BRPI1107365A2 - bioprocesso para produção de extrato proteolítico fibrinolítico, extrato proteolítico fibrinolítico e composição fibrinolítica de cogumelo comestível - Google Patents

Abstract

bioprocesso para produção de extrato proteolítico fibrinolítico, extrato proteolítico fibrinolítico e composição fibrinolítica de cogumelo comestível. a presente invenção descreve o desenvolvimento e a caracterização de um produto novo e inventivo compreendendo propriedades fibrinolíticas, obtido a partir de cogumelo comestivel que compreende, entre outras, atividade nutracêutica, farmacêutica e/ou nutricional. mais especificamente, descreve o processo de produção de proteases fibrinolíticas do extrato bruto e um extrato proteolítico que degrada o coágulo de fibrina.

Description

Bioprocesso para Produção de Extrato Proteolítico Fibrinolítico, Extrato Proteolítico Fibrinolítico e Composição Fibrinolítica de Cogumelo Comestível Campo da Invenção A presente invenção descreve o desenvolvimento e a caracterização de um produto novo e inventivo compreendendo propriedades fibrinolíticas, obtido a partir de cogumelo comestível que compreende, entre outras, atividade nutracêutica, farmacêutica e/ou nutricional. Mais especificamente, descreve o processo de produção de proteases fibrinolíticas do extrato bruto e um extrato proteolítico que degrada o coágulo de fibrina. A presente invenção se situa no campo da nutrição, farmácia e bioquímica.

Antecedentes da invenção Espécies de cogumelos comestíveis são utilizados como alimento por etnias indígenas na Amazônia, como exemplo, Favolus brasiliensis, Lentinus sp. e Pleurotus sp. Entre esses, Favolus é um dos principais integrantes da dieta dos povos nativos, além de Lentinus e Pleurotus os quais são preparados em folhas de bananeira e na forma de sopa apimentada (quinhapira), preparações características da rotina gastronômica regional (Fidalgo, 1978).

Em geral, os cogumelos são ricos em proteínas (19 a 35 %), têm baixo valor calórico (30 cal/100 g de matéria seca), alto valor de aminoácidos essenciais (lisina, triptofano e leucina), vitaminas (Bi e C), polissacarídeos, minerais, fibra (4 a 20%) e carboidratos (51 a 88 %) (Chang; Buswell, 1997; Smith; Sullivan, 2004).

Embora sejam fontes nutricionais, raros são os estudos envolvendo os basidiomicetos como fonte de fármacos, por isso, ainda representam um dos maiores recursos inexplorados como novas fontes de biocompostos para a promoção da saúde do homem (Brizuela et al., 1998; Fortes; Novaes, 2006; Furlani; Godoy, 2005).

Dos diferentes grupos de fungos, os basidiomicetos estão se destacando como fonte de produtos naturais propriedades que os caracterizam como alimentos nutracêuticos ou funcionais fisiológicos. Entre os produtos naturais já descobertos que têm propriedades farmacológicas, compostas com atividade antitumoral, as enzimas, os anticarcinogênicos, antivirais, hipoglicemiantes, hipocolesterolêmicas e antimicrobianas são os mais citados.

Em função do potencial nutricional e medicinal já descrito na literatura, nas últimas décadas, o potencial biotecnológico dos cogumelos vem estimulando o interesse na investigação de biocatalisadores hidrolíticos extracelulares. Por exemplo, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporíum, Serpula lacrymans, Schizophyllum communee, Chondrostereum purpureum, Armillaria mellea e Grífola frondosa são fontes de proteases, destacando-se entre essas, as serinoproteases e metaloproteases (Healy et al.,1999; Sabotic et al., 2007).

Entre as enzimas hidrolíticas, as proteases apresentam uma grande variedade de aplicações industriais, principalmente no setor alimentício, farmacêutico, couro, detergente e, em processos ecológicos de biorremediação (Taniguchi et al., 2005; Rao et al., 1998). Além das diversas potencialidades das proteases a aplicação medicinal para tratamento de trombose está sendo evidenciada por meio das proteases fibrinolíticas.

As proteases fibrinolíticas têm atraído consideravelmente o interesse médico, durante as últimas décadas, pela possibilidade do emprego dessas enzimas na produção de novos agentes fibrinolíticos que possam ser usados clinicamente na intervenção de patologias cardiovasculares, a exemplo de trombose, infarto do miocárdio, dentre outras e, sobretudo atenderem às limitações apresentadas pelos medicamentos atualmente em uso (Lima et al., 2006).

Fisiologicamente, os coágulos no organismo humano são formados pela conversão do fibrinogênio em fibrina, via ação proteolítica da trombina e posteriormente, dissolvida pela plasmina quando esta é ativada pelo ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) (Collen; Lijnen, 2000).

No coração, a fibrina provoca obstrução do fluxo sanguíneo para o tecido muscular, o que pode resultar em um ataque do coração, ao passo que no cérebro a fibrina bloqueia sangue e oxigênio, de forma a não atingirem___________ determinadas áreas, o que pode resultar em infarto cerebral e demência (Sugimoto et al., 2007).

Clinicamente, os fármacos mais utilizados para a terapia trombolítica incluem o t-PA (células endoteliais), a Uroquinase (urina humana) e a estreptoquinase (Streptococcus hemolyticus) (Franco, 2001; Peng et al., 2005). Com base no mecanismo de ação, os agentes trombolíticos são classificados em dois tipos. No primeiro grupo estão incluídos os agentes que ativam o plasminogênio que uma vez convertido em plasmina degrada o coágulo de fibrina, a exemplo da uroquinase, estreptoquinase e ativador do plasminogênio tecidual (t-PA). No segundo grupo estão os agentes que degradam diretamente o coágulo de fibrina sem haver a necessidade de ativação do plasminogênio, como é o caso da lumbroquinase e fibrolase. (Peng et al., 2005).

