509), E assim por diante. Vetores pGEX (Promega, Madison, WI) também são usadas para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção a contas glutationa-agarose seguido de eluição na presença de glutationa livre. Proteínas produzidas em tais sistemas são projetadas para incluir heparina, trombina, ou fator XA sítios de clivagem da protease para que o polipeptídeo clonado de interesse pode ser liberado a partir da metade GST à vontade.

[00204]Na levedura Saccharomyces cerevisiae, um número de vetores contendo promotores constitutiva ou induzida, como o fator alfa, oxidase, álcool e PGH são usados. Exemplos de outras sequências de promotor adequado para uso com hosts levedura incluem os promotores para 3 - quinase fosfoglicerato ou outras enzimas glicolíticas, como a desidrogenase enolase, gliceraldeído-3-fosfato, hexoqui- nase, descarboxilase do piruvato, fosfofrutoquinase, a glicose-6-fosfato isomerase, 3 -fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, isomerase triosefosfato, isomerase fosfogli- cose e glucoquinase. Para revisões, ver Ausubel et al. (supra) e Grant et al. (1987) Métodos Enzymol. 153:516-544. Promotores de levedura outros promotores induzí- veis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento incluem as regiões promotoras de álcool desidrogenase 2, isocytochrome C, fosfatase ácida, as enzimas de degradação associados com o metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, enzimas e responsável pela maltose e utilização galactose. Vetores adequados e promotores para uso na expressão de levedura são descritos nos EP 73657. Glicosilada expressão de proteínas de superfície da hepatite C em levedura é divulgado no WO 96/04385. Potenci- adores de levedura também são usados vantajosamente com os promotores de levedura.

[00205]Nos casos em que vetores de expressão de plantas são usados, a expressão de sequências de codificação de polipeptídeos são movidos por qualquer um de uma série de promotores. Por exemplo, os promotores virais, tais como os promotores 35S e 19S de CaMV são usados sozinhos ou em combinação com a sequência líder omega de TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311. Alternativamente, os promotores de plantas, como a subunidade menor da RUBISCO ou promotores de choque térmico são utilizados (Coruzzi, G. et al (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al (1984) Ciência 224:838-843; e Winter, J., et al. (1991) Resultados celular Probl. Differ. 77:85-105). Estas construções podem ser introduzidas nas células vegetais por transformação direta ou patógeno DNA mediada por transfecção. Tais técnicas são descritas em um número de modo geral opiniões disponível (ver, por exemplo, Hobbs, S. ou Murry, LE em McGraw Hill Anuário de Ciência e Tecnologia (1992) McGraw Hill, New York, NY, pp 191-196).

[00206]Um sistema de inseto também é usado para expressar um polipeptí- deo de interesse. Por exemplo, em um sistema desse tipo, Autographa californica vírus da poliedrose nuclear (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda e em larvas Trichoplusia. As sequências de codificação do polipeptídeo são clonados em uma região não-essencial do vírus, como o gene poliedrina, e colocado sob controle do promotor poliedrina. Inserção de sucesso da sequência polipeptídica codificação torna o gene poliedrina inativos e produzir vírus recombinantes faltando proteína capsidial. Os vírus recom- binantes são então utilizados para infectar, por exemplo, células de S. frugiperda Trichoplusia ou larvas, em que o polipeptídeo de interesse é expressa (Engelhard, EK et al (1994) Proc Natl Acad Sci 91:3224- 3227).

[00207]A deglicosilação parcial das glicoproteínas de superfície recombinan- te pode ser realizada com o uso controlado de combinações de glicosidases diversos, tais como o tratamento com neuraminidase para remover o ácido siálico, com alfa-1-manosidase (Sigma) para decompor os resíduos de manose externa, ou com endo FN glycanase ((Bioquímicos Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha), que de forma eficiente se unir ambos os glicanos N-linked de alta manose e complexo.

[00208]Os peptídeos HA da presente invenção também podem ser sintetizados por processos que incluem os métodos comumente utilizados na síntese de peptídeos como a solução clássica de acoplamento de resíduos de aminoácidos e / ou fragmentos de peptídeos, e, se desejar, técnicas de fase sólida. Qualquer método para a síntese de peptídeos conhecidos na arte pode ser usado, por exemplo, Schroeder e Lubke, em "O Peptídeos", vol. 1, Academic Press, New York, NY, pp 2128 (1965), "O Peptídeos: Biologia análise, síntese", (E. Gross et al, Eds..), Academic Press, New York, NY, vol. 08/01, (1979-1987); Stewart and Young, em "Síntese de Peptídeos em Fase Sólida", segundo Ed, Pierce Chem.. Co., Rockford, 111. (1984); selvagem et al, Proc.. Natl. Acad. Sci. EUA, 89: 10.537 (1992) e Rimsky et al, J Virol, 72: 986 (1998); Chan & White em "Síntese de Peptídeos em Fase Sólida Fmoc.:_Uma Abordagem Prática ", Oxford University Press, (2000). Em algumas modalidades, glicopeptídeos podem ser sintetizados usando aminoácidos glicosilados de modo que aminoácidos glicosilados, tais como GlcNAc-Asn (V-Labs, Covington, LA), são incorporados nos apropriados sítios de glicosilação do peptídeo.

[00209]Vacinas da presente divulgação podem ser empregadas como um agente antiviral através da administração do peptídeo topicamente, por via intranasal, ou através de administração parenteral, como através de sub-cutânea de injeção, injeção intramuscular, injeção intravenosa, intraperitoneal ou intra-dérmica por exemplo, injeção, para um animal de sangue quente, os seres humanos, cavalos, outros mamíferos, etc Os peptídeos antiviral podem ser usados individualmente ou em combinação.

