BRPI1103669A2

BRPI1103669A2 - bactéria produtora de l-aminoácido, e, método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BRPI1103669A2
Authority: BR
Inventors: Mikhail Yurievich Kiryukhin; Mikhail Markovich Gusyatiner
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2012-12-04

Abstract

BACTéRIA PRODUTORA DE L-AMINOáCIDO, E, MéTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOáCIDO. A presente invenção proporciona um método para produzir L-aminoácido usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia ou Pantoea, que foi modificada para acentuar a expressão do gene bssR que codifica regulador de biopelícula por meio de secreção de sinal.

Description

"BACTÉRIA PRODUTORA DE L-AMINOÁCIDO, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO"

Campo técnico

A presente invenção refere-se à indústria microbiológica, e, particularmente, a um método para produzir um L-aminoácido usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae que foi modificada para acentuar a expressão do gene bssR. Este gene codifica um regulador de biopelícula por meio de secreção de sinal.

Arte anterior

Convencionalmente, L-aminoácidos são produzidos industrialmente por meio de métodos de fermentação usando cepas de microorganismos obtidas de fontes naturais, ou mutantes dos mesmos. Tipicamente, os microorganismos são modificados para incrementar os rendimentos de produção de L-aminoácidos.

Foram reportadas muitas técnicas para incrementar a produção de rendimentos de L-aminoácidos, incluindo a transformação de microorganismos com DNA recombinante (Patam 4.278.765). Outras técnicas para aumentar os rendimentos de produção incluem incrementar as atividades de enzimas envolvidas na biossíntese de aminoácidos e/ou dessensibilização das enzimas-alvo à inibição de feedback causada pelos L- aminoácidos resultantes (Patentes dos Estados Unidos nums. 4.346.170, 5.661.012 e 6.040.160).

Os genes yliH e yceP são induzidos na formação de biopelículas de Eseheriehia eoli (Ren, D., et ai., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 64: 515-524). Mostrou-se que a deleção de yceP (bl060) e yliH (.b0836) aumenta a formação de biopelícula em câmaras de fluxo contínuo com meio mínimo de glicose via incremento da massa de biopelícula, cobertura superficial, e espessura média. Para determinar a base genética deste aumento na formação de biopelícula, examinou-se perfis de expressão de genes diferenciais em biopelículas quanto a ambos os mutantes, relativamente à cepa de tipo selvagem, em meio rico de glicose, e verificou-se que de 372 a 882 genes foram induzidos consistentemente, e que de 76 a 337 foram reprimidos consistentemente. O aumento da formação de biopelícula foi relacionado com a expressão diferencial de genes relacionados com a resposta ao estresse (de 8 a 64 genes) para ambos os mutantes. Mais importante, de 42 a 130 genes foram relacionados com a sinalização celular de autoindutor-2, e também foram expressos diferencialmente. Estes genes também foram relacionados com a sinalização do indol, porque de 17 a 26 genes relacionados com indol foram expressos diferencialmente. A formação incrementada de biopelícula nos mutantes yliH e yceP em LB suplementado com glicose a 0,2 % (LB glu) ocorre por meio de uma redução das concentrações de indol extracelulares e intracelulares em ambos os mutantes (de 50 a 140 vezes), e a adição de indol à cultura restaurou o fenótipo de formação de biopelícula de tipo selvagem; consequentemente, o indol reprime biopelículas. Ambos os mutantes regulam a formação de biopelícula por meio de sensor de quorum [<quorum sensing], porque a deleção de yliH ou yceP aumentou as concentrações extracelulares de autoindutor-2 em 50 vezes quando desenvolvidos em meio complexo (o mais notavelmente na fase estacionária). Ambas as proteínas estão envolvidas na regulação de motilidade, por que as proteínas YliH (127 aminoácidos) e YceP (84 aminoácidos) reprimem a motilidade de duas a sete vezes em LB. Foram propostos novos nomes para estes dois Ioci: bssR para yliH e bssS para yceP, com base na expressão "regulador de biopelícula por meio de secreção de sinal". (DomkaJ., et.al., Appl. Environ. Microbiol.;72f4):2449-59Í2006V).

No entanto, correntemente, não tem havido relatos de incremento da expressão do gene bssR com o objetivo de produzir L- aminoácidos.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO Aspectos da presente invenção incluem o incremento da produtividade de cepas que são capazes a produzir L-aminoácidos e proporcionar um método para produzir um L-aminoácido usando-se estes cepas.

Os aspectos acima foram alcançados ao se verificar que o incremento da expressão do gene bssR pode incrementar a produção de L- aminoácidos, como L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, L-arginina, L- citrulina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

A presente invenção proporciona uma bactéria da família Enterobacteriaceae apresentando uma capacidade incrementada de produzir aminoácidos, como L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, L-arginina, , L- citrulina, L-omitina, L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

E um aspecto da presente invenção proporcionar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae, sendo que referida bactéria foi modificada para acentuar a expressão do gene bssR.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referida expressão é incrementada mediante modificação de uma seqüência de controle de expressão do gene bssR.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referida bactéria pertence ao gênero Escherichia.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referida bactéria é Escherichia coli. Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referida bactéria pertence ao gênero Pantoea.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referido L- aminoácido é selecionado do grupo que consiste de um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não-aromático.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referido L- aminoácido aromático é selecionado do grupo que consiste de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referido L- aminoácido não-aromático é selecionado do grupo que consiste de L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L- histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L- glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, L-arginina, L-citrulina, e L-ornitina.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria como descrita acima, sendo que referido L- aminoácido é L-arginina.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar a bactéria como descrita acima em um meio de cultura, e recolher referido L-aminoácido do meio.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar o método como descrito acima, sendo que referido L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste de um L-aminoácido aromático e um L- aminoácido não-aromático.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar o método como descrito acima, sendo que referido L-aminoácido aromático é selecionado do grupo que consiste de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar o método como descrito acima, sendo que referido L-aminoácido não-aromático é selecionado do grupo que consiste de L-treonina, L-lisina, L- cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, L-arginina, L-citrulina, e L-ornitina.

Constitui um aspecto adicional da presente invenção proporcionar o método como descrito acima, sendo que referido L-aminoácido é L-arginina.

DESCRIÇÃO DE CONCRETIZAÇÕES

1. Bactéria A bactéria de acordo com o objeto presentemente revelado é uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae, sendo que a bactéria foi modificada de forma a acentuar a expressão do gene bssR.

A expressão "bactéria produtora de L-aminoácido" pode significar uma bactéria que apresenta uma capacidade de produzir e excretar um L-aminoácido em um meio, quando a bactéria é cultivada no meio.

O termo "bactéria produtora de L-aminoácido" também pode significar uma bactéria que é capaz de produzir e causar o acúmulo de um L- aminoácido em um meio de cultura numa quantidade maior do que uma cepa de tipo selvagem ou parental de uma bactéria da família Enterobacteriaceae, por exemplo, E. coli, como E. coli K-12, e pode significar que o microorganismo é capaz de causar acúmulo, em um meio, de uma quantidade não inferior a 0,5 g/l, em outro exemplo não inferior a 1,0 g/l, do L- aminoácido alvo. A bactéria pode produzir um tipo de L-aminoácido ou mistura de dois ou mais tipos de L-aminoácidos.

O termo "L-aminoácido" inclui, por exemplo, L-alanina, L- arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L- glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina.

O termo "L-aminoácido aromático" inclui, por exemplo, L- fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano. O termo "L-aminoácido não- aromático" inclui, por exemplo, L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L- asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, e L-arginina. L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-leucina, L-histidina, L-ácido glutâmico, L-fenilalanina, L-triptofano, L-prolina, e L-arginina são exemplos particulares.

A família Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencentes aos gêneros Eseherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc. Especificamente, é possível usar aquelas classificadas nas Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information [Centro Nacional para Informação de Biotecnologia) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id:=:543). Uma bactéria pertencente ao gênero Eseherichia ou Pantoea são exemplos particulares.

A expressão "uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia" pode significar que a bactéria é classificada no gênero Eseherichia de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na arte da microbiologia. Exemplos de uma bactéria pertencente ao gênero Eseherichia incluem, mas sem limitação, Eseherichia coli (E. colí). A bactéria pertencente ao gênero Escherichia não é particularmente limitada, contudo, por exemplo, é possível usar bactérias descritas por Neidhardt, F.C. et ai. (Eseheriehia eoli e Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1).

A expressão "uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea" pode significar que a bactéria é classificada como o gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na arte da microbiologia. Algumas espécies de Enterobacter agglomerans têm sido reclassificadas recentemente em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou análogos, com base na análise de seqüências de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

A expressão "a bactéria foi modificada para acentuar a expressão do gene" pode significar que a expressão do gene é maior do que aquela de uma cepa não-modificada, por exemplo, uma cepa de tipo selvagem. Exemplos de referida modificação incluem aumentar o número de cópias do gene expresso por célula, aumentar o nível de transcrição do gene, aumentar o nível de tradução do mRNA transcrito do gene, e assim por diante. A quantidade do número de cópias de um gene expresso é medido, por exemplo, por meio de restrição do DNA cromossômico seguido de Southern blotting usando uma sonda baseada na seqüência gênica, hibridação in situ por fluorescência direta (FISH), e análogos. O nível de transcrição gênica pode ser medido por meio de vários métodos conhecidos incluindo manchamento Northern blotting, RT-PCR quantitativa, e análogos. O nível de tradução do mRNA, ou a quantidade do produto gênico pode ser medida por meio de vários métodos conhecidos incluindo Western blotting usando-se anticorpos. Análise por manchamento Western blotting também reflete o nível de transcrição juntamente com o nível de tradução. Adicionalmente, cepas de tipo selvagem que podem atuar como um controle incluem, por exemplo, Escherichia eoli K-12 ou Pantoea ananatis FERM BP-6614.