Sugimoto et al. (2007) cita que os fármacos usados na terapia de tromboses, como uroquinase (serina protease) e streptoquinase são administrados por via intravenosa. Todavia, o uso de proteases por via oral já foi avaliado para aplicação dessas enzimas na terapia trombolítica, visto que proteases administradas por via oral são absorvidas do trato intestinal para o plasma.

Apesar da existência de enzimas fibrinolíticas para terapia trombolítica, estas ainda são de elevado custo e expressam propriedade termolábil. Além disso, esses biofármacos têm expressado efeitos colaterais, entre os quais se destacam os processos hemorrágicos.

Considerando os efeitos colaterais e as características das proteases fibrinolíticas disponíveis comercial mente, várias pesquisas estão direcionadas para a busca de novos agentes trombolíticos de origem natural, como vegetais e microrganismos e também dos macrofungos (Tabela 1). Entre os microrganismos têm se destacado Streptomyces megasporus, Bacillus subtilis e Aspergillus ochraceus, além de espécies de basidiomicetos, como Pleurotus ostreatus, Armillaria mellea e Flamullina velutipes (Chite; Dey, 2000; Jeong et al., 2001; Lee et al., 2005; Peng et al., 2005).

Tabela 1. Fontes de proteases fibrinolíticas e classificação das proteases Em uma concretização, a presente invenção provém de uma espécie de cogumelo comestível denominado Lentinus citrinus, do acervo da Coleção de Culturas DPUA, com registro sob número DPUA 1535. As fontes de proteases fibrinolíticas desse cogumelo foi o extrato bruto obtido por fermentação submersa e os basidiomas produzidos por fermentação semi-sólida em cultivos axênicos utilizando resíduo agroflorestal da Amazônia. A atividade in vitro de proteases fibrinolíticas foi determinada no extrato bruto recuperado do meio líquido fermentado e da suspensão celular dos basidiomas de L. citrinus. De cada cultivo submerso foram retiradas amostras ao término de 3, 5, 10 e 15 dias de fermentação para recuperação do extrato bruto, para os quais foi determinada a atividade fibrinolítica no meio sólido no coágulo de fibrina. Para se determinar a atividade enzimática a partir dos basidiomas, estas estruturas foram desidratados a 40 °C e submetidos a trituração. Deste produto triturado foram retirados 5g para extração das enzimas em 50 mL de água destilada esterilizada ou solução tampão Tris-HCI 0,2M, pH 7,2. A suspensão celular foi mantida a 150 rpm, a 25 °C. Após 24 h o material sólido foi removido por filtração em tecido de algodão e o extrato bruto recuperado por centrifugação, a 4°C, 8000xg por 10 minutos, seguido de filtração em membrana Milipore (0,22 pm). A fibrinólise in vitro no coágulo de fibrina foi determinada em meio sólido após período de incubação a 37 °C por 24 horas. A busca na literatura patentaria apontou alguns documentos relevantes, os quais serão descritos a seguir. O documento US 2010/0279353 descreve um processo de produção de enzima fibrinolítica a partir de cogumelos. No dito processo, uma enzima fibrinolítica isolada de certa cultura de cogumelos tem característica de degradar uma fibrina ou um fibrinogênio sem ativar a atividade de um plasminogênio. O plasminogênio é ativado para gerar uma plasmina para degradar a fibrina e / ou fibrinogênio, de modo que a enzima fibrinolítica seja usada para tratamento de doenças relacionadas com a trombose degradando a fibrina e fibrinogênio de coágulos sanguíneos sem ativar o plasminogênio, evitando assim uma hemorragia devido à ativação do plasminogênio para gerar mais plasmina. A presente invenção difere deste documento por utilizar método de obtenção de proteases fibrinolíticas diferente e por extrair um extrato fibrinolítico de um cogumelo que não havia sido usado para tais fins anteriormente, sendo que as fontes de proteases fibrinolíticas desse cogumelo________________ foram o extrato bruto obtido por fermentação submersa e os basidiomas produzidos por fermentação semi-sólida em cultivos axênicos utilizando resíduo agroflorestal da Amazônia. O documento US 7,618,638 descreve um medicamento que contém um extrato do cogumelo Ganoderma atrum. Tal extrato, possui metaloproteinases com propriedades fibrinolíticas e é eficaz para a prevenção, supressão e alívio sintomático de doenças como a metástase de câncer, ulceração, artrite reumatóide, osteoporose, periodontite, e envelhecimento da pele. Para obtenção do extrato, utiliza-se um solvente, o qual é selecionado do grupo consistindo de água, um alcoól de cadeia pequena, um álcool líquido poliídrico, ou misturas dos mesmos, e em que a composição farmacêutica ou cosmética é fornecida em uma forma selecionada do grupo que consiste de um pó, um tablet, um comprimido, um supositório, uma emulsão, uma cápsula, um grânulo, uma loção, um creme, um gel, um aerossol, um batom, uma pomada, um cataplasma e uma bandagem adesiva. A presente invenção difere deste documento no que tange ao método de extração da substância fibrinolítica, bem como na espécie de cogumelo empregada, sendo que neste documento adotou-se cogumelos Ganoderma atrum e na presente invenção, cogumelos da espécie Lentinus citrinus. O documento US 6,638,503 descreve um processo para isolamento do microorganismo Streptomyces megasporus, um método de extração de uma enzima fibrinolítica presente no dito microorganismo compreendendo cultivar o Streptomyces megasporus ou seus mutantes sob condições aeróbicas e temperatura na faixa de 45 °C a 65 °C, em meio aquoso alcalino com nutrientes e posterior recuperação da enzima por filtração em gel , cromatografia de troca iônica e focalização isoelétrica na presença de um tampão com um pH na faixa de 3-10. O documento ainda relata um método para o tratamento de distúrbios trombolíticos compreendendo a administração de uma dosagem adequada da tal enzima. A presente invenção difere deste documento por empregar um método diferente para extração da enzima fibrinolítica, bem como por utilizar um organismo diferente como fonte para extração de enzimas. O documento US 3,713,981 relata uma enzima protease com propriedades fibrinogenolíticas, fibrinolíticas e anticoagulantes, a qual é extraída de um fungo denominado Armillaria mellea e também seu método de__________ extração. O método compreende resumidamente homogeneização de corpos de frutificação maduros de Armillaria mellea com a água no liquidificador sob 2°C a 4°C, separando a mistura resultante por filtração ou centrifugação, de modo a obter uma fase sólida e uma fase aquosa, precipitando proteínas indesejadas contaminantes da dita fase aquosa pela inserção de pelo menos um solvente orgânico, precipitando a protease bruta, adicionando à dita solução, que compreende a protease, um solvente orgânico. Purificação parcial da protease bruta por cromatografia em um material de cromatografia de troca catiônica contendo radicais carboximetil anexados a uma matriz de polissacarídeos e, por último, purificar a protease impura dissolvendo-a em um pequeno volume de uma solução tampão de pH 6-8 a cerca de 2°C, e aplicando-se a solução resultante em cerca de 2°C a uma coluna ou membrana de um polímero reticulado hidrofílico com característica de peneira molecular em relação a um peso molecular de cerca de 30.000. A presente invenção difere deste documento por utilizar o fungo Lentinus citrinus como fonte para extração de enzimas, diferentemente do empregado na invenção relaciondada a este documento, bem como por apresentar um extrato final com características diferentes. O documento US 2009/0155239A1 reivindica uma nova protease com propriedade fibrinolítica, útil para a fabricação de agentes trombolíticos para o tratamento ou prevenção de trombose, e nos gêneros alimentícios e farmacêuticos. Reivindica também o microorganismo adotado para extração, do gênero Fusarium e o processo de produção de alimentos fermentados obtidos através da inocuiação da protease produzida a partir do microorganismo em um alimento e fermentação do alimento. A presente invenção difere deste documento por utilizar o fungo Lentinus citrínus como fonte para extração de enzimas, diferentemente do empregado na invenção relaciondada a este documento.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção _________________________ Dessa forma, a presente invenção apresenta uma fonte nova e inventiva de produtos e/ou composições proteolíticas. O fato de se utilizar uma fonte comestível e não-tóxica (cogumelo comestível) como fonte de produtos proteolíticos é um diferencial que leva também aos produtos obtidos as características dos cogumelos comestíveis, tornando-os seguros para consumo humano. É um objeto da presente invenção, o bioprocesso de obtenção do extrato fibrinolítico compreendendo extração aquosa a partir de cogumelos comestíveis.