[00210]Além disso, o peptídeo antiviral pode ser administrado sozinho ou como parte de uma composição que inclui ainda um ou mais transportadores farma- ceuticamente aceitáveis, a proporção de que é determinada pela natureza química e solubilidade do peptídeo, a via de administração e de administração padrão biológica. Uma vez que peptídeos inventivos podem ter como alvo as proteínas na superfície do vírus e/ou da célula, para garantir a eficácia, a transportadora em tais formulações devem ser livres ou substancialmente livres (por exemplo, melhor do que 90, 95, 98 ou 99% em peso) de proteínas que se ligam aos peptídeos.Composições Farmacêuticas

[00211]De acordo com outro aspecto, as vacinas e proteínas deglicosilatada da divulgação presentes podem ser incluídos em uma composição farmacêutica ou nutracêuticos ou formulação em conjunto com agentes ativos adicionais, transportadores, veículos, coadjuvantes, excipientes ou agentes auxiliares identificáveis por uma pessoa qualificada na arte após a leitura da divulgação presentes.

[00212]As vacinas da presente divulgação será vantajosamente compreendem um peptídeo adjuvante em uma quantidade adjuvante eficaz. Como será evidente para um técnico no assunto, a concentração ideal do peptídeo adjuvante ou peptídeos necessariamente depender do peptídeo específico (s) utilizado, as características do paciente, o imunógeno utilizado, bem como a natureza da infecção viral para que o tratamento ou profilaxia é pedido. Esses fatores podem ser determinados por aqueles de habilidade nas artes médicas e farmacêuticas tendo em vista a divulgação presentes. Em geral, os peptídeos adjuvantes são mais desejavelmente administrados a um nível de concentração que geralmente pagar atividade adjuvante sem causar efeitos colaterais prejudiciais ou nocivos. Geralmente, uma quantidade eficaz adjuvante é desejada. Uma quantidade adjuvante eficaz refere-se a um montante de um peptídeo adjuvante que é capaz de estimular uma resposta imunológica a um imunógeno administrada.

[00213]Adjuvantes adequados para inclusão nas composições da divulgação presentes incluem aqueles que são bem conhecidas na arte, como adjuvante de Freund completo (CFA) que não é usada em humanos, alum adjuvante de Freund incompleto de (IFA), esqualeno, esqualano, e óleos diversos, os quais são bem conhecidas na arte, e estão disponíveis comercialmente a partir de fontes diversas, tais como Novartis (por exemplo, MF59 adjuvante).

[00214]As composições farmacêuticas ou nutracêuticos, preferencialmente, compreendem pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Em tais composições farmacêuticas, a proteína da vacina ou deglicosilatada forma o "composto ativo", também referido como o "agente ativo". Como usado aqui a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de absorção de adiar, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Compostos ativos complementares também podem ser incorporados em composições. Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com a sua rota pretendida de administração. Exemplos de vias de administração parenteral incluem, por exemplo, por via intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmico (tópica), transmucosal e administração rectal. Soluções ou suspensões usadas para parenteral, intradérmica, subcutânea ou aplicação pode incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução fisiológica, óleos fixos, glicóis de polietileno, glicerina, propileno glicol, ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como benzílico ou parabenos metil; antioxidantes como o ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como o ácido Etlilenodia- minotetracético; buffers, como acetatos, citratos, fosfatos e ou agentes para o ajuste de tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como o ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser fechado em ampolas, seringas descartáveis, ou frascos de doses múltiplas de vidro ou de plástico.

[00215]Adequados portadores farmaceuticamente aceitável para as composições contendo os peptídeos são descritos nos textos padrão farmacêutica. Ver, por exemplo, "Pharmaceutical Sciences Remington", 18 ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia (1990). Específicos não limitando exemplos de portadores adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem água, soro fisiológico, dextrose, glice- rol, etanol, ou algo semelhante e suas combinações. Além disso, se desejar, a composição pode ainda conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como molhar ou agentes emulsificantes, agentes de pH tampão que melhoram a eficácia antiviral da composição.

[00216]Sujeito como aqui utilizado refere-se aos seres humanos e primatas não-humanos (por exemplo, de guerrilha, macaco, sagui), animais de gado (por exemplo, ovelhas, vaca, cavalo, burro, porco e), animais de companhia (por exemplo, o cão. Cat) , animais de teste de laboratório (por exemplo, mouse, coelho, rato, cobaia hamster.), em cativeiro animais silvestres (por exemplo, a raposa. veados), e quaisquer outros organismos que podem se beneficiar os agentes da revelação presente. Não há nenhuma limitação sobre o tipo de animal que poderia se beneficiar de agentes atualmente descrita. Um assunto, independentemente de se tratar de um organismo humano ou não humano pode ser referido como um paciente, indivíduo, animal, hospedeiro, ou recipiente.

[00217]Para a administração parenteral, os peptídeos da presente divulgação ou vacinas daí podem ser administrados por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou injeção intradérmica, sozinhos ou em composições compreendendo mais operadoras farmaceuticamente aceitos. Para administração por injeção, é preferível usar o peptídeo antiviral em uma solução em um veículo estéril aquosa, que também pode conter outros solutos tais como tampões ou preservativos, bem como quantidades suficientes de sais farmaceuticamente aceitáveis ou de glicose para fazer a solução isotônica. Os peptídeos antiviral da presente di- vulgação pode ser obtido na forma de sais terapeuticamente aceitáveis, que são bem conhecidas na arte.

[00218]Composições farmacêuticas adequadas para um uso injetável estéril incluem soluções aquosas (onde solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, os portadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany. NJ.) Ou tampão fosfato salino (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluído na medida em que existe siringabilidade fácil.

[00219]Deve ser estável sob as condições de fabrico e de armazenamento e ser preservado contra a ação de microorganismos contaminantes, como bactérias e fungos. O portador pode ser um meio solvente ou dispersão contendo, por exemplo, misturas de água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e glicol polyetheylene líquido, e afins), e adequada dos mesmos.

[00220]A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessária no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabens, clorobutanol, ácido ascórbico fenol, timerosal, e assim por diante. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônica, por exemplo, açúcares, poliálcoois como o cloreto de manitol, sorbitol, ou de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetável pode ser provocada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00221]Soluções estéril injetáveis podem ser preparadas pela incorporação a composição ativa na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básicas e os ingredientes necessários outros daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de estéreis soluções injetáveis, métodos de preparo incluem secagem a vácuo e liofilização, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente estéril filtrado dele.