O gene bssR (sinônimos: yliH, b0836) codifica o regulador da formação de biopelícula BssR. O gene bssR (nucleotídeos de 877.471 a877.854; n° de acesso GenBank NC_000913.2; gi:49175990) encontra-se localizado entre o gene rimO, orientado na direção oposta, e o gene ylil no cromossomo de E. eoli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene bssR e a seqüência de aminoácidos da proteína BssR codificadas pelo gene bssR são mostradas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Como pode haver algumas diferenças em seqüências de DNA entre os gêneros ou cepas da família Enterobaeteriaeeae, o gene bssR a ser modificado para acentuar sua expressão não é limitado ao gene mostrado na SEQ ID No:l, mas pode incluir genes homólogos à SEQ ID No:l. Portanto, a variante de proteína codificada pelo gene bssR pode apresentar uma homologia não inferior a 80 %, em outro exemplo não inferior a 90 %, em outro exemplo não inferior a 95 %, em outro exemplo não inferior a 98 %, e em outro exemplo não inferior a 99 %, com relação à seqüência de aminoácido inteira mostrada na SEQ ID NO. 2, desde que a variante de proteína apresente a atividade da proteína BssR. O termo "homologia" pode significar "identidade".

A expressão "variante de proteína" pode significar proteínas que apresentam em suas seqüências, quer sejam deleções, inserções, adições, ou substitutições de um ou vários aminoácidos. O número de alterações nas proteínas variantes depende da posição na estrutura tridimensional da proteína ou do tipo de radicais de aminoácidos. Ele pode ser de 1 a 30, em outro exemplo de 1 a 15, e em outro exemplo de 1 a 5 na SEQ ID NO: 2. Estas alterações nas variantes podem ocorrer em regiões da proteína que não são críticas para a estrutura tridimensional da proteína. Isto se deve ao fato de que alguns aminoácidos apresentam elevada homologia entre si, de forma que a estrutura tridimensional não é afetada por uma alteração do tipo referido. A homologia entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinada usando-se métodos bem conhecidos, por exemplo, o programa de computador BLAST 2.0, que calcula três parâmetros: escore, identidade e similaridade.

A substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários radicais de aminoácidos deveria(m) ser mutação/mutações conservativa(s) de forma a manter a atividade. A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie, substituição de lie, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de lie, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

Além disso, o gene bssR pode ser uma variante que hibridiza em condições estringentes com a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeos, desde que codifique uma proteína BssR funcional. "Condições estringentes" incluem aquelas em que um híbrido específico, por exemplo, um híbrido apresentando homologia não inferior a 60 %, em outro exemplo não inferior a 70 %, em outro exemplo não inferior a 80 %, em outro exemplo não inferior a 90 %, em outro exemplo não inferior a 95 %, em outro exemplo não inferior a 98 %, e em outro exemplo não inferior a 99 %, é formado; e um híbrido não-específico, por exemplo, um híbrido apresentando homologia inferior à acima, não é formado. Por exemplo, condições estringentes podem ser exemplificadas por meio de lavagem uma vez ou mais, ou em outro exemplo, duas ou três vezes, a uma concentração de sal de 1ÕSSC, 0,1 % de SDS, ou em outro exemplo, 0,10 SSC, 0,1 % de SDS a 6tfC. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para o manchamento e, via de regra, deveria ser o que é recomendado pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana de nylon Hybond™ (Amersham) em condições estringentes é de 15 minutos. A etapa de lavagem pode ser realizada de 2 a 3 vezes. O comprimento da sonda pode ser selecionado vantajosamente dependendo das condições de hibridização, e é usualmente de 100 bp a 1 kbp.

Métodos de incrementar a expressão gênica incluem aumentar o número de cópias do gene. A introdução de um gene em um vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria da família Enterobacteriaceae aumenta o número de cópias do gene. É possível usar vetores com baixo número de cópias. Exemplos de vetores com baixo número de cópias incluem, mas sem limitação, pSClOl, pMW118, pMW119, e análogos. O termo "vetor com baixo número de cópias" é usado para vetores, cujo número de cópias é de até5 cópias por célula. No entanto, também é possível usar vetores com elevado número de cópias, como plasmídeos derivados de pBR.

O incremento da expressão gênica também pode ser obtido introduzindo-se múltiplas cópias do gene em um cromossomo bacteriano por meio de, por exemplo, recombinação homóloga, integração do Mu, ou análogos. Por exemplo, um ato de integração do Mu permite a introdução de até 3 cópias do gene em um cromossomo bacteriano.

O aumento do número de cópias de um gene também pode ser alcançado introduzindo-se múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico da bactéria. Para introduzir múltiplas cópias do gene em um cromossomo bacteriano, a recombinação homóloga é realizada usando-se múltiplas cópias de uma seqüência como alvos no DNA cromossômico. Seqüências apresentando múltiplas cópias no DNA cromossômico incluem, mas sem limitação DNA repetitivo, ou repetições invertidas presentes na extremidade de um elemento transponível. Da mesma forma, é possível incorporar o gene em um transpóson, e permitir que o mesmo seja transferido para introduzir múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico.

O aumento da expressão gênica também pode ser obtido modificando-se uma seqüência de controle de expressão do gene, como promotor, terminador e seqüência Shine-Dalgarno (SD) sequence, por exemplo, por meio de colocação do gene objeto sob o controle de um promotor potente. Por exemplo, o promotor Iac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor PR, ou os promotores Pl do fago lambda são, todos, conhecidos por serem promotores potentes. O uso de um promotor potente pode ser combinado com a multiplicação de cópias de genes. Alternativamente, o efeito de um promotor pode ser acentuado, por exemplo, por meio da introdução de uma mutação no promotor para incrementar o nível de transcrição de um gene localizado a jusante do promotor. Adicionalmente, é de conhecimento geral que a substituição de vários nucleotídeos na região espaçadora entre o sítio de ligação do ribossoma (RBS, ribosome binding site) e o códon de iniciação, particularmente as seqüências imediatamente a montante do cóton de iniciação, podem afetar profundamente a traduzibilidade do mRNA. Por exemplo, encontrou-se uma faixa de 20 vezes nos níveis de expressão, dependendo da natureza dos três nucleotídeos que precedem o códon de iniciação (Gold et al, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al, EMBO J., 3, 623-629, 1984).

Além disso, também é possível introduzir uma substituição de nucleotídeo na região promotora de um gene no cromossomo bacteriano, o que resulta em uma função promotora mais forte. A alteração da seqüência de controle de expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira que a substituição do gene usando um plasmídeo sensível a temperatura, como divulgado no WO 00/18935 e JP 1-215280 A.

Métodos para a preparação de DNA plasmídico, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador \primer], e análogos podem ser ordinariamente métodos bem conhecidos por alguém com prática na arte. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E.F., e Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Bactérias produtoras de L-aminoácido

Como uma bactéria de acordo com o objeto presentemente revelado que é modificada de forma a acentuar a expressão do gene bssR, é possível usar bactérias que são capazes de produzir L-aminoácidos aromáticos ou não-aromáticos.

A bactéria de acordo com o objeto presentemente revelado pode ser obtida acentuando-se a expressão do gene bssR em uma bactéria que possui inerentemente a capacidade de produzir L-aminoácido. Alternativamente, a bactéria de acordo com o objeto presentemente revelado pode ser obtida conferindo-se a capacidade de produzir L-aminoácido a uma bactéria que já apresenta a expressão acentuada do gene bssR.

Bactérias produtoras de L-treonina

Exemplos de bactérias produtoras de L-treonina ou cepas parentais, que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- treonina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente dos Estados Unidos n° 5.175.107, Patente dos Estados Unidos n° 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente dos Estados Unidos n°5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente dos Estados Unidos n5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente dos Estados Unidos n° 5.474.918), E. coli FERM ΒΡ-3519 e FERM ΒΡ-3520 (Patente dos Estados Unidos n°5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em Russo),14,947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), e análogos.

A cepa TDH-6 é deficiente de gene thrC, e também é assimilativa de sacarose, e o gene ilvA apresenta uma mutação hipomórfica. Esta cepa também apresenta uma mutação no gene rhtA, que confere resistência a elevadas concentrações de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 que foi obtido inserindo-se um óperon thrA*BC que inclui um gene mutante thrA no vetor derivado de RSFl010. Este gene mutante thrA codifica aspartoquinase homosserina desidrogenase I que apresenta inibição de feedback substancialmente dessensibilizada pela treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no All- Union Scientific Center of Antibiotics (Rússia, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) [Coleção nacional russa de microorganismos industriais] (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso B-3996.

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) também pode ser usada como uma cepa parental para derivar bactérias produtoras de L-treonina. A cepa B-5318 é prototrópica com relação à isoleucina, e um repressor de fago- lambda Cl sensível à temperatura e promotor PR substitui a região reguladora do óperon treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VICPM B-5318 foi depositado na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 3 de maio de 1990 sob número de acesso de VKPM B-5318.

