BRPI9710460B1 - composição imunogênica multi-valente e composição de vacina - Google Patents

Abstract

"composição imunológica multi-valente e seu uso em vacinas". composição de vacina multi-componente é descrita compreendendo componentes de vacina para coqueluche acelular, toxóide de difteria, toxóide de tétano, e polio vírus inativado. a composição também pose conter um conjugado de um polissacarrídeo capsulado de haemophilus influenzae tipo b e toxóide de tétano, cujo qual pode ser reconstituído de um estado liofilização por outros componentes da vacina. a administração da vacina multi componente resulta não ocasiona diminuição da imunogenicidade de qualquer componente como uma resultante da interferência por outros componentes da vacina.

Description

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA MULTI-VALENTE E COMPOSIÇÃO DE VACINA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a vacinas multivalentes, particularmente para administração pediátrica.

FUNDAMENTOS DA INVENCAO

A Coqueluche é uma infecção do trato respiratório superior, grave e altamente contagiosa causada por Bordetella pertussis. A Organização Mundial da Saúde calcula que há 60 milhões de casos de coqueluche por ano e 0,5 a 1 milhão de mortes associadas. Em populações não vacinadas, uma taxa de incidência de coqueluche tão elevada quanto

80% foi observada em crianças com menos de 5 anos de idade.

Embora coqueluche seja geralmente considerada uma doença da infância, há evidência crescente de doença clínica assintomática em adolescentes e adultos.

introdução de vacinas de célula integral compostas de organismos

B.pertussis inativados química e termicamente na década de foi responsável por uma redução acentuada na incidência de coqueluche ocasionada por B.

coqueluche.

As taxas de eficácia para vacinas de célula integral foram calculadas ate 95% dependendo da definição do caso. Embora a infecção com B.pertussis confira imunidade por toda vida, há evidência crescente de proteção diminuída após imunização com vacinas de célula integral. Vários relatórios citando uma relação entre vacinação de coqueluche de célula integral, reatogenicidade e efeitos colaterais sérios conduziram a um declínio em aceitação de vacina e epidemia repetida consequente. Mais recentemente, foram

Petição 870180160549, de 10/12/2018, pág. 8/12

2/120 desenvolvidas vacinas de coqueluche com componente definido.

Antígenos para Vacinas de Per-t-u-s-si-s—definida

Várias vacinas de I coqueluchp acelular foram desenvolvidas e incluem os antígenos de Bordetella &

pertussis, toxina de Coqueluche (PT), Hemaglutinina

Filamentosa (FHA), a proteína de membrana externa de 69 kDa (pertactina) e aglutinógenos fimbriais (Tabela 1).

Toxina de Coqueluche p,

I _0 A toxina da Coqueluche é uma exotoxina que é um membro da família A/B de toxinas bacterianas com atividade ADPribosiltransferase. A fração-A destas toxinas apresenta a atividade ADP-ribosiltranserase e a porção B media a ligação da toxina a receptores de célula hospedeira e a

PT também facilita a aderência de B.pertussis a células epiteliais ciliadas e também desempenha um papel na macrófagos por B. pertussis incluíram

Todas as vacinas (acelulares| de coqueluche

PT, que foi proposto com um principal fator de virulência e antígeno de proteção. A infecção natural com B. pertussis gera respostas tanto mediadas por célula como humoral à PT.

As crianças têm anticorpos anti-PT transplacentalmente derivadas e colostro humano contendo anticorpos anti-PT 25 foram eficazes na proteção passiva de camundongos contra aerossol infectado. Uma resposta imune mediada por célula (CMI) a subunidades PT foi demonstrada após imunização com uma vacina acelular e uma resposta CMI a PT foi gerada após

3/120 vacinação de célula integral. PT quimicamente inativado’ em vacinas de componente ou célula integral é protetor em modelos animais e em seres humanos. Além disso, anticorpos monoclonais específicos para subunidade SI protegem contra infecção por B.pertussis.

Os efeitos patof isiológicos de PT são devidos a sua atividade ADP-ríbosíltransferase. PT catalisa a transferência de ADP-ribose de NAD para a proteína de ligação por nucleotídeo guanina G_iz desse modo rompendo o sistema regulador de ciclase adenilato celular. PT também evita a migração de macrófagos e linfócitos para sítios de inflamação e interfere com fagocitose mediada por neutrófilo e extermínio de bactérias. Diversos ensaios in vitro e in vivo foram utilizados para avaliar a atividade enzimática de SI e/ou PT, incluindo a ADB-ribosilação de transducina bovina , o ensaio de agrupamento de células de ovário de hamster Chinês (CH) , sensibilização de histamina , leucocitose, e NAD glicohidrolase. Quando expostas a PT, as células CHO desenvolvem uma morfologia agrupada característica. Este fenômeno depende da ligação de PT, e subsequente translocação e atividade de ADPribosiltransferase de SI e desse modo o ensaio de agrupamento de célula CHO é amplamente utilizado para testar a integridade e toxicidade de holotoxinas PT. Hemaglutinina filamentosa

Hemaglutinina filamentosa é um polipeptídeo não tóxico (220 kDa) que media a ligação de B.pertussis a células ciliadas do trato respiratório superior durante colonização

4/120 bacteriana. A infecção natural induz anticorpos anti-FHA è imunidade mediada por célula. Anticorpos anti-FHA são encontrados em colostro humano e também são transmitidos transplacentalmente. A vacinação com vacinas acelulares ou de célula integral de coqueluche geraanticorpos anti-FHA e vacinas acelulares contendo FHA também induzem uma resposta CMI a FHA. FHA é um antígeno de proteção em um modelo de infestação respiratória de camundongo após imunização ativa ou passiva. Contudo, FHA sozinho não protege no ensaio de potência de infestação intracerebral de camundongo.

Proteína de membrana externa de 69 kDa (Pertactina)

A proteína de 69 kDa é uma proteína de membrana externa que foi originalmente identificada por B.bronchiseptica. A proteína também é conhecida como pertactina e P.69. Foi mostrada como sendo um antígeno de proteção contra B.bronchiseptica e foi subseqüentemente identificada tanto em B.pertussis como B.perapertussis. A proteína de 69 kDa se liga diretamente a células eucarióticas e a infecção natural por B.pertussis induz uma resposta humoral anti-P.69 e P.69 também induz uma resposta imune mediada por célula. A vacinação com vacinas acelulares ou de célula integral induz anticorpos anti-P.69 e vacinas acelulares induzem P.69 CMI. Pertactina protege os camundongos contra infestação por aerossol com B .pertussis. e em combinação com FHA, protege no teste de infestação intracerebral contra B.pertussis. A transferência passiva de anticorpos anti-P.69 policlonal ou monoclonal também protege camundongos contra infestação por

5/120 aerossol.

Aqlutinócfenos

Serotipos de B.pertussis são definidos por suas

	fímbrias de aglutinação.	A	Organização Mundial	de Saúde
5	recomenda	que vacinas	de	célula integral	incluam
	aglutinógenos dos tipos 1,	2	e	3 (Aggs) uma vez que não são
	de proteção	cruzada . Agg	1	é	não fimbrial e é	encontrado

em todas as cepas de B.pertussis enquanto os Aggs de serotipo 2 e 3 são fimbriais. A infecção natural ou _0 imunização com vacinas acelulares ou de célula integral induz anticorpos anti-Agg. Uma resposta imune mediada por célula específica pode ser gerada em camundongos por Agg 2 e Agg 3 após infecção por aerossol. Aggs 2 e 3 são protetores em camundongos contra infestação respiratória e 15 colostro humano contendo anti-aglutinógenos também protegerão neste ensaio.

Vacinas acelulares para Coqueluche

A primeira vacina acelular para coqueluche desenvolvida foi a vacina PT + FHA de dois componentes 2 0 (HNIH 6) de Sato e outros. Esta vacina foi preparada por co-purificação de antígenos FHA e PT do sobrenadante de cultura da cepa B.pertussis Tohama, seguido por formação de toxóide de formalina. Vacinas acelulares de vários fabricantes e de várias composições foram utilizadas com 25 sucesso para imunizar crianças japonesas contra coqueluche desde 1981 resultando em uma redução acentuada na incidência da doença. A vacina JNIH 6 e uma vacina de toxóide PT de mono-componente (JNIH 7) foram testadas em um

6/120 grande experimento clínico na Suécia em 1986. Os resultados iniciais indicaram eficácia mais baixa do que a eficácia relatada de uma vacina de célula integral, porém estudos de acompanhamento mostraram a mesma como sendo mais eficaz contra doença mais branda diagnosticada por métodos sorológicos.

Contudo, houve evidência de reversão da toxicidade de PT inativado-formalina nestas vacinas.

Verificou-se também que estas vacinas são capazes de proteger contra a doença ao invés da infecção.

Diversas vacinas novas de coqueluche de componente e acelulares estão atualmente sendo avaliadas, as quais incluem combinações de PT, FHA, P.69, e/ou aglutinógenos e estas estão relacionadas na Tabela 1. Várias técnicas de desintoxicação química foram utilizadas para PT incluindo inativação com formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e tetranitrometano.

Tétano

O Tétano é uma infecção aguda causada por Clostridium tetani. A doença é caracterizada por contrações musculares dolorosas, severas, acompanhadas por hipersensibilidade, hiper-reflexia e estimulação autonômica aumentada da(s) parte(s) do corpo afetada(s). Os estímulos brandos podem ocasionar espasmos musculares de reflexo severos. A febre devido a espasmo muscular extremo pode estar presente. O Tétano pode ser generalizado, envolvendo o rosto, pescoço, abdômen e tronco, ou localizada em uma parte específica do corpo (local do ferimento). O envolvimento do músculo masseter do rosto resulta em trismo, dando origem à

7/120 expressão facial clássica conhecida como risus sardonicus.

C. tetani existe como um organismo não patogênico no intestino de seres humanos e animais. 0 organismo também é encontrado em solo contaminado por fezes e pode sobreviver em solo por anos como esporos infecciosos.

O tétano resulta do crescimento anaeróbico de C.tetani e produção de neurotoxina em ferimentos contaminados. A infecção é causada pela introdução de materiais contaminados por organismos ou esporos no tecido. 0 cenário mais comum é infecção através de um ferimento penetrante. Contudo, em muitos casos nenhum histórico de ferimento é obtenível. A presença de tecido isquêmico ou necrótico facilita o crescimento do bacilo.

A prevenção de infecção é por vacinação e por boa higiene de ferimento incluindo limpeza cuidadosa e debridamento de tecidos desvitalizados. As pessoas com ferimentos contaminados devem receber tanto a vacina de tétano como a imunoglobulina de tétano.

O tratamento da síndrome é principalmente de apoio e pode incluir apoio respiratório, administração de antitoxina de tétano e limpeza cuidadosa de ferimentos infectados. Apesar de cuidados médicos modernos as taxas de fatalidade de caso ainda são tão elevadas quanto 30 a 90%. Isto é particularmente verdadeiro nos idosos. A infecção natural nem sempre produz imunidade contra infecção adicional.

A prevenção de infecção por vacinação é o método mais

8/120 eficaz para controlar a doença. Desde a introdução de vacinação universal, o tétano se tornou extremamente raro em países desenvolvidos. Os casos ocorrem quase exclusivamente em pessoas que deixaram de completar sua série de vacinações ou que não receberam doses de reforço apropriadas. As pessoas devem receber uma dose de reforço uma vez a cada dez anos.

Difteria

Difteria é uma infecção aguda causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae. 0 sítio principal de infecção é o trato respiratório superior (nariz, faringe, laringe e traquéia. A lesão característica, um resultado da citotoxina bacteriana, são placas de pseudomembrana cinzenta circundados por inflamação. Esta é acompanhada por linfadenopatia cervical, inchaço e edema da garganta. Em casos graves o inchaço pode progredir até o ponto de obstrução (difteria laríngea). Outras complicações incluem miocardite, efeitos do sistema nervoso central (neuropatias sensórias, de motor e cranial, como paralisia ascendente), e trombrocitopenia. Outras membranas de mucosa podem ser menos frequentemente afetadas. A apresentação clínica pode variar de infecção assintomática para multi-sistema fulminante, e morte. Infecções cutâneas e de ferimento com difteria são comuns nos trópicos e foram frequentemente reportados na população indigente dos E.U.A. O único reservatório de C. diphtheriae é o homem.

Um diagnóstico presumível pode ser feito em observação clínica das lesões características porém deve ser

9/120 confirmado por exame bacteriano das lesões. Caso haja uma forte suspeita clínica de difteria, o tratamento deve ser iniciado imediatamente com antibióticos (penicilina ou eritromicina) e antitoxina de difteria, mesmo se o diagnóstico não for confirmado. A mortalidade aumenta quanto mais tempo se espera após o início de sintomas clínicos. A taxa de fatalidade de caso varia de cinco a dez por cento apesar do tratamento médico moderno e ocorre principalmente nos muito jovens e nos idosos. A infecção natural nem sempre produz imunidade contra infecção adicional.

A transmissão é por contato direto com secreções uma pessoa infectada. As pessoas são contagiosas enquanto bactérias são observadas nas secreções. Isto pode durar até quatro semanas após a infecção. A transmissão pode ocorrer também com fomitos infectados. O isolamento rigoroso de casos é recomendado.

Raramente as pessoas podem se tornar portadoras e espalhar organismos até seis meses após a infecção. Portadores não imunizados devem ser imediatamente vacinados com a série total. 0 tratamento com antibióticos elimina transporte e capacidade de infecção de casos em 4 dias. Poliomielite

Vacinas de poliovírus tanto inativadas (IPV) como atenuadas vivas (OPV) foram eficazes no controle de poliomielite no mundo inteiro. Uma vacina DPT-IPV combinada é atualmente licenciada na Europa e no Canadá e tem sido mostrada como segura e eficaz em milhões de crianças no

10/120 mundo inteiro.

Haemophilus influenzae do tipo b

Antes da disponibilidade de vacinas eficazes,

Haemophilus influenzae tipo b (Hib) era causa principal de infecções invasivas de meningite carregadas pelo sangue em crianças pequenas e era a principal causa de meningite nos primeiros anos de vida. Aproximadamente 10% de vitimas de meningite por Haemophilus influenzae morrem apesar do tratamento médico. Seqüelas permanentes são comuns em _0 sobreviventes. A imunização contra Haemophilus influenzae começou no Canadá em 1987 com uma vacina de polissacarídeo

	(polirribose ribitol		fosfato [PRP]	de Haemophilus
	influenzae tipo b) .	A	imunogenicidade	aperfeiçoada foi
	obtida em crianças de	18	meses de idade e	mais velhas com a
15	introdução em 1988	de	uma vacina consistindo em PRP

conjugado com toxóide de difteria (PRP-D). Desde 1992, a imunização de crianças tem sido possível com a liberação de vacinas conjugadas de PRP imunogênicas em bebês com menos de 1 ano de idade (PRP conjugado com toxóide de tétano ou 20 PRP-T). O uso destas vacinas conjugadas de Haemophilus influenzae foi associado a uma redução acentuada na incidência de infecção de difteria invasiva no Canadá e em outros lugares. Dois estudos clínicos canadenses envolvendo quase 900 crianças em British Columbia e Alberta demonstram

25	que PRP-T	liofilizado	pode	ser reconstituído	com	DPT
	(COMBIPACK	ou com DPT-	•Polio	Adsorbed	(ΡΕΝΤΑ™)	além	do
	diluente	de solução	salina	usual.	Estudos	clínicos

envolvendo mais de 100.000 crianças em todo o mundo

11/120 demonstraram a eficácia de PRP-T liofilizado (ActHib^Ttó) . Mais de 90% obtêm níveis anti-PRP considerados como de proteção (> 0,15 ug/ml) após 3 doses de PRP-T iniciando com 2 meses ou após uma única dose de PRP-T dados após 12 meses de idade. A proporção obtendo níveis indicativos de proteção a longo prazo (>l,0 ug/ml) varia de 70 a 100% dependendo do estudo. Milhões de doses de PRP-T foram vendidas no Canadá desde 1992. Casos de alastramento da infecção invasiva por Haemophilus após vacinação com PRP-T _0 são raros e podem ser associados a doenças como imunodeficiência.

Combinação de vacinas

Embora haja muitos benefícios efetivos e potenciais de vacinas que combinem antígenos para conferir proteção 15 contra múltiplos patógenos, estas combinações podem ter um efeito prejudicial sobre a imunogenicidade dos componentes individuais. As combinações de toxóide de tétano e difteria com vacina de coqueluche de célula integral (DTP) estão disponíveis há mais de 50 anos e a resposta de anticorpo à 20 combinação é superior àquela dos componentes individuais, talvez como resultado de um efeito adjuvante da vacina de coqueluche de célula integral. Combinações DTP que também incluem vacinade poliovírus inativado são licenciadas em muitas jurisdições, embora a resposta de anticorpo aos 25 antígenos de coqueluche possa ser diminuída.______p.or________esta ...

combinação.^ O_efeito de combinar vacinas DTP com vacina cõnjügã Hib tem sido variável.. Os estudos com um DTP francês e PRPT demonstraram segurança similar porém uma

Y

12/120 ο V 7 12/120

AJ ’ resposta diminuídk^ de anticorpo a PRP ao passo que estudos vacina de DTP e PRPT canadense não mostraram efeito com uma sobre a resposta PRP porém aglutinógenos de coqueluche mais baixos e sensibilidade aumentada no local grupo de imunização combinado.

Os dados estão se tornando disponíveis agora sobre^o efeito de combinar vacinas APDT com vacina conjugada Hib\ Em bebês com dois meses de idade que receberam três doses, (APDT) , a resposta de uma vacina acelular de coqueluche-difteria-tétano combinada com uma vacina conjugada Hib (PRP-iT)) de anticorpo a PRP foi no grupo que recebeu significativamente mais injeções separadas no baixa do que mesmo dia.

Resultados similares foram reportados com outra vacina acelular de coqueluche-difteria-tétano combinada com PRP-T dada para as três primeiras doses.

Em contraste com outros estudos relatados, as crianças imunizadas com a vacina combinada tiveram uma resposta de anticorpo superior a PRP, difteria, e vários dos antígenos de coqueluche quando comparado com crianças que receberam PRP em uma visita separada. Pode haver vários motivos para imunogenicidade equivalente ou melhor para estas vacinas quando dadas como uma injeção combinada ao invés da imunogenicidade diminuída relatada com outros produtos. Todas as vacinas de coqueluche acelulares e de componente não são idênticas em seu conteúdo antigênico, método de formação de toxóide, adjuvante ou conservador. Contudo, a

imunogenicidade	diminuída	foi	relatada com vacinas
acelulares de coqueluche contendo	(PT) FHA e 69K e contendo
			! U . . y r·. y 1 Â / V U fín v- frip......''

