BRPI1102880A2 - biossensor, seu uso e mÉtodo para detecÇço de Íons cÁlcio - Google Patents
biossensor, seu uso e mÉtodo para detecÇço de Íons cÁlcio Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI1102880A2 BRPI1102880A2 BRPI1102880-7A BRPI1102880A BRPI1102880A2 BR PI1102880 A2 BRPI1102880 A2 BR PI1102880A2 BR PI1102880 A BRPI1102880 A BR PI1102880A BR PI1102880 A2 BRPI1102880 A2 BR PI1102880A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- calcium
- biosensor
- solution
- protein
- ion
- Prior art date
Links
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 14
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- 239000010931 gold Substances 0.000 abstract description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 abstract description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 2
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 102000058242 S100A12 Human genes 0.000 description 11
- 108700016890 S100A12 Proteins 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- -1 (2- (bis (carboxymethyl) amino) -5'-methylphenoxy) methyl Chemical group 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 11-mercaptoundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCS GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFTFKUDGYRBSAL-UHFFFAOYSA-N 15-crown-5 Chemical compound C1COCCOCCOCCOCCO1 VFTFKUDGYRBSAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYAOREPNYXXCOA-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylundecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(S)C(O)=O DYAOREPNYXXCOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000013017 Child Nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATWXVVNLVXXTQN-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-2-[(17-nitro-2,5,8,11,14-pentaoxabicyclo[13.4.0]nonadeca-1(15),16,18-trien-18-yl)carbamoyloxymethyl]tetradecyl] n-(17-nitro-2,5,8,11,14-pentaoxabicyclo[13.4.0]nonadeca-1(15),16,18-trien-18-yl)carbamate Chemical compound O1CCOCCOCCOCCOC(C=C2[N+]([O-])=O)=C1C=C2NC(=O)OCC(C)(CCCCCCCCCCCC)COC(=O)NC(C(=C1)[N+]([O-])=O)=CC2=C1OCCOCCOCCOCCO2 ATWXVVNLVXXTQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 235000020189 fortified milk Nutrition 0.000 description 1
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001465 metallisation Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 239000002094 self assembled monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- XAGUNWDMROKIFJ-UHFFFAOYSA-J tetrapotassium;2-[2-[[8-[bis(carboxylatomethyl)amino]-6-methoxyquinolin-2-yl]methoxy]-n-(carboxylatomethyl)-4-methylanilino]acetate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].C1=CC2=CC(OC)=CC(N(CC([O-])=O)CC([O-])=O)=C2N=C1COC1=CC(C)=CC=C1N(CC([O-])=O)CC([O-])=O XAGUNWDMROKIFJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N tin dioxide Chemical compound O=[Sn]=O XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001887 tin oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
BIOSSENSOR, SEU USO E MÉTODO PARA DETECÇçO DE IONS CÁLCIO. A presente invenção se refere a um biossensor para detecção de íons metálicos, particularmente lons cálcio, utilizando um eletrodo de vidro recoberto de ouro (BK7/Au) cuja superfície foi modificada com tiois por meio da técnica de monocamadas auto-organizadas (SAMs). Sobre estas superfícies preparadas, foram imobilizadas enzimas CaGc por meio de ligação covalente entre os grupos lisinas das mesmas e os grupos terminais ativados presentes na monocamada. A detecção dos lons cálcio é realizada segundo medidas elétricas de potencial elétrico, por meio da excitação elétrica na porta de um dispositivo do tipo SEGFET.
Description
BIOSSENSOR, SEU USO E MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ÍONS CÁLCIO
Campo da invenção
A presente invenção se referé a um biossensor utilizado na detecção e quantificação de íons de cálcio, seja na área alimentícia, seja na área médica.
Descrição do estado da técnica
A imobilização de proteínas em filmes de ouro é uma técnica já conhecida que pode ser empregada para a construção de biossensores. Os biossensores possibilitam grandes avanços para a indústria de alimentos e na área ambiental, devido à capacidade de caracterização e quantificação de certos analitos de interesse.
