BRPI1015444B1 - Método para produzir (+)-zizaeno - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR (+)-ZIZAENO. A presente invenção fornece um método para produzir (+)-zizaeno, tal método compreende colocar em contato pelo menos um polipeptídeo com farnesil pirofosfato (FPP). Em particular, tal método pode ser executado in vivo para produzir (+)- zizaeno, um composto que pode ser usado como precursor para diversos compostos úteis no campo da perfumaria e aromatização. A presente invenção também fornece a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo útil no método da invenção. Um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção e um vetor de expressão que contém tal ácido nucleico também fazem parte da presente invenção e um vetor de expressão que contém tal ácido nucleico também fazem parte da presente invenção. Um organismo hospedeiro não humano ou uma célula transformada para serem usados no método para produzir (+)-zizaeno são também objeto da presente invenção.

Description

Campo técnico

(001) A presente invenção fornece um método de produção de (+)-zizaeno, tal método compreendendo o contato de pelo menos um polipeptídeo com farnesil pirofosfato (FPP). Em particular, tal método pode ser executado in vitro ou in vivo para produzir (+)-zizaeno, um composto que pode ser usado como precursor para diversos compostos úteis no ramo da perfumaria e aromatização. A presente invenção também fornece a sequência de aminoácido de um polipeptídeo útil no método da invenção. Um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção e um vetor de expressão que contém tal ácido nucleico também fazem parte da invenção. Um organismo hospedeiro não humano ou uma célula transformada para ser usados no método de produção de (+)-zizaeno também são objetos da presente invenção.

Estado da técnica

(002) Os terpenos são encontrados na maioria dos organismos (microorganismos, animais e plantas). Estes compostos são compostos por cinco unidades de carbono chamados unidades de isopreno e são classificados pelo número destas unidades presentes em sua estrutura. Desta forma, monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos são terpenos que contêm, respectivamente, 10, 15 e 20 átomos de carbono. Os sesquiterpenos, por exemplo, são largamente encontrados no reino vegetal. Muitas moléculas de sesquiterpenos são conhecidas por suas propriedades aromatizantes e de fragrância, e seu cosmético por seus efeitos medicinal e anti- microbiano. Mais de 300 hidrocarbonetos sesquiterpenos e 3000 sesquiterpenoides foram identificados e muitas novas estruturas são identificadas a cada ano. Os extratos de planta obtidos por diferentes meios, tais como destilação a vapor ou extração por solvente, são usados como fonte de terpenos. As moléculas de terpeno são, frequentemente, usadas tal qual, mas, em alguns casos, são usadas reações químicas para transformar os terpenos em outras moléculas de alto valor.

(003) A produção biossintética de terpenos envolve enzimas chamadas terpenos sintases. Existe quase que uma infinidade de sesquiterpenos sintases presentes no reino vegetal, todos usando o mesmo substrato (farnesil pirofosfato, FPP), mas com diferentes perfis de produto. Genes e cDNA que codificam as sesquiterpenos sintases foram clonados e as correspondentes enzimas recombinantes caracterizadas. A biossíntese dos terpenos nas plantas e em outros organismos foi extensivamente estudada e não é mais detalhada aqui.

(004) Geralmente, o preço e disponibilidade dos extratos naturais de plantas são dependentes da abundância, rendimento em óleo e origem geográfica das plantas. Além disto, a disponibilidade e qualidade dos extratos naturais são extremamente dependentes do clima e outras condições locais, conduzindo à variabilidade de ano para ano, tornando o uso de tais ingredientes em perfumaria de alta qualidade muito difícil ou até mesmo impossível alguns anos.

(005) O óleo de Vetiver é um destes extratos naturais. É um ingrediente de perfumaria relativamente caro, que consiste de uma mistura complexa de álcoois de sesquiterpenos, aldeídos e ácidos que tem um perfil olfativo complexo. Os constituintes individuais do óleo de vetiver também poderiam ser úteis como ingredientes de perfumaria, mas sua purificação do óleo não é viável em larga escala.

(006) Um método independente da planta para produzir os constituintes do óleo de vetiver seria muito desejável, mas a relação custo-benefício das sínteses químicas de tais componentes até então não é conveniente.

(007) O (+)-zizaeno é uma molécula sesquiterpeno de ocorrência natural. Ele pode ser usado como precursor para vários compostos que são úteis no ramo da perfumaria e aromatização, em particular, para constituintes do óleo de vetiver, como o khusimol, zizaen-12-al e ácido khuzenic. Uma rota bioquímica que leva à síntese do (+)-zizaeno seria, portanto, de grande interesse.

(008) A análise da composição do óleo de vetiver mostrou que derivados de zizaeno são os principais constituintes deste óleo e contribuem para o odor do vetiver. Veja, por exemplo, Weyerstahl et al (2000), Flav. Fragr. J., 15, 395-412. Entretanto, este documento não fornece, ou mesmo sugere, um aminoácido ou uma sequência nucleotídea que leve à produção do (+)-zizaeno.

(009) A biossíntese do óleo de vetiver em raízes de vetiver foi investigada em Del Giudice et al (2008), The microbial community of Vetiver root and its involvement into essential oil biogenesis, Environ. Microbiol., 10(10), 2824-2841. Esta publicação descreve a produção de sesquiterpenos por microorganismos isolados das raízes de vetiver e apoia a ideia de que os microorganismos estariam envolvidos na biossíntese dos sesquiterpenos vetiver. Os nossos resultados são opostos às sugestões feitas neste artigo porque mostramos que o zizaeno é produzido por um sesquiterpeno sintase expresso pelas raízes vetiver por si só e não pela comunidade microbiana.

(010) Um sesquiterpeno sintase capaz de sintetizar um precursor dos constituintes do óleo de vetiver, em particular (+)-zizaeno, nunca foi divulgado no estado da arte.

(011) A percentagem de identidade entre os sesquiterpenos sintases conhecidos e o polipeptídeo da invenção é muito baixa. A sequência de proteína mais próxima à (+)-zizaeno sintase da invenção é um terpeno sintase putativa da Zea mays (NCBI acesso No. ACG24265) que compartilha 56% de identidade da sequência de aminoácido com o (+)-zizaeno sintase da invenção. Os produtos obtidos com este terpeno sintase putativa não foram identificados. A sintase mais próxima plenamente caracterizada é um (E)-beta-cariofileno sintase da Zea mays (NCBI acesso No ABY79212), que é apenas 51% idêntica à sintase da invenção.

(012) Além da diferença entre as sequências, também tem de ser salientado que a estrutura e as propriedades dos produtos sintetizados pela enzima acima mencionada são muito diferentes daqueles do (+)-zizaeno. Em particular, o (E)-beta- cariofileno não é adequado como um precursor para a produção dos constituintes do óleo de vetiver.

(013) Apesar de extensos estudos de ciclização de terpenos, o isolamento e caracterização dos terpenos sintases ainda é difícil, particularmente em plantas, devido à sua baixa abundância, seus padrões de expressão frequentemente transitórios, a complexidade de purificá-los a partir de misturas de resinas e compostos fenólicos em tecidos onde são expressos.

(014) É um objetivo da presente invenção fornecer métodos para produzir (+)- zizaeno de uma forma econômica, como acima indicado. Por conseguinte, a presente invenção tem o objetivo de produzir (+)-zizaeno com pequeno desperdício, em um processo de energia e de recurso mais eficiente, reduzindo a dependência de combustíveis fósseis. É ainda objetivo fornecer enzimas capazes de sintetizar (+)- zizaeno, que sejam úteis como precursoras para ingredientes para perfumar e/ou aromatizar. Abreviações utilizadas bp par de base kb base quilo BSA albumina de soro bovino cDNA DNA complementar CTAB brometo de cetiltrimetilamônio DMAPP difosfato dimetil alil DNA ácido dioxirribonucleico dATP trifosfato de deoxiadenosina dNTP deoxinucleotídeo trifosfato DTT ditiotreitol EDTA ácido etilenodiaminotetracético FPP farnesil pirofosfato GC cromatografia gasosa idi isopentenil difosfato isomerase IPP isopentenil difosfato IPTG isopropil-D-tiogalacto-piranosídeo LB lisogenia caldo MOPSO ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanossulfônico MS espectrômetro de massa mvaK1 mevalonato quinase mvaK2 mevalonato difosfato quinase PCR reação em cadeia da polimerase PVP polivinilpirrolidona RMCE troca de cassete mediada por recombinase 3’-/5’-RACE amplificação rápida das extremidades 3’ e 5’ do cDNA RNA ácido ribonucleico mRNA ácido ribonucleico mensageiro TE tris e EDTA YNB base nitrogenada de levedura

Descrição da invenção

(015) A presente invenção fornece um método para produzir (+)-zizaeno biossinteticamente, de forma econômica, confiável e reprodutível.