13/120

PT, FHA, 69K e fímbrias.

A vacina APDT de cinco componentes examinada neste estudo foi verificada ter uma eficácia de proteção de 85% (Exemplo 5) (95% Cl 81/89) em um experimento clínico de fase III recentemente concluído na Suécia sob os auspícios do National Institutes of Health.

Vacinas de combinação comercialmente disponíveis atuais podem não conter formulações apropriadas de antígenos apropriados em formas imunogênicas apropriadas para obter um nível desejado de eficácia em uma população humana suscetível a coqueluche.

Seria desejável fornecer vacinas de combinação eficazes compreendendo componentes de coqueluche acelulares contendo quantidades relativas selecionadas de antígenos selecionados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é dirigida à vacinas de combinação ou multivalentes contendo componentes de vacina de coqueluche acelular, e métodos de uso das mesmas.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição imunogênica multivalente para conferir proteção em um hospedeiro contra doença causada por infecção por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynbacterium diphtheriae, poliovírus i e/ou/ Haemophilus influenzae, compreendendo:

a) toxóide de coqueluche, hemaglutinina filamentosa, pertactina e aglutinógenos em forma purificada,

14/120

b) toxóide de tétano,

c) toxóide de difteria,

d) vírus de pólio inativado, íe opcionalmente,

e) um conjugado de uma molécula portadora selecionada dentre toxóide de tétano e toxóide de difteria e um polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo

A composição imunogênica pode ser formulada como uma Ί vacina para administração in vivo ao hospedeiro em que os componentes individuais a composição são formulados de tal modo que a imunogenicidade de componentes por outros componentes individuais da compreender ainda um adjuvante, particularmente hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.

Tal composição imunogênica pode conter aproximadamente 5 a aproximadamente 3 0 ug de^jaitxogênio de toxóide de coqueluche, aproximadamente 5 a 30 ug de nitrogênio de hemaglutinina filamentosa, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 ug de nitrogênio de pertactina e aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ug de nitrogênio de aglutinógenos.

Em uma modalidade específica, a composição imunogênica pode compreender toxóide de coqueluche, hemaglutinina fimbrial, a proteína 69 kDa e aglutinógenos filamentosos de Bordetella pertussis a uma razão de peso de aproximadamente 20:20:5:3 como fornecido por aproximadamente 20 ug de

15/120 toxóide de coqueluche, aproximadamente 20 ug de hemaglutinina filamentosa, aproximadamente 5 ug de aglutinógenos fimbriais e aproximadamente 3 ug de proteína 69 kDa em uma dose humana única. Em outra modalidade específica, a vacina pode compreender toxóide de coqueluche, hemaglutinina filamentosa, a proteína de 69 kDa e aglutinógeno—fimbrial de Bordetella pertussis a uma razão de peso de ' 10 : 5 : 5 : 3 pomo fornecido por aproximadamente 10 ug de toxóide de coqueluche, aproximadamente 5 ug de hemaglutinina filamentosa, aproximadamente 5 ug de aglutinógeno fimbrial e aproximadamente 3 ug de proteína 69 kDa em uma dose humana única. Em uma modalidade da composição imunogênica fornecida aqui, a vacina contém aproximadamente 15 Lfs de toxóide de difteria e aproximadamente 5 Lfs de toxóide de tétano.

poliovírus inativado empregado na composição imunogênica da invenção compreende geralmente uma mistura de poliovírus inativado dos tipos 1, 2 e 3. Tal mistura de poliovírus inativado tipos 1, 2 e 3 pode ser empregada nas composições:

aproximadamente 20 a aproximadamente 50 D unidades de\/ antígeno de poliovírus do tipo 1;

aproximadamente 5 a aproximadamente 10 D unidades de U antígeno de poliovírus do tipo 2;

aproximadamente 20 a aproximadamente 50 D unidades de antígeno de poliovírus do tipo 3 em uma dose humana única. Em uma formulação, tais misturas de tipos de poliovírus inativados podem

16/120 compreender :

	aproximadamente	40	D	unidades	de	antígeno	de /
	poliovírus tipo 1;
	aproximadamente	8	D	unidades	de	antígeno	de
5	poliovírus tipo 2;						\y
	aproximadamente	32	D	unidades	de	antígeno	de
	poliovírus tipo 3 em uma	dose	humana única.

O componente de molécula conjugada da composição imunogênica pode compreender) um conjugado de toxóide de ^0 tétano ou toxóide de difteria e polirribose ribitol fosfato (PRP) de Haemophilus influenzae tipo b. Tal molécula de conjugado pode ser fornecida em uma forma liofilizada, que é reconstituída para administração por combinação com os outros componentes. A composição imunogênica pode conter o 15 conjugado em uma quantidade de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 ug de PRP conjugado com aproximadamente 15 a aproximadamente 3 5 ug de toxóide de tétano, em uma dose humana única. Em uma formulação, o conjugado é empregado em uma quantidade de aproximadamente 10 ug de PRP 20 conjugado com aproximadamente 20 ug de toxóide de tétano.

Em tais modalidades específicas, as composições imunogênicas fornecem um perfil de resposta imune a cada um dos antígenos de coqueluche contidos na mesma e o perfil de resposta fornecido pelos componentes acelulares é 25 substancialmente equivalente àquele produzido por uma vacina de coqueluche de célula integral.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, é fornecida uma composição de vacina multivalente,

17/120 compreendendo, por dose de 0,5 ml, 20 _ug de toxóide de coqueluche, 20 ug de hemaglutinina filamentosa; 5 _ug de fímbrias 2 e 3; 3 ug de proteína de membrana de pertactina;

Lf de toxóide de difteria; 5 Lf de toxóide poliovírus-do tipo 1 ^0 D unidades de antígeno tipo 2 8 unidades de antígeno; 1,5 ug de alumínio.

Tal composição jpode compreender ainda, ml, 10 ug de polissacarídeo capsular de fosfato de por dose de 0,5 fosfato ribitol influenzae tipo poliribose purificado (PRP) _de Haemophilus

q. 2 ug'j de toxóide de tétano. Além podem conter, por dose de 0,5 ml, b covalentemente ligado disso, tais composições

0,6% 2-fenoxietanol.

Em um aspecto adicional da invenção, é fornecido um método de imunizar um hospedeiro contra múltiplas doenças, compreendendo administrar ao hospedeiro, que pode ser humano, uma quantidade imunoeficaz imunogênica ou vacina como fornecido aqui.

As vantagens da presente invenção incluem uma vacina multivalente que pode conferir contra uma gama de doenças pediátricas comuns em um modo seguro e eficaz. A capacidade de fornecer uma vacinação única contra múltiplas

A presente invenção será entendida adicionalmente da seguinte descrição detalhada e Exemplos com referência ao desenho em anexo, no qual:

18/120

A Figura 1 é um fluxograma esquemátieo’ de um procedimento para o isolamento de uma preparação de aglutinógeno de uma cepa de Bordetellã.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Com referência à Figura 1, é ilustrado um fluxograma de um método para preparar uma preparação de aglutinógeno de uma cepa de Bordetellã. Como visto na Figura 1, uma pasta de célula de Bordetellã contendo os aglutinógenos,

1'0 como pasta de célula B.pertussis, é extraída, por exemplo, com um tampão potássio, 150 s e1et ivament e produzir um aglutinógenos contendo uréia, mM NaCl e 4M os aglutinógenos como 10 mM de fosfato de de uréia, para extrair da pasta de célula para primeiro sobrenadante (spl) e um primeiro precipitado residual primeiro sobrenadante (spl) é separado do contendo (pptl). 0 primeiro precipitado precipitado clarifiçado diafiltrado potássio/150 residual (pptl), residual (pptl) é (spl) pode ser como por centrifugação. 0 descartado.

sobrenadante seguir concentrado e contra, por exemplo mM NaCl/0,1% Triton mM

X-100 de fosfato utilizando, de por exemplo, um filtro de membrana NMWL de 300 primeiro sobrenadante é incubado a uma temperatura e por um tempo para produzir um sobrenadante clarificado (sp2) contendo aglutinógenos e um segundo precipitado de descartar (ppt2) contendo contaminantes não aglutinógenos.

Temperaturas apropriadas incluem aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100°C, incluindo

19/120 aproximadamente 75° a aproximadamente 85°ê, e tempos de incubação apropriados incluem aproximadamente 1 a aproximadamente 60 minutos. O sobrenadante clarificado é então concentrado, por exemplo, pela adição de polietileno 5 glicol com peso molecular de aproximadamente 8000 (PEG 8000) a uma concentração final de aproximadamente 4,5 ±

0,2% e agitando suavemente por um mínimo de aproximadamente 30 minutos para produzir um terceiro precipitado (ppt3) que pode ser coletado por centrifugação.

O sobrenadante .0 restante sp3 é descartado.

é extraído, por exemplo, com mM de fosfato de potássio/150 aglutinógeno mM NaCI para fimbrial bruta.

ser adicionado ã aproximadamente 100

Alternativamente, fornecer a solução contendo

1M de fosfato de potássio pode fimbrial bruta para tornar mM com relação a sobrenadante fosfato de potássio.

clarificado de aglutinógenos fimbriais tratados termicamente pode ser purificado sem precipitação por cromatografia por filtração 20 em gel utilizando um gel, como Sepharose CL6B. Os aglutinógenos fimbriais na solução bruta são então purificados por cromatografia de coluna, como, passando através de uma coluna de sílica PEI, para produzir a preparação de aglutinógeno fimbrial na passagem.

Esta passagem contendo aglutinógeno fimbrial pode ser adicionalmente concentrado e diafiltrado contra, por exemplo, um tampão contendo 10 mM de fosfato de potássio/150 mM NaCI utilizando uma membrana NMWL de 100

20/120

300 kDa. A preparação de aglutinógeno pode ser-esterilizada por filtração através de um filtro de membrana < 0,22 uM, para fornecer a preparação de aglutinógeno fimbrial purificada, final, contendo aglutinógeno fimbrial 2 e 3 substancialmente isento de aglutinógeno 1. A razão de peso de Agg 2 para Agg 3 pode ser de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 2:1. As vacinas podem conter outros imunógenos de Bordetella purificados incluindo hemaglutinina filamentosa, a proteína de membrana externa x0 de 69 kDa e toxina de coqueluche ou um seu toxóide, incluindo análogos geneticamente detoxifiçados de PT.

Os outros imunógenos de Bordetella, toxina de coqueluche (incluindo seus análogos geneticamente detoxifiçados, como descrito, por exemplo em Klein e 15 outros, patente norte-americana 5.085.862 cedida ao cessionário da presente e aqui incorporado mediante referência ao mesmo), FHA e a proteína de 69 kDa podem ser produzidos em forma purificada por uma variedade de métodos como descrito abaixo.

Purificação de PT

PT pode ser isolado do sobrenadante de cultura de uma cepa de B. pertussis utilizando métodos convencionais. Por exemplo, o método de Sekura e outros pode ser utilizado. PT é isolado primeiramente absorvendo sobrenadante de cultura 25 sobre uma coluna contendo a matriz de gel ligante-corante,

Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) . PT é eluído desta coluna por sal elevado, como, 0,75 M de cloreto de magnésio e, após remover o sal, é passado

21/120 através de uma coluna de matriz de afinidade Sefarosefetuína composta de fetuína ligada a Sefarose ativada por brometo de cianogênio. PT é eluído da coluna de fetuína utilizando 4M de sal de magnésio.

Alternativamente, o método de Irons e outro pode ser utilizado. Sobrenadante de cultura é absorvido sobre uma coluna de Sepharose 4B ativada por CNB4 à qual haptoglobina é primeiramente covalentemente ligado. O PT se liga ao absorvente no pH 6,5 e é eluído da coluna utilizando tampão xO 0,1M Tris/0,5M NaCl por uma mudança em etapa para pH 10.

Alternativamente, o método descrito na patente norteamericana 4.705.686 concedida a Scott e outros em 10 de novembro de 1987 e aqui incorporada mediante referência à mesma pode ser utilizado. Neste método sobrenadantes de 15 cultura ou extratos celulares de B.pertussis são passados através de uma coluna de uma resina de permuta de ânion de capacidade suficiente para adsorver endotoxina porém permitir que antígenos de Bordetella fluam através ou de outro modo sejam separados da endotoxina.

Altemativamente, PT pode ser purificado utilizando cromatografia de perlite, como descrito na patente da Organização Européia de Patentes 336 736, cedida à cessionária da mesma e aqui incorporada mediante referência à mesma.

Detoxificação de PT

PT é detoxifiçado para remover atividades indesejáveis que poderíam causar reações colaterais da vacina final. Qualquer de uma variedade de métodos convencionais de

22/120 detoxificação química pode ser utilizada, como tratamento com formaldeído, peróxido de hidrogênio, tetranitro-metano ou glutaraldeído.

Por exemplo, PT pode ser detoxifiçado com glutaraldeído utilizando uma modificação do procedimento descrito em Munoz e outros. Neste processo de detoxificação PT purificado é incubado em uma solução contendo 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato. A solução é feita 0,05% com glutaraldeído e a mistura é incubada em mO temperatura ambiente por duas horas, e a seguir feita 0,02

M com L-lisina. A mistura é adicionalmente incubada por duas horas em temperatura ambiente e a seguir dialisada por dois dias contra 0,01 M PBS. Em uma modalidade especifica, o processo de detoxificação da patente EP no. 336 736 pode ser utilizado. Resumidamente PT pode ser detoxifiçado com glutaraldeído com a seguir:

PT purificado em 75 mM de fosfato de potássio em pH 8,0 contendo 0,22 M de cloreto de sódio é diluído com um volume igual de glicerol a concentrações de proteína de 20 aproximadamente 50 a 400 ug/ml. A solução é aquecida a 37°C e detoxificada pela adição de glutaraldeído a uma concentração final de 0,5% (peso/v). A mistura é mantida a 37°C por 4 horas e a seguir ácido aspártico (1,5 M) é adicionado a uma concentração final de 0,25 Μ. A mistura é 25 incubada em temperatura ambiente por 1 hora e a seguir diafiltrada com 10 volumes de 10 mM de fosfato de potássio em pH 8,0 contendo 0,15 M de cloreto de sódio e 5% de glicerol para reduzir o glicerol e remover o glutaraldeído.

23/120 toxóide PT é filtrado-esterilizado através / de uma membrana de 0,2 uM.

e técnicas recombinantes forem utilizadas para preparar uma molécula mutante PT que não mostra nenhuma ou mostra pouca toxicidade, para uso como a molécula formado em toxóide, detoxificação química não é necessária. Purificação de FHA

FHA pode ser purificado do sobrenadante de cultura essencialmente como descrito por Cowell e outros. Promotores de crescimento, como beta-ciclodextrinas metiladas, podem ser utilizados para aumentar o rendimento de FHA em sobrenadantes de cultura. O sobrenadante de cultura é aplicado a uma coluna de hidroxilapatite. FHA é adsorvido sobre a coluna, porém PT não é. A coluna é extensamente lavada com Triton X-100 para remover endotoxina. FHA é então eluído utilizando 0,5M NaCl em 0,1M de fosfato de sódio e, se necessário, passado através de uma coluna fetuína-Sepharose para remover PT residual. Purificação adicional pode envolver passagem através de uma coluna C1-6B Sepharose.

Alternativamente, FHA pode ser purificado utilizando anticorpos monoclonais ao antígeno, onde os anticorpos são afixados a uma coluna de afinidade ativada por CNBr.

Alternativamente, FHA pode ser purificado utilizando cromatografia de perlite como descrito na patente da Organização Européia de Patentes 336 736 acima mencionado. Purificação de Proteína de Membrana externa de 69 kPa (pertactina)

24/120

A proteína de membrana externa de 69 kDa - (69K ou pertactina) pode ser recuperada de células bacterianas primeiramente inativando as células com um agente bacteriostático, como timerosal, como descrito no EP 484

621 publicado e aqui incorporado mediante referência ao mesmo. As células inativadas são suspensa em um meio aquoso, como PBS (pH 7 a 8) e submetidas à extração repetida em temperatura elevada (45 a 60°C) com resfriamento subsequente até a temperatura ambiente ou 4°C. xü As extrações liberam a proteína 69K das células. O material contendo a proteína 69K é coletado por precipitação e passado através de uma coluna Affi-gel Blue. A proteína 69K é eluída com uma elevada concentração de sal, como 0,5M cloreto de magnésio. Após diálise, é passada através de um suporte de cromatofocalização.

Alternativamente, a purificada pertussis,

91/15505, do sobrenadante como descrito proteína 69 kDa pode de cultura no Pedido no nome da cessionária incorporado mediante referência ao do ser de uma cultura

PCT publicado

B.

WO presente e aqui mesmo. Tal método é preferido uma vez que a pertactina materiais de cromatografia de corante é fornecida livre de ciclase adenilato.

patente U.S. no. 5.276.142, concedida a Gotto e outros em 4 de janeiro de 1984 e na patente norte-americana 5.101.014, concedida a Burns em 31 de março de 1992.

25/120

Outros Componentes da Invenção ·

As vacinas da invenção também contêm imunógenos não Bordetella incluindo toxóide de tétano, ........-tox0_i.de de difteria, poliovírus inativado (IPV) ;e, opcionalmente) um k......................................... ' conjugado de toxóide de difteria ou toxóide de tétano e um polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b. Outros componentes potenciais das vacinas de multicomponentes incluem proteínas de membrana externa de Haemophilus, antígeno de superfície de hepatite B, caxumba, xO sarampo e rubéola.

Os conjugados do toxóide de tétano ou toxóide de difteria e o polissacarídeo capsular de Hib podem ser formados por isolamento de fosfato de ribitol poliribose (PRP) isolado de H. influenzae tipo b, derivando o PRP para 15 fornecer um diidrazida de ácido adípico e conjugar covalentemente com toxóide de tétano (ou)toxóide de difteria para fornecer conjugados PRP-T ou PRP-D respectivamente.

Cada um dos antígenos é individualmente absorvido em um adjuvante, como fosfato de alumínio ou hidróxido de 20 alumínio, coletivamente denominado alume, para fornecer produção conveniente e rápida de vacinas contendo quantidades relativas selecionadas destes antígenos nas vacinas como fornecido aqui.