A bactéria pode ser modificada adicionalmente para acentuar a expressão de um ou mais dos seguintes genes:

- o gene thrA mutante que codifica para aspartoquinase homosserina desidrogenase I resistente a inibição de feedback por treonina; - o gene thrB que codifica para homosserina quinase;

- o gene thrC que codifica para treonina sintase;

- o gene rhtA que codifica para uma proteína de transmembrana putativa;

- o gene asd que codifica para aspartato-P-semialdeído desidrogenase; e

- o gene aspC que codifica para aspartato aminotransferase (aspartato transaminase);

O gene thrA que codifica aspartoquinase homosserina desidrogenase I de Escherichia colijá foi elucidado (posições de nucleotídeos de 337 a 2799, n° de acesso GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA encontra-se localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. eoli K-12. O gene thrB que codifica homosserina quinase de Eseheriehia eoli foi elucidado (posições de nucleotídeos de 2801 a 3733, n° de acesso GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrB encontra-se localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. eoli K-12. O gene thrC que codifica treonina sintase de Escherichia eoli foi elucidado (posições de nucleotídeos de 3734 a 5020, n° de acesso GenBank NC_000913.2, gi:49175990). O gene thrC encontra-se localizado entre o gene thrB e a matriz de leitura aberta yaaX no cromossomo de E. eoli K-12. Todos os três genes funcionam como um óperon de treonina simples. Para acentuar a expressão do óperon de treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é removida desejavelmente do óperon (W02005/049808, W02003/097839).

Um gene thrA mutante que codifica para aspartoquinase homosserina desidrogenase I resistente a inibição de feedback por treonina, bem como os genes thrB e thrC, podem ser obtidos como um óperon do bem conhecido plasmídeo pVIC40 que está presente na cepa VKPM B-3996 de E. eoli produtora de treonina. O plasmídio pVIC40 é descrito detalhadamente na Patente dos Estados Unidos n° 5.705.371. O gene rhtA existe a 18 min no cromossomo de E. coli próximo do óperon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico à ORPl (genQybiF, posições de nucleotídeos de 764 a 1651, número de acesso GenBank AAA218541, gi:440181) e encontra-se localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa uma proteína codificada pela ORFl foi designada o gene rhtA (rht: resistência à homosserina e treonina). Da mesma forma, revelou-se que a mutação rhtA23 é uma substituinte de A-por-G na posição 1 com relação ao códon de iniciação ATG (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology em conjugação com Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia, agosto de 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

O gene asd de E. coli já foi elucidado (posições de nucleotídeos de 3572511 a 3571408, n° de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por meio de PCR (reação em cadeia da polimerase; referir a White, T.J. et ai., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira similar.

Da mesma forma, o gene aspC de E. coli já foi elucidado (posições de nucleotídeos de 983742 a 984932, n° de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16128895), e pode ser obtido por meio de PCR. Os genes aspC de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira similar.

Bactérias produtoras de L-Iisina

Exemplos de bactérias produtoras de L-Iisina pertencentes ao gênero Escherichia incluem mutantes apresentando resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-Iisina inibe o crescimento de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, mas esta inibição é totalmente ou parcialmente dessensibilizadda quando a L-lisina está presente no meio. Exemplos do análogo de L-Iisina incluem, mas sem limitação, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), γ-metil-lisina, a- clorocaprolactama etc. Mutantes apresentando resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se bactérias pertencentes ao gênero Escherichia a um tratamento convencional de mutagênese artificial. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-Iisina incluem Eseheriehia eoli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente dos Estados Unidos n° 4.346.170) e Eseheriehia eoli VL611. Nestes microorganismos, a dessensibilização de feedback de aspartoquinase por L- lisina é dessensibilizada.

A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-Iisina de Eseheriehia eoli. Esta cepa bacteriana foi cultivada conferindo- se resistência a AEC à cepa W3110, que foi derivada de Eseheriehia eoli K- .12. A cepa resultante foi designada como cepa AJ13069 de Eseheriehia eoli e foi depositada no National Institute of Bioseienee and Human-Teehnology, Ageney of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso FERM P-14690. Em seguida, foi convertida a um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de .1995, e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (Patente dos Estados Unidos n° 5.827.698).

Exemplos de bactérias produtoras de L-Iisina ou cepas parentais, que podem ser ser usados para derivar bactérias produtoras de L- lisina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-Iisina são acentuados. Exemplos de referidos genes incluem, mas sem limitação, genes que codificam diidrodipicolinato sintase (dapA), aspartoquinase (IysC), diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (lysÂ), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patam 6,040,160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). Adicionalmente, as cepas parentais podem apresentar expressão incrementada do gene envolvido na eficiência energética {cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente dos Estados Unidos n° 5.830.716), o genQybjE (W02005/073390), ou combinações dos mesmos.

Exemplos de cepas parentais, que podem ser usados para derivar bactérias produtoras de L-Iisina também incluem cepas apresentando atividade diminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa uma reação para gerar um composto diferente da L-Iisina por meio de ramificação secundária da via biossintética da L-lisina. Exemplos das enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto diferente da L-lisina por meio de ramificação secundária da via biossintética da L-lisina incluem homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (Patente dos Estados Unidos n° 5.827.698), e a enzima málica (W02005/010175).

Bactérias produtoras de L-cisteína

Exemplos de bactérias produtoras de L-cisteína ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- cisteína incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli JM15 que é transformada com diferentes alelos cysE que codificam para serina acetiltransferases resistentes a feedback (Patente dos Estados Unidos n° 6.218.168, pedido de patente russa 2003121601); E. coli W3110 apresentandos genes superexpressos que codificam proteínas vantajosas para secretar substâncias tóxicas para células (Patente dos Estados Unidos n° 5.972.663); cepas de E. coli apresentando atividade reduzida de cisteína dessulfoidrase (JP11155571A2); E. coli W3110 com atividade incrementada de um regulador transcricional positivo para o régulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WOO127307Al), e análogos.

Bactérias produtoras de L-Ieucina

Exemplos de bactérias produtoras de L-Ieucina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-Ieucina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como cepas de E. coli resistentees à leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B- .7386, Patente dos Estados Unidos n° 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5- trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); cepas de E. coli obtidas pelo método de manipulação genética descrito no W096/06926; E. coli H- .9068 (JP 8-70879 A), e análogos.

A bactéria pode ser aperfeiçoada acentuando-se a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese da L-leucina. Exemplos incluem genes do óperon leuABCD, que são representados, de preferência, por um gene IeuA mutante que codifica para isopropilmalato sintase que é livre de inibição de feedback por L-leucina (Patente dos Estados Unidos n° 6.403.342). Adicionalmente, a bactéria pode ser aperfeiçoada acentuando-se a expressão de um ou mais genes que codificam para proteínas que excretam L- aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de referidos genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias produtoras de L-histidina

Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- histidina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli cepa 24 (VKPM B-5945, RU2003677); E. coli cepa .80 (VKPM B-7270, RU2119536); E. coli NRRL B-12116-B12121 (Patente dos Estados Unidos n° 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H- .9343 (FERM BP-6676) (Patente dos Estados Unidos n° 6.344.347); E. coli H- .9341 (FERM BP-6674) (EP1085087); E. coli AI80/pFM201 (Patente dos Estados Unidos n° 6.258.554) e análogos.

Exemplos de cepas parentais, que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-histidina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codifica, uma enzima biossintética de L- histidina é acentuada. Exemplos de referidos genes incluem genes que codificam ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP cicloidrolase (hisl), fosfribosil-ATP pirofosfoidrolase (hisIE), fosforibosilformimino-5- aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), histidinol desidrogenase (hisD), etc.

E de conhecimento geral que enzimas biossintéticas de L- histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina, e, portanto, também é possível acentuar uma capacidade produtora de L- histidina via introdução de uma mutação em ATP fosforibosiltransferase que confere resistência à inibição de feedback (patentes russas nums. 2003677 e .2119536).

Exemplos específicos de cepas apresentando uma capacidade produtora de L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048 que foram introduzidas com um vetor que porta um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (JP 56-005099 A), cepas de E. coli introduzidas com rht, um gene para uma exportação de aminoácido (EP1016710A), cepa .80 de E. coli conferida com sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina, e resistência à estreptomicina (VKPM B-7270, Patente russa n° 2119536), etc. Bactérias produtoras de L-ácido glutâmico

Exemplos de bactérias produtoras de L-ácido glutâmico ou cepas parentais que podem ser usadas a derivar bactérias produtoras de L- ácido glutâmico incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica de L-isoleucina e L-treonina apresentando mutações em genes thrC e ilvA (Patente dos Estados Unidos n° 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido por meio do método de transdução geral usando um bacteriófago Pl que foi desenvolvido em células de Kl 2 de E. coli de tipo selvagem (VKPM B-7). Como um resultado, obteve-se uma cepa auxotrófica para L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B- .8961), que é capaz de produzir L-ácido glutâmico.

Exemplos de cepas parentais, que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-ácido glutâmico incluem, mas sem limitação, cepas que são deficientes de atividade de a-cetoglutarato desidrogenase, ou cepas em que um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-ácido glutâmico são sintetizados. Exemplos dos genes envolvidos na biossíntese do L-ácido glutâmico incluem genes que codificam glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF\ IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído- .3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bifosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), e glicose fosfato isomerase (pgi).

