BRPI1103789B1 - meios de cultura de torta residual de mamona para produção simultânea das enzimas fitase e tanase, e detoxificação da torta de mamona, pelo microorganismo paecilomyces variotii através da fermentação sólida, enzimas obtidas e seus usos - Google Patents

Abstract

MEIOS DE CULTURA DE TORTA RESIDUAL DE MAMONA PARA PRODUÇÃO SIMULTÂNEA DAS ENZIMAS FITASE E TANASE, E DETOXIFICAÇÃO DA TORTA DE MAMONA, PELO MICROORGANISMO PAECILOMYCES VARIOTII ATRAVÉS DA FERMENTAÇÃO SÓLIDA, ENZIMAS OBTIDAS E SEUS USOS. O presente invento visa à produção simultânea de tanase e fitase em torta residual de mamona em fermentação em estado sólido com Paecilomyces variotii, além da diminuição da concentração de ricina após a fermentação, promovendo assim sua detoxificação. O uso de enzimas na alimentação animal é conhecido e está sendo bem explorado. A maior dificuldade de expandir o uso de enzimas ainda é o custo de produção. O uso dos resíduos para alimentação animal representa uma alternativa viável para este setor, assim como para a produção de biocatalizadores através da fermentação sólida. Esta invenção determinou valores ótimos na constituição do meio de cultura que utiliza torta residual de mamona para produção das enzimas fitase e tanase através da fermentação sólida pelo microorganismo Paecilomyces variotii de forma a obter-se a maior quantidade de enzima produzida e suas maiores atividades. Adicionalmente, o presente invento permite a detoxificação da torta residual de mamona, devido à degradação da ricina, seu maior agente tóxico, e, dessa forma, tornando o (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

O presente invento visou à determinação de parâmetros para produção ; simultânea das enzimas fitase e tanase através da fermentação sólida, em torta residual de mamona, empregando o fungo Paecilomyces variotii.

O uso de enzimas na alimentação animal é conhecido e está sendo bem explorado. A maior dificuldade de expandir o uso de enzimas ainda é o custo de produção. Uma alternativa para isto seria a utilização destes resíduos como substrato da fermentação para produção de enzimas.

A mamona é uma oleaginosa muito usada para a produção de biodiesel. A torta residual da extração do óleo é de grande utilidade para adubação e também rica em proteínas, abrindo possibilidade da sua utilização como ração animal. Esta segunda aplicação enfrenta o problema da presença da ricina, composto tóxico presente na torta, havendo a necessidade de detoxificá-la antes do destino como ração, fato observado através da utilização do presente invento.

Dessa forma, o uso dos resíduos para alimentação animal representa uma alternativa viável para este setor, assim como para a produção de biocatalizadores através da fermentação sólida.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO

A fermentação em estado sólido (FES) proporciona o cultivo de microrganismos em substratos sólidos na ausência de uma fase aquosa livre (Pandey, A. Solid-state fermentation. Biochemistry Engeenering Journal 13, p. 81- 84, 2003). No entanto, o substrato deve apresentar umidade adequada para manter o crescimento e o metabolismo do microrganismo, sem exceder a capacidade de retenção máxima de água pela matriz (Foong, C. W.; Janaun, J.; Krishnaiah, K.; Prabhakar, A. Effect of superficial air velocity on solid state fermentation of palm kernel cake in a lab scale fermenter using locally isolated strain. Industrial Crops and Products 30, p. 114-118, 2009).

A matriz sólida utilizada no processo pode ser tanto a fonte de nutriente quanto simplesmente um suporte impregnado com nutrientes adequados ao desenvolvimento do microrganismo (Pandey, 2003), (Nagao, N.; Matsuyama,T.; Yamamoto, H.; Toda, T. A novel hybrid system of solid state and submerged fermentation with recycle for organic solid waste treatment. ProcessBiochemistry 39, p. 37-43, 2003). Existem diferenças significativas entre os processos de fermentação em estado sólido e fermentação submersa (FS). A principal diferença entre FES e FS é a quantidade de água livre no meio de cultivo. Na FS, a quantidade de sólidos não ultrapassam 50 g/L, enquanto na FES o conteúdo de sóldios varia de 20 a 70% do peso total do meio (Mitchell, D. A.; Losane, B. K. Definition, characteristic and potential. In: Doelie, H.; Mitchell, D. A., Rols, C. E. Solid substrate cultivation. Elsevier Applied Science, p. 1-16,1992).

A FES confere vantagens sobre a FS como a utilização de meios de cultura simples e não hidrossolúveis, compostos de materiais de origem vegetal, como farelos e cascas de arroz, trigo, milho e outros cereais, necessitando de poucos nutrientes adicionais ao meio. Adicionalmente, o custo do meio de fermentação pode representar até 30% do total de uma produção enzimática. Assim, há interesse na utilização de resíduos agroindustriais como substrato, representando, em países como o Brasil, matéria prima abundante e de baixo custo (Graminha, E. B. N.; Gonçalves, A. Z. L; Pirota, R. D. P. B.; Balsalobre, M. A. A.; Da Silva, R. E. Enzyme production by solidstate fermentation: application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology 144, p. 1-22, 2008), (Pandey, 2003). Devido ao baixo teor de umidade e a ausência de água livre no meio, a probabilidade de contaminação por bactérias é reduzida. A pequena quantidade de água empregada na FES também implica em vantagens, tais como menor reacional e maior concentração do produto (Nagao, 2003), (Mitchell, 1992) (Mohapatra, P. K.; Maity, C.; Rao, R. S.; Pati, B. R.; Mondai, K. C. Tannase production by Bacillus licheniformis KBR6: Optimization of submerged culture conditions by Taguchi DOE methodology. Food Research International 42, p. 430-435, 2009.; Singhania, R. R.; Patel, A. K.; Soccol, C. R.; Pandey, A. Recent advances in solidstate fermentation. Biochemical Engineering Journal 44, p. 13-18, 2009).

Dentre as características da FES, a baixa atividade de água do meio de cultivo sólido influencia nos aspectos fisiológicos dos microrganismos, tais como no seu crescimento vegetatívo, esporulação, germinação de esporos, produção de enzimas e atividade enzimática (Graminha, 2008). A FES pode, em alguns casos, ser economicamente mais interessante na produção de enzimas. George e colaboradores (George, S.; Raju, V.; Subramanian, T. V.; Jayaraman, K. Comparative study of protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation. Bioprocess Engineering 16, p. 381-382, 1997) compararam a produção de protease entre a fermentação em estado sólido e submersa. Os autores relataram que para um mesmo rendimento do produto, foram utilizados 100 mL de nutrientes em FS e 1 g para FES.

PRODUÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL UTILIZANDO RESÍDUOS AGRÍCOLAS

A economia brasileira é uma das mais importantes economias do mundo e baseia-se, principalmente, na agricultura. Entretanto, a grande produção desses materiais agrícolas gera grandes quantidades de resíduos. Nos últimos anos houve um aumento na tentativa de tornar mais eficiente a utilização desses resíduos cuja disposição no meio ambiente causam sérios problemas de poluição (Soccol, C. R.; Vandenbergher, L. P. S. Overview of applied solid-state fermentation in Brazil. Biochemical Engineering Journal 13, p. 205-218, 2003).

Resíduos agroindustriais são amplamente produzidos pela atividade humana, agrícola e industrial. Dentre os resíduos produzidos em quantidades significativas pela atividade industrial brasileira, podemos citar: casca, palha e farelo de arroz; palha e farelo de trigo; bagaço de cana; folha de mandioca; bagaço de laranja e torta de mamona (Schieber, A.; Stintzing, F. C.; Carle, R. By-products of plant food processing as a source of functional compounds - recent developments. Trends in Food Science ^Technology 12, p. 401-413, 2001); (Graminha, 2008).

A maioria destes produtos apresenta potencial nutricional e assim, apresentam inúmeras possibilidades para aplicação, como a produção de biomassa microbiana para alimentação animal, ou seja, o uso destes resíduos como substratos para cultivo de microrganismos capazes de biodegradá-los para obtenção de nutrientes para seu desenvolvimento (Goel, G.; Puniya, A. K.; Aguilar, C. N.; Singh, K. Interation of gut microflora with tannins in feeds. Naturwissenschaften 92, p. 497-503, 2005.; Cao, L; Wang, W.; Yang, C.; Yang, Y.; Diana, J.; Yakupitiyage, A.; Luo, Z.; Li, D. Application of microbial phytase in fish feed. Enzyme and Microbial Technology 40, p. 497-507, 2007. ; Kuhad, R. G; Singh, A.; Tripathi, K. K.; Saxena, R. K.; Eriksson, K. E. L. Microrganisms as an alternative source of protein. Nutrition Reviews 55, p. 65-75, 1997).

Genericamente, as rações são materiais de fontes orgânicas com a finalidade de nutrir adequadamente o animal. As principais características de uma ração são a disponibilidade energética, quantidade de fibras (importantes para a digestibilidade) e proteínas suplementares, principalmente aminoácidos essenciais (González-Martín, I.; Alvarez-Garcia, N.; Hernández-Andaluz, J. L. Instantaneous determination of crude proteins, fat and fibre in animal feeds using near infrared reflectancespectroscopy technology and remote reflectance fibre-optic probe. Animal Feed Science and Technology 128, p. 165-171, 2006); (Makkar, H. P. S. Review: Effects and fate of tannins in ruminant animals, adaptation to tannins, and strategies to overcome detrimental effects of feeding tannin-rich feeds. Small Ruminant Research 49, p. 241- 256, 2003).

Rações produzidas com sub-produtos agrícolas ou resíduos de indústrias alimentícias são utilizados freqüentemente, isso porque há grande disponibilidade de resíduos devido à alta produção de alimentos (Bampidis, V. A.; Robinson, P. H. Citrus by-products as ruminant feeds: a review. Animal Feed Science and Technology 128, p. 175-217, 2006). A utilização deste tipo de ração pode trazer alguns benefícios para os animais e, conseqüentemente, para os produtos deles obtidos. Um exemplo disso é a maior produtividade e qualidade da carne e do leite (Vasta, V.; Nudda, A.; Cannas, A.; Lanza, M.; Priolo, A. Alternative feed resources and their effects on the quality of meat and milk from small ruminants. Animal Feed Science and Technology 147, p. 223-246, 2008). Porém, estas rações devem ser cuídadosamente formuladas para garantir que os compostos antinutricionais, especialmente fitatos e taninos, não interfiram de forma negativa na saúde do animal. Estes compostos podem causar mudanças na estrutura e composição dos ácidos graxos do leite e também da carne (Hérvas, G.; Frutos, P.; Giráldez, F. J.; Mantecón, A. R.; Del Pino, M. C. A.; Effect of different doses of quebracho tannins extract on rumen fermentation in ewes. Animal Feed Science and Technology 109, p. 65-78, 2003).

