BRPI1103672A2 - sequÊncia de Ácido nuclÉico recombinante que codifica para os aminoÁcidos 39 a 512 da proteÍna p1 do s. mutans, proteÍna recombinante e seus usos na prevenÇço e controle da cÁrie dental - Google Patents

Abstract

SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE QUE CODIFICA PARA OS AMINOÁCIDOS 39 A 512 DA PROTEÍNA P1 DO S. MUTANS, PROTEÍNA RECOMBINANTE E SEUS USOS NA PREVENÇçO E CONTROLE DA CÁRIE DENTAL. A presente invenção provê uma sequência de ácidos nucléicos (SEQ. de ID. Nº. 1) e correspondente sequência de aminoácidos da proteína imunogênica P1~39-512~ (SEQ. de ID. Nº. 2) derivada da proteína P1 de Streptococcus mutans (S. mutans), compreendendo os aminoácidos 39 ao 512 da proteína nativa, expressa em linhagens recombinantes de Bacillus subtilis e formulações farmacêuticas, preferencialmente vacinas, voltadas para o controle da cárie humana. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso de formulações farmacêuticas das sequências de ácidos nucléicos e/ou proteínas e/ou anticorpos específicos derivados da P1~39-512~ para o controle profilático ou terapêutico da cárie e outras doenças associadas ao S. mutans.

Description

SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE QUE CODIFICA PARA

OS AMINOÁCIDOS 39 A 512 DA PROTEÍNA Pl DO S. MUTANS, PROTEÍNA RECOMBINANTE E SEUS USOS NA PREVENÇÃO E CONTROLE

DA CÁRIE DENTAL

Campo da Invenção:

Δ presente invenção provê uma seqüência de ácidos nucléicos (SEQ. de ID. No. 1) e correspondente seqüência de aminoácidos da proteína imunogênica PI39-512 (SEQ. de ID. No. 2) derivada da proteína Pl de Streptococcus mutans (S. mutans) , compreendendo os aminoácidos 39 ao 512 da proteína nativa, expressa em linhagens recombinantes de Bacillus subtilis, e formulações farmacêuticas, preferencialmente vacinas, voltadas para o controle da cárie humana. _, _

Adicionalmente, o presente pedido de patente destina- se ao uso de formulações farmacêuticas das seqüências de ácidos nucléicos e/ou proteínas e7ou anticorpos específicos derivados da PI39-512 para o controle profilático ou terapêutico da cárie e outras doenças associadas ao S. mutans.

EHindamentos da técnica:

O S. mutans é um dos principais agentes etiológicos da cárie dental, uma das doenças infecto-contagiosas humanas mais comuns entre os seres humanos (Russell et al., 2000).

Já é de conhecimento que a aderência do S. mutans ao dente envolve dois processos, um sacarose-dependente e outro sacarose-independente, sendo este último derivado da formação de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas entre a bactéria e a película dental (Gibbons et al., 1984 e Gibbons et al., 1986). 0 S. mutans também interage com outros microrganismos orais, incluindo colonizadores primários, tais como o Streptoccoccus gordonii (Jenkinson & Lamont, 2005 e Nobbs et ai-, 2009).

0 complexo processo multifatorial de aderência do S. mutans envolve o maior antigeno de superfície de S. mutans, uma proteína de peso molecular de aproximadamente 185 kDa denominada proteína PI, originalmente identificada como Antigeno I/II (Russell & Lehner, 1978).

A família da proteína Pl é expressa por quase todos os estreptococos orais e genes ortólogos têm sido também identificados em S. pyogenes e S. Agalactiae (Zhang et al., 2006).

A Pl está também relacionada ao fenômeno da agregação bacteriana mediada pela saliva, _pos_siv_elmente . por me.io_de_ um mecanismo não imune de eliminação do patógeno, o qual é abolido em cepas de S. mutans nocautes na proteína Pl (Lee - et al- , 1989-e Koga" et~al7, 1990)". ~ "

A proteína Pl tem-se mostrado um alvo promissor na imunidade protetora natural em humanos e tem sido estudada como um potencial antigeno protetor em estudos de imunização ativa de primatas não-humanos e murinos (Lehner et al., 1981; Michalek et al., 2001; Smith et al., 2008 e Shivakumar et al., 2009). Além disso, a imunização passiva com anticorpos monoclonais contra a Pl pode conferir uma proteção parcial contra a colonização de S. mutans em macacos (Lehner et al., 1985) e humanos (Ma et al., 1987).

A seqüência primária da Pl de S. mutans apresenta características distintas: a porção N-terminal codifica para o peptídeo sinal (resíduos de aminoácido 1 a 38) e uma região rica em alanina (região A, que corresponde aos resíduos de aminoácidos 186-4 64) . Recentemente, a proteína Pl teve sua estrutura resolvida e demonstrou-se que a região A apresenta uma periodicidade de sete resíduos, que adota uma estrutura em alfa-hélice extendida (Larson et al., 2010).

A região central apresenta um segmento rico em prolina

(P-região, correspondente aos resíduos de aminoácidos 840- 963) . Entre as regiões A e P, localiza-se um segmento comumente referido como região variável ou V, na qual reside a maior parte da diferença de seqüência da proteína Pl de cepas de S. mutans (Brady et al., 1991).