Em uma realização preferenciai, o bioprocesso da presente invenção compreende as etapas de: a) meios para a produção em condições axênicas de cogumelos comestíveis; b) extração dos basidiomas do cogumelo; c) processamento dos basidiomas para extração das proteases; d) recuperação do extrato proteolítico bruto.

Em uma realização preferencial, o meio empregado para cultivo do cogumelo é um resíduo agroflorestal amazônico compreendendo casca de cucpuaçu. É um objeto adicional da presente invenção um outro bioprocesso de obtenção de extrato fibrinolítico compreendendo fermentação submersa a partir de cogumelos comestíveis.

Em uma realização preferencial, o bioprocesso da presente invenção compreende as etapas de: a) obtenção de culturas viáveis e puras de cogumelos comestíveis; b) preparação do inóculo; c) fermentação submersa de b); d) meios para ocorrência da fermentação; e) meios de separação da biomassa resultante. É também um objeto da presente invenção um extrato fibrinolítico obtido a partir de cogumelos comestíveis.

Em uma realização preferencial, o extrato será obtido de acordo com qualquer um dos bioprocessos descritos acima. ___________________________ É um objeto adicional da presente invenção uma composição fibrinolítica obtida a partir do cogumelo comestível compreendendo: a) extrato fibrinolítico obtido a partir de cogumelos comestíveis; b) veículo aceitável.

Em uma realização preferencial, o veículo aceitável será escolhido de acordo com a função que se deseja obter da composição, mais preferencialmente, o veículo será um veículo nutricionalmente aceitável, farmaceuticamente aceitável e/ou nutraceuticamente aceitável.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 representa o fluxograma do bioprocesso, o qual divide-se em produção da protease por fermentação submersa e obtenção da proteação, via extração aquosa, a partir do basidioma desidratado, onde: (A) Lentinus citrinus DPUA 1535; (B) fermentação submersa; (C) meio líquido com fonte de carbono ( Glicose, Amido ou Frutose) fonte de nitrogênio (peptona); (D) recuperação do extrato bruto; (E) atividade proteolítica fibrinolítica; (F) degradação do coágulo de fibrina (meio sólido); (G) Halo (mm); (H) fermentação semi-sólida; (I) basidiomas desidratados (40 °C); (J) extração de proteases (água ou tampão); (K) recuperação do extrato bruto (filtração e centrifugação); (L) atividade de proteases (U/mL); (M) extrato bruto (maior atividade proteolítica); (N) caracterização das enzimas; (O) degradação do coágulo de fibrina (meio sólido). A figura 2 é uma imagem de (A) produto desidratado fibrinolítico (Basidioma desidratado, em pó). A figura 3 mostra a atividade fibrinolítica do extrato bruto dos basidiomas de L. citrinus, em meio sólido, onde: (A) área de fibrinólise; (B) padrão. A figura 4 ilustra o efeito do pH na atividade proteolítica dos basidiomas do cogumelo. A figura 5 ilustra o efeito da temperatura na atividade proteolítica dos basidiomas do cogumelo. A figura 6 ilustra o efeito do pH na estabilidade das proteases dos____________________ basidiomas do cogumelo. A figura 7 ilustra o efeito da temperatura na estabilidade das proteases dos basidiomas do cogumelo.