Um biossensor é definido como um dispositivo compacto capaz de fornecer informação analítica, quantitativa ou semiquantitativa, incorporando um elemento de reconhecimento biológico intimamente ligado a um transdutor. O transdutor é capaz,de converter uma resposta-bioquímica em sinal apropriado, podendo este sinal ser: potenciométrico, amperométrico, condutométrico, óptico, piezelétrico ou entalpimétrico, segundo o princípio físico de transdução [1].
~ "Um biossensor consiste essencialmente de dois elementos: um elemento bioseletivo e um transdutor. O elemento bioseletivo pode reconhecer o analito de Jnteresse e, desta maneira, reagir ou-se ligar a ele gerando, por meio de uma" reação bioquímica, um sinal que pode ser um produto da variação de massa, absorção ou emissão de luz, emissão de calor, mudança de estado de oxidação, liberação de gases e etc. Já o elemento transdutor possibilita o controle de um processo ou fenômeno, ou pode realizar uma medição, através da conversão do sinal bioquímico em sinal elétrico.
A força motriz para o desenvolvimento de biossensores surgiu do crescente interesse na miniaturização destes dispositivos, particularmente para aplicação em sistemas de diagnóstico. Biossensores eletroquímicos são uma escolha corrente uma vez que os mesmos apresentam melhor sensibilidade e podem ser nanoestruturados.
A determinação de íons metálicos como o Cálcio é de fundamental interesse em muitos setores industriais. Um exemplo comum é a questão do leite enriquecido, importante medida adotada em programas de combate à desnutrição infantil. O íon Cálcio está presente no organismo humano em concentrações de cerca de 2% (4,5 a 5,4 mg/dL em plasma sangüíneo) sendo um fator importante na formação óssea do organismo. O íon cálcio também está presente em outros processos como coagulação sangüínea e batimento cardíaco. Ele também pode ser encontrado na urina, em concentrações variando entre 50 e 150 mg/24 hs podendo atingir até 300 mg/24 hs em dietas enriquecidas [2-3]. Ainda como íon de sinalização intracelular, o íon Ca2+ está envolvido em muitas funções celulares (como a fertilização, contração, diferenciação celular, proliferação, apoptose e até mesmo no surgimento do câncer, em casos de falta de regulação).
Os métodos usuais para detecção de íons metálicos baseiam-se em medidas de fluorescência.
A patente US 5,154,890 intitulada "Fiber optic-potassium ion sensor" descreve um sensor para detectar a concentração de íons potássio. O referido sensor compreende a molécula 2,2-bis(3,4-(15-crown-5)-2-nitrofenilcarbamoxi métiirtetrãclecánol-l^conhecida como BME-44 que complexa seletivamente os íons potássio. A molécula BME-44 se liga, através do seu sítio de ligação, a um agente fluorescente como Rodamina-B e depois é imobilizada em gel de acrilamida, complexando os íons de potássio de forma que a intensidade da fluorescência aumente. A mudança na intensidade da fluorescência é uma medida direta da concentração de íons potássio.
O primeiro indicador fluorescente de cálcio foi o 2-((2-(bis(carboximetil) amino)-5'-metilfenoxi)metil)-6-metoxi-8-(bis(carboximetil)amino)quinolina, no qual a ligação do cálcio a esta molécula causa um aumento na intensidade do sinal de fluorescência [4].
A patente US 5,496,522 intitulada "Biosensor and chemical sensor probes for calcium and other metal ions" descreve um sensor químico e sondas biosensoras para medir concentrações baixas de metais e íons metálicos em amostras complexas tais como: fluidos biológicos, células vivas e amostras ambientais. Mais especificamente, a invenção se refere a sondas ,sensoras químicas contendo o agente fluorescente lndo-1, Fura-2 e Quin-2 para medir baixas concentrações de cálcio, cádmio, magnésio e outros. Embora sensores baseados em métodos fluorimétricos sejam muito sensíveis podendo distinguir sinais inferiores a 1 μΜ, esta técnica necessita de um fluorímetro e, para uso industrial, se mostra pouco prática.