Exemplos de cepas modificadas para que a expressão do gene citrato sintetase, o gene fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou o gene glutamato desidrogenase é/seja acentuada incluindo aquelas reveladas na EP1078989A, EP955368A, e EP952221A.

Exemplos de cepas que foram modificadas para que a expressão do gene citrato sintetase e/ou o gene fosfoenolpiruvato carboxilase fosse reduzida, e/ou/são deficientes de atividade de a-cetoglutarato desidrogenase incluem aquelas reveladas na EP1078989A, EP955368A, e ΕΡ952221Α.

Exemplos de cepas parentais, que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-ácido glutâmico também incluem cepas apresentando atividasde diminuída ou eliminada de um enzima que catalisa a síntese de um composto diferente do L-ácido glutâmico por meio de ramificação secundária de uma via de biossíntese do L-ácido glutâmico. Exemplos de referidas enzimas incluem isocitrato liase (aceA), a- cetoglutarato desidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato quinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (ilvG), acetolactato sintase (z/vi), formiato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (Idh), e glutamato descarboxilase (gadAB). Bactérias pertencentes ao gênero Escherichia deficientes da atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou apresentando uma reduzida atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e métodos para obter as mesmas são descritas nas Patentes dos Estados Unidos nums. 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente, estas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::KmR E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W311 OsucA: :KmR é uma cepa obtida por meio de disrupção do gene α-cetoglutarato desidrogenase (referido a seguir como "gene sue A") de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente da a- cetoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos de bactérias produtoras de L-ácido glutâmico incluem aquelas que pertencem ao gênero Escherichia e apresentam resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Estas cepas também podem ser deficientes da atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (Patente dos Estados Unidos n° 5.908.768), FFRM P-12379, que apresenta adicionalmente uma baixa capacidade de decomposição do L-ácido glutâmico (Patente dos Estados Unidos n° 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente dos Estados Unidos n° 6.110.714), e análogos.

Exemplos de bactérias produtoras de L-ácido glutâmico incluem cepas mutantes pertencentes ao gênero Pantoea que são deficientes da atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou que apresentam uma atividade diminuída de α-cetoglutarato desidrogenase, e podem ser obtidas como descrito acima. Referidas cepas incluem Pantoea ananatis AJl3356. (Patente dos Estados Unidos n° 6.331.419). Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Teehnology, Ageney of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central .6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 sob um número de acesso de FERM P-16645. Em seguida, foi convertido a um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e receberam um número de acesso de FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente da atividade de α-cetoglutarato desidrogenase como um resultado da rompimento do gene de subunidade de aKGDH-El (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando ela foi isolada e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13356. No entanto, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA etc. Embora AJ13356 fosse depositada no depositório previamente indicado como Enterobacter agglomerans, para os fins desta descrição, elas são descritas como Pantoea ananatis.

Bactérias produtoras de L-fenilalanina

Exemplos de bactérias produtoras de L-fenilalanina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- fenilalanina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HWl089 (ATCC 55371) abrigando o gene pheA34 mutante (Patente dos Estados Unidos n° 5.354.672); E. coli MWEClOl-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente dos Estados Unidos n° 4.407.952). Da mesma forma, como uma cepa parental, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERMBP-3566), E. coliK-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] denominado AJ 12604 (FERM BP-3579) podem ser usadas (EP 488424 BI). Adicionalmente, bactérias produtoras de L-fenilalanina pertencentes ao gênero Escherichia com uma atividade incrementada da proteína codificada pelo gene yedA ou o gene yddG também podem ser usadas (Pedidos de Patentes dos E.U.A. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Bactérias produtoras de L-triptofano Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactéiras produtoras de L- triptofano incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) que é deficiente da triptofanoil-tRNA sintetase codificada pelo gene trpS mutante (Patente dos Estados Unidos n° 5.756.345); E. coli SV164 (pGH5) apresentando um alelo serA que codifica fosfoglicerato desidrogenase livre de inibição de feedback por serina e um alelo trpE codificando antranilato sintase livre de inibição de feedback por triptofano (Patente dos Estados Unidos n° 6.180.373); E. coli AGXl7 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX5 0)aroP (NRRL B-12264) deficiente da enzima triptofanoase (Patente dos Estados Unidos n° 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50,pACKG4- pps em que uma capacidade produtora de fosfoenolpiruvato é incrementada (W09708333, Patente dos Estados Unidos n° 6.319.696), e análogos podem ser usados. Bactérias produtoras de L-triptofano pertencentes ao gênero Escherichia com uma atividade incrementada da proteína identificada codificada por e o gene yedA ou o gene yddG também podem ser usados (Pedidos de Patentes dos E.U.A. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactérias produtoras de L-triptofano também incluem cepas em que uma ou mais atividades das enzimas selecionadas dentre antranilato sintase, fosfoglicerato desidrogenase, e triptofano sintase são incrementadas. A antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase são, ambas, sujeitas à inibição de feedback por L-triptofano e L-serina, de forma que uma mutação dessensibilizadora da inibição de feedback podem ser introduzidas nestas enzimas. Exemplos específicos de cepas apresentando uma mutação do tipo referido incluem uma E. coli SVl64 que abriga antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante obtida por meio de introdução na E. coli SVl64 do plasmídeo pGH5 (WO 94/08031), que contém um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para feedback.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactérias produtoras de L-triptofano também incluem cepas em que o óperon de triptofano que contém um gene que codifica antranilato sintase dessensibilizada foi introduzido (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, Patente dos Estados Unidos n° 4.371.614). Além disso, a capacidade produtora de L- triptofano pode ser conferida via acentuação da expressão de um gene que codifica triptofano sintase, entre óperons de triptofano (trpBA). A triptofano sintase consiste de subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Adicionalmente, a capacidade produtora de L- triptofano pode ser conferida acentuando-se a expressão do óperon de isocitrato liase-malato sintase (W02005/103275).

Bactérias produtoras de L-prolina

Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente do gene ilvA e que é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433). As bactérias podem ser aperfeiçoadas acentuando-se a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese da L-prolina. Exemplos de referidos genes para bactérias produtoras de L-prolina que são preferidas incluem o gene proB que codifica para glutamato quinase cuja inibição de feedback por L-prolina é dessensibilizada (patente alemã DE .3127361). Adicionalmente, as bactérias podem ser aperfeiçoadas acentuando- se a expressão de um ou mais genes que codificam para proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Referidos genes são exemplificados pelos genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP123 9041 A2).

Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, que apresentam uma atividade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (GB Patent 2075056), VKPM B-8012 (Russian patent application 2000124295), mutantes de plasmídeos descritos na patente DE 3127361, mutantes de plasmídeos descritos por Bloom F.R. et al {The 15th Miami winter symposium, 1983, p. .34), e análogos.

Bactérias produtoras de L-arginina

Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- arginina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli cepa 237 (VKPM B-7925) (Pedido de Patente dos E.U.A. 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas que abrigam a N- acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russa n° 2001112869), E. coli cepa 382 (VKPM B-7926) (EPl 170358A1), uma cepa produtora de arginina em que gene argA que codifica N-acetilglutamato sintetase é introduzido ali (EP1170361 Al), e análogos. Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-arginina também incluem cepas cuja expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossíntese de L-arginina é acentuada. Exemplos de referidos genes incluem genes que codificam N-acetilglutamil fosfato redutase (iargC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), ornitina carbamoil transferase (argF), ácido argininossuccínico sintetase (argG), ácido argininossuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB).

Bactérias produtoras de L-citrulina

Exemplos de bactérias produtoras de L-citrulina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- citrulina incluem, mas sem limitação, cepas pertencentes ao gênero Escherichia, como cepas mutantes de E. coli 7V-acetilglutamato sintase237/pMADSll, 237/pMADS12 e 237/pMADS13 (RU2215783, EP1170361B1, US6790647B2), cepas de E. coli 333 (VKPM B-8084) e 374 (VKPM B-8086), ambas abrigando carbamoil fosfato sintetase mutante resistente a feedback (Patente Russa RU2264459 C2), cepas E. coli, em que a atividade de α-cetoglutarato sintase é incrementada, e atividades de ferredoxina NADP+ redutase, piruvato sintase ou a-cetoglutarato desidrogenase são modificadas adicionalmente (EP 2133417 Al), e cepa P. ananantis NAlsucAsdhA, em que as atividades de succinato desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase são diminuídas (Pedido de Patente dos E.U.A. n° 2009286290), e análogos.

Como a L-citrulina é um intermediário da via biossíntese da L- arginina, exemplos de cepas parentais, que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-citrulina, incluem cepas, cuja expressão de um ou mais genes que codificam uma via biossintética da L-arginina é acentuada. Exemplos de referidos genes incluem, mas sem limitação, genes que codificam N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamato quinase (argB), N-acetilglutamila fosfato redutase (argC), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoiltransferase (iargF/1), e carbamoil fosfato sintetase (carAB), ou combinações dos mesmos.

Da mesma forma bactérias produtoras de citrulina podem ser facilmente obtidas de qualquer bactéria produtora de arginina, por exemplo, cepa de E. coli 382 (VKPM B-7926), por meio de inativação de argininossuccinato sintase codificada pelo gene argG.