Na aqüicultura, algumas rações formuladas com farelo de soja são interessantes como fontes alternativas às fontes protéicas de peixes, eliminando assim proteínas de origem animal na formulação da ração (Carter, C. G.; Hauler, R. C. Fish meal replacement by plant meals in extruded feeds for Atlantic salmon, Salmo saiar L Aquaculture 185, p. 299-311, 2000). Um estudo mostrou que o salmão (Hippoglossus hippoglossus L) necessita de uma concentração mínima de 35% de proteínas em sua alimentação para seu crescimento, sendo necessária a utilização de resíduos agroindustriais que apresentam essa concentração, sem a necessidade de suplementação de outros produtos (Arnason, J.; Imsland, A. K.; Gústavsson, A.; Gunnarsson, S.; Arnarson, I.; Reynisson, H.; Jónsson, A. F.; Smáradóttir, H.; Thorarensen, H. Optimum feed formulation for Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L: Minimum protein content in diet for maximum growth. Aquaculture 291, p. 188-191, 2009). Existem rações suplementados com resíduos de camarão fermentados, que apresentaram uma maior disponibilização de aminoácidos essenciais em relação à ração contendo resíduo não fermentado (Narayan, B.; Velappan, S. P.; Zituji, S. P.; Manjabhatta, S. N. Yield and chemical composition of fractions from fermented shrimp biowaste. l/Vαste Management & Research 28, p. 64-70, 2009).

PRODUÇÃO DE MAMONA

A mamona, Ricinus communis, é cultivada em regiões tropicais para utilização do seu óleo, que está presente na semente, o qual é extensivamente usado para propósitos industriais e medicinais (Anandan, S.; Kumar, G. K. A.; Ghosh, J.; Ramachandra, K. S. Effect of different physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal Feed Science and Technology 120, p. 159-168, 2005); (Jones, D. B. Proteins of the castor bean-their preparation,, properties, and utilization. The Journal of The American Oil Chemists' Society, July, p. 247-251, 1947). Os principais países produtores são a índia, com 60% da produção mundial e China, com 20%. O Brasil em 2002 produziu 37.000 toneladas de óleo, representando somente 7,5% da produção mundial (Savy Filho, A. Mamona: Tecnologia Agrícola. Campinas. SP: EMOPI, 2005). Mas este cenário está mudando com a substituição gradual da obtenção de energia via fontes petrolíferas para o óleo vegetal, incluindo o óleo de mamona.

A torta residual de mamona, resíduo da extração do óleo, representa metade do peso da semente e apresenta uma quantidade de 34 - 36% de proteínas (Gowda, N. K. S.; Pal, D. T.; Srinivas, R. B.; Bharadwaj, U.; Sridhar, M.; Satyanarayana, M. L; Prasad, C. S.; Ramachandra, K. S.; Sampath, K. Evaluation of castor (Ricinus communis) seed cake in the total mixed ration for sheep. Journal of the Science of Food and Agriculture 89, p. 216-220, 2008); (Anandan, 2005); 20% de fibras, 0,7% de cálcio; 0,8% de fósforo e 4% de extrato etéreo (Souza, R. M. Efeito do farelo de mamona detoxificado sobre os valores hematológicos de suínos. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, 1979). Apesar disso, a torta de mamona não pode ser usada como fonte de proteínas devido à sua toxicidade, sendo usada geralmente como fertilizante orgânico (Jones, 1947). Dentre as toxinas presentes estão a ricinina, a albumina 2S e a ricina.

A ricinina é um alcalóide tóxico denominado l,2-dihidro-4-metoxi-l-metil-2- oxo-3-piridinocarbonitrila (CgHgNzC^), presente na torta de mamona e de baixa toxicidade (Beltrão, N. E. M.; Lima, R. L. S. Aplicação do óleo de mamona como fonte de energia: Biodiesel. In: Azevedo, D. M. P.; Beltrão, N. E. M. (Ed.). OAgronegódo da mamona no Brasil. 23 Edição, Embrapa Informação Tecnológica, Brasília-DF, p. 395- 416,2007).

O complexo alergênico denominado antigamente de CB-1A (Castor Bean Allergen), atualmente mencionado como Albumina 2S está presente também em nozes e outras sementes como castanha do maranhão, avelã, mostarda e algodão (Breiteneder, H.; Radauer, C. A classification of plant food allergens. Journal of

Allergy and Clinical Immunology 113, p. 821-30, 2004). Há muitos anos que a presença desta toxina é conhecida, no entanto, os tratamentos aplicados à torta no que se referem à detoxificação são geralmente ineficientes (Anandan, 2005).

A ricina (n° CAS: 9009-86-3) é uma das mais potentes fitotoxinas conhecidas, sendo classificada como uma proteína inativadora de ribossomos (RIP) do tipo 2, que são heterodímeros compostos de duas cadeias unidos por pontes dissulfeto: cadeia A, enzimaticamente ativa; e a cadeia B, ligante de receptores, descrito por Stírpe e colaboradores (Stírpe, F.; Batelli, M. G. Ribossome-inactívating proteins: progress and problems. Cellular and Molecular Life Sciences 63, p. 1850-1866, 2006), que pode ser visualizado no Anexo 1, de Rutenber (Rutenber, E.; Robertus, J. D. Structure of ricin B-chain at 2.5 Â resolution. Proteins: Structure, Funcion and Genetics 10, p. 260- 269,1991).

A cadeia A remove um resíduo adenina numa região "loop" do RNA ribossomico, com essa modificação, estes ribossomos não podem dar suporte à síntese de proteínas, como pode ser visualizado na Figura 1. Esta inatívação pode ser efetuada na proporção de uma ricina para cada 2.000 ribossomos a cada minuto, uma velocidade em que a célula não consegue acompanhar (Olsnes, S.; Fernandez- Puemtes, C.; Carrasco, L; Vazquez, D. Ribosome inactivation by the toxin lectins abrin and ricin. Kinetics of the enzimic activity of the toxin A-chain. European Journal of Biochemistry, v. 60, p. 281-288,1975).

A ricina por ser termossensível, poderia facilmente ser inativada por qualquer processo de cozimento ou autoclavagem (Anandan, 2005), mas este processo não apresenta viabilidade para aplicação em escala industrial devido ao alto custo. Para solucionar esse problema, uma detoxificação via fermentação poderia ser realizada (Anandan, 2005); (Godoy, M. G. Produção de lipase microbiana e detoxificação simultânea de rejeitos agroindustriais. Dissertação de Mestrado, IQ-UFRJ - RJ, 2009), fato realizado pelo presente invento.

TANINOSE TANASE

Os taninos são um grupo de compostos fenólicos com alta massa molecular, solúveis em água, capazes de precipitar proteínas e de se ligarem a metais (quelantes). Estes compostos se complexam com a celulose, pectina e amido tornando-os insolúveis. São classificados em dois grupos, os taninos hidrolisáveis, como os elagitaninos e galotaninos, e condensados, também nomeados por proantocianidinas (Gross, G. G. From lignins to tannins: forty years of enzyme studies on the biosynthesis of phenolic compounds. Phytochemistry 69, p. 3018-3031, 2008.; Waghorn, 2008).

Os taninos hidrolisáveis (Figura 2) são unidos por ligações ésteres entre grupos de ácido gálico e resíduo de glicose através de ligações esterásicas e ligações depsidásicas (Mueller-Harvey, I. Analysis of hydrolysable tannins. Animal Feed Science and Technology 91, p. 3-20, 2001). A unidade básica (monômero) destes taninos são os polióis, que são ácidos gálicos esterificados geralmente com glicose em seus grupos hidroxilas (galotaninos ou elagitaninos) (Battestin, V.; Matsuda, L K.; Macedo, G. A. Fontes e aplicações de taninos e tanases em alimentos. Alimentos e Nutrição 15, p. 63-72 2004); (Gross, 2008).

Os taninos condensados (Figura 3) são mais vastamente distribuídos que os hidrolisáveis no reino vegetal, eles são condensados devido à sua estruturação compacta (Mutabaruka, R.; Hairiah, K.; Cadisch, G. Microbial degradation of hydrolysable and condensed tannin polyphenol-protein complexes in soils from different land-use histories. Soil Biology & Biochemistry 39, p. 1479-1492, 2007). Eles estão presentes em grande quantidade nos alimentos, podem conter de 2 a 50 unidades flavonóides. Os condensados são resistentes a hidrólise, devido à ausência de ligações ésteres e depsídicas (Battestin, 2004); (Gross, 2008).

Taninos são frequentemente distribuídos em diferentes partes das plantas como sementes, flores, casca e folhas. Ocorrem naturalmente no metabolismo secundário de vegetais e têm sido considerado o quarto mais abundante constituinte, depois de celulose, hemicelulose e lignina (Manjit; Yadav, A.; Aggarwal, N. K.; Kumar, K.; Kumar, A. Tannase production by Aspergillus fumigatus MA under solid-state fermentation. World Journal of Microbiologyand Biotechnology 24, p. 3023-3030, 2008). Estes compostos inibem o crescimento de muitos microrganismos por se complexarem com proteínas. Estas características são altamente antinutricionais e impedem a utilização de plantas ricas em taninos para ração animal (Sabu, A.; Pandey, A.; Daud, M. J.; Szakacs, G. Tamarind seed powder and palm kernel cake: two novel agroresidues for the production of tannase under solid state fermentation by Aspergillus nigerATCC 16620. Bioresource Technology 96, p. 1223-1228,2005).

O efeito negativo de taninos na nutrição animal é devido à sua capacidade dé se ligar a macromoléculas, diminuindo a absorção destes componentes. Contudo, baixos níveis da concentração de taninos (40 g/kg de matéria seca) na ração têm demonstrado um aumento na assimilação de nitrogênio em ruminantes, rendendo maior taxa de crescimento e produção de leite (Belmares, R.; Contreras-Esquivel, J.; Rodríguez-Herrera, R.; Coronel, A. R.; Aguilar, C. N. Microbial production of tannase:. an enzyme with potential use in food industry. Lebensmittel-Wissenschaft und-; Technologic 37, p. 857-864, p. 2004); (Min, B. R.; Barry, T. N.; Attwood, G. T.; McNabb, W. C. The effect of condensed tannins on the nutrition and health of ruminants fed fresh temperate forages: a review. Animal Feed Science and Technology 106, p. 3-19, 2003).