A proteína Calgranulina C recombinante (CaGC)1 também conhecida como S100A12, é uma proteína que sofre mudanças conformacionais pela ligação de cálcio, dando suporte ao seu potencial envolvimento em eventos celulares de transdução de sinal dependentes de Ca2+. In vitro, essas mudanças conformacionais sofridas pela ligação do cálcio' tomam a CáCG uma atraente' molécula para ser usada em biossensores. A CaGC possui um sítio Iigante adicional de Zn2+, comum para a maioria das proteínas da família S100 da qual
......ela faz parte. A ligação do Zn2+ induz uma profunda variação nas propriedades dá
proteína em se ligar ao Ca2+. Na ausência de Zn2+, a CaGC se liga a um íon Ca2+ por monômero, enquanto que na presença de Zn2+, a proteína se liga a dois íons por monômero, sendo consistente com a presença de dois motivos Iigantes de cálcio ("EF-hands") preditos na sua seqüência primária [5], Sendo os sítios dè -ligação dos íons cálcio e zinco separados, podemos melhorar a eficiência da ligação e, consequentemente, de detecção de cálcio quando trabalhamos na presença de zinco. Ainda é importante salientar que a CaGC não se liga a outros metais bivalentes que não sejam o cálcio, garantindo especificidade para a detecção.
O Transistor de Efeito de Campo íon-seletivo (ISFET) foi apresentado pela primeira vez por P. Bergveld, em 1970 [6]. Um ISFET é um dispositivo eletrônico íon-seletivo usado para medir íons H+ e outros íons, sendo que a troca da camada dielétrica pode melhorar a sensibilidade do dispositivo. Tal dispositivo se baseia em um MOSFET sem a metalização da porta onde a mesma é posta diretamente em contato com uma solução. Uma das desvantagens deste tipo de dispositivo é a isolação entre o dispositivo e o meio químico. Além disso, efeitos ópticos também podem comprometer a sensibilidade dos mesmos [7].
Em 1983, J. Van der Spiegel et ai publicaram o primeiro artigo utilizando üma nova configuração ao sistema proposto por Bergveld onde o FET é isolado do meio químico, o Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida (EGFET) [8],
Chi et ai propuseram uma estrutura de porta estendida separada sensível a íons H+ (SEGFET) onde a estrutura original foi dividida em duas partes: um eletrodo íon-seletivo conectado à porta, por meio de um fio metálico, de um MOSFET comercial [9-10]. Este tipo de estrutura permite uma melhor estabilidade em longo prazo e um custo baixo de produção uma vez que se utilizam dispositivos comerciais já produzidos em larga escala como elemento transdutor.
A publicação internacional WO 88/08972 descreve um instrumento de medição que possui uma proteína imobilizada, de forma reversível de ligação, _ seletiva no transistor IGFET Iocalizado em um sensor. Com o sensor imerso na" solução, a proteína liga-se a um componente selecionado da solução produzindo um efeito sobre uma corrente fluindo através do IGFET. Apesar do objetivo deste documento ser semelhante ao da presente invenção, tal documento descreve um dispositivo FET com arquitetura IGFET, onde o eletrodo está no próprio semicondutor. Já na presente invenção, é proposta * uma arquitetura SEGFET, onde o eletrodo está desacoplado do dispositivo sensor. Nesse caso, há a vantagem de termos o eletrodo livre para ser imerso na solução que se deseja detectar cálcio. Além disso, na referida publicação nâo é mencionada especificamente a proteína que estamos utilizando. Na invenção, usamos especificamente a proteína CaGC, para detecção específica de íons cálcio. Esse analito não é mencionado no referido documento.
Embora filmes finos compostos de materiais de alta impedância sejam apreciáveis a dispositivos íon-seletivos baseados em estruturas FET (ISFETs), filmes com melhor condutividade e sensibilidade se mostram mais adequados aos dispositivos do tipo SEGFET. A imobilização de uma proteína diretamente ao eletrodo de ouro revestido de uma monocamada molecular automontada funcionalizada possibilita um tempo de resposta rápido uma vez*que a resposta - do biossensor eletroquímico depende da transferência de massa do analito até o biorreceptor imobilizado.