(016) Um “sesquiterpeno sintase” ou um “polipeptídeo que tenha uma atividade de sesquiterpeno sintase” é aqui intencionado como um polipeptídeo capaz de catalizar a síntese de uma molécula de sesquiterpeno ou de uma mistura de moléculas de sesquiterpenos do precursor terpeno acíclico FPP.

(017) Como um “(+)-zizaeno sintase” ou como um “polipeptídeo que tenha a atividade de um (+)-zizaeno sintase”, queremos dizer aqui um polipeptídeo capaz de catalizar a síntese do (+)-zizaeno a partir do FPP. O (+)-zizaeno pode ser o único produto ou pode ser parte de uma mistura de sesquiterpenos.

(018) A capacidade de um polipeptídeo para catalizar a síntese de um sesquiterpeno em particular (por exemplo (+)-zizaeno) pode ser simplesmente confirmada executando o ensaio enzimático detalhado no Exemplo 3.

(019) De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos também devem incluir polipeptídeos truncados, desde que mantenham a sua atividade de sesquiterpeno sintase, conforme definido em qualquer uma das personalizações acima, e que compartilhe pelo menos a percentagem definida da identidade com o correspondente fragmento da SEQ ID NO:1.

(020) Como intencionado logo abaixo, “uma sequência nucleotídica obtida modificando-se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas” engloba qualquer sequência que tenha sido obtida modificando-se a sequência de SEQ ID NO:2, de SEQ ID NO:11 ou do complemento de uma destas duas sequências usando-se qualquer método conhecido na arte, por exemplo, introduzindo-se quaisquer tipos de mutações, tais como mutações de exclusão, inserção ou substituição. Exemplos de tais métodos são citados na parte da descrição em relação aos polipeptídeos variantes e os métodos para prepará-los.

(021) A percentagem de identidade entre duas sequências peptídicas ou nucleotídicas é uma função do número de aminoácidos ou resíduos de nucleotídeos que são idênticos nas duas sequências quando um alinhamento destas duas sequências foi gerado. Resíduos idênticos são definidos como resíduos que são os mesmos nas duas sequências em uma dada posição do alinhamento. A percentagem de identidade de sequência, como aqui usada, é calculada a partir do alinhamento ideal, tomando-se o número de resíduos idênticos entre duas sequências, dividindo-o pelo número total de resíduos na sequência mais curta e multiplicando-se por 100. O alinhamento ideal é o alinhamento no qual a percentagem de identidade é a mais alta possível. Podem ser introduzidos intervalos em uma ou ambas sequências em uma ou mais posições do alinhamento para se obter o alinhamento ideal. Estes intervalos são então considerados como resíduos não idênticos no cálculo da percentagem de identidade de sequência.

(022) O alinhamento com o propósito de determinar a percentagem de identidade de sequência de aminoácido ou ácido nucleico pode ser obtido de várias formas usando-se programas computacionais e, por exemplo, programas computacionais públicos disponíveis na rede mundial. De preferência, o programa BLAST (Tatiana et al, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999) definido para os parâmetros padrões, disponível no Centro Nacional de Informação em Biotecnologia (NCBI) em Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi, pode ser usado para se obter um alinhamento ideal de sequências peptídicas ou nucleotídicas e para calcular a percentagem de identidade de sequência.

(023) Um objeto da presente invenção é, portanto, um método para produzir (+)- zizaeno que compreende: a) colocar FPP em contato com pelo menos um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase e compreenda uma sequência de aminoácido pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO:1; b) opcionalmente, isolar o (+)-zizaeno produzido na etapa a).

(024) De acordo com a personalização preferida, o método é um método para produzir (+)-zizaeno como o produto principal. De acordo com uma personalização ainda mais preferida, (+)-zizaeno representa, pelo menos, 50%, preferencialmente pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90% do produto produzido pelo método da invenção.

(025) O método pode ser executado in vitro, assim como in vivo, como será explicado em detalhes adiante.

(026) O polipeptídeo a ser colocado em contato com o FPP in vitro pode ser obtido por extração de qualquer organismo que o expresse, usando-se proteína padrão ou tecnologias de extração enzimática. Se o organismo hospedeiro for um organismo unicelular ou uma célula que libera o polipeptídeo da invenção no meio de cultura, o polipeptídeo pode, simplesmente, ser coletado do meio de cultura, por exemplo, por centrifugação, opcionalmente seguido por etapas de lavagem e re-suspensão em soluções tampões adequados. Se o organismo ou célula acumula o polipeptídeo dentro de suas células, o polipeptídeo pode ser obtido pela interrupção ou lise das células e posterior extração do polipeptídeo do lisado celular.

(027) O polipeptídeo que tem uma atividade de (+)-zizaeno sintase, seja em uma forma isolada ou junto com outras proteínas, por exemplo em um extrato de proteína bruta obtida a partir de células cultivadas ou microorganismos, pode então ser suspenso em uma solução tampão de pH ideal. Se for adequado, sais, BSA e outros tipos de co-fatores enzimáticos podem ser adicionados de forma a otimizar a atividade da enzima. Condições adequadas são descritas de forma mais detalhada nos Exemplos mais adiante.

(028) O precursor FPP pode então ser adicionado à suspensão ou solução, que é então incubada em temperatura ideal, por exemplo, entre 15 e 40°C, de preferência entre 25 e 35°C, e mais preferencialmente a 30°C. Após a incubação, o (+)-zizaeno produzido pode ser isolado da solução incubada através de procedimentos padrões de isolamento, tais como extração por solvente e destilação, opcionalmente após a remoção de polipeptídeos da solução.

(029) De acordo com uma outra personalização preferida, o método de qualquer uma das personalizações acima descritas é executado in vivo. Neste caso, a etapa a) compreende cultivar um organismo hospedeiro não humano ou célula capaz de produzir FPP e transformado para expressar pelo menos um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO:1 e que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, sob condições propícias para a produção de (+)-zizaeno.

(030) De acordo com uma personalização ainda mais preferida, o método compreende ainda, antes da etapa a), transformar um organismo não humano ou célula capaz de produzir FPP com pelo menos um ácido nucleico que codifique um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO:1 e que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, de modo que tal organismo expresse tal peptídeo.

(031) Estas personalizações da invenção são particularmente vantajosas uma vez que é possível executar o método in vivo sem isolar o polipeptídeo previamente. A reação ocorre diretamente dentro do organismo ou célula transformada para expressar tal polipeptídeo.

(032) De acordo com uma particular personalização da invenção, pelo menos um ácido nucleico que codifica o (+)-zizaeno sintase compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 50%, de preferência pelo menos 55%, preferencialmente pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente ainda pelo menos 95% e ainda mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. De acordo com uma personalização ainda mais preferida, tal ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. Em uma personalização ainda mais preferida, o ácido nucleico consiste das SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas.

(033) De acordo com uma personalização ainda mais preferida, pelo menos um ácido nucleico usado em qualquer uma das personalizações acima compreende uma sequência de nucleotídeos que foi obtida modificando-se as SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. De acordo com uma ainda mais preferida personalização, tal ácido nucleico consiste de uma sequência de nucleotídeos que foi obtida modificando-se as SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas.

(034) De acordo com uma outra personalização, pelo menos um ácido nucleico é isolado da Vetiveria zizanoides.

(035) O organismo ou célula é utilizado para “expressar” um polipeptídeo, contanto que o organismo ou célula sejam transformados para abrigar um ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo, este ácido nucleico é transcrito para mRNA e o polipeptídeo é encontrado no organismo hospedeiro ou célula. O termo “expressar” engloba “expressar heterologamente” e “super expressar” para níveis de mRNA, polipeptídeo e/ou atividade enzimática, além do que é medido em um organismo ou célula não transformada. Uma descrição mais detalhada de métodos adequados para transformar um organismo hospedeiro não humano ou célula será dada adiante na parte da especificação que é dedicada à tais organismos hospedeiros não humanos ou células como objetos específicos da presente invenção e nos exemplos.

(036) Um organismo ou célula particular é entendido ser “capaz de produzir FPP” quando produz FPP naturalmente ou quando não produz FPP naturalmente, mas é transformado para produzir FPP, ou antes da transformação com um ácido nucleico, como aqui descrito, ou junto com tal ácido nucleico. Organismos ou células transformados para produzir uma maior quantidade de FPP do que o que ocorre naturalmente no organismo ou célula também estão englobados nos “organismos ou células capazes de produzir FPP”. Os métodos para transformar organismos, por exemplo microorganismos, para que produzam FPP já são conhecidos na arte. Tais métodos podem, por exemplo, ser encontrados na literatura, por exemplo, nas seguintes publicações: Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D., and Keasling, J.D. Nat Biotechnol., 2003, 21(7), 796-802 (transformação de E. coli); Wu, S., Schalk, M., Clark, A., Miles, R.B., Coates, R., and Chappell, J., Nat Biotechnol., 2006, 24(11), 1441-1447 (transformação de plantas); Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, B. T., McMullin, T., Song, L., Maurina-Brunker, J., Rosson, R., Noel, J., Chappell, J, Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(1), 170-181 (transformação de levedura).

(037) Para executar a invenção in vivo, o organismo hospedeiro ou célula é cultivada sob condições propícias para a produção de (+)-zizaeno. Desta forma, se o hospedeiro for uma planta transgênica, ótimas condições de crescimento são fornecidas, tal como luz ideal, água e nutrientes, por exemplo. Se o hospedeiro for um organismo unicelular, as condições propícias para a produção de (+)-zizaeno podem incluir a adição de co-fatores adequados para o meio de cultura do hospedeiro. Além disto, o meio de cultura pode ser selecionado de modo a maximizar a síntese do (+)-zizaeno. Condições ideais de cultura são descritas de uma forma mais detalhada nos Exemplos.

(038) Os organismos hospedeiros não humanos, desejáveis para executar o método da invenção in vivo, podem ser quaisquer organismos multicelulares ou unicelulares não humanos. Em uma personalização preferida, o organismo hospedeiro não humano usado para realizar a invenção in vivo é uma planta, um procarioto ou um fungo. Qualquer planta, procarioto ou fungo pode ser usado. Plantas particularmente úteis são aquelas que naturalmente produzem altas quantidades de terpenos. Em uma personalização mais preferida, a planta é selecionada da família da Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Malvaceae, Asteraceae ou Lamiaceae. Por exemplo, a planta é selecionada a partir do gênero Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (rapé), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodão), Artemisia, Salrota e Mentha. De preferência a planta pertence à espécie da Nicotiana tabacum.

(039) Em uma personalização mais preferida o organismo hospedeiro não humano usado para executar o método da invenção in vivo é um microorganismo. Qualquer microorganismo pode ser usado mas, de acordo com uma personalização ainda mais preferida, tal microorganismo é uma bactéria ou levedura. Mais preferencialmente, tal bactéria é a E. coli e a levedura é a Saccharomyces cerevisiae.

(040) Alguns destes organismos não produzem FPP naturalmente. Para serem adequados para executar o método da invenção, estes organismos têm de ser transformados para produzir tal precursor. Eles podem ser transformados ou antes da modificação com o ácido nucleico, descrito de acordo com qualquer uma das personalizações acima, ou simultaneamente, conforme explicado acima.

(041) Células eucarióticas superiores isoladas também podem ser usadas, ao invés de organismos completos, como hospedeiros para realizar o método da invenção in vivo. Células eucarióticas superiores adequadas podem ser quaisquer células não humanas, mas, de preferência, células de planta ou fungo.

(042) De acordo com uma personalização preferida, pelo menos um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, usado em qualquer uma das personalizações acima descritas, ou codificado pelo ácido nucleico, usado em qualquer uma das personalizações acima descritas, que compreenda uma sequência de aminoácido pelo menos 55%, de preferência pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 65%, de preferência pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, de preferência pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e ainda mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO:1. De acordo com uma personalização mais preferida, tal polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1. Em uma personalização ainda mais preferida tal polipeptídeo consiste de SEQ ID NO:1.

(043) De acordo com uma outra personalização preferida, pelo menos um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, usado em qualquer uma das personalizações acima descritas, ou codificado por um ácido nucleico, usado em qualquer uma das personalizações acima descritas, que compreenda uma sequência de aminoácido que é uma variante de SEQ ID NO:1 obtida por engenharia genética. Em outros termos, tal polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido codificado por uma sequência de nucleotídeos que foi obtida modificando-se as SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. De acordo com uma personalização ainda mais preferida, pelo menos um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, usado em qualquer uma das personalizações acima citadas, ou codificado por um ácido nucleico, usado em qualquer uma das personalizações acima citadas, consiste de uma sequência de aminoácidos que é uma variante de SEQ ID NO:1 obtida por engenharia genética, ou seja, uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos que foi obtida modificando-se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas.

(044) Como aqui usado, o polipeptídeo é concebido como um polipeptídeo ou fragmento de peptídeo que compreende as sequências de aminoácidos aqui identificadas, assim como polipeptídeos truncados ou variantes, contanto que mantenham sua atividade, como acima definido, e que compartilhem pelo menos a percentagem de identidade definida com o correspondente fragmento da SEQ ID NO:1.

(045) Exemplos de polipeptídeos variantes são proteínas de ocorrência natural que resultam de eventos de splicing (corte e emenda) alternativo do mRNA ou clivagem da forma proteolítica dos polipeptídeos aqui descritos. Variações atribuídas à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N- ou C- em expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais do polipeptídeo da invenção. Os polipeptídeos codificados por um ácido nucleico, obtidos por mutação natural ou artificial de um ácido nucleico da invenção, como descrito posteriormente, também são englobados pela invenção. Por exemplo, como detalhado no Exemplo 4, abaixo, a SEQ ID NO:11 é uma variante da SEQ ID NO:2, obtida por mutação artificial da SEQ ID NO:2, levando a um sequência de nucleotídeos que é otimizada para a expressão em E. coli e que codifica o mesmo (+)-zizaeno sintase como SEQ ID NO:2 (ou seja. SEQ ID NO:1). As sequências SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:11 são 76% idênticas.

(046) As variantes de polipeptídeo resultantes de uma fusão de sequências adicionais de peptídeos nas extremidades terminais amino e carboxila também podem ser usadas nos métodos da invenção. Em particular, tal fusão pode melhorar a expressão dos polipeptídeos, ser útil na purificação da proteína ou melhorar a atividade enzimática do polipeptídeo em um ambiente desejado ou sistema de expressão. Tais sequências adicionais de peptídeos podem ser peptídeos sinais, por exemplo. Desta forma, a presente invenção engloba métodos que usam polipeptídeos variantes, tais como aqueles obtidos pela fusão com outro oligo- ou polipeptídeo e/ou aqueles que estão ligados aos peptídeos sinais. Os polipeptídeos que resultam de uma fusão com outra proteína funcional, tal como outra proteína da rota de biossíntese de terpeno, podem também, vantajosamente, serem usados nos métodos da invenção.

(047) De acordo com outra personalização, pelo menos um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, usado em qualquer uma das personalizações acima descritas, ou codificado por um ácido nucleico, usado em qualquer uma das personalizações acima descritas, é isolado da Vetiveria zizanoides.

(048) Uma ferramenta importante para executar o método da invenção é o próprio polipeptídeo. Um polipeptídeo que tenha uma atividade do (+)-zizaeno sintase e que compreenda uma sequência de aminoácidos pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO:1 é, portanto, outro objeto da presente invenção.

(049) De acordo com uma personalização preferida, o polipeptídeo é capaz de produzir (+)-zizaeno como principal produto. De acordo com uma ainda mais preferida personalização, ele é capaz de produzir uma mistura de sesquiterpenos onde o (+)-zizaeno representa pelo menos 60%, de preferência pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90% dos sesquiterpenos produzidos.

(050) De acordo com uma personalização mais preferida, o polipeptídeo tem uma atividade de (+)-zizaeno sintase.

(051) De acordo com uma personalização preferida, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 55%, de preferência pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e ainda mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO:1. De acordo com uma personalização mais preferida, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1. De acordo com uma personalização ainda mais preferida, o polipeptídeo consiste de SEQ ID NO:1.

(052) De acordo com outra personalização preferida, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é uma variante de SEQ ID NO:1 obtida por engenharia genética. Em outros termos, tal polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos que foi obtida modificando-se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. De acordo com uma mais preferida personalização, o polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase consiste de uma sequência de aminoácidos que é uma variante de SEQ ID NO:1 obtida por engenharia genética, ou seja, uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos que foi obtida modificando-se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas.

(053) De acordo com outra personalização, o polipeptídeo é isolado da Vetiveria zizanoides.