[00222]As vacinas também podem ser administradas por via oral. Composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um portasdor comestível. Para efeitos de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, troches, ou cápsulas, por exemplo, cápsulas, gelatina. Composições orais também podem ser preparadas usando um portador de fluido para uso como um anti-séptico bucal. Agentes de ligação far- maceuticamente compatíveis, ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição.

[00223]Os comprimidos, pílulas, cápsulas, troches e similares podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de natureza semelhante: um ligante, como goma de celulose microcristalina, tragacanth ou gelatina; um excipien- te como o amido ou lactose, um agente de desintegração tal como o ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante como o estearato de magnésio ou Ste- rotes; um dióxido de silício, tais glidant ascolloidal, um adoçante como a sacarose ou sacarina, ou um agente aromatizante, tais como hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou aroma de laranja.

[00224]Porque a peptídeos e vacinas da divulgação presentes mostraram atividade contra vírus respiratórios, eles também podem ser entregues localmente para o sistema respiratório, por exemplo, para o nariz, seios cavidades membranas, seios e pulmões. O peptídeo (s), vacinas, ou composições farmacêuticas contendo um ou mais peptídeos ou vacinas, pode ser entregue ao sistema respiratório de qualquer maneira adequada, como por inalação através da boca ou por via intranasal. As presentes composições podem ser dispensadas como um aspersor nasal em pó ou líquido, suspensão, gotas nasais, um gel ou pomada, através de um tubo ou cateter, por seringa, por packtail, por chumaço, ou por infusão submucosa. Os pep- tídeos ou vacinas podem ser convenientemente entregues na forma de um aerossol pressurizado usando um pacote ou um nebulizador e um propulsor adequado, por exemplo, sem limitação, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dichlorotetraflu- oroethane ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dose pode ser controlada através de uma válvula de entregar um montante mensurado.

[00225]Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador pode ser formulada contendo uma mistura em pó do peptídeo e uma base em pó adequada como a lactose ou amido. Exemplos de formulações in- tranasais e métodos de administração podem ser encontrados em publicações PCT WO 01/41782, WO 00/33813, e Pat EUA. N ° s 6180603; 6313093 e 5624898. As patentes dos últimos citados EUA estão aqui incorporados por referência e para todos os efeitos. Um propulsor de uma formulação de aerossol pode incluir de ar comprimido, nitrogênio, dióxido de carbono, ou um hidrocarboneto com base de solvente de baixa ebulição.

[00226]Os peptídeos ou vacinas da divulgação presentes podem ser conve-nientemente entregues na forma de uma apresentação de spray de um nebulizador ou algo semelhante. Em alguns aspectos, os ingredientes ativos são devidamente micronizado de modo a permitir a inalação de substancialmente todos os ingredientes ativos para os pulmões com a administração da formulação de pó seco, portanto, os ingredientes ativos terão um tamanho de partícula de menos de 100 mícrons, desejavelmente menos de 20 microns, e de preferência no intervalo de 1 a 10 microns. Em uma modalidade, um ou mais dos peptídeos ou vacinas são embalados em um dispositivo que pode entregar uma quantidade predeterminada, e, geralmente, eficaz, do peptídeo por via inalatória, por exemplo, um aspersor nasal ou inalador.

[00227]A administração sistêmica também pode ser transmucosal ou trans- dérmica. Para a administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriadas para a barreira a ser permeado são usados na formulação. Penetrantes como são geralmente conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, para a administração transmucosa, detergentes, sais biliares, e derivados do ácido fusídico. Administração transmucosa pode ser realizada através do uso de aspersores nasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em pomadas, unguentos, géis ou cremes, geralmente conhecido no art. Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases supositório convencionais, tais como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para entrega retal.

[00228]De acordo com implementações, os compostos ativos estão preparados com as operadoras que irão proteger o composto contra a rápida eliminação do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulado. Biodegradáveis, polímeros biocompatíveis podem ser usadas, tais como acetato de etileno vinil, anidridos poli, ácido poliglicólico, colágeno, polyorthoesters e ácido polilático. Métodos para a preparação de tais formulações será evidente para aqueles hábeis na arte. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente da Alza Corporation e Farmacêutica Nova, Inc.

[00229]Suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos específicos de células) também podem ser utilizadas como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos para aqueles hábeis na arte, por exemplo, como descrito nos EUA Pat. No.4, 522,811, que é incor- porada por referência

[00230]É vantajoso para formular composições oral ou parenteral em forma de dose unitária para facilitar a administração ea uniformidade da dose. Dosagem unidade forma como aqui utilizado refere-se a unidades discretas fisicamente adequados como doses unitárias para o assunto a ser tratado, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com a transportadora requerida farmacêutica.

[00231]Será apreciado por aqueles hábeis na arte que aqui referência para o tratamento estende-se a profilaxia, bem como o tratamento de infecções estabelecidas ou sintomas. Os peptídeos e vacinas da divulgação presentes pode ser administrado terapeuticamente ou profilaticamente. O tratamento é preferencialmente iniciado antes ou no momento da infecção ou na hora do mamífero é exposto a um vírus que é capaz de causar uma infecção respiratória viral, e continuou até o vírus não está mais presente e ativa no trato respiratório. No entanto, o tratamento também pode ser iniciado após a infecção, após o mamífero foi exposto a um vírus que é capaz de causar uma infecção viral respiratória, ou após o aparecimento dos sintomas de infecção estabelecida.

[00232]Vai ser ainda mais apreciada que a quantidade de um peptídeo antiviral da presente divulgação que é útil no tratamento ou prevenção da gripe irá varia não só com o peptídeo específico selecionado, mas também com a via de administração, a natureza da condição sendo tratados, e da idade e condição do paciente, e acabará por ser a critério do médico assistente ou médico veterinário. Em geral, porém, uma dose adequada será na faixa de cerca de 0,01 a 750 mg / kg de peso corporal por dia, de preferência na faixa de 0,1 a 100 mg / kg / dia, de preferência na faixa de 0,5 a 25 mg / kg / dia.

[00233]O peptídeo ou vacina podem ser convenientemente administrados em forma de dosagem unidade, por exemplo, contendo de 10 a 1500 mg, conveni- entemente 2-10 mg, mais convenientemente 50-700 mg de ingrediente ativo por forma dose unitária, por exemplo, 1 mg / kg equivale a 75 mg/75 kg de peso corporal.