Na literatura ainda não foram publicados biossensores específicos para íons metálicos como o Ca2+ baseados em estruturas FET com enzimas imobilizadas. Contudo, este protótipo para o sensoriamento de íons metálicos oferece vantagens, tais como: simplicidade do biossensor, possibilidade de miniaturização, portabilidade, baixo custo e a não necessidade de pessoal treinado para a utilização do mesmo. Portanto, o biossensor desenvolvido se mostra promissor para a quantificação do íon metálico Ca2+ com detecção de até " 30 vézes o valor da concentração dé cálcio nó leite"comercial (cerca de 1,2 g/L).
Sumario da invenção
A presente invenção se refere a um biossensor compreendendo uma proteína CaGC imobilizada em urna monocamada automontada de tiol, como elemento bioseletivo e um transistor de efeito de campo (FET) pelo qual as medições são realizadas, como elemento transdutor. O biossensor é utilizado para detecção específica de íons cálcio em meio aquoso.
Breve descrição das figuras
A figura 1 mostra as etapas de fabricação do biossensor.
20__________A figura 2 mostra o esquema do aparato de medição do biossensor
utilizando configuração SEGFET.
A figura 3 é um gráfico do sinal de saída expresso como uma variação de tensão em relação à quantidade de íons cálcio presentes na solução.
Descrição detalhada da invenção Preparação da proteína
A preparação da proteína é realizada mediante duas etapas principais, conforme mostrado na figura 1. Na etapa A, ocorre a formação de uma monocamada automontada de tiol, enquanto que na etapa B é realizada a imobilização da proteína CaGC por ligação covalente através da imersão do substrato em solução contendo esta proteína. ' " ~ Na etapa-Α, ο eletrodo de-vidro (ΒΚ7) recoberto com ouro,, ou seja, o
substrato de BK7/Au, previamente limpo, é imerso por 24 horas em uma solução etanólica de ácido mercaptoundecanóico a 1,5 mM (11-mercaptoundecanoic acid, MUA). Em seguida, o substrato é lavado com uma solução recém preparada de etanol:água deionizada (75:25 v/v) para a retirada do excesso de material e seco em fluxo de N2. Uma monocamada automontada de MUA é então formada. A monocamada de tiol é incubada em uma solução tampão contendo 100 mM de NHS (N-hydroxysuccinimide) e 100 mM de EDC (N-ethyl-N-(3-diethylaminopropyl) carbodiimide) por aproximadamente 16 horas, durante a noite, para a ativação dos grupos terminais da monocamada do éster de NHS.
* ^ T *
Para a imobilização covalente da CaGC (etapa B), os eletrodos* foram lavados em solução tampão e imediatamente incubados em solução enzimática de CaGC a 2 mg/mL por 3 horas. Os grupos Iisinas presentes na proteína se ligam com o éster formando uma ligação amida. A Figura 1 apresenta o esquema dos passos descritos acima.
Método de medição de cálcio usando o biossensor
A Figura 2 apresenta o esquema utilizado na transdução do biossensor. O sistema de medida (SEGFET) é constituído de um amplificador operacional de instrumentação comercial, operando como um seguidor de tensão e dé um , 20 eletrodo de referência Ag/AgCI. Assim, a tensão de entrada é igual à tensão de saída. O eletrodo de referência é aterrado e o eletrodo de trabalho é o substrato de ouro contendo a enzima imobilizada (conforme descrito acima). O circuito elétrico é, então, fechado pela imersão de ambos os eletrodos, eletrodo de trabalho e eletrodo de referência, na solução de medida (que pode ser água deionizada ou solução tampão de baixa força iônica). Após estabilização do sistema, para calibração do mesmo, alíquotas sucessivas de uma solução padrão de cloreto de cálcio, de determinada concentração, foram adicionadas à solução de medida sob agitação suave. A agitação serve para homogeneização da solução e pode ser feita por meio de uma barra magnética. As medidas foram realizadas a cada adição de solução contendo íons cálcio, após homogeneização da solução, sendo o sinal de saída expresso como uma variação de tensão que é proporcional à quantidade de íons cálcio presentes na solução (figura 3). Mais especificamente, a detecção dos íons cálcio é realizada segundo medidas elétricas de potencial elétrico, por meio da excitação elétrica na porta do dispositivo SEGFET, sendo o sinal resultante representado por uma curva Diferença de Potencial Elétrico em Relação ao Branco (solução isenta do íon) em relação ao Tempo, onde após adição de amostras do analito, há o aparecimento de picos intensos dos quais podem ser relacionados com as concentrações dos analitos em um simples eixo de coordenadas do tipo AV versus Concentração. Quanto mais íons cálcio são capturados pela proteína, mais alta é a carga elétrica que esses íons geram na superfície do eletrodo e maior o valor da corrente. Embora o sistema apresente sinal após a primeira adição de solução, verificou-se que o sistema pode ser quantitativo apenas para a primeira adição. O sinal de< resposta (VO) foi mêdidópor meio"de uni mültímetro digital conectado à saída do amplificador operacional de instrumentação e foi expresso pela variação de .tensão com o tempo. _ _
Na figura 2 são mostradas as conexões do amplificador operacional de instrumentação e o esquema de medição.