Formulações de vacina multivalente selecionadas

Em modalidades selecionadas, a invenção fornece vacinas com as seguintes características (ug de proteínas aqui utilizadas se baseiam em resultados de teste Kjedahl realizados em concentrados purificados e são expressos como

26/120 ug de nitrogênio de proteína) , todas as quais podem ser administradas por injeção intramuscular:

a) CP_20/20/5/3DT-mIPV (Híbrido) :

Uma formulação compreende uma combinação de vacina de coqueluche de componente (CP) combinada com toxóides de difteria (Dl) e tétano (T) e poliovíruslinativado (mlPV) e é denominada CP_20/20/s/3DT-mIPV /(Híbrido)]. O poliovírus cultivado em células MRC-5 é designado mlPV enquanto poliovírus cultivado em células vero é designado IPV ou 10 vIPV. Qualquer material de poliovírus inativado pode ser utilizado intercambiavelmente nas formulações.

Cada dose humana de 0,5 ml de CP_20/20/5/3DT-mIPV (Híbrido)'foi formulada para conter aproximadamente:

\ 20 ug de toxóide de coqueluche (PT)

20 ug de hemaglutinina filamentosa (FHA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIM) ug de proteína de membrana externa Pertactina (69 kDa)

Lf de toxóide de Difteria

5 Lf de toxóide de Tétano

D unidades de antígeno Poliovírus tipo 1

D unidades de antígeno Poliovírus tipo 2

D unidades de antígeno Poliovírus tipo 3 l,5^mg^ de fosfato de alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol, como conservador.

(b) CP_20/20/5/3DT-mIPV (Híbrido) + PRP-T:

Outra formulação compreende uma combinação de vacina de coqueluche de componente (CP) combinada com toxóides de

27/120 difteria (D) e tétano (T) e poliovírus inativado (mlPV) denominado CP_20/20/5/3DT-mIPV (Híbrido) e é utilizado para reconstituir PRP-T liofilizada. A composição resultante contém, por dose de 0,5 ml, aproximadamente:

ug de toxóide de coqueluche (PT) ug de hemaglutinina filamentosa (FHA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIM) ug de proteína de membrana externa Pertactina (69 kDa)

Lf de toxóide de Difteria

Lf de toxóide de Tétanot ug de polissacarídeo capsular de fosfato | z ribitol poliribose purificado (PRP) de Haemophilusf influenzae tipo b c oval entemente ligado a 2 0 ug de toxóidel de tétano

Poliovírus	tipo	1	40	D unidades	de	antígeno
Poliovírus	tipo	2	8 :	D unidades	de	antígeno
Poliovírus	tipo	3	32	D unidades	de	antígeno
1,5 mg de	fosfato	de	alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol

c) CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (Híbrido) :

uma combinação de vacina de coqueluche de componente (CP) combinada com toxóides de difteria (D) e tétano (T), (mlPV) e

PRP-T denominado (Híbrido).

Cada dose humana de

0,5 ml da presente composição contém aproximadamente:

ug de toxóide de coqueluche (PT)

28/120 ug de hemaglutinina filamentosa (FKA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIM) ug de proteína de membrana externa Pertactina (69 kDa)

15 Lf de toxóide de Difteria

Lf de toxóide de Tétano ug de polissacarídeo capsular de fosfato ribitol ribose purificado (PRP) de Haemophilus influenzae

	tipo b covalentemente	ligado	a	20	ug de toxóide de tétano
0	Poliovírus	tipo	1	40	D	unidades	de	antígeno
	Poliovírus	tipo	2	8	D unidades	de	antígeno
	Poliovírus	tipo	3	32	D	unidades	de	antígeno
	1,5 mg de :	Eosfato	de	alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol

Experimentos clínicos (a) Vacina de coqueluche de componente DTP

Diversos experimentos clínicos foram realizados em seres humanos como descrito aqui para estabelecer a segurança, não reatogenicidade e utilidade de vacinas de 20 coqueluche de componente contendo aglutinógenos fimbriais preparados como descrito aqui, para proteção contra coqueluche. Em particular, as respostas imunes a cada um dos antígenos contidos nas vacinas (Tabela 3) foram obtidas. Uma vacina de coqueluche multivalente, específica, 25 CP_10/s/5/3DT foi analisada em um grande experimento clínico duplo-randomizado, de multi-centro, controlado por placebo em uma população humana em risco para calcular a eficácia da vacina contra coqueluche típica.

29/120

A definição do caso para doença típica de coqueluche foi:

vinte e um dias ou mais de tosse espasmôdica, e

B.pertussis de cultura confirmada, ou evidência sorológica de infecção específica de Bordetella indicada por um aumento de 100% de anticorpo IgA ou IgG em ELISA contra FHA ou PT em soro em pares, ou se dados sorológicos estiverem ausentes, a criança em estudo esteve em contato com um caso de B.pertussis de cultura confirmada no lar com início de tosse até 28 dias antes ou após o início de tosse na criança em estudo.

Os resultados deste estudo mostraram CP10/5/5/3DT como sendo aproximadamente 85% eficaz na prevenção de coqueluche como definido na definição do caso para doença típica de coqueluche como descrito acima. No mesmo estudo, uma vacina acelular de coqueluche de dois componentes contendo apenas PT e FHA foi aproximadamente 58% eficaz (PT_2S. FHA₂₅. DT) e uma vacina de coqueluche de célula integral (DTP) foi aproximadamente 48% eficaz (Tabela 4). Além disso, a vacina CP_10/5/5/3DT evitou coqueluche branda definida como uma tosse com pelo menos um dia de duração até uma eficácia de aproximadamente 77%. Em particular, o perfil de resposta imune obtida foi substancialmente igual àquele obtido após imunização com vacinas de coqueluche de célula integral que são reportadas como sendo altamente eficazes contra

30/120 coqueluche .

(b) Vacina DPT-PRP-T-IPV multivalente xO (I) A segurança e imunogenicidade de vacinas de coqueluche difteria e toxóide de de componente em combinação com toxóide de tétano Haemophilus influenzae tipo be vacina de poliomielite (CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV) coqueluche inativadacultivada em .......

foram comparadas integral (a) em células vero c om va cina..... de de célula combinação com toxóides de difteria e tétano e vacina de poliomielite inativada adsorvida com toxóides de tétano e difteria e vacina de poliomielite inativada e de

adsorvida utilizada cultivada em células MRC-5 (adsorvidas DPT-pólio) para reconstituir vacina conjugada de toxóide de tétano de Haemophilus influenzae tipo b liofilizada (ΡΕΝΤΑ™), íou; c) vacina de coqueluche de componente em combinação com vacina conjugada de toxóide de tétano de Haemophilus influenzae tipo b adsorvida de toxóides de tétano e difteria e vacina de poliomielite inativada cultivada em células MRC-5 (CP_20/20/5/3DT-mIPV) dadas separadamente de ou utilizadas para reconstituir vacina conjugada de toxóide de tétano de Haemophilus influenzae tipo b (PRP-T) em crianças com 2, 4, 6 e 18 meses de idade.

Este experimento controlado randomizado registrou 897 bebês com dois meses de idade para receber um de oito braços de vacina diferentes: CP_20/20/5/3 DT-PRP-T-IPV (líquido) ; CP_20/20/5/3Dt dado simultaneamente porém em local diferente de PRP-T; ou a vacina de controle, DPT-pólio de

31/120 célula integral utilizada para reconstituir PRP-T (ΡΕΝΤΑ™) .

Todas as vacinas de estudo foram bem toleradas. Nenhuma diferença significativa em taxas de reação foi vista entre os dois tipos de combinações de coqueluche recombinantes. As crianças que receberam CP_20/20/5/3DT-mIPV combinado utilizado para reconstituir PRP-T tinham taxas ligeiramente mais elevadas de reações locais em comparação

	com os mesmos produtos administrados em locais diferentes.
0	Todas	as combinações	de coqueluche	de	componente tinham
	taxas	compativelmente	mais baixas	de	reações local e

sistêmica do que a combinação de célula integral. As diferenças em taxas de reação entre vacinas de coqueluche de componente e célula integral foram mais evidentes nas 24 15 horas imediatamente após vacinação.

As duas combinações de coqueluche de componente produziram respostas excelentes a todos os antígenos. Em todas as situações, respostas de PT, FHA e pertactina de coqueluche foram superiores a respostas vistas para 20 combinações de célula integral. Nenhuma diferença significativa foi vista entre combinações de componente e célula integral. Nenhuma diferença significativa foi vista entre formulações de componente e célula integral para anti-PRP, difteria e pólios 1 e 2. As duas formulações de 25 coqueluche de componente produziram respostas de tétano mais elevadas do que ΡΕΝΤΑ™. As duas formulações de componente produziram respostas sorológicas similares a todos os antígenos exceto pólio 3, para o qual CP_20/20/5/3DT

32/120 mlPV utilizado para reconstituir PRP-T produziu respostas mais elevadas do que CP_20/20/s/3DT-PRP-T-IPV. O método de administração não afetou respostas sorológicas a quaisquer antígenos exceto tétano. Em grupos tanto combinados como separados, 100% das crianças foram protegidas (>0,l EU/ml) contra tétano após 3 doses de vacina.

Mais importante ainda, todos os grupos de vacina tiveram boas respostas a PRP-T com 98,3% de crianças obtendo níveis > 0,15 ug/ml e mais de 86,1% de crianças obtendo níveis >1,0 ug/ml. Estes dados são comparáveis com aqueles observados em estudos anteriores nos quais a vacina de coqueluche de célula integral foi utilizada com PRP-T.

As respostas sorológicas obtidas e descritas acima são mostradas nas Tabelas 5 a 7 (H = híbrido).

(II) Segurança e imunogenicidade de vacina de coqueluche de componente em combinação com toxóides de tétano e difteria e vacina de poliomielite inativada e adsorvida cultivadas em células MRC-5 (CP_20/20/s/3DT-mIPV) dadas separadamente de ou utilizadas para reconstituir vacina conjugada de toxóide de tétano de Haemophilus influenzae tipo b liofilizada (PRP-T) foram comparados com vacina de coqueluche de célula integral em combinação com toxóides de tétano e difteria e vacina de poliomielite inativada e adsorvida cultivada em células MRC-5 (DPT-pólio adsorvido) utilizado para reconstituir vacina conjugada de toxóide de tétano Haemophilus influenzae tipo b liofilizada (ΡΕΝΤΑ™) em crianças com 18 a 19 meses de idade.

Este estudo de cinco braços incluía um braço de A

33/120 controle ΡΕΝΤΑ™ de célula integral e - CE_20/Wi/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T. O quinto grupo recebeu

CP20/20/5/3DT-mlPV simultaneamente porém em um local diferente de PRP-T. Quatrocentos e oitenta e nove pessoas receberam vacina com 18-19 meses de idade das quais 466 (95%) completaram o estudo de acordo com o protocolo. CP_20/20/s/3DTmlPV utilizado para reconstituir

PRP-T era significativamente menos reatogênico do que ΡΕΝΤΑ™ particularmente nas primeiras horas após vacinação. 0 x0 produto reconstituído teve taxas ligeiramente mais elevadas de reações locais do que o produto separadamente administrado.

ΡΕΝΤΑ™ produziu respostas de pólio 1 mais elevadas do que CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T.

Nenhuma diferença significativa foi vista para anti-PRP, difteria, aglutinina de coqueluche, fimbrias, pólio 2 ou pólio 3. CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T produziu respostas sorológicas de coqueluche PT, FHA e pertactina. CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir

PRP-T produziu respostas sorológicas compatíveis com todos os antígenos testados. Nenhuma diferença significativa foi vista entre CP_20/20/s/3DT-mIPV dado separadamente versus utilizado para reconstituir PRP-T exceto com antitoxina de tétano (6,78 vs 4,91 EU/ml).

Este estudo demonstrou que CP_20/20/s/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T produziu respostas sorológicas compatíveis em três lotes e......foi.........mais.....“ímühõgêrTícõ^dõ que

ΡΕΝΤΑ™ para respostas de coqueluche. CP_20/20/s/3DT-mIPV também

34/120 produziu taxas significativamente mais baixas de reações locais e sistêmicas do que PENTA™.

(III) A segurança e imunogenicidade de vacina de coqueluche de componente combinada com toxóides de tétano e difteria adsorvidos e vacina de poliomielite inativada cultivada em células

MRC-5 (^<“^P20/20/5/3^'^P HlIPV) foram comparados com vacina de coqueluche de célula integral em com toxóides de tétano e difteria adsorvidos e vacina de poliomielite inativa cultivada em células MRC-5

J.0 (DPT-pólio adsorvido) em crianças com 4 a 6 anos de idades.

Cento e sessenta e quatro pessoas foram alocadas aleatoriamente em uma

CP_20/20/5/3DT-mIPV (n+131) adverso significativo *~'^P20/20/5/3^P*'^P—ml PV razão de ou DPT-pólio ou grave para (n=33) ocorreu para receber

Nenhum evento no estudo.

teve taxas compativelmente mais baixas de período de 0 a local como sistêmica particularmente no os dois grupos com 97% de DPT-pólio e

76,9% de receptores de

CP_20/20/5/3DT-mIPV. tendo alguma reação local no período de 0 a horas.

C^p2o/2o/s/3^DT-^mPIV eram normalmente brandas ou moderadas.

Em contraste, mais da metade de receptores classificadas como de DPT-pólio graves. Sensibilidade de local vermelhidão ou inchaço tendeu a persistir bem no período de de a 72 horas.

a 24 horas eram desapareceu em 72 horas porém a

menos comuns em receptores CP_20/20/5/3DT-mIPV (38,5%) do que

35/120 em receptores DPT-pólio (90,9%). Reações sistêmicas no período de 24-72 horas foram incomuns para os dois grupos.

As respostas de difteria, tétano, pólio 2 e 3 foram comparáveis entre as duas vacinas. Os receptores de DPT5 pólio tiveram uma resposta de pólio 1 significativamente mais elevada (15.462) do que os receptores de

0^20/20/5/3^xO mlPV (10.903). Todas as pessoas tiveram respostas e seriam consideradas protegidas respectivas doenças. Respostas sorológicas a excelentes contra as todos os antígenos de coqueluche eram significativamente mais elevadas em receptores de CP_20/20/s/3DT-mIPV.

(IV) A segurança e imunogenicidade de vacina de coqueluche difteria e de tétano componente em combinação com toxóides de tétano adsorvidos, vacina conjugada de toxóide

Haemophilus influenzae tipo b e vacina de poliomielite inativada cultivada em células MRC-5 (CP_20/20/5/₃DT-PRP-T-mIPV) foram comparadas com vacina de com toxóides de difteria e tétano adsorvidos e vacina de poliomielite inativada cultivada em células MRC-5 (DPT-pólio adsorvido) utilizado para reconstituir vacina conjugada de toxóide de tétano Haemophilus influenzae tipo b liofilizada (ΡΕΝΤΑ™) ou vacina de coqueluche de componente em combinação com toxóides de tétano e difteria adsorvidos e vacina de poliomielite inativada cultivada em células MRC-5 (CP_20/20/5/3DT-mIPV) utilizadas para reconstituir vacina conjugada de toxóide de tétano Haemophilus influenzae tipo b liofilizada (PRP-T) em crianças com 18 a 19 meses de ί

36/120 idade.

A finalidade deste estudo cego, único, controlado randomizado de três braços foi avaliar a segurança e imunogenicidade das duas combinações de coqueluche acelulares novas, CP₂ ο/20/5/3-DT PRP T IPV e CP_20/20/5/3DT mlPV utilizadas para reconstituir PRP-T, com ΡΕΝΤΑ™ (pólio DPT de coqueluche de célula integral utilizado para reconstituir PRP-T) em crianças de 18 a 19 meses de idade. Um total de 99 crianças; 33 em cada um dos três grupos de x0 vacina participou, das quais 97 (98%) completaram o estudo de acordo com o protocolo.

Nenhuma reação grave foi observada neste estudo. Receptores ΡΕΝΤΑ™ era significativamente mais provável de experimentar reações locais e sistêmicas moderadas ou 15 graves do que receptores das duas outras vacinas. As diferenças foram mais acentuadas em 24 horas e atingiram importância estatística por febre, vermelhidão, inchaço, sensibilidade, rebuliço, atividade reduzida e comer menos. As reações tenderam a ser brandas em crianças que receberam 20 combinações de coqueluche de componente. Nenhuma diferença significativa em taxas de reação foi vista entre as duas formulações de coqueluche de componente embora rebuliço fosse visto mais frequentemente em 24 horas naqueles recebendo CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T 25 vs CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (18% vs 3%) .

Respostas sorológicas foram satisfatórias com 100% de participantes obtendo níveis considerados de proteção para antitoxina de difteria (> 0,01 IU/ml), antitoxina de tétano

37/120 (> 0,01 IU/ml) e anti PRP (> 1,0 ug/ml) . Anticorpos de neutralização detectáveis a pólio tipos 1, 2 e 3 foram vistos em todos os participantes após imunização.

As respostas de difteria foram mais elevadas em receptores ΡΕΝΤΑ™ refletindo o teor mais elevado de antígeno desta vacina (25 Lf vs 15 Lf).

Anticorpos de coqueluche foram compativelmente mais elevados nas duas combinações de coqueluche de componente versus ΡΕΝΤΑ™ atingindo importância estatística para respostas GMT anti-PT, anti-FHA e anti-pertactina. Anticorpos de aglutinação de coqueluche e anti-fimbrial também foram mais elevados em receptores de coqueluche de componente embora as diferenças não atingissem importância estatística.

Em resumo, este estudo mostrou que as duas combinações de coqueluche acelulares CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizadas para reconstituir PFP-T e CP_20/20/5/3DT-PRP-T-IPV foram comparáveis e produziram taxas de reação satisfatoriamente baixas e elevadas respostas sorológicas quando dadas como um reforço para crianças com 18 a 19 meses de idade.

(V) A segurança e imunogenicidade de vacina de coqueluche de componente em combinação com difteria e toxóide de tétano adsorvido (CP_20/20/s/3DT) individualmente ou em combinação com um ou dois poliovírus inativados, um mlPV, cultivado em células MRC-5 e o outro vIPV cultivado em células vero, ou vacina de poliomielite oral (OPV) em crianças com 17 a 19 meses de idade.

