BRPI1014631B1 - Composições que compreendem um peptídeo que inibe a sinalização de tgf-beta 1 em um veículo farmaceuticamente aceitável e usos do dito peptídeo para tratar ou prevenir doenças discais degenerativas, fibrose em órgãos corporais, câncer e glomerulosclerose - Google Patents
Composições que compreendem um peptídeo que inibe a sinalização de tgf-beta 1 em um veículo farmaceuticamente aceitável e usos do dito peptídeo para tratar ou prevenir doenças discais degenerativas, fibrose em órgãos corporais, câncer e glomerulosclerose Download PDFInfo
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Abstract
peptídeos e seus usos a presente invenção oferece um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de seq id no: 1, um variante e um sal farmaceuticamente aceitável. um novo peptídeo da presente invenção, variante do mesmo e seu sal são eficazes no tratamento e/ou prevenção de doenças discais degenerativas, no tratamento da fibrose em órgãos corporais, no tratamento do câncer e/ou glomerulosclerose, e são eficazes na inibição do sinal tgf-beta 1.
Description
[001]A presente invenção está relacionada a um novo peptídeo que é eficaz no tratamento e/ou prevenção de doenças discais degenerativas, no tratamento da fibrose em órgãos corporais, no tratamento do câncer, no tratamento da glomerulos- clerose, ou semelhantes.
[002]A doença discal degenerativa (DDD), uma causa da dor crônica lombar, é uma condição patológica que é acompanhada de dor lombar, resultante da ruptura e desgaste do disco, em virtude de sua degeneração ou achatamento em resposta à desidratação do disco (particularmente, no núcleo pulposo) causada pelo envelhe-cimento. O desgaste no disco é caracterizado por inervação aumentada e angiogê- nese, e alterações no número e função das células (formação de aglomerados, ne-crose, apoptose, etc.). Uma das características moleculares do disco degenerado é uma redução do agrecano. A perda do agrecano, que exerce um papel crucial na sustentação do disco, resulta na diminuição da pressão osmótica do disco, ocasio-nando a perda da capacidade de retenção da água, consequentemente acelerando a degeneração discal existente, incluindo o ânulo fibroso, e apresentando influência significativa em outras estruturais espinais e funções, tais como degeneração e hi-pertrofia das junções da faceta e ligamento flavo.
[003]Como terapias atuais disponíveis para dor lombar crônica patológica, incluindo essas doenças discais degenerativas, estão as terapias com analgésicos, reabilitações com exercícios, e semelhantes. Infelizmente, essas terapias enfrentam freqüentes recidivas da doença, longos períodos de tempo e esforços para tratar a doença, e também riscos de possíveis complicações devido a uma medicação pro-longada.
[004]Quando não existe nenhum resultado favorável da doença mesmo após tal tratamento conservador a longo prazo, o paciente enfrentará inevitavelmente uma terapia cirúrgica. Tratamentos cirúrgicos representativos incluem cirurgia de fusão lombar convencional envolvendo remoção completa dos tecidos do disco afetado e inserção de enxerto ósseo no local da lesão, e a recente inserção de disco artificial. Entretanto, esses métodos cirúrgicos apresentam várias desvantagens, tais como o preço relativamente caro e também riscos potenciais de complicações cirúrgicas a curto ou a longo prazo. Por exemplo, a cirurgia de fusão lombar requer frequente-mente novas cirurgias periódicas em virtude da degeneração dos discos adjacentes. Um disco artificial desenvolvido para reduzir essa desvantagem não oferece resulta-dos satisfatórios em estudo de acompanhamento a longo prazo. Logo, a cirurgia com disco artificial não é muito realizada hoje em dia. Conforme descrito acima, existe uma grande dificuldade no tratamento da dor lombar crônica em virtude das doenças discais degenerativas. Para lidar com tais situações, como uma alternativa à terapia conservadora e terapia cirúrgica, uma variedade de terapias experimentais foi utilizada para obter uma regeneração do disco enquanto minimizava a sua degene-ração.
[005]Recentemente, foram experimentadas diversas terapias biológicas para tratamento da degeneração discal, por exemplo, um método que regule de forma crescente a produção de importantes proteínas da matriz (por exemplo, agrecano), um método que regule de forma decrescente o catabolismo induzido pelas citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, interleucina-1 (IL-1), fator- alfa de necrose tumoral (TNF- α)) (Ahn, SH et al., Spine 27:911-917, 2002; Burke JG et al., Spine 28:2685- 2693, 2003; Kang JD et al., Spine 21: 271-277, 1996; Weiler C et al., Spine 30: 4453, 2005; Igarashi T et al., Spine 25:2975-2980, 2000; Olmarker K et al., Spine 23:2538-2544, 1998; Le Maitre CL et al., Arthitis Res Ther 7:R732R745, 2005; e Seguin CA et al., Spine 30: 1940-1948, 2005).