As etapas de medição podem, portanto, ser definidas pela: a) adição de alíquota de solução padrão de cloreto de cálcio; b) homogeneização da solução por agitação mecânica; c) tomada da medida.
Referencias
1. IUPAC: http://old.iupac.org/reports/1999/7112thevenot/, último acesso 19/07/2010.
2. Onifade, K. U., Mohammad, Α. A., Petersen, J. R. and Okorodudu, A.
O. Ionized calcium: indications and advantages of its measurement, J. Lab. Med. 29(4) (2005), pp. 235-240.
3. Heilberg, I. P. and Schor, N. Calculose renal: causas, avaliação e tratamento médico, Arq. Bras. Endocrinol. Metab. 50(4) (2006), pp. 823-831. 4. Tsien1 R. Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures, Biochemistry 19(11) (1980), pp. 2396-2404.
5. EC. DeirAngeIica1 C.H. Schleicher, J.A. Santome, Primary structure and binding proteins of cargranulin C, a novel SIOO-Iike calcium-binding protein
from pig granulocytes, J. Biol. Chem. 269 (1994) 28929-28936.
6. BERGVELD, P. Development of an ion sensitive solid-state device for neurophysiological measurements, IEEE Trans. Biomed. Eng. BME-17, p. 70-71, 1970.
7. Chou, J. C., Chang, J. L., Wu, C. L. pH and procaine characteristics of the extended gate field effect transistor based on ITO glass Jpn. J. Appl. Phys.
44 (2005), pp.4838-4842. · -
8. Van der Spiegel, J.; Lauks, I.; Chan, D. Babic, P. Study on extended gate field effect transistor with tin oxide sensing membrane. Sens. Act. B 4 (1983), pp. 291-298: ---------------------------------
9. Chi, L. L., Yin, L. T., Chou, J. C., Chung, W. Y., Sun, T. P., Hsiung, K.
P., Hsiung, S. K. Study on separative structure of EnFET to detect acetylcholine, Sens. Act. B 71 (2000), pp. 68-72.
10. Chi, L. L., Chou, J. C., Chung, W. Y., Sun, T. P., Hsiung, S. K. Study on extended gate field effect transistor with tin oxide sensing membrane, Mater. Chem. Phys. 63 (2000), pp. 15-23.
Claims (5)
1. Biossensor para detecção de íons cálcio caracterizado por compreender um elemento bioseletivo e um transdutor.
2. Biossensor1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do elemento bioseletivo ser a proteína CaGC imobilizada em monocamada automontada de tiol.
3. Biossensor1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do transdutor ser um dispositivo SEGFET.
4. Método de medição de cálcio utilizando o biossensor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por compreender as*etapas de: a) adicionar alíquotas de solução padrão de cloreto de cálcio; b) homogeneizar a solução por agitação mecânica; e c) fazer a tomada da medida.