Descrição detalhada Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.

Bioprocesso de obtenção do extrato fibrinolítico via extração aquosa É um objeto da presente invenção, o bioprocesso de obtenção do extrato fibrinolítico compreendendo extração aquosa a partir de cogumelos comestíveis.

Em uma realização preferencial, o bioprocesso da presente invenção compreende as etapas de: a) meios para cultivo em condições axênícas de cogumelos comestíveis; b) extração dos basidiomas do cogumelo; c) processamento dos basidiomas para extração das proteases; d) recuperação do extrato proteolítico bruto.

Meios para cultivo do cogumelo Lentinus citrínus Os meios para produção de L citrínus na presente invenção compreendem, mas não se limitam a, substratos de resíduos agroindustriais, tais como palha e cavaco de madeira, substratos de resíduos agroflorestais, tais como troncos e cascas de madeira, organismos vivos (micorrízicos) ou demais meios para cultivo de cogumelos, desde que o dito substrato esteja em condições axênicas. Em especial, na presente invenção o substrato em condições axênicas empregado foi um resíduo agroflorestal amazônico [casca de cupuaçu e farelo de arroz (CC+FA) e casca de cupuaçu e liteira (CC+LI)].

Extração dos basidiomas do cogumelo A extração dos basidiomas do corpo do cogumelo pode ocorrer em qualquer fase a partir de sua formação. Em especial, na presente invenção, os basidiomas são extraídos quando estes atingem a maturidade, garantindo assim, maior concentração de proteases fibrinolíticas no extrato final.

Processamento dos basidiomas ___________________________ O processamento dos basidiomas na presente invenção compreende a homogeneização de basidiomas triturados (biomassa) utilizando um solvente adequado para tal e agitação para formação de uma suspensão, a qual deve ser centrifugada para remoção de materiais insolúveis. Em especial, na presente invenção, o processamento dos basidiomas para a extração das proteases acontece desidratando os basidiomas maduros de L. citrínus a 40 °C, triturando as amostras, homogeneizando a biomassa resultante com água destilada ou Tampão Tris-HCI 0,2 M, pH 7,2, em frascos Erlenmeyers. Em seguida, agitando-se as amostras a 150 rpm, 25 °C por 24 horas, seguindo-se a filtração em tecido de algodão. A suspensão é então centrifugada a 8.000*g por 15 min para remoção de materiais insolúveis.

Recuperação do extrato proteolítico bruto A recuperação do extrato proteolítico bruto na presente invenção compreende, mas não se limita a, empregar uma peneira ou um filtro, seja este de papel, porcelana, algodão, micropore, ou demais aparatos que permitam a separação das fases da suspensão. Em especial, na presente invenção, o extrato bruto é recuperado extraindo-se o sobrenadante da filtraçao em membrana Milipore(0,22 pm).

Bioprocesso de produção do extrato fibrinolítico por fermentação submersa É um objeto adicional da presente invenção um outro bioprocesso de obtenção de extrato fibrinolítico compreendendo fermentação submersa a partir de cogumelos comestíveis.

Em uma realização preferencial, o bioprocesso da presente invenção compreende as etapas de: a) obtenção de culturas viáveis e puras de cogumelos comestíveis: b) preparação do inóculo; c) fermentação submersa de b); d) meios para ocorrência da fermentação: e) meios de separação da biomassa resultante.

Obtenção de culturas viáveis e puras de L, Citrínus A obtenção de culturas viáveis e puras do cogumelo na presente___________________ invenção compreende, mas não se limita a, cultivá-lo em qualquer meio com condições axênicas, ou seja, um meio não contaminado ou livre de qualquer organismo vivo. Em especial, na presente invenção, obtiveram-se culturas viáveis e puras de L. citrinus da Coleção de Culturas DPUA/UFAM (Departamento de Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas) preservadas em óleo mineral, as quais foram reativadas em ágar batata dextrose (BDA) adicionado de extrato de levedura 0,5% (p/v), em tubos inclinados (25mm x 150mm) e mantidos a 25° C por oito dias, na ausência de luminosidade.

Preparação do inóculo A preparação do inóluco na presente invenção compreende, mas não se limita a, misturar em um recipiente, o cogumelo, ou partes preferenciais do mesmo, com uma substância reativadora. Em especial, na presente invenção, dos subcultivos de L. citrinus, a cultura denominada de inóculo foi preparada transferindo-se fragmentos de micélio (0 = 8mm) para a superfície de ágar BDA, em placas de Petri (0=90 x 15 mm), mantendo-se os cultivos nas mesmas condições de reativação.

Fermentação submersa A fermentação submersa na presente invenção, é preparada uinindo-se em um frasco para reação, o cogumelo, ou partes preferenciais do mesmo, com um meio de fermentação. Em especial, na presente invenção, a fermentação submersa foi preparada retirando fragmentos de micélio de L. citrinus, medindo 8 mm de diâmetro, para frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 30 mL de meio de fermentação.

Meios para ocorrência da fermentação Os meios para ocorrência da fermetação na presente invenção, compreendem, mas não se limitam a, qualquer composição que permita a ocorrência da fermentação dos micélios do cogumelo. Em especial, na presente invenção, o meio para ocorrência da fermentação é um meio líquido, o qual é formulado com KH2PO4 (0,5 g/L); MgS04.7H20 (0,5 g/L); glicose (20,0 g/L) e peptona (10,0 g/L).