As regiões AeP interagem e contribuem para a formação de epítopos descontínuos (Dolleweerd van et al., 2004; Rhodin et al., 2004; Seifert et al1,_20_04_ e_ McArthur. et al., 2007). Na porção C-terminal, há o motivo LPXTG e uma cauda citoplasmática (Pancholi e Fischetti, 1989 e _ .Thon-That ■ ct al. , 2004)- - - — —

A região A tem sido associada à interação de S. mutans com componentes salivares, incluindo aglutininas salivares (SAG) , tais como a proteína gp340 (Prakobphol et al., 2000) . Devido a estas interações, a região A é por vezes referida como região de ligação de saliva ou SBR (aminoácidos 186 a 464) (Nakai et al., 1993; Hajishengallis et al., 1995 e Hajishengallis et al., 1998). Esse segmento " da Pl' inibe competitivamente a aderência do S. mutans em SAG imobilizado e agregação na presença de SAG livre (Crowley et al., 1993), porém, determinantes diferentes podem estar associados aos dois processos (Brady et al., - 1992) .

A região A também é antigênica e abrange epítopos para células B e para células T (Takahashi et al., 1991, Kelly et al., 1995 e Senpuku e col., 1996). Anticorpos contra esse segmento da Pl são capazes de bloquear a agregação de S. mutans e reduzir o desenvolvimento de cárie dental (Takahashi et al., 1991; Koga, 1992; Munro et al., 1993, Huang et al., 2001; Michalek et al. , 2001b e Tsuha et al., 2004) .

0 principio de imunização contra a cárie dental foi inicialmente descrito por Bowen e colaboradores em 1969, e pesquisas posteriores confirmaram que a geração de anticorpos, em especial do tipo IgA na saliva e IgG no fluido crevicular, pode levar ao controle da cárie dental (Oli et al., 2004; Rhodin et al. , 2004 e Tsuha et al., 2004). Desde então, foram^propostas^ várias^ estratégias, vacinais anti-cárie que envolveram vacinas de subunidades, vacinas conjugadas, sistemas vivos de entrega e, mais recentemente, vacinas "de "DNA- (Sh"ivák'umãr et a~l. , 2009). No entanto, nenhuma proteção completa contra a formação da cárie foi observada em testes clínicos.

Além disso, algumas estratégias vacinais,

particularmente aquelas baseadas em vacinas de subunidades, as quais empregam apenas frações acelulares expressas em linhagens bacterianas recombinantes (Escherichia coli), não obtiveram sucesso devido à geração de respostas imunes insatisfatórias ou inadequadas, o que sugere que a natureza do antígeno usado não reproduz a conformação da proteína nativa expressa pelo patógeno.

Desta forma, o emprego de proteínas recombinantes que melhor representam a conformação da proteína nativa ou o uso de sistemas de expressão que permitam a expressão de proteínas recombinantes mais compatíveis com o emprego vacinai representam passos importantes para que estratégias imunoprofiláticas ou terapêuticas efetivas contra a cárie dental sejam desenvolvidas.

Estudos prévios demonstraram o desenvolvimento de vacinas anti-cárie baseadas na região N-terminal de Pl expressa em E. coli (Okahashi et al., 1993, Crowley et al., 1993; Hajishengallis et al., 1995; Toida et al. , 1997 e Matsumoto-Nakano et al., 2008). Normalmente, a proteína Pl recombinante expressa em linhagens de E. coli apresenta-se na forma de uma proteína de fusão ligada covalentemente a proteínas de alto peso molecular de modo a permitir a sua secreção para o periplasma bacteriano, reduzir a degradação proteolítica ou simplificar o processo de purificação.. _

Proteínas híbridas expressas em bactérias podem perder importantes determinantes imunológicos característicos da - -proteína-- nativa,- "logo," â~ geração "de~ peptídeos não fusionados derivados da Pl empregando um sistema de expressão alternativo pode resultar em antígenos vacinais mais promissores e contribuir para o desenvolvimento de produtos e processos voltados para bloqueio da colonização pelo S. mutans e, consequentemente, a promover o controle da cárie dental.

Baixo custo e alto rendimento são as duas razões importantes que justificam o uso de cepas de E. coli como sistemas bacterianos de expressão de proteínas heterólogas. No entanto, muitos problemas estão associados à expressão de proteínas recombinantes em E. coli como, por exemplo, o baixo rendimento, a geração de proteínas insolúveis e a contaminação por endotoxinas. Assim, uma alternativa aos sistemas convencionais de E. coli devem ser baseados em outras espécies de bactérias, como espécies do gênero Bacillus. Dentre as espécies de Bacillus destaca-se o B. SubtiliSr uma bactéria de solo com grande uso industrial e alta capacidade de expressão de proteínas heterólogas, com atividade biológica preservada e sem a contaminação por lipopolissacarídeos que podem afetar as respostas imunes.

Adicionalmente, o atual nível de conhecimento de sua fisiologia e genética, assim como a presença de diversos sistemas de expressão que tornam o emprego de B. subtilis ainda mais atraente (Meima et al. , 2004; Westers et al. , 2004; Harwood, 1992; Paulitz et al. , 2001 e Ferreira et al., 2005). No entanto, poucos laboratórios de pesquisa no mundo estão capacitados para empregar_ linhagens, de. subtilis como sistema de expressão de proteínas heterólogas.

_ _ — De fato, -linhagens de ~B.~ subtili~s demonstram uma boa capacidade de expressão e potencial para a purificação de proteínas recombinantes, principalmente com proteínas derivadas de bactérias gram positivas, tal como demonstrado para a estreptoquinase, que apresentou uma grande estabilidade quando expressa em B. subtilis (Harwood, 1992; Terpe, 2006, Schumann, 2007 é Wong et al., 1994). Resultados semelhantes foram observados com a interleucina humana 3, a qual foi purificada com sucesso a partir de B. subtilis e com um ótimo rendimento de cerca de 100 mg/L (Westers et al., 2005).

Diante de todos os problemas técnicos expostos, ■ desenvolveu-sè uma proteína recombinante inédita, derivada da proteína Pl do S. mutans que engloba a região A ou SBR e seqüências adicionais localizadas à jusante e à montante da referida região A. Os resultados obtidos demonstram que, em função da definição de um novo segmento da proteína Pl do S. mutans (PI39-512) e a utilização de linhagens recombinantes de B. subtilis, foi possível obter um antígeno com características antigênicas e imunogênicas inéditas e inesperadas, que permitem o seu uso como ferramenta para a geração de estratégias vacinais ou terapêuticas inovadoras no controle da cárie humana e geração de produtos inexistente no mercado até o momento.

Estado da técnica:

0 documento coreano CN101036791 A provê o uso de uma vacina gênica voltada para o controle do S. mutans que codifica a proteína GTF (glicosiltranferase) , envolvida, na síntese de material capsular pela bactéria. Diferentemente da invenção em questão, o pedido de patente coreano está baseado- em -(i) um-gene encontrado na"bactéria" em seu estado natural, (ii) uma proteína distinta da proteína PI, (iii) o uso de uma vacina gênica e (iv) uma bactéria (Escherichia coli) distinta daquela ora pleiteada (B. subtilis).

A patente GB 2060647 A descreve o uso do antígeno I/II (ou proteína PI) para o desenvolvimento de vacinas contra a cárie causada pelo S. mutans. No entanto, a patente trata do uso da proteína natural extraída da bactéria S. mutans, enquanto" ~o "presente pedido refere-se ao uso da proteína recombinante produzida em B. subtilis, a qual engloba apenas um trecho da sequencia original da proteína Pl e com características distintas da proteína natural.

0 artigo "Vacinação: uma opção preventiva contra a cárie dental aprimorada pelos conhecimentos da imunologia e da biotecnologia" (PGR-Pós-Grad Rev Fac Odontol São José dos Campos, ν. 4, n.l, jan./abr. 2001) descreve de forma genérica e superficial conceitos relativos ao desenvolvimento de vacinas e o eventual desenvolvimento de vacinas voltadas para o controle da cárie dental causada pelo S. mutans. No entanto, o gene que codifica para a proteína Pl (spaP) é apenas citado como um dos candidatos a antígeno vacinai para o controle da cárie dental e não são mencionados dados experimentais ou definição de processos que conflitam com a presente invenção. 0 documento WO 2006/060903 Al descreve o uso de

peptídeos que interferem com a capacidade do S. mutans em trocar material genético e produzir biofilme, necessário à ligação da bactéria à superfície denta_l. _ O presente pedido, por sua vez, propõe uma estratégia experimental totalmente distinta, envolvendo o conceito de vacinas e anticorpos que - -bloqueiam a adesão da "bactéria ao ho'spe~deiró~, Baseados em um derivado da proteína PI, sem qualquer ligação com a capacidade de troca de material genético entre bactérias.

0 documento WO 1988/006594 descreve o uso de peptídeos sintéticos derivados da proteína Pl do S. mutans apresentando até 35 aminoácidos derivados da proteína PI. Nenhum deles coincide com a proteína recombinante descrita na presente invenção. Pelo contrário, a estratégia descrita "está voltada no uso de polipeptídeos sintéticos e não de proteínas recombinantes.

A patente US 4442085 descreve um processo de purificação da proteína A do S. mutans e sua utilização na preparação de vacinas. De fato, a noção de que proteínas de superfície do S. mutans poderiam ser usadas como base para o desenvolvimento de vacinas anti-cárie já existe, no entanto, a presente invenção se diferencia pelo fato de empregar um fragmento da proteína Pl que se mostrou mais eficaz do que a proteína natural na geração de anticorpos que neutralizam a capacidade do S. mutans em aderir a superfícies abióticas.

A patente CN 101036790 A descreve o uso de vacinas de DNA que codificam para proteínas localizadas na superfície do S. mutans. No entanto, tanto o conceito vacinai quanto as proteínas expressas são distintos daqueles descritos na invenção ora pleiteada.

0 artigo "Differenciation of salivary agglutinin- mediated adherence and aggregation of mutans streptococci by use of monoclonal antibodies against_the major surface protein PI" (Infection and Immunity, vol. 60, no. 3, Mar. 1992, p. 1008-1017) demonstra que anticorpos monoclonais gerados - com a- proteína Pl do S. ItiuiTans podem bloquear a capacidade de adesão da bactéria a superfície dental. Os experimentos foram feitos empregando formas recombinantes da proteína Pl produzidas em E. coli. A presente invenção se diferencia do estudo feito pelo fato de empregar um fragmento da proteína Pl que se mostrou mais eficaz do que a proteína natural na geração de anticorpos que neutralizam a capacidade do S. mutans em aderir a superfícies abióticas. Além disto, o uso de linhagens de B. subtilis, e não E.colif contribuiu de forma não previsível para a geração de uma proteína com potencial vacinai superior a qualquer outra já descrita na literatura.

O artigo "Identification of a salivary agglutinin- binding domain within cell surface adhesin Pl of Streptococcus mutans" (Infection and Immunity, vol. 61, no. 4, Apr. 1993, ρ. 1547-1552) descreve regiões da proteína Pl do S. mutans que estão diretamente relacionadas ao processo de adesão da bactéria a superfícies abióticas, como a superfície dental. A seqüência descrita no estudo engloba os aminoácidos 186-464 da proteína nativa, enquanto a seqüência descrita na presente invenção engloba os aminoácidos 39 a 512. A diferença na região expressa, assim como a expressão da proteína em B. subtilis, contribuíram para a produção de um material com características antigênicas únicas, o que resultou na geração de anticorpos mais eficientes para o bloqueio da adesão da bactéria.

Descrição das Figuras:

A figura 1 mostra a construção_ do vetor pLDV7 01_ (B) , no qual o fragmento de DNA codificante (A) para a proteína PI39-512 foi clonado à montante do promotor Pgrac (P) do

.vetor. "pHT08^. - ------------- ~ " ""

A figura 2 revela a expressão, detecção e purificação da proteína recombinante PI39-512 a partir da linhagem recorabinante de B. subtilis (LDV701). A figura 3 revela a especificidade dos anticorpos

gerados com a proteína PI39-512 após a imunização subcutânea com adjuvante de Freund (Sigma) em camundongos Balb/c fêmeas.

- " A figura 4' mostra a titulação dos anticorpos anti-Pl39-

512 (IgG) presentes em amostras de soro de animais imunizados com a proteína recombinante.

A figura 5 mostra a detecção por imunofluorescência da proteína Pl nativa na superfície do S. mutans empregando os soros gerados com as proteínas recombinantes PI39-512 e PI39- 512d · A figura 6 revela a caracterização funcional dos anticorpos gerados com a proteína PI39-512 nativa ou desnaturada por tratamento térmico.

Descrição detalhada da invenção:

0 presente pedido de patente de invenção provê uma

seqüência de aminoácidos de uma proteína imunogênica recombinante derivada da proteína Pl de S. mutans, que inclui a porção amino terminal, sem o peptídeo sinal (1), e 473 aminoácidos da região variável (aminoácidos 39 a 512) da proteína nativa; um plasmídeo recombinante; formulações farmacêuticas derivadas destes, preferencialmente vacinas, e anticorpos poli e monoclonais derivados desta.

Adicionalmente, a presente ^invenção destina-se ao .uso das seqüências e/ou plasmídeos recombinantes que codificam para o antígeno vacinai Pl39_5i2 aplicado no controle . _ . profilát-ico ou terapêutico da "cárie" e"/oiI doenças sistêmicas associadas à bactéria, tal como a endocardite bacteriana.

Em uma primeira modalidade, o presente pedido de patente trata da seqüência de aminoácidos da proteína imunogênica Pl39_si2, que difere da região A (2), a qual corresponde aos aminoácidos 186-464, previamente utilizados em pesquisas voltadas para o desenvolvimento de vacinas contra a cárie dental, por englobar regiões adicionais à " montante e à jusante. A proposta de uso desta região é inédita e contribui para as propriedades imunogênicas observadas.

A figura IA corresponde a um esquema representativo da seqüência primária da proteína Pl de S. mutans, a qual apresenta em sua porção N-terminal o peptídeo sinal (resíduos de aminoácido 1-38) (1) e a região rica em alanina denominada de região A ou SBR (resíduos de aminoácidos 186-464) (2). A região central contêm a porção variável ou região V (resíduos de aminoácidos 465-839) (3) e a região rica em prolina ou região P (resíduos de aminoácidos 840-963) (4). Na porção C-terminal, há a região de ancoramento na membrana citoplasmástica e parede celuar (resíduos de aminoácidos 1486-1556) (5), o motivo LPXTG (resíduos de aminoácidos 1529-1533) (6) e cauda citoplasmática (resíduos de aminoácidos 1557-1561) (7).

Para a geração da proteína Pl39_5i2, foi clonada a região que compreende a porção N-terminal, sem o peptídeo sinal (1), e uma pequena porção da região V (8) .

Em uma segunda modalidade da_invenção, descreve-se um. plasmídeo recombinante pLDV701, derivado do vetor pHT08 (Nguyen et al., 2007), construído a partir da clivagem por enzimas de-restrição- (BamHI "e ""AstriΓ cio" plasmídeo pGPlN, o qual é derivado do vetor pGEM-T-easy e possui a seqüência codificante para os aminoácidos 39 a 512 de S. mutans UA159 (Adjic et al., 2002) .

A enzima BamHI digere o fragmento SpaPlN à montante enquanto a enzima de restrição AatII digere o fragmento numa região à jusante do fragmento SpaPlN. Como resultado da dupla digestão do pGlN, é gerado um fragmento de DNA de tamanho molecular Igual a 1.461 pb, que é extraído do gel de agarose 0,8%, purificado utilizando-se, por exemplo, o kit de extração "QIAquick® Gel" e ligado com o auxílio da T 4 Ligase, resultando no plasmídeo recombinante PLDV701 contendo a seqüência de ácidos nucléicos que codifica para

a proteína Pl39_5i2·

A figura IB corresponde à representação do vetor ' 13/33 construído pLDV701, o qual apresenta o promotor Pgrac (P) e uma cauda com 8 histinas (H) à jusante da região que codifica para a proteína Pl39_5i2·

Em uma terceira modalidade, o presente pedido destina- se ao preparo de formulações farmacêuticas contendo a proteína recombinante Pl39_5i2, preferencialmente, vacinas. As formulações farmacêuticas podem ser administradas por via de mucosa, transcutânea e/ou vias de administração parenteral.

Em uma quarta modalidade, a invenção pleiteia o uso da seqüência e/ou plasmídeos recombinantes como antígeno vacinai no preparo de formulações vacinais e/ou imunoterapêuticas _aplicadas__ no controle^ prof ilátxco=, e/.ou terapêutico de doenças associadas ao S. mutans, como a cárie dental e a endocardite bacteriana.

'Em uma"quinta" modalidade, ~a presente invenção provê o uso da proteína Pl39_5i2 e/ou proteínas e peptídeos dela derivados, na produção de anticorpos poli ou monocíonais empregados na prevenção ou tratamento de cárie dental e outras doenças associadas à infecção pelo S. mutans.

A proteína recombinante Pl39_5i2 foi construída em laboratório com base nos estudos de caracterização fisiológica e imunológica da proteína Pl completa de S. mutans, assim como da região denominada A (ou SBR).

Os resultados indicam que a inclusão de seqüências adicionais à montante e à jusante da região A (2) e sua produção em linhagens recombinantes de B. subtilis conferiu propriedades inéditas à proteína recombinante quanto à sua estabilidade, conformação e, sobretudo, suas propriedades imunológicas. Construção da proteína, recombinante PI39 512

O plasmideo recombinante pLDV701, que codifica para a proteina Pl39 512, foi obtido a partir da inserção do produto de amplificação de uma porção do gene spaP, da linhagem laboratorial de S. mutans UA159, no vetor pGEM-T-Easy nos sítios de clivagem das enzimas de restrição BamHI e AatII.

Os iniciadores utilizados na amplificação por PCR continham sítios de clivagem para as referidas enzimas. 0 produto de amplificação contendo 1.4 61 pb foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8%, e posteriormente, excisado e purificado empregando o sistema "QIAquick® Gel extraction kit" conforme instruções do fabricante.

0 fragmento foi ligado ao vetor j?HT08jom, xe.tor ^de, expressão previamente descrito para uso em linhagens de B. subtilis, utilizando-se a enzima T4 ligase. Desta forma, _ .foi .obtido o -plasmideo - recombinante "contendo "o fragmento que codifica para a porção amino-terminal da proteína Pl e uma pequena porção da região variável da proteína.

Os demais procedimentos de confirmação da obtenção do plasmideo recombinante e de transformação em linhagens de E. coli K-12 e B. subtilis são procedimentos laboratoriais de uso rotineiro.

Procedimento para a purificação da proteína PI39 512 - As etapas"desenvolvidas para a purificação da proteína

Pl39 512 referem-se à preparação da massa celular, extração da proteína e cromatografia de afinidade.

- Preparação da Massa Celular:

Uma alíquota do estoque congelado de B. subtilis recombinante LDV701, albergando o plasmideo pLDV701 foi inoculada em 5 mL de meio LB com cloranfenicol (30 yg/mL) em erlenmeyer de 500 mL e incubada a 37 °C, 200 rpm em agitador orbital por 18 horas.

Este pré-inóculo foi utilizado como inóculo de 1 L (1 erlenmeyers de 3 L com 1 L de meio de cultura) nas mesmas condições de cultivo do pré-inóculo, até a absorbância de 0.6-0.8, no qual foi adicionado 0,1 M de IPTG. A cultura foi mantida por 4 horas sob indução e a amostra foi centrifugada a 10.000 χ g por 30 minutos a 4°C e a massa celular estocada a -80°C para processamento posterior.

- Extração da Pl39 512'

A massa bacteriana foi ressuspensa em 1/10 do volume original em tampão A (0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaClf pH 7.5) e lisozima (800 pg/mL) e mantida por 30_ minutos_ a. 3.7°. C. Posteriormente, 0,01% de SDS (dodecil sulfato de sódio) e 0,01 M de PMSF (fenilmetilsulfonil fluoreto) foram adicionados -à - suspensão -e " as "células "foram ".1 isadas por sonicação.

O homogenato obtido foi clarificado por centrifugação a 10.000 rpm por Ih a 4 °C. O sobrenadante foi micro- filtrado com filtros de 0.22 μιη Millipore. A solução obtida ao final desse processo foi denominada homogenato clarificado e foi aplicada à coluna de cromatografia de afinidade.

- Cromatografia de Afinidade por Níquel:

A cromatografia foi realizada no aparelho Akta Explorer empregando-se a resina Histrap equilibrada com 5 volumes de coluna (vc) de tampão A com fluxo de 1 mL/min. O homogenato clarificado (1 L) foi aplicado em coluna com fluxo de 1,0 mL/min. A fração não adsorvida foi denominada FT. A proteína Pl39_5i2 foi eluida com 5 mL de tampão de eluição com concentrações crescentes de imidazol (0.05 M até 1 Μ) . A coluna foi regenerada com 5 vc de Tampão B e 10 vc de água destilada.

As frações eluidas foram quantifiçadas por espectrofotometria e caracterizadas em SDS-PAGE com géis de poliacrilamida na concentração de 12,5%.

Avaliação Ixaonológica da proteína PI39 512 - Ensaio de Imunização:

Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem Balb/C, de 6 a 8 semanas de idade, obtidos no Biotério de Isogênicos da Parasitologia-ICBII/USP.

O protocolo de imunização consistiu da administração subcutânea de 5 doses de 10 yg de proteína _Pl39^5i2 combinada com adjuvante de Freund completo ou incompleto (a partir da segunda dose) com intervalo de 14 dias.

A proteína- recombinante- foi- empregada como ántígeno em duas formas: solúvel (Pl39_5i2) ou desnaturada a 100°C por 10 minutos (PI39 5i2d) · O sangue dos animais foi coletado um dia antes de cada dose e duas semanas após a última dose. Os soros dos animais foram recolhidos após a

coagulação do sangue a 37°C por 30 minutos e retração do coágulo a 4 0C por 30 minutos. Após a centrifugação refrigerada de 3.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi - retirado e estocado á -20°C. Como controle, empregou-se a proteína Pl recombinante completa, expressa e purificada da cepa de E. coli CG14.

Avaliação da Resposta Humor a. 1

Ensaio de ELISA para Titulação de Anticorpos

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Específicos contra PI39-512· Poços alternados de uma microplaca de poliestireno Polisorp (Nunc) foram sensibilizados por 18 horas a 4°C com 200 ng de proteína recombinantes PI, Pl39_5i2 solúvel ou desnaturada.

As placas foram lavadas três vezes com PBS Ix e, após a lavagem, foi feito o bloqueio adicionando-se 200 μΐ de PBS Ix Tween 0.05% com leite 5% durante 60 min a 37°C.

Após novo ciclo de lavagens (3x) , 100 μΐ dos soros foram aplicados aos poços e diluídos sericamente, estes conjuntos foram incubados à temperatura ambiente por lh30min.

As placas foram novamente lavadas 3 vezes com PBS contendo Tween a 0,05% (PBST) e a revelação foi feita com 100 pL/poço da solução reveladora por^2_0=rain,= à^temperatura ambiente e no escuro e interrompida com 50 pL por poço de ácido sulfúrico a 1 M. _ _ _ A leitura -da- densidade" ópti"ca" foi "realizada ~a 4 92 nm em leitor de placa (Multiscan MS- Labsystems). Cada ensaio foi realizado em duplicata e os títulos dos anticorpos foram estabelecidos como o inverso da maior diluição dos soros com densidade óptica acima daquelas obtidas com os soros pré-imunes.

Avaliação funcional dos anticozrpos anti-pl39_5i2 específicos

- Imunofluorescência: As linhagens PC3370 (ΔΡ1), deletada no gene que

codifica a proteína PI, e PC3370C de S. mutans crescidas foram preparadas por meio de lavagens com PBS IX e ressuspensão em 1 ml de PBS IX.

As bactérias preparadas (100 μΐ) foram espalhadas em lâminas de vidro e fixadas por aquecimento. Em seguida, as lâminas foram bloqueadas com BSA 3% por 30 min à temperatura ambiente e foi adicionado 20 μΐ de soro (anti- Pl, anti-Pl39-5i2 ou anti-Pl39-5i2d) diluido 1/500 e a mistura foi incubada por 30 min à 37° C. Posteriormente, a lâmina foi lavada com PBS.

Após esse procedimento, o segundo anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado ao FITC (Sigma Aldrich) foi adicionado e incubado ao abrigo da luz por 30 min à 37° C. Novas lavagens foram feitas e a células marcadas foram observadas em microscópio de fluorescência.

Inibição da agregação mediada por saliva de S. mutans por meio de anticorpos anti-Pl39-5i2 em placas de

micro t i tulação: __ __________ ==,, ____—— ——

Inicialmente, a saliva de um único doador foi clarificada por centrifugação (14.000 rpm, 15 min à 4°C).

~Pár"ã" os "ensaios de "agregação dê~S. mutans e inibição em presença de diferentes soros, as células de S. mutans PC3370 (controle negativo) e -PC3370C foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas para uma DO (600 nm) de 1.

Para o ensaio de agregação, 100 μΐ da suspensão bacteriana juntamente com 50 μΐ PBS IX, 50 μΐ de saliva clarificada diluída em tampão KPBS (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 6.5 mM Na2HPO4, pH 7.2) e 2 μΐ de CaCl2 (0.1 M) foram misturados e aplicados a poços de placas de microtitulação.

Esse material foi incubado por 5 min à 31° C para estabilização e depois a DO (600nm) foi medida em espectrofotômetro para medição da absorbância no tempo 0 (TO) . Em seguida, a placa foi incubada por mais 60 min e a DO foi novamente medida, resultando no valor T60. Para calcular a taxa de agregação das cepas, foi utilizada a equação: [TO - T60] .

Para o ensaio de inibição da agregação, foram misturados 133 μΐ de suspensão bacteriana, 50 μΐ PBS com os anticorpos devidamente diluídos e 2 μΐ de CaCl2. A mistura foi colocada em poços de placas de microtitulação e incubada por 30 min a 22° C. Posteriormente, a saliva clarificada diluída em KPBS foi adicionada e o conjunto foi incubado por 5 min a 37 0C e a DO no tempo 0 foi determinada.

Depois, a placa foi incubada por mais 60 min e a DO foi novamente medida. A inibição da agregação bacteriana foi estimada por meio do mesmo cálculo _descrito anteriormente. Todos os testes foram independentemente repetidos por três vezes.

— Inibição' da' adesão medi a d a~'"p o F saliva de ST mutans por meio de anticorpos anti-Pl39-5i2 em placas de microtitulação:

A saliva clarificada diluída em KPBS (100 μΐ/ poço) foi colocada em poços de placas de microtitulação e incubada por uma noite à 4°C.

A saliva foi removida e os poços lavados uma vez com TBSC (10 mM Tris-HClf 150 mM NaCl; pH 7. 6 e 5 mM CaCl2), bloqueados com BSA 1% por 1 hora à temperatura ambiente. Depois, os poços foram lavados duas vezes com TBSC e 100 μΐ da suspensão bacteriana (D0600nm = 1) foram adicionados aos poços e as placas incubadas à 370C por 2 horas.

Então, os poços "foram lavados com TBS e as células aderentes fixadas com formaldeído 25% por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, a placa foi lavada com TBS e as células foram marcadas com cristal violeta 0.5% por 1 min à temperatura ambiente.

Por fim, a placa foi lavada com TBS e o corante remanescente foi diluído em ácido acético 7% e a absorbância de cada amostra foi determinada em espectrofotômetro (D0600nm) . Para os ensaios de inibição da adesão, inicialmente as células preparadas foram incubadas com os soros anti-Pl39-si2, anti-Pi39-5i2d ou anti-Pl (controle positivo) na diluição de 1/3200 por 30 min à 37°C, e depois, adicionadas à placa revestida com saliva.

0 número de células ligadas com as amostras de soro, com e sem incubação prévia, e depois adicionadas a placa de ELISA foram calculadas a partir _de uma curva _padrão._ que_ relaciona o número de células de S. mutans e a D0600nm.

Como controle positivo para a reação de inibição foi empregado^ também EDTA ( 3 mM) , pois""a l~igáção "entre a Pl e a gp34 0 é cálcio dependente (Crowley, 1993) . Como controle negativo foi empregado o soro pré-imune. Os -experimentos foram repetidos três vezes de forma independente.

Resultados obtidos:

Avaliações Estatísticas:

Os resultados foram analisados no programa GraphPrism e foram expressos como ±SD. O método estatístico One way ANOVA foi usado para comparar a inibição de aderência pelos soros anti-Pl39-5i2. As diferenças foram consideradas significativas quando o valor de ρ < 0.05.

- Ensaio 1:

A proteína recombinante Pl39_5i2 foi expressa e purificada com eficácia empregando um sistema de B. subtilis. A proteína recombinante é reconhecida por anticorpos gerados com a proteína Pl completa, indicando a preservação de epítopos importantes.

- Ensaio 2:

Um primeiro exemplo de formulação vacinai foi testado em modelo murino, por administração subcutânea, consistindo no uso da proteína recombinante Pl39_5i2 co-administrada com o adjuvante de Freund.

- Ensaio 3:

A proteína recombinante Pl39_5i2 também pode ser utilizada sozinha ou em co-administração com outros adjuvantes para o controle e/ou erradicação do S. mutans.

0 produto da presente invenção foi caracterizado em um

- - estudo ,—baseado, em sua obtenção. ..e ..avaliação___de...... suas

propriedades imunológicas e funcionais. A proteína recombinante Pl39_5i2 foi expressa e

purificada com grande eficiência pelo sistema de B. subtilis.

O vetor pLDV7 01 codifica o polipeptídio N-terminal recombinante, truncado da proteína Pl de S. mutans, com uma cauda de histidina (H) sob controle do promotor Pgrac (P) induzível por IPTG (Fig. 1B).

A proteína codificada tem uma massa molecular predita de 55,7 kDa. Uma única banda, com uma massa molecular aparente de aproximadamente 50 kDa, reativa com um anti- soro anti-Pl, foi detectada em immunoblots de extratos totais de B. subtilis LDV701 após a incubação com IPTG para induzir a expressão da proteína.

0 mesmo anticorpo policlonal específico contra a Pl detectou apenas uma proteína de 18 5 kDa correspondendo à Pl presente no extrato do S. mutans PC3370C, usado como controle positivo.

Nenhuma reação cruzada foi observada em extratos de B. subtilis transformadas com o vetor vazio, pHT08, ou na cepa LDV701 na ausência do indutor (Fig. 2A).

A proteína recombinante é acumulada no citoplasma do B. subtilis LDV701 e aproximadamente 50% da proteína apresenta-se na fração solúvel e 50% na fração insolúvel (Fig. 2B).

Δ obtenção da proteína Pl39_5i2 purificada foi feita carregando uma coluna de níquel com extratos solúveis do B. subtilis LDV701 e a proteína recombinante foi eluída com 0,5 M de imidazol (Fig. 2C) . O rendimento final da proteína recombinante foi de 15 mg/L de cultura, foi realizado após

a incubação a 370C por 4h na presença "de -I-PTG.-----------

A caracterização das propriedades imunológicas da proteína^ --Pl39^512 - ,foi,_ ániciada por meio da imunização subcutânea de dois grupos de camundongos com 5 doses* "cfa proteína: um grupo com a proteína solúvel e outro com a proteína desnaturada por fervura (Pl39-si2d) ·

Os anticorpos obtidos com a proteína não-tratada e desnaturada, assim como o anticorpo anti-Pl, foram titulados por meio de ELISA usando as proteínas purificadas Pl 39-512/ Pl39-5i2d e Pl como antígeno de fase sólida.

Os maiores" títulos de IgG -sérico, anti-Pl39-512 foram obtidos com a proteína solúvel, 7.6 χ IO4, e quando a proteína desnaturada foi empregada os títulos de IgG foram um pouco menores (6.8 χ IO3). A proteína solúvel empregada como antígeno ligado apresentou títulos de IgG que variaram de 7.6 χ IO4 até l.lx IO4, com o soro anti-Pl39-512 e anti- Pl39-5i2d / respectivamente. Quando a proteína desnaturada Pl39-.51.2d foi empregada como antígerio ligado, os títulos de IgG foram similares, contudo com uma potência menor do que quando foi empregado a proteína solúvel, conforme pode ser observado na Tabela 1 abaixo:

Soro Antigeno de fase sólida: Pl PI39-512 Pl-39-512d Anti-Pl 1.65 χ IO9 1.3 χ IO4 6.3 χ IO3 AntÍ-Pl39-5i2 7.0 χ IO3 7.6 χ IO4 6.8 χ IO3 Anti-Pl39-Si2d 8.4 χ IO3 1.1 χ IO4 5.1 χ IO3 Anti-Smua ND 1.7 χ IO5 7.0 χ ~10"4~ Anti-SmuAPlb - - ■ -. - . ,ND - 2.0 χ IO2 1.4 χ IO2

ND - Não determinado a - Soro anti-S. mutans PC3370C b - Soro anti-S. mutans PC3370

As propriedades antigênicas da proteína PI39-512 na forma solúvel e desnaturada foram estudas e comparadas em ensaios de ELISA empregando três anticorpos: o primeiro contra o S. mutans (α-Smu), o segundo contra a proteína Pl recombinante completa e, por fim, um controle negativo, - com anticorpo contra uma linhagem de S. mutans nocaute para a 15' proteína Pl (PC3370).

Os resultados mostraram que o soro contra a proteína recombinante Pl e contra o S. mutans (PC3370C) . foram fortemente reativos com ambas as formas da proteína PI39-512 e que os títulos de IgG menores foram obtidos com a proteína PI39-512 desnaturada (Figura 4) .

Os anticorpos gerados com as duas formas da proteína PI39-512 são capazes de reconhecer especificamente a proteína Pl nativa expressa na superfície da linhagem PC3370C de S. mutans, mas não na linhagem nocaute PC3370 (Fig. 3) . Além disso, este reconhecimento foi semelhante ao anticorpo anti-Pl.