A expressão "inativação de argininossuccinato sintase" significa que a bactéria foi modificada de tal modo que a bactéria modificada contém argininossuccinato sintase inativa ou ela também pode significar que a bactéria é incapaz de sintetizar a argininossuccinato sintase. A inativação da argininossuccinato sintase pode ser realizada por meio de inativação do gene argG.

A expressão "inativação do gene argG" significa que o gene modificado codifica uma proteína completamente não-funcional. Também é possível que a região de DNA modificada é incapaz de expressar naturalmente o gene devido à deleção de uma parte do gene ou do gene inteiro, ao desvio da matriz de leitura do gene, à introdução de mutação/mutações missensense [n.t.: sentido trocado^lnonsense [n.t.: sem sentido], ou a modificação de uma região adjacente do gene, incluindo seqüências que controlam a expressão gênica, como um promotor, acentuador, atenuador, sítio de ligação de ribosoma, etc.

A presença ou ausência do gene argG no cromossomo de uma bactéria pode ser detectada por meio de métodos bem conhecidos, incluindo PCR, Southern blotting, e análogos. Adicionalmente, o nível da expressão gênica pode ser estimado medindo-se a quantidasde de mRNA transcrito do gene que usa vários métodos bem conhecidos, incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativa, e análogos. A quantidade da proteína codificada pelo gene argG pode ser medida por meio de métodos bem conhecidos, incluindo SDS-PAGE seguido de um ensaio de imuno-manchamento (análise por manchamento Western blotting), e análogos.

A expressão do gene argG pode ser atenuada introduzindo-se uma mutação no gene no cromossomo de modo que a atividade intracelular da proteína codificada pelo gene é diminuída em comparação com uma cepa não-modificada. Mutações que resultam em atenuação da expressão do gene incluem a substiuição de uma base ou mais causando uma substituição de aminoácidos na proteína codificada pelo gene (mutação missensé), introdução de um códon de interrupção [stop\ (mutação nonsensé), deleção de uma ou duas bases para causar um desvio de matriz, inserção de um gene de resistência a droga, ou deleção de uma parte do gene ou de todo o gene (Qiu, Z. e Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). A expressão do gene argG também pode ser atenuada modificando-se uma seqüência reguladora de expressão, como o promotor, a seqüência Shine-Dalgarno (SD), etc. (W095/34672, Carrier, T.A. e Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Por exemplo, os métodos a seguir podem ser usados para introduzir uma mutação por meio de recombinação de genes. Prepara-se um gene mutante que codifica uma proteína mutante com menor atividade, e a bactéria a ser modificada é transformada com um fragmento de DNA contendo o gene mutante. Em seguida, o gene nativo no cromossomo é substituído pelo gene mutante por meio de recombinação homóloga, e a cepa resultante é selecionada. E possível realizar substituição ou disrupção gênica usando recombinação homóloga por meio do uso de um DNA linear, que é conhecido como "integração impelida ao vermelho [Red-driven integration]" (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 12, ρ 6640-6645 (2000)), ou por meio do usoo de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente dos Estados Unidos n° 6.303.383 ou JP 05-00749IA). Adicionalmente, a mutação sítio-específica por meio de substituição gênica também pode ser incorporada usando recombinação homóloga, como apresentando acima usando-se um plasmídeo que é incapaz de replicar no hospedeiro.

A expressão do gene também pode ser atenuada inserindo-se um transpóson ou um fator IS na região codificante do gene (Patente dos Estados Unidos n° 5.175.107), ou por meio de métodos convencionais, como por meio de mutagênese com irradiação UV ou nitrosoguanidina (N-metil-N'- nitro-N-nitrosoguanidina).

Bactérias produtoras de L-ornitina

Bactéria produtora de L-ornitina pode ser obtida facilmente de qualquer bactéria produtora de arginina, por exemplo, a cepa de E. coli 382 (VKPM B-7926), por meio de inativação da ornitina carbamoiltransferase codificada por ambos os genes argF e argl. Métodos para inativação da ornitina carbamoiltransferase são descritos acima.

Bactérias produtoras de L-valina

Exemplos de bactérias produtoras de L-valina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina incluem bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, como H-81 (VKPM B- .8066), NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (US patent No. 4,391,907), VKPM B-4411 (US patent No. 5,658,766), VKPM B-7707 (Pedido de Patente Européia EP1016710A2), ou análogos.

Exemplo de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-valina incluem, mas sem limitação, cepas que foram modificadas para superexpressar o óperon ilvGMEDA (Patente dos Estados Unidos n° .5.998.178). E desejável remover a região do óperon ilvGMEDA que é requerido para atenuação de modo que a expressão do óperon não seja atenuada por L-valina que é produzida. Adicionalmente, o gene ilvA no óperon é desejavelmente rompido de modo que a atividade de treonina desaminase seja diminuída.

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem mutantes apresentando uma mutação de amino- acila t-RNA sintetase (Patente dos Estados Unidos n° 5.658.766). Por exemplo, é possível usar E. coli VL1970, que apresenta uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina tRNA sintetase. E. coli VL1970 foi depositado na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 24 de junho de .1988 sob número de acesso VKPM B-4411.

Adicionalmente, também é possível usar mutantes que requerem ácido lipóico para crescimento e/ou que carecem de H+-ATPase, as cepas parentais (W096/06926).

Bactérias produtoras de L-isoleucina

Exemplos de bactérias produtoras de L-isoleucina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- isoleucina incluem, mas sem limitação, mutantes apresentando resistência a .6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), mutantes apresentando resistência a um análogo de isoleucina, como tiaisoleucina e isoleucina hidroxamato, e mutantes apresentando adicionalmente resistência a etionina DL e/ou arginina hidroxamato (JP 5-130882 A). Adicionalmente, também é possível usar cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese da L-isoleucina, como treonina desaminase e acetoidroxato sintase, como cepas parentais (JP 2-458 A, FR 0356739, e Patente dos Estados Unidosn0 5.998.178).

Bactérias produtoras de L-metionina

Exemplos de bactérias produtoras de L-metionina e cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-metionina incluem, mas sem limitação, cepa mutante auxotrófica para L-treonina e cepa mutante resistente a norleucina (JP 2000-139471 A). Adicionalmente, uma cepa deficiente de repressor de metionina e cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese da L-metionina, como homosserina transsuccinilase e cistationina γ-sintase (JP 2000-139471 A) também podem ser usadas como cepas parentais.

2. Método

Métodos exemplares de acordo com o objeto presentemente revelado incluem a produção de um L-aminoácido por meio do cultivo da bactéria de acordo com o objeto presentemente revelado em um meio de cultura para produzir e excretar o L-aminoácido no meio, e recolher o L- aminoácido do meio.

O cultivo, coleta, e purificação de um L-aminoácido do meio e análogos pode ser realizado de uma maneira similar a métodos de fermentação convencionais em que um aminoácido é produzido usando-se uma bactéria.

O meio selecionado para a cultura pode ser um meio sintético ou um meio natural, desde que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que a bactéria selecionada requer para o crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos, como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microorganismo usado é possível usar álcool, incluindo etanol e glicerol. Como a fonte de nitrogênio, é possível usar vários sais de amônio, como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio, como aminas, uma fonte de nitrogênio natural, como peptona, hidrolisado de soja, e microorganismo fermentativo digerido. Como minerais, é possível usar monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e análogos. Como vitaminas é possível usar tiamina, extrato de levedura, e análogos. O cultivo pode ser realizado em condições aeróbicas, como por meio de sacudimento e/ou agitação com aeração, a uma temperatura de 20 a 40 °C, ou em outro exemplo, de 30 a 38 °C. O pH da cultura é usualmente entre 5 e 9, ou em outro exemplo, entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tamponadores. usualmente, um cultivo de 1 a 5 dias leva ao acúmulo do L- aminoácido que é alvo no meio líquido.

Após o cultivo, é possível remover sólidos, como células, do meio líquido por meio de centrifugação ou filtração por membrana, e então o L-aminoácido pode ser recolhido e purificado por meio de troca de íon, concentração, e/ou métodos de cristalização.

Exemplos

A presente invenção será explicada abaixo mais concretamente com referência aos exemplos não-limitantes a seguir.

Exemplo 1. Construção da cepa de E. coli MG1655::PT.tacbssR.

A cepa de E. coli MG1655::PL_taCbssR foi obtida por meio de substituição da região promotora nativa do gene bssR na cepa MGl 655 por meio do promotor PL-tac·

Para substituir a região promotora nativa do gene bssR, o fragmento de DNA que porta um promotor Plj4ac e marcador de resistência ao cloranfenicol (CmR) codificado pelo gene cat foi integrado no cromossomo do E. coli MG1655 em lugar da região promotora nativa por meio do método descrito por Datsenko K.A. e Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, .2000, 97, 6640-6645), que também é denominado "integração mediada com vermelho [Red-mediated integration]" e/ou "integração impelida com vermelho [Red-driven integration]".

O fragmento do conjunto promotor PL_tac com o gene cat foi obtido por meio de PCR usando DNA cromossômico da cepa de E. coli MGl 655PL.tacxylE (W02006/043730) como um modelo. A seqüência de nucleotídeos do promotor PL.tac é apresentada na listagem de seqüências (SEQ ID NO: 3). Os iniciadores Pl (SEQ ID NO: 4) e P2 (SEQ ID NO: 5) foram usados para amplificação com PCR. O iniciador Pl contém 36 nucleotídeos complementares à região localizada 166 bp [pares de bases] a montante do códon start [n.t.: seqüência de iniciação de tradução] do gene bssR introduzido no iniciador para integração adicional no cromossomo bacteriano e o iniciador P2 contém 36 nucleotídeos idênticos à seqüência a 5' do gene bssR.

PCR foi proporcionada usando o amplificador "Gene Amp PCR System 2700" (Applied Biosystems). A mistura de reação (volume total - 50 μΐ) consistiu de 5 μΐ de IOx tamponador de PCR com 15 mM de MgCl2 ("Fermentas", Lithuania), 200 μΜ cada de dNTP, 25 pmol cada dos iniciadores explorados e 1 U de Taq-polimerase ("Fermentas", Lithuania). Aproximadamente 20 ng do DNA genômico de E.coli MG1655PL_tacxylE foram adiicionados nas misturas de reação como um modelo para PCR.

O perfil de temperaturas foi o seguinte: desnaturação de DNA inicial durante 5 min a 95 °C, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95 0C durante 30 s, recombinação a 54 0C durante 30 s, alongamento a 72 0C durante 1,5 min e o alongamento final durante 5 min a 72 °C. Em seguida, o fragmento de DNA amplificado foi purificado por meio de gel de agarose- eletroforese, extraído usando "GenElute Spin Columns" ("Sigma", E.U.A.) e precipitato com etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado para eletroporação e integração mediada com vermelho no cromossomo bacteriano de E. coli MGl655/pKD46. O plasmídeo pKD46 (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:12:6640-45) contém uma origem de replicação sensível a temperatura, e inclui um fragmento de DNA com .2.154 nucleotídeos de fago λ (posições de nucleotídeos de 31088 a 33241, n° de acesso GenBank J02459), e também os genes do sistema de recombinação homóloga λ Red (genes exo, γ, β), que estão sob o controle do promotor Para0 induzível com arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integração do produto de PCR no cromossomo da cepa MGl655. A cepa MGl655 pode ser obtida da American Type Culture Collection. (P.O. Box 1549 Manassas, VA20108, E.U.A.).

Células MG1655/pKD46 foram desenvolvidas de um dia para o outro a 30 0C no meio LB líquido com a adição de ampicilina (100 μg/ml), depois diluídas a 1:100 com o meio SOB (Extrato de levedura, 5 g/l; NaCl,0,5 g/l; Triptona, 20 g/l; KCl, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) com a adição de ampicilina (100 μg/ml) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir os genes codificantes do plasmídeo no sistema Red) e desenvoolvidos a 30 0C para atingira a densidade óptica da cultura bacteriana OD60O^O,4-0,7. Células desenvolvidas de 10 ml da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes com a água deionizada gelada, seguido de suspensão em 100 μΐ da água. Adicionou-se 10 μΐ de fragmento de DNA (100 ng) dissolvidos na água deionizada à suspensão de células. A eletroporação foi realizada com eletroporador "Bio-Rad" (E.U.A.) (n° 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células submetidas a choque foram adicionadas a1 ml de meio SOC (Sambrook et aí, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubado durante 2 horas a 37 0C, e então foram espalhadas sobre agar L contendo 25 μg/ml de cloranfenicol. Colônias que se desenvolveram dentro de 24 horas foram testadas quanto à presença do marcador CmR, em lugar da região promotora nativa do gene bssR por meio de PCR usando-se iniciadores P3 (SEQ ID NO: 6) e P4 (SEQ ID NO: 7). Para tal fim, uma colônia recentemente isolada foi suspensa em 20 μΐ de água e então usou-se 1 μΐ da suspensão obtida para PCR. Usou-se o perfil de temperatura a seguir: desnaturação de DNA inicial durante 10 min a 95 0C; depois 30 ciclos de desnaturação a 95 0C durante 30 s, recombinação a 55 0C durante 30 s e alongamento a 72 0C durante 1 min; o alongamento final durante 7 min a 72 °C. Algumas poucas colônias CmR testadas continham o fragmento de DNA desejado com -2000 bp, confirmando a presença do promotor Pl4ac e DNA marcador de CmR em lugar da região promotora nativa com 255 bp do gene bssR. Uma destas cepas foi curada do plasmídeo termossensível pKD46 por meio de cultivo a 37°C e a cepa resultante foi denominada E. coli MG1655PL.tacbssR.

Exemplo 2. Produção de L-arginina por meio de E. coli 382 Pu^bssR

Para testar o efeito da expressão acentuada do gene bssR que se encontra sob o controle do promotor Pl-^c sobre a produção de arginina, fragmentos de DNA do cromossomo da assim descrita E. coli MG1655PL_ tacbssR foram transferidos para a cepa 283 de E. coli produtora de arginina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). A cepa 382 foi depositado na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 10 de abril de 2000 sob número de acesso VKPM B-7926.

Ambas as cepas, 382 e 382 Pi_tacbssR, foram cultivadas separadamente com agitação a 37 0C durante 18 horas em 3 ml de brodo de nutriente, e 0,3 ml das culturas foi inoculado em 2 ml de um meio de fermentação em tubos de teste de 20 χ 200 mm em um agitador rotativo a 37 0C durante 48 horas.

Após o cultivo, a quantidade de L-arginina que havia se acumulado no meio foi determinada por meio de cromatografia em papel usando-se a fase móvel a seguir: butanolrácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Usou-se uma solução de ninidrina (2 %) em acetona como um reagente de visualização. Recortou-se um ponto \spot\ contendo L-arginina, a L-arginina foi eluiu com solução em água a 0,5 % de CdCl2, e a quantidade de L-arginina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como a seguir: Glicose 48,0 (NH4)2S04 35,0 KH2PO4 2,0 MgS04-7H20 1,0 Tiamina HCl 0,0002 Extrato de levedura 1,0 Isoleucina L 0,1 CaCO3 5,0

Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO: é esterilizado com calor seco a 180 0C durante 2 horas. O pH é ajustado em 7,0.

Os resultados das fermentações em tubo de ensaio são mostradas na Tabela 1. Como se pode ver na Tabela 1, a cepa 382 Pi_tacbssR com expressão acentuada do gene bssR foi capaz de produzir uma maior quantidade de acúmulo de L-arginina em comparação com a cepa 283 de E. coli parental produtora de L-arginina.

Tabela 1

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 3. Produção de L-treonina pela cepa de E. coli B-3996 Pi.farbssR

Para testar o efeito de acentuar a expressão do gene bssR sobre a produção de treonina, os fragmentos de DNA do cromossomo de E. coli MG1655 Pi^bssR como descrito acima podem ser transferidos para a cepa E. coli VKPM B-3996 produtora de treonina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter B-3996 Pi.taCbssR. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Rússia, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street, 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) sob o número de acesso B-3996.

Ambas as cepas de E. coli, B-3996 e B-3996 Pi.tacbssR, podem ser desenvolvidas durante 18-24 horas a 37 0C em placas de L-agar. Para se obter uma cultura de sementes, as cepas podem ser desenvolvidas em um agitador rotativo (250 rpm) a 32 0C durante 18 horas em tubos de ensaio de 20x200 mm contendo 2 ml de brodo L suplementada com glicose a 4 %. Em seguida, o meio de fermentação pode ser inoculado com 0,21 ml (10 %) de material de semente. A fermentação pode ser realizada em 2 ml de meio mínimo para fermentação em tubos de ensaio de 20x200 mm. Células podem ser desenvolvidas durante 65 horas a 32 0C com agitação a 250 rpm.

Após o cultivo, a quantidade de L-treonina, que havia se acumulado no meio, pode ser determinada por meio de cromatografia em papel usando-se a fase móvel a seguir: butanol-ácido acético-água = 4:1:1 (v/v). Usou-se uma solução de ninidrina (2 %) em acetona como um reagente de visualização. E possível recortar um ponto contendo L-treonina, L-treonina pode ser eluída com solução de CdCl2 em água a 0,5 %, e a quantidade de L- treonina pode ser estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como a seguir:

Glicose 80,0

(NH4)2SO4 22,0

NaCl 0,8

KH2PO4 2,0

MgS04-7H20 0,8

FeS04-7H20 0,02

MnSO4SH2O 0,02

Tiamina HCl 0,0002

Extrato de levedura 1,0

CaCO3 30,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por meio de calor seco a 180 0C durante 2 horas. O pH é ajustado em 7,0. O antibiótico é introduzido no meio após esterilização.

Exemplo 4. Produção de L-Iisina por meio de E. coli AJl 1442 P1-tacbssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de lisina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa de E. coli MGl 655 Pi_tacbssR descrita acima podem ser transferidos para a cepa de E. coli AJ11442 produtora de lisina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa AJl 1442 Pi_tacbssR. A cepa AJl 1442 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science e Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japão) em 1 de maio de 1981 e recebeu um número de acesso de FERM P-5084. Em seguida, isto foi convertido a um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de outubro de 1987, e recebeu um número de acesso de FERM BP-1543.