Meios de separação da biomassa resultante Os meios para separação da biomassa resultante na presente invenção compreendem, mas não se limitam a, filtração à vácuo, filtração empregando_______ filtro de porcelana, de papel ou de algodão, peneira ou demais formas de separação de fases de suspensões. Em especial, na presente invenção, a biomassa oriunda do cultivo submerso é separada por filtração à vácuo e o extrato bruto é filtrado em membrana Millipore (0,22 pm).

Composição fibrinolítica de cogumelo comestível É um objeto adicionai da presente invenção uma composição fibrinolítica obtida a partir do cogumelo comestível compreendendo: a) extrato fibrinolítico obtido a partir de cogumelos comestíveis; b) veículo aceitável.

Extrato fibrinolítico obtido a partir de cogumelos comestíveis A invenção provê um extrato fibrinolítico extraído de cogumelo comestível, preferencialmente L. citrinus, a partir do qual obtem-se uma composição. Esta composição pode ser, preferencialmente, um alimento, um fármaco ou um alimento com propriedades farmacológicas, alterando apenas o veículo a ser incorporado ao extrato.

Veículo Aceitável Em uma realização preferencial, o veículo aceitável será escolhido de acordo com a função que se deseja obter da composição, mais preferencialmente, o veículo será um veículo nutricionalmente aceitável, farmaceuticamente aceitável e/ou nutraceuticamente aceitável.

Exemplo 1. Realização preferencial Esta invenção relata o desenvolvimento e a caracterização de um produto fibrinolítico de cogumelo comestível, o processo de produção de proteases fibrinolíticas do extrato bruto de uma espécie de cogumelo comestível denominado de Lentinus citrinus, do acervo da Coleção de Culturas DPUA, com registro sob número DPUA 1535. As fontes de proteases fibrinolíticas desse cogumelo foi o extrato bruto obtido por fermentação submersa e os basidiomas produzidos por fermentação semi-sólida em cultivos axênicos utilizando resíduo agroflorestal da Amazônia. A atividade in vitro de proteases fibrinolíticas foi determinada no extrato bruto recuperado do meio líquido fermentado e da suspensão celular dos basidiomas de L citrinus. De cada cultivo submerso foram retiradas amostras ao término de 3, 5, 10 e 15__________________ dias de fermentação para recuperação do extrato bruto, nos quais foi determinada a atividade fibrinolítica no meio sólido no coágulo de fibrina. Para se determinar a atividade enzimática a partir dos basidiomas, estas estruturas foram desidratados a 40 °C e submetidos a trituração. Deste produto triturado foram retirados 5g para extração das enzimas em 50 ml_ de água destilada esterilizada ou solução tampão Tris-HCI 0,2M, pH 7,2. A suspensão celular foi mantida a 150 rpm, a 25 °C. Após 24 h o material sólido foi removido por filtração em tecido de algodão e o extrato bruto recuperado por centrifugação, a 4°C, 8000xg por 10 minutos, seguido de filtração em membrana Milipore (0,22 pm). A fibrinólise in vitro no coágulo de fibrina foi determinada em meio sólido após período de incubação a 37 °C por 24 horas.

Obtenção através de fermentação semi-sólida de basidiomas Origem dos basidiomas de L. cltrínus Os basidiomas in natura de L, citrinus foram adquiridos na Universidade Federal do Amazonas-UFAM, Manaus-Amazonas, de uma produção em condições axênicas, na qual foi utilizado como substrato resíduo agroflorestal amazônico [casca de cupuaçu e farelo de arroz (CC+FA) e casca de cupuaçu e liteira (CC+LI)]. Ao término do período de cultivo quando os basidiomas atingiram a maturidade, estes foram colhidos para processamento e investigação das enzimas proteolíticas fibrinolíticas.

Extração aquosa das proteases dos basidiomas Para as análises enzimáticas, os basidiomas inteiros e maduros, após colheita foram desidratados a 40 °C (Simas-Teixeíra, 2007). Para obtenção do extrato bruto e determinação da atividade proteolítica e fibrinolítica, depois do processo de trituração, de cada amostra, de acordo como o substrato de cultivo, cinco gramas de biomassa foram homogeneizadas em 50 mL água destilada ou 50 mL de Tampão Tris-HCI 0,2 M, pH 7,2, em frascos Erlenmeyers de 125 mL. As amostras foram agitadas a 150 rpm, 25 °C por 24 horas, seguindo-se a filtração em tecido de algodão. A suspensão foi então centrifugada a 8.000xgr por 15 min para remoção de materiais insolúveis, seguida pela filtração em membrana Milipore (0,22 pm). O sobrenadante foi utilizado como extrato bruto nos experimentos posteriores.

Determinação quantitativa da atividade de proteases_______________________ No extrato bruto obtido no item anterior foi determinada a atividade proteolítica de acordo com a metodologia descrita por Leighton et al. (1973). A mistura reacional contendo 0,15 mL de extrato enzimático e 0,25 mL de substrato (azocaseína a 1% (p/v) em tampão Tris-HCI 0,2 M, pH 7,2) foi incubada por 60 minutos. A reação foi interrompida pela adição de ácido tricloroacético (10%, (p/v)) e centrifugada (8000 rpm) por 15 minutos, a 4 °C. Do sobrenadante foi retirada uma alíquota e a absorbância lida a 440 nm. Uma unidade de atividade proteolítica foi definida como a quantidade de enzima capaz de produzir um aumento na absorbância de 0,01 em uma hora. Caracterização parcial das proteases Para a caracterização parcial das proteases foi utilizado o extrato bruto dos basidiomas que expressaram a maior atividade proteolítica nos testes da atividade proteolítica.

Determinação do efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica O efeito do pH na atividade proteolítica utilizando azocaseína a 1% (p/v) foi determinado incubando-se o extrato enzimático em diferentes faixas de pH (5,0-10,0) a 25 °C por 60 minutos. Os tampões utilizados foram Citrato-Fosfato 0,2 M (pH 5,0-6,0), Tris-HCI 0,2M (pH 7,0-8,0) e Glicina-NaOH (pH 9,0-10,0). O efeito da temperatura foi determinado a 25 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C e 70 °C, em 60 minutos, pH 7,2 e a atividade das proteases foi determinada conforme descrito nos teste quantitativos.

Determinação do efeito do pH e da temperatura na estabilidade das proteases O efeito do pH na estabilidade das proteases foi estudada incubando-se o extrato enzimático por 120 minutos à 25 °C em diferentes tampões: Citrato-Fosfato 0,2 M (pH 5,0-6,0), Tris-HCI 0,2M (7,0-8,0), Glicina-NaOH (9,0-10,0). A cada 30 minutos as amostras foram retiradas e submetidas à determinação da atividade de proteases. O efeito da temperatura na estabilidade de proteases foi avaliado incubando-se o extrato enzimático em diferentes temperaturas (25, 30, 40, 50, 60 e 70 °C), em pH 7, 2. Durante 120 minutos à 25 °C, a cada 30 minutos de incubação as amostras foram submetidas à determinação da atividade proteolítica.

Determinação do efeito de íons metálicos e inibidores na atividade proteolítica __________ Para verificar o efeito de íons metálicos na atividade proteolítica o extrato enzimático foi incubado na presença de Sulfato ferroso (FeS04), Sulfato de cobre (CUSO4) .Sulfato de magnésio (MgSC>4), Sulfato de zinco (ZnS04), Sulfato de manganês (MnS04), Cloreto de sódio (NaCI), Cloreto de potássio (KCI) e Cloreto de cálcio (CaCh), nas concentrações de 1 e 10 mM (Cui et al., 2008). O efeito de inibidores na atividade proteolítica foi determinado incubando-se o extrato enzimático com os seguintes inibidores de protease: EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil), pepstatina e ácido iodoacético, durante 1 hora, a 25°C. A atividade proteolítica foi determinada conforme descrito previamente.

Determinação da atividade fibrinolítica pelo método da placa de fibrina A atividade fibrinolítica foi determinada segundo metodologia citada por Lee et al. (2006). Em uma placa de Petri (0 = 60 x 15) adicionou-se 2,5 mL da solução de fibrinogênio bovino a 1 % (p/v) (Sigma Aldrich), 7,4 mL de solução de agarose 1 % (p/v) e 0,1 mL de solução de trombina de plasma bovino 100 NIH U/mL (Sigma Aldrich), em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Após homogeneização as placas foram mantidas por 30 minutos em temperatura ambiente. Foram feitos pocinhos (cup plates) no meio sólido, seguindo-se da adição de 60 pL do extrato enzimático bruto de L. citrínus e como padrão negativo utilizou-se tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. As placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas e a atividade fibrinolítica foi avaliada medindo-se o diâmetro do halo (mm).

Obtenção através de fermentação submersa A produção e a recuperação das enzimas foram realizadas executando-se as etapas descritas a seguir.

Subcultivo de L. citrínus: Para obtenção de culturas viáveis e puras, L. citrínus, da Coleção de Culturas DPUA/UFAM (Universidade Federal do Amazonas) preservado em óleo mineral foi reativado em ágar batata dextrose (BDA) adicionado de extrato de levedura 0,5% (p/v), em tubos inclinados (25mm x 150mm) e mantidos a 25° C por oito dias, na ausência de luminosidade (Castillo et al., 2007).

Inóculo: Dos subcultivos de L. citrínus, a cultura denominada de inóculo foi preparada transferindo-se fragmentos de micélio (0 = 8mm) para a superfície________ de ágar BDA, em placas de Petri (0=90 x 15 mm), mantendo-se os cultivos nas mesmas condições de reativação.

Fermentação Submersa Do cultivo inóculo foram retirados fragmentos de micélio de L. citrinus, medindo 8 mm de diâmetro, para frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 30 mL de meio de fermentação.

Meio de fermentação O meio líquido foi formulado com KH2PO4 (0,5 g/L); MgS04.7H20 (0,5 g/L); glicose (20,0 g/L) e peptona (10,0 g/L). Para se verificar a influência de fontes de carbono na produção de proteases, nesta etapa experimental foram analisadas as fontes de carbono: frutose (20,0 g/L) e amido solúvel (20,0 g/L), substituindo a glicose do meio original. O pH do meio foi aferido para 6,5, pela adição de NaOH 1M ou HCI 1M e os meios de cultivo esterilizados a 121 °C, 1 atm por 15 minutos (Gbolagade, 2006). A fermentação submersa foi conduzida em agitador orbital (Certomat MO) durante 15 dias, 150 rpm a 25 °C. Amostras de 3, 5, 10 e 15 dias foram retiradas para determinação da biomassa e atividade de proteases fibrinolíticas. A biomassa oriunda do cultivo submerso foi separada por filtração à vácuo e o extrato bruto foi filtrado em membrana Milipore (0,22 pm).

Atividade das proteases dos basidiomas de L. citrinus A atividade proteolítica nas quatro amostras do extrato bruto extraído do produto teve diferença significativa quando foi utilizado água ou tampão Tris-HCI 0,2M, pH7,2, na extração das enzimas dos basidiomas desidratados de L. citrinus (Tabela 2). Dos extratos originários dos basidiomas produzidos em CC+LI, usando água ou Tampão Tris-HCI 0,2 M, pH 7,2, as maiores atividades foram 463,55±6,4 U/mL e 435,55±6,4 U/mL, respectivamente.

Dos basidiomas produzidos em CC+FA, sob tratamentos semelhantes, a redução na atividade proteolítica foi 47,74% e 21,14% nos extratos obtidos com água e tampão, respectivamente, em relação a máxima atividade. Esses resultados mostram que o quantitativo das enzimas estava relacionado aos basidiomas e não a tecnologia do processo de extração.

De acordo com Sabotic et al., (2007), nos basidiomas de cogumelos a atividade proteolítica pode variar com a idade, estágio de desenvolvimento,_______ ambiente de crescimento e período de senescência, entre outros fatores.

Tabela 2. Atividade proteolítica nos extratos brutos dos basidiomas desidratados de L. citrinus.

Letras iguais=diferença estatisticamente não significativa;

Letras diferentes= diferença estatisticamente significativa Caracterização das proteases Nas Figuras 4 e 5 estão demonstrados os efeitos do pH e da temperatura na atividade das proteases de L. citrinus. A atividade ótima foi observada em pH 7,0 e 9,0, observado-se ainda 95% da atividde relativa em pH 10,0. A redução da atividade foi de 27% em pH 6,0 e cerca de 40% em pH 5,0 e 8,0 (Figura 5).

Essas enzimas com atividade máxima em condição neutra e alcalina têm potencial utilização como aditivo de detergentes, no processamento de couro, recuperação de prata, fins medicinais, processamento de alimentos, produção de rações e indústrias químicas, bem como para tratamento de resíduos (Al-Shehri; Mostafa., 2004; Gupta et al., 2004; Haddar et al., 2009).

Em geral enzimas proteolíticas do extrato dos basidiomas de outros cogumelos, a exemplo de Fiammulina velutipes e de Lentinus edodes expressaram ótima atividade em pH 8,0 e 7,0-7,5, respectivamente (Shin; Choi, 1998). Nos basidiomas de Pleurotus eryngii, a máxima atividade proteolítica foi verificada em pH 4,0 e pH 12,0 (Wang; Ng 2001), enquanto de G. frondosa, em pH 3,0 e 7,0 (Nishiwaki et al., 2009).

Na determinação do efeito da temperatura (Figura 5), as proteases expressaram atividade em todas as temperaturas testadas (25 °C a 70 °C), com atividade ótima a 50 °C, nas demais temperaturas, entre 25 a 40 °C, a atividade relativa variou de 71% a 82% enquanto a 60 °C e 70 °C, os valores foram reduzidos a 54% e 52% , respectivamente. Em relatos anteriores, os_________________ dados demonstraram na mesma faixa de temperatura, a atividade ótima das proteases de Grifola frondosa e Pleurotus citrinopileatus (Nishiwaki et al., 2009;

Cui et al., 2007).

Em termos de estabilidade ao pH (Figura 6) no extrato bruto as enzimas foram estáveis em pH 6,0, 7,0, 9,0 e 10,0 até 90 minutos de incubação, com retenção da atividade 100%, 129%, 147% e 61%, respectivamente. A maior atividade proteolítica foi observada em pH 7,0 e 9,0, semelhante aos resultados observados na curva do pH ótimo dessas enzimas. Esta estabilidade ao pH das proteases dos basidiomas de L. citrinus, de forma geral estão na faixa descrita na literatura. Nos estudos realizados por McHenry et al. (1998), a atividade de proteases de Chondrostereum purpureum, um basidiomiceto patógeno vegetal, a estabilidade se manteve na faixa de pH 4,0 a 8,5, como os obtidos por Nishiwaki et al. (2009) para proteases de Grífola frondosa.

Nos testes de estabilidade a temperatura (Figura 7), as enzimas foram ativas em todas as temperaturas testadas (25 °C a 60 X). Nesta faixa de temperatura, as proteases demonstraram a maior estabilidade a 30 °C, com atividade residual superior a 100% até 60 minutos, atingindo 99% aos 120 minutos. A 25 °C e a 40 °C , as enzimas também mostraram estabilidade, com atividade residual inferior de 90% e 80%, nos primeiros 60 minutos, respectivamente, mantendo a atividade na faixa de 90% até 120 minutos de incubação, nas duas temperatura de incubação. Nas demais temperaturas ( 50 X e 60 X), a atividade das enzimas foi drasticamente reduzida, com retenção de 15 a 22% de atividade residual entre 30 a 90 minutos. O efeito de íons e inibidores na atividade das proteases dos basidiomas de L. citrinus O efeito de íons e inibidores na atividade proteolítica estão demonstrados na tabela 3. A atividade das enzimas foi fortemente inibida na presença de Cu2+, Zn2+, Fe2+ nas concentrações de 10 mM, com os demais, a inibição foi moderada, exceto com Mg2+ e K+. Já com esses mesmos íons a 1mM, a ativação das enzimas foi predominante. Com PMSF, as enzimas tiveram inibição branda, todavia EDTA e Pepstatina expressaram forte inibição na atividade proteolítica. EDTA remove certos íons da molécula que são essenciais na atividade da enzima, promovendo a inativação das mesmas (Lee et al., 2006) Estes resultados estão sugerindo que as enzimas proteolíticas de L. citrinus são metaloproteases e aspártica proteases. Metaloprotease com atividade fibrinolítica já foi caracterizada em Fomitella fraxinea (Lee et al., 2006), Flamulina velutipes (Shin; Choi, 1998) e de Armillariella mellea, uma candidata para terapia trombolítica por via oral (Kim; Kim, 1999).

Tabela 3. O efeito de íons e inibidores da atividade de proteases dos basidiomas de L. citrínus.