Este estudo de cinco braços foi designado para

38/120 examinar a

CP20/20/5/3DT θ dois

IPVs (cultivados em células Vero ou em células MRC-5). Os dois

IPVs foram combinados como um produto líquido único com

CP_20/20/5/3DT-mIPV e CP_20/20/s/3DT-vIPV ou dados simultaneamente porém em um local de injeção separado (CP_20/20/5/3DT+mIPV e CP_20/20/5/3DT+vIPV) ^Um quinto grupo de estudo recebeu ^CP2o/2o/5/3^{DT e} OPV simultaneamente. Todas as pessoas receberam PRP-T na tirada de sangue após imunização. Respostas anti-PRP não foram avaliadas neste estudo.

□.0

PROJETO DE ESTUDO

Número	Visita 1 (17-19 meses)	Visita 2 (+1 mês)
85	1· CP20/20/s/3DT-mIPV (1 inj eção)	PRP-T
85	2. CP2O/2o/5/3DT+mI PV (2 injeções)	PRP-T
85	3· CP20/20/s/3DT-vIPV (1 inj eção)	PRP-T
85	4- CP20/20/s/3DT+vIPV (2 inj eções)	PRP-T
85	5- CP20/20/5/3DT+OPV (1 inj eção)	PRP-T

Em geral, não houve diferença nas taxas de reações adversas reportadas após as vacinas de poliomielite inativadas derivadas de célula vero ou MRC-5,quer a vacina tenha sido dada como......umainjeção........separada ou combinada com a vacina CP_20/20/5/3DT (Híbrido) .

.....Nenhuma diferença significativa foi vista entre grupos para PT, FHA e pertactina. As respostas em crianças que

39/120 recebem CP_20/20/5/3DT (Híbrido) e OPV foram ligeiramente porém não significativamente mais elevadas do que em crianças recebendo CP_20/20/5/3DT (Híbrido) e IPV de célula Vero para FIM, aglutinina de coqueluche, difteria e tétano. As 5 respostas de pólio eram geralmente comparáveis ou mais elevadas em crianças recebendo um IPV versus uma vacina OPV. Todos exceto um indivíduo tiveram aglutinina de coqueluche > 1:64. Todos exceto um indivíduo atingiram níveis de antitoxina de difteria > 0,1 U/ml e todos x-0 atingiram níveis de antitoxina de tétano > 0,1 EU/ml.

Os resultados deste estudo demonstraram que CP_20/20/s/3DT (Híbrido) em combinação com IPV (quer célula Vero ou MRC-5) é seguro e imunogênico em crianças de 17 a 19 meses de idade. As vacinas de combinação eram pelo menos tão 15 imunogênicas quanto a vacina dada como injeções separadas e em alguns casos mais imunogênica. A combinação da vacina como uma injeção única não foi associada a um aumento significativo em reações adversas locais. Nenhuma diferença substancial foi detectada nas reações adversas ou resposta 20 imune às duas preparações de IPV quer como injeções separadas ou produtos combinados. A inclusão de IPV não aumentou a taxa de reações adversas em comparação com CP_20/20/s/3DT (Híbrido) fornecido individualmente (isto é, com OPV) .

Os resultados sorológicos obtidos no estudo são resumidos na Tabela 8 (H = híbrido).

(VI) A segurança e imunogenicidade de vacinas de coqueluche de componente em combinação com toxóides de

40/120 χΟ tétano e difteria adsorvidos (CP_20/20/5/3DT e CP 10/10/5/3DT) individualmente ou em combinação com vacina conjugada Haemophilus influenzae tipo b foram determinados em crianças de 17 a 19 meses de idade.

O estudo de seis braços foi designado para examinar a interação entre formulações de coqueluche de componente tanto clássico (CP _10/10/s/₃DT) como Híbrido (CP 20/20/5/3DT) e Vacina conjugada de Haemophilus influenzae tipo B (PRP-T) em crianças de 18 a 19 meses de idade.

Três programas foram utilizados, nos quais (a) cada uma das vacinas de coqueluche de componente foi utilizada para reconstituir PRP-T, (b) dados simultaneamente porém em um local separado de PRP-T ou (c) PRP-T foi dado 1 mês após a vacina de coqueluche de componente. Todas as crianças receberam OPV na primeira visita e foram providas com a mesma vacina de coqueluche de componente com 2, 4 e 6 meses de idade. Todas as crianças tinha participado previamente no grande estudo de segurança destas duas formulações de vacina.

Um total de 545 pessoas foi registrado no éstudo dos

542

completaram

PROJETO DE ESTUDO

NUMERO	VISITA 1 (17-19 meses)		VISITA 2 (+1 mês)	VISITA 3 (+2 meses)
154	1 · CP2O/2o/5/3DT utilizado para reconstituir PRP-T		sangue

41/120

152	(-^20/20/5/3-^11 dado simultaneamente com PRP-T OPV	SANGUE + OPV	sangue
159	(-^20/20/5/3-^11		PRP-T	sangue
27	(-^10/5/5/3^1 utilizado para reconstituir PRP-T		sangue
29	cpio/5/5/3DT dado simultaneamente com PRP-T	SANGUE + OPV	sangue
21	CP10/5/5/3DT		PRP-T	sangue

Respostas sorológicas foram geralmente mais elevadas

	para a	maioria dos antígenos quando	uma	vacina de
	combinação de	coqueluche de	componente e	PRP-T	foram dados
	no mesmo	dia	em comparação	com em dias	separados (Tabela
5	9) ·
	De	modo	importante,	respostas anti-PRP	não foram

diminuídas quando PRP-T foi dado separadamente versus combinado com uma vacina de combinação de coqueluche de componente no mesmo dia. GMTs após imunização em crianças 10 que receberam as vacinas em dias separados foram significativamente mais baixos. As diferenças em respostas anti-PRP entre injeções combinadas e separadas foram vistas quando as pessoas foram estratifiçadas por formulação de vacina de coqueluche de componente. Receptores de 15 ^CP2o/2o/5/3^DT (Híbrido) demonstraram níveis anti-PRP inferiores quando a vacina foi dada combinada ao invés de

42/120 separadamente. Estas diferenças não eram vistas com os receptores de CP_10/s/5/3DT e as diferenças desapareceram quando os grupos foram combinados. Todos os participantes atingiram níveis anti-PRP > 0,15 ug/ml e mais de 98% de cada grupo tinha nível > 1,0 ug/ml. Apenas quatro participantes (0,7%) no estudo falharam em obter este nível; três nas injeções separadas em dias separados e um no grupo de injeção combinada. Mais de 82% de cada grupo excedeu títulos de 10 ug/ml de anticorpo anti-PRP.

Das reações locais causadas, apenas sensibilidade foi relatada mais freqüentemente no grupo combinado (27,8%) comparado com o grupo de vacinação de dia separado (16,7%). Esta taxa não foi diferente daquela vista no grupo que recebeu vacinas no mesmo dia que injeções separadas 15 (24,2%).

No geral, uma reação sistêmica foi reportada com freqüência similar (60 a 62,1%) em participantes de cada um dos grupos de vacina. Febre foi reportada em aproximadamente um terço dos participantes. Apenas agitação 20 foi reportado mais comumente no grupo de injeção combinada (33,3%) em comparação com os grupos de injeção separada (22,0%) ou de dia separado (22,8%).

Para resumir os resultados deste experimento, a administração simultânea de CP_10/5/5/3DT ou CP_2O/2o/5/3^{DT e} PRP-T 25 no mesmo dia não interferiu com respostas anti-PRP porém pode na realidade ter aumentado as mesmas. Respostas sorológicas a outros antígenos também foram excelentes. Tétano foi o único antígeno afetado quando as duas vacinas

43/120 tf foram misturadas juntas porém todas as crianças tiveram altos níveis de proteção.

Para os experimentos clínicos mencionados por último CP_10/s/s/3DT-IPV cultivado em células MRC5 para reconstituição com ActHib (PRP-T) e A5I (CP_10/5/5/3DT-PRP-T-IPV cultivado em células Vero 3 ug/ml) foram preparadas. Antígenos de coqueluche componente foram individualmente adsorvidos em fosfato de alumínio 3 mg/ml na ausência de conservador. A este respeito, PT estavam em 10 mM de fosfato de potássio, xO 0,15M NaCl, 5% de glicerol, FHA estava em 10 mM de fosfato de potássio, 0,5M de NaCl, 69K estava em 10 mM de fosfato de potássio, 0,15M de NaCl, e fímbrias estavam em 10 mM de fosfato de potássio, 0,15M NaCl. D foi absorvido em fosfato de alumínio (6,25 mg/ml) a uma concentração de 300 Lf/ml.

2-fenoxietanol é adicionado como conservador a 0,6%. T foi adsorvido em fosfato de alumínio (6,25 mg/ml) a uma concentração de 300Lf/ml. 2-fenoxietanol é adicionado a

0,6%.

Os antígenos de coqueluche de componente adsorvido

0 foram combinados com D adsorvido e T adsorvido a uma concentração de 3,65 doses/ml ou 55% do volume final. 0 teor de 2-fenoxietanol foi de 0,6%. Antes da combinação com mlPV ou v-IPV/PRP-T, esterilizada, teor de alumínio e teor de 2-fenoxietanol foram confirmados. Para 5ml, m-IPV e 225 fenoxietanol foram adicionados e diluídos até a resistência final. Para A5I, v-IPV, PRP-T e 2-fenoxietanol foram adicionados e diluídos até a resistência final.

Em resumo dos resultados de experimento clínico com

44/120 vacinas multivalentes, pode ser visto que CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T produz respostas sorológicas comparáveis a difteria, tétano e pólios 1, 2 e 3 em comparação com ΡΕΝΤΑ™ (contendo vacina de coqueluche 5 de célula integral). Respostas anti-PRP são comparáveis ou mais elevadas do que aquelas observadas com ΡΕΝΤΑ™ em doses tanto de bebê como de reforço. Respostas de tétano são mais baixas do que CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T quando comparado com CP_20/20/s/3DT-mIPV 10 dado separadamente de PRP-T, porém esta redução não é clinicamente relevante. Compatível com outros estudos, a vacina de célula integral produz respostas de aglutinina e fímbria comparáveis ou mais elevadas do que vacina de coqueluche componente, contudo, a vacina de célula integral 15 utilizada é conhecida como contendo um componente fimbrial altamente imunogênico. Todas as outras respostas de coqueluche eram compativelmente mais elevadas com

CP_20/20/5/3DT-mIPV utilizado para reconstituir PRP-T do que com ΡΕΝΤΑ™. Desse modo, a presente invenção fornece 20 composições imunogênicas multi-valentes nas quais as respostas imunes aos antígenos não são diminuídas ou prejudicadas pelos outros componentes ou por sua inclusão na vacina multivalente. Respostas imunes diminuídas são às vezes mencionadas como interferência.

Preparação e Uso da Vacina

Desse modo, composições imunogênicas, adequadas para serem utilizadas como vacinas, podem ser preparadas dos imunógenos como aqui revelado. A vacina causa uma resposta

45/120 imune em uma pessoa que produz anticorpos.

Composições imunogênicas incluindo vacinas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou emulsões. Os imunógenos podem ser misturados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são compatíveis com os imunógenos. Tais excipientes podem incluir água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, e suas combinações. As composições imunogênicas e vacinas podem conter ainda substâncias auxiliares, como agentes de 10 umedecimento ou emulsificante, agentes de tamponamento de pH, ou adjuvantes para aumentar a eficácia dos mesmos. Composições imunogênicas e vacinas podem ser administradas parenteralmente, por injeção subcutaneamente ou intramuscularmente. As preparações imunogênicas e vacinas 15 são administradas em um modo compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade como será terapeuticamente eficaz, imunogênico e protetor. A quantidade a ser administrada depende da pessoa a ser tratada, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imune da pessoa 20 sintetizar anticorpos, e se necessário, produzir uma resposta imune mediada por célula. Quantidades precisas de ingrediente ativo necessário ser administrado dependem da decisão do médico. Contudo, faixas de dosagem adequadas são facilmente determinadas por uma pessoa versada no estado da 25 técnica e podem ser da ordem de microgramas dos imunógenos.

Regimes adequados para administração inicial e doses de reforço também são variáveis, porém podem incluir uma administração inicial seguida por administrações

46/120 subsequentes. A dosagem também pode depender da via de administração e variará de acordo com o tamanho do hospedeiro.

imunógenos em uma imunogênica de acordo com a invenção é em geral aproximadamente 1 a aproximadamente 95%. A imunogenicidade pode ser aperfeiçoada de forma significativa se os antígenos forem co-administrados com adjuvantes, comumente utilizados como 0,005 a 0,5 por cento de solução em solução 10 salina tamponada com fosfato. Os adjuvantes aumentam a imunogenicidade de um antígeno porém não são necessariamente imunogênicos eles próprios. Os adjuvantes podem atuar retendo o antígeno localmente próximo ao local de administração para produzir um efeito de depósito 15 facilitando uma liberação lenta e contínua de antígeno para células do sistema imune. Os adjuvantes também podem atrair células do sistema imune para um depósito de antígeno e estimular tais células a causar respostas imunes.

Os agentes imunoestimuladores ou adjuvantes têm sido utilizados há muitos anos para aperfeiçoar as respostas imunes hospedeiras, por exemplo, a vacinas. Adjuvantes intrínsecos, como lipopolissacarídeos, são normalmente os componentes das bactérias exterminadas ou atenuadas utilizadas como vacinas. Adjuvantes extrínsecos são 25 imunomoduladores que são tipicamente não covalentemente ligados a antígenos e são formulados para aumentar as respostas imunes do hospedeiro. Desse modo, adjuvantes têm sido identificados que aumentam a resposta imune a /

47/120 t» antígenos fornecidos parenteralmente. Alguns destes adjuvantes são tóxicos, contudo, e podem causar efeitos colaterais indesej áveis, tornando os mesmos inadequados para uso em seres humanos e muitos animais. Realmente, 5 apenas hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio (coletivamente mencionados comumente como alume) são rotineiramente utilizados como adjuvantes em vacinas para seres humanos e veterinárias. A eficácia de alume em aumentar as respostas de anticorpo aos toxóides de tétano e r0 difteria é bem estabelecida.

Uma ampla faixa de adjuvantes extrínsecos pode provocar respostas imunes potentes a antígenos. Estas incluem saponinas complexadas com antígenos de proteína de membrana (complexos de estimulação imune), polímeros 15 plurônicos com óleo mineral, microbactérias exterminadas em óleo mineral, adjuvante completo de Freund, produtos bacterianos, como dipeptídeo de muramila (MDP) e lipopolissacarídeo (LPS), bem como lipídeo A, e lipossomas.

Para induzir de forma eficiente, respostas imunes humorais (HIR) e imunidade mediada por célula (CMI), os imunógenos são frequentemente emulsifiçados em adjuvantes. Muitos adjuvantes são tóxicos, induzindo granulomas, inflamações agudas e crônicas (adjuvante completo de Freund, FCA), citólise (saponinas e polímeros Plurônicos), 25 e pirogenicidade, artrite e uveíte anterior (LPS e MDP) .

Embora FCA seja um excelente adjuvante e amplamente utilizado em pesquisa, não é licenciado para uso em vacinas humanas ou veterinárias devido a sua toxicidade.

48/120

Características desejáveis de adjuvantes ideais incluem:

1) ausência de toxicidade;

2) capacidade de estimular uma resposta imune de longa duração;

3) simplicidade de fabricação e estabilidade em armazenagem de longa duração;

4) capacidade de causar tanto CMI como HIR a antígenos administrados por várias ias;

5) sinergia com outros adjuvantes;

6) capacidade de interagir seletivamente com populações de células apresentando antígeno (APC);

7) capacidade de causar especificamente respostas imunes específicas de célula T_H1 ou T_H2 apropriadas; e

8) capacidade de aumentar seletivamente níveis de isotipo de anticorpo apropriados (por exemplo, IgA) contra antígenos.

A patente norte-americana 4.855.283 concedida a Lockhoff e outros em 8 de agosto de 1989 que é aqui incorporada mediante referência à mesma revela análogos de glicolipídeo incluindo N-glicosilamidas, N-glicosiluréias e N-glicosilcarbamatos, cada um dos quais é substituído no resíduo de açúcar por um aminoácido, como imunomoduladores ou adjuvantes. Desse modo, Lockhoff e outros (patente norte-americana 4.855.283) reportaram que análogos de Nglicolipídeo exibindo similaridades estruturais aos glicolipídeos de ocorrência natural, como glicosfingolipídeos e glicoglicerolipídeos, são capazes de

49/120 causar respostas imunes fortes tanto em vacina de vírus de herpes simples como vacina de vírus de pseudo-raiva.

Alguns glicolipídeos foram sintetizados de alquilaminas cadeia longa e ácidos graxos que são ligados diretamente 5 com os açúcares através do átomo de carbono anomérico, para imitar as funções dos resíduos de lipídeo de ocorrência natural.

A patente norte-americana

4.258.029 concedida a ±0

Moloney, cedida ã cessionária incorporada hidrocloreto um adjuvante da presente e aqui mediante referência de tirosina de octadecila quando complexado vacina de vírus de poliomielite mesma, revela que (OTH) funciona como com toxóide tipo I, II e de

III tétano e inativada por formalina.

Além disso,

Nixon-George e outros, reportaram que ésteres de octodecila de aminoácidos aromáticos hepatite B hospedeiro complexados com um antígeno superficial de recombinante, aumentaram as respostas imunes do contra vírus de hepatite B.

EXEMPLOS

A revelação acima descreve, genericamente, a presente invenção. Um entendimento mais completo pode ser obtido mediante referência aos seguintes Exemplos específicos. Estes exemplos são descritos unicamente para fins de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da invenção.

Mudanças em forma e substituição de equivalentes são consideradas conforme as circunstâncias possam sugerir ou tornar apropriado. Embora termos específicos tenham sido aqui empregados, tais termos são destinados em um sentido

50/120 χθ descritivo e não para fins de limitação.

Os métodos de bioquímica de proteína, fermentação e imunologia utilizados porém não explicitamente descritos nesta revelação e estes Exemplos são amplamente reportados na literatura científica e estão compreendidos na capacidade daqueles versados no estado da técnica.

Exemplo 1: '

Este exemplo descreve, o crescimento de Bordetella pertussis.

Semente mestre:

Culturas de semente mestre de uma cepa de Bordetella pertussis foram mantidas como lotes de semente secas por congelamento, a 2°C até 8°C.