A tanase (EC 3.1.1.20) ou tanino-acil-hidrolase (TAH) catalisa a hidrólise de ligações ésteres de ácido gálico (Figura 4) nas moléculas de taninos hidrolisáveis (Kumar, R.; Sharma, J.; Singh, R. Production of tannase from Aspergillus rubber under solid-state fermentation using jamun (Syzygium cumini} leaves. Microbiological Research 162, p. 384-390, 2007); (Trevino-Cueto, B.; Luis, M.; Contreras-Esquivel, J. C.; Rodríguez, R.; Aguilera, A.; Aguilar, C. N. Gallic acid and tannase accumulation during fungal solid state culture of a tannin-rich desert plant (Larrea tridentata Cov.). Bioresource Technology 98, p. 721-724, 2007). Esta enzima é produzida por alguns fungos filamentosos, principalmente das espécies: Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Trichoderma, mas também pode ser produzida por bactérias do gênero Bacillus, Corynebacterium, Klebsíela, Streptococcus e Selenomonas.

Vegetais também produzem tanase para acelerar o processo de amadurecimento de frutas (Aissam, H.; Errachidi, F.; Penninckx, M. J.; Merzouki, M.;

Benlemlih, M. Production of tannase by Aspergillus niger HA37 growing on tannic acid and olive Mill waste waters. World Journal of Microbiology & Biotechnology 21, p. 609-614, 2005); (Batra, A.; Saxena, R. K. Potential tannase producers from the genera Aspergillus and Penicillium. Process Biochemistry 40, p. 1553-1557, 2005); (Hamdy, H. S.; Purification and characterization of a newly isolated stable long-life tannase produced by Fusarium subglutinans - Wollenweber and Reinking. Journal of Pharmaceutical Innovation 3, p. 142-151, 2008); (Aguilar, C. N.; Gutiérrez-Sánchez, G. Review: sources, properties, applications and potential uses of tannin acyl hydrolase. Food Science and Technology International 7, p. 373-382, 2001b); (Deschamps, A. M.; Otuk, G.; Lebeault, J. M. Production of tannase and degradation of chestnut tannin by bacteria. Journal of Fermentation Technology 61, p. 55-59,1983); (Rodrigues, T. H. S.; Dantas, M. A. A.; Pinto, G. A. S.; Gonçalves, L. R. B. Tannase production by solid- state fermentation of cashew apple bagasse. Applied Biochemistry and Biotechnology 136-140, p. 675-688, 2007); (Rodríguez, H.; Rivas, B.; Gómez-Cordovés, C.; Munoz, R. Characterization of tannase activity in cell-free extracts of Lactobacillus plantarum CECT 748T. International Journal of Food Microbiology 121, p. 92-98, 2008); (Van de Lagemaat, J.; Pyle, D. L Modelling the uptake and growth kinetics of Penicillium glabrum in a tannic acid-containing solid-state fermentation for tannase production. Process Biochemistry 40, p. 1773-1782, 2005); (Purohit, J. S.; Dutta, J. R.; Nanda, R. K.; Banerjee, R. Strain improvement for tannase production from coculture of Aspergillus foetidus and Rhizopus oryzae. Bioresource Technology 97, p. 795-801, 2006); (Belmares, 2004).

A tanase apresenta inúmeras aplicações como: • Ração Animal: o emprego de enzimas em rações torna possível aumentar a assimilação dos nutrientes nele contido, como a quebra de fatores antinutricionais. Ao mesmo tempo reduz os custos para melhoramento da ração, já que esta enzima pode ser produzida via fermentação (Battestin, 2004; Graminha 2009). Existem estudos em que se utilizaram a ação da tanase, produzida por Paecilomyces variotii, em grãos de sorgo tipo vassoura sobre os fatores antinutricionais, neste caso os taninos. Nestes estudos foram verificadas nas amostras tratadas com a tanase uma redução dos taninos, aumento de fósforo, melhora na digestibilidade e diminuição da excreção de fósforo, em comparação ao sorgo cru (Schons, P. F. Detanificação e desfitinização de grãos de sorgo (Sorghum bicolor) por tanase e fitase e estudo biológico. Dissertação de Mestrado - UNICAMP-FEA, 2009). • Preparação de Chás Instantâneos: uma das bebidas mais consumidas no mundo, pelo seu aroma, sabor e principalmente efeitos medicinais. Na preparação destes chás, que são muitas vezes na forma gelada, produz um precipitado insolúvel. Este precipitado é o complexo de polifenóis, que é o principal problema detectado. A tanase, adicionada ao processo do produto, ' catalisa a quebra das ligações ésteres, que acaba clivando os compostos insolúveis, diminuindo sua turbidez e aumentando sua qualidade, já que a enzima libera compostos fenólicos e voláteis (Lekha, P. K.; Lonsane, B. K. Production and application of tannin acyl hydrolase: State of the art. Advances in Applied Biochemistry and Microbiology 44, p. 215-260, 1997); (Khokhar, S.; Magnusdottir, S. G. M. Total phenol, catechin, and caffeine contents of teas commonly consumed in the United Kingdom. Journal of Agricultural and FoodChemistry 50, p. 565-570,2002). • Fabricação de Cervejas: as cervejas apresentam compostos polifenólicos provenientes do malte. Assim a tanase cliva estes compostos e diminui sua turbidez, tornando um produto aceitável ao mercado (Battestin, 2004). • Produção de Ácido Gálico: usado principalmente nas indústrias farmacêuticas, como na síntese de trimetoprima, agente antibacteriano e sulfonamida (Aguilar, C. N.; Augur C.; Favela-Torres, E.; Viniegra-González, G. Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in submerged and solid-state fermentation: influence of glucose and tannic acid. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 26, p. 296-302, 2001a). • Produção de Antioxidantes: a tanase cliva compostos polifenólicos resultando em compostos como epigalocatequina, epicatequina e ácido gálico, que são estruturas moleculares com capacidade antioxidante (Battestin, V.; Macedo, G. A.; De Freitas, V. A. P. Hydrolysis of epigallocatechin gallate using a tannase from Paecilomyces variotii. Food Chemistry 108, p. 228-233, 2008).

O TAH pode ser obtido de várias fontes, como de animais (intestino de ruminantes), plantas (folhas, casca de frutas, galhos) e principalmente de microrganismos, já que sua produção é mais estável e abundante, comparado com as outras fontes. Além disso, os microrganismos podem ser manipulados geneticamente para melhoramento da enzima e sua produção (Battestin, V.; Macedo, G. A. Tannase Production by Paecilomyces variotii. Bioresource Technology 98, p. 1832-1837, 2007b); (Aguilar, C. N.; Rodríguez, R.; Gutiérrez-Sánchez, G.; Augur, C.; Favela-Torres, E.; Prado-Barragan, L A.; Ramirez-Coronel, A.; Contreras-Esquivel, J. C. Microbial tannases: advances and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology 76, p. 47-59, 2007).

Um dos tópicos mais estudados sobre TAH refere-se às propriedades químicas desta enzima, mas o mecanismo de ação e regulação ainda não é totalmente compreendido. A enzima TAH fúngica é uma glicoproteína com pH de estabilidade na faixa de 3,5 e 8,0; pH ótimo de 5,5 e 6,0; temperatura de estabilidade na faixa de 30 e 60°C; temperatura ótima entre 30 e 40°C; ponto isoelétrico de 4,0 e 4,5 e massa molecular entre 186 e 300 kDa. Essas propriedades variam de acordo com o tipo de microrganismo e condições de cultivo da linhagem usada. O TAH é inibido por Cu2+, Zn+2, Fe+2, Mn+2 e Mg+2, sendo inativada por EDTA, 2-mercaptoetanol, tioglicolato de sódio, sulfato de magnésio e de cálcio e ofenantrolina (Aguilar, 2001a); (Aguilar, 2007); (Battestin, V.; Macedo, G. A. Purification and biochemical characterization of tannase from a newly isolated strain of Paecilomyces variotii. Food Biotechnology 21, p. 207-216, 2007a); (Belmares, 2004); (Mahapatra, K.; Nanda, R. K.; Bag, S. 5.; Banerjee, R.; Pandey, A.; Szakacs, G. Purification, characterization and some studies on secondary structure of tannase from Aspergillus awamori nakazawa. Process Biochemistry 40, p. 3251-3254, 2005); (Sharma, S.; Agarwal, L; Saxena, R. K, Statistical optimization for tannase production from Aspergillus niger under submerged fermentation. Indian Journal of Microbiology 47, p. 132-138, 2007); (Sharma, S.; Agarwal, L; Saxena, R. K. Purification, immobilization and characterization of tannase from Penicillium variable. Bioresource Technology 99, p. 2544-2551, 2008),

FITATOS E FITASE

O ácido fítico, /W/o-lnositol-l,2,3,4,5,6-hexaquisfosfato (Figura 5), é um álcool cíclico derivado da glicose com 6 grupamentos fosfatos ligados em cada carbono da molécula glicosídica. Dentre os compostos agrupados em fosforilados, o ácido fítico é o mais abundante em vegetais, principalmente em sementes já que apresenta função de estocagem do grupo fósforo para obtenção de energia (Raboy, V. Molecules of interest: myo-lnositol-l,2,3,4,5,6-hexakisphosphate. Phytochemistry 64, p. 1033- 1043, 2003). A presença de fitato em excesso polue o meio ambiente como também atrapalha na dieta de animais monogástricos. O fitato age como um antinutriente ligando-se às proteínas, aminoácidos e lipídios e quelando minerais como cálcio, ferro, zinco e magnésio formando, assim, sais insolúveis (Howson, S. J.; Davis, R. P. Production of phytase-hydrolysing enzyme by some fungi. Enzyme and Microbial Technology 5, p. 377-343, 1983), Além disso, interage com enzimas digestivas reduzindo suas atividades, influenciando na digestão e prejudicando o aproveitamento de vitaminas.