(054) Como aqui usado, o polipeptídeo é concebido como um polipeptídeo ou fragmento de peptídeo que engloba as sequências de aminoácidos identificadas aqui, assim como polipeptídeos truncados ou variantes, contanto que mantenham sua atividade, como acima definido, e que compartilhem pelo menos a percentagem de identidade definida com o fragmento correspondente da SEQ ID NO:1.

(055) Exemplos de polipeptídeos variantes são proteínas de ocorrência natural que resultam de eventos de splicing (corte e emenda) alternativo do mRNA ou clivagem da forma proteolítica dos polipeptídeos aqui descritos. Variações atribuídas à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N- ou C- em expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais do polipeptídeo da invenção. Os polipeptídeos codificados por um ácido nucleico, obtidos por mutação natural ou artificial de um ácido nucleico da invenção, como descrito posteriormente, também são englobados pela invenção. Por exemplo, como detalhado no Exemplo 4, abaixo, a SEQ ID NO:11 é uma variante da SEQ ID NO:2,obtida por mutação artificial da SEQ ID NO:2, levando a um sequência de nucleotídeos que é otimizada para a expressão em E. coli e que codifica o mesmo (+)-zizaeno sintase como SEQ ID NO:2 (ou seja, SEQ ID NO:1). As sequências SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:11 são 76% idênticas.

(056) As variantes de polipeptídeo resultantes de uma fusão de sequências adicionais de peptídeos nas extremidades terminais amino e carboxila também são englobados pelos polipeptídeos da invenção. Em particular, tal fusão pode melhorar a expressão dos polipeptídeos, ser útil na purificação da proteína ou melhorar a atividade enzimática do polipeptídeo em um ambiente desejado ou sistema de expressão. Tais sequências adicionais de peptídeos podem ser peptídeos sinais, por exemplo. Desta forma, a presente invenção engloba variantes dos polipeptídeos da invenção, tais como aquelas obtidas pela fusão com outro oligo- ou polipeptídeo e/ou aquelas que estão ligados aos peptídeos sinais. Os polipeptídeos que resultam de uma fusão com outra proteína funcional, tal como outra proteína da rota de biossíntese de terpeno, também são englobados pelos polipeptídeos da invenção.

(057) Como mencionado acima, o acido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção é uma ferramenta útil para modificar organismos hospedeiros não humanos ou células destinadas a serem usadas quando o método é executado in vivo.

(058) Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das personalizações acima descritas é, portanto, também um objeto da presente invenção.

(059) De acordo com uma personalização preferida, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 50%, de preferência pelo menos 55%, preferencialmente pelo menos 60%, de preferência pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e mais ainda de preferência 98% idêntica à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. De acordo com uma personalização mais preferida, o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. De acordo com uma personalização ainda mais preferida, o ácido nucleico consiste de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas.

(060) De acordo com outra personalização, o ácido nucleico é isolado da Vetiveria zizanoides.

(061) O ácido nucleico da invenção pode ser definido como o que inclui polímeros deoxiribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, tanto na forma simples com na forma de dupla fita (DNA e/ou RNA). O termo “sequência de nucleotídeos” também deve ser entendido como compreendendo uma molécula de polinucleotídeo, ou uma molécula de oligonucleotídeo, na forma de um fragmento separado ou como um componente de um ácido nucleico maior. Os ácidos nucleicos da invenção também englobam certas sequências de nucleotídeos isolados, incluindo aquelas que estão consideravelmente livres do material endógeno contaminante. O ácido nucleico da invenção pode ser truncado, contanto que codifique um polipeptídeo abrangido pela presente invenção, como acima descrito.

(062) De acordo com uma personalização mais preferida, pelo menos um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das personalizações acima, compreende uma sequência de nucleotídeos que tenha sido obtida modificando-se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas. Preferencialmente, tal ácido nucleico consiste de uma sequência de nucleotídeos que tenha sido obtida modificando-se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11 ou o complemento destas.

(063) Os ácidos nucleicos que compreendem uma sequência obtida pela mutação das SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, ou o complemento destas, estão englobados pela invenção, contanto que as sequências compartilhem pelo menos a percentagem de identidade definida com os correspondentes fragmentos das SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, ou o complemento destas, e contanto que codifiquem um polipeptídeo que tenha uma atividade do (+)-zizaeno sintase, como definido em qualquer uma das personalizações acima. Mutações podem ser quaisquer tipos de mutações destes ácidos nucleicos, tais como mutações de ponto, mutações de deleção, mutações de inserção e/ou mutações de alteração de quadro. Um ácido nucleico variante pode ser preparado de forma a adaptar sua sequência de nucleotídeos a um sistema de expressão específico. Por exemplo, sistemas de expressão bacteriano são conhecidos por expressar de forma mais eficiente polipeptídeos se os aminoácidos estão codificados por um códon preferencial. Devido à degeneração do código genético, onde mais de um códon pode codificar o mesmo aminoácido, múltiplas sequências de DNA podem ser códigos para o mesmo polipeptídeo, todas estas sequências de DNA sendo englobadas pela invenção.

(064) Outra importante ferramenta para transformar organismos hospedeiros ou células adequadas para executar o método da invenção in vivo é um vetor de expressão que compreenda um ácido nucleico de acordo com qualquer personalização da invenção. Tal vetor também é, portanto, um objeto da presente invenção.

(065) Um “vetor de expressão”, como aqui usado, inclui qualquer vetor linear ou circular recombinante, incluindo, mas não limitado a, vetores virais, bacteriófagos e plasmídeos. A pessoa qualificada é capaz de selecionar um vetor adequado de acordo com o sistema de expressão. Em uma personalização, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico da invenção, operavelmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora, que controla o início e/ou término da transcrição e/ou tradução, tal como um promotor para transcrição, ou operador, ou melhorador, ou um sítio de ligação do mRNA ribossomal e, opcionalmente, incluindo pelo menos um marcador de seleção. As sequências de nucleotídeos são “operavelmente ligadas” quando a sequência reguladora funcionalmente se relacionada com o ácido nucleico da invenção.

(066) Os vetores de expressão da presente invenção podem ser usados nos métodos para preparar um organismo hospedeiro geneticamente transformado e/ou célula, em organismos hospedeiros e/ou células que abrigam ácidos nucleicos da invenção e nos métodos para produzir ou preparar polipeptídeos que tenham uma atividade do (+)-zizaeno sintase, como divulgado mais abaixo.

(067) Organismos hospedeiros recombinantes não humanos e células transformadas para abrigar pelo menos um ácido nucleico da invenção, de modo que expresse heterologamente ou super expresse pelo menos um polipeptídeo da invenção, são também ferramentas bastante úteis para executar o método da invenção. Tais organismos hospedeiros não humanos e células são, portanto, outros objetos da presente invenção.

(068) Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das personalizações acima descritas, pode ser usado para transformar os organismos hospedeiros não humanos e células e o polipeptídeo expresso pode ser qualquer um dos polipeptídeos acima descritos.

(069) Os organismos hospedeiros não humanos da invenção podem ser quaisquer organismos multicelular ou unicelular. Em uma personalização preferida, o organismo hospedeiro não humano é uma planta, um procarioto ou um fungo. Qualquer planta, procarioto ou fungo é adequado para ser transformado de acordo com a presente invenção. As plantas particularmente úteis são aquelas que naturalmente produzem altas quantidades de terpenos. Em uma personalização mais preferida, a planta é selecionada da família da Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Malvaceae, Asteraceae ou Lamiaceae. Por exemplo, a planta é selecionada a partir do gênero Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (rapé), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodão), Artemisia, Salrota e Mentha. De preferência a planta pertence à espécie da Nicotiana tabacum.

(070) Em uma personalização mais preferida, o organismo hospedeiro não humano é um microorganismo. Qualquer microorganismo é adequado para a presente invenção, mas, de acordo com uma personalização ainda mais preferida, tal microorganismo é uma bactéria ou levedura. Mais preferencialmente, tal bactéria é a E. coli e tal levedura é Saccharomyces cerevisiae.

(071) Células eucarióticas superiores isoladas podem também ser transformadas, ao invés de organismos completos. Como células eucarióticas superiores, queremos dizer aqui, qualquer célula eucariótica não humana, exceto células de levedura. As células eucarióticas superiores preferidas são células de planta ou fungo.

(072) O termo “transformado” se refere ao fato de que o hospedeiro foi submetido à engenharia genética para incorporar uma, duas ou mais cópias de cada um dos ácidos nucleicos necessários em qualquer uma das personalizações acima descritas. De preferência o termo “transformado” se refere a hospedeiros que expressam heterologamente os polipeptídeos codificados por um ácido nucleico com o qual eles são transformados, assim como super expressam tais polipeptídeos. Desta forma, em uma personalização, a presente invenção fornece um organismo transformado, no qual os polipeptídeos são expressos em maior quantidade do que no mesmo organismo, porém não transformado.

(073) Existem vários métodos conhecidos na arte para a criação de organismos hospedeiros transgênicos ou células, tais como plantas, fungos, procariotos, ou culturas de células eucarióticas superiores. Clonagem e vetores de expressão adequados para uso com hospedeiros celulares bacteriano, de fungo, de levedura e de mamífero são descritos, por exemplo, em Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, New York and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Clonagem e vetores de expressão para plantas superiores e/ou células vegetais, em particular, estão disponíveis para pessoa qualificada. Veja, por exemplo, Schardl et al. Gene 61: 1-11, 1987.

(074) Métodos para transformar organismos hospedeiros ou células para abrigar ácidos nucleicos transgênicos são familiares para uma pessoa qualificada. Para a criação de plantas transgênicas, por exemplo, métodos atuais incluem: eletroporação de protoplastos vegetais, transformação mediada por lipossomas, transformação mediada por agrobacterium, transformação mediada por polietilenoglicol, bombardeamento de partículas, microinjeção de células vegetais, e transformação com uso de vírus.

(075) Em uma personalização, DNA transformado é integrado em um cromossomo de um organismo hospedeiro não humano e/ou célula, de tal forma que resulte em um sistema recombinante estável. Qualquer método de integração cromossômica, conhecido na arte, pode ser usado na prática da invenção, incluindo, mas não limitado a troca de cassete mediada por recombinase (RMCE), inserção de sítio cromossômico viral específico, adenovírus e injeção pronuclear.

(076) A fim de executar o método para produzir (+)-zizaeno in vitro, como exposto acima, é muito vantajoso fornecer um método para preparar pelo menos um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)- zizaeno sintase, como descrito em qualquer personalização da invenção. Desta forma, a invenção fornece um método para produzir pelo menos um polipeptídeo, de acordo com qualquer personalização da invenção, que compreende: a) cultivar um organismo hospedeiro não humano ou célula de acordo com qualquer personalização da invenção; b) isolar o polipeptídeo a partir do organismo hospedeiro não humano ou célula cultivada na etapa a).

(077) De acordo com uma personalização preferida, tal método compreende ainda, antes da etapa a), transformar um organismo hospedeiro não humano ou célula com pelo menos um ácido nucleico, de acordo com qualquer personalização da invenção, de tal forma que o organismo expresse o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico.

(078) Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das personalizações acima descritas pode ser usado.

(079) A transformação e cultivo do organismo hospedeiro não humano ou célula podem ser realizados como descrito acima para o método de produção de (+)- zizaeno in vivo. A etapa b) pode ser executada usando-se qualquer técnica bem conhecida na arte para isolar um polipeptídeo específico a partir de um organismo ou célula.

(080) Um “polipeptídeo variante”, como aqui referido, significa um polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase e seja consideravelmente homólogo ao polipeptídeo, de acordo com qualquer personalização acima, mas que tenha uma sequência de aminoácidos diferente daquela codificada por qualquer uma das sequências de ácido nucleico da invenção, por causa de uma ou mais exclusões, inserções ou substituições.

(081) As variantes podem incluir sequências substituídas de forma conservadora, o que significa que um dado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo que tenha características físico-químicas semelhantes. Exemplos de substituições conservadoras incluem substituição de um resíduo alifático por outro, tal como Ile, Val, Leu, ou Ala de um por outro, ou substituições de um resíduo polar por outro, como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gln e Asn. Veja Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-Wesley Pub. Co. Os efeitos de tais substituições podem ser calculados usando-se matrizes de pontuação de substituição, tal como um PAM-120, PAM-200, e PAM-250, como discutido em Altschul, J. Mol. Biol., 1991, 219, 555-565. Outras substituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras que tenham características semelhante de hidrofobicidade são bem conhecidas.

(082) Peptídeos variantes de ocorrência natural também são englobados pela invenção. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de splicing alternativo do mRNA ou da clivagem proteolítica dos polipeptídeos aqui descritos. As variações atribuídas à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N- ou C- da expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais dos polipeptídeos codificados pelas sequências da invenção.

(083) As variantes dos polipeptídeos da invenção podem ser usadas para atingir, por exemplo, uma desejada melhoria ou redução da atividade enzimática, região química ou estereoquímica modificada ou utilização de substrato alterado ou distribuição de produto, aumento de afinidade para o substrato, melhoria de especificidade para a produção de um ou mais compostos desejados, aumento da velocidade de reação da enzima, maior atividade ou estabilidade em um meio específico (pH, temperatura, solvente, etc), ou um nível de expressão melhorada em um sistema de expressão desejado. Uma variante ou um local mutante controlado pode ser preparado por qualquer método conhecido na arte. As variantes e derivados dos polipeptídeos nativos podem ser obtidos isolando-se as variantes de ocorrência natural, ou a sequência de nucleotídeos das variantes, de outra ou das mesmas linhas ou espécies vegetais, ou por programações artificiais de mutações de sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos da invenção. As alterações da sequência de aminoácidos podem ser acompanhadas por qualquer um de uma série de métodos convencionais.

(084) As variantes dos polipeptídeos que resultam de uma fusão de sequências adicionais de peptídeos nas extremidades terminais amino e carboxila dos polipeptídeos da invenção podem ser usadas para aumentar a expressão dos polipeptídeos, serem úteis na purificação da proteína ou melhorar a atividade enzimática do polipeptídeo no ambiente desejado ou sistemas de expressão. Tais sequências adicionais de peptídeos podem ser peptídeos sinais, por exemplo. Assim, a presente invenção engloba variantes de polipeptídeos da invenção, tais como aqueles obtidos pela fusão com outro oligo- ou polipeptídeos e/ou aqueles que estão ligados ao peptídeos sinais. A fusão de polipeptídeos englobada pela invenção também compreende a fusão de peptídeos que resultem de uma fusão de outras proteínas funcionais, como outras proteínas da rota da biossíntese do terpeno.

(085) Portanto, em uma personalização, a presente invenção fornece um método para preparar uma variante de polipeptídeo que tenha uma atividade de (+)-zizaeno sintase, como descrita em qualquer uma das personalizações acima, e que compreenda as etapas de: (a) selecionar um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das personalizações acima expostas; (b) modificar o ácido nucleico selecionado para obter pelo menos um ácido nucleico mutante; (c) transformar células hospedeiras ou organismos unicelulares com a sequência de ácido nucleico mutante para expressar um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico mutante; (d) triagem do polipeptídeo para pelo menos uma propriedade modificada e; (e) opcionalmente, se o polipeptídeo não tiver a atividade de um variante desejado do (+)-zizaeno sintase, repetir as etapas de (a) a (d) até que seja obtido um polipeptídeo com a atividade de um variante desejado do (+)-zizaeno sintase. (f) opcionalmente, se um polipeptídeo que tenha a atividade de um variante desejado do (+)-zizaeno sintase for identificado na etapa (d), isolar o ácido nucleico mutante correspondente obtido na etapa (c).

(086) De acordo com uma incorporação preferida, o polipeptídeo variante preparado é capaz de produzir (+)-zizaeno como o produto principal. De acordo com uma personalização ainda mais preferida, ele é capaz de produzir uma mistura de sesquiterpenos onde o (+)-zizaeno representa pelo menos 60%, de preferência pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90% dos sesquiterpenos produzidos.

(087) Na etapa (b), um grande número de sequências de ácido nucleico mutante pode ser criada, por exemplo, por mutagênese aleatória, mutagênese sítio específica, ou embaralhamento de DNA. Os procedimentos detalhados para embaralhamento genético são encontrados em Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA., 1994, 91(22): 10747-1075. Em resumo, o embaralhamento de DNA se refere a um processo de recombinação aleatória de conhecidas sequências in vitro, que envolve pelo menos dois ácidos nucleicos selecionados para recombinação. Por exemplo, as mutações podem ser introduzidas em locais especiais sintetizando-se oligonucleotídeos que contenham uma sequência mutante, flanqueados por sítios de restrição que permitem a ligação à fragmentos da sequência nativa. Após a ligação, a sequência resultante reconstruída codifica um análogo que tenha a inserção, substituição ou exclusão do aminoácido desejado. Alternativamente, os procedimentos de mutagênese controlada de oligonucleotídeo- sítio específica podem ser empregados para fornecer um gene alterado onde códons pré-determinados podem ser alterados por substituição, exclusão ou inserção.

(088) Desta forma, o polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO:1 pode ser recombinado com qualquer outro sesquiterpeno sintase que codifique ácidos nucleicos, por exemplo, isolados de um organismo que não a Veriveria zizanoides. Assim, os ácidos nucleicos mutantes podem ser obtidos e separados, usados para transformar uma célula hospedeira de acordo com um procedimento padrão, por exemplo, como divulgado nos exemplos.

(089) Na etapa (d), o polipeptídeo obtido na etapa (c) é selecionado para pelo menos uma propriedade modificada, por exemplo, uma desejada atividade enzimática modificada. Exemplos de atividades enzimáticas desejadas, para as quais um polipeptídeo expresso pode ser selecionado, incluem aumento ou redução da atividade enzimática, como medido pelo valor KM ou Vmax, região química ou estereoquímica modificada e utilização de substrato alterado ou distribuição de produto. A seleção da atividade enzimática pode ser realizada de acordo com procedimentos familiares ao profissional qualificado e aqueles divulgados nos presentes exemplos.

(090) A etapa (e) sustenta a repetição das etapas (a)-(d), que pode, de preferência, ser executada em paralelo. Desta forma, pela criação de um número significante de ácidos nucleicos mutantes, muitas células hospedeiras podem ser transformadas com diferentes ácidos nucleicos mutantes ao mesmo tempo, levando em conta a subsequente triagem para um elevado número de polipeptídeos. As chances de se obter um desejado polipeptídeo variante podem, assim, ser aumentadas a critério do profissional qualificado.

(091) Todas as publicações mencionadas nesta aplicação estão incorporadas por referência e descrevem os métodos e/ou materiais em conexão com as publicações citadas.

Descrição dos desenhos

(092) Figura 1: Análise de GC-MS de sesquiterpenos produzidos pela Vetiveria zizanoides (+)-zizaeno sintase (VzZS). A, cromatograma de íon total total. B, espectro de massa do pico principal (1). C, espectro de massa de um autêntico (+)- zizaeno padrão. O pico 1 foi identificado como o (+)-zizaeno. Os picos 2, 3 e 4 foram identificados como prezizaeno, α-funebreno e β-funebreno, respectivamente. Os picos marcados com S são compostos de sesquiterpeno não identificados.

(093) Figura 2: Estrutura dos principais compostos de sesquiterpenos produzidos pela Vetiveria zizanoides (+)-zizaeno sintase (VzZS).

(094) Figura 3: Perfil do produto obtido pela produção de (+)-zizaeno in vitro (A) e in vivo (B). O pico principal em cada análise é (+)-zizaeno.

Personalizações específicas da invenção ou Exemplos

(095) Agora a invenção será descrita com mais detalhes por meio dos seguintes

Exemplos. Exemplo 1

(096) Extração de RNA e construção da biblioteca de cDNA

(097) As plantas de Vetiver (Vetiveria zizanoides) foram obtidas a partir do viveiro de plantas (The Austral Plants Company, Les Avirons, The Reunion Island, France). As plantas foram cultivadas em vasos em uma casa de vegetação na Lullier Agronomy research Station (Switzerland) e foi propagada vegetativamente pela divisão em grupos de seis meses a um ano. Para a colheita das raízes, as plantas foram removidas dos vasos e lavadas com água da torneira.

(098) Para a preparação da biblioteca do cDNA, as raízes de várias plantas foram combinadas: (de 4 a 6 meses após a propagação), plantas antigas com um sistema de raiz bem desenvolvido (1 a 2 anos após propagação) e plantas jovens secas em temperatura ambiente por 24 a 36 horas após remoção dos vasos. As raízes foram cortadas a partir da parte aérea das plantas e congeladas em nitrogênio líquido. Primeiramente elas foram grosseiramente cortadas em nitrogênio líquido usando-se um Waring Blendor (Waring Laboratory, Torrington, USA) e então moídas a um fino pó usando-se um almofariz e um pilão. O RNA total foi extraído seguindo-se o procedimento descrito em Kolosova et al (Kolosova, Miller, Ralph, Ellis, Douglas, Ritland and Bohlmann, Isolation of high-quality RNA from gymnosperm and angiosperm trees. J. Biotechniques, 36(5), 821-4, 2004) com as seguintes modificações. Um volume de 20mL de tampão de extração foi usado para 2 gramas de tecido moído e o tampão de extração foi suplementado com 2% (w/v) de PVP (polivinilpirrolidona, Sigma-Aldrich). Para a extração do CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio, Sigma-Aldrich), o ácido nucleico projétil foi ressuspenso em 2 ml de tampão TE (Tris-HCl 10mM, pH 8, EDTA 1mM) e a extração foi executada com 2 ml de NaCl 5M e 1ml de CTAB 10%. Para a precipitação de isopropanol, o ácido nucleico projétil foi dissolvido em 500 μl de TE. O projétil final de RNA foi ressuspenso em 50 μl de água.

(099) Uma biblioteca de cDNA fita dupla foi preparada usando-se o kit de síntese de cDNA SMART™ PCR (Clontech Laboratories, Mountain View, CA), de acordo com as instruções do fabricante e usando-se a RNAse H transcriptase reversa SuperScript™ II (Invitrogen, Carlsbad, CA) para a etapa de transcrição reversa. Uma quantidade de 1 μg de RNA de tecido subterrâneo total de vetiver foi usado como molde para a síntese de cDNA e 15 ciclos foram executados para o procedimento de amplificação. A biblioteca foi carregada sobre um gel de agarose 1% e os fragmentos de tamanhos de 1.3 a 3 Kb foram eluídos. Para o sequenciamento, 270 ng desta biblioteca de cDNA foram usados.

Exemplo 2

(0100) Sequenciamento da biblioteca de cDNA e amplificação de um cDNA sesquiterpeno sintase

(0101) A tecnologia de sequenciamento paralelo maciço de pequenos fragmentos de DNA desenvolvida pela Illumina (San Diego, California) foi usada para sequenciar toda a biblioteca de cDNA. A preparação do DNA para sequenciamento, o sequenciamento e a montagem das leituras foram executadas pela Fasteris SA (Plan-les-Ouates, Switzerland). A biblioteca de cDNA foi tratada seguindo o kit Genomic Sample Prep (Illumina) e sequenciada no sistema Genome Analyzer (Illumina). Um total de 4.2 milhões de 35 bp foram obtidos (dos quais 3.6 milhões foram sequências únicas). Estas leituras foram montadas usando-se EDENA 2.1.1, um software que localiza sobreposições entre as leituras e a montagem de novo contigs (Hernandez D., François P., Farinelli L., 0sterâs M., and Schrenzel J., De novo bacterial genome sequencing: Millions of very short reads assembled on a desktop computer. Genome Res. 18(5), 802-809, 2008). Após eliminar contigs menores do que 100 bases, 4324 contigs únicos foram obtidos com um comprimento máximo de 1882 bp. Outra montagem foi executada usando-se o programa Velvet 1.0 (Zerbino and Birney (2008), Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs Genome Res. 18(5), 821-829), fornecendo 9264 contigs únicos de comprimento entre 100 e 2006 bases.

(0102) Todos os contigs gerados foram comparados com um banco de dados de uma sequência de proteína (contendo uma seleção de 7000 sequências de proteína vegetal), usando-se o algorítmo Blastx (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990). Os contigs que mostraram significante homologia de sequência com os sesquiterpenos sintases vegetais foram retidos e a homologia ainda confirmada realizando-se, para cada contig selecionado, uma busca nas sequências de proteína não redundante no NCBI (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Desta maneira, 15 contigs foram confirmados como sendo fragmentos de sesquiterpenos que codificam cDNA.

(0103) Um dos contigs selecionados (VzCtg306, SEQ ID NO:3) foi de comprimento1090 bp e as comparações de sequência com terpeno sintase com comprimento completo mostraram que as extremidades 3’e 5’estavam faltando. Dois iniciadores frente (ctg306-3R1 (SEQ ID NO:4) e ctg306-3R2 (SEQ ID NO:5)) e dois iniciadores reversos (ctg306-5R1 (SEQ ID NO:6) e ctg306-5R2, (SEQ ID NO:7)) foram designados a partir desta sequência e usados para a amplificação rápida das extremidades do cDNA (RACE). O kit de amplificação do cDNA SMARTTM RACE (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) foi usado com a transcriptase reversa PrimeScript (TaKaRa Bio, Shiga, Japan). Desta forma, um conjunto de cDNA de SMARTTM 5’RACE-Ready e SMARTTM 3’RACE-Ready foi preparado, cada um a partir de 1.2 μg de RNA total de raiz de vetiver. Para o 5’RACE, uma primeira rodada de PCR foi realizada com o iniciador UPM (Clontech Laboratories) e o iniciador ctg306-5R1 (SEQ ID NO:6) seguido por uma segunda rodada de PCR com o iniciador NUP (Clontech Laboratories) e o iniciador ctg306-5R2 (SEQ ID NO:7). Para o 3’RACE, uma primeira rodada de PCR foi executada com o iniciador UPM (Clontech Laboratories) e o iniciador ctg306-3R1 (SEQ ID NO:4) seguido por uma segunda rodada de PCR com o iniciador NUP (Clontech Laboratories) e o iniciador ctg306-3R2 (SEQ ID NO:5). As amplificações foram realizadas nas condições detalhadas no manual do fabricante (Clontech).

(0104) A combinação do RACE 5’ e 3’permitiu a reconstituição de um cDNA 1925 bp (VzZS, SEQ ID NO:8) contendo um quadro de leitura aberta de 1668 bp (SEQ ID NO:2) codificando para uma proteína de comprimento de 555 aminoácidos (SEQ ID NO:1).

Exemplo 3

(0105) Expressão heteróloga e caracterização da enzima

(0106) O quadro de leitura aberta (VzZS-ORF, SEQ ID NO:2) com comprimento completo VzZS foi amplificado a partir de um conjunto de cDNA SMARTTM 5’RACE- Ready, usando-se o iniciador ctg306-iniciar (SEQ ID NO:9) e ctg306-cessar (SEQ ID NO:10). A amplificação deste cDNA para as construções de expressão foi realizada usando-se a Pfu DNA polimerase (Promega, Madison, WI, USA), em um volume final de 50 μl contendo 5 μl de Pfu DNA polimerase tampão 10X, cada dNTP 200 μM, cada iniciador frente e reverso 0.4 μM, 2.9 unidades de Pfu DNA polimerase e 2.5 μl do cDNA (preparado como acima descrito). As condições térmicas do ciclo foram: 1.5 minutos a 95°C; 30 ciclos de 45 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C e 4 minutos a 72°C; e 10 minutos a 72°C.

(0107) Os produtos do PCR foram inseridos no vetor pET101/D-TOPO usando-se o Kit Champion pET101 Directional TOPO Expression (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo-se as instruções do fabricante. Vários clones foram selecionados e os plasmídeos inseridos sequenciados para confirmar que a sequência era idêntica à sequência obtida pelo RACE.

(0108) O plasmídeo pET101-VzZS foi usado para transformar as células de E. Coli Bl21(DE3) (Novagen, Madison, WI). Colônias ímpares de células transformadas foram usadas para inocular 5 ml de meio LB. Após 5 a 6 horas de incubação a 37°C, as culturas foram transferidas para uma incubadora a 20°C e deixadas por 1 hora para equilíbrio. A expressão da proteína foi então induzida pela adição de IPTG 1 mM e a cultura foi incubada durante a noite a 20°C. No dia seguinte, as células foram coletadas por filtração, ressuspendidas em 0.1 volume de MOPSO 50 mM pH 7, glicerol 10% e lisadas por sonicação. Os extratos foram clareados por centrifugação (30 minutos a 20,000 g) e o sobrenadante, contendo as proteínas solúveis, foi usado para experimentos adicionais.

(0109) Os extratos brutos de proteína de E coli, contendo a proteína recombinante, foram usados para a caracterização das atividades enzimáticas. Farnesil difosfato (FPP) foi sintetizado como descrito por Keller, R.K., and Thompson, R., J. Chromatogr. 645(1), 161-167, 1993. Os ensaios foram executados em 1 a 4 mL de MOPSO 50 mM pH 7, glicerol 10%, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM na presença de 10 a 100 μM de substrato e 0.1 a 0.5 mg de proteína bruta. Os tubos foram incubados de 12 a 24 horas a 30°C e extraídos duas vezes com um volume de pentano. Após a concentração sob um fluxo de nitrogênio, os extratos foram analisados por GC e GC-MS e comparados aos extratos do ensaio com as proteínas de controle. A análise de GC foi executada em um sistema GC Agilent 6890 Series equipado com um detector de ionização de chama usando-se coluna capilar SPB-1 de 30m com diâmetro interno de 0.25 mm (Supelco, Bellefonte, PA). O gás de arraste foi o He a um fluxo constante de 1 mL/min. A temperatura inicial do forno foi de 80°C (1 min de espera) seguido por um gradiente de 10°C/min a 300°C. A análise de GC-MS foi executada nas mesmas condições e o espectro foi registrado em um detector de massa Agilent 5975.

(0110) Nestas condições, a proteína recombinante codificada pelo cDNA VzZS produziu um sesquiterpeno principal representando 75% da mistura de sesquiterpenos produzida. Este produto principal foi identificado como sendo (+)- zizaeno pela correspondência do espectro de massa e índice de retenção com os padrões autênticos e dados publicados (Joulain, D., and Konig, W.A., The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons, EB Verlag, Hamburg, 1998). A enzima também produziu 6.9% de prezizaeno, 2.8% de α-funebreno, 2.7% de β- funebreno e pelo menos 3 outros sesquiterpenos em proporções entre 0.85 e 8.7% (Figura 2). Assim, o cDNA VzZS, isolado da Vetiveria zizanoides, codificado para um (+)-zizaeno sintase (SEQ ID NO:1), produziu o precursor de hidrocarboneto dos sesquiterpenos mais abundantes em raízes de vetiver (Khusimol, zizaen-12-al, ácido khuzenic). A enzima também produziu como produtos secundários alguns dos precursores dos menores constituintes das raízes de vetiver.

Exemplo 4

(0111) Uso da proteína recombinante VzZS para produção in vivo do (+)- zizaeno em bactéria

(0112) Para uma expressão ideal do VzZS em E coli, a sequência de DNA do ORF do cDNA VzCtg306 foi redesenhada para levar em consideração o uso do códon hospedeiro e outros parâmetros que influenciam a estabilidade do mRNA e sua tradução. A sequência otimizada (VzZS-opt, SEQ ID NO:11) foi desenhada e sintetizada com os sítios de restrição NdeI e KpnI e as extremidades 3’ e 5’ (DNA 2.0, Menlo Park, CA, USA) e subclonada no plasmídeo pETDuet-1 (Novagene, Madison, WI) fornecendo o plasmídeo pETDuet-VzZS-opt.

(0113) Para avaliar a produção in vivo do (+)-zizaeno, células de E. coli foram transformadas com plasmídeo pETDuet-VzZS-opt e a produção de sesquiterpenos do conjunto de FPP endógenos foi avaliada. Para aumentar a produtividade das células, uma FPP sintase e os genes que codificam para uma rota de mevalonato parcial também foram expressos nas mesmas células. Mais tarde estes genes foram organizados em um operon simples e codificados para um mevalonato quinase (mvaK1), um fosfomevalonato quinase (mvaK2), um mevalonato difosfato descarboxilase (MvaD), um isopentenil difosfato isomerase (idi), um mevalonato exógeno convertido a isopentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP), os dois substratos da FPP sintase.

(0114) O gene FPP sintase de levedura foi amplificado a partir do DNA genômico do S. Cerevisiae, usando-se os iniciadores FPPy_NcoI (SEQ ID NO:12) e FPPy-Eco (SEQ ID NO:13). O DNA genômico foi isolado do S. cerevisiae usando-se o kit Qiagen RNA/DNA Maxi (Qiagen AG, Basel, Switzerland). O PCR foi executado com o Pfu DNA polimerase (Promega AG, Dubendorf, Switzerland) em um volume final de 50 μl contendo 0.4μl de cada iniciador, 200 μM de dNTPs, 0.5 μl de DNA polimerase, 5 μl de DNA genômico de S. cerevisiae. As condições do ciclo de PCR foram as seguintes: 90 segundos a 95°C; 28 ciclos de 45 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C, 4 minutos a 72°C e 10 minutos a 72°C. O DNA amplificado foi ligado como um fragmento NdeI-EcoRI no primeiro sítio de multi clonagem (MCS1) do plasmídeo pACYCDuet-1 (Novagen, Madison, WI) que fornece o plasmídeo pACYCDuet-FPPs que abriga os genes FPPs sob o controle de um promotor T7.