Semente de trabalho:

A cultura seca por congelamento foi recuperada em meio

Hornibrook e utilizada para semear placas de Agar BordetGengou (BGA). O meio Hornibrook tem a seguinte composição:

Componente	para 1 litro
hidrolisado de caseína (tratado com carvão)	10,0 g
ácido nicotinico	0,001 g
cloreto de cálcio	0,002 g
cloreto de sódio	5,05
hexaidrato cloreto de magnésio	0,025 g
cloreto de potássio	0,200 g
fosfato de potássio dibásico	0,250 g
amido	1,0 g
água destilada	até 1,0 litro

51/120

O pH é ajustado para 6,9 ± 0,1 com solução de carbonato de esterilizado sódio a 1%. 0 meio é dispensado em tubos e por formação de vapor na autoclave por 2 0 minutos e colocando em autoclave por 20 minutos a 121°C até

124°C. A semente foi subcultivada duas vezes, em placas BGA a seguir em Agar de Coqueluche (CPA) . 0 Ágar de Coqueluche de Componente seguinte composição:

NaCl	2,5 g/L
KH2PO4	0,5 g/L
KC1	0,2 g/L
MgCl2 (H20)6	0,1 g/L
base Tris	1,5 g/L
ácidos casamino	10,0 g/L
NaH Glutamato	10,0 g/L
HC1 conc.	até pH 7,2
ágar	15,0 g/L
fatores de crescimento
(CPGF)	10,0 ml/L
Os fatores de crescimento de coqueluche
(CPGF) - 100X tem a seguinte	composição:
L-cisteína HC1	4,0 g/L
niacina	0,4 g/L
ácido ascórbico	40,0 g/L
glutationa, reduzida	15,0 g/L
Fe2SO4, (H20)7	1,0 g/L
dimetila-B-ciclodextrina	100 g/L
CaCl2 (H20)2	2,0 g/L

de componente primeiramente de Componente (CPA) tem a

52/120

A cultura final foi suspensa em Tampão de Suspensão de semente de Coqueluche (CPSB), dispensada em alíquotas de 2 a 4 ml e armazenada congelada a -60°C até -85°C. 0 Tampão de Suspensão de Semente de Coqueluche (PSSB) tem a seguinte composição:

ácidos casamino	10,0 g/L
base Tris	1,5 g/L
glicerol anidro	100 mL/L
HCl conc.	até pH 7,2

Estas suspensões de glicerol forneceram o material de partida para a preparação da semente de trabalho.

Processo de cultivo:

A propagação da semente de trabalho foi conduzida em garrafas Roux de Ágar de Coqueluche de componente por 4 a 7 dias a 34 °C até 38 °C. Após este cultivo, as células foram retiradas por lavagem do ágar com Caldo de Coqueluche de Componente (CPB). As amostras foram observadas por coloração Gram, em relação à pureza de cultura e opacidade.

As células foram transferidas para frascos cônicos de 4 litros contendo CPB e incubadas a 34 °C até 38°C por 20 a 26 horas com agitação. As amostras foram observadas por coloração Gram e a pureza de cultura foi checada. Os fracos foram agrupados e a suspensão foi utilizada para semear dois fermentadores contendo CPB (volume de 10 litros iniciando em OD₆₀₀ 0,1 - 0,4) . A semente foi crescida até um OD₆₀₀ final de 5,0 a 10,0. As amostras foram testadas por coloração Gram, em relação à pureza de cultura, por ELISAs específicos de antígeno e em relação ã esterilidade.

53/120

Este exemplo descreve a purificação de antígenos da cultura de célula de Bordetella pertussis.

Produção de concentrados de célula e caldo:

A suspensão bacteriana foi cultivada em dois f ermentadores de produção, a 34°C até 37°C por 35 a 50 horas. Os fermentadores foram amostrados para teste de esterilidade de meio. A suspensão foi alimentada para uma centrífuga de pilha de disco de fluxo contínuo (12.000 x g) para separar as células do caldo. As células foram coletadas para esperar extração de componente de fímbrias. O licor clarificado foi passado através de filtro de membrana < 0,22 um. O licor filtrado foi concentrado por ultra filtração utilizando uma membrana limite de peso molecular nominal (NMWL) de 10 a 3 0 kDa. O concentrado foi armazenado para esperar a separação e purificação dos componentes de Toxina de Coqueluche (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e 69 kDa (pertactina).

Separação dos componentes de caldo:

Os componentes do caldo (69 kDa, PT e FHA) foram separados e purificados por etapas de eluição seletiva e cromatografia de perlite, essencialmente como descrito patente da Organização Européia de Patentes no. 336 736 e o Pedido PCT publicado pelos depositantes, no. WO 91/15505, descrito acima. As operações de purificação específica efetuadas são descritas abaixo.

Toxina de Coqueluche (PT):

A coluna de perlite foi lavada com tampões de 50 mM

54/120

Tris, 50 mM Tris/ 0,5% Triton X-100 e 50 mM Tris. A fração PT foi eluída da coluna de pelite com tampão de 50 mM Tris/0,12M NaCl.

A fração de PT da cromatografia de perlite foi carregada sobre uma coluna de hidroxilapatite e a seguir lavada com tampão de 3 0 mM de fosfato de potássio. PT foi eluído com tampão de 75mM de fosfato de potássio/225 mM NaCl. A coluna foi lavada com 200mM de fosfato de potássio/0,6M NaCl para obter a fração de FHA que foi descartada. Glicerol foi adicionado ao PT purificado até 50% e a mistura foi armazenada a 2°C até 8°C até detoxificação, em uma semana.

Hemaglutinina filamentosa (FHA):

A fração de FHA foi eluída da coluna de perlite com

50mM Tris/0,6M NaCl. Hemaglutinina filamentosa foi purificada por cromatografia sobre hidroxilapatite. A fração de FHA da coluna de perlite foi carregada sobre uma coluna de hidroxilapatite a seguir lavada com 30 mM de fosfato de potássio contendo 0,5% Triton X-100, seguido por tampão de 30 mM de fosfato de potássio. A fração PT foi eluída com tampão de 85 mM de fosfato de potássio e descartada. A fração de FHA foi então eluída com 200 mM de

	fosfato de potássio/0,6M NaCl e armazenada a 2°C até 8°C até detoxificação em uma semana.
25	69 kDa (pertactina):
	0 concentrado de caldo foi diluído com água para
	injeção (WFI) para obter condutividade de 3 a 4 mS/cm e
	carregado sobre uma coluna de perlite em uma carga de 0,5 a

55/120

3,5 mg de proteína por ml de perlite. A passagem (Fração de componente de 69 kDa) foi concentrada por ultra-filtração utilizando uma membrana NMWL de 10 a 3 0 kDa. Sulfato de amônio foi adicionado ao concentrado de passagem até 35% ± 5 3% (peso/v) e a mistura resultante armazenada a 2°C até 8°C por 4 ± 2 dias ou centrifugado (7.000 x g) imediatamente. Sobrenadante em excesso foi decantado e o precipitado coletado por centrifugação (7.000x g) . A pelota de 69 kDa foi armazenada congelada a -20°C até -30°C ou dissolvida em 10 tampão de fosfato ou Tris e utilizada imediatamente.

A proteína de membrana externa de 6 9 kDa obtida pela precipitação de sulfato de amônio a 35% (peso/v) de passagem de perlite concentrado foi utilizada para a purificação. Sulfato de amônio (100 ± 5 g por litro) foi 15 adicionada à fração de 69 kDa e a mistura agitada por pelo menos 2 horas a 2°C até 8°C. A mistura foi centrifugada (7.000 x g) para recuperar o sobrenadante. Sulfato de amônio (100 a 150 g por litro) foi adicionado ao sobrenadante e a mistura agitada por pelo menos 2 horas a 20 2°C até 8°C. A mistura foi centrifugada (7.000 x g) para recuperar a pelota, que foi dissolvida em 10 mM Tris, HCI, pH 8. A resistência iônica da solução foi ajustada ao equivalente de 10 mM Tris HCI (pH 8) , contendo 15 mM de sulfato de amônio.

A proteína de 69 kDa foi aplicada a uma coluna de hidroxilapatite conectada em tandem a uma coluna QSepharose. A proteína de 69 kDa foi coletada na passagem, foi lavada das colunas com 10 mM Tris, HCI (pH 8), contendo

56/120 ί

mM de sulfato de amônio e agrupada com proteína 69 kDa na passagem. O grupo de proteína 69 kDa foi diafiltrado com 6 a 10 volumes de 10 mM de fosfato de potássio (pH 8) , contendo 0,15M NaCI em uma membrana NMWL de 100 a 300 kDa.

0 ultra filtrado foi coletado e a proteína 69 kDa no ultra filtrado concentrado.

A proteína de 69 kDa foi permutada com solvente em 10 mM Tris HCl (pH8), e adsorvida sobre Q-Sepharose, lavada com 10 mM Tris HCl (pH 8)/5 mM de sulfato de amônio. A proteína de 69 kDa foi eluída com 50 mM de fosfato de potássio (pH 8). A proteína de 69 kDa foi diafiltrada com 6 a 10 volumes de 10 mM de fosfato de potássio (pH 8) contendo 0,15 M NaCI em uma membrana NMWL de 10 a 30 kDa. A proteína de 69 kDa foi filtrada esterilizada através de um filtro < 0,22 um. Este volume esterilizado foi armazenado a

2^o até 8°C e a adsorção foi realizada em três meses.

Aglutinógenos fimbriais:

Os aglutinógenos foram purificados da pasta de célula após a separação do caldo. A pasta de célula foi diluída até uma fração de 0,05 volume de células em um tampão contendo 10 mM de fosfato de potássio, 150mM NaCI e 4M de uréia e foi misturada por 30 minutos. 0 lisado de célula foi clarificado por centrifugação (12.000 x g) a seguir concentrado e diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio/150mM NaCl/0,1% Triton X-100 utilizando um filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa.

O concentrado foi tratado com aquecimento a 80°C por min. a seguir reclarifiçado por centrifugação (9.000 x

57/120

g) . PEG 8000 foi adicionado ao sobrenadante clarificado a uma concentração final de 4,5% ± 0,2% e agitado suavemente por um mínimo de 30 minutos. O precipitado resultante foi coletado por centrifugação (17.000 x g) e a pelota extraída com tampão de 10 mM de fosfato de potássio/150 mM NaCl para fornecer uma solução bruta de aglutinógeno fimbrial. Os aglutinógenos fimbriais foram purificados por passagem sobre sílica PEI. A solução bruta foi feita 100 mM com relação a fosfato de potássio utilizando tampão de 1M de fosfato de potássio e passada através da coluna de sílica PEI.

A passagem das colunas foi concentrada e diafiltrada contra tampão de 10 mM de fosfato de potássio/150mM de NaCl utilizando um filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa.

Este volume esterilizado é armazenado a 2°C até 8°C e a adsorção realizada em três meses. A preparação de aglutinógeno fimbrial continha Agg fimbrial 2 e Agg fimbrial 3 em uma razão de peso de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2:1 e foi verificada ser substancialmente isenta de Agg 1.

Exemplo 3: )

Este exemplo descreve a formação de toxóide dos antígenos de Bordetella pertussis purificados, PT e FHA.

PT, preparado em forma pura como descrito no exemplo

5 1, foi formado em toxóide pelo ajuste da concentração de glutaraldeído na solução PT até 0,5% ± 0,1% e incubando a 37°C ± 3°C por 4 horas. A reação foi parada pela adição de L-aspartato até 0,21 ± 0,02M. A mistura foi então mantida

58/120 em temperatura ambiente por 1 ± 0,1 horas e a seguir a 2°C até 8°C por 1 a 7 dias.

A mistura resultante foi diafiltrada contra tampão de mM de fosfato de potássio/0,15 M NaCl/5% de glicerol em um filtro de membrana NMWL de 3 0kDa e a seguir esterilizado por passagem através de um filtro de membrana < 0,22 um.

Este volume esterilizado foi armazenado a 2°C até 8°C e a adsorção realizada em três meses.

A fração de FHA, preparada em forma pura como descrito x0 no exemplo 2, foi formado em toxóide pelo ajuste da concentração de L-lisina e formaldeído até 47 ± 5mM e 0,24 ± 0,05% respectivamente e incubando a 35 °C até 38 °C por 6 semanas. A mistura foi então diafiltrada contra 10 mM de fosfato de potássio/0,5M NaCl utilizando um filtro de 15 membrana NMWL de 3 0 kDa e esterilizada pela passagem através de um filtro de membrana. Este volume esterilizado foi armazenado a 2°C até 8°C e a adsorção realizada em três meses.

Exemplo 4:

Este Exemplo descreve a

Bordetella pertussis purificados.

Para a adsorção individual de PT, FHA, Agg e 69 kDa sobre fosfato de alumínio (alume), uma solução de estoque de fosfato de alumínio foi preparada até uma concentração 25 de 18,75 ± 1 mg/ml. Um vaso adequado foi preparado e qualquer um dos antígenos assepticamente dispensado no vaso. 2 -fenoxietanol foi assepticamente adicionado para fornecer uma concentração final de 0,6% ± 0,1% v/v e

59/120 agitado até ficar homogêneo. O volume apropriado de fosfato de alumínio foi assepticamente adicionado ao vaso. Um volume apropriado de água destilada esterilizada foi adicionado para levar a concentração final até 3 mg de 5 fosfato de alumínio/ml. Os recipientes foram vedados e rotulados e deixados agitar em temperatura ambiente por 4 dias. O vaso foi então armazenado esperando formulação final.

Exemplo 5:

xO Este exemplo descreve á formulação de uma vacina de coqueluche de componente combinada com.......toxóides de tétano e difteria.

	Os antígenos B.	pertussis preparados como descrito nos
Exemplos	anteriores	foram formulados	com	toxóides	de
15	difteria	e tétano para fornecer vacinas	de	coqueluche	de

componente(CP) como descrito abaixo.

Os componentes de coqueluche foram produzidos de Bordetellã pertussis crescida em cultura submersa como descrito em detalhe nos Exemplos 1 a 4 acima. Após término 20 de crescimento, o caldo de cultura e as células bacterianas foram separadas por centrifugação. Cada antígeno foi purificado individualmente. Toxina de coqueluche (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA.) foram purificados do caldo por cromatografia sequencial sobre perlite e 25 hidroxilapatite. PT foi detoxifiçado com glutaraldeído e qualquer PT residual (aproximadamente 1%) presente na fração de FHA foi detoxifiçado com formaldeído.

Aglutinógenos fimbriais (2+3) (AGG) foram preparados das

60/120 células bacterianas. As células foram rompidas com uréia e tratadas a calor, e os aglutinógenos fimbriais foram purificados por precipitação com polietileno glicol e cromatografia sobre sílica de polietilenoimina. 0 componente de proteína de 69 kDa (pertactina) foi isolado da passagem da etapa de cromatografia de perlite (Exemplo 2) por precipitação de sulfato de amônio, e purificado por cromatografia seqüencial sobre hidroxilapatite e QSepharose. Todos os componentes foram esterilizados por 10 filtração através de um filtro de membrana de 0,22 um.

Toxóide de difteria foi preparado de Corynebacterium diphtheria e cultivada em cultura submersa por métodos produção de

Toxóide de

Difteria é dividido em cinco está.

gios a saber:

da semente crescimento de Corynebacterium diphtheriae, de trabalho, colheita da toxina de de Trabalho

A cepa de Corynebacterium diphtheriae foi mantida como um lote de semente seca por congelamento. A semente reconstitu ida horas a

35°C ± 2°C, e a seguir transferida para frascos de relação à pureza e teor de Lf. A semente restante foi utilizada para inocular um fermentador.

| (II) trescimento de Corynebacterium diphtheriae

61/120 fermentador. Quantidades predeterminadas de sulfato ferroso, cloreto de cálcio e soluções de fosfato foram adicionadas à cultura. As quantidades efetivas de cada solução (fosfato, sulfato ferroso, cloreto de cálcio) foram 5 determinadas experimentalmente para cada lote de meio. Os níveis escolhidos são aqueles que forneceram o teor mais

	elevado	de	Lf. Ao término	do	ciclo de crescimento	(30 a	50
	horas),	as	culturas foram	amostradas em relação à	pureza	e
	teor de	Lf.
10	0	pH	foi ajustado	com	bicarbonato de sódio, e	a

cultura inativada com 0,4% de tolueno por 1 hora em uma temperatura mantida de 35°C ± 2°C. Um teste de esterilidade foi então realizado para confirmar a ausência de C. diphtheriae vivo.

(III) Colheita de toxina de difteria

As culturas tratadas com tolueno de um ou vários fermentadores foram agrupadas em um grande tanque. Aproximadamente 0,12% de bicarbonato de sódio, 0,25% de carvão, e 23% de sulfato de amônio foram adicionados, e o 20 pH foi testado.

A mistura foi agitada por aproximadamente 30 minutos.

Terra diatomácea foi adicionada e a mistura bombeada para dentro de um filtro de profundidade. O filtrado foi recirculado até ficar claro, a seguir coletado, e amostrado para teste de teor de Lf. Sulfato de amônio adicional foi adicionado ao filtrado para fornecer uma concentração de 40%. Terra diatomácea também foi adicionada. Esta mistura foi mantida por 3 a 4 dias a 2°C a 8°C para permitir que o

62/120 precipitado assente. Toxina precipitada foi coletada e dissolvida em 0,9% de solução salina. A terra diatomácea foi removida por filtração e a toxina dialisada contra 0,9% de solução salina, para remover o sulfato de amônio. Toxina 5 dialisada foi agrupada e amostrada para teste de pureza e teor de Lf.

(IV) Detoxificação de toxina de difteria

	A	detoxificação ocorre imediatamente	após
	diálise. Para	detoxificação, a	toxina foi diluída de	modo
±0	que a solução	final continha:
	a) toxina de difteria	a 1000 ± 10% Lf/ml.

b) 0,5% de bicarbonato de sódio

c) 0,5% formalina

d) 0,9% peso/v de monohidrocloreto de L-lisina

A solução foi trazida até o volume com solução salina e o pH ajustado para 7,6 ± 0,1.

Toxóide foi filtrado através de chumaços de filtro de terra diatomácea e/ou um pré-filtro de membrana e filtro de membrana de 0,2 um para dentro do vaso de coleta e incubado 2 0 por 5 a 7 semanas a 34 °C. Uma amostra foi retirada para teste de toxicidade.

(V) Concentração de toxóide purificado

Os toxóides foram agrupados, a seguir concentrados por ultrafiltração, e coletados em um 25 recipiente adequado. As amostras foram tiradas para teste de pureza e teor de Lf. 0 conservador (2-fenoxietanol) foi adicionado para fornecer uma concentração final de 0,375% e o pH ajustado para 6,6 até 7,6.