Apesar de o fitato servir como fonte principal de energia e fósforo para germinação de sementes, o fósforo ligado é pouco disponível para animais monogástricos, de maneira que, o fósforo inorgânico, um mineral não-renovável e caro, é acrescentado nas dietas de suínos, peixes e aves para atender suas necessidades nutricionais de fósforo (Vats, P.; Banerjee, U. C. Production studies and catalytic properties of phytases (myo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolases): an overview. Enzyme and Microbial Technology 35, p. 3-14, 2004). O fósforo do fitato que não é utilizado é excretado tornando-se um poluente ambiental em áreas de agropecuária intensiva (Lei, X. G.; Porres, J. M. Phytase enzimology, applications and biotechnology. Biotechnology Letters 25, p. 1787-1794,2003).

A enzima ácido fosfohidrolase catalisa a hidrólise de fosfato e ácido fítico (Figura 6) a fosfato inorgânico e derivados de fosfato mio-inositol. Fitases são classificadas como histidina ácido fosfatases (Histidine Acid Phosphatases - HAPs), uma subclasse de fosfatases (Vats, 2004). Existe uma outra classificação baseada na posição do primeiro fosfato a ser hidrolisado, nomeado de 3-fitase (E.C.3.1.3.8) e 6- fitase (E.C.3.1.3.26), do qual a 3-fitase (mio-inositol-hexakisfosfato-3-fosfohidrolase) é originado principalmente via microbiana e a 6-fitase é derivada de plantas. Para obtenção de fitase microbiana, os fungos são os mais pesquisados, dentre eles podemos citar os gêneros PenicilHum, Aspergillus e Mucor, Dentre as leveduras destaca-se o gênero Soccharomyces (Dvoráková, J. Phytase: Sources, preparation and exploitation. Folia Microbiológica 43, Issue 4, p.323-338, 1998); (Ries, E. F.; Macedo, G. A. Progressive screening of thermostable yeasts for phytase production. Food Science and Biotechnology 18, p. 655-660, 2009). Pelo processo fermentativo, a fitase pode ser produzida com a utilização de substratos de baixo custo como torta de sementes oleaginosas (Roopesh, K.; Ramachandran, S.; Nampoothiri, K. M.; Szakacs, G.; Pandey, A. Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in solid-state fermentation by Mucor racemosus. Bioresource Technology 97, p. 506- 511, 2006).

A suplementação de fitase em ração animal aumenta a biodisponibilidade de . fósforo em animais monogástricos, que consequentemente reduz a poluição 'dê fósforo no meio ambiente. A enzima também impede: quelação do ácido fítico com íons metais, ligação de proteínas, lipídeos e carboidratos, aumentando assim suã nutrição na ração (Vats, 2004).

Pesquisas na área de produção da enzima fitase têm importância ressaltada não apenas pela investigação de uma fonte pouca explorada de fitase como também pela busca de fitases com características desejáveis para indústria de alimentação animal, principalmente relacionadas à termoestabilidade, à estabilidade em baixo pH e ao custo do processo fermentativo.

Hong e colaboradores, utilizaram resíduos de mandioca como meio de cultivo, subprodutos do processamento do amido de mandioca, suplementado com fonte de nitrogênio para fermentação em estado sólido com Aspergillus niger para produção de fitase. Foi obtido um rendimento máximo de 6,73 UA/g de matéria seca. A enzima apresentou atividade residual de 4,71 UA/g à 75°C durante 30 minutos, que suportaria em processamentos na indústria de ração (Hong, K.; Ma, Y.; Lt, M. Solid-state fermentation of phytase from cassava dregs. Applied Biochemistry and Biotechnology 91-93, p. 777-785,2001).

Utilizou-se torta proveniente da extração do óleo de coco para produção de fitase extrace I u la r via fermentação em estado sólido com Rhizopus oligosporus. A produção enzimática maxima de 14,29 UA/g de substrato seco após 96 horas de incubação sem suplementação de nutrientes (Sabu, A.; Sarita, S.; Pandey, A.; Bogar, B.; Szakacs, G.; Soccol, C. R. Solid-state fermentation for production of phytase by Rhizopus oligosporus. Applied Biochemistry and Biotechnology 102-103, p. 251-26Q, 2002).

ENZIMAS EM RAÇÃO ANIMAL

As enzimas são usadas atualmente em inúmeros produtos e processos industriais, ao mesmo tempo novas áreas de aplicação estão sendo adicionadas, devido à sua eficácia e economia nas suas ações, principalmente na redução do uso de energia, para ativação da reação e quantidade de água (Kirk, O.; Borchert, T. V.; Fuglsang, C. C. Industrial enzyme applications. Current Opinion in Biotechnology 13, p. 345-351, 2002).

O uso de enzimas como aditivos em alimentos também é bem conhecida, como por exemplo, a ação da bromelina em carne, uma protease que aumenta a maciez do produto, tornando-o mais interessante ao consumo. As enzimas também podem aumentar a disponibilização de nutrientes, principalmente em rações para animais, como a xilanase e beta-glucanase que são utilizadas em cereais que ajudam nà digestibilidade dos nutrientes em animais monogástricos, que ao contrário dos ruminantes, são incapazes de hidrolisar totalmente os alimentos de origem vegetal, principalmente celulose e hemicelulose (Polizeli, M. L. T. M.; Rizzatti, A. C. S.; Monti, R.; Terenzi, H. F.; Jorge, J. A.; Amorim, D. S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiological Biotechnologic 67, p. 577-591,2005).

O uso de resíduos agroindustriais favorece economicamente a formulação de rações, entretanto esses resíduos devem ser suplementados com enzimas que hidrolisam compostos para aumentar seu valor nutricional, como os fatores antinutricionais já mencionados para os taninos e fitatos. Assim, para extrair o máximo valor nutritivo, são adicionadas enzimas exógenas nos alimentos ou resíduos para melhor absorção aos animais monogástricos (Pariza, M. W.; Cook, M. Determining the safety of enzymes used in animal feed. Regulatory Toxicology and Pharmacology 5ft p. 332-342, 2010).

Nos últimos anos, o foco tem sido a utilização de fósforo orgânico pafa alimentação, estocado no ácido fítico, que está presente em várias espécies é estruturas dos vegetais. Entretanto esse fósforo não está disponibilizado aos- • V ' monogástricos, já que eles não apresentam enzimas que hidrolisam o fítato e liberam- • o fósforo. Assim, a suplementação da enzima fitase na ração auxilia na nutrição dos • animais (Lei, X. G.; Stahl, C. H. Nutritional benefits of phytase and dietary determinants of its efficacy. Journal of Applied Animal Research 17, p. 97-112, 2000); (Kies, A. K.; Van Hemert, K. H. F.; Saber, W. C. Effect of phytase on protein and amino acid digestibility and energy utilization. World's Poult Science Journal 57, p. 109-126, 2001).

Existe também a suplementação de complexos enzimáticos em rações para animais, como a adição de carbohidrases, representadas por xilanase, beta-glucanase e celulase feita em ração à base de trigo, que mostraram uma melhora no crescimento e aparente aumento na digestibilidade de nutrientes em porcos (Emiola, I. A.; Opapeju, F. O.; Slominski, B. A.; Nyachoti, C. M. Growth performance and nutrient digestibility in pigs fed wheat distillers dried grains with solublesbased diets supplemented with a multicarbohydrase enzyme. Journal of Animal Science 87, p. 2315-2322, 2009).

Colombatto e colaboradores (Colombatto, D.; Beauchemin, K. A. A protease additive increases fermentation of alfalfa diets by mixed ruminal microorganisms in vitro. Journal of Animal Science 87, p.1097-1105, 2009) verifica rama a ação de protease em ração à base de componentes vegetais, para ruminantes. Concluíram que esta enzima age removendo proteínas estruturais da parede celular vegetal e consequentemente disponibiliza uma maior quantidade de nutrientes para digestibilidade na microbiota dos ruminantes.

Nuero e Reyes (Nuero, O. M.; Reyes, F.; Enzymes for animal feeding from Penicillium chrysogenum mycelial wastes from penicillin manufacture. Letters in Applied Microbiology 34, p. 413- 416, 2002) verificaram a produção multienzimática para utilização como aditivo em ração animal através do Penicillium chrysogenum.. O microrganismo produziu enzimas como: tanase, lipase, invertase e beta-l,3-glucanase, com atividades enzimáticas comparáveis com a comercial e assim, possibilitando sua aplicação na alimentação animal, o presente invento, por sua vez utiliza o microorganismo Paecilomyces variotii para produção simultânea das enzimas fitase è tanase em torta residual de mamona.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Para produção de biodiesel, o óleo proveniente da mamona se destaca entre as ' sementes oleaginosas. Além do óleo, a mamona após a extração produz a torta que é de grande interesse para fertilização orgânica. A torta também apresenta alta concentração de proteínas, o que traz possibilidades para sua utilização como ingrediente para nutrição animal. No entanto, essa aplicação enfrenta problemas na presença de toxinas, principalmente da ricina, uma proteína que impede a síntese protéica nas células de animais que as ingerem. Atualmente, diversas técnicas vêm surgindo para detoxificar a torta de mamona e utilizá-la na alimentação animal. Dentre estas técnicas, a fermentação em estado sólido mostrou-se promissora na detoxificação da torta, e simultaneamente pode ser utilizada para produção de enzimas de interesse biotecnológico, aumentando seu valor comercial.

O presente invento, visou a otimização da produção simultânea das enzimas fitase e tanase utilizando o fungo Paecilomyces variotii através da fermentação em estado sólido em torta residual de mamona.

De acordo com a cinética de fermentação estabelecida, determinou-se que ó meio contendo torta de mamona apresentou maior atividade nos tempos de 48 e 72 horas para produção de tanase e fitase, respectivamente. As melhores condições pará produção de tanase foram: 90% de umidade relativa do ambiente, 25% de soluçãq .

salina e 4,6% de ácido tânico, obtendo-se uma atividade enzimática de 2800 U/g de substrato.

Por sua vez, para produção da enzima fitase as melhores condições foram: 90% de umidade relativa do ambiente e 25% de solução salina, obtendo-se uma atividade enzimática de 280 U/g de substrato.

Durante o processo fermentative, a concentração da ricina mostrou-se menor com a utilização do fungo Paecilomyces variotii. Este resultado foi confirmado pelos testes de eletroforese em gel e do ensaio biológico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: "Loop" do RNA ribossômico e sítio de despurinação da Ricina, descrito por' Stirpe e colaboradores (2006).

Figura 2: Estrutura química do Tanino Hidrolisável descrita por Battestin e colaboradores (2004).

Figura 3; Exemplo da Estrutura Química do Tanino Condensado descrito por Battestin e colaboradores (2004).

Figura 4: Hidrólise do Ácido Tânico descrito por Battestin e colaboradores (2004).

Figura5: Estrutura química do Ácido Fítico descrito por Raboy e colaboradores (2003).

Figura 6; Hidrólise do Ácido Fítico descrito por Dvoráková e colaboradores (1998).

Figura 7: Concentração mínima necessária para inibição do crescimento das células, considerando-se a porcentagem de células vivas em relação à quantidade de proteínas no extrato de torta de mamona.

Figura 8: Porcentagem de crescimento das células em torta in natura e em cada tempo de fermentação (24,48 e 72 horas).

BREVE DESCRIÇÃO DOS ANEXOS

Anexo 1: Estrutura da Ricina descrita por Rutenber e colaboradores (1991).

Anexo 2: Superfície de Resposta e Curva de Contorno para Atividade da Fitase (U/mL)

Anexo 3: Superfície de Resposta e Curva de Contorno Atividade da Tanase (U/mL): (a) em função do volume da solução salina e umidade relativa do ar, (b) em função da umidade relativa do ar e ácido tânico e (c) em função do ácido tânico e volume da solução salina.

Anexo 4: SDS-PAGE 12% do extrato protéico de cada amostra testada. 1 M = Marcador; R = Ricina purificada; IN = Torta de Mamona in natura; Au = Torta de Mamona Autoclavada; 24 = Torta de Mamona Fermentada durante 24 horas; 48 = Torta de Mamona Fermentada durante 48 horas; 72 = Torta de Mamona Fermentada durante 72 horas. 2 * Massa Molecular de cada cadeia do Marcador.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO CARACTERIZAÇÃO DO RESÍDUO

Anteriormente à utilização da torta de mamona residual como meio de cultura para produção das enzimas tanase e fitase, este resíduo deve ser caracterizado para certificação quanto às suas características, para obtenção de quantidades ótimas das enzimas, a partir da menor quantidade possível de meio de cultura.

Para essa caracterização, primeiramente a torta residual de mamona deve ser triturada e submetida a um processo de separação granulométrica em tamis de 10 mesh, com 1,68 mm.

A) Determinação do pH:

Devem-se adicionar 5 mL de água deionizada a 0,5 g de amostra, a mistura foi vigorosamente agitada. Após 10 minutos, o pH do sobrenadante é medido em potenciômetro.

Para que sua utilização como meio de cultura para produção de enzimas, a torta residual de mamona deve apresentar pH de 5,95, com variação de 0,04 para mais ou para menos.

B) Porcentagem de Água (Karl-Fischer):

Para determinar-se a quantidade de água presente Na torta residual de mamona, sugere-se utilizar metodologia para amostras com baixa quantidade de água livre, como cereais, casca de frutas, resíduos vegetais e grãos, como a desenvolvida por Laitinen (Laitnen, H. A. Boyer, K. W. Automobile exhaust particulates properties of environmental significance. Environmental Science and Technology 279, p. 457-1086, 1975).

Esta metodologia baseia-se na oxidação de SO2 pelo 12, que constituem o reagente de Karl Fischer, na presença de água, conforme ilustrado na equação química a seguir. I2 + SO2 + H2O -> 2HI + H2SO4

Esta metodologia foi realizada por titulação volumétrica que fornece diretamente a porcentagem de água da amostra, sendo necessário fornecer a massa de amostra adicionada no frasco de titulação.

A quantidade de água na amostra deve ser de aproximadamente 4,78%, com variação de 0,07% para mais ou para menos.

C) Umidade:

Para determinação da umidade da amostra, deve-se fazer a incubação de 0,5 g por 24 horas em estufa a 105"C e, deve-se fazer a pesagem em períodos regulares até que essas amostras atinjam peso constante.

Para que a torta residual de mamona seja utilizada para produção ótima de fitase e tanase, ele deve apresentar teor de umidade de 6,7%, em relação ao peso total da amostra, com variação de 0,16% para mais ou para menos, como pode-se verificar na Tabela 1. Tabela 1: pH, quantidade de água e umidade relativa da torta de mamona in naturo.

PROCESSO FERMENTATIVO A) Microrganismo

O microrganismo Paecilomyces variotii deve ser mantido em meio Potato Dextrose Agar (PDA - OXOID - CM0139) com suplemento de 0,2% de ácido tânico (Tanal B - Prozyn - BioSolutions) e incubados em estufa a 30°C durante 72 horas.

Após a incubação, deve ser realizada uma suspensão celular com um homogeneizador, obtendo-se no final uma concentração de 9 x 106 células/mL

B) Meio de Fermentação

Devem ser misturados, na proporção de g/ml, 1 parte do resíduo (torta residual de mamona) para 1 parte da solução salina (g/L) composta por: 1,0 de KH2PO4; 2,0 de NH4NO3; 0,2 de MgSO4.7H2O; 0,02 de CaCI2.2H2O; 0,004 de MnCI2.4H2O; 0,002 de Na2Mo04.2H20 e 0,0025 de FeSO4.7H2O; e 10% de ácido tânico. Em seguida, o recipiente no qual foi feita a mistura deve ser esterilizado em autoclave a temperatura de 121°C durante 15 minutos.

Após ser resfriado à temperatura ambiente, adiciona-se a suspensão de esporos do Paecilomyces variotii, ao meio de cultura Potato Dextrose Agar (PDA - OXOID - CM0139) com suplemento de 0,2% de ácido tânico. Após a inoculação, os recipientes devem ser incubados em estufa a 30°C durante 120 horas.

C) Otimização de Produção Enzimática

Para a otimização da produção das enzimas tanase e fitase na torta residual de mamona, é necessária que seja mantida a proporção correta entre a concentração de ácido tânico e solução salina no meio de produção enzimática.

Fitase:

Determinou-se que o período ótimo de incubação do microorganismo Pαecilomyces vαriotii para produção de fitase, é de 72 horas, sofrendo uma pequena queda até as 96 horas, quando o valor de produção torna-se constante e apresenta queda após 120 horas, como podemos verificar na Tabela 2. Tabela 2: Avaliação da cinética de fermentação para a atividade fitásica em Torta de Mamona.

Não é necessária a adição de ácido tânico ao meio de cultura com torta residual de mamona, pois ele não interfere na produção dessa enzima. Adicionalmente, também não é necessária a suplementação do ácido fítico, que geralmente se usa pa/a produção da fitase, resultando em uma produção com maior viabilidade econômica.

A porcentagem do volume da solução salina em relação ao peso total do meio é entre 25 a 28%, sendo a concentração ótima de 25%. Porcentagens menores dq volume da solução inibem o crescimento do microrganismo.

Dessa forma, determinou-se que as melhores condições para a produção da fitase, em 10 g de meio, seriam: 2,5 mL de SS (%); 7,5 g de torta de mamona, incubados à 90% de UR. Obtendo-se dessa forma uma atividade de 70 U/mL ou 280 U/g de substrato na fermentação pela linhagem P. variotii.

Tanase:

Para otimização de produção da enzima tanase também foram determinados a concentração de ácido tânico e porcentagem do volume da solução salina adicionada em relação ao meio.

A otimização da cinética de fermentação, para que se obtenha a maior quantidade de tanase no menor tempo possível mostrou que para a produção dessa enzima, o tempo ótimo de fermentação é de 48 horas

A Anexo 3 indica que a faixa em que se obteria a maior atividade enzimática seria entre 84 a 90% de umidade relativa (UR%), com porcentagem de umidade ótima de 90%.

Valores acima de 90% provocam desequilíbrio entre umidade e temperatura na Câmara Climática. Condições de umidade do ar menores a 84% diminuem a atividade enzimática.

A atividade da enzima tanase é maior em concentrações entre 4,6 a 6% de ácido tânico, com atividade enzimática ótima em 4,6% e Concentrações maiores de ácido tânico diminuem a atividade tanásica.

Para a concentração do volume da solução salina em relação ao peso total do meio, a faixa de 25 a 33% estimularia a produção da enzima, com concentração ótima de 25%. Concentrações menores da solução salina impedem o crescimento do microrganismo no meio e o aumento da solução salina no meio de cultivo diminuiu a atividade tanásíca.

A umidade relativa do meio presente antes da fermentação era de 25% e após incubação na Câmara há um pequeno aumento de 2%, resultando em 27%. Entretanto a Câmara quando utilizada a 90% de umidade relativa do ar, consegue-se manter a umidade presente no meio de cultivo, não havendo perda de água do meio para o ar, resultando em um equilíbrio da água presente no meio com o ar, como pode ser observado na Tabela 3. Tabela 3: Umidade relativa do meio de cultivo antes e após incubação na câmara climática para o meio otimizado para produção de tanase em torta de mamona.

* TM 48h = meio de cultivo de torta de mamona com 4,6% do peso do ácido tânico em relação ao peso total do meio (p/p) e 25% do volume da solução salina em relação ao peso total do meio (v/p).

Dessa forma, para otimizar as condições para a produção da tanase, em 10 g de meio, seriam: 3 mL de SS (%); 0,46 g de AT (%); 6,54 g de torta de mamona, incubados à 90% de UR. Obtendo-se dessa forma uma atividade de 700 U/mL ou 2800 U/g de substrato na fermentação pela linhagem P. variotii.

EXEMPLOS Exemplo 1: CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO

Com o objetivo de definir a cinética de fermentação, as atividades enzimáticas de tanase e fitase foram determinadas em diferentes tempos: 24, 48, 72 e 96 horas.

Definindo assim o melhor tempo de fermentação do meio para produção das enzimaí, sendo este tempo utilizado na etapa de delineamento experimental.

Utilizando a torta de mamona como substrato, o melhor tempo de fermentação para produção enzimática da tanase foi após 48 horas, como indicada na 5 Tabela 4. Tabela 4: Avaliação da cinética de fermentação para a atividade tanásica em Torta de Mamona.

*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p>0,05) ao nível de 5% de probabilidade.

A partir de 48 horas de incubação a atividade enzimática diminuiu para 249 U/mL após 72 horas e manteve-se estatisticamente constante. Para enzima fitase, o melhor tempo de incubação para sua produção foi após 72 horas, após 96 horas a atividade diminuiu para 13,89 U/mL, como indicados na Tabela 5. Tabela 5: Avaliação da cinética de fermentação para a atividade fitásica em Torta de Mamona.

*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p>0,05) ao nível de 5% de probabilidade.

Exemplo 2: DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Com objetivo de otimizar a produção das enzimas tanase e fitase na torta de mamona, foram analisados a influência da concentração do ácido tânico e volume da solução salina no meio de produção enzimática. Utilizou-se a técnica do delineamento composto central rotacional (DCCR), apresentando 8 pontos fatoriais (p.f.), 6 pontos axiais (p.a.) e 3 pontos centrais (p.c.) totalizando 17 ensaios (23 p.f. + 6 p.a. + 3 p.c. = 17). As 3 variáveis independentes foram: umidade relativa do ar (%) em Câmara Climática (Nova Ética-Modelo 420/CLDTS 300); concentração de ácido tânico, que foi expresso em porcentagem em relação ao peso total do meio (p/p); e o volume da solução salina, que foi expresso em porcentagem em relação ao peso total do meio (v/p). As variáveis dependentes (respostas) foram atividade enzimática da tanase e fitase.

A concentração de ácido tânico (%) utilizada nesse estudo foi determinada de acordo com Battestin e colaboradores (2007b), onde a produção máxima de tanase foi obtida utilizando 8 a 15% de ácido tânico. Para o presente trabalho, foram testadas concentrações menores de ácido tânico a fim de reduzir os custos do meio de produção. ,

A quantidade de sal adicionado no meio de fermentação está descrita ná Descrição Detalhada, no item de Processo Fermentativo. Nesse estudo foi avaliado o volume de água adicionado ao meio de fermentação. A faixa de volume de ág^ua adicionada foi determinada de acordo com a capacidade máxima de absorção do substrato, sem apresentar água livre no meio, conforme Tabela 6. Os valores reais utilizados nos ensaios do planejamento estão apresentados na Tabela 7 e a matriz dos ensaios na Tabela 8. Tabela 7: Valores utilizados no DCCR para três fatores.

* AT (%) = Concentração de Ácido Tânico (p/p); volume SS {%) = volume da Solução Salina (v/p); UR (%) = Porcentagem da Umidade Relativa do Ar. Tabela 8: Matriz do delineamento contendo valores codificados das variáveis.

* xl= UR (%) = % umidade relativa do ar; x2 = volume SS (%) = % do volume da solução salina em relação ao peso total (v/p); x3 = AT (%) = % do peso do ácido tânico em relação ao peso total (p/p).

De acordo com a Tabela 6, a capacidade máxima de água que a torta de mamona absorveu em 10 gramas foram 11 mL de água, ou seja, em um meio com torta de mamona e água, 55% do peso do meio eram representados por água. Tabela 6: Capacidade de Absorção de Água da Torta de Mamona.

*Peso da torta de mamona postado para avaliar a capacidade de absorção de água em seu meio.

Com os resultados do planejamento foi possível no software STATISTCA 7.0 a determinação dos coeficientes de regressão para a resposta de interesse, calculou a ANOVA para analisar a possibilidade de construir a equação da resposta em função dos coeficientes de regressão estatisticamente significativo e também a superfície de resposta, com nível de significância de 10% (p-valor<0,l).

O primeiro delineamento foi realizado considerando-se a variável dependente atividade enzimática da fitase após 72 horas de fermentação e o segundo delineamento para variável dependente atividade enzimática da tanase após 48 horas de fermentação.

A) DCCR para Produção de Fitase

O delineamento composto central rotacional foi utilizado para avaliar a resposta ou variável dependente atividade enzimática da fitase. Os ensaios foram incubados com o microrganismo durante 72 horas, que foi o tempo que apresentou atividade fitásica mais alta. As variáveis independentes estudadas foram: a umidade relativa do ar, concentração do ácido tânico e a porcentagem do volume da solução salina adicionada em relação ao meio.

Apresenta-se na Tabela 9 a matriz das variáveis independentes em estudo, com valores reais e codificados, e a variável dependente fitase durante 72 horas de incubação.

Analisando-se os valores de atividade obtidos na Tabela 9, verifica-se um aumento na de atividade enzimática, variando-se de 1,97 U/mL para o ensaio 3 (66% de umidade relativa do ar, 49% do volume da Solução Salina em relação ao peso total e 6% de ácido tânico) até uma atividade máxima de 42,01 U/mL, para o ensaio 2 (84% de umidade relativa do ar, 31% do volume da Solução Salina e 6% de ácido tânico). Tabela 9: Matriz DCCR 23e a resposta da atividade enzimática da fitase após 72 horas de incubação.

xl = UR (%) = porcentagem da umidade relativa do ar; x2 = volume SS (%) = % do volume da Solução Salina em relação ao peso total (v/p); x3 = AT (%) = % do peso do ácido tânico em relação ao peso total (p/p).

A Tabela 10 apresenta os valores dos coeficientes de regressão, t e p-valor para 10 avaliar quais são as variáveis e suas interações, estatisticamente significativo, acima de 90%(p<0,10).

Com os resultados da Tabela 10, verificou-se que as variáveis linear, e quadrática de AT (%) (concentração de ácido tânico) e interação UR (%) com AT (%) e UR (%) com AT (%) não foram significativos, sendo avaliados para Resíduos na Fonte dç Variação, apresentando pvalor igual a 0,17, 0,67, 0,36 e 0,18, respectivamente. Assim, somente as variáveis Média, UR (%) (L) e (Q), volume SS (%) (L) e (Q) e interação UR (%) e volume SS (%) foram avaliados para Regressão na Fonte de Variação no ANOVA. Tabela 10: Resultados do Coeficiente de Regressão, Erro Padrão, t, p e Limite de Confiança na otimização dos componentes do meio de cultivo (umidade relativa do ar, volume da solução salina e ácido tânico) na atividade de fitase.

* parâmetros estatisticamente significativos a 90% de nível de confiança. L = parâmetro linear; Q= parâmetro quadrático.

A análise de variância (ANOVA) está representada na Tabela 11. Tabela 11: Análise de Variância no estudo do efeito dos componentes do meio de cultivo (UR (%), volume SS (%) e AT (%)) na atividade de fitase.

R2=0,92 Ftab(0,l;5;ll)=2,45 Ftab(0,l;9;2)=9,38

Para o coeficiente de correlação (R) o valor obtido foi de 0,96, para o coeficiente de determinação (R2) foi de 0,92, indicando uma correlação satisfatória entre os valores obtidos pelo experimento e os preditos pelo modelo. O valor F da Falta de Ajuste obtido a partir da ANOVA foi de 91,2 (9,72 vezes maior do que o valor de Ftabelado=9,38) e indicou uma falta de ajuste do modelo maior que o indicado pelo valor tabelado. O valor de F da Regresão obtido foi de 25,8 (10,53 vezes maior do que o valor de Ftabelado=2,45), indicando que o modelo para a atividade de fitase pode ser considerado estatisticamente significativo a 90% de nível de confiança.

Estes resultados podem ser considerados satisfatório e suficientes, permitindo obter um modelo codificado que descreve as respostas em função das variáveis analisadas. A partir da validação dos parâmetros de estudo, foi obtido o modelo- polinomial quadrático que representa o comportamento da atividade enzimática (1):

Fitase (U/mL) = 5,74 +8,14*(UR) +5*(UR)2 -8,8*(volume SS) +4*(volume SS)2 - 4,12*(UR)*(volume SS) (1)

O modelo polinomial quadrático foi utilizado para construir as superfícies de resposta e curvas de contorno. O Anexo 2 mostra os efeitos dos componentes umidade relativa do ar e porcentagem do volume da solução salina em relação ao peso total do meio, na produção de tanase pelo Paecilomyces variotii.

B) DCCR para Produção de Tanase

A Tabela 12 demonstra a matriz das variáveis independentes em estudo, com valores reais, codificados e a variável dependente tanase após 48 horas de fermentação.

Analisando-se os valores de atividade tanásica obtidos. Na Tabela 12, verifica-se 5 um aumento na atividade, variando de 104 U/mL no ensaio 12 (75% de umidade relativa do ar, 55% do volume da solução salina adicionado em relação ao peso total do meio e 8% de ácido tânico suplementado no meio) para 573 U/mL no ensaio 2 (84% de umidade relativa do ar, 31% do volume da solução salina e 6% de ácido tânico). Tabela 12: Matriz DCCR 23 e a resposta da atividade enzimática da tanase após 48 10 horas de fermentação. Valores Codificados Valores Reais Resposta

xl = UR (%) - umidade relativa do ar (%); x2 = volume SS (%) = % do volume da Solução Salina em relação ao peso total (v/p) ; x3 = AT (%) = % do peso do ácido tânico em relação ao peso total (p/p).

A Tabela 13 apresenta os coeficientes de regressão, erro padrão, t, p-valor e limite de confiança das variáveis e suas interações, em resposta a atividade da tanase com limite de confiança estatística de 90% (p<0,10). Tabela 13: Resultados do Coeficiente de Regressão, Erro Padrão, t, p e Limite de

* parâmetros estatisticamente significativos a 90% de nível de confiança. L = parâmetro linear; Q = parâmetro quadrático.

Com os resultados da Tabela 5, as variáveis UR (%) quadrático (umidade relativa do ar), AT (%) quadrático (concentração de ácido tânico) e interação UR (%) e volume SS (%) não foram significativos, apresentando p-valor igual a 0,48, 0,55 e 0,36, respectivamente. Assim, somente as variáveis UR (%) (L), volume SS (%) (L), volume SS (%) (Q), AT (%) (L), interação UR (%) com AT (%) e interação volume SS (%) com AT (%) foram avaliados para Regressão na Fonte de Variação no ANOVA.

A análise de variância (ANOVA) está representada na Tabela 14. Tabela 14: Análise de Variância no estudo do efeito dos componentes do meio de cultivo (UR (%), volume SS (%) e AT (%)) na atividade de tanase.

R2=O,94 Ftab(0,l;6;10)=2,46 Ftab(0,l;8;2)=9,37

Para o coeficiente de correlação (R) o valor obtido foi de 0,97, para o coeficiente de determinação (R2) foi de 0,94, indicando uma boa correlação entre os valores obtidos pelo experimento e os preditos pelo modelo. O valor F da Falta de Ajuste obtido a partir da ANOVA foi de 5,11 (1,83 vezes menor do que o valor de Ftabelado=9,37), resultando em uma falta de ajuste do modelo menor que o indicado pelo valor tabelado. O valor de F da Regressão obtido foi de 25,3 (10,2 vezes maior do que o valor de Ftabelado=2,46), indicando que o modelo para a atividade de tanase pode ser considerado estatisticamente significativo a 90% de nível de confiança.

Estes resultados podem ser obtidos por um modelo codificado que descreve as respostas em função das variáveis analisadas. A partir da validação dos parâmetros de estudo, foi obtido o modelo polinomial quadrático que representa o comportamento da atividade enzimática (2):

Tanase (U/mL) = 288 + 58,24*(UR) -75,21*(volume SS) -20,93*(volume SS)2 - 60,77*(AT) -36*(UR)*(AT) +79,25*(volume SS) * (AT) (2)

O modelo polinomial quadrático foi utilizado para construir as superfícies de resposta e curvas de contorno. O Anexo 3, (a), (b) e (c), ilustra os efeitos dòs componentes umidade relativa do ar, concentração de ácido tânico e porcentagem do volume da solução salina em relação ao peso total do meio, na produção de tanase pelo Paecilomyces variotii.

Exemplo3: EXTRAÇÃO ENZIMÁTICA E DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS

Após a fermentação procedeu-se a extração da enzima adicionando 4 partes de tampão acetato pH 5,5 - 0,02 M para 1 parte do meio de fermentação em cada Erlenmeyer. Os frascos foram agitados a 200 rpm por 1 hora (Battestin, 2007b). A solução foi filtrada em gaze e o extrato retido na filtração foi denominado extrato sólido bruto. O filtrado foi centrifugado a 7100 x g por 30 minutos a 4°C, sendo então chamado de extrato enzimático bruto (Lekha, P. K.; Lonsane, B. K. Production and application of tannin acyl hydrolase: State of the art. Advances in Applied Biochemistry and Microbiology 44, p. 215-260, 1997). O extrato enzimático foi utilizado para determinação da atividade das enzimas tanase e fitase. O extrato sólido bruto foi utilizado para determinações analíticas de fenóis totais, taninos condensados, taninos hidrolisados e detoxificação.

O objetivo principal das determinações analíticas foi avaliar as concentrações de compostos de valor nutricional no meio pré-fermentado e pós-fermentado como compostos fenólicos, taninos hidrolisáveis, condensados, avaliação da presença de ricina e determinação do processo de detoxificação.

A) Extração de Fenóis Totais

Foram utilizadas os seguintes solventes para o processo de extração, na proporção de 50% do solvente e 50% de água: Acetato de Etila, Acetona e Metanol. Também foi testado com o solvente Hexano em sua forma anidra (100%). Foram pesados 200 mg da amostra em 10 mL do solvente, em seguida foram incubados a temperatura ambiente com agitação de 150 rpm durante 120 minutos. Após a homogeneização foram centrifugados a 1320 x g a 5°C durante 15 minutos e analisados por determinação de Fenóis Totais (Naczk, M.; Shahidi, F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A 1054, p. 95-111, 2004); (Schons, 2009).

B) Determinação de Fenóis Totais

Foi utilizada a técnica de Follin-Ciocaulteau (Singleton, V. L Rossi, J. A. J. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture 20, p. 144-158,1965) para determinação de fenóis presentes na amostra. Este método baseia-se na redução do ácido fosfomolibdíco e fosfotungstico pelas hidroxilas dos fenóis produzindo uma coloração azul, quantificada por espectrofotometria a 760 nm.

Em um Erlenmeyer de 50 mL foram adicionados 1 mL do reagente Follin- Ciocaulteau, 10 mL de água destilada, 1 mL da amostra e deixou-se em repouso durante 3 minutos. Foram adicionados 8 mL de carbonato de sódio (7,5%) e a reação ocorreu por 2 horas em local escuro. Após 2 horas, foi realizada a leitura da amostra em espectrofotômetro à absorbância de 760 nm. O branco foi composto por todos os constituintes da reação, com exceção da amostra. 0 curso da reação foi acompanhado por uma curva de calibração com ácido gálico, conforme metodologia descrita.

C) Determinação de Taninos Hidrolisáveis

Foi empregada a metodologia de Brune e colaboradores (Brune, M. Hallberg, L. Skânberg, A. Determination of iron-binding phenolic groups in foods. Journal of Food Science 56, p. 128-131, 1991) sendo que a extração das amostras foi realizada como indicado para os fenóis totais. Utilizou-se uma solução de sulfato de ferro (III) e amónio, denominada FAS. A solução era constituída por: 89% de solução tampão acetato 0,1 M - pH 4,4; 10% de solução de goma arábica à 1%; 1% de solução de sulfato de ferro (III) e amónio à 5%. Em um tubo de ensaio adicionou-se 2 mL da amostra em estudo e 8 mL da solução FAS. Após 15 minutos de reação, foi lida a absorbância em 578 nm. O branco foi realizado substituindo a amostra por água destilada. O curso da reação foi acompanhado por um a curva de calibração com ácido tânico, conforme metodologia descrita.

D) Determinação de Taninos Condensados

Empregou-se a metodologia de Prince e colaboradores (Price, M. L. Van Scoyoc, S. Butler, L. G. A critical evaluation of the vanillin reaction as an assay for tannin in sorghum grain. Journal of Agricultural and Food Chemistry 26, p. 1214- 1218, 1978), sendo específica para flavonóides e dihidroxichalconas que possuem ligação simples na posição 2 e 3 e uma hidroxila livre no anel beta. A vanilina é protonada em uma solução ácida, resultando em um carbocation eletrofílico fraco, o qual reage com o anel aromático nas posições 6 ou 8, este composto é imediatamente desidratado formando um composto vermelho.

A extração da amostra foi realizada como nos fenóis e taninos hidrolisáveis. Utilizou uma solução de vanilina contendo: 1 parte para a solução de vanilina (1% de vanilina dissolvido em metanol) e 1 parte para solução de HCI (8% de HCI em metanol).

O método foi realizado com a adição de 1 mL da amostra em estudo e 5 mL da solução de vanilina durante 5 minutos, sendo que a cada 1 minuto foi colocado 1 mL da solução de vanilina. O branco foi constituído por 1 mL de água destilada e 5 mL da solução de vanilina, em seguida a reação foi conduzida durante 20 minutos e por fim foi feita a leitura em espectrofotômetro a 500 nm. O curso da reação foi acompanhado por uma curva de calibração com catequina, conforme metodologia descrita.

D) Resultados

Na Tabela 15 estão representadas as concentrações de Fenóis Totais em cada grama de amostra extraída por quatro diferentes solventes diluídos a 1:1 com água destilada, com exceção ao Hexano: Acetato de Etila, Acetona e Metanol, em torta de mamona não fermentada. Tabela 15: Concentração de Fenóis Totais em torta de mamona não fermentada em diferentes tipos de solventes.

*Acetato = 1:1 de Acetato de Etila e Água destilada; Acetona = 1:1 de Acetona e Água destilada; Metanol = 1:1 de Metanol e Água destilada; Hexano = somente Hexano.

Os resultados mostram que o solvente Acetona diluído a 1:1 com água destilada apresentou maior concentração de fenóis, com uma média de 47 miligramas por grama de amostra.

Não há um consenso para utilização de um solvente para extração dos compostos fenólicos na maioria das amostras na área de alimentos, principalmente em vegetais. Mas os resultados acima indicam que o melhor solvente para extração de compostos fenólicos são aqueles que apresentam polaridade, o que não ocorre com o Hexano por ser um solvente apoiar e não interage com compostos polares, somente com apoiares.

Para melhor extração de Fenóis Totais e também para Taninos Hidrolisáveis e Condensados, foi utilizada a solução de Acetona para analisar os seus teores antes e após a fermentação da torta de mamona.

Os teores de Fenóis Totais e Taninos Hidrolisáveis das amostras, torta de mamona in natura e meio de cultivo otimizado e fermentado para produção de fitase (após 72 horas de fermentação), estão apresentados na Tabela 16. Tabela 16: Concentração de Fenóis Totais e Taninos Hidrolisáveis antes e após fermentação.

*TM = Torta de Mamona in natura; TM F72h = meio de cultivo otimizado e fermentado para produção de fitase (após 72 horas de fermentação).

Os resultados mostraram que a fermentação da torta de mamona por Pαecilomyces vαriotii após 72 horas de incubação diminuiu a concentração de fenóis totais e também de taninos hidrolisáveis. Provavelmente o microrganismo produziu enzimas que hidrolisaram estes compostos, como a tanase, que tem capacidade de clivar taninos hidrolisáveis. Para estas amostras, não foram detectados concentrações suficientes de taninos condensados, provavelmente não foram postados quantidades suficientes das amostras no processo de extração para determinar os taninos. condensados.

Não foram encontradas na literatura recente, pesquisas que envolvessem a determinação de compostos fenólicos em torta de mamona, já que estes resíduos não apresentam ainda interesse na produção de ração animal e consequentemente não há estudos para análises de compostos de interesse funcional ao animal.

Xu e colaboradores {Xu, L; Diosady, L. L Rapid method for total phenolic acid determination in rapeseed/canola meals. Food Research Internationa! 30, p. 571- 574,1997) quantificaram a presença de compostos fenólicos em canola, uma semente utilizada para extração de seu óleo para o setor de biocombustíveis. Foi realizado uma etapa de extração em que a amostra passou por uma extração ácida de acetona em seguida por uma hidrólise alcalina, depois passou por uma acidificação, depois por uma extração de éter etílico com acetato de etila e finalmente por uma evaporação.e dissolução em metanol. Essa extração foi realizada para que se obtive-se três tipos de fenóis: os livres, os esterificados e os insolúveis, favorecendo um maior amplo de compostos identificados na análise colorimétrica. De acordo com os resultados, a canola apresentou 1683 miligramas de compostos fenólicos a cada 100 gramas de amostra.

Segundo Kozlowska e colaboradores (Kozlowska, H.; Naczk, M.; Shahihi, F.; Zadernowski, R. Phenolic acids and tannins in rapeseed and canola. In Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition and Processing Technology, ed. F. Shahidi, AVI Book, New York, NY, p. 193-210, 1991) a concentração de ácidos fenólicos em farelo de canola está na ordem de 6,4 a 12,8 gramas por kg de amostra.

A partir destes resultados verificamos que a torta de mamona apresentou uma composição de compostos fenólicos mais expressivos em relação à canola, apresentando vantagem em relação a sua composição fenólica para um futuro uso como ração animal.

Exemplo 4: AVALIAÇÃO DA DETOXIFICAÇÃO DA TORTA DE MAMONA POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO A) Detecção de ricina por SDS-PAGE

Para avaliar a detoxificação da torta de mamona via fermentação em estado, sólidopor Paecilomyces variotii, foi identificada a presença da ricina por SDS-PAGE. A ricina apresentavam 2 cadeias que quando clivados pelo SDS e corridos no gel dé poliacrilamida apresentam duas bandas, uma chamada de cadeia A com 32 kDa e outra de cadeia B com 34 kDa (Anandan, 2005).

Foi avaliado o extrato proteico do produto fermentado em diferentes tempos de incubação, entre 24 a 72 horas, comparando com a ricina purificada, a torta de mamona in natura e a autoclavada (Anexo 4).

Primeiro, efetuou-se a extração com adição de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,2 na proporção 1:4 (1 g de resíduo sólido para 4 mL de tampão) no resíduo que foi mantido em agitação durante 3 horas, em seguida submetido à centrifugação a 14000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para determinação de ricina presente na amostra, foi realizada a quantificação de proteínas (Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72, p. 248, 1976) para obter uma concentração padrão para todas as amostras. Adicionou 80 pL do sobrenadante a 40 pL de tampão contendo Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e β- mercaptoetanol, totalizando 120 pL. Deste total, foram aplicados 25 pL para correr o gel de SDS-PAGE 12% (10x10x0,lcm). Após a corrida, as proteínas foram fixadas e coradas por 1 hora com solução de Coomassie-Brilliant-Blue 0,1% em metanol/ácido acético/água (45/10/45, v/v/v). Após esse tempo, o gel foi descorado com uma solução contendo metanol/ácido acético/água (45/10/45, v/v/v).

De acordo com o Anexo 4 as bandas em que a ricina aparecem no gel estão ná faixa entre 31,3 e 38,2 kDa, sendo também visualizadas na corrida com a ricina, purificada. As amostras torta de mamona in natura e torta de mamona autoclavada'. apresentaram as duas bandas da ricina no gel, mostrando que a metodologia é válida para identificação deste composto em amostras de extrato protéíco. O processo de autoclavagem, a 121°C durante 15 minutos, não destruiu as cadeias da ricina. Na amostra de extrato protéico fermentado após 24 horas, a presença de ricina é fracamente visível, demonstrando uma provável inicialização da hidrólise do composto. Nas amostras de 48 e 72 horas de fermentação, as bandas onde a ricina se localizam estão completamente ausentes, mostrando possivelmente que o microrganismo Paecilomyces variotii hidrolisou a ricina, tornando possível uma torta detoxificada e viável para uso em ração animal. A detecção mínima de proteínas em SDSPAGE por Coomassie Blue é de 10 pg/mL de amostra, concentrações mais baixas dificilmente são detectáveis pelo método (Anandan, 2005); (Godoy, 2009) e (Schãgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols l,p. 16-22, 2006).

Uma alternativa seria a utilização do corante de prata para uma detecção de compostos com menores concentrações.

B) Teste de Atividade Tóxica em Cultura de Células

Foi usado o teste MTT de acordo com metodologia de Mosmann (Mosmann, T., 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. 65, 55-63). Durante os ensaios, células do tipo RAW 264,7 foram cultivados em meio DMEM em estufas a 37°C na presença de CO2 em sua atmosfera. Para 100 pL de cultura de células, um volume de 100 pL de MTT (5 mg/mL em PBS) e extrato da amostra foram adicionadas em poços de microplacas. Cada microplaca foi incubada na estufa de acordo com o tempo de 24 horas. Após incubação, as microplacas foram lidas em espectrofotômetro à 540 nm de absorbância.

O ensaio foi conduzido utilizando-se a ricina obtida como descrito no item da extração, a fim de determinar a dose mínima para induzir morte na cultura de células. Para isso, foram utilizadas diferentes diluições da proteína feita em PBS pH 7,0: 100

Ug/mL, 50 pg/mL, 10 pg/mL, 1 pg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL, 50 pg/mL e 10 pg/mL. Em seguida utilizou-se a concentração mínima inibitória do extrato sobre as células para avaliar o substrato fermentado nos tempos de 24, 48 e 72 horas de fermentação.

Através dos resultados obtidos pela análise em eletroforese, as amostras foram testadas em culturas de células vivas para verificação da viabilidade da mesma em presença da torta de mamona in natura e fermentada.

De acordo com a Figura 7, a concentração mínima necessária para que ocorra a morte das células foi de 1 pg/mL de extrato da torta. Menores concentrações a viabilidade celular no meio de cultura foi próximos dos 100% e assim não interferiram em seu crescimento. A partir destes valores, o segundo ensaio foi realizado com extratos do material fermentado com 1 pg/mL em diferentes tempos (24, 48 e 72 horas de fermentação). De acordo com a Figura 8, durante o processo fermentativo, em seu progresso do tempo, a viabilidade celular foi aumentando em que após 72 horas de fermentação apresentou aproximadamente 100% da viabilidade celular. Sendo assim, provavelmente o microorganismo Pαecilomyces vαriotii hidrolizou os possíveis compostos tóxicos (ricina) no meio e favoreceu o crescimento das células em estudo. Tabela 17: Umidade relativa do meio de cultivo antes e após incubação na câmara climática para o meio ótimo para produção de fitase em torta de mamona.

* TM 72h = meio de cultivo de torta de mamona com 25% do volume da solução salina em relação ao peso total do meio (v/p). ** Incubação em Câmara Climática a 90% de Umidade Relativa do Ar a temperatura de 30°C.

Claims (39)

1. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii caracterizado por ser constituído de torta residual de mamona e solução salina;

2. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela solução salina ser composta em grama por litro de 1 parte de KH2PO4; 2 partes de NH4NO3; 0,2 partes de MgSO4.7H2O; 0,02 partes de CaCI2.2H2O; 0,004 partes de MnCI2.4H2O; 0,002 partes de Na2MoO4.2H2O e 0,0025 partes de FeSO4.7H2O.

3. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por não conter ácido fítico.

4. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por preferencialmente não conter ácido tânico.

5. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter de 25 a 28% de solução salina, em relação ao peso total do meio.

6. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por conter preferencialmente 25% de solução salina, em relação ao peso total do meio.

7. Meio de cultura para produção de enzima fitase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter preferencialmente 75% do peso total composto pela torta residual de mamona.

8. Processo para produção de enzima fitase, caracterizado por ser feito pelo microorganismo Paecilomyces variotii através de fermentação sólida.

9. Processo para produção de enzima fitase, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ser em torta residual de mamona.

10. Processo para produção de enzima fitase, de acordo com as reivindicações 8 e 9, caracterizado por ser feito como descrito nas reivindicações de 1 a 7.

11. Processo para produção de enzima fitase, de acordo com as reivindicações 8 a 10, caracterizado por ser obtido preferencialmente após 72 horas de incubação.

12. Processo para produção de enzima fitase, de acordo com as reivindicações 8 a 11, caracterizado por ser obtido entre 85 e 90% de umidade relativa ambiente, preferencialmente 90%.

13. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces varioti caracterizado por ser constituído de torta residual de mamona, solução salina e de ácido tânico;

14. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela solução salina ser composta em grama por litro de 1 parte de KH2PO4; 2 partes de NH4NO3; 0,2 partes de MgSO4.7H2O; 0,02 partes de CaCI2.2H2O; 0,004 partes de MnCl2.4H2O; 0,002 partes de Na2MoO4.2H2O e 0,0025 partes de FeSO4.7H2O.

15. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por conter de 4,6 a 6,0 % de ácido tânico, em relação ao peso total do meio.

16. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por conter preferencialmente 4,6% de ácido tânico em relação ao peso total do meio.

17. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por conter de 25 a 33% de solução salina, em relação ao peso total do meio.

18. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por conter preferencialmente 25% de solução salina, em relação ao peso total do meio.

19. Meio de cultura para produção de enzima tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por conter preferencialmente 65,4% de torta residual de mamona.

20. Processo para produção de enzima tanase, caracterizado por ser feito pelo microorganismo Paecilomyces variotii através de fermentação sólida.

21. Processo para produção de enzima tanase, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por ser em torta residual de mamona.

22. Processo para produção de enzima tanase, de acordo com as reivindicações 20 e 21, caracterizado por ser produzido como descrito nas reivindicações de 13 a 19.

23. Processo para produção de enzima tanase, de acordo com as reivindicações 20 a 22, caracterizado por ser obtida preferencialmente após 48 horas de incubação.

24. Processo para produção de enzima tanase, de acordo com as reivindicações 20 a 23, caracterizado por ser obtido em ambiente com umidade relativa entre 84 e 90%, preferencialmente 90%.

25. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii caracterizado por ser constituído de torta residual de mamona e solução salina com ou sem ácido tânico.

26. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela solução salina ser composta em grama por litro de 1 parte de KH2PO4; 2 partes de NH4NO3; 0,2 partes de MgSO4.7H2O; 0,02 partes de CaCI2.2H2O; 0,004 partes de MnCI2.4H2O; 0,002 partes de Na2MoO4.2H2O e 0,0025 partes de FeSO4.7H2O.

27. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por não conter ácido fítico.

28. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por conter ácido tânico de 4,6 a 6% de ácido tânico.

29. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por conter de 25 a 33% de solução salina, em relação ao peso total do meio.

30. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por conter preferencialmente 25% de solução salina, em relação ao peso total do meio.

31. Meio de cultura para produção simultânea das enzimas fitase e tanase pelo microorganismo Paecilomyces variotii, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por conter de 65,4 a 75% do peso total composto pela torta residual de mamona.

32. Uso da enzima fitase obtida de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizado por ser para suplementação alimentar.

33. Uso da enzima fitase obtida de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizado por ser para suplementação em ração animal.

34. Uso da enzima tanase obtida de acordo com as reivindicações de 13 a 19, caracterizado por ser para suplementação alimentar.

35. Uso da enzima tanase obtida de acordo com as reivindicações de 13 a 19, caracterizado por ser para suplementação em ração animal.

36. Uso da enzima fitase obtida de acordo com as reivindicações de 25 a 31, caracterizado por ser para suplementação alimentar.

37. Uso da enzima fitase obtida de acordo com as reivindicações de 25 a 31, caracterizado por ser para suplementação em ração animal.

38. Uso da enzima tanase obtida de acordo com as reivindicações de 25 a 31, caracterizado por ser para suplementação alimentar.

39. Uso da enzima tanase obtida de acordo com as reivindicações de 25 a 31, caracterizado por ser para suplementação em ração animal

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