Atividade relativa íons/ Inibidores de (%) proteases 1mM 10mM

Fez+ 84,80 48,26 Cu2+ 77,97 22,02 Mg2+ 83,36 83,36 Zn2+ 80,09 41,92 Mn2+ 84,70 73,36 Na+ 82,49 79,32 K+ 77,78 77,68 Ca2+ 77,20 73,94 PMSF 45,00 41,53 EDTA 27,50 16,73 Aclodoac 83,17 67,88 Pepstatina 16,79 ND* • ND- Não determinado Atividade fibrinolítica do extrato bruto dos basidiomas de L. citrínus O resultado da atividade fibrinolítica do extrato bruto dos basidiomas desidratados de L. citrínus, na degradação do coágulo in vitro de fibrina, nesta pesquisa está sendo um dado pioneiro. A figura 7 está mostrando o diâmetro do halo fibrinolítico, hialino, em média, igual a 20 mm. Cogumelos comestíveis constituem importantes fontes de agentes fibrinolíticos, a exemplo de Flammulina velutipes, Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa, Trícholoma saponaceum, Armillaria mellea e Cordyceps militaris, conforme citado por Kim et al (2006). ______________________ Proteases fibrinolíticas no extrato bruto da fermentação submersa As enzimas fibrinolíticas de L. citrínus realizaram a lise do coágulo in vitro de fibrina e, portanto podem ser consideradas uma alternativa como agente trombolítico. A tabela 3 está demonstrando que essas proteases foram evidenciadas em todos os extratos obtidos da fermentação submersa. Em média, os maiores halos foram observados, nos décimo e terceiro dias de fermentação, no meio suplementado com glicose seguido de frutose e amido, no quinto dia de fermentação. Segundo os dados, ao final do processo fermentativo, o pH do extrato bruto variou de 4,4 a 7,5, determinando-se os maiores halos: 17 mm, 15,5 mm e 15 mm, nos extratos de pH 5,5, 7,0 e 4,4, respectivamente.

Além das enzimas fibrinolíticas de L. citrínus, diversas enzimas já foram isoladas e caracterizadas a partir de alimentos tradicionais asiáticos, como o natto, pasta de camarão fermentada, DouChi (fermentado de soja), microrganismos (Bacillus subtilis, Rhizopus chinensis, Fusarium sp) e basidiomicetos (Flammulina velutipes, Armillaría mellea, Fomitella fraxinea) (Park et al„ 2007; Shin; Choi, 1998; Kim et ai.; 2006; Peng et al., 2005).

Tabela 4 Diâmetro do halo de fibrinólise (mm) e pH dos extratos brutos obtidos do processo fermentativo suplementado com glicose (G), frutose (F) e amido (A) durante o 3o (G3, F3 e A3), 5o (G5, F5 e A5), 10 0 (G10, F10 e A10) e 15 ° (G15, F15 e A15) dias de cultivo. ___ _ p . . fibrinólise (Extrato tos Média do Halo Bruto) (mm) A3 14 7,1 A5 15 5,5 A10 11 7,5 A15 13 6,0 F3 14 7,1 F5 15 4,5 F10 12 4,4 F15 14 6,7 G3 16 7,0 G5 13 6,5 G10 17 4,4 G15______________8_______________7,5 As enzimas microbianas com atividade fibrinolítica, principaimente aquelas que são fontes alimentícias, têm o potencial de ser desenvolvidas como aditivos de alimentos funcionais e medicamentos para prevenir ou curar doenças cardiovasculares (Peng et al., 2005).

Com base nos resultados das atividades experimentais in vitro pode se afirmar que: 1. O produto alimentício tem propriedades fibrinolíticas e por se tratar de um cogumelo comestível pode ser utilizado como alimento in natura ou desidratada na profilaxia nas doenças que envolvam a formação de coágulos sanguíneos. 2. Os basidiomas de L. citrinus são fontes de proteases solúveis em meio aquoso e também excretam essas enzimas através de processos de fermentação para o meio extracelular. 3. L. citrinus produz proteases extracelulares com atividade fibrinolítica nos meios de fermentação contendo glicose, frutose e amido. 4. Em todos os extratos brutos obtidos dos bioprocessos de fermentação em meio líquido, a atividade fibrinolítica foi positiva, com maior halo de fibrinólise no extrato recuperado do meio suplementado com glicose. 5. Basidiomas de L. citrinus tem maiores quantitativos de proteases fibrinolíticas solúveis em água e são metaloproteases e aspártica proteases. 6. L. citrinus (Figura 2) pode ser considerado uma nova alternativa alimentícia na prevenção de doenças trombolíticas e pode ser produzidas em escala industrial a baixo custo.

Reivindicações Bioprocesso para Produção de Extrato Proteolítico Fibrinolítico, Extrato Proteolítico Fibrinolítico e Composição Fibrinolítica de Cogumelo Comestível

Claims (8)

1. Bioprocesso de obtenção do extrato fibrinolítico caracterizado por compreender extração aquosa a partir de cogumelos comestíveis.

2. Bioprocesso de obtenção do extrato fibrinolítico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: a) meios para a produção em condições axênicas de cogumelos comestíveis; b) extração dos basidiomas do cogumelo; c) processamento dos basidiomas para extração das proteases; d) recuperação do extrato proteolítico bruto.

3. Bioprocesso de obtenção de extrato fibrinolítico caracterizado por compreender a fermentação submersa a partir de cogumelos comestíveis.

4. Bioprocesso de obtenção de extrato fibrinolítico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender as etapas de: a) obtenção de culturas viáveis e puras de cogumelos comestíveis; b) preparação do inóculo; c) fermentação submersa de b); d) meios para ocorrência da fermentação; e) meios de separação da biomassa resultante.

5. Extrato fibrinolítico caracterizado por ser obtido de acordo com qualquer um dos bioprocessos descritos nas reivindicações 1 e 3.

6. Composição fibrinolítica caracterizada por compreender: a) extrato fibrinolítico obtido a partir de cogumelos comestíveis; b) veículo aceitável.

7.

Veiculo aceitável, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado------------- por compreender um veículo nutricionalmente aceitável e/ou farmaceuticamente aceitável e/ou nutraceuticamente aceitável.