BRPI1106599A2 - Oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras - Google Patents

Abstract

Oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A presente invenção descreve oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A invenção está relacionada com a identificação taxonômica e detecção de leveduras em bebidas.

Description

OLIGONUCLEOTÍDEOS, USO, MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE CONTAMINAÇÃO DE AMOSTRAS POR LEVEDURAS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção descreve oligonucleotídeos universais, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A presente invenção se situa no campo industrial.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O processo de detecção de leveduras é efetuado por plaqueamento em meios próprios e por meio de técnicas de biologia molecular. Entre estas últimas, a PCR e suas variações têm sido amplamente empregadas. O par de oligonucleotídeos da presente invenção foi desenhado para detectar qualquer gênero de levedura e ser empregado como controle positivo de amplificação em PCR. Desta forma, os oligos da presente invenção auxiliam na verificação da eficácia de diferentes processos de extração de DNA, em produtos alimentícios e em bebidas, especialmente vinho, cerveja e cidra.

Existem muitos oligos para detectar leveduras específicas como os descritos em WO 2007132589 (grupo de primers utilizados para detectar D.anômala, D.bruxellensis, D.custersiana ou B.naardenensis), WO 2008/006985 (kit para detecção de contaminação por leveduras Brettanomyces), US 2004/0166492 (novos oligonucleotídeos capazes de se ligar à região do espaçador transcrito interno de Dekkera bruxellensis, entre outros, sendo útil para a identificação de microorganismos relacionados à fermentação), FR 2908786 (kit para detecção de contaminação de leveduras Brettanomyces), WO 2007/021027 (oligonucleotídeos, arranjos contendo esses oligos, aparato, método e kit de detecção de microorganismos, incluindo Dekkera), US 20080268430 (métodos e kits relacionados a detecção, identificação e quantificação de leveduras em vinho, cerveja e sucos). No entanto, poucos documentos mostram oligos universais para identificação de leveduras sem a detecção de outros microorganismos.

Andorrà et al. (Andorrà, i.; Landi, s.; Mas, a; Guillamón, j.m.; Esteve-zarzoso, h. Effect of oenological practices on microbial populations using culture-independent techniques. Food microbiol, 25(7): 849—856, 2008) utilizaram PCR em processos de avaliação de populações de leveduras, bactérias lácticas e acéticas em vinho para evitar o emprego de técnicas dependentes de meios de cultura. A PCR aliada a outras técnicas tem sido empregada para caracterizar leveduras, presentes em presunto (Andrade, m.j.; Rodríguez, m.; Casado, e.; Córdoba, j.j. Efficiency of mitochondrial dna restriction analysis and rapd-pcr to characterize yeasts growing on dry-cured iberian ham at the different geographic areas of ripening. Meat Science, 84(3): 377 — 383, 2010), entereococos de queijos (Andrighetto, c.; Psomas, e.; Tzanetakis, n.; Suzzi, g.; Lombardi. A randomly amplified polymorphic DNA (rapd) PCR for the Identification of yeasts isolated from dairy products. Lett appl microbiol 30(1): 5—9, 2000; Andrighetto, c.; Knijff, e.; Lombardi, a; Torriani, s.; Vancanneyt, m.; Kersters, k.; Swings, j.; Dellaglio, f. Phenotypic and genetic diversity of enterococci isolated from italian cheeses. j dairy res, (68)(2): 303—316, 2001) e lactobacilos em produtos cárneos (Andrighetto, c.; Zampese, 1.; Lombardi. A rapd-pcr characterization of lactobacilli isolated from artisanal meat plants and traditional fermented sausages of veneto region (italy)., lett appl microbiol, 33(1): 26—30, 2001a) . A diversidade microbiana de queijos também foi determinada por técnicas associadas a PCR (andrighetto, et al. 2004). lactobacilos termofílicos foram identificados por amplificação por PCR, utilizando primers espécie-específicos para amplificar segmento da região do gene 16s rRNA (andrighetto et al., 1998). Há processos que envolvem PCR na identificação de leveduras (De barros lopes, m.; Soden, a.; Henschke, p.a.; Langridge, p. PCR differentiation of commercial yeast strains using intron splice site primers. appl environ microbiol, 62: 4514—4520, 1996; De barros lopes. m.; Soden, a.; Martens; a.l; Henschke, p.a.; Langridge, p. Differentiation and species Identification of yeasts using per. int j syst bacteriol, 48: 279—286, 1998; Arroyo-lópez, f.n.; Durán-quintana, m.c.; Ruiz-barba, j.l.; Querol, a.; Garrido- femández, a. Use of molecular methods for the Identification of yeast associated with table olives, food microbiology, 23: 791 — 796, 2006; Borman, a.m.; Linton, c.j; Miles, s.j; Campbell, c.k.; Johnson, e.m. Ultra-rapid preparation of total genomic DNA from isolates of yeast and mould using whatman fia filter paper technology - a reusable dna archiving system. med mycol, 44: 389—398, 2006. Cada um destes trabalhos apresentam procedimentos e possuem detalhes específicos que abrangem desde os primers propriamente ditos, como regiões diferentes do DNA, às condições de técnicas de amplificação. Algums primers são específicos para um determinado gênero ou espécie de leveduras operando com uma variação da técnica denominada PCR aninhada (Tbeas, j.i.; Lozano, i.; Perdigones, f.; Jimenez, j. Detection of dekkera-brettanomyces strains in sherry by a nested {per} method. appl environ microbiol, 62: 998—1003, 1996), outros usam primers derivados de 28 RNA (WO 2007/062442) para a detecção de leveduras e fungos fílamentosos (WO 2007/062442) e, fínalmente, outros ainda são mais gerais pois detectam bactérias, fungos fílamentosos e leveduras com primers e sondas derivados de 16s rRNA e de 18s rDNA (US 2004/0265850) e micro-organismos (WO 2004/009839). Todos estes métodos diferem da presente invenção e se caracterizam por apresentar, além de tudo, procedimentos complexos.

Quando se pretente amplificar um segmento de DNA, o primer desenhado para tal fim é empregado de imediato. Fatores externos podem interferir de tal sorte que a amplificação não se realiza. Surgem dúvidas sobre o primer, as condições de amplificação e as atividades das polimerases (Taq e Thh). A presente tecnologia permite a amplificação de um segmento de aproximadamente 375 pb da região 18S do DNA ribossômico de leveduras. Este par de oligonucleotídeos possui capacidade de amplificar pequenas quantidades de DNA. Por se tratar de um primer que pode ser utilizado para qualquer gênero de levedura, a escolha de um gênero de fácil acesso e de crescimento rápido para testes da eficiência das polimerases torna o processo de otimização da amplificação por PCR com outros primers, mais dinâmico. Assim, a inibição por diferentes compostos da amplificação por PCR e a eficiência de diferentes procedimentos de extração de DNA podem ser facilmente avaliadas. O par de oligonucleotídeos desenvolvido tem se mostrado muito eficiente para trabalhos de extração direta de DNA em ambientes, como vinho, nos quais há potentes inibidores enzimáticos. Amostras de líquidos naturais se caracterizam por possuir um elevado número de compostos químicos, onde alguns atuam como forte inibidores da PCR. O emprego deste par de oligonucleotídeos permite investigar a eficiência dos procedimentos de remoção de tais inibidores das amostras.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção descreve oligonucleotídeos, seu uso para detecção de leveduras, método e kit compreendendo tais oligonucleotídeos, para serem utilizados para detecção da contaminação por leveduras.

De acordo com a primeira concretização da invenção é provido um grupo de oligonucleotídeos para uso na detecção de leveduras, caracterizado por hibridizar especificamente com as seqüências selecionadas do grupo de SEQ ID NO 1 ou SEQ ID N02.

Uma segunda concretização da invenção diz respeito ao uso ao uso de marcador molecular específico selecionado do grupo descrito em SEQ ID NOl ou SEQ ID N02.

Uma terceira concretização da presente invenção diz respeito a um método de detecção de contaminação por leveduras compreendendo as etapas de: a. realizar a reação de amplificação, de ácido nucléico contido em uma amostra através da utilização de oligonucleotídeos que hibridizam especificamente com a região 18S DNAr de microorganismos; e b. detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, onde a geração de um produto de amplificação indica a presença do microorganismo.

Uma quarta concretização da presente invenção diz respeito a um kit de identificação de microorganismos em uma amostra caracterizado por compreender aparato para realização da reação de amplificação e reagentes de amplificação compreendendo os oligonucleotídeos da presente invenção.

Uma quinta concretização da invenção diz respeito ao uso dos oligonucleotídeos da presente invenção caracterizado por ser na identificação de microorganismos em amostras.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 — Amplificação de um específico de DNA de 375 bp da região 18S de Dekkera e Saccharomyces: M- 100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae — padrão com células lisadas com tampão de lise; 2- D. bruxellensis -padrão com células lisadas com tampão de lise; 3- Sacch. cerevisiae - células lisadas com fervura; 4- D. bruxellensis - células lisadas com fervura; 5 — Sacch. cerevisiae - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; 6- D. bruxellensis - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; A- 25 ciclos; B- 30 ciclos; C- 35 ciclos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As leveduras estão presentes em vários tipos de bebidas, como bebidas alcoólicas e refrigerantes. Assim, a presença ou ausência de levedura pode ser utilizada como um indicador do controle de qualidade de vários tipos de bebidas. Assim, o grupo de oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção é útil para o controle de qualidade de vários tipos de bebidas (por exemplo, bebidas alcoólicas e refrigerantes, e, particularmente, vinho e cerveja) e do exame de amostras ambientais. A presente invenção está relacionada particularmente ao desenvolvimento de um grupo de oligonucleotídeos para identificação taxonômica de leveduras. A presente invenção também está relacionada com o uso no método de identificação de leveduras em bebidas. O par de oligonucleotídeos desenvolvido tem se mostrado muito eficiente também para trabalhos de extração direta de DNA em ambientes, como vinho, nos quais há potentes inibidores enzimáticos. Amostras de líquidos naturais se caracterizam por possuir um elevado número de compostos químicos, onde alguns atuam como forte inibidores da PCR. O emprego deste par de oligonucleotídeos permite investigar a eficiência dos procedimentos de remoção de tais inibidores das amostras. A presente invenção compreende o uso de oligonucleotídeos capazes de reconhecer a região 18S rDNA de leveduras. A presente invenção também está relacionada com uma metodologia para identificação taxonômica de leveduras por meio da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase utilizando um par de oligonucleotídeos específico baseado na região 18S do DNA ribossômico. A inovação consiste no desenvolvimento de oligonucleotídeos baseados em uma região do DNA ribossômico ainda não utilizada para a detecção de leveduras de uma forma geral, tendo como consequência o desenvolvimento de um método de detecção confiável e viável de ser utilizado na rotina industrial. A vantagem é que permite, com alto grau de confiabilidade, a detecção de várias espécies de leveduras que são contaminantes de bebidas, entre elas o vinho, e que causam perdas econômicas ao setor vinícola ao se desenvolverem no produto final e produzirem quantidade de compostos fenólicos acima do limiar de percepção (LP). Permite a detecção rápida da contaminação por leveduras, possibilitando ações que reduzam as perdas econômicas.

Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção. “Sense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5’—3’ da seqüência de interesse. “Antisense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ da seqüência de interesse. O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto “sense” como “antisense”.

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos ccrca de 99% puro. O termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele. O termo “primer” como utilizado aqui refere-se a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a seqüência do ‘primer’ deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5’ de um ‘primer’ complementar. Altemativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da seqüência de oligonucleotídeo do ‘primer’, desde que o ‘primer’ tenha complementaridade suficiente com a seqüência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto. O termo “hibridizando especificamente” diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam seqüências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1, 2003) Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 4, 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridização entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et ah, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press): Tm = 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda) Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NOl ou SEQ ID N02 ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da seqüência especificada como SEQ ID NOl ou SEQ ID N02, ou uma variante desta. O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um segmento relativamente curto de uma seqüência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores (“primers”), onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase. O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 15-50 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1 ou SEQ ID N02. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica. A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “seqüência reversa”, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a seqüência 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a seqüência reversa é 5’TGAAGTGA3’.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas seqüências de nucleotídeos com as seqüências de nucleotídeo descritas aqui (SEQ ID NO 1 ou SEQ ID N02), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas seqüências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.govl.

Aqui, o termo "mutação" significa que os nucleotídeos podem ser os mesmos ou diferentes, podem ser selecionados a partir de uma substituição, uma exclusão, uma inserção e uma adição. Essa mutação pode ser preferencialmente selecionada de "uma substituição de uma base", onde uma certa base é substituída por outra base, “uma base de exclusão", onde uma certa base é excluída, “uma base de inserção", onde uma certa base está inserida, e "uma base de adição", em que uma certa base é adicionada. O número de mutações pode ser 1-6 bases, 1, 2, 3 ou 4, bases, 1 ou 2 bases ou uma base.

Um polinucleotídeo que constitui o grupo de primers da presente invenção pode ser preparado pela síntese química de um ácido nucléico de acordo com um método comum, como um método de fosfato triéster (Hunkapiller, M. et al. Nature, 310, 105, 1984). Caso contrário, o DNA total de uma cepa como meta de detecção pode ser obtido, e um fragmento de DNA contendo uma seqüência de nucleotídeos de interesse pode ser então obtido, conforme o caso, pelo método de PCR ou similar, com base nas seqüências de nucleotídeos divulgada na presente especificação. Mais especificamente a presente invenção diz respeito ao método de detecção de leveduras do gênero Dekkera e Brettanomyces através da técnica de PCR (Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Hom, K. B. Mullis, and Η. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491; United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction).

De acordo com a presente invenção, é previsto um método de detectar leveduras compreendendo as seguintes etapas: (a) realizar a reação de amplificação de ácido nucléico contido em uma amostra através da utilização do grupo de primers selecionados do grupo de SEQ ID NOl ou SEQ 1D N02; e (b) detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, onde a geração de um produto de amplificação indica a presença de levedura. O grupo de primers da presente invenção pode ser provido na forma de um kit, isoladamente ou em combinação. Então, de acordo com a presente invenção, é provido um kit para detecção de leveduras, que compreende um grupo de primers selecionados de seqüências de oligonucleotídeos substancialmente similares às seqüências de SEQ ID NOl ou SEQ ID N02 e uma combinação dos mesmos. O kit de acordo com a presente invenção pode compreender reagentes e aparatos, que são necessários para a implementação da reação de amplificação de ácido nucléico pelo método da presente invenção. Os reagentes do kit da presente invenção podem ser enzimas (Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase), solução tampão específicas para enzimas, oligonucleotídeos da presente invenção, desoxirribonucleotídeos trifosfatos, cofator cloreto de magnésio. Os aparatos do kit da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a tubo de reação feitos de polipropileno. A reação de amplificação pode ocorrer em aparelhos específicos tais como termocicladores.

Assim, o conjunto de primers e kit de acordo com a presente invenção pode ser usado no controle de qualidade de bebidas alcoólicas (por exemplo, vinho, cerveja, cerveja com baixo teor de malte, vinho de fruta) e / ou de refrigerantes (por exemplo, bebidas espumantes não alcoólicas tais como a soda de limão e água gaseificada), a análise de uma amostra do ambiente (por exemplo, a água das matérias-primas).

Dekkera anômala, Dekkera bruxellensis e Dekkera custersiana, podem ser encontradas como espécies de leveduras causadoras da deterioração no processo de produção de cerveja e cerveja com baixo teor de malte ou nos produtos finais dos mesmos. Por isso, os primers da presente invenção e combinação dos mesmos podem ser utilizados em métodos de detecção e quantificação. Este último por meio de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) usando qualquer um desses primers (SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2), e um kit compreendendo esses grupos de primers. A reação de amplificação de ácido nucléico pelo método da presente invenção pode ser realizada através de métodos de amplificação utilizando reagentes comerciais já existentes no estado da técnica (cloreto de magnésio, Taq DNA polimerase e dNTP nas concentrações adequadas — Invitrogen, Promega). A reação de amplificação de ácido nucléico pode ser realizada, por exemplo, através do DNA da amostra de mistura, uma solução de primer, e reagentes de amplificação (por exemplo, um kit de amplificação de DNA Loopamp fabricado pela Eiken Chemical Co. , Ltd.), em conformidade com as instruções incluídas com o kit, e em seguida, mantendo a mistura obtida em uma determinada temperatura (óO.degree. C. a 65.degree. C.), de modo a reagir por um determinado período de tempo (em geral, uma hora). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tomar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: bebidas) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 ciclos. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Este último, no entanto, tem como características o valor mais elevado e a toxicidade antes da polimerização. A reação de amplificação do ácido nucléico pelo método da presente invenção pode ser realizada através das seguintes etapas: (i) Em um primeiro momento é obtida uma amostra de DNA para que se ocorra a reação de amplificação; (ii) Em seguida a amostra é colocada em contato com uma reação de amplificação contendo 0,1 mM de cada dNTP (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), 1,5 U de uma enzima para polimerizar a cadeia de DNA (Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase), 0,8 pmol de cada oligonucleotídeo, 2,5 mM de cloreto de magnésio e uma solução tampão 1 x específica para atuação da enzima em questão; (iii) Na primeira etapa da reação (desnaturação) ocorre a separação das fitas do DNA de interesse através da elevação da temperatura entre 93 a 95°C, preferencialmente 94 °C de 4 a 6 min, preferencialmente 5 minutos; (iv) Na segunda etapa ocorrem de 25-30 ciclos de desnaturação a uma temperatura entre 93°C a 95°C, preferencialmente 94°C em um tempo de 20 segundos a 1 min, preferencialmente 30 segundos; (v) Posteriormente a temperatura é reduzida para 65 a 70°C, preferencialmente 68 °C; (vi) O oligonucleotídeo é então anelado à região 18S do DNAr e a síntese do DNA é extendida pela ação de uma enzima (preferencialmente Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase) a uma temperatura entre 70 a 74°C, preferencialmente 72 °C entre 20 segundos e 1 minutos, preferencialmente 30 segundos; (vii) Uma etapa posterior envolve uma extensão final de 72°C a 5 minutos. A amostra de DNA pode ser obtida por diferentes formas de extração: Processo de fervura; Processo congelamento-descongelamento e Processo de lise. A utilização direta de amostra de bebida vai depender do tipo de bebida. É possível que os especialistas na área realizem a reação de amplificação de ácido nucléico pelo método da presente invenção, fazendo pequenas modificações no processo acima descrito. Os oligonucleotídeos definidos de acordo com a presente invenção também podem ser usados em tal método modificado.

Se a amplificação de ácidos nucleicos é observada, isso significa que um gene-alvo está presente, indicando que a cepa como meta de detecção do conjunto de primers é positiva (+). Ao contrário, se amplificação de tais ácidos nucléicos não for observada, isso significa que um gene-alvo está ausente, indicando que a cepa como meta de detecção do conjunto de primers é negativa (-).

Exemplos de uma amostra utilizada como um alvo de detecção do conjunto de oligonucleotídeos e kit de acordo com a presente invenção incluem: bebidas alcoólicas, como vinho, cerveja, cerveja de baixo índice de malte, refrigerantes, como cidra, refrigerante de limão e água gaseificada, amostras ambientais, tais como a água coletada para uso como matéria-prima e produtos semi-acabados coletados a partir do processo de produção de bebidas alcoólicas, refrigerantes, etc.

Quando estes produtos são utilizados como amostras para o método da presente invenção, operações como a concentração, separação e cultura de células existentes na amostra, a separação de um ácido nucléico das células, e a concentração do ácido nucleico podem ser realizadas como pré-tratamentos. Métodos de concentração e separação de células existentes na amostra incluem filtragem e centrifugação, e esses métodos podem ser selecionados, conforme o caso. Além disso, as células concentradas e isoladas da amostra podem ser ainda mais cultivadas, de modo a aumentar o número de células. Para a cultura, ágar sólido ou um líquido, que é adequado para a proliferação da levedura alvo, pode ser usado. Além disso, a fim de selecionar a cepa de levedura alvo, um agente como cicloheximida pode ser adicionado. A fim de liberar um ácido nucleico de células existentes em uma amostra de bebida ou uma amostra ambiental ou de culturas de células, um método que utiliza um kit comercialmente disponível ou de um método de tratamento de células com uma solução alcalina e então aquecer as células a 100°C para liberar o ácido nucléico pode ser selecionado, por exemplo. Além disso, se for necessário purificar um ácido nucléico, o ácido nucléico pode ser purificado por um tratamento fenol/clorofórmio, precipitação de etanol, centrifugação, etc, e o ácido nucléico purificado pode ser finalmente re-dissolvido em tampão TE ou semelhantes, de modo que possa ser usado como modelo em testes de DNA (European Brewery Convention: Analytica-Microbiológica-EBC, 2.sup.nd ed 2005, Fachveríag Hans Carl, Nuemberg, Rolf et al:. diagnósticos clínicos e PCR-. pesquisa, Springer-Verlag, Berlin, 1992; Yasuji Oshima et al: Tanpaku Koso Kakusan (proteínas, ácidos nucléicos, enzimas), Vol. 35, 2523-2541, 1990). A detecção da levedura da espécie Dekkera bruxellensis e da levedura da espécie Brettanomyces brwcellensis usando o conjunto de primer e kit de acordo com a presente invenção pode ser feita da seguinte forma, por exemplo.

Primeiro, a levedura da espécie Dekkera bruxellensis e da levedura da espécie Brettanomyces bruxellensis que são consideradas de existir em uma amostra são cultivadas em um meio adequado. Em seguida, o DNA é separado de uma colônia formada em meio ágar, e o método da presente invenção usando os primers definidos de acordo com a presente invenção são aplicados para o DNA, de modo a amplificar as regiões do 18S DNAr da levedura da espécie Dekkera bruxellensis e da levedura da espécie Brettanomyces bruxellensis. O produto de amplificação do gene obtido indica a presença de uma cepa como um alvo do conjunto de primers.

EXEMPLOS

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

EXEMPLO 1 - EXTRAÇÃO DE DNA

Processo de Fervura Uma alíquota de 1000 mL de suspensão celular contendo 107 cels/mL de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxelensis foi transferida para microtubos e incubada a 90°C em um banho de água fervente por 5 min. A suspensão contendo DNA foi vigorosamente homogenizada através de vortex por 10 segundos e o tubo foi congelado no gelo. A amostra de DNA foi estocada a -18 °C.

Processo congelamento-desconuelamento Uma alíquota de 1000 mL de suspensão celular contendo 107 cels/mL of Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxelensis foi transferida para microtubos e incubadas a -18°C até a formação de gelo. As amostras foram permitidas descongelar a temperatura ambiente e homogeneizadas por vortex por 10 s.

Processo de Extração de DNA com tampão de lise celular padrão Uma alíquota de 1000 mL de suspensão celular contendo 107 cels/mL of Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxelensis foram cultivadas em meio Agar por 24 a 48 horas a 25 °C e transferidas para microtubos contendo 500 mL de tampão de lise (NaCl 0.15M (Vetec, BR), Tris-HCl 50 mM (Invitrogen Life Technologies, USA), EDTA 10 mM (Sigma-Aldrich CO., USA), SDS 2.0 % (w/v) (Labsynth, BR); pH 8,0). A mistura foi incubada por 1 hora a 60°C em um banho-maria. Um volume igual (500 mL) de tampão saturado com fenol (Sigma Chemical CO., USA) : clorofórmio (Reagen, BR) (1:1) foi adicionado à solução de DNA. A mistura foi vigorosamente misturada em vortex, e centrifugada para fase de separação em uma centrífuga Sorval (Sorval, USA) a 10,000 x g por 15 minutos. A camada superior aquosa (contendo o DNA) foi cuidadosamente transferida para um tubo limpo, evitando a adição da evitando da interface de fenol e volume igual de clorofórmio. A mistura foi vigorosamente misturada por vortex e centrifugada a 10,000 x g por 15 min. A extração de clorofórmio foi repetida. A camada superior aquosa foi transferida para uma centrífuga limpa e volume igual de isopropanol gelado (Chimie Test, BR) foi adicionado à amostra de DNA. A mistura foi vigorosamente misturada por vortex, o tubo foi permitido ficar em um banho de água fria por 30 minutos e então centrifugado a 10,000 x g por 20 min. Para recuperar o DNA precipitado, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. Os pellets foram lavados com etanol gelado a 70%, centrifugado a 10,000 x g por 15 min. O DNA resultante foi secado ao ar e dissolvido em 100 mL de TE (Tris-HCl 10 mM pH 7.6, EDTA 1 mM pH 8.0). A amostra foi estocada a -18 °C.

EXEMPLO 2 - DETECÇÃO DE LEVEDURAS UTILIZANDO OS OLIGOSNUCLEOTÍDEOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Um par de oligonucleotídeos universal para leveduras foi desenvolvido para uso em Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e identificados como SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2. Este par de oligonucleotídeos amplifica um segmento de 375 pb da região 18S do DNA ribossômico. A reação foi preparada para um volume final de 25pL contendo 1,50U de enzima Taq DNA polimerase, tampão da enzima lx, 2,5mM de cloreto de magnésio, 0,8pmol de cada oligonucleotídeo (SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2) e l,()pL de DNA extraído de diferentes espécies de leveduras. A condição de amplificação ideal é desnaturação a 94°C/5 minutos, seguida de 25-30 ciclos de desnaturação a 94°C/30 segundos, pareamento a 68°C/45 segundos e extensão a 72°C/30 segundos, e uma extensão final de 72°C/5 minutos. Após a amplificação, o produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0% a 80V, revelado com brometo de etídeo e fotografado utilizando transiluminador UV com câmera acoplada. O DNA utilizado como molde de amplificação teve diferentes origens de extração. A extração foi realizada tanto de leveduras crescidas em meio sólido como de vinhos previamente inoculados. A Eigura 1 mostra a amplificação de um específico de DNA de 375 bp da região 18S de Dekkera e Saccharomyces: M- 100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae — padrão com células lisadas com tampão de lise; 2- D. bruxellensis -padrão com células lisadas com tampão de lise; 3- Sacch. cerevisiae - células lisadas com fervura; 4- D. bruxellensis -células lisadas com fervura; 5 - Sacch. cerevisiae - células lisadas com o processo de congelamento\descongeIamento; 6- D. bruxellensis - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; A- 25 ciclos; B- 30 ciclos; C- 35 ciclos.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Claims (16)

1. Oligonucleotídeos para identificação de microorganismos caracterizados pelo fato dos oligonucleotídeos ou seus complementos hibridizarem especificamente com a região 18S DNAr de microorganismos.

2. Oligonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato dos microorganismos identificados serem leveduras.

3. Oligonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de serem selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NOS 1 e 2 e suas seqüências complementares.

4. Método para detecção de microorganismos em uma amostra caracterizado por compreender os passos: a. realizar a reação de amplificação de ácido nucléico contido em uma amostra através da utilização de oligonucleotídeos que hibridizam especificamente com a região 18S DNAr de microorganismos; e b. detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, onde a geração de um produto de amplificação indica a presença do microorganismo.

5. Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fato da amostra ser selecionada do grupo de bebidas alcoólicas, refrigerantes, amostras ambientais, dentre outros.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fato dos oligonucleotídeos serem selecionados do grupo de SEQ ID NOl e SEQ ID N02 e suas seqüências complementares.

7. Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fato da detecção da presença ou ausência do produto de amplificação se dar através de visualização em gel de agarose ou gel de acrilamida.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7 caracterizado pelo fato dos microorganismos identificados serem leveduras.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7 caracterizado pelo fato da reação da amplificação compreender as seguintes etapas: a. Obter uma amostra de DNA para que se ocorra a reação de amplificação; b. Colocar a amostra em contato com uma reação de amplificação contendo dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), uma enzima para polimerizar a cadeia de DNA e uma solução tampão específica para atuação da enzima em questão; c. Elevar a temperatura entre 93 a 95°C, preferencialmente 94 °C de 4 a 6 min, preferencialmente 5 minutos; d. Fazer de 25-30 ciclos de desnaturação a uma temperatura entre 93°C a 95°C, preferencialmente 94°C em um tempo de 20 segundos a 1 min, preferencialmente 30 segundos; e. Posteriormente a temperatura é reduzida para 65 a 70°C, preferencialmente 68 °C; f. O oligonucleotídeo é então anelado à região 18S do DNAr e a síntese do DNA é extendida pela ação de uma enzima (preferencialmente Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase) a uma temperatura entre 70 a 74°C, preferencialmente 72 °C entre 20 segundos e 1 minutos, preferencialmente 30 segundos; g. Uma etapa posterior envolve uma extensão final de 72°C a 5 minutos.

10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato da temperatura de anelamento dos oligonucleotídeos depender da quantidade de C e G encontrada no oligonucleotídeo.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato dos oligonucleotídeos serem selecionados do grupo de SEQ ID NOl e SEQ ID N02 e suas seqüências complementares.

12. Kit de identificação de microorganismos em uma amostra caracterizado por compreender aparato para realização da reação de amplificação e reagentes de amplificação compreendendo os oligonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1.

13. Kit de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelo fato dos reagentes serem enzimas, tampões, desoxirribonucleotídeos trifosfatos e oligonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1.

14. Uso dos oligonucleotídeos de acordo com reivindicação 1 caracterizado por ser na identificação de microorganismos em amostras.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato dos microorganismos identificados serem leveduras.

16. Uso de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato da amostra ser selecionada do grupo de bebidas alcoólicas, refrigerantes, amostras ambientais, dentre outros.