5. Uso do biosensor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por ser para a medição de cálcio.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI1102880-7A BRPI1102880B1 (pt) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | Biossensor e método para detecção de íons cálcio |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI1102880-7A BRPI1102880B1 (pt) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | Biossensor e método para detecção de íons cálcio |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI1102880A2 true BRPI1102880A2 (pt) | 2013-07-16 |
| BRPI1102880B1 BRPI1102880B1 (pt) | 2022-06-28 |
Family
ID=48771091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI1102880-7A BRPI1102880B1 (pt) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | Biossensor e método para detecção de íons cálcio |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BRPI1102880B1 (pt) |
-
2011
- 2011-06-29 BR BRPI1102880-7A patent/BRPI1102880B1/pt active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI1102880B1 (pt) | 2022-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ayankojo et al. | Molecularly imprinted polymer based electrochemical sensor for quantitative detection of SARS-CoV-2 spike protein | |
| Han et al. | Designed antifouling peptides planted in conducting polymers through controlled partial doping for electrochemical detection of biomarkers in human serum | |
| Huang et al. | Impedance biosensor for peanut protein Ara h 1 | |
| Diouf et al. | Development and characterization of an electrochemical biosensor for creatinine detection in human urine based on functional molecularly imprinted polymer | |
| Jolly et al. | Label-free impedimetric aptasensor with antifouling surface chemistry: A prostate specific antigen case study | |
| EP3586115B1 (en) | Analyte detector for detecting at least one analyte in at least one fluid sample | |
| Limbut et al. | A reusable capacitive immunosensor for carcinoembryonic antigen (CEA) detection using thiourea modified gold electrode | |
| US6322963B1 (en) | Sensor for analyte detection | |
| Gonçalves et al. | Detection of DNA and proteins using amorphous silicon ion-sensitive thin-film field effect transistors | |
| Hasanzadeh et al. | Mesoporous silica materials for use in electrochemical immunosensing | |
| Arkan et al. | Multiwall carbon nanotube-ionic liquid electrode modified with gold nanoparticles as a base for preparation of a novel impedimetric immunosensor for low level detection of human serum albumin in biological fluids | |
| Qu et al. | A micro-potentiometric hemoglobin immunosensor based on electropolymerized polypyrrole–gold nanoparticles composite | |
| Sarangadharan et al. | Rapid detection of NT-proBNP from whole blood using FET based biosensors for homecare | |
| CN105651840A (zh) | 一种检测β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法 | |
| Luo et al. | Direct detection of doxorubicin in whole blood using a hydrogel-protected electrochemical aptamer-based biosensor | |
| Shi et al. | A one-piece lateral flow impedimetric test strip for label-free clenbuterol detection | |
| Rezaei et al. | Immobilization of specific monoclonal antibody on Au nanoparticles for hGH detection by electrochemical impedance spectroscopy | |
| Duran et al. | Development of an electrochemical impedimetric immunosensor for Corticotropin Releasing Hormone (CRH) using half-antibody fragments as elements of biorecognition | |
| Gutiérrez-Sanz et al. | Transistor-based immunosensing in human serum samples without on-site calibration | |
| Allafchian et al. | Flower-like self-assembly of diphenylalanine for electrochemical human growth hormone biosensor | |
| Aydın et al. | Ultrasensitive detection of interleukin 1α using 3-phosphonopropionic acid modified FTO surface as an effective platform for disposable biosensor fabrication | |
| TWI475227B (zh) | 具有共價鍵結電子傳導分子之抗體探針晶片 | |
| Azzouzi et al. | Spatially hierarchical nano-architecture for real time detection of Interleukin-8 cancer biomarker | |
| Sharma et al. | Electrochemical impedance immunosensor for the detection of cardiac biomarker Myogobin (Mb) in aqueous solution | |
| Park et al. | Fabrication and characteristics of MOSFET protein chip for detection of ribosomal protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 4A ANUIDADE. |
|
| B08G | Application fees: restoration [chapter 8.7 patent gazette] | ||
| B15K | Others concerning applications: alteration of classification |
Ipc: A61B 5/00 (1968.09), G01N 17/00 (1968.09) |
|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06V | Preliminary requirement: patent application procedure suspended [chapter 6.22 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 29/06/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |