BRPI1103675A2 - promotor acentuado e mÉtodo para produzir l-lisina com o uso do mesmo - Google Patents

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BRPI1103675A2
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Jae Woo Jang
Jun Ok Moon
Sang Jo Lim
Hyung Joon Kim
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Cj Cheiljedang Corp
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Abstract

PROMOTOR ACENTUADO E MÉTODO PARA PRODUZIR L-LISINA COM O USO DO MESMO. A presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico que tem atividade promotora acentuada, que é ligada de modo operável a um gene que encodifica aspartato aminotransferase e derivado de Corynebacterium glutamicum, um vetor que compreende a molécula de ácido nucléico, um transformante transformado com o vetor, e um método para produzir L-lisina com o uso do transformante.

Description

PROMOTOR ACENTUADO E MÉTODO PARA PRODUZIR L-LISINA COM O USO DO MESMO
Campo da Técnica
A presente invenção refere-se a um promotor acentuado e a um método para produzir L-Iisina com o uso do mesmo.
Antecedentes da Técnica
As bactérias corineformes são microorganismos industriais que foram amplamente usados para produzir aminoácidos e vários ácidos nucléicos. As bactérias corineformes são bactérias gram-positivo que são usadas para produzir substâncias químicas que têm várias aplicações industriais nas áreas de alimentação animal, fármacos, processamento de alimento ou similares, que incluem aminoácidos tais como L-lisina, L-treonina, L-arginina e ácido glutâmico, e vários ácidos nucléicos, e requerem biotina para crescimento. Elas são caracterizadas por divisão por ruptura de junta (snapping division), e têm pouca tendência degradar metabolitos produzidos. Tais bactérias corineformes são exemplificadas pelo gênero Corynebacterium que inclui Corynebacterium glutamieum, o gênero Brevibacterium que inclui Brevibacterium flavum, Arthrobacter sp. e Mierobaeterium sp.
Como um dos L-aminoácidos, a L-lisina é comercialmente usada como um suplemento de alimentação animal, por causa de sua capacidade de aprimorar a qualidade de alimentação através do aumento da absorção de outros aminoácidos, na medicina humana, particularmente, como ingredientes de soluções de infusão, e na indústria farmacêutica. Portanto, a produção industrial de lisina tem se tornado um processo industrial economicamente importante.
Para aprimorar a eficiência da produção de lisina, a atividade enzimática da rota biossintética tem sido aumentada através da amplificação dos genes individuais na rota biossintética da lisina ou da modificação de seus promotores. As cepas de Corynebacterium que ancoram genes acentuados envolvidos em biossíntese de lisina e métodos de produção L-Iisina também são conhecidos na técnica. Por exemplo, a patente US6.746.855 revela cepas de corynebacteria com um gene IysE acentuado (gene portador para exportação de lisina), no qual os genes selecionado do grupo que consiste em um gene dap A, um gene IysC, um gene pyc e um gene dapB são adicionalmente introduzidos, e um método para a produção de L-lisina através do cultivo de cepas. Além disso, a patente US6.221.636 revela uma bactéria corineforme que porta um DNA recombinante que compreende uma codificação de seqüência de DNA para aspartoquinase, na qual a atividade inibitória de retroalimentação de L-lisina e L-treonina é substancialmente dessensibilizada, e uma codificação de seqüência de DNA para uma diaminopimelato decarboxilase. 0 pedido de patente US 20060003424 revela um método de produção de L-aminoácido com o uso de bactérias corineformes que tem uma atividade enzimática aprimorada através da modificação do promotor para gene GDH, gene CS, gene ICDH, gene pDH ou gene produtor de ACO para tornar isto próximo a uma seqüência consensual.
Para desenvolver cepas de alta titulação a partir de tais bactérias corineformes através da engenharia genética ou engenharia metabólica, a expressão de genes envolvidos em diversas rotas metabólicas deve ser seletivamente regulada em bactérias corineformes. Em suma, é importante regular a atividade de um promotor, que é uma região regulatória e recruta polimerase de RNA para iniciar a transcrição da molécula de DNA. Até o presente momento, não há relato de bactérias corineformes que tenham uma alta taxa de expressão através do aprimoramento do promotor de gene aspartato aminotransferase (EC; 2.6.1.1; aspB) que é considerado por desempenhar um papel importante no suprimento de um precursor de lisina, aspartato na lisina rota biossintética.
Descrição
Problema Técnico
Portanto, os presentes inventores se esforçaram para aumentar a taxa de expressão através do aprimoramento do promotor do gene aspB. Finalmente, eles fornece um microorganismo pertencente ao gênero Corynebacterium, que mostra uma atividade de aspartato aminotransferase maior que sua atividade endógena através do aprimoramento do promotor aspB no cromossomo da Corynebacterium através da substituição de base e da introdução do promotor aprimorado, completando assim a presente invenção.
Solução Técnica
Um objetivo da presente invenção consiste em fornecer uma molécula de ácido nucléico que tem uma atividade promotora acentuada, que é derivada de Corynebacterium glutamicum.
Um outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer um vetor que compreende a molécula de ácido nucléico que tem uma atividade promotora acentuada.
Ainda outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer um transformante que é transformado com o vetor.
Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer um método para produzir lisina, que compreende a etapa de cultura do transformante.
Efeitos Vantajosos A molécula de ácido nucléico que tem uma atividade promotora acentuada de acordo com a presente invenção, que é ligada de modo operável ao gene aspB e derivada de Corynebacterium glutamicum, mostra uma atividade promotora mais alta que a do tipo selvagem e, portanto, aprimora a atividade de aspartato aminotransferase, levando à produção de eficiência de lisina aumentada. Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra um vetor pDZ para inserção no cromossomo Corynebacterium;
A Figura 2 mostra a um pDZ-aspBPl para substituição de base no Corynebacterium;
A Figura 3 mostra um vetor pDZ-aspBP2 para substituição de base no Corynebacterium; e
A Figura 4 mostra um vetor pDZ-aspBP3 para substituição de base no Corynebacterium.
Melhor Modo
Em um aspecto para alcançar os objetivos acima, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico que tem uma atividade promotora acentuada, que tem qualquer uma seqüência base selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 2, 3 e 4.
Em uma modalidade preferencial, a seqüência base pode ser ligada de modo operável a uma codificação de gene para aspartato aminotransferase, e pode ser derivada do gênero Corynebacteri um.
0 termo "promotor", conforme usado no presente documento, indica uma região do DNA à qual uma polimerase se liga para iniciar a transcrição de gene, a saber, uma seqüência de ácido nucléico não traduzida, usualmente encontrada a montante de uma seqüência de codificação, que fornece um sítio de recognição para RNA polimerase, e localizado a montante de um sítio de iniciação de transcrição de mRNA, para a direção 5'.
Amolécula de ácido nucléico de Corynebacterium glutamicum que tem atividade promotora da presente invenção é ligada de modo operável à codificação de gene para aspartato aminotransferase. A codificação de gene para aspartato aminotransferase é um gene aspB, que é um gene principal envolvido na rota de biossíntese de lisina no gênero Corynebacterium. A aspartato aminotransferase desempenha um papel importante no suprimento do precursor para biossíntese de lisina, aspartato através da catalisação da reação de transferência de grupos amino de glutamatopara oxaloacetato. Portanto, quando a atividade de aspartato aminotransferase aumenta, o precursor para biossíntese de lisina, aspartato, é aumentado, levando à biossíntese de lisina aumentada. Além disso, o termo "ligada de modo operável", conforme usado no presente documento, significa que a seqüência de ácido nucléico que tem uma atividade promotora da presente invenção é funcionalmente ligada ao gene que encodifica aspartato aminotransferase para iniciar e mediar a transcrição da seqüência de codificação, indicando que a seqüência de ácido nucléico que tem uma atividade promotora da presente invenção está ligada de modo operável ao gene aspB para controlar a atividade transcricional do gene operon.
Até o momento, o sítio de início transcricional que inicia a transcrição de gene no promotor do gene aspB ainda não identificado.
Consequentemente, em um Exemplo específico, os presentes inventores executaram a técnica 5'-RACE (Rapid Amplification of 5' cDNA Ends) (Sambrook, J., Russell, D.W. Molecular Cloning: a laboratory manual 3rd ed. 8.54) com a finalidade de identificar o sítio de início transcricional do gene aspB. 5'-RACE é um método para clonar uma região a montante de 5' desconhecida com o uso de um mRNA conhecido, e foi executado com o uso de um core set 5'-Full Race (Cat. n2 6122) disponível junto à Takara. Como um resultado, o sítio de início transcricional do gene aspB foi identificado com o G encontrado 72 bp a montante do códon de iniciação, ATG.
0 sítio de início transcricional identificado foi numerado como +1, e a região de seqüência consensual do promotor foi selecionada para aprimoramento.
A seqüência de ácido nucléico que tem atividade promotora da presente invenção é um promotor de aspB aprimorado de Corynebacterium glutamicum, e é caracterizado pelo fato de que tem uma atividade promotora mais alta que o promotor do tipo selvagem. 0 aprimoramento da atividade promotora pode ser executado por qualquer método conhecido na técnica sem limitação. De preferência, a mutação na seqüência promotora do gene aspB de Corynebacterium glutamicum pode ser induzida por deleção, inserção, substituição conservante ou não conservante ou combinações das mesmas para aprimoramento do promotor.
A molécula de ácido nucléico do promotor da presente invenção pode ser isolada ou preparada com o uso de uma técnica de biologia molecular padrão. Por exemplo, pode ser isolada por PCR com o uso de seqüências iniciadores apropriadas. Ademais, pode ser preparada por uma técnica de síntese padrão com o uso de um sintetizador de DNA automatizado.
Em um Exemplo específico, os presentes inventores adquiriram uma seqüência base (SEQ ID NO. 1) que contém a região promotora do gene aspB (NCBI número de registro NCgl0237) com base no GenBank do US National Institutes of Health (NIH) e, então, com base nisto, sintetizaram oito iniciadores (SEQ ID NOs. 10 a 17). Subseqüentemente, PCR foi executado com o uso de DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo e os iniciadores acima para obter a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, que contém o promotor que tem seqüência modificada (SEQ ID NOs. 2, 3 e 4).
A molécula de ácido nucléico que tem atividade promotora Corynebacterium glutamicum da presente invenção é útil como um promotor para expressão de gene de células procarióticas, em particular, E.coli ou bactérias corineformes. 0 termo "bactérias corineformes", conforme usado no presente documento, inclui microorganismos pertencentes ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium, Arthrobaeter sp. e Mierobaeterium sp. Tais bactérias corineformes incluem Corynebaeterium glutamicum ATCC 13 032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium f lavixm ATCC 14 067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e mutantes que produzem L-aminoácido ou cepas preparadas a partir disso, por exemplo, Corynebacterium glutamicum KFCC 10881 e Corynebacterium glutamicum KFCC 11001 e, de preferência, Corynebacterium glutamicum KFCC 10881, mas não estão limitadas a isto.
Ainda em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um vetor que compreende a molécula de ácido nucléico que tem uma atividade promotora acentuada.
O termo "vetor", conforme usado no presente documento, se refere a um construto de DNA que contém uma seqüência de DNA que é ligada de modo operável a uma seqüência de controle para expressar um gene alvo em um hospedeiro adequado. Tais seqüências de controle podem incluir um promotor para direcionar a transcrição, uma certa seqüência operadora para controlar tal transcrição, uma seqüência que encodifica um sítio de ligação de ribossomo adequado no mRNA, e uma seqüência para controlar o termino da transcrição e da tradução.
0 vetor usado na presente invenção não é particularmente limitado, e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, desde que seja replicável no hospedeiro. Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago ou simplesmente um inserto de genoma potencial e é, preferencialmente, um vetor pECCG122 (Kab-Su Noh et al., Kor.Jour.Microbiol.July.1991 p. 149-154), mas não se limita a isto. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma hospedeiro ou pode, em alguns casos, se integrar no próprio genoma.
Especificamente, o vetor da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira para gerar recombinação homóloga entre a molécula de seqüência de ácido nucléico que tem atividade promotora no vetor e a região promotora do gene endógeno aspB no genoma hospedeiro e, dessa forma, pode se integrar no genoma. Portanto, o vetor da presente invenção pode incluir adicionalmente um marcador de seleção para assegurar a inserção cromossômica. 0 marcador de seleção é usado para a seleção de células transformadas, a saber, usado para assegurar a inserção de um gene alvo, e pode incluir marcadores que fornece fenótipos selecionáveis, tal como resistência ao fármaco, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou expressão de proteína de superfície. Somente as células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou mostrar diferentes fenótipos sob o ambiente que contém o agente seletivo e, dessa forma, as células transformadas podem ser selecionadas De preferência, o vetor da presente invenção pode incluir um gene lacZ.
Em um Exemplo específico da presente invenção, os presentes inventores construíram um vetor capaz de substituir a região promotora do gene aspB de Corynebacterium glutamicum com a seqüência promotora mutada para aprimoramento de sua atividade via recombinação homóloga. Primeiramente, um vetor de clonagem da E.coli pACYC177 foi tratado com enzimas de restrição para preparar terminações abruptas, e para inserção de um gene lacZ, o gene IacZ foi preparado por amplificação de gene a partir do DNA genômico de E.coli K12 W3110 através de PCR, designado para conter o promotor do mesmo, seguido da inserção de uma seqüência adaptadora que contém uma pluralidade de sítios de recognição de enzima de restrição para construir o vetor pDZ para a inserção no cromossomo Corynebacterium (Figurai). Posteriormente, conforme descrito acima, amolécula de ácido nucléico que tem uma alta atividade promotora, que é preparada para conter mutações na seqüência promotora do gene aspB, foi inserida na região adaptadora do vetor pDZ com a finalidade de construir um vetor pDZ-aspBPl que contém a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO. 2 (Figura 2), um vetor pDZ-aspBP2 que contém a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO. 3 (Figura 3), e um vetor pDZ-aspBP3 que contém a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO. 4 (Figura 4).
Ainda em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um transformante transformado com o vetor.
0 termo "transformação", conforme usado no presente documento, significa a introdução de DNA em um hospedeiro de tal maneira que possa replicar como um elemento extracromossômico ou por integração extracromossômica. Em uma modalidade preferencial, após a transformação de uma célula hospedeira com o vetor, a seqüência de ácido nucléico que tem uma atividade promotora no vetor pode ser integrada no cromossomo através de recombinação homóloga com a região promotora de gene endógeno aspB no genoma hospedeiro ou retida em uma forma de plasmídeo.
O método de transformação do vetor da presente invenção pode incluir qualquer método de introdução de um ácido nucléico em uma célula, e pode ser executado através do uso de técnicas padrões conhecidas na técnica, dependendo da célula hospedeira. Os exemplos dos mesmos incluem eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, um método de polietileno glicol (PEG), um método de DEAE-dextran, um método de lipossomo catiônico e um método um ácido acético litio-DMSO.
As células hospedeiras que têm alta eficiência de introdução de DNA estranho que tem altos níveis de expressão de DNA introduzido podem ser tipicamente como as células hospedeiras. As células hospedeiras úteis podem ser todos os microorganismos que incluem células procarióticas ou eucarióticas, preferencialmente, E.coli ou bactérias corineformes, mais preferencialmente, o gênero Corynebacterium ou Brevibacterium, e muito mais preferencialmente, Corynebacterium glutamicum KFCC10881.
0 transformante transformado com o vetor da presente invenção é caracterizado pelo fato de que tem um gene aspB que tem um promotor acentuado através da substituição da região promotora do gene aspB de Corynebacterium glutamicum com a seqüência promotora mutada para ter uma atividade promotora acentuada através da recombinação homóloga, fornecendo assim uma maior atividade de aspartato aminotransferase que o tipo selvagem.
Em um Exemplo específico da presente invenção, sendo que cada um dentre o vetor pDZ-aspBPl que contém a molécula de ácido nucléico que tem a atividade promotora de SEQ ID NO. 2 (Figura 2), o vetor pDZ-aspBP2 que contém a molécula de ácido nucléico que tem a atividade promotora de SEQ ID NO. 3 (Figura 3), e o vetor pDZ-aspBP3 (Figura 4) que contém a molécula de ácido nucléico que tem a atividade promotora de SEQ ID NO. 4 de acordo com a presente invenção foi transformado em Corynebacterium glutamicum KFCC10881 para preparar cada transformante que tem uma aspB atividade promotora acentuada. Na presente invenção, um transformante transformado com pDZ-aspBPl, um transformante transformado com pDZ-aspBP2, e um transformante transformado com pDZ-aspBP3 foram designados como KFCC10881-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3, respectivamente. A atividade de aspartato aminotransferase de cada transformante foi comparada com aquela da cepa parental, KFCC10881. Foi concluído que cada transformante teve atividade superior de 2.1, 2.6 e 1.8 vezes que a cepa parental (Tabela 3), indicando que o promotor acentuado da presente invenção aprimora a atividade de aspartato aminotransferase. Além disso, uma vez que foi comprovado o efeito dos transformantes no aprimoramento da atividade, cada um dentre KFCC10881-aspBPl, KFCC10881-aspBP2, e KFCC10881-aspBP3 foi designado como CA01-773, CA01-774 e CAO1-775, e depositado no Korean Culture Center of Microorganisms (doravante no presente documento, abreviado como "KCCM") em 5 de fevereiro de 2010 sob os números de acesso, KCCM11061P, KCCM11062P e KCCM11063P. Ainda em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para produzir lisina que compreende a etapa de cultivar o transformante.
Na presente invenção, o cultivo dos transformantes pode ser executado de acordo com métodos comuns na técnica, e as condições tais como temperatura, tempo e pH de meio podem ser adequadamente controladas . Os métodos de cultivo conhecidos são descritos na literatura na técnica [Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1991), eStorhas; Bioreaktorenund periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]. Além disso, os métodos de cultivo incluem cultura em batelada, cultura contínua e cultura de batelada alimentada. De preferência, os microorganismos podem ser continuamente cultivados pelo processo em batelada, processo de batelada alimentada ou processo em batelada repetido, mas os métodos não são limitados a isto.
Os meios de cultura usados para o cultivo precisam satisfazer as exigências para crescimento de cepas particulares de uma maneira apropriada. Os meios de cultura para várias cepas são revelados em, por exemplo, "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology (Washington D. C, EUA, 1981). Uma fonte de carbono para os meios de cultura pode ser sugar e carboidrato (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melado, amido e celulose), óleo e gordura (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), um ácido graxo (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolênico), um álcool (por exemplo, glicerol e etanol) , e um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético). As fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura. Uma fonte de nitrogênio também pode ser um composto orgânico que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor fermentado de milho, farelo de soja e uréia) ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio). A fonte de nitrogênio pode ser usada sozinha ou em uma mistura. Uma fonte fósforo pode ser fosfato de diidrogênio de potássio, fosfato de hidrogênio de dipotássio ou seu sal de sódio do mesmo. Além disso, os meios de cultura devem conter um sal de metal (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro) essencial para crescimento. Finalmente, o meio de cultura pode incluir adicionalmente substâncias essenciais para crescimento tais como aminoácidos e vitaminas além das substâncias mencionadas acima. Os precursores adequados também podem ser adicionados aos meios de cultura. Aqueles componentes de meios de cultura podem ser adicionados aos meios de cultura em uma batelada ou em uma base contínua durante o cultivo.
0 pH do meio de cultura pode ser ajustado com um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia), ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Um agente desespumante tal como poliglicol éster de ácido graxo pode ser adicionado para impedir a formação de bolhas. Um estado aeróbico pode ser mantido através da injeção de oxigênio ou gás que contém oxigênio (por exemplo, ar) no meio de cultura. Embora o organismo seja cultivado, o meio de cultura é tipicamente mantido na faixa de 20 a 45°C e, preferencialmente, na faixa de 25 a 40°C. 0 cultivo é continuado até que a produção de L-aminoácido alcance o máximo. A esse respeito, leva de 10 a 160 horas para atingir a quantidade máxima de L-lisina. Este aminoácido pode ser liberado no meio de cultura ou pode permanecer nas células.
Nesse ínterim, o método para produzir lisina que compreende a etapa de cultivo do transformante da presente invenção pode compreender adicionalmente a etapa de recuperar a lisina que é produzida na etapa de cultivo acima. A recuperação de L-lisina das células ou meios de cultura é bem conhecida na técnica. Os exemplos de métodos de recuperação de L-lisina incluem, mas não são limitados a, filtração, cromatografia com troca de anion, cristalização e HPLC.
Modo para Invenção
Nos presentes Exemplos, o sítio de início transcricional do gene aspB foi identificado para a construção do promotor acentuado, e um vetor recombinante para substituição do promotor de aspB da cepa que produz lisina Corynebacterium glutamicum com o promotor acentuado através da recombinação homóloga foi construído. 0 vetor foi transformado na cepa Corynebacterium glutamicum KFCC10881 para obter uma cepa que tem um promotor acentuado no cromossomo, através do qual a cepa produz lisina com alta eficiência.
A cepa Corynebacterium glutamicum KFCC10881 usada na presente invenção é uma cepa com resistência à cisteína S- (2-aminoetila) (AEC) e um caráter vazante de homoserina, que foi preparado através da mutação artificial da cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) como uma cepa parental (vide patentes coreanas 0159812 e 03 97322).
Doravante no presente documento, a presente invenção será descrita em mais detalhes em referência aos seguintes Exemplos. Entretanto, estes Exemplos são somente para propósitos ilustrativos, e a invenção não se destina a ser limitada por estes Exemplos.
Exemplo 1; Identificação do sítio de início transcricional do gene aspB
No presente Exemplo, o sítio de início transcricional desconhecido do gene aspB foi identificado.
Para identificar o sítio de início transcricional do gene aspB, a técnica 5'-RACE (Rapid Amplification of 5'cDNA Ends) (Sambrook, J., Russell, D.W. Molecular Cloning: a laboratory manual 3rd ed. 8.54) foi executada. 5'-RACE é um método para clonar uma região a montante de 5' desconhecida com o uso de um mRNA conhecido, e foi executado com o uso do core set 5' -Full Race (Cat. n° 6122) disponível junto à Takara.
Para o experimento 5'-RACE, cinco iniciadores (Tabela 1, SEQ ID NOs. 5 a 9) foram sintetizados com base na seqüência base do gene aspB (NCBI número de registro NCgl0237) registrado no GenBank do US National Institutes of Health (NIH).
[Tabela 1]
<table>table see original document page 16</column></row><table>
Primeiramente, o mRNA foi extraído da cepa ATCC 13032, e um primeiro cDNA de filamento foi sintetizado com o uso de um a iniciado RT de terminação fosforilada 5' (SEQ ID NO. 5) específico para mRNA do gene aspB por reação de transcrição reversa. Subseqüentemente, o filamento de RNA de DNA-RNA híbrido foi degradado por tratamento com RNaseH e, então, um único cDNA de filamento foi circulado por Ligase de RNA (ou unido em uma forma concatemérica).
Após completação da ligação, PCR foi executada com o uso da amostra como um modelo e SEQ ID NOs. 6 e 7 como um iniciador para obter um produto de PCR primário. A PCR foi executada novamente com o uso do produto de PCR primário como um modelo e SEQ ID NOs. 8 e 9 como um iniciador para obter um produto de PCR secundário. A PCR foi executada sob as seguintes condições: 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s; recozimento a 55°C por 30 s; e polimerização a 72°C por 1 min. A purificação do produto de PCR final foi executada, e a análise de seqüência base foi executada por sequenciamento.
Como um resultado da análise de seqüência base, o sítio de início transcricional do gene aspB foi identificado como G encontrado 72 bp a montante do códon de iniciação, ATG. 0 sítio de início transcricional identificado foi numerado como +1, e a região de seqüência consensual do promotor foi selecionada para aprimoramento.
Exemplo 2: Construção de vetor recombinante para aprimoramento do promotor
<2-1> Construção do vetor para inserção cromossômica (pDZ)
No presente Exemplo, com base no vetor de clonagem de E.coli pACYC177 (New England Biolab, acesso GenBank η° X06402), um vetor pDZ para a inserção no cromossomo Corynebacterium foi construído.
0 vetor pACYC177 foi tratado com enzimas de restrição, AcuI e BanI e, então, tratamento klenow foi executado para render terminações abruptas. 0 gene lacZ derivado de E. coli a ser usado como um marcador de seleção foi amplificado a partir do DNA genômico de E.coli K12 W3110 por PCR, designado por incluir o promotor do mesmo, e o tratamento de T4 DNA polimerase e polinucleotídeo quinase foi executado para criar terminações abruptas e fosforilação em terminação 5'. Estes dois fragmentos de DNA foram ligados entre si para gerar uma molécula de DNA circular, seguido da inserção de uma seqüência adaptadora artificialmente sintetizada que contém uma pluralidade de sítios de restrição no sítio de restrição BamHI da molécula de DNA circular para construir o vetor pDZ para inserção no cromossomo Corynebacterium. A Figura 1 é uma vista esquemática que mostra o vetor pDZ para inserção no cromossomo Corynebacterium.
<2-2> Construção do vetor recombinante para aprimoramento de promotor de aspB
No presente Exemplo, um vetor recombinante foi construído a fim de aprimorar o promotor do gene aspB derivado da cepa que produz lisina, Corynebacterium glutamicum.
Primeiramente, uma seqüência base (SEQIDNO. 1) que contém a região promotora de gene aspB (NCBI número de registro NCgl0237) foi adquirida com base no GenBank do US National Institutes of Health (NIH), e os fragmentos de DNA que contêm as seqüências promotoras modificadas foram obtidas (SEQIDNOs. 2, 3 e 4). Cada seqüência promotora modificada foi designada com base na seqüência consensual promotora conhecida em microorganismo geral.
Além disso, os oito iniciadores (Tabela 2, SEQ ID NOs. 10 a 17) para a preparação das seqüências promotoras modificadas foram sintetizados com base nas seqüências bases acima.
[Tabela 2]
<table>table see original document page 19</column></row><table>
Para obter a seqüência promotora de gene aspB derivado de Corynebacterium glutamicum, PCR foi executada com o uso do DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 como um modelo e os pares de oligonucleotídeo na Tabela 2 como um iniciador. Um DNA polimerase de alta fidelidade PfuUltra™ foi usado como uma polimerase e condições de PCR foram as seguintes: 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s; recozimento a 55°C por 30 s; e polimerização a 72°C por 1 min. Como um resultado, um fragmento de DNA de 300 bp que contém a região substituída em uma extremidade foi obtida. O aspBPl-1 foi amplificado através do uso de SEQ ID NOs . 10 e 13 como um iniciador, e aspBPl-2 foi amplificado através do uso de SEQ ID NOs. 11 e 12 como um iniciador. O produto amplificado foi misturado com o vetor pDZ que foi previamente digerido com a enzima de restrição XbaI, e a clonagem foi executada com o uso do kit In-fusion Cloning Kit (TAKARA) para obter um vetor pDZ-aspBPl.
pDZ-aspBP2 e pDZ-aspBP3 também foram construídos da mesma maneira que na preparação de pDZ-aspBPl, exceto pelo fato de que mediante a amplificação de PCR de fragmento de inserção, pDZ-aspBP2 foi preparado a partir do fragmento aspBP2-l obtido com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOs. 10 e 15 e do fragmento de aspBP2-2 obtido com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOs. 11 e 14, e pDZ-aspBP3 foi preparado a partir do fragmento aspBP3-l obtido com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOs. 10 e 17 e o fragmento aspBP3-2 obtido com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOs. 6 e 11. As Figuras 2, 3 e 4 mostram os vetores pDZ-aspBPl, pDZ-aspBP2 e pDZ-aspBP3 para substituição de base na Corynebacterium, cada um contém aspBPl, aspBP2 e aspBP3 correspondentes a SEQ ID NOs. 2, 3 e 4, respectivamente.
Exemplo 3: Inserção de vetor recombinante na cepa Corynebacterium glutamicum
No presente Exemplo, para aprimorar o promotor de aspB no cromossomo de Corynebacterium, os vetores recombinantes construídos foram transformado na Corynebacterium glutamicum KFCC10881 que produz lisina, e a seqüência promotora no cromossomo foi substituída pela seqüência promotora do vetor através da recombinação homóloga, levando à inserção da seqüência promotora acentuada no cromossomo.
Cada um dos vetores recombinantes para substituição de base no Corynebacterium, pDZ-aspBPl, pDZ-aspBP2 e pDZ-aspBP3, que foram designados para incluir fragmentos de DNA que têm a seqüência promotora acentuadas no Exemplo 2, foi transformado em Corynebacterium glutamicum KFCC10881 por um método de pulso elétrico (por transformação de acordo com Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545), e triado para transformantes, no qual o gene de interesse foi inserido no cromossomo devido à homologia em um meio de seleção que contém 25 mg/L de canamicina.
A aparência de uma cor azul no meio sólido que contém X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo) indicou inserção de gene com sucesso no DNA nuclear com o uso do vetor.
As cepas primárias com cromossomo inserido foram cultivadas em um caldo nutritivo (30°C, 8 h) com agitação e foram, então, serialmente diluídas de 10^4 a 10^10 antes de serem espalhadas nos meios sólidos que contêm X-gal. A maioria das colônias que cresceram foram manchadas com uma cor azul. As colônias brancas, que foram uma minoria das colônias crescidas, foram selecionadas. As cepas que têm substituição de base no promotor de aspB através de crossover secundário foram selecionadas. Estas cepas foram finalmente analisadas para a substituição de base e a seqüência base na região correspondente através de PCR antes da seleção final.
A substituição de base no promotor foi analisada através de PCR com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOs. 11 e 19, SEQ ID NOs. 11 e 18, e SEQ ID NOs. 11 e 18, cada um deles é usado para aspBPl, aspBP2 e aspBP3, um teste final foi executado na região alvo através da análise de seqüência base.
Finalmente, as cepas que produzem lisina, Corynebacterium glutamicum KFCC10881-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3, que têm substituição de base do promotor de aspB no cromossomo através de crossover secundário, foram obtidas, e cada uma delas foi designada como CA01-773, CA01-774 e CAO1-775, e depositadas no Korean Culture Center of Microorganisms em 5 de fevereiro de 2010 sob os números de acesso, KCCMll06IP, KCCMll062P e KCCM11063P.
Exemplo 4 : Avaliação da atividade de aspartato aminotransferase na cepa que tem promotor de aspB acentuado Para avaliar as atividades de aspartato aminotransferase da cepa parental Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e das cepas que produzem L-lisinas, Corynebacterium glutamicum KFCC10881-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3 que foram finalmente preparadas no Exemplo 3, o cultivo foi executado da seguinte forma, e as proteínas foram isoladas dos meios de cultura para avaliar a atividade de aspartato aminotransferase.
Após cada cepa ter sido cultivada até que a fase exponencial fosse alcançada, os meios de cultura foram inoculados em 25 ml dos meios de alimentação para ODe0o de 0,3, seguido pelo cultivo para aproximadamente OD6oo de 15 . As células foram coletadas dos meios de cultura através da centrifugação (5.000 rpm, 10 min), lavadas com tampão de Tris-HCl a 0,1% (pH 8,0) duas vezes, e suspensas no mesmo tampão para gerar a densidade óptica a 600 nm de 160. 1, 25 g de microesfera de vidro foi adicionado a 1,5 ml de suspensão e, então, as células foram rompidas com o uso de um batedor de microesfera por 6 min. 0 sobrenadante foi coletado por centrifugação (13.000 rpm, 30 min), e a concentração de proteína foi determinada pelo método Bradford (M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248-254), e o sobrenadante foi usado como uma solução de proteína crua para a avaliação de atividade de aspartato aminotransferase.
A avaliação da atividade de aspartato aminotransferase foi iniciada através da adição de 0,1 ml da solução de proteína crua para a reação solution que contém 0,24 M de aspartato, 0,09 M de Tris (pH7,8), 0, 64 mM NADH, 0 ,11 mM fosfato piridoxal, 0,93 kU/1 MDH, e 0,42 kU/1 LDH a 30°C e 10 min e, então, da adição de 12 mM de 2-oxoglutarato. A redução em absorbância foi medida a 340 nm por 5 min, seguida do cálculo da atividade de aspartato aminotransferase. Uma unidade (U) da atividade de aspartato aminotransferase é definida como a quantidade reduzida de NADH (nmol) por 1 mg de proteína por minuto.
Cada atividade de aspartato aminotransferase das cepas de Corynebacterium glutamicum KFCC10881-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3 foi comparada àquela da cepa parental, KFCC10881. Como um resultado, concluiu-se que as cepas KFCC10881-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3 mostram 2,1, 2,6 e 1,8 vezes atividades de aspartato aminotransferase a mais que na cepa parental, respectivamente (Tabela 3).
[Tabela 3]
<table>table see original document page 23</column></row><table>
* Meio de alimentação (pH 7,0)
Açúcar bruto 2 0 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, uréia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H20 0.5 g, biotina 100 μg, HCl de tiamina 1000 μ9, cálcio-ácido pantotênico 2000 μg, nicotinamida 2000 μ9 (em 1 litro de água destilada)
Exemplo 5: Lisina produção in cepa que tem promotor de aspB acentuado
Para a produção of L-lisina, Corynebacterium glutamicum KFCC10881 foi usada como a cepa parental e a as cepas que produzem L-lisina, Corynebacterium glutamicum KFCC108 81-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3 que foram finalmente preparadas no Exemplo 3, foram cultivadas da seguinte forma. As cepas parentais Corynebacterium glutamicum KFCC10881, e KFCClO 8 81-aspBPl, KFCC10881-aspBP2, e KFCC10881-aspBP3 foram inoculadas em um frasco com reentrâncias no canto de 250 ml que contém 25 ml da cultura de alimentação que tem a seguinte composição, sgu9da do cultivo a 30°C por 20 horas com agitação a 200 rpm. 1 mL da cultura de alimentação foi inoculado em um frasco com reentrâncias no canto de 250 ml que contém 24 ml do meio de produção que tem a seguinte composição, seguido do cultivo a 30°C por 12 0 horas com agitação a 200 rpm.
Mediante a completação do cultivo, a produção de L-Iisina foi medida por HPLC. As quantidades de produção de L-Iisina nos meios de cultura de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e KFCC108 81-aspBPl, KFCC10881-aspBP2 e KFCC10881-aspBP3 são mostradas na seguinte Tabela 4.
[Tabela 4]
<table>table see original document page 24</column></row><table>
* Meio de alimentação (pH 7,0)
Açúcar bruto 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, uréia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H20 0.5 g, biotina 100 μg, HCl de tiamina 1000 μg, cálcio-ácido pantotênico 2000 μg, nicotinamida 2000 μ9 (em 1 litro de água destilada)
* Meio de produção (pH 7,0)
glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, proteína de soja 2,5 g, sólidos fermentados de milho 5 g, uréia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H20 0,5 g, biotina 100 μg, hidrocloreto de tiamina 1000 μg, cálcio-ácido pantotênico 2000 μ9, nicotinamida 3000 CaCO3 30 g (em 1 litro de água destilada)
Conforme mostrado na Tabela acima 4, foi concluído que a cepa KFCC10881-aspBP2 que tem atividade de aspartato aminotransferase 2,6 vezes mais altas mostrou mais que 5% de aumento na produção de lisina, em comparação à cepa parental KFCC10881. Foi concluído que a cepa KFCC10881-aspBPl que tem atividade de aspartato aminotransferase 2,1 vezes mais alta e a cepa KFCC10881-aspBP3 que tem atividade de aspartato aminotransferase 1,8 vezes mais alta mostrou mais de 3% de aumento na produção de lisina.
Aplicabilidade Industrial
A molécula de ácido nucléico que tem atividade promotora acentuada, derivada de Corynebacterixxm glutamicum, de acordo com a presente invenção, exibe uma atividade promotora superior a do tipo selvagem, aprimorando assim a atividade de aspartato aminotransf erase e a eficiência da biossíntese de lisina. Dessa forma, L-lisina, que é um dos L-aminoácidos úteis na indústria, pode ser produzida com alta eficiência.

Claims (13)

1. Molécula de ácido nucléico contendo atividade promotora, caracterizada por ter qualquer uma seqüência base selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 2, 3 e 4.
2. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência base está ligada de modo operável a um gene que encodif ica aspartato aminotransferase.
3. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico contendo atividade promotora acentuada da reivindicação 1 ou 2.
4. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vetor é qualquer um selecionado do grupo que consiste em pDZ-aspBPl, pDZ-aspBP2 e pDZ-aspBP3, revelado nas Figuras 2, 3 e 4.
5. Transformante, caracterizado por ser transformado com o vetor da reivindicação 3.
6. Transformante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transformante pertence ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium.
7. Transformante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transformante é identificado pelo número de acesso KCCM11061P.
8. Transformante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transformante é identificado pelo número de acesso KCCM11062P.
9. Transformante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transformante é identificado pelo número de acesso KCCM11063P.
10. Transformante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico contendo uma atividade promotora da reivindicação 1 ou 2 é inserida no cromossomo por recombinação homóloga.
11. Transformante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico contendo uma atividade promotora da reivindicação 1 ou 2 é retida em uma forma de plasmídeo.
12. Método para produzir lisina, caracterizado por compreender a etapa de cultivo do transformante de qualquer uma das reivindicações 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa de recuperar a lisina que é produzida na etapa de cultivo acima.
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