Ambas as cepas de E. coli, AJl 1442 e AJl 1442 Pi_tacbssR, podem ser cultivadas em meio L a 37 °C, e 0,3 ml da cultura obtida pode ser inoculado em .20 ml do meio de fermentação contendo as drogas requeridas em um frasco de .500 ml. O cultivo pode ser realizado a 37 0C durante 16 h com o uso de um agitador reciprocante na velocidade de agitação de 115 rpm. Após o cultivo, as quantidades de L-Iisina e glicose residual no meio podem ser medidas por meio de um método conhecido (Biotech-analyzer AS210 fabricado pela Sakura Seiki Co.). Em seguida, o rendimento da L-Iisina pode ser calculado relativamente à glicose consumida para cada uma das cepas.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como a seguir: Glicose 40

(NH4)2SO4 24

K2HPO4 1,0

MgSO4VH2O 1,0

FeSO4YH2O 0,01

MnS04-5H20 0,01

Extrato de levedura 2,0

O pH é ajustado em 7,0 com KOH e o meio é autoclavado a 115 0C durante 10 min. Glicose e MgS04-7H20 são esterilizadas separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180 0C durante 2 horas e adicionado ao meio para uma concentração final de 30 g/l.

Exemplo 5. Produção de L-cisteína pela cepa de E. coli JM15(ydeD) P1^bssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-cisteína, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita E. coli MGl 655 Pi_taCbssR podem ser transferidos para a cepa JM15(ydeD) de E. coli produtora de L-cisteína por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa JM15(ydeD) Pi_tacbssR.

A cepa de E. coli JM15(ydeD) é um derivado da cepa de E. coli JMl5 (Patente dos Estados Unidos n° 6.218.168) que pode ser transformada com DNA apresentando o gene ydeD, que codifica para uma proteína de membrana, e não está envolvida em uma via biossintética de qualquer L-aminoácido (Patente dos Estados Unidos n° 5.972.663). A cepa JMl5 (CGSC# 5042) pode ser obtida da The Coli Genetic Stock Collection no E.coli Genetic Resource Center, MCD Biology Department, Yale University (http://cgsc.biology.yale.edu/).

As condições de fermentação para avaliação da produção de L- cisteína foram descritas detalhadaente no Exemplo 6 da Patente dos Estados Unidosn0 6.218.168.

Exemplo 6. Produção de L-Ieucina por meio de E. coli 57 P]_ taçbssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-leucina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MGl655 Pi_taCbssR podem ser transferidos para a cepa 57 de E. coli produtora de L-leucina (VKPM B-7386, Patente dos Estados Unidos n° 6.124.121) por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa 57 Pi_taCbssR. A cepa 57 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 19 de maio de .1997 sob número de acesso VKPM B-7386.

Ambas as cepas de E. coli, 57 e 57 Pi_tacbssR, podem ser cultivadas durante 18-24 horas a 37 0C em placas de agar L. Para obter uma cultura de sementes, as cepas podem ser desenvolvidas em um agitador rotativo (250 rpm) a 32 0C durante 18 horas em tubos de ensaio de 20x200 mm contendo 2 ml de brodo L suplementado com 4 % de sacarose. Em seguida, o meio de fermentação pode ser inoculado com 0,21 ml de material de semente (10 %). A fermentação pode ser realizada em 2 ml de um meio de fermentação mínimo em tubos de ensaio de 20x200 mm. Células podem ser desenvolvidas durante 48-72 horas a 32 0C com agitação a 250 rpm. A quantidade de L-leucina pode ser medida por meio de cromatografia em papel (composição da fase líquida: butanol-ácido acético-água = 4:1:1).

A composição do meio de fermentação (g/l) (pH 7.2) é como a seguir:

Glicose 60,0 (NH4)2SO4 25,0 K2HPO4 2,0 MgSO4-7Η20 1,0 Tiamina 0,01 CaCO3 25,0

Glicose e CaCO3 são esterilizadas separadamente. Exemplo 7. Produção de L-histidina pela cepa de E. coli 80 Pi.tarbssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-histidina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita E. coli MG1655 Pi.tacbssR podem ser transferidos para a cepa .89 de E. coli produtora de histidina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, .1972, Plainview, NY) para se obter a cepa 80 Pi_tacbssR. A cepa 80 foi descrita na Patente Russa 2119536 e depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 15 de outubro de 1999 sob número de acesso VRPM B- .7270 e então convertida em um depósito sob o Tratado de Budapeste em 12 de julho de 2004.

Ambas as cepas de E. coli, 80 e 80 Pi_tacbssR, podem, cada uma, ser cultivadas em brodo L durante 6 h a 29 °C. Em seguida, 0,1 ml da cultura obtida pode ser inoculado em 2 ml de meio de fermentação em um tubo de ensaio de 20x200 mm e cultivado durante 65 horas a 29 0C com agitação em um agitador rotativo (350 rpm). Após o cultivo, a quantidade de histidina que se acumula no meio pode ser determinada por meio de cromatografia em papel. O papel pode ser revelado com uma fase móvel consistindo de n-butanol:ácido acéticorágua = 4:1:1 (v/v). Uma solução de ninidrina (0,5 %) em acetona pode ser usada como um reagente de visualização.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como a seguir (pH 6,0):

Glicose 100,0 Mameno (hidrolisado 0,2 de como de soja) nitrogênio total L-prolina 1,0 (NH4)2SO4 25,0 KH2PO4 2,0 MgSO4 7H20 1,0 FeSO4 7H20 0,01 MnSO4 0,01 Tiamina 0,001 Betaína 2,0 CaCO3 60,0

Glicose, prolina, betaína e CaCO3 são esterilizados separadamente. O pH é ajustado em 6,0 antes da esterilização.

Exemplo 8. Produção de L-ácido glutâmico pela cepa de E. coli VL334thrC+ P1^bssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre o L-ácido glutâmico produção, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MGl 655 Pi_tacbssR podem ser transferidos para a cepa VL334thrC+ de E. coli produtora de L-ácido glutâmico (EP1172433) por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa VL334thrC+-Pi_taCbssR. A cepa VL334thrC+ foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 6 de dezembro de 2004 sob o número de acesso VKPM B-8961 e então convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 8 de dezembro de 2004.

Ambas as cepas, VL334thrC+ e VL334thrC+ Pi_tacbssR, podem ser desenvolvidas durante 18-24 horas a 37 0C sobre placas de agar L. Em seguida, uma alça das células pode ser transferida para tubos de ensaio contendo 2 ml de meio de fermentação. O meio de fermentação contém glicose (60g/l), sulfato de amônio (25 g/l), KH2PO4 (2g/l), MgSO4 (1 g/l), tiamina (0,1 mg/ml), L-isoleucina (70 μg/ml), e CaCO3 (25 g/l). O pH é ajustado em 7,2. Glicose e CaCO3 são esterilizados separadamente. O cultivo pode ser realizado a 30 0C durante 3 dias com agitação. Após o cultivo, a quantidade de L-ácido glutâmico que é produzida pode ser determinada por meio de cromatografia em papel (composição da fase líquida de butanol-ácido acético-água = 4:1:1) com manchamento subsequente por meio de ninidrina (solução a 1 % em acetona) e eluição adicional dos compostos em 50 % de etanol com 0,5 % de CdCl2.

Exemplo 9. Produção de L-fenilalanina pela cepa de E. coli AJ12739 Pu^bssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-fenilalanina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita E. coli MGl 655 Pi.tacbssR podem ser transferidos para a cepa AJ12739 de E. coli produtora de fenilalanina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa AJ12739 Pi.taCbssR. A cepa AJ12739 foi depositado na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 6 de novembro de 2001 sob número de acesso n° VKPM B-8197 e então convertida em um depósito sob o Tratado de Budapeste em 23 de agosto de 2002.

Ambas as cepas, AJ12739 e AJ12739 Pi.tacbssR, podem ser cultivadas a 37 0C durante 18 horas em um brodo de nutriente, e 0,3 ml da cultura obtida pode ser, cada uma inoculado em 3 ml de um meio de fermentação em um tubo de ensaio de 20x200 mm e cultivadas a 37 0C durante .48 horas com agitação em um agitador rotativo. Após o cultivo, a quantidade de fenilalanina que se acumula no meio pode ser determinada por meio de TLC. As placas de TLC com 10x15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm do sílica-gel Sorbfil não contendo indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rússia) podem ser usadas. As placas Sorbfil podem ser reveladas com um fase móvel consistindo de propan-2-ol : etilacetato : 25 .10 % de amônia aquosa : água — 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Uma solução de ninidrina (2 %) em acetona pode ser usada como um reagente de visualização.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como a seguir: Glicose 40,0 (NH4)2SO4 16,0 K2HPO4 0,1 MgS04-7H20 1,0 FeSO4-7H20 0,01 MnSO4SH2O 0,01 Tiamina HCl 0,0002 Extrato de levedura 2,0 Tirosina 0,125 CaCO3 20,0

Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180 0C durante 2 horas. O pH é ajustado em 7,0.

Exemplo 10. Produção de L-triptofano pela cepa de E. coli SV164 (pGH5) Pu1-tac bssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-triptofano, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MG1655 Pi_tacbssR podem ser transferidos para a cepa SV164 de E. coli produtora de triptofano (pGH5) por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para ser obter a cepa SV164(pGH5) PUacbssR. A cepa SV164 foi obtida introduzindo-se o alelo trpE que codifica antranilato sintase livre de inibição de feedback por triptofano em uma cepa deficiente de trpE, E. coli KB862 (DSM7196) (W094/08031, Divulgação de Patente Japonesa n° 7-507693). 0 plasmídeo pGH5 abriga um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato desidrogenase livre de inibição de feedback por serina. A cepa SV164 (pGH5) foi descrita detalhadamente na Patente dos Estados Unidos n° 6.180.373 ou Patente Européia 0662143. A cepa KB862 foi denominada AJ13 828 e foi depositado em 21 de dezembro de 2000 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (correntemente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) como um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste com um número de depósito de FERM BP-7405.

Ambas as cepas, SV164(pGH5) e SV164(pGH5) Pi-tacbssR, podem ser cultivadas com agitação a 32 0C durante 18 horas em 3 ml de brodo de nutriente suplementado com tetraciclina (10 mg/ml, marcador do plasmídeo pGH5). As culturas obtidas (0,3 ml cada um) podem ser inoculadas em 3 ml de um meio de fermentação contendo tetraciclina (10 mg/ml) em tubos de ensaio de 20 χ 200 mm, e cultivadas a 32 0C durante 72 horas com um agitador rotativo a 250 rpm. Após o cultivo, a quantidade de triptofano que se acumula no meio pode ser determinada por meio de TLC como descrito no Exemplo 9.

Os componentes do meio de fermentação encontram- se listados na Tabela 2, mas deveriam ser esterilizados em grupos separados (A, B, C, D, E, F, G e Η), como mostrado, para evitar interações adversas durante a esterilização.

Tabela 2

<table>table see original document page 47</column></row><table>

O pH da solução A é ajustado em 7,1 com NH4OH.

Exemplo 11. Produção de L-prolina pela cepa de E. coli .702ilvA PuJjssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-prolina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MGl655 P]_tacbssR podem ser transferidos para a cepa 702ilvA de E. coli produtora de prolina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa 702ilvA Pi_taCbssR. A cepa .702ilvA foi depositado na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 18 de julho de 2000 sob número de acesso VKPM B-8012 e então convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

Ambas as cepas de E. coli, 702ilvA e 702ilvA Pi_tacbssR, podem ser desenvolvidas durante 18-24 horas a 37 0C em placas de agar L. Em seguida, estas cepas podem ser cultivadas nas mesmas condições que no Exemplo 8.

Exemplo 12. Produção de L-citrulina pela cepa de E. coli .382AargG PuJjssR.

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-citrulina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MGl655 Pi_taCbssR podem ser transferidos para a cepa 382AargG de E. coli produtora de L-citrulina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa 382AargG P]_tacbssR. A cepa 382AargG pode ser obtida por meio de deleção do gene argG no cromossomo de 382 cepa (VKPM B-7926) por meio do método inicialmente desenvolvido por Datsenko, K.A. e Wanner, B.L. denominado "integração impelida ao vermelho" (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640- .6645). De acordo com este procedimento é possível construir os iniciadores de PCR homólogos tanto à região adjacente ao gene argG e ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo modelo. O plasmídeo pMW118-attL- Cm-attR (WO 05/010175) pode ser usado como o modelo na reação PCR.

Ambas as cepas de E. coli, 382AargG e 382AargG Pi.tacbssR, podem ser cultivadas separadamente com agitação a 37 0C durante 18 horas em 3 ml de brodo de nutriente, e 0,3 ml das culturas obtidas foi inoculado em 2 ml de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 χ 200 mm e cultivado a 32 0C durante 48 horas em um agitador rotativo.

Após o cultivo, a quantidade de citrulina que se acumula no meio pode ser determinada por meio de cromatografia em papel usando-se a fase móvel a seguir: butanol:ácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Uma solução de ninidrina (2 %) em acetona pode ser usada como um reagente de

r

visualização. E possível recortar um ponto contendo citrulina, a citrulina pode ser eluída com solução em água a 0,5 % de CdCl2, e a quantidade de citrulina pode ser estimada espectrofotometricamente a 540 nm. A composição do meio de fermentação (g/l) pode ser como a seguir:

Glicose 48,0

(NH4)2S04 35,0

KH2PO4 2,0

MgSO4TH2O 1,0

Tiamina HCl 0,0002

Extrato de levedura 1,0

IsoleucinaL 0,1

ArgininaL 0,1

CaCO3 5,0

Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180 0C durante 2 horas. O pH é ajustado em 7,0. Exemplo 13. Produção de L-ornitina pela cepa de E. coli 382AargFAargI Pj. taçbssR.

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR

sobre a produção de L-ornitina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MGl655 Pi_taCbssR podem ser transferidos para a cepa 382AargFAargI de E. coli produtora de L-ornitina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa382AargFAargI Pi.tacbssR. A cepa 382 AargFAargI pode ser obtido por meio de deleção consecutiva de genes argF e argl no cromossomo da cepa 382 (VKPM B-7926) por meio do método inicialmente desenvolvido por Datsenko, K.A. e Wanner, B.L. denominado "integração impelida ao vermelho" (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640-6645). De acordo com este procedimento, é possível construir dois pares de iniciadores de PCR homólogos tanto à região adjacente ao gene argF ou argl e ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo modelo. O plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR (WO 05/010175) pode ser usado como o modelo na reação PCR.

Ambas as cepas de E. coli, 3 82AargFAargI e 382 AargFAargI P1. tacbssR, can be separadamente cultivated com agitação a 37 0C durante 18 horas em 3 ml de brodo de nutriente, e 0,3 ml das culturas obtidas foi incubado em 2 ml de a meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 χ 200 mm e cultivado a 32 0C durante 48 horas em um agitador rotativo.

Após o cultivo, a quantidade de ornitina que se acumula no meio pode ser determinada por meio de cromatografia em papel usando-se a fase móvel a seguir: butanol:ácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Uma solução de ninidrina (2 %) em acetona pode ser usada como um reagente de

r

visualização. E possível recortar um ponto contendo ornitina, ornitina pode ser eluiu com solução em água a 0,5 % de CdCl2, e a quantidade de ornitina pode ser estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

A composição do meio de fermentação (g/l) pode ser como a seguir: Glicose 48,0 (NHM)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgS04-7H20 1,0 Tiamina HCl 0,0002 Extrato de levedura 1,0 isoleucina L 0,1 arginina L 0,1 CaCO3 5,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO:

é esterilizado com calor seco a 180 0C durante 2 horas. O pH é ajustado em 7,0. Exemplo 14. Produção de L-valina pela cepa de E. coli H-81 Pu^bssR

Para testar o efeito da acentuação da expressão do gene bssR sobre a produção de L-valina, os fragmentos de DNA do cromossomo da acima descrita cepa de E. coli MGl655 Pi_tacbssR podem ser transferidos para a cepa H-81 de E. coli produtora de valina por meio de transdução de Pl (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) para se obter a cepa H-81 Pi_tacbssR. A cepa H-81 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais [Russian National Collection of Industrial Microorganisms] (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Federação Russa) em 30 de janeiro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8066, e em seguida foi convertida em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 1 de fevereiro de .2002.

As cepas H-81 e H-81 Pi.tacbssR podem ser cultivadas a 37 0C durante 18 horas em um brodo de nutriente e 0,1 ml de cada uma das culturas obtidas podem ser inoculadas em 2 ml de meio de fermentação em um tubo de ensaio de 20x200 mm e cultivadas a 32 0C durante 72 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo durante 48 horas e durante 72 horas é possível medir com TLC quantidades acumuladas de L-valina. As placas de TLC de 10x15 cm com camadas de 0,11 mm de sílica-gel Sorbfil não contendo indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rússia) podem ser usadas. As placas de Sorbfil podem ser desenvolvidas com um fase móvel consistindo de propan-2-ol:etilacetato:25 % de amônia aquosa:água = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Uma solução de ninidrina (2 %) em acetona pode ser usada como um reagente de visualização.

Composição do meio de fermentação (g/l): Glicose 60,0 (NH4)2SO4 18,0 KH2PO4 1,8 MgSO4VH2O 1,2

CaCO3 20,0

TiaminaHCl 0,001

CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180 0C durante 2 horas. O pH ajustado em 7,0.

Embora a invenção tenha sido descrita detalhadamente com referência a suas concretizações preferidas, alguém com prática na arte perceberá que é possível realizar várias modificações, e usar equivalentes, sem afastar-se do escopo da invenção. Todas as referências aqui indicadas são incorporadas como uma parte deste pedido, por referência. Aplicabilidade industrial

De acordo com a presente invenção, é possível melhorar a produção de aminoácido L por uma bactéria da família Enterobacteriaceae.

Claims

1. Bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de que referida bactéria foi modificada para acentuar a expressão do gene bssR.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que referida expressão é acentuada modificando-se uma seqüência de controle de expressão do gene bssR.

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que referida bactéria pertence ao gênero Escherichia.

4. Bactéria de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que referida bactéria é Escherichia coli.

5. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que referida bactéria pertence ao gênero Pantoea.

6. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que referido L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste de um L- aminoácido aromático e um L-aminoácido não-aromático.

7. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que referido L-aminoácido aromático é selecionado do grupo que consiste de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

8. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que referido L-aminoácido não- aromático é selecionado do grupo que consiste de L-treonina, L-lisina, L- cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, L-arginina, L-citrulina e L-ornitina.

9. Bactéria produtora de L-aminoácido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que referido L-aminoácido é L-arginina.

10.Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 em um meio de cultura, e coletar referido L- aminoácido do meio.

11.Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que referido L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste de um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não-aromático.

12.Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que referido L-aminoácido aromático é selecionado do grupo que consiste de L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

13.Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que referido L-aminoácido não-aromático é selecionado do grupo que consiste de L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L- isoleucina, L-valina, L-histidina, glicina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, L- ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, L-prolina, L-arginina, L- citrulina e L-ornitina.

14.Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que referido L-aminoácido é L-arginina.