63/120

O toxóide foi esterilizado por filtração através de um pré-filtro e um filtro de membrana de 0,2 um (ou equivalente) e coletado. O toxóide esterilizado foi então amostrado para irreversibilidade de teor Lf de toxóide, 5 teor de conservador, pureza (teor de nitrogênio), esterilidade e teste de toxicidade. 0 toxóide concentrado esterilizado foi armazenado a 2°C até 8°C até a formulação final.

Preparação de toxóide de tétano:

Toxóide de tétano (T) foi preparado de Clostridium tetani cultivado em cultura submersa.

A produção de Toxóide de tétano pode ser dividida em cinco estágios a saber: manutenção da semente de trabalho, crescimento de Clostridium tetani, colheita de Toxina de 15 tétano, detoxificação de toxina de tétano e purificação de toxóide de tétano.

(I) Semente de trabalho:

A cepa de Clostridium tetani utilizada na produção de toxina de tétano para a conversão em toxóide de 20 tétano foi mantida na forma liofilizada em um lote de semente. A semente foi inoculada em meio de tioglicolato e deixada crescer por aproximadamente 24 horas a 35°C ± 2°C. Uma amostra foi tirada para teste de pureza de cultura.

(II) Crescimento de Clostridium tetani

O meio de tétano foi dispensado em um fermentador, tratado com aquecimento e resfriamento. O fermentador foi então semeado e a cultura deixada crescer por 4 a 9 dias a 34°C ± 2°C. Uma amostra foi retirada para

64/120 verificação de pureza da cultura, e teste de teor de Lf.

(III) Colheita de toxina de tétano

A toxina foi separada por filtração através de chumaços de terra diatomácea de celulose, e a toxina 5 clarificada a seguir esterilizada por filtro utilizando filtros de membrana. As amostras foram tiradas para teste de esterilidade e teor Lf. A toxina foi concentrada por ultrafiltração, utilizando um tamanho de poro de 30.000 daltons.

1'0 (IV) Detoxificação de toxina de tétano

A toxina foi amostrada para teste de teor Lf antes da detoxificação. A toxina concentrada (475 a 525 Lf/ml) foi detoxifiçada pela adição de 0,5% peso/v de bicarbonato de sódio, 0,3% v/v formalina e 0,9% peso/v de 15 monohidrocloreto de L-lisina e trazida até o volume com solução salina. O pH foi ajustado até 7,5 ± 0,1 e a mistura incubada a 37°C por 20 a 30 dias. As amostras foram tiradas para teste de toxicidade e esterilidade.

(V) Purificação de toxóide

O toxóide concentrado foi esterilizado através de pré-filtros, seguido por filtros de membrana de 0,2 um. As amostras foram tiradas para teste de teor Lf e esterilidade.

A concentração ideal de sulfato de amônio foi baseada 25 em uma curva S de fracionamento determinada das amostras do toxóide. A primeira concentração foi adicionada ao toxóide (diluída até 1900-2100 Lf/ml). A mistura foi mantida por pelo menos 1 hora a 20°C até 25°C e o

65/120 sobrenadante coletado e o precipitado contendo a fração com elevado peso molecular, descartado.

Uma segunda concentração de sulfato de amônio foi adicionada ao sobrenadante para o segundo fracionamento remover as impurezas de baixo peso molecular. A mistura foi mantida por pelo menos 2 horas a 20 °C até 25 °C e a seguir podia ser mantida a 2°C até 8°C por um máximo de três dias. O precipitado, que representa o toxóide purificado, foi coletado por centrifugação e filtração.

Sulfato de amônio foi removido do toxóide purificado por diafiltração, utilizando membranas de ultrafiltração Amicon (ou equivalente) com PBS até que não se pôde detectar mais sulfato de amônio na solução de toxóide. O pH foi ajustado para 6,6 a 7,6, e 2-fenoxietanol adicionado para fornecer uma concentração final de 0,375%. 0 toxóide foi esterilizado por filtração de membrana, e as amostras são tiradas para teste (irreversibilidade de toxóide, teor Lf, pH, teor de conservador, pureza, esterilidade e toxicidade).

Formulação de vacina multivalente

Uma formulação de uma vacina de coqueluche de componente combinada com toxóides de tétano e difteria foi denominada CP_10/s/5/3DT (as vezes denominada CLÁSSICA) . Cada dose humana de 0,5 ml de CP_10/5/s/3DT foi formulada para conter:

ug de toxóide de coqueluche (PT) ug de hemaglutinina filamentosa (FHA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIMB)

66/120 ug de proteína de membrana externa de 69 kDa

Lf de toxóide de difteria

Lf de toxóide de tétano

1,5 mg de fosfato de alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol como conservador

Outra formulação de vacina de coqueluche de componente combinada com toxóides de tétano e difteria foi denominada CP_10/5/sDT (às vezes denominada HÍBRIDA) . Cada dose humana de 0,5 ml de CP_10/5/5DT foi formulada para conter:

r0 10 ug de toxóide de coqueluche (PT) ug de hemaglutinina filamentosa (FHA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIMB)

Lf de toxóide de difteria

Lf de toxóide de tétano

1,5 mg de fosfato de alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol como conservador

Outra formulação de vacina de Coqueluche de componente combinada com toxóides de tétano e difteria foi denominada CP_20/20/5/3DT. Cada dose humana de 0,5 ml de CP_20/20/5/3DT foi 20 formulada para conter:

ug de toxóide de coqueluche (PT) ug de hemaglutinina filamentosa (FHA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIMB) ug de proteína de membrana externa de 69 kDa

15 Lf de toxóide de difteria

Lf de toxóide de tétano

1,5 mg de fosfato de alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol como conservador

67/120 ν’

Uma formulação adicional de uma vacina de coqueluche de componente combinada com toxóides de difteria e tétano foi determinada CP_20/10/10/6DT. Cada dose humana de 0,5 ml de CP_20/10/10/6DT foi formulada para conter:

20 ug de toxóide de coqueluche (PT) ug de hemaglutinina filamentosa (FHA) ug de aglutinógenos fimbriais 2 e 3 (FIMB) ug de proteína de membrana externa de 69 kDa

Lf de toxóide de difteria

Lf de toxóide de tétano

1,5 mg de fosfato de alumínio

0,6% de 2-fenoxietanol como conservador

Exemplo 6:

Este exemplo descreve à, avaliação clínica de vacinas de Coqueluche acelulares de componente.

Estudos em adultos:

Estudos em adultos e crianças com idade de 16 a 2 0 meses indicaram que as vacinas de multi-componentes contendo aglutinógenos fimbriais são seguras e imunogênicas 20 (Tabela 2).

Um estudo clínico de Fase I foi realizado em crianças com 17 e 18 meses em Calgary, Alberta com a vacina de Coqueluche de cinco componentes (CP_10/5/5/3DT) e a reação adversa reportada. Trinta e três crianças receberam a 25 vacina e adicionalmente 35 receberam a mesma vacina sem o componente de proteína 69 kDa.

As reações locais foram raras. As reações adversas sistêmicas, consistindo principalmente de irritabilidade

68/120 estavam presentes aproximadamente na metade de participantes do estudo, independente de qual vacina foi dada. Aumentos significativos de anticorpo foram medidos para anti-PT, anti-FHA, aglutinógenos anti-fimbriais e anticorpos IgG anti-69 kDa, por imunoensaio de anzima e

CHO. Nenhuma diferença em resposta de anticorpo foi detectada em crianças que receberam os quatro componentes ((-P10/5/5DT) ou cinco componentes (CP_10/5/s/3DT) exceto no anticorpo anti-69 kDa.

As crianças que receberam a vacina de cinco componentes contendo a proteína 69 kDa tiveram um nível de anticorpo anti-69 kDa pós-imunização significativamente mais elevado.

Um estudo de resposta de dose foi feito com a vacina de 4 componentes em Winnipeg, Manitoba, Canadá. Duas formulações de vacina de componentes foram utilizadas: CP_10/5/5/3DT e CP_20/10/10/6DT. Uma vacina DPT de célula integral também foi incluída como controle.

Este estudo foi um estudo duplo-cego em 91, com bebês de 17 a 18 meses de idade na época de sua dose de reforço para coqueluche. Tanto CP_10/s/5/3DT como CP_20/10/10/6DT foram bem tolerados por estas crianças. Nenhuma diferença foi demonstrada no número de crianças que tiveram qualquer reação local, ou reações sistêmicas após qualquer uma das vacinas de componente. Em contraste, um número significativamente maior de crianças que receberam a vacina de célula integral tiveram reações locais e sistêmicas do que aquelas que receberam as vacinas de componente

69/120 (-^20/10/10/6^¹^ ·

Estudos em bebês:

Fase II:

Um estudo foi realizado utilizando a vacina CP_10/5/5/3DT em Calgary, Alberta, e British Columbia, Canadá. Neste estudo, 432 bebês receberam a vacina de coqueluche de componente ou a vacina de controle de célula integral DPT com 2, 4 e 6 meses de idade. A vacina CP_10/5/s/3DT foi bem tolerada por estes bebês. As reações locais eram menos 10 comuns com a vacina de componente do que a vacina de célula integral após cada dose.

Uma resposta de anticorpo significativa a todos os antígenos foi demonstrada após vacinação com a vacina de coqueluche de componente. Receptores da vacina de célula 15 integral tiveram uma resposta de anticorpo vigorosa a aglutinógenos fimbriais D e T. Em sete meses, 82% a 89% de recipientes de vacina de componente e 92% de receptores de vacina de célula integral tiveram um aumento de quatro vezes ou maior aumento em título de anticorpo para 20 aglutinógenos fimbriais. Em contraste, a resposta de anticorpo a FHA foi 75% a 78% em receptores. Um aumento de quatro vezes em anticorpo anti-69 kDa foi visto em 90% a 93% de vacinas de componente e 75% de receptores de célula integral. Um aumento de quatro vezes em anticorpo contra PT 25 por imunoensaio de enzima foi visto em 40% a 49% de vacinas de componente e 32% de vacinas de célula integral; um aumento de quatro vezes em anticorpo PT por neutralização CHO foi encontrado em 55% a 69% de vacinas de componente e

7Q/12Q

6% de vacinas de célula integral. (Tabela 2)

Fase IIB:

As vacinas CP_20/20/s/3DT e CP_10/10/5/3DT foram avaliadas em um estudo cego randomizado contra um controle D₁₅PT com um teor inferior de difteria de 15 Lf em comparação com uma formulação de 25 Lf de 100 bebês com 2, 4 e 6 meses de idade. Nenhuma diferença em taxas de reações adversas foi detectada entre as duas formulações de componentes; ambas foram significativamente menos reatogênico do que o 10 controle de célula integral. Títulos mais elevados de anticorpo contra PT por imunoensaio de enzima e neutralização de CHO e FHA foram obtidos em receptores da vacina CP_20/20/5/3DT com teor aumentado de antígeno. Com 7 meses, o título médio geométrico anti-FHA foi 95,0 em 15 receptores de CP_20/20/5/3DT, 45,2 em receptores CP_10/5/5/3DT foram apenas 8,9 em receptores D₁₅PT. Títulos anti-PT foram 133,3, 58,4 e 10,4 por imunoensaio e 82,4, 32,7 e 4,0 por neutralização CHO respectivamente (Tabela 2).

Este estudo demonstrou que a vacina de Coqueluche de 20 componente combinada com toxóides de difteria e tétano adsorvidos, com teor aumentado de antígeno, era segura e imunogênica em bebês e que o teor aumentado de antígeno aumentou a resposta imune aos antígenos preparados (PT e FHA) sem aumento em reatogenicidade.

NIAID, FASE II, Experimento comparativo nos Estados

Unidos da América.:

Um estudo de fase II foi realizado nos Estados Unidos sob os auspícios do National Institute of Allergy and

71/120

Infectious Diseases (NIAID) como um prelúdio para um experimento de eficácia em grande escala de vacinas de coqueluche acelulares. Uma vacina de coqueluche de componente da invenção em combinação com toxóides de tétano e difteria adsorvidos (CP_10/s/5/3DT) foi incluída naquele experimento juntamente com 12 outras vacinas acelulares e 2 vacinas de célula integral. Os resultados de segurança foram reportados em 137 crianças imunizadas com 2, 4 e 6 meses de idade com a vacina de componente CP₁₀ /5/5/3-DT ·

Como visto em estudos anteriores, a vacina de componente foi verificada ser segura, de baixa reatogenicidade e ser bem tolerada por vacinas.

Em 7 meses, anticorpo anti-PT, anticorpo anti-FHA, anticorpo anti-69 kDa e anticorpo de aglutinógenos anti15 fimbriais foram todos mais elevados do que ou equivalentes a níveis obtidos após as vacinas de célula integral (Tabela 2) . Um estudo cego duplo foi realizado no qual crianças foram aleatoriamente alocadas para receberem a formulação de vacina CP_20/20/5/3DT ou CP_10/5/5/3DT. Um total de 2 050 bebês 20 foram registrados nos Estados Unidos e no Canadá; 1961 bebês completaram o estudo. As duas formulações de vacina eram seguras, de baixa reatogenicidade e imunogênicas nestes bebês. Imunogenicidade foi avaliada em um subgrupo de 292. Um aumento de anticorpo foi causado para todos os 25 antígenos contidos na vacina pelas duas formulações de vacina. A formulação CP_20/20/5/3DT induziu títulos de anticorpo mais elevados contra FHA porém não PT. A formulação CP_10/5/5/3:

DT causou títulos mais elevados contra

72/120 fímbrias e títulos de aglutinógenos mais elevados.

Um estudo adicional de segurança e imunogenicidade foi conduzido na França. 0 projeto do estudo foi similar ao estudo norte-americano, descrito acima, exceto que as 5 vacinas foram administradas com 2, 3 e 4 meses de idade.

Reações locais e sistêmicas foram geralmente menores. No geral, a vacina foi bem aceita pelos participantes do estudo francês utilizando este regime de administração.

Experimento de eficácia controlado por placebo de duas 1'0 vacinas de coqueluche acelulares e de uma vacina de célula integral em 10.000 bebês

Após os resultados do experimento comparativo dos Estados Unidos da América de Fase II do NIAID, uma vacina acelular de dois componentes e uma de cinco componentes 15 foram selecionadas para um experimento de eficácia controlada por placebo, randomizado-duplo, controlado, em multi-centro. O experimento clínico foi realizado na

Suécia, onde há elevada incidência de coqueluche. A vacina _: de dois componentes continha gliceraldeído e PT inativado por formalina (25 ug), FHA tratada por formalina (25 ug) e toxóide de difteria 17 Lf e toxóide de tétano 10 Lf. A vacina de coqueluche de cinco componentes era CP_10/5/5/3DT.

Para o experimento, dez mil bebês, representando aproximadamente metade dos bebês deste grupo de idade na 25 Suécia, foram recrutados em 14 locais de estudo geograficamente definidos pelo uso de registro de nascimento.

As crianças nascidas em janeiro e fevereiro de 1992

73/120 foram randomizadas em um experimento de 3 braços. Após consentimento dos pais, dois terços dos bebês receberam uma das duas preparações de coqueluche difteria-tétano-acelular com dois, quatro e seis meses de idade. O grupo de controle 5 recebeu apenas DT. Em maio de 1992, uma vacina DTP de célula integral comercializada licenciada nos E.U.A. foi introduzida e as crianças nascidas de março até dezembro de 1992 foram randomizadas em um experimento de 4 braços. Após consentimento dos pais, três quartos dos bebês receberam 10 uma dentre três preparações de DTP com dois, quatro e seis meses de idade. O grupo de controle recebeu apenas DT.

Cada vacina foi administrada a aproximadamente 2.500 crianças. As vacinas foram administradas em três doses. A primeira dose foi dada com 2 meses de idade e não posterior 15 a 3 meses de idade. Doses subseqüentes foram dadas com intervalos de 8 semanas. As vacinas foram dadas por injeção intramuscular.

As crianças e seus lares foram acompanhados por 30 meses. Caso houvesse suspeita de coqueluche, dados clínicos 20 eram coletados, e a verificação laboratorial procurada por aspirados nasais para cultura bacteriológica e diagnóstico de reação de cadeia de polimerase (PCR). Amostras de sangue de pacientes em estado agudo e convalescente foram coletadas para diagnóstico sorológico.

Antes deste estudo, a extensão de pertactina proporcionada por vacinas de coqueluche de componente da presente invenção em uma população humana em risco (particularmente neonatos) era desconhecida. Em particular, ·» ·.>

a contribuição dos vários componentes de Bordeteilá é sua presença em vacinas de coqueluche em quantidades relativas selecionadas para eficácia das vacinas não era conhecida.

O principal objetivo do experimento foi calcular a capacidade das vacinas de coqueluche acelulares e vacina de célula integral em proteger contra coqueluche típica como comparado com placebo.

Um ponto final secundário foi explorar a eficácia da vacina contra infecção confirmada de coqueluche de gravidade variada.

A eficácia da vacina é definida como a redução em percentagem na probabilidade de contrair coqueluche dentre os receptores de vacina em relação às crianças não vacinadas.

risco relativo de coqueluche em dois grupos de vacina é expresso como a razão da probabilidade de doença nos dois grupos.

A probabilidade de contrair coqueluche, também chamada a taxa de ataque, pode ser calculada em diferentes modos. Nos cálculos do tamanho de amostra, a probabilidade de contrair coqueluche em um dado grupo de estudo é calculada pelo quociente entre o número de crianças com coqueluche e as crianças que permanecem no grupo de estudo ao término do acompanhamento do estudo.

A eficácia da vacina de componente CP_10/5/5/3DT neste experimento em evitar coqueluche típica é mostrada na Tabela 4 e foi de aproximadamente 85%. No mesmo experimento, uma vacina acelular de coqueluche de dois

58% eficaz e uma vacina de célula integral foi aproximadamente 48% eficaz. O CP_10/s/s/cDT também foi eficaz para prevenção de coqueluche branda em uma eficácia estimada de aproximadamente 77%.

Exemplo 7:

polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae.