[006]Esses métodos biológicos terapêuticos foram amplamente utilizados fo-ra do país. Um método popular que desperta um grande interesse é a injeção direta do fator de crescimento ósseo (proteína morfogenética óssea, BMP) em um disco ou transplante de células discais com injeção de genes (Masuda K et al., Spine 31:742-745, 2006; Imai Y et al., Spine 32: 1197-1205, 2007; Zhang Y et al., Spine 33: 831838, 2008). Entretanto, esse método é simplesmente um método de obtenção de alterações físicas de uma estrutura discal através da regeneração física, não propor-cionando alívio ou remoção da dor em pacientes, e um crescimento excessivo, caso ocorra, pode resultar no agravamento das condições neurológicas em virtude da compressão nervosa.
[007]Sabe-se, entretanto, que a sinalização de TGF-beta1 está envolvido na fibrose, apoptose, angiogênese, invasão celular tumoral e metástase, e a inibição da sinalização de TGF-beta1 pode ser uma medição possível no tratamento da fibrose em órgãos corporais, câncer e/ou glomerulosclerose (Prud’ homme GJ, Lab Invest 87: 1077-1091, 2007).
[008]Com essa finalidade, existe uma necessidade do desenvolvimento de um novo material biológico que é eficaz na doença discal degenerativa promovendo a regeneração discal enquanto minimiza a degeneração do disco, e é capaz de tratar a fibrose em órgãos corporais, câncer, glomerulosclerose, ou semelhantes, através da inibição da sinalização de TGF-beta 1.
[009]A presente invenção tem a finalidade de oferecer um novo peptídeo, que é capaz de promover a regeneração discal enquanto minimiza a degeneração do disco.
[0010]A presente invenção também tem a finalidade de oferecer uma com-posição eficaz para tratar fibrose em órgãos corporais, câncer e glomerulosclerose.
[0011]A presente invenção oferece um peptídeo que compreende uma se-quência de aminoácidos (LQVVYLH) da SEQ ID NO: 1 ou uma variante, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[0012]Na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1, L, Q, V, Y e H repre-sentam leucina (Leu), glutamina (Gln), valina (Val), tirosina (Tir), e histidina (His), respectivamente.
[0013]Cada um dos aminoácidos da composição do peptídeo pode estar na forma L, D e/ou DL, todos abrangidos nos aminoácidos do peptídeo da presente in-venção.
[0014]Variante é uma forma onde a estrutura do peptídeo da presente inven-ção é parcialmente alterada pela variação espontânea ou artificial, sem causar ne-nhuma alteração da atividade principal. Por exemplo, onde um ou mais aminoácidos na posição da glutamina, tirosina e histidina na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 são substituídos com outros aminoácidos. De preferência, onde as substi-tuições da glutamina com asparagina, tirosina com fenilalanina ou triptofano, e/ou histidina com lisina ou arginina são introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Glutamina e asparagina pertencem ao grupo de aminoácidos que contêm grupo amina terminal. Tirosina, fenilalanina e triptofano pertencem ao grupo de aminoácidos aromáticos contendo cadeias laterais aromáticas. Histidina, lisina e arginina pertencem ao grupo de aminoácidos básicos contendo cadeia lateral muito polarizada, o que os tornam altamente hidrofílicos. Considera-se que aminoácidos no mesmo grupo apresentem as mesmas ou características bioquímicas similares (tamanho, forma, carga, capacidade de ligação com hidrogênio ou reatividade quí-mica).
[0015]O peptídeo ou variante do mesmo pode apresentar a fórmula geral (I) L - Xi - VV - X2 - L - X3 (I), onde X1 é Q ou N; X2 é Y, F, ou W; X3 é H, K, ou R; L é leucina, Q é glutami- na, N é asparagina, V é valina, Y é tirosina, F é fenilalanina, W é triptofano, H é his- tidina, K é lisina e R é arginina.
[0016]Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis podem incluir cloridra- to, sulfato, fosfato, lactato, maleato, fumarato, oxalato, metanosulfonato, p- toluenosulfonato, e semelhantes.
[0017]A presente invenção também oferece um uso medicinal de um peptí- deo ou variante, ou seu sal farmaceuticamente aceitável da presente invenção. O uso medicinal inclui uso terapêutico e/ou preventivo para doenças discais degenera-tivas, uso terapêutico para fibrose em órgãos corporais, uso terapêutico para câncer, e uso terapêutico para glomerulosclerose. O tratamento da fibrose em órgãos corpo-rais, câncer ou glomerulosclerose ocorre pela inibição da sinalização do fator de transformação do crescimento beta1 (TGF - β1).
[0018]TGF- β é conhecido como uma citocina altamente pleiotrópica que exerce um importante papel no controle da apoptose, angiogênese, cicatrização de feridas, imune-regulação e biologia do tumor. TGF- β existe em três isoformas: TGF- β1, TGF- β2, e TGF- β3. Todos os três tipos de TGF- β utilizam o mesmo receptor. O receptor do TGF- β apresenta três componentes: tipo I (RI ou ALK5), tipo II (RII) e tipo III (RIII ou betaglicano). TGF- β (todas as isoformas) se ligam ao RIII e admite RII, que então fosforila RI para formar um complexo de serina/treonina qui- nase heterotetramérico. Por sua vez, RI fosforila Smad2 e Smad3 (Smads associados ao receptor (R-Smads)), e a última forma um complexo heteromérico com Smad4, que se transloca para o núcleo, se liga ao DNA e regula a transcrição (Prud’homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007).
[0019]Conforme utilizado na presente invenção, o termo “inibição a sinaliza-ção de TGF-beta1” significa que TGF- β 1 falha ao se ligar ao receptor, então Smad2 e Smad3 falham ao se submeter à fosforilação, não formando um complexo com Smad4, e como resultado, o complexo falha ao se translocar para o núcleo e regular a transcrição.
[0020]Desta forma, a presente invenção oferece uma composição para tratar e/ou prevenir uma doença discal degenerativa, compreendendo um peptídeo ou uma variante, ou seu sal farmaceuticamente aceitável da presente invenção.
[0021]A presente invenção também oferece uma composição para tratar uma fibrose do órgão corporal, compreendendo um peptídeo ou uma variante, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável da presente invenção.
[0022]A presente invenção também oferece uma composição para tratar câncer, compreendendo um peptídeo ou uma variante, ou um seu sal farmaceutica- mente aceitável da presente invenção.
[0023]A presente invenção também oferece uma composição para tratar glomerulosclerose, compreendendo um peptídeo ou uma variante, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável da presente invenção.
[0024]O peptídeo da presente invenção pode ser preparado por processos comumente utilizados na síntese de peptídeos. Por exemplo, o peptídeo pode ser preparado pelos processos descritos em Schroder e Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press, New York, 1965, e semelhantes, e pode ser preparado por síntese das fases de solução ou síntese em fase sólida.
[0025]Exemplos dos métodos para formação das ligações peptídicas incluem método com azida, método com cloreto ácido, método com anidrido simétrico, método com mistura de anidrido, método com carbodiimidazol, método com adição de carbodiimidazol, método de oxidação-redução, e o método que utiliza o reagente K de Woodward. Na síntese peptídica, a metade com cistina pode ser formada através do emprego de um derivado da cistina, ou pela conversão de uma metade da cisteína da cadeia peptídica em uma metade de cistina, após a formação da cadeia peptídica pelo método convencional.
[0026]Antes da reação de ligação, um grupo carboxila, um grupo amino, um grupo guanidino, um grupo hidroxila, e semelhantes que não participam da reação podem ser protegidos, e o grupo carboxila e o grupo amino que participam da reação de ligação, podem ser ativados por métodos conhecidos na área.
[0027]Exemplos de grupos de proteção para o grupo carboxila podem incluir grupos de formação de éster, tais como metila, etila, benzila, p-nitrobenzila, t-butila e ciclohexila.
[0028]Exemplos de grupos de proteção para o grupo amino podem incluir benziloxicarbonila, t - butoxicarbonila, isoborniloxicarbonila, e/ou 9 - fluorenilmeti- loxicarbonila.
[0029]Exemplos de grupos de proteção para o grupo guanidino podem incluir nitro, benziloxicarbonila, tosila, p- metoxibenzenosulfonila, e/ou 4 - metoxi - 2,3,6 - trimetilbenzenosulfonila.
[0030]Exemplos de grupos de proteção para o grupo hidroxila podem incluir t - butila, benzila, tetrahidropiranila e/ou acetila.
[0031]Exemplos de formas ativadas de grupo carboxila podem incluir anidri- do simétrico, azida e éster ativos (éster com álcool, por exemplo, pentaclorofenol, 2,4 - dinitrofenol, álcool cianometílico, p - nitrofenol, N - hidroxi - 5 - norborneno - 2,3 - dicarboximida, N - hidroxisuccinimida, N - hidroxiftalimida e 1 - hidroxibenzo- triazol).
[0032]Um exemplo de grupo amino ativado é o fosfato de amida.
[0033]A reação é realizada em um solvente, tal como clorofórmio, diclorome- tano, acetato de etila, N,N - dimetilformamida, dimetilsulfóxido, piridina, dioxano, tetrahidrofurano, água, metanol, ou uma mistura destes.
[0034]A mistura da reação pode estar na faixa de aproximadamente -30 a 50°C, temperatura que é geralmente empregada para a reação.
[0035]A reação utilizada para a remoção do grupo de proteção do peptídeo da presente invenção pode ser diferente dependendo do tipo do grupo de proteção, mas deve ser aquela que seja capaz de liberar o grupo de proteção sem interferir na ligação peptídica.
[0036]O grupo de proteção pode ser removido por tratamento ácido, por exemplo, tratamento com cloreto de hidrogênio, brometo de hidrogênio, fluoreto de hidrogênio, ácido metanosulfônico, ácido trifluorometanosulfônico, ácido trifluoroacé- tico ou uma mistura desses ácidos. Além disso, a redução com um metal de sódio em amônia líquida ou a redução catalítica sobre carbono-paládio pode ser utilizada.
[0037]Na reação para remoção do grupo de proteção pelo tratamento ácido descrito acima, um aditivo, tal como anisol, fenol ou tioanisol pode ser utilizado.
[0038]Após o término da reação, o peptídeo preparado da presente invenção pode ser recuperado por um processo convencional para purificação de peptídeos, por exemplo, extração, partição, reprecipitação, recristalização ou cromatografia em coluna.
[0039]Além disso, o peptídeo da presente invenção pode ser convertido em variante do mesmo ou seu sal farmaceuticamente aceitável, conforme descrito ante-riormente de forma convencional.
[0040]O peptídeo, de acordo com a presente invenção, pode ser sintetizado por um sintetizador peptídico automatizado ou pode ser produzido por técnicas de engenharia genética. Por exemplo, um peptídeo desejado pode ser produzido pela preparação de um gene de fusão que codifica uma proteína de fusão que consiste de um parceiro de fusão e o peptídeo da presente invenção, através da manipulação genética, pela transformação de um microorganismo hospedeiro com o gene de fu- são, pela expressão de um peptídeo desejado na forma de uma proteína de fusão no microorganismo hospedeiro, e pela clivagem e separação do peptídeo da presente invenção da proteína de fusão utilizando uma protease ou composto.
[0041]Os aminoácidos utilizados na presente invenção são abreviados, de acordo com a nomenclatura IUPAC-IUB conforme descrito a seguir.
[0042]Uma dose do peptídeo ou variante do mesmo ou seu sal farmaceuti- camente aceitável está na faixa de 50 μg/dia a 1 mg/dia, de preferência 0,5 mg/dia a 1 mg/dia para administração parenteral. Para administração oral, a dose é 1,2 a 1,5 vezes maior do que a dose parenteral. Para administração retal, a dose é 2 a 5 vezes maior do que a dose parenteral. O peptídeo da presente invenção é amplamente administrado por vias parenterais, por exemplo, injeção local (injeção intradiscal para doença discal degenerativa, e injeção local intralesional para fibrose em órgãos cor-porais e câncer), injeção intravenosa/intramuscular ou subcutânea, administração intracerebroventricular ou intra-espinal ou administração transnasal e intraretal. Além disso, a administração oral pode ser adotada, se necessário.
[0043]O peptídeo ou composição da presente invenção, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, pode ser formulado em formas de dosagem desejadas, tais como injeções, supositórios, pós, gotas nasais, grânulos, comprimidos, etc.
[0044]O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser preparado, de acordo com um número de fatores bem conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, levando em consideração os seguintes fatores não limitantes: o material fisiologica- mente ativo em particular a ser utilizado, e sua concentração, estabilidade e biodis- ponibilidade; a doença, distúrbio ou condição a ser tratada; o indivíduo que está sendo tratado, e sua idade, altura/peso e condição geral; e a via de administração da composição, por exemplo, nasal, oral, local, transdérmica e intramuscular. Geral-mente, exemplos do veículo farmaceuticamente aceitável utilizado para a adminis-tração de um material fisiologicamente ativo, diferente da via de administração oral, pode incluir D5W (5% de glicose em água), uma solução aquosa contendo 5% em volume ou menos de dextrose, e solução salina. No caso da injeção local intralesio- nal, uma variedade de hidrogéis injetáveis pode ser empregada para melhorar os efeitos terapêuticos e aumentar a duração da eficácia da droga. Além disso, o veículo farmaceuticamente aceitável pode conter componentes adicionais que podem me-lhorar a estabilidade dos componentes ativos, tais como conservantes e antioxidan- tes. O peptídeo ou composição da presente invenção pode ser formulado de prefe-rência em uma forma de dosagem desejada, dependendo da doença a ser tratada e dos componentes, utilizando qualquer método apropriado conhecido na área, por exemplo, conforme descrito em “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Pub-lishing Co., Easton, PA (última edição).
[0045]O peptídeo da presente invenção pode ser armazenado em solução salina e liofilizado em uma ampola após a adição de manitol ou sorbitol. O peptídeo liofilizado pode ser dissolvido em solução salina ou semelhante para reconstituição antes de ser utilizado.
[0046]A presente invenção também oferece um peptídeo ou uma variante ou seu sal farmaceuticamente ativo para ser utilizado como um medicamento.
[0047]A presente invenção também oferece o uso de um peptídeo ou uma variante ou seu sal farmaceuticamente ativo da presente invenção para a produção de um medicamento para tratar e/ou prevenir a doença discal degenerativa, fibrose em órgãos corporais, câncer e/ou glomerulosclerose.
[0048]A presente invenção também oferece um método para tratamento e ou prevenção da doença discal degenerativa, fibrose em órgãos corporais, câncer e/ou glomerulosclerose, compreendendo a administração de um peptídeo ou uma variante ou seu sal farmaceuticamente ativo da presente invenção em um indivíduo (mamí-fero, incluindo humanos).
[0049]O tratamento da fibrose em órgãos corporais, câncer, e/ou glomeru- losclerose pode ser por inibição da sinalização de TGF-beta1.
[0050]Um novo peptídeo da presente invenção ou um variante ou seu sal farmaceuticamente aceitável é eficaz no tratamento e/ou prevenção de doenças dis-cais degenerativas, fibrose em órgãos corporais, câncer, e/ou glomerulosclerose, e é eficaz na inibição da sinalização de TGF-beta1.
[0051]A fig. 1 ilustra uma fotografia realizada após a coloração do tecido dis-cal normal, tecido de disco degenerado DMSO-administrado, e tecido de disco de-generado administrado com peptídeo 1.
[0052]A fig. 2 ilustra um gráfico apresentando os níveis de expressão do ge-ne do agrecano de um grupo de disco DMSO-administrado e um grupo de disco peptídeo administrado Exemplo 1 em um modelo de degeneração de disco, em comparação com um grupo de disco normal como referência.
[0053]A fig. 3 ilustra os resultados da análise Western blot para a confirma-ção do Smad2 fosforilado expresso em células HepG2 não tratado, células tratadas com TGF-beta1, células SB431542/TGF-beta1 tratadas, células tratadas com peptí- deo exemplo 1/TGF-beta1, e células DMSO-tratadas/TGF-beta1.
[0054]A presente invenção será descrita mais detalhadamente com referên-cia aos seguintes exemplos. Esses exemplos são oferecidos somente para ilustrar a presente invenção e não devem ser elaborados como limitantes do escopo e espírito da presente invenção.
[0055]Um peptídeo (LQVVYLH: SEQ ID NO: 1) apresentando uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 foi preparado por Peptron Inc. (República da Coréia), por requisição dos inventores. Especificamente, as unidades dos aminoáci- dos foram ligadas uma a uma a partir do terminal-C, por Fmoc SPPS (9 - fluorenil- meiloxicarbonil - síntese de peptídeo de fase sólida de) utilizando um sintetizador de peptídeo automático (ASP48S, Peptron Inc.).
[0056]A resina NH2 - His (Trt) - 2 - cloro - tritila foi utilizada onde o primeiro aminoácido do terminal-C do peptídeo foi ligado a uma resina. Todos os aminoáci- dos utilizados na síntese de peptídeos foram os protegidos por tritila (Trt), t - buti- loxicarbonila (Boc), t - butila (t-Bu), e semelhantes, onde o N-terminal é protegido por Fmoc, e os resíduos foram todos removidos em ácido. Como um reagente de ligação, foi utilizado hexafluorfosfato de 2 - (1H - benzotriazol - 1 - il) - 1,1,3,3 - tetrametilurônio (HBTU)/ hidroxibenzotriazol (HOBt) / N - metilmorfolina (NMM). (1) Aminoácido protegido (8 equivalentes) e o reagente de ligação HBTU (8 equivalen- tes)/ HOBt (8 equivalentes) /NMM (16 equivalentes) foram dissolvidos em dimetilfor- mamida (DMF) e adicionados seguido pela reação à temperatura ambiente por 2 horas. (2) A remoção do Fmoc foi realizada pela adição da piperidina 20% em DMF, seguido pela reação à temperatura ambiente por 5 minutos, duas vezes. As reações (1) e (2) foram repetidas para preparar uma estrutura peptídica básica, e o peptídeo foi separado da resina utilizando ácido trifluoroacético (TFA)/ 1,2 - etanoditiol (EDT) / tioanisol/ triisopropilsilano (TIS) / H2O = 90/2,5/2,5/2,5/2,5. O peptídeo foi purificado por HPLC de fase reversa utilizando um Vydac Everest com coluna C18 (250 mm 22 mm, 10 μm), e então separado por gradiente linear água - acetonitrila (10 a 75% (v/v) de acetonitrila), contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (v/v). Um peso molecular do peptídeo purificado foi confirmado utilizando um LC/MS (Agilent série HP1100), seguido por liofilização.
[0057]Trinta coelhos (coelhos brancos da Nova Zelândia, Orient Bio Inc.), pesando 3 a 3,5 kg foram preparados independente do sexo.
[0058]Os coelhos foram anestesiados por injeção intramuscular de 5 mg/kg de xilazina (RFompun, Bayer) e 35 mg/kg de cloridrato de cetamina (Ketalar, Pfizer). Antes do procedimento, um fluoroscópio com tubo de raio-X com placa lateral (Mo-delo VPX-200); Toshiba, Co.) foi obtido para definir a pré-injeção na altura da base do disco intravertebral. O controle da base se refere a um padrão para medição do espaço discal. Depois que os coelhos foram posicionados na mesa do laboratório, os níveis dos discos L23, L34, L45 e L56 foram confirmados pelo aparelho, e o ânulo fibroso foi perfurado no lado posterolateral do disco nos níveis L23, L45 e L56, utili- zando uma agulha 18G. Após recuperação da anestesia, os animais foram coloca-dos em uma gaiola sob as seguintes condições: temperatura de 20-25°C, umidade de 10% - 50%, ciclo de claro/escuro (L/D): (luz de 08:00 h a 20:00 h). Todos os ani-mais foram alimentados uma vez ao dia. Fotografias de raio-X foram obtidas com 2 e 4 semanas após a punção anular inicial. O raio-X foi realizado após a anestesia. Ba-seado nos resultados do raio-X, o espaço do disco intervertebral (altura IVD) foi me-dido. A partir dos resultados da medição, o nível de degeneração discal foi quantifi-cado pela modificação do método descrito em Lu et al., Spine. 22: 1828-34, 1997.
[0059]Posteriormente, os experimentos foram realizados em dois grupos se-parados, o grupo controle DMSO-administrado, e o grupo com o peptídeo experi-mental do exemplo 1, e os coelhos foram eutanisados por injeção de cetamina (25 mg/kg) e pentobarbital sódico (1,2 g/kg, Nembutal, Ovation), de acordo com o plane-jado, seguido pela extração do disco para análise histológica e bioquímica, respecti-vamente.
[0060]Os coelhos com discos degenerados da seção 2-1 foram divididos em dois grupos. Cada grupo recebeu sulfóxido de dimetila (DMSO) e o peptídeo do exemplo 1 (0,5 nM/animal) por injeção intradiscal local duas vezes. O ponto de administração para cada grupo foi 4 semanas após a indução da degeneração discal e 2 semanas depois. Após a segunda administração, os animais foram engordados por 2, 4 e 8 semanas, respectivamente. Na 4a, 6a e 10a semana após a primeira administração do peptídeo do exemplo 1 e DMSO, os tecidos discais respectivos foram extraídos e fixados em formalina. Os tecidos discais fixados foram embebidos em parafina, e foram preparados cortes seriais com uma espessura de 4 μm ao longo do plano sagital. Desses cortes, dois cortes sagitais foram corados com hematoxilina e eosina (H&E). Para comparação com o tecido discal normal, o disco foi extraído, tratado e corado dos coelhos sem indução de degeneração discal, de acordo com o mesmo método descrito acima.
[0061]A FIG.1 ilustra os resultados micrográficos de tecidos discais individu-ais, que foram extraídos e corados na 10a semana. A e B: tecido discal normal, C e D: tecido discal degenerado DMSO administrado, e E e F: tecido discal degenerado administrado com o peptídeo do exemplo 1. A, C e E: x40, e B, D e F: x400. Nas fotos x400, a seta indica um núcleo celular discal.
[0062]Como resultado, foi observado que o núcleo pulposo e o ânulo fibroso são distinguíveis entre si, e os componentes da matriz extracelular são abundantes no tecido discal normal (painéis A e B da figura 1). Além disso, a coloração distinta do núcleo celular foi observada no núcleo pulposo do tecido discal normal (painel B da fig. 1).
[0063]Por outro lado, o tecido discal DMSO-administrado exibiu uma redução no tamanho do disco, entre o ânulo fibroso e o núcleo pulposo, e falta dos com-ponentes da matriz extracelular (painéis C e D da fig. 1). Além disso, foi difícil encon-trar o núcleo celular corado na região do núcleo pulposo (painel D da fig. 1). Logo, estes resultados indicam morte celular, o que ocorreu no núcleo pulposo. A morte celular devido a degeneração do disco, conforme comprovado, e a ausência de célu-las resulta na falta de produção dos componentes da matriz extracelular, piorando a degeneração discal.
[0064]O tecido discal que recebeu o peptídeo do exemplo 1 exibiu um au-mento no espaço discal quando comparado com o que recebeu DMSO, podendo ser observado entre o núcleo pulposo e o ânulo fibroso, e apresento grande quantidade de componentes da matriz extracelular (painéis E e F da figura 1). Além disso, o nú-cleo celular foi observado com coloração intensa na região do núcleo puposo (painel F da fig. 1).
[0065]A partir destes resultados, foi demonstrado que o peptídeo do exemplo 1 apresentou efeitos terapêuticos evitando a redução dos componentes da matriz extracelular e morte das células devido a degeneração discal.
[0066]A reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real foi realizada para examinar o nível de expressão do gene do agrecano, que é um componente representativo da matriz extracelular nos tecidos discais.
[0067]Da mesma forma que no exemplo 2-1, os animais foram preparados e divididos em dois grupos, sendo administrados para cada grupo DMSO e o peptídeo do exemplo 1 (0,5 nM/animal) por injeção intradiscal local.
[0068]O ponto de administração para cada grupo foi 4 semanas após a indu-ção da degeneração discal e 2 semanas depois. Após a segunda administração, os animais foram engordados por 2, 4 e 8 semanas, respectivamente. Na 4a, 6a e 10a semana após a primeira administração do peptídeo do exemplo 1 e DMSO, os tecidos discais respectivos foram extraídos e o núcleo pulposo e o ânulo fibroso foram separados e colocados em tubo, seguido por congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenados em um freezer com temperatura ultra-baixa de -70°C.
[0069]O RNA total foi isolado do tecido do disco congelado e armazenado utilizando um reagente de Trizol (Invitrogen). cDNA foi sintetizado utilizando o RNA total isolado (2 μg), oligo dT e transcriptase reversa - MMLV (Invitrogen).
[0070]A quantidade de mRNA de GAPDH e agrecano foi examinada por um Prism 7900HT (ABI) utilizando Mix Master PCR PowerSYBR Green (Applied Biosys-tems Inc.). A quantidade de 25 ng de cDNA, 3 μL de Primers 10 μM, e 2X PCR Master Mix PowerSYBR foram misturados para completar um volume total de 10 μL. A reação de PCR foi realizada sob as seguintes condições de reação: indução da atividade enzimática à temperatura de 50°C por 2 minutos, e à temperatura de 95°C por 10 minutos, e então 45 ciclos com cada um abrangendo uma reação à tempera-tura de 95°C por 15 segundos e uma reação à temperatura de 60°C por 1 minuto, seguido pela medição de cada valor do ciclo inicial (CT). GADH foi selecionado com um gene de referência, e uma diferença de valor de CT (ΔCT) entre o gene de refe-rência e o gene do agrecano foi calculada. Além disso, uma diferença no valor de CT (Δ ΔCT) entre o disco normal e o disco que recebeu o peptídeo do exemplo 1 (ou DMSO-administrado) foi calculada. Então 2(-Δ ΔCT) foi calculada e expressa em termos de porcentagem relativa ao valor do disco normal.
[0071]Os resultados da PCR em tempo real foram fornecidos na fig. 2. A fi-gura 2 é um gráfico apresentando os níveis de expressão do gene do agrecano du-rante o tempo do grupo de disco que recebeu DMSO e do grupo de disco que rece-beu o peptídeo do exemplo 1 no modelo de degeneração discal, em comparação com um grupo de disco normal como referência. Conforme demonstrado no gráfico acima, pode ser observado que na 4a semana, o tecido discal que recebeu o peptí- deo 1 exibiu um aumento na expressão do gene do agrecano quanto comparado com o tecido discal DMSO-administrado. Na 6a e 10a semanas, o tecido discal que recebeu o peptídeo do exemplo 1 exibiu um nível de expressão de agrecano similar ao apresentado pelo tecido discal DMSO-administrado. Em virtude do peptídeo do exemplo 1 somente ser administrado na semana 0 e na 2a semana, e desde então os animais permanecerem sem outra administração, pode ser dito que um aumento na expressão do gene do agrecano na 4a semana foi obtido pela eficácia do peptí- deo do exemplo 1, que, entretanto, não manteve a expressão do gene do agrecano na 6a e 10 semana. A partir destes resultados, pode ser observado que o peptídeo da presente invenção exibe efeitos de regeneração discal pelo aumento da expressão do gene do agrecano, um componente da matriz extracelular representativo es-sencial para regeneração discal no tecido discal, e a duração dos efeitos de melhora da expressão do gene do agrecano do peptídeo não foi longa o suficiente para ex-cluir possíveis efeitos colaterais devido a um aumento excessivo da expressão do gene do agrecano.
[0072]A inibição da sinalização de TGF-beta1 pelo peptídeo do exemplo 1 foi confirmada de acordo com o seguinte método experimental.
[0073]O tratamento de células HepG2 com TGF-beta1 é conhecido por oca-sionar apoptose, onde Smad2 é inicialmente fosforilado (Park TJ. Et al., Mol Carci-nog. 47:784-796, 2008: e Gressner AM. et al., J Hepatol. 26:1079-1092, 1997). Utili-zando essas propriedades, o experimento foi realizado conforme abaixo. A quanti-dade de 1 x 106 de células HepG2 (ATCC: American Type Culture Collection) foram semeadas em uma placa de 60 mm, estabilizada durante a noite, e então deixada sem nutrientes com meio sem soro (SFM) por 24 horas. Antes do tratamento das células com o peptídeo do exemplo 1, 5 ng/mL de TGF-beta1 (PromoKine, Alemanha) e o peptídeo acima (1, 5 e 25 μM) foram submetidos à pré-incubação com TGF-beta1 (5 ng/mL) à temperatura de 37°C por 1 hora. Então, as células foram tratadas com as soluções pré-incubadas por 30 minutos, seguido pela extração de proteínas. Além disso, as células foram tratadas anteriormente somente com SB431542 10 μM (TOCRIS, USA), um inibidor do receptor TGF-beta, seguido pela incubação por 1 hora, e então tratadas com TGF-beta1 (5 ng/mL) por 30 minutos. Então, as células foram tratadas com as soluções pré-incubadas por 30 minutos, seguido pela extração de proteínas. Além disso, as células foram tratadas anteriormente somente com 10 μM de SB431542 (TOCRIS, USA), um inibidor do receptor TGF-beta, seguido pela incubação por 1 hora, e então tratadas com TGF-beta1 (5 ng/mL) por 30 minutos. Então, as células foram homogeneizadas em gelo em Radioimunoprecipita- ção (RIPA) Tampão Lise (Millipore) {Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, ácido desoxicólico 0,25%, NP-40 1%, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1 mM, NaF 40 mM, Na3VO4 1mM, ditiotreitol 1mM (DTT)}. O homogeneizado foi sonicado cinco vezes utilizando um BRANSON SONIFIER 450 com controle de saída de 2,56, ciclo Duty (%) 20, e timer 6. O lisado celular foi cen- trifugado à temperatura de 4°C e 12.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi utilizado para análise de Western blot. A concentração protéica foi ensaiada utilizan-do o método de Bradford. A quantidade de 30 μg da proteína foi adicionada ao tam-pão da amostra SDS contendo 2 - mercaptoetanol. Após deixado em repouso à temperatura de 95°C por 5 minutos, o fracionamento foi realizado por SDS-PAGE 10%, seguido por Western blot. Da análise de Western blot, a proteína fracionada foi transferida para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad Lab) e bloqueada com leite desnatado 5% em PBS-T, seguido pela reação com uma diluição 1:3000 do an-ticorpo principal em leite desnatado em PBS-T, à temperatura de 4C durante a noite. Posteriormente, a membrana foi lavada três vezes com PBS-T por 5 minutos, tratada com uma diluição 1:5000 de anticorpo secundário anti-coelho conjugado com pero-xidase de rábano silvestre (HRP) (Bio-Rad Lab, 1706515) em leite desnatado 5% em PBS-T, à temperatura ambiente por 1 hora, e submetido à coloração utilizando ECL (Amersham Pharmacia). Uma vez que Smad2 é primeiro fosforilado simultaneamente com a ligação do TGF-beta1 ao receptor TGF-beta, o anticorpo fosfo-Smad2 (ser465/467) (Cell /Signaling, 3101, 8) capaz de detectar Smad2 fosforilado foi utili-zado como um anticorpo primário.
[0074]Os resultados estão apresentados na fig. 3. A fig. 3 ilustra os resulta-dos do Western blot (coluna 1: células HepG2 não tratadas, coluna 2: células TGF- beta1 tratadas, coluna 3: células TGF-beta1/SB431542 tratadas, colunas 4, 5 e 6: células tratadas com 1, 5, e 25 μM de TGF-beta1/peptídeo, respectivamente, e coluna 7: células tratadas com TGF-beta1/DMSO). Na fig. 3, o símbolo '+' representa que foi tratado com o material em questão, e '-' representa que não foi tratado com o material em questão. A parte inferior da fig. 3 ilustra os resultados da coloração Coomassie Blue da membrana utilizada em Western blot, demonstrando que a quantidade de proteína é a mesma em todas as colunas.
[0075]Com relação à fig. 3, foi observado que a coluna 1 exibe pouca fosfori- lação da proteína extraída das células HepG2 não tratadas, enquanto a coluna 2 exibe fosforilação significativa da proteína por TGF-beta1. Além disso, foi observado que a coluna 3 exibe inibição completa da fosforilação por SB431542. Foi confirmado que o nível de fosforilação da proteína foi reduzido de uma forma dose- dependente, quando o peptídeo do exemplo 1 foi tratado a uma concentração de 1 μM, 5 μM, e 25 μM, respectivamente. A coluna 7 tratada com DMSO exibiu os mesmos perfis do tratamento com TGF-beta1.
[0076]A partir destes resultados, pode ser observado que uma vez que o peptídeo da presente invenção exibe inibição dose dependente do sinal do TGF- beta1, as doenças curáveis pela inibição da sinalização de TGF-beta1 mencionado acima, isto é, fibrose em órgãos corporais, câncer, e/ou glomerulosclerose podem ser tratadas (Prud'home GJ, Lab Invest 87: 1077-1091, 2007). Além disso, pode ser observado que o peptídeo do exemplo 1 não inibe completamente a sinalização de TGF-beta1 ao contrário do SB431542. A medida que a sinalização de TGF-beta1 é um mecanismo regulatório importante no corpo humano, a inibição completa da si-nalização de TGF-beta1, tal como a realizada pelo SB431542, pode causar efeitos colaterais. Entretanto, o peptídeo da presente invenção reduz a sinalização de TGF- beta1 de uma forma dose dependente, de forma que a concentração peptídica possa ser vantajosamente ajustada, para reduzir possíveis efeitos colaterais, quando é utilizado no tratamento das doenças relacionadas.
[0077]Um novo peptídeo da presente invenção ou um variante ou seu sal farmaceuticamente aceitável é eficaz no tratamento e/ou prevenção de doenças dis-cais degenerativas, fibrose em órgãos corporais, câncer, e/ou glomerulosclerose, e é eficaz na inibição da sinalização de TGF-beta1, e é, portanto, aplicável industrial-mente.
Claims (11)
1. Composição para tratar e prevenir doenças discais degenerativas CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 em um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. Composição para tratar fibrose em órgãos corporais CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 em um veí-culo farmaceuticamente aceitável.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o tratamento de fibrose em órgãos corporais é pela inibição da sinaliza-ção do TGF-beta 1.
4. Composição para tratar câncer CARACTERIZADA pelo fato de que com-preende um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 em um veículo farmaceuticamen- te aceitável.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o tratamento do câncer é pela inibição da sinalização do TGF-beta 1.
6. Composição para tratar glomerulosclerose CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 em um veículo farma- ceuticamente aceitável.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o tratamento de glomerulosclerose é pela inibição da sinalização do TGF-beta 1.
8. Uso de um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças discais degenerativas.
9. Uso de um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar fibrose em órgãos corporais.
10. Uso de um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 CARACTERIZADO pe-lo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar câncer.
11. Uso de um peptídeo da sequência SEQ ID NO: 1 CARACTERIZADO pe-lo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar glomerulosclero- se.
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