[00234]De preferência, a concentração de imunógeno para cada cepa do vírus influenza para a inclusão da vacina é um montante que induz uma resposta imune sem significativa, os efeitos secundários adversos. Tal valor irá variar dependendo de qual imunógeno é usado, o tipo e quantidade de peptídeo adjuvante incluídos na vacina. Normalmente, uma vacina será composta imunógeno em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 1000 mg por ml, mais preferencialmente de cerca de 3 a cerca de 300 mg por ml e mais preferivelmente cerca de 10 mg a cerca de 15 mg por ml, conforme medido por um SRD ensaio. Após uma vacinação inicial, assuntos que estão sendo vacinados podem receber imunizações de reforço de uma ou várias espaçadas adequadamente depois.

[00235]A toxicidade e eficácia terapêutica de tais composições podem ser determinadas por procedimentos padrão de farmacêuticos em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para a determinação da DL50 (a dose letal para 50% da população) eo ED50 (dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação entre dose de efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a proporção LD50/ED50. Compostos que apresentam alto índice terapêutico são os preferidos. Enquanto os compostos que apresentam efeitos colaterais tóxicos podem ser utilizados, cuidados devem ser tomados para projetar um sistema de entrega que torna alvo tais compostos para o sítio do local afetado para minimizar potenciais danos às células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais.

[00236]Os dados obtidos com os ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos reside de preferência dentro de uma faixa de circulação de concentrações que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método de divulgação, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de experimentos de cultura celular. A dose pode ser formulada em modelos animais para obter uma ampla concentração circulante de plasma que inclui o IC50 (ou seja, a concentração do composto de ensaio que atinge uma inibição meio máxima dos sintomas), conforme determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em seres humanos. Níveis no plasma pode ser medido, por exemplo, por cromatografia líquida.

[00237]Tal como definido aqui, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ativo (ou seja, uma dose eficaz) pode variar de cerca de 0,001-100 peso corporal g / kg, ou outros intervalos que seria aparente e compreendido por artesãos sem experimentação indevida. O artesão habilidoso irá perceber que alguns fatores podem influenciar a dosagem eo tempo necessário para efetivamente tratar um assunto, incluindo mas não limitado a gravidade da doença ou desordem, tratamentos anteriores, o estado geral de saúde ou idade do sujeito, e outras doenças presentes.

EXEMPLOS

[00238]Sem a intenção de limitar o escopo da invenção, instrumentos exemplares, aparelhos, métodos e seus resultados relacionados de acordo com as incorporações da presente invenção são apresentados abaixo. Note que títulos ou legendas pode ser utilizada nos exemplos para a conveniência de um leitor, que de forma alguma deve limitar o escopo da invenção. Além disso, algumas teorias são propostas e divulgadas aqui, no entanto, de nenhum modo que, se eles estão certos ou errados, devem limitar o escopo da invenção, enquanto a invenção é praticada de acordo com a invenção sem levar em conta qualquer teoria em particular ou esque- ma de ação.

Exemplo 1: construção para a expressão do gene HA

[00239]A sequência de Influenza H5N1 HA foi do consenso H5, CHA5 (MW Chen, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci EUA 105:13538-13543). Os códons de CHA5 foram otimizados para a expressão usando códons humanos. O sítio de clivagem da protease original viral PQRERRRKKRG foi mutado para PQRERG para evitar proteínas da clivagem enzimática para formar HA I e HA2. A região transmembrana (resíduos: 533-555) foi substituída com os resíduos adicionais(LVPRGSPGSGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH) no terminal C da construção de HA, onde o local de clivagem da trombina é em itálico, a sequência de trimerização da fibritina foldon do bacteriófago T4 sublinhada, e sua tag está em negrito (Stevens J. et al. (2006) Ciência 312:404-410). A sequência modificada de HA foi clonada no vetor PTT para a expressão da proteína (Durocher Y, et al (2002) Ácidos Nucleicos Res 30: E9).

Exemplo 2: expressão e purificação de proteínas.

[00240]O plasmídeo, que codifica o HA secretado foi transfectado em células embrionárias de rim humano de qualquer HEK293EBNA (número ATCC CRL-10852) ou as células-GnTI HEK293S (Reeves PJ, et al. (2002) Proc Natl Acad Sci EUA 99: 13.419-13.424) usando polietilenoimina e foi cultivado em meio de expressão Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 0,5 % de soro bovino. O so- brenadante foi coletado 72 h após a transfeção e limpo por centrifugação. Proteínas HA foram purificadas com quelação Nickel por cromatografia como descrito anteriormente (Wei CJ, et al. (2008) J Virol 82:6200-6208) para obter HAfg totalmente gli- cosilada e de alta manose tipo Hahm.

[00241]Para obter a proteína HA sem sialilação - a HAdS dessialisada - proteína purificada foi tratada com 20 mM Clostridium neuraminidase (NA; Sigma) por 2 horas a 37°C. Após o tratamento NA, a proteína foi purificada novamente para ser separada do NA. O Hahm purificado foi tratado com Endo H (NEB) durante 2 horas a 37°C para produzir proteína HA com uma única GIcNAc nos locais de glicosilação, o HAmg monoglicosilatado. Todas as proteínas purificadas HA foram analisadas com SDS PAGE, matriz glicana e espectrometria de massa (MS).

Exemplo 3: Lançamento do N-glicanos de glicoproteínas para análise MS.

[00242]As glicoproteínas HA purificadas foram reduzidas com ditiotreitol (DTT, Sigma) 10 mM a 37°C por 1 hora. A amostra reduzida foi então alquilada em iodoacetamida 50 mM (IAA, Merck) no escuro por 1 h e depois foi dessalinizada por dupla destilação (ddH2O) e seca em um vácuo de velocidade. Os extratos de proteína reduzida e alquilada HA foram primeiro digeridos com tripsina (Roche), em uma proporção aproximada de enzima para proteína em 1: 20 (w/w) em tampão de bicarbonato de amónio 5OmM pH 8,3 a 37°C durante 4 horas, seguido pela digestão secundária de tripsina (Roche), e depois carregados em fase reversa C 18 Sep-Pak cartucho (Waters Corp).

[00243]As amostras foram, além disso, incubadas com N-glicosidase F (Roche) em de bicarbonato de amônio 50 mM pH 8,3 a 37°C por 16 horas, e com mais duas incubações N-glicosidase F. N-glicanos liberados foram separados de peptí- deos / glicopeptídeos pelo procedimento de C 18 Sep-Pak com N-glicanos coletados em ácido acético 5% (AcOH), através da fração de escoamento. Os peptídeos foram eluídos em 20%, 40% e 60% de 1-propanol com AcOH 5%.

Exemplo 4: MALDI-MS e MS / MS análise.

[00244]Todas as amostras de glicano foram permetiladas usando o método de suspensão NaOH / dimetil sulfóxido. A pasta NaOH / DMSO foi misturada com amostras secas de glicano com tampa de rosca em tubo de vidro e 300 m de iodometano (Merck) foi adicionado ao tubo, e o tubo foi suavemente agitado por 25 min. A reação foi terminada pela adição de 1 ml ~ ddH20 gota a gota, em seguida, um volume igual de clorofórmio foi adicionado. Glicanos permetiltados foram extraídos para a camada orgânica e NaOH adicional, bem como outros contaminantes hidrofí- licos foram removidos por sucessivas extrações com ddH2O.

[00245]Clorofórmio foi evaporado por gás nitrogênio. Para a caracterização do glicano, glicanos permetilados em acetonitrila foram misturados 1: 1 com 10 mg/ml de ácido 2,5-diidroxibenzoic (DHB) em acetonitrila 50%, visto em placa-alvo aquecida, e recristalizado em placa com acetonitrila. Aquisição de dados foi realizada em ABI 4700Proteomics Analyzer (Applied Biosystems) operados no modo reflec- tron. Disparos de laser (5 Hz, 10 tiros por espectro) foram acumulados até que um sinal-ruído satisfatório foi conseguido quando combinado e suavizados. No instrumento TOF / TOF, de alta energia, dados CID MS / MS foram adquiridos manualmente e, normalmente, compostos por um total de 40 sub-espectros de 125 disparos de laser em uma configuração de energia do laser de 5000-5500.

Exemplo 5: Fabricação de Microarranjo de glicano.

[00246]Vinte e quatro glicanos contendo ácidos siálicos projetados para HAS foram preparados quimicamente e utilizados para a fabricação da matriz. Microarran- jos foram impressos (BioDot; Technologies cartesiano) pelo pino robótico (SMP3; TeleChem International) na deposição de ~0,7 nL de diferentes concentrações de aminas contendo glicanos em tampão de impressão (tampão fosfato 300 mM, pH 8,5, contendo 0,005% de Tween 20) a partir de uma placa de 384lâminas de vidro revestida NHS (Nexterion H diapositivo; SCHOTT América do Norte).

[00247]As lâminas para sialosides foram manchadas com soluções de glica- nos 1-17 e 21-27, com concentrações de 100 mM em cada linha de um glicano de baixo para cima, com 12 repetições horizontalmente colocadas em cada subarranjo, e cada lâmina foi projetada para 16 grades para futuros experimentos de incubação. Lâminas impressas foram autorizados a reagir em uma atmosfera de umidade de 80% por uma hora seguida de dessecação durante a noite, e elas foram armazenadas em temperatura ambiente em dessecador até o uso. Antes do ensaio de ligação, estas lâminas foram bloqueadas com etanolamina (50 mM etanolamina em tampão borato, pH 9,2) e depois lavadas com água e tampão PBS, pH 7,4, por duas vezes.

Exemplo 6: Etiquetando Hemaglutinina com Ester Cy3-NHS

[00248]Cada amostra de proteína HA foi diluída com PBS (pH = 7,4) para a concentração final de 1 mg/mL, em seguida, rotulados com Cy3Mono NHS Ester (5 mL, 0,2 mg/ml) (GE Healthcare, UK). Após as reações serem procedidas 18 h no gelo, 20 μL de 500 mM de glicina em PBS foi adicionado a cada tubo para extinguir as reações. Em seguida, as soluções foram incubadas em gelo por um adicional de 30 min. Moléculas não-reativas de corante foram removidas, passando cada solução através de um tamanho de exclusão de filtro spin (microcontrolador YM-30, Millipore, EUA) com um corte de peso molecular de 30 kDa. A fim de obter a relação de coran- te/proteína, cada amostra de proteína marcada foi diluída com PBS para as medições de absorbância a 280 nm dupla (para proteína) e em 552 nm (para Cy3, o coeficiente de extinção molar é de 150.000 M-1cm -1 neste comprimento de onda) usando Espectrofotômetro NanoDrop ND-IOO (NanoDrop Technologies, EUA). Depois de corrigir o cálculo de absorbância de CyDye a 280 nm (aproximadamente 8% da ab- sorbância a 552 nm), as razões de corante / proteína foram geradas partir dos resultados de medições de absorbância dupla.

Exemplo 7: Ensaio de vinculação indireta

[00249]Variantes de HA glicosilada foram preparadas em Tween 20/ tampão PBS a 0,005%, pH 7,4, e adicionada para cobrir a grade na matriz glicana com aplicação de uma lamela. Após incubação em câmara úmida com agitação por 1 h, as lâminas foram lavadas três vezes com Tween 20/Tampão PBS 0,005%, pH 7.4. Em seguida, o anticorpo anti-H5N1 HA do coelho foi adicionado as lâminas e incubados em câmara úmida por 1 h. Depois de lavar as lâminas com 0,005% de Tween 20/ Tampão PBS Tween três vezes, Cy 3 de cabra conjugado com anticorpo anti-coelho IgG foi adicionado foi adicionada às lâminas e incubadas em câmara úmida por mais 1h. As lâminas foram lavadas três vezes com 0,05% de Tween 20/Tampão PBS, pH 7,4; três vezes com tampão PBS, pH 7,4, e três vezes com H2O, e depois secadas. As lâminas foram digitalizadas a 595 nm (para Cy3) com um chip de microarranjo de leitor de fluorescência (GenePix Pro 6.0; Dispositivos Molecular).

Exemplo 8: Ensaio de Ligação Direta

[00250]Proteínas HA marcadas Cy3 com diferentes glicosilações foram preparadas em Tween 20/tampão PBS 0,005% (pH 7,4) e adicionado para cobrir a grade na matriz glicana com aplicação de uma lamela. Após a incubação em câmara de umidificação com agitação para 1h, as lâminas foram lavadas três vezes com Tween 20/tampão PBS 0,005% três vezes com tampão PBS (pH 7,4), e três vezes com H20 e então secadas. A lâmina foi digitalizada a 595 nm (para Cy3) com um chip de microarray de leitor de fluorescência (GenePix Pro 6.0, dispositivos moleculares, EUA).

Exemplo 9: Ensaio de Microneutralização

[00251]O vírus recém-preparado H5N1 (NIBRG-14) (National Institute for Bi-ological Standards and Control, Potters Bar, Reino Unido) foi quantificado com a dose mediana de cultura de tecidos infecciosos (TCID50). O TCID50 de 100 vezes do vírus foi misturado em igual volume com 2 diluições da solução estoque de soro em placas de 96 poços e incubadas por 1 h, a 37°C. A mistura foi adicionada para as células MDCK (1,5 x 104 células por poço) sobre as placas, seguido de incubação a 37°C por 16-20h. As células foram lavadas com PBS, fixadas em solução de aceto- na/metanol (vol/vol 1:1), e bloqueadas com 5% de leite desnatado. O antígeno viral foi detectado por ELISA indireto com um mAb contra a influenza A NP (Sui JH, et al (2009). Nat Struct MoI Biol 16:265-273).

Exemplo 10: Ratos, Vacinação e Desafio.

[00252]Camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade BALB / c (n = 15) foram imunizadas por via intramuscular com 20 μg de HAfg purificada ou proteínas HAmg em 50 μL de PBS, pH 7,4, e misturados com 50 μL de 1 mg/mL de hidróxido de alumínio (Alum; Sigma) nas semanas 0 e 2. O sangue foi coletado 14 dias após a imunização, e amostras de soro foram coletadas de cada rato. Os camundongos imunizados foram desafiados por via intranasal com um vírus geneticamente modificado H5N1, NIBRG-14, com uma dose letal (100 vezes a dose letal para 50% dos ratos). Os ratos foram monitorados diariamente por 14 dias após o desafio para a sobrevivência. Todos os experimentos com animais foram avaliados e aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso Academia Sinica.

Exemplo 11: ensaio de Hemaglutinação (HA)

[00253]Hemaglutinação de células vermelhas do sangue de galinha (cRBCs, Lampire Biological Laboratories, Pipersville, Pa.) é realizada em placas de fundo redondo de 96 poços de microtitulação, preparando diluições duplas de amostras virais em PBS, conforme descrito em Jones, et. al, Journal of Virology, 80 (24): 1196011967 (2006). O título é relatado como unidades hemaglutinantes por 50 μL (HAU/50 μL) de amostra.

Exemplo 12: Purificação de hemaglutinina viral

[00254]Hemaglutinina (HA) associada com viron foi purificada a partir de par-tículas do vírus influenza, conforme descrito no Johansson, et al. Journal of Virology, 1989, vol. 63 (3), p. 1239-1246, com modificações. Resumidamente, o vírus é coletado a partir do líquido alantóico de ovos de galinha infectada e sacarose purificada como descrito acima. Pellets são ressuspensos em 0,5 mL de tampão acetato de sódio (0,05 M de acetato de sódio, 2 mM CaCl.sub.2, 0,2 mM EDTA, pH 7,0), homogeneizado através de uma agulha de calibre 18, e misturado com um volume igual de 15% de octil glicosídeo (octil-β-d-tioglucoside; Fisher Scientific, Norcross, Geórgia) em tampão acetato de sódio, seguido por vigorosa agiatação por 5 minutos. Esta suspensão é centrifugada a 18.400 xg durante 60 minutos a 4°C, e o sobrenadan- te cuidadosamente retirado e reservado como a fração rica em HA. Dois por cento brometo de amônio cetil trimetil-aquoso (CTAB, Bio-Mundo, Dublin, Ohio) é adicio- nado à fração HA para uma concentração final de CTAB 0,1%, e a amostra é aplicada a um (DEAE-Sephadex A-50, GE saúde, Uppsala, Suécia), coluna de troca iônica (leito, 0,7 cm x 6,0 cm) previamente equilibrada com M Tris-cloridrato 0,05 (pH 7,5) contendo octil glicosídeo 0,1%. Vinte 0,5 mL frações foram coletados por gravidade com baixo tampão de eluição sal HA (0,05 M TrisHCl, 0,1 M NaCl, 0,1% Triton X100, pH a 7,5) e novamente com uma alta tampão de eluição sal HA (0,05 M TrisHCl, 0,2 M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH para 7,5). Frações individuais são testadas para a atividade HA e analisadas pela pureza por eletroforese em gel SDS- poliacrilamida em condições de não-redução seguidas de coloração com Commas- sie coloidal. Concentração de proteína é determinada pela BCA ensaio como por as instruções do fabricante do (Pierce, Rockford, 111).

Exemplo 13: Exibição de Análise de Dados.

[00255]O software GenePix Pro (Axon Instruments) foi usado para a análise de fluorescência dos dados extraídos. O fundo local foi subtraído do sinal em cada ponto. Os pontos com defeitos óbvios, nenhum sinal detectável, ou uma fluorescência líquida de <100 foram retirados da análise. O "medianas dos rácios" de spots repetição foram em média no mesmo array. O perfil dos HA ligação à matriz (Fig. 2A) ea determinação de associação constante (Fig. 2B) foram realizados sob as mesmas condições na mesma matriz para que os dados foram normalizados.

[00256]Para determinar o valor KD,surf, os dados de equilíbrio de ligação foram analisados pelo ajuste dos dados para as isotermas de Langmuir (equação 1), assumindo que ligantes ligados a um ou dois sites independentes, usando o programa de regressão não-linear comercial PRISM GradPad (Graph-Pad). Fmax é a intensidade máxima de fluorescência, uma medida da quantidade de carboidrato ativos na superfície; (P) é o total HA concentração de proteínas, e KD,Surf, é a dissociação constante de equilíbrio entre os carboidratos e as proteínas de superfície.

[00257]Os valores de KD,Surf de cada amostra foram repetidas e calculadas pelo menos 4 vezes para derivar média de KD,surf. Usando os valores de KD,surf, os parâmetros termodinâmicos podem ser derivadas as equações (2) e (3) .Fobs = Fmax(P)/( KD,surf + (P)) { Equação 1 }KD,surf = KA.surf-1 { Equação 2 }Δ Gmultl = RT ln(KA,surf) { Equação 3 }

[00258]O KA,surf representa a constante de associação na equação (1). Na equação (2), R = 1,987 cal mol -1 K-1; T é a temperatura absoluta, e os experimentos foram realizados a 298 K. Estes valores de cada amostra foram calculados usando o Microsoft Excel. A análise estatística dos KD.surf em glicoformsa diferentes HA foi realizada com ANOVA usando GraphPad Prism (GraphPad).

Exemplo 14: Determinação da HA anticorpos específicos no soro por ELISA

[00259]As proteínas HA foram purificadas a partir HEK293 e revestido nas placas de 96 poços (5 mg / mL) durante a noite. O rato de soro foi diluído 100 vezes para ser o soro de ações para a medição de HA vinculativo. As placas recobertas foram incubadas com soro em duas diluições de série para 1 h. HA-specific IgG foi detectada usando HRP-conjugado anti-ratinho. A diluição desfecho foi calculado, escolhendo a diluição para os quais a leitura ficou acima do que 1: 50 a diluição de soro preimmune (Stevens J. et al (2006) Ciência 312:404-410.). Anti-soro de coelho foi preparado por LTK BioLaboratories. Coelho foi imunizado em cerca de 0,25-0,35 mg de proteínas HA misturado com adjuvantes completo ou incompleto. Foi coletado sangue de coelho depois de seis imunizações, com um calendário de imunização de um a cada 2 semanas.

Exemplo 15: Local de Análise de Glicosilação para HA

[00260]Um total de 297 sequências full-length HA de Hl, H3, H5 e vírus influenza foram recuperados do banco de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia e alinhados por ClustalW2 programa no EMBL-EBI (Larkin MA, et al (2007). 23:2947-2948 bioinformática). As sequências de data a partir dos anos 1918 para 2000 e foram isolados de seres humanos. Para reduzir a redundância, as cepas em um país foram selecionadas apenas um vez para análise. Sequências utilizadas para o alinhamento incluem: Hl (AAX56530, AAY78939, ABA18037, ABB51962, ABC42750, ABD60867, ABD62061, ABEL 1690, ABF47869, ABF82830, ABF82852, ABG37362, ABI19015, ABI21211, ABI95294, AB 196103, ABK39995, ABK57092, ABK57093, ABK79970, ABO32948, ABO32970, ABR15885, ABS71664 e ABS76427); H3 (AAT08000, AAT12654, AAXl 1455, AAY58320, AAZ32943, AAZ43394, ABA26700, ABA26777, ABB51961, ABB71825, ABC42596, ABC42607, ABC42629, ABC43017, ABD15713, ABD59850, ABD61359, ABF17954 , ABG37450 e ABG37461); H5 (AAS65618, AAT39065, AAT73273, AAT73274, AAT73275, AAT84153, AAV32636, ABC72655, ABD28180, ABD28182, ABE97624, ABI16504, ABI36144, ABI36439, ABO10181, ABO36644 e ABP51968)._N-glicosilatos conectados de sequências de HA foram previstos pelo centro de previsão de sequência de análise biológica severs (www.cbs.dtu.dk/services/). Para glicosilação de asparagina (Asn), as sequências contêm padrão de aminoácidos Asn-Xaa (Ser / Thr), onde Xaa pode ser qualquer aminoácido, exceto para prolina (Gavel Y, et al (1990) Proteína Eng 3:433. - 442), seguido de serina ou treonina. Os resultados para análise de dados foram preparados usando o programa PRISM (GraphPad) e Jalview (Waterhouse AM, et al (2009). Bioinformatics 25:1189-1191).

Exemplo 16: Método químico para a síntese de glicopeptídeos HA

[00261]A síntese gradual de glycopepides HA pode ser realizado pelo anidri- do dimethylphosphinothioic mista (MPT-MA) método (Inazu, T., et al. (1997) em Química Peptide 1996 (Kitada, C. ed.) Pp 41-44, Protein Research Foundation, Osaka). Glicoproteínas HA pode ser sintetizada por um método tioéster com uma sequência consenso "Asn-X-Ser / Thr" para N-glicosilação, mas não cadeias de açúcar. O fragmento de peptídeo é preparado por um sintetizador automática, utilizando um programa fornecido Boc-estratégia. A reação de acoplamento é realizada usando DCC / HoBT como ativar o reagente. Asn resíduos (GlcNAc) é acoplado através de um método MPT-MA usando Boc-Asn (GlcNAc)-OH (3 equiv). As reações de acoplamento são realizadas por Ih e repetido com monitoramento. Após o tratamento com HF anidro contendo anisole 10% e purificação por HPLC, um tioéster glicopep- tídeo é obtido. Este segmento tioéster glicopeptídeos é acoplado com o segmento de peptídeo outro, que foi preparado separadamente pelo método de condensação segmento tioéster. Depois desproteções e formação da ligação dissulfeto, o analógico GIcNAc-HA é obtido.

[00262]Como alternativa, um método de síntese convergente de glycopepi- des HA pode ser realizada pela reação de acoplamento do grupo β-carboxil do pep- tidil Asn com glycosylamine. (Veja Cohen-Abisfeld, ST, e Lansbury, PT (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 10531-10537).