Preparação de componente PRP-T

O polissacarídeo capsular (PRP) de H. influenzae foi purificado e conjugado com toxóide de tétano no seguinte modo. De ampolas liofilizadas de lote de semente de trabalho de H. influenzae, três pré-culturas sucessivas foram realizadas. A primeira pré-cultura foi em meio sólido. Ampolas foram inoculadas sobre pratos de ágar de carvão + sangue em ebulição (10% de sangue de cavalo aquecido por 15 min. a 80°C) e incubados por 20 ± 4 horas em 36°C a 37°C sob CO₂. A segunda pré-cultura estava em meio líquido por 8 horas a 37°C. O meio líquido tinha a seguinte composição por litro:

ácidos ι	casamino Difco	lOg
fosfato	de monossódio 2H20	2,03 g
fosfato	de dissódio 12H20	31,14 g
lactato	de sódio (60% solução)	1,5 mL
L-cistina	0,07 g
L-triptofans	0,02 g
CaCL2, 2H20	0,02 g

76/120 /

(ΝΗ4)- SO₄ ’ ' 1 g

MgSO₄, 7H₂0 0,4 g anti-espuma Dow Corning M.S.A a 25% em óleo de parafina 0,15 ml

2. Ultrafiltrado de hemina + dextrose na proporção de 2 0 g de dextrose e 1 mg de hemina. Esta solução é adicionada com 5 mg de nicotinamida - dinucleotídeo de adenina esterilizado por filtro.

3. extrato de levedura Difog 5 g esterilizado por filtro.

A terceira pré-cultura estava em meio líquido com agitação por 4 horas a 37°C. A terceira pré-cultura foi utilizada para inocular o fermentador e a cultura foi mantida com agitação a 37°C por 12 a 14 horas. A cultura foi coletada em um tanque refrigerado. Formalina foi adicionada a uma concentração de 10 ml/litro. A cultura foi mantida, com agitação suave, a + 4°C por 2 - 24 horas e a seguir centrifugada. A formalina adicionada não foi destinada a inativar completamente a bactéria porém deter crescimento e inibir metabolismo. Esta adição reduziu a lise de célula com contaminação consequente com componentes intracelulares. A duração desta fixação foi entre 2 e 24 horas e tipicamente a cultura é deixada durante a noite antes de ser centrifugada. O sobrenadante contendo o polissacarideo foi colhido e a pelota bacteriana foi descartada.

O processo de purificação foi realizado geralmente em um ambiente frio ou em condições tais que a

77/120 temperatura dos produtos e reagentes é menor ao que ou igual a + 10°C exceto para a etapa de purificação de fenol que foi realizada em temperatura ambiente. Após centrifugação da cultura, o sobrenadante da cultura foi 5 concentrado. 0 polissacarídeo capsular foi precipitado do concentrado resultado pela adição de centrimida para fornecer uma concentração final de 5% peso/V. Centrimida precipitou PS do fluido concentrado (SNF). Um pouco de proteína, ácido nucléico e lipopolissacarídeo (LPS) também XO foram co-precipitados. Os precipitados foram coletados por centrifugação deixando alguns outros contaminantes e proteína para trás no SNF. A pelota resultante foi coletada por centrifugação e armazenada a < -20°C.

As pelotas foram suspensas novamente em 0,3 M de 15 solução NaCI e a suspensão centrifugada novamente. NaCI dissociou seletivamente complexos de centrimida de polissacarídeo. Alguns contaminantes (ácido nucléico, LPS, proteína) também foram dissociados no processo. Ao sobrenadante foi adicionado etanol absoluto pré-resfriado 20 até uma concentração final de 60%. O precipitado resultante foi coletado por centrifugação e lavado com etanol absoluto, frio. 0 precipitado foi seco a vácuo a 0-4°C, e era o produto intermediário. O produto intermediário foi dissolvido em tampão de acetato de sódio e com fenol em 25 temperatura ambiente. A fase aquosa foi coletada por centrifugação contínua. A extração de fenol e centrifugação pode ser repetida várias vezes e a fase aquosa foi dialisada e diafiltrada. O polissacarídeo capsular da

78/120 solução diafiltrada foi precipitada pela adição de etanol pré-resfriado até uma concentração final de 60% na presença

	de NaCl 0,3	M.	0	precipitado foi	coletado	por
	centrifugação,	lavado	com etanol absoluto	pré-resfriado,
5	acetona e éter e seco	a	vácuo a 4°C. 0 precipitado seco	foi
	então triturado	até um	pó fino sob baixa	umidade e	este

produto constitui o polissacarídeo de Haemophilus influenzae tipo b purificado.

O polissacarídeo purificado foi dissolvido em água Í0 para obter 5 mg de polissacarídeo por ml de solução, e o pH ajustado para 10,8 ± 0,2 com NaOH. Brometo de cianogênio como uma solução em água foi adicionado nas proporções de 0,5 mg CNBr/mg de polissacarídeo. O pH da mistura de reação foi mantido com NaOH a 10,8 ± 0,2 por 35 a 40 minutos a 23} 15 ± 3°C. 0 pH foi reduzido para pH9 pela adição de HC1.

Diidrazida de ácido adapico foi adicionado para fornecer uma concentração final de 3,5 mg ADH/mg de polissacarídeo e o pH ajustado para 8,5. A mistura de reação foi incubada a 23 ± 3°C por 15 minutos (pH mantido em 8,5) e a seguir a 20 solução foi incubada durante a noite a +4°C, com agitação suave. A mistura de reação foi dialisada contra solução NaCl e a seguir concentrada. A solução foi então filtrada através de um filtro de 0,45u e congelada a < -40 °C. Isto constitui o AH-polissacarídeo e foi armazenado a uma 25 temperatura < -40°C.

Para produzir o componente de toxina de tétano, uma cepa de Clostridium tetani foi inoculada em uma série de tubos contendo 10 ml de meio Rosenow ou meio de

79/120

Fórmula (em gramas por litro

Peptona de água destilada) extrato de carne glicose cloreto de sódio indicador Andrade (5% de ácido Fuchsin) mL mármore branco peça cérebro peça

O meio, preparado imediatamente antes do uso de produtos prontos para uso, foi enchido em tubos esterilizado a 120°C por minutos.

Uma garrafa de litros contendo 3 litros de meio de

Massachusetts foi inoculado com C.tetani e incubado por a 18 horas a 35°C ± 1°C por 16 horas. 0 conteúdo foi então transferido para uma garrafa de 20 litros contendo 15 litros de meio de Massachusetts esterilizado e incubado 8 horas a 35 °C ± 1°C. Cada garrafa foi utilizada para inocular um fermentador contendo 582 litros de meio de Massachusetts e incubado a 35 °C por 5 a 6 dias com aeração. Os fermentadores foram resfriados e à cultura foi adicionado cloreto de sódio 12 kg, citrato de trissódio 8 kg. A agitação foi mantida por um dia a seguir parada e este processo permite extração da toxina residual da bactéria ao término da cultura. A toxina foi clarificada por filtração ou por passagem através de uma centrífuga contínua.

80/120

O sobrenadante de 1200 1 de cultura foi concentrado por ultra filtração e a toxina concentrada diafiltrada contra 0,07 M de solução de fosfato de dissódio pH 8,2. O volume final foi ajustado para 500 Lf/m.

Uma precipitação dupla com sulfato de amônio foi realizada para obter a toxina de tétano purificado. Desse modo, sulfato de amônio e 10 g de carvão são lentamente adicionados por litro da toxina diafiltrada previamente obtida. Após 15 a 24 horas de incubação a +4°C, a toxina 10 foi filtrada em cartuchos para eliminar o precipitado.

seguir, uma quantidade de sulfato de amônio suficiente para fazer 320 gm/1 foi lentamente adicionada por litro do sobrenadante previamente obtido. Após aproximadamente 48 horas a +4°C a pelota foi coletada por centrifugação e 15 dissolvida em uma solução de fosfato de dissódio 0,05 M pH

8,2. A solução foi diafiltrada contra 0,05 M de solução de fosfato de dissódio pH 8,2 e ajustada para 300 Lf/ml. A solução foi então esterilizada por filtro. 7,5 u moles (0,225%) de formaldeído foram adicionados por ml da solução 20 de toxina. A detoxificação foi obtida após incubação por 24 dias a +37°C incluindo períodos intermediários a +4°C e 22°C. A esterilização por filtração (0,22 u) foi realizada para obter o toxóide de tétano. O toxóide de tétano foi dialisado e concentrado contra NaCI utilizando uma membrana 25 tendo um corte de peso molecular < 50.000. A proteína concentrada foi então assepticamente filtrada e armazenada a +4°C.

Quantidades iguais de AH-polissacarídeo e toxóide de

81/120 tétano (± 20%) foram misturadas com 0,05 M NaCl para fornecer uma concentração de 7,5 mg de polissacarídeo por ml. O pH da solução foi ajustado para pH 5,7 + 0,2 com HCI e 1-etila 3 - (3 dimetil aminopropila) carbodiimida (EDAC) adicionado para fornecer uma concentração final de 19,17 mg

EDAC/ml de mistura de reação. Os grupos de carboxila da proteína de tétano são ativados por ligação a EDAC. Sob as condições levemente ácidas da reação, segue uma reação de condensação na qual o AH-PS e a proteína de tétano ativada 10 por EDAC se torna covalentemente ligada. A mistura foi incubada em pH constante (5,7) por 60 minutos a + 4°C, e a seguir o pH ajustado para pH 6,9 ± 0,2 com NaOH e a mistura de reação dialisada contra NaCl a + 4°C. O conjugado foi purificado por centrifugação de zona em um gradiente de 15 sacarose (4% a 60%) para eliminar EDAC, polissacarídeo-AH livre, proteína de tétano livre, e conjugado de baixo peso molecular. À fração contendo o conjugado de polissacarídeo foi então adicionada água isenta de pirogênio, sacarose, tampão Tris-HCI para obter uma solução de conjugado da 20 seguinte composição:

sacarose 8,5 % peso/V ± 0,5% conc. de polissacarídeo aproximadamente 200 ug/ml tampão Tris-HCI 10 mM pH 7,0 ± 0,5.

A solução foi então filtrada assepticamente utilizando 25 um filtro de 0,2 u e armazenada a -40°C.

O volume de conjugado de polissacarídeo Haemophilus influenzae tipo b foi diluído sob condições esterilizadas com diluente para obter a composição final:

82/120

Tampão concentrado de conjugado de pòlissacarídeo

Haemophilus tipo b tampão Tris-HCl 200

	a pH 7,2	a
5	sacarose	a
	agua para	inj eção

O volume final foi enchido

200 mg de polissacarídeo mM mM

850 g

L em vias e liofilizado. (A vacina liofilizada foi reconstituída com 0,5 ml ou 0,4%

NaCl para uso).

Formulação

Duas formulações da vacina de componente multivalente (APDT) foram testadas. A primeira (APDT-baixo) continha 10 ug de toxóide de coqueluche (PT) , 5 ug de hemaglutinina filamentosa (FHA), 5 ug de fímbrias 2 e 3 ug de proteína 69 15 K (69K) por dose de 0,5 ml (CLÁSSICA). A segunda formulação (APDT-elevado) continha duas vezes a quantidade de PT (20 ug) e quantidades idênticas de FIM e 69K (Híbrido). As duas formulações continham 15 Limite de floculação (Lf) de toxóide de difteria, 5 Lf de toxóide de tétano, 1,5 mg de fosfato de alumínio como adjuvante e 0,6% de 2-fenoxietanol como conservador. A vacina de conjugado de toxóide de tétano-Hib (PRPT) foi produzida, no modo descrito acima, por Connaught Laboratories Inc. (Swiftwater, E.U.A.).

População

Crianças saudáveis com 17 a 21 meses de idade que tinham sido imunizadas com três doses de APDT-baixo ou PRPT como injeções separadas com 2, 4 e 6 meses de idade em um experimento clínico prévio foram recrutadas no estudo. Após

83/120 consentimento por escrito, informado, as crianças foram alocadas por uma lista de bloco equilibrado gerada por computador de números aleatórios para receber PRT-T como uma injeção separada no mesmo dia, como uma injeção separada com o PRP-T dado um mês após a vacina APDT, ou como uma única injeção (PRP-T liofilizado reconstituído em APDT) . A formulação de APDT (elevada ou baixa) para cada criança permaneceu igual como tinha sido dada nas três primeiras doses (razão de alocação 6:1 APDT-elevada; APDTbaixa) . As vacinas foram dadas i.m. com uma agulha de 2 5 mm no músculo deltóide do braço ou o músculo vasto lateral da coxa se o deltóide não tivesse massa suficiente. Quando uma segunda injeção era necessária para PRPT, o membro oposto era injetado.

Monitoração laboratorial e clínica

Os participantes foram monitorados em relação a reações adversas locais e sistêmicas imediatamente após a imunização e pelos pais durante 72 horas após imunização. Os dados foram coletados através de uma entrevista por telefone estruturada em 24 e 72 horas. A temperatura do corpo foi medida pelo menos uma vez por dia ou sempre que os pais achassem que a criança estava febril. Sensibilidade é reações sistêmicas (irritabilidade, atividade diminuída, alimentação diminuída) foram classificadas como branda, moderada ou severa de acordo com critérios preestabelecidos pelos quais o pai selecionava uma gravidade com base em exemplos estruturados. Reações locais medidas foram classificadas por seu tamanho e choro prolongado por sua

84/120 duração. ·...

Amostras de sangue foram coletadas por venopuntura ou por picada do dedo antes de e 28 dias após imunização; em crianças que receberam a injeção PRP-T (portanto, 2 meses após APDT). Anticorpos ao polissacarídeo capsular de Hib (PRP) foram medidos por RIA. Anticorpos IgG a PT foram medidos por ELA e anticorpo de neutralização-PT por neutralização de citotoxicidade de célula de ovário de hamster Chinês (CHO). Anticorpos IgG anti-FHA, anti-FIM, e anti-69K foram medidos por EIA; unitage foi calculada utilizando o antisoro de referência de FDA US (#3) . As aglutininas de coqueluche também foram medidas. Antitoxina de difteria foi medida por ensaio de microneutralização e antitoxina de tétano por EIA. Títulos de anticorpo foram expressos como títulos de meio geométrico; amostras de soro com títulos menores do que o limite de detecção de teste foram atribuídos um valor de metade do limite de detecção inferior para a finalidade de cálculos estatísticos.

Análise estatística

Reações adversas foram analisadas após agrupamento por importância clínica. Taxas de reações adversas foram comparadas por estimativas Mantel-Haneszel de risco relativo utilizando formulação de vacina e centro como as variáveis de estratificação. Estimativas de ponto e 95% Cl do RR foram calculados em cada caso. Cl que não incluem 1,00 são estatisticamente significativas.

Títulos de anticorpo de média geométrica e 95% Cl foram computados para o titulo de anticorpo para cada

85/120 antígeno de vacina pré- e após imunização. Títulos de registro médio foram comparados por análise de variância de três fatores. A proporção de pessoas obtendo níveis préespecifiçados em cada grupo foi comparada por regressão logística. Nenhum ajuste foi feito para múltiplas comparações.

Um total de 545 crianças (44% do sexo feminino) foram registradas no estudo, 74% daquelas que tinham completado o estudo de série de bebê. A proporção de participantes neste estudo que tinham recebido as duas formulações permaneceu 6:1 (468 APDT-elevado, 77 APDT-baixo). A idade média era de 18,9 meses (faixa de 17-21 meses); todas exceto 3 crianças (99,4%) completaram o estudo.

Reações adversas

As taxas de reações adversas não diferiram em grupos imunizados com APDT-elevado ou APDT-baixo; as taxas também foram similares se as imunizações foram dadas separadamente em uma visita, em visitas separadas, ou em uma única injeção combinada.

Resposta de anticorpo

Antes da imunização, os níveis de anticorpo contra todos os antígenos exceto FHA eram similares em crianças que tinham recebido APDT-elevado ou APDT-baixo em suas três primeiras doses. Crianças providas com APDT-elevada com seu teor de FHA de quatro vezes tiveram títulos de FHA significativamente mais elevados do que crianças imunizadas com APDT-baixa (p-0,0001). Após imunização, títulos de anticorpo mais elevados induzidos por APDT-elevado do que

86/120

APDT-baixo (p=0,0001). Em contraste, títulos anti-PT de pré-imunização medidos por neutralização de CHO ou EIA foram similares nos dois grupos. Paradoxalmente, apesar de duas vezes o teor antigênico, títulos anti-PT eram mais 5 baixos apesar da imunização com APDT-elevado do que APDTbaixo (p=0,038). Similarmente, anticorpos anti-FIM e pósimunização de aglutinina foram mais elevados no grupo APDTbaixo (p=0,01 e p=0,04, quantidades idênticas de formulações de vacina.

Antes da imunização, respectivamente) apesar de antígeno fimbrial nas duas houve poucas diferenças em anticorpos anti-coqueluche dentre o grupo randomizado para receber o

PRPT combinado com APDT como uma dado como separados inj eções (Tabela separadas nos mesmos dias ou em dias

10) . Os dados são apresentados separadamente para receptores de APDT-elevado ou APDTbaixo; contudo, devido ao pequeno número de crianças no grupo APDT-baixo, estes resultados não serão discutidos J adicionalmente. O grupo randomizado para receber injeções separadas no mesmo dia teve anticorpos anti-PT mais elevados por neutralização CHO do que o grupo que estava para receber as injeções tow em dias separados (6,14 vs 4,80 unidades; p<0,05). Níveis de anticorpo pós-imunização também foram mais elevados neste grupo (176 unidades) do 25 que o grupo de injeção separada em dias separados (122 unidades; p<0,01) embora níveis similarmente mais elevados fossem encontrados no grupo que recebeu a imunização única combinada (171 unidades; p<0,01). A resposta de anticorpo

87/120 anti-69K foi detectada neste grupo pós-imunização, embora as crianças imunizadas com duas injeções no mesmo dia tiveram uma resposta de anticorpo mais elevada do que as crianças imunizadas com a vacina única combinada e crianças imunizadas com duas injeções no mesmo dia tiveram resposta de anticorpo mais elevada do que crianças imunizadas em dias separados (243 vs 190 unidades; p<0,001) do que crianças imunizadas com duas injeções em dias separados.