(0115) Um operon que contém os genes que codificam para mvaK1, mvaK2, MvaD e idi foi amplificado a partir do DNA genômico do Streptococcus pneumoniae (ATCC BAA-334, LGC Standards, Molsheim, France) com os iniciadores MVA-up1-iniciar (SEQ ID NO:14) e MVA-up2-cessar (SEQ ID NO:15). O PCR foi realizado usando-se o DNA polimerase PfuUltra™ II Fusion HS (Stratagene, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). A composição da mistura de PCR estava de acordo com as instruções do fabricante. As condições do ciclo térmico foram 2 minutos a 95°C; 30 ciclos de 20 segundos a 95°C, 20 segundos a 58°C e 90 segundos a 72°C; e 3 minutos a 72°C. O fragmento 3.8 Kb foi purificado sobre um gel de agarose e ligado usando-se o kit PCR Clonagem In-Fusion™ Dry-Down (Clontech Laboratories) em um segundo MCS do plasmídeo pACYCDuet-FPPs digerido com NdeI and XhoI que fornece o plasmídeo pACYCDuet-4506. As sequências das duas inserções foram completamente sequenciadas para excluir qualquer mutação.

(0116) Células de E. coli BL21 Star™(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram transformadas com o plasmídeo pETDuet-VzZS-opt ou co-transformadas com o mesmo plasmídeo e com o plasmídeo pACYCDuet-4506. As células transformadas foram selecionadas em placas de agarose LB com carbenicilina (50 μg/ml) e cloranfenicol (34 μg/ml). As colônias únicas foram usadas para inocular 5 mL do meio líquido LB suplementado com os mesmos antibióticos. A cultura foi incubada por toda noite a 37°C. No dia seguinte, 2 mL do meio TB suplementado com os mesmos antibióticos foram inoculados com 0.2 mL da cultura da noite. Após 6 horas de incubação a 37°C, a cultura foi resfriada para 28°C e 1 mM de IPTG, 2 mg/mL de mevalonato (preparado dissolvendo-se mevalonolactona (Sigma) em NaOH 0.5N a uma concentração de 1 g/mL e incubando-se a solução por 30 minutos a 37°C) e 0.2 ml de decano foram adicionados em cada tubo. As culturas foram incubadas por 48 horas a 28°C. As culturas foram então extraídas duas vezes com 2 volumes de acetato de etila, a fase orgânica foi concentrada para 500 μL e analisada por GC-MS como descrito no Exemplo 3. Com as células produzindo (+)-zizaeno sintase, a FPP sintase e as enzimas das quatro rotas de mevalonato, a produtividade de 0.1 mg/mL foi obtida e o perfil do produto foi idêntico aos perfis observados com os ensaios in vitro (Figura 3).

(0117) Este exemplo mostra que uma célula de E. coli transformada com um (+)- zizaeno sintase, como definido na presente invenção, é capaz de produzir (+)- zizaeno. As outras enzimas com as quais a célula de E. coli é transformada não são essenciais para a produção de (+)-zizaeno. De fato, (+)-zizaeno é também produzido quando uma célula de E. coli é transformada apenas com o (+)-zizaeno sintase, mas em menores quantidades. As outras enzimas com as quais a célula de E. coli é transformada são adicionadas apenas com o propósito de aumentar a quantidade de precursores disponíveis para o (+)-zizaeno sintase.

Exemplo 5

(0118) Uso da proteína recombinante VzZS para a produção in vivo de (+)-zizaeno em levedura

(0119) Para a produção in vivo de sesquiterpenos em células de levedura, uma cepa de Saccharomyces cerevisiae (YNP5) na qual o gene ERG9 (que codifica para o esqualeno sintase, a enzima que converte FPP para esqualeno) foi regulado para baixo substituindo o promotor nativo ERG9 pelo promotor MET3, desta forma fornecendo uma cepa com reduzida biossíntese do ergosterol e maior conjunto de FPP disponível para sesquiterpenos sintases (Asadollahi, M.A., Maury, J., M0ller., K, Nielsen, K.F., Schalk, M., Clark, A., and Nielsen, J., Biotechnology and Bioengineering 99(3), 666-677, 2008).

(0120) O cDNA VZZS foi amplificado a partir do plasmídeo pETDuet-VzZS-opt com os iniciadores Ctg306_iniciar_opt (SEQ ID NO:16) e Ctg306_cessar_opt (SEQ ID NO:17). O PCR foi executado com o Pfu DNA Polimerase (Promega) usando-se as seguintes condições de ciclo térmico: 90 segundos a 94°C; 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C, 4 minutos a 72°C; e 10 minutos a 72°C. O cDNA amplificado foi purificado e, a fim de adicionar saliências (overhangs) 3’A, foi incubada por 15 minutos a 72°C na presença de 0.2 mM de dATP e DNA polimerase1U HotStart Taq em tampão adequado (Qiagen). O cDNA foi ligado no plasmídeo pYES2.1/V5-His-TOPO® usando-se o kit pYES2.1 TOPO® TA Expression (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os plasmídeos foram selecionados para correta sequência e orientação da inserção e foram usados para transformar as células de levedura YNP5 usando-se o kit S.c. EasyComp™ Transformation (Invitrogen, Carlsbad, CA).

(0121) Uma colônia única de cepas de levedura transformadas foi usada para inocular 20 ml de meio YNB (5 g/L de (NH4)2SO4; 3 g/L de KH2PO4; 0.5 g/L de MgSO4.7 H2O; 1 mL/L de solução de metal traço) suplementado com glucose 2%. A cultura foi incubada por 24 horas a 28°C. As células foram recuperadas por centrifugação e ressuspendidas em 20 mL de meio YNB suplementado com galactose 2%. Após 1 horas de cultura, metionina em concentração final de 0.5 mM e 2 mL de decano foram adicionados à cultura. Após 24 horas de incubação a 28°C, as culturas foram extraídas com acetato de etila e analisadas por GC-MS, como descrito no Exemplo 3. A quantidade total de sesquiterpenos produzida pelas células de levedura, nestas condições, foi estimada em 25 mg/L.

Claims (11)

1. Vetor de expressão, caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico que consiste na sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11; que codifica um polipeptídio com atividade (+) - zizaeno-sintase e com sequencias de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

2. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por estar na forma de um vetor viral, um bacteriófago ou um plasmídeo.

3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo ácido nucleico está operativamente ligado a pelo menos uma sequência reguladora, que controla a iniciação e / ou a terminação da transcrição e / ou tradução, com a sequência regulatória incluindo um promotor, operador ou potencializador de transcrição, ou um local de ligação ao ribossoma de ARNm e compreendendo ainda pelo menos um marcador de seleção.

4. Microrganismo transformado, caracterizado por compreender: a) pelo menos um ácido nucleico que consiste na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11, que codifica um polipeptídio com atividade de (+) - zizaeno sintase e com sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que o referido microrganismo expressa heterologamente pelo menos um polipeptídio possuindo uma atividade (+) - zizaeno-sintase, ou b) o vetor de expressão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser uma bactéria ou levedura.

6. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida bactéria ser E. coli e a referida levedura ser Saccharomyces cerevisiae.

7. Método para a produção de (+) - zizaeno, caracterizado por compreender: a) o contato do farnesil pirofosfato (FPP) com pelo menos um polipeptídio possuindo uma atividade de (+) - zizaeno sintase e compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; b) adicionalmente isolar o (+) - zizaeno produzido no passo a).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo passo a) compreender a cultura de um microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o microrganismo produz (+) - zizaeno.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda, antes do passo a), transformar um microrganismo capaz de produzir farnesil pirofosfato (FPP) com o vector de expressão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3; ou com pelo menos um ácido nucleico, de modo que o referido organismo expresse o polipeptídio codificado pelo referido ácido nucleico, em que o ácido nucleico consiste na sequência nucleotidica de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11, que codifica um polipeptídio com atividade de (+) - zizaeno sintase e com sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

10. Método para produzir pelo menos um polipeptídio possuindo uma atividade de (+) - zizaeno sintase, caracterizado por compreender a) cultivar um microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6; b) isolar o polipeptídio do microrganismo cultivado no passo a).

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender ainda, antes do passo a), transformar um microrganismo com pelo menos um ácido nucleico que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11, que codifica um polipeptídio com atividade de (+) - zizaeno sintase e com sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que o referido organismo expressa o polipeptídio codificado pelo referido ácido nucleico.