Exemplo 17: Método quimio-enzimático para a síntese de glicopeptídeos HA

[00263]A preparação de um glicopeptídeo contendo um oligossacarídeo complexo pode ser realizada utilizando métodos enzimáticos em conjunto com métodos químicos. Síntese de N-glicopeptídeos pode ser realizada utilizando a atividade trans glicosilação de endo-β-N-acetylglucosaminidase (endo-β-GlcNAc-ase). (Ta- kegawa, K., et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 3094-3099). Endo-β-ase GlcNAc- hidrolisa a ligação glicosídica entre o N, N'-diacetylchitobiose fracção de um N-linked oligossacarídeo, e transfere o fragmento liberado oligossacarídeo a um composto de hidroxila. A síntese de N-glicopeptídeos usando endo-β-GlcNAc ase pode ser feita em duas etapas. Primeiro, um peptídeo contendo GIcNAc é preparado por uma rota química. Em seguida, um fragmento de oligossacarídeo de um doador glicosil é transferido para a porção GIcNAc do glicopeptídeo como aceitador glicosil pela reação transglicosilação de endo-β-GlcNAc ase.

[00264]Embora concretizações específicas da invenção foram descritas neste documento para fins de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Assim, a invenção não é limitada, exceto como pelas reivindicações anexado.

[00265]Enquanto a invenção tem sido descrita em conjunto com a descrição detalhada dos mesmos, a descrição acima é destinada a ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexado. Outros aspectos, as vantagens e as modificações estão dentro do escopo das reivindicações seguinte.

[00266]A patente e literatura científica aqui referidos estabelece o conhecimento que está disponível para aqueles com habilidade na arte. Todas as patentes dos Estados Unidos e publicada ou não os pedidos de patentes Estados Unidos citados são incorporados por referência. Todas as patentes publicadas estrangeira e aplicações de patentes citadas aqui são incorporadas por reference. Genbank e submissões NCBI indicado pelo número de acesso citadas aqui são incorporados por referência. Todas as outras referências, documentos, manuscritos e literatura científica citados são incorporados por referência.

[00267]Enquanto esta invenção tem sido particularmente apresentada e descrita com referências a modalidades preferidas dele, será compreendido por aqueles hábeis na técnica que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas nela sem se afastar do âmbito da invenção abrangido pelas reivindicações anexas.

Claims (20)

1. Composição imunogênica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:uma glicoproteína de superfície viral parcialmente glicosilada,em que a glicoproteína de superfície viral parcialmente glicosilada é uma hemaglutinina (HA) do vírus influenza,em que a glicoproteína de superfície viral é mono-glicosilada, di-glicosilada, ou tri-glicosilada em um ou mais sítios de glicosilação.

2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a glicoproteína de superfície viral parcialmente glicosilada do patógeno é gerada por deglicosilação parcial usando um ou mais dos métodos químicos ou enzimáticos.

3. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a glicoproteína de superfície viral parcialmente glicosilada compreende um sítio de N-glicosilação compreendendo uma sequência de aminoácidos de asparagina-Xaa-serina e asparagina-Xaa-treonina, onde Xaa é qualquer aminoácido, exceto prolina.

4. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus influenza parcialmente glicosilada é glicosilada com N-acetilglicosamina (GIcNAc) e/ou manose.

5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a glicoproteína HA do vírus influenza é de uma cepa de influenza selecionada do grupo consistindo em H1, H3 e H5.

6. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus influenza parcialmente glicosilada é uma hemaglutinina mono-glicosilada do vírus influenza glicosilada com N-acetilglicosamina (GIcNAc).

7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina mono-glicosilada do vírus influenza compreende um sítio de N-glicosilação compreendendo a região Sa.

8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina mono-glicosilada do vírus influenza compreende glicosilação parcial no resíduo de asparagina na posição 177 do polipeptídeo HA (SEQ ID NO:10).

9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus influenza mono- GIcNAc glicosilada apresenta uma especificidade reduzida e afinidade aumentada para ligação aos receptores HA com relação à especificidade e afinidade para ligação ao receptor HA pela hemaglutinina anterior a deglicosilação.

10. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus influenza mono- GIcNAc glicosilada se liga a um receptor HA sialilado, em que o receptor é encontrado em uma célula alvo.

11. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus influenza mono- glicosilada compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência H5 HA consenso (SEQ ID NO: 4).

12. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a sequência H5 HA consenso mono-glicosilada (SEQ ID NO: 4) é glicosilada em resíduos de asparagina em uma ou mais das posições 39, 127, 170, 181, 302, 495 e 500.

13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus influenza mono- glicosilada compreende uma sequência de polipeptídeo H1 selecionada do grupo consistindo em uma sequência de NIBRG-121 sazonal (cepa da vacina contra A(H1N1) da pandemia de 2009) (SEQ ID NO: 6), uma sequência consenso H1-A (SEQ ID NO: 8) e uma sequência consenso H1-C (SEQ ID NO: 10).

14. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a sequência da hemaglutinina (HA) mono- glicosilada do vírus influenza é selecionada do grupo que consiste em uma sequência HA H5 consenso (SEQ ID NO: 4), uma sequência de NIBRG-121 (vacina da pandemia de 2009 contra A(H1N1)) (SEQ ID NO: 6), uma sequência consenso H1-A (SEQ ID NO: 8) e uma sequência H1-C consenso (SEQ ID NO: 10),em que a sequência de HA é modificada através da substituição de uma região transmembrana na proteína para permitir a expressão de uma célula eucariótica adequada e secreção a partir da mesma.

15. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a hemaglutinina do vírus de influenza mono- glicosilada compreende um polipeptídeo H1 (Brisbane) sazonal.

16. Vacina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:(a) uma composição imunogênica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e(b) um adjuvante,em que a composição imunogênica é capaz de induzir uma resposta imune contra um vírus.

17. Vacina, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, tanto o hidróxido de alumínio quanto o fosfato de alumínio, adjuvante de Freund incompleto (IFA), esqualeno, alúmen e MF59.

18. Uso da composição imunogênica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para influenza em um mamífero.

19. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais sítios de glicosilação di- glicosilados ou tri-glicosilados compreendem N-acetilglicosamina (GlcNAc) e/ou ma- nose.

20. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais sítios de glicosilação di- glicosilados ou tri-glicosilados compreendem N-acetilglicosamina (GlcNAc).