Coletivamente, estes resultados indicam que proteína PI39-512 purificada a partir da linhagem recombinante de B. subtilis, nas formas solúvel e desnaturada, apresentam determinantes antigênicos e imunogênicos da proteína Pl nativa de S. mutans e induzem altos títulos de IgG antígeno-específico após imunização parental.

Entretanto, a presença de títulos"IgG"anti-Pl- menores gerados em camundongos imunizados com a proteína P139-512d sugerem" que*alguns- determinantes_ antigênicos, como epítopos conformacionais, são perdidos após desnaturação por fervura da proteína. Além disso, estes resultados sugerem que epítopos lineares e conformacionais presentes na proteína Pl nativa, particularmente, aqueles localizados na superfície intacta das células de S. mutans, são mantidos no polipeptídeo recombinante PI39-512 não desnaturado

As características funcionais dos anticorpos gerados contra a proteína recombinante Pl39_512 produzida em B. subtilis foi demonstrada por meio da análise da capacidade destes anticorpos em inibir in vitro tanto a agregação quanto a aderência de S. mutans mediada por saliva em superfícies abiótica. Os anticorpos anti- PI39-512 quanto o anti-Pl39-5i2d inibem o processo de agregação mediado por saliva de S. mutans em níveis similares aos alcançados pelo soro anti-Pl (Fig. 3A) .

Em contraste, o soro pré-imune (controle ne.gativo) não teve nenhum efeito neste processo. Ambos os anticorpos anti-Pl39_5i2 e ant i-Pl39-5i2d inibiram significativamente a ligação da linhagem PC3370C de S. mutans aos constituintes salivares imobilizados (Fig. 3B).

Nenhuma inibição significante foi observada em presença do soro pré-imune, assim como nenhuma agregação e aderência foi observada sem ou com saliva quando a linhagem de S. mutans PC3370, nocaute na proteína PI, foi empregada. Os resultados indicam que importantes determinantes imunológicos, necessários tanto para a agregação como para . _a adesão da proteína Pl nativa de S. mutans, estão presentes na proteína recombinante expréssa"em Bz -subti-lis e que os anticorpos gerados apresentam papel efetor e possível' aplicação - em . vacinas_ acelulares contra o S. mutans.

0 presente pedido de patente apresenta uma proteína recombinante derivada da proteína Pl de S. mutans com potencial imunogênico preservado e, quando associado ao adjuvante de Freund ou outros substâncias com propriedades adjuvantes em imunizações por vias parenterais, induz altos títulos de IgG sérico específicos contra a proteína Pl de S. mutans. -

Apesar de representar apenas uma porção da principal

proteína de adesão de S. mutans, a formulação demonstrou ser mais eficiente em gerar anticorpos neutralizantes contra o patógeno do que a proteína Pl completa.

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Claims (18)

1. Seqüência de ácido nucléico recombinante que codifica para os aminoácidos 39 a 512 da proteína Pl do S. -mutans caracterizada pelo fato de ser estabelecida na SEQ. de ID. No. Ie compreender a região amino terminal da proteína Pl sem incluir o peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 38), toda a sua região A e parte da região variável expressa por linhagens da bactéria S. mutans.

2. Proteína recombinante PI39-512 caracterizada pelo fato de não apresentar o peptídeo sinal e de conter toda a região A e parte da região variável da proteína Pl do S. mutans.

3. Proteína recombinante, de acordo com a reivindicação 2, carac te rizada pelo fato de compreender a SEQ. de ID. No. 2.

4. Proteína recombinante, de acordo com qualquer umas das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de ser , posteriormente purificada por cromatografia de afinidade de formas solúvel e insolúvel.

5. Proteína recombinante, de acordo com qualquer umas das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de ser expressa em linhagens recombinantes de B. subtilis.

6. Proteína recombinante, de acordo com a reivindicação -5, car ac te r i ζ ada pelo fato de ser expressa em outros sistemas de expressão em bactérias, fungos (leveduras), vírus ou células de mamífero.

7. Proteína recombinante, de acordo com as reivindicações 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de ainda ser submetidas a um tratamento desnaturante.

8. Proteína recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o tratamento desnaturante consiste na incubação da proteína a IOO0C por 10 minutos.

9. Proteína recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que esta pode ser fusionada a outras proteínas heterólogas para subsequente purificação da proteína híbrida por cromatografia de afinidade.

10. Proteína recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que pode ser fusionada a antígenos de natureza viral, bacteriana, parasitária ou fúngica.

11. Formulação farmacêutica e/ou veterinária caracterizada pelo fato de compreender a proteína recombinante conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5,_ 6, 7, 8, 9 ou 10 e/ou a seqüência de ácidos nucléicos conforme definida na reivindicação 1 em veículos farmaceuticamente aceitáveis.

12. Formulação, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de compreender, de forma preferencial, a proteína PI39-512 purificada.

13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que esta está, preferencialmente, na forma de vacina.

14. Formulação, de acordo com a reivindicação 13, car ac ter i zada pelo fato de que a formulação vacinai compreende, opcionalmente, vacinas de DNA que codificam a proteína P139-512-

15. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13 ou 14, caracterizada pelo fato de compreender, opcionalmente, adjuvantes vacinais, particularmente, sais de alumínio (alumen), MF59 e saponina.

16. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a proteína PI39-512 recombinante purificada está presente em uma concentração de 1 pg/dose a 500 pg/dose, de preferência, 50 a 100 yg/dose.

17. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que pode ser administrada pelas vias intramuscular, subcutânea, intradérmica e mucosas, preferencialmente, a via oral.

18. Uso da proteína recombinante conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de ser para preparar uma formulação compreendendo a proteína PI39-512 como ingrediente ativo indicado para o tratamento de cáries% ou infecções sistêmicas associadas ao S. mutans, preferencialmente, endocardites e outras infecções sistêmicas.