Os níveis de anticorpo anti-PRP eram similares entre os três grupos antes da imunização. Títulos de pósimunização eram mais elevados em crianças imunizadas com injeções separadas no mesmo dia (66,0 ug/ml) do que em crianças imunizadas em dias separados (28,4 ug/ml; p<0,001) ou em crianças que receberam a imunização combinada única (47,1; p<0,05). A imunização combinada também causa níveis de anticorpo significativamente mais elevados do que as vacinas dadas em dias separados (p<0,05). Nenhuma diferença foi detectada entre os grupos na percentagem que obteve níveis de proteção; todos os participantes tiveram títulos pós-imunização em excesso de 0,15 ug/ml e apenas 4 participantes (0-, 7%) falharam em obter um título em excesso de 1 ug/ml (3 no grupo que recebeu injeções separadas em dias separados e um no grupo que recebeu a injeção combinada única). Mais de 82% das crianças em cada 25 grupo excedem um nível de anticorpo anti-PRP de 10 ug/ml.

Uma resposta de anticorpo vigorosa também foi causada contra os toxóides de tétano e difteria. Comparado com o grupo que recebeu a imunização em dias separados (2,1

88/120

IU/ml) níveis de anticorpo anti-difteria signíficátivamente mais elevados foram causados em crianças imunizadas com duas injeções no mesmo dia (3,1; p<0,01 IU/ml) ou as injeções únicas combinadas (3,3 IU/.ml; p<0,001).

Anticorpos anti-tétano foram mais elevados em receptores das duas injeções no mesmo dia (6,7 IU/ml) do que em crianças imunizadas em dias separados (5,2 IU/ml; p<0,01) ou crianças que receberam a injeção única combinada (4,8 IU/ml; p<0,001). Todas as crianças tiveram títulos de 10 anticorpo anti-difteria e anti-tétano pós-imunização em excesso de 0,1 IU/ml, um nível de dez vezes o suposto nível de proteção. Mais de 96% de títulos anti-tétano e mais de 74% de títulos anti-difteria excederam um nível de 1,0

IU/ml; não houve diferença entre os grupos de imunização.

Exemplo 8:

Este Exemplo descreve a formulação e imunogenicidade de uma vacina de combinação multivalente contendo vacina de pólio inativada.

J. a) Preparação de poliovírus inativado

i) Cultivado em células MRC-5

Vírus de pólio inativado cultivado em células MRC 5 foi produzido como a seguir. As células foram de células de rim de um macaco verde (Ceropithacus aethiops):

A vacina de poliovírus trivalente, inativada continha componentes tipo I (Mahoney) , tipo II (MEF) e tipo III (Saukett) , que foram cultivados em células MRC-5 em contas microportadoras, processadas e inativadas separadamente antes da combinação em uma vacina de vírus de pólio

89/120

Uma suspensão de célula MRC-5 foi adicionada ao meio de crescimento de célula em um fermentador a pH 7,2 (6,9 a trivalente.

7,6) e temperatura 37°C ± 0,5°C. O meio de crescimento de célula teve a seguinte composição:

Meio CMRL 1969 bicarbonato de sódio 0,15% soro bovino adulto 5,00% - 7,00% sulfato de neomicina (ug de atividade) 10 IU/ml polimixina B 200 IU/ml meio CMRL tinha a seguinte composição:

Pó seco

Ingredientes mg/litro aminoácido

L-alanina	25,0
L-arginina (base livre)	58,0
L-ácido aspártico	30,0
L-cisteína .HCl	0,1
L-cistina dissódio	24,0
L-ácido glutâmico . H20	67,0
L-glutamina	200,0
L-glicina	50,0
L-histidina (base livre)	16,2
L-hidroxiprolina	10,0
L-isoleucina	20,0
L-leucina	60,0
L-lisina .HCl	70,0
L-metionina	15,0

90/120

L-fenilalanina	25,0
L-prolina	40,0
L-serina	25,0
L-triptofano	10,0
L-tirosina	40,0
L-valina	25,0

Vitaminas

p-ácido aminobenzóico	0,05
ácido ascórbico	0,05
d-biotina	1,00
pantotenato de cálcio	1,00
citrato de diidrogênio de colina	2,12
ácido fólico	1,00
glutationa	0,05
i-inositol	2,00
nicotinamida	1,00
piridoxal .HCI	1,00
Riboflavina-5-fosfato	0,10

Tiamina HCI

1,00

Ingredientes mg/litro

Componente
cloreto	de	sódio	8000,0
cloreto	de	potássio	400,0
cloreto	de	cálcio(anidro)	140,0
sulfato	de	magnésio.7H20	200,0
fosfato	de	sódio,dibásico anidro	180,0
fosfato	de	sódio,não básico	70,0
D-glicose	(anidro)	1000,0

91/120 vermelho fenol

0,0

10,852 g fornece 1 litro de Meio CMRL 1969.

O meio foi preparado como a seguir:

450 litros de água isenta de pirogênio destilada são adicionados a 905 ml de IN ácido clorídrico. A esta mistura é adicionado 5426,5 g de pó seco CMRL 1969 com agitação contínua até dissolver em solução transparente. Os seguintes produtos químicos foram adicionados na ordem dada, com agitação contínua, esperando que cada produto

1'0 químico dissolva antes de adicionar o seguinte:

neomicina polimixina B solução de tampão TES bicarbonato de sódio mcg/mL

200 unidades/mL

5000,0 mL

750,0 g soro bovino

30,0 L

O volume foi trazido até

500 L com água destilada fresca e agitada até ser misturada uniformemente.

O crescimento de célula foi monitorado e quando as células foram determinadas como estando em fase logarítmica, o meio de crescimento usado foi descartado e substituído por meio de crescimento de vírus. O meio de crescimento de vírus tinha a seguinte composição:

Produtos químicos de Meio 199 com sais de Earle bicarbonato de sódio ,26%

Tween 80

0 ppm sulfato de neomicina (ug de atividade) 10 IU/mL

Polimixina B 200 IU/mL

L-glutamina 100 mg/L

92/120

L-arginina

L-leucina

L-isoleucina

L-metionina

L-serina

L-treonina

L-cistina citrato diH de colina

29mg/L

30mg/L mg/L

7.5mg/L

12.5mg/L mg/L mg/L

107 mg/L

O meio CMRL 199 tinha a seguinte composição:

1'0 Pó seco

Ingredientes mg/litro

L-alanina25,0

L-arginina (base livre)58,0

L-ácido aspártico30,0

L-cisteína.HCl.H₂00,1

L-cisteína dissódio24,0

L-ácido glutâmico H₂067,0

L-glutamina100,0

I glicina50,0

L-histidina (base livre)16,2

L-hidroxiprolina10,0

L-isoleucina20,0

L-leucina60,0

L-lisina70,0

L-metionina15,0

L-fenilalanina25,0

L-prolina40,0

L-serina25,0

/12

L-treonina

L-triptofano

L-tirosina

L-valina p-ácido aminobenzóico ácido ascórbico d-biotina pantotenato de cálcio citrato diidrogênio de colina ácido fólico glutationa i-inositol menadiona nicotinamida (niacinamida) ácido nicotínico (niacina) piridoxal .HCI piridoxina.HCI riboflavina-5-fosfato tiamina HCI vitamina A acetato vitamina D (calciferol) vitamina E (fosfato de tocoferol sulfato de adenina trifosfato de adenosina adeosina-5-ácido fosfórico deoxi-2 -ribose d-ribose colesterol

30,0

10,0

40,0

25,0

0,050

0,050

0,010

0,010

1,060

0,010

0,050

0,050

0,010

0,025

0,025

0,025

0,015

0,010

0,020

0,100

0,100

0,010 , 000

1,000

0,200

0,500

0,500

0,200

94/120 guanina 0,300 hipoxantina 0,300

As culturas foram infectadas com o vírus de semente apropriado, em uma multiplicidade de infecção. A infecção 5 prosseguiu a 3 6 °C ± 1°C. Quando o C.P.E. de vírus estava completo, a cultura foi resfriada a 2°C até 15°C.

A colheita do vírus foi clarificada por filtração. O volume de colheita de vírus foi reduzido por ultrafiltração de membrana, com um corte de peso molecular nominal de 10 100.000 ate um volume adequado para diafiltração contra

0,04M de tampão de fosfato. Após diafiltração, o volume foi adicionalmente concentrado até um volume adequado para filtração de gel. 0 concentrado de vírus vivo foi amostrado e armazenado a 2°C até 8°C.

O concentrado de vírus vivo foi aplicado a uma coluna de filtração de gel e eluído da coluna com 0,04M de tampão de fosfato. A fração de vírus foi coletada pela monitoração da densidade óptica do eluato de coluna a 254 e 280 nm.

J Uma segunda etapa de purificação foi realizada utilizando um meio de permuta de íon-DEAE, com 0,04M de fosfato como o tampão de eluição. Esta etapa pode ser repetida duas vezes, se a quantidade de meio de permuta de íon utilizada era insuficiente, como determinado pela monitoração a 254 e 280 nm.

25	A	fração	de vírus	coletada	foi	concentrada	e	dialisada
	contra	Meio	Especial	de Hank	para reduzir	o	teor de
	fosfato	0	meio	Especial	de	Hank tem	a	seguinte

composição:

95/120

Aminoácidos D, L-alanina	mg/litro 25,00 58,00 30,00
	L-arginina . HC1 D, L-ácido aspártico
5	L-cisteína HC1 H20	0,10
	L-cisteína 2HC1	26,00
	D,L-ácido glutâmico	67,00
	L-glutamina	100,00
	glicina	50,00
10	L-histidina HC1 .H20	16,20
	L-hidroxiprolina	10,00
	D,L-isoleucina	20,00
	D,L-leucina	60,00
	L-lisina .HC1	70,00
15	D,L-metionina	15,00
	D,L-fenilalanina	25,00
	L-prolina	40,00
	D,L-serina	25,00
I I	D,L-treonina	30,00
20	D, L-triptofano	10,00
	L-tirosina (sal de dissódio)	40,00
	D,L-valina	25,00
	Vitaminas
	ácido ascórbico	0,050
25	d-biotina	0,010
	vitamina D (calciferol)	0,100
	D-pantotenato de cálcio	0,010

cloreto de colina

1,060

96/120

	ácido fólico i-inositol Sais minerais cloreto de cálcio (anidro)	0,010 0,050 mg/litro 40,00
5	nitrato férrico . 9H20	0,10
	cloreto de potássio	400,00
	cloreto de sódio	8000,00
	sulfato de magnésio. 7H20	200,00
	Outros ingredientes
10	sulfato de adenina	10,000

trifosfato de adenosina(sal de dissôdio) 1,000 ácido adenílico 0,200 d a tocoferol ácido fosfórico(sal de sódio) 0,010

colesterol	0,200
15	desoxirribose	1000,000
	glutationa	0,050
	guanina .HCl	0,300
	hipoxantina (sal de sódio)	0,300
.......í	ribose	0,500
20	acetato de sódio.3H20	81,500
	timina	0,300
	Tween 80	20,000
	Uracila	0,300
	Xantina (sal de sódio)	0,300
25	Menadiona	0,010
	ácido nicotínico	0,025
	nicotinamida	0,025
	p-ácido aminobenzóico	0,050

97/120

Piridoxal .HC1

0,025

Piridoxina .HC1

Riboflavina-5-fosfato tiamina .HC1 vitamina A (acetato) um filtro de porosidade de 0,2 u.

Uma ou mais frações de purificadas podem nos resultados do foi diluído para:

Tipo

I: 1750

Tipo

Tipo

0,025

0,010

0,010

0,140 foi filtrada, através de concentrado de vírus teste ELISA, o grupo de vírus monovalente ± 250 DU/ml

II : 1500 ± 250 DU/ml e

III: 1250 ± 250 DU/ml com Meio Especial de

Hank.

1°C, a seguir filtrado através de um filtro de porosidade de 0,2 quantidade necessária de formalina, para obter uma

1:4000, foi adicionada. 0 grupo de vírus e formalina foram misturados e agitados continuamente a 37°C ± 1°C. O grupo de vírus monovalente foi amostrado para viabilidade. No sexto dia, o grupo de foi filtrado através de um filtro de 0,2 u e mantido a 37°C ± 1°C. No décimo terceiro dia de inativação, o grupo de vírus foi filtrado através de um filtro de 0,2 u.

Um ou mais componentes monovalentes inativados foram selecionados e assepticamente conectados a um tanque de agrupamento. O grupo monovalente foi adicionalmente

98/120 concentrado, por ultrafiltração de membrana, com um corte de peso molecular nominal de 100.000. Diálise, contra diluente RIV-PBS:

fosfato de hidrogênio de dissódio (Na₂HPO₄) 0,346 g/CCml fosfato de dihidrogênio de potássio (KH₂P0₄) 187 g/CCml com Tween foi então realizado para obter uniformidade do produto final.

Albumina (humana) foi adicionada para obter uma concentração final de 0,5%. O concentrado monovalente agrupado foi então filtrado através de um filtro de 0,2 u. Diluente RIV-PBS com Tween foi adicionado para obter uma concentração estimada (por cálculo) de 10 a 15 doses por 0,5 ml. 0 concentrado agrupado foi armazenado a 2°C até 8°C até necessário.

Os volumes apropriados dos componentes monovalentes tipos I, II e III foram calculados e combinados. A vacina trivalente foi direcionada para conter:

tipo I: 40 DU/dose de 0,5 ml tipo II: 8 DU/dose de 0,5 ml tipo III: 32 DU/dose de 0,5 ml

O concentrado trivalente foi armazenado a 2°C até 8°C até utilizado. Formaldeído e 2-fenoxietanol foram adicionados e misturados. Albumina (humana) foi adicionada, por cálculo, para fornecer uma concentração final de 0,5%.

(ii) Cultivado em células Vero

Ampolas do grupo de célula de trabalho Vero foram sub-

99/120 cultivadas até o nível de passagem celular escolhida. As ampolas de célula foram preservadas em nitrogênio líquido. As células foram cultivadas utilizando contas de microsuporte que eram contas esféricas de um diâmetro médio de 5 aproximadamente 100 micrômetros, constituídas por polímeros

Dextrano tendo radículas de DEAE enxertado em sua superfície (dietilaminoetila), dando as mesmas uma carga positiva.

meio básico para crescimento celular era o Meio essencial mínimo (MEM) de Eagle em solução salina Earle enriquecido com 0,2% de hidrosilado de lactalbumina, 0,1% de dextrose, 5% de soro de vitelo. Cada ml de meio contém os seguintes antibióticos:

Estreptomicina:	75 unidades por	mL
Neomicina:	14 unidades por	mL
sulfato de Polimixina B	35 unidades por	mL

As células Vero foram progressivamente subcultivadas em Biogeradores de tamanho crescente. A seguir, o meio de cultura e o volume suficiente de contas de microsuporte por 20 litro de meio foram introduzidos no biogerador industrial.

A temperatura foi estabilizada a + 37°C. As células coletadas por tripsinação foram adicionadas e colocadas sob agitação. A cultura continuou durante 4 a 7 dias a + 37°C, a agitação sendo progressivamente aumentada. Normalmente, 25 ao término da cultura, um aumento de 6 a 2 0 vezes no crescimento celular foi observado. O meio utilizado para o crescimento de vírus foi o meio 199 (Parker) em solução salina Earle, enriquecida com 0,1% de dextrose. Este meio

100/120 contém os mesmos antibióticos, na mesma concentração que o meio para crescimento celular, porém não contém soro de vitelo. No 4^o/7° dia de crescimento celular, a agitação do biogerador no estágio industrial, foi parada; as contas assentaram no fundo do tanque, o meio antigo é removido. Um pouco de meio 199 isento de soro foi então introduzido em cada biogerador e agitado. Este meio foi então extraído, efetuando uma lavagem das contas e células. Um pouco de meio 199 isento de soro foi transferido para o biogerador juntamente com o volume necessário de lote de semente. O vírus foi adsorvido nas células por agitação suave. Ao término da cultura de vírus, a agitação foi parada. A suspensão de vírus foi extraída e coletada e as contas foram retidas por filtração. A suspensão de vírus foi homogeneizada. A colheita, filtrada em uma membrana orgânica de poros de tamanho médio a 0,20 mm foi armazenada a +4°C. 0 vírus foi concentrado por ultrafiltração.

O vírus foi adicionalmente purificado por cromatografia de permuta de íon utilizando suporte de DEAEdextrano-Spherosil, equilibrado com tampão de fosfato 0,04 M, pH = 7,00. 0 vírus foi adicionalmente purificado por cromatografia de filtração de gel, utilizando uma coluna contendo um gel agarose, Sepharosis CL-6B tamponado com fosfato 0,04 M, pH = 7,00. O vírus foi adicionalmente purificado por cromatografia utilizando DEAE dextranoSpherosil, tamponado com um tampão de fosfato 0,04 M, pH = 7,00. Tão logo a última purificação seja realizada, a suspensão de vírus foi ajustada até o volume necessário com

101/120 algum meio M-199, pH = 7,0 sem fosfato, concentrado dez vezes em EDTA 5 mm, glicina a 0,5 % e Tween 80 em uma concentração final de 50 mg/litro (Meio de inativação). Esta mistura constitui uma Mistura de vírus concentrado e é filtrada em uma membrana de 0,2 um. A suspensão de vírus concentrado foi armazenada a +4°C pendendo inativação.

Um ou vários lotes de Mistura de vírus concentrada do mesmo tipo foram misturados e possivelmente diluídos ou ajustados com algum Meio de inativação em um tanque adequado. A diluição foi ajustada para o volume correto de acordo com os tipos para se obter um título de antígeno D entre:

- 1500 e 2000 D unidades no tipo 1

- 800 e 1000 D unidades no tipo 2

- 1000 e 1500 D unidades no tipo 3 e uma taxa de proteína de:

- < 40 ug/ml no tipo1

- < 70 ug/ml no tipo2

- < 30 ug/ml no tipo3

A suspensão de vírus concentrado purificada, ajustada foi filtrada em uma membrana de 0,2 um no máximo 72 horas antes do início de ativação. A suspensão de vírus foi então aquecida novamente a +37°C. Para inativação, a solução de formaldeído foi adicionada para se obter uma concentração a 1/4000. Para seguir a cinética de inativação após 24, 48, e 96 horas, as amostras foram retiradas durante os quatro primeiros dias. Uma amostragem de 10 ml foi realizada com neutralização imediata do formaldeído por

102/120 ação de bissulfeto de sódio e armazenagem direta a -20°C pendendo titulação.

No 6² dia, a suspensão de vírus durante inativação foi filtrada utilizando um filtro de 0,22 um. Após filtração, a incubação do líquido continua a +37 °C por mais 6 dias com uma agitação constante. No 9² dia de inativação, 3 vezes o volume correspondendo a 3000 doses humanas e 500 ml mínimo da colheita individual bruta foi retirada. Este volume foi calculado de acordo com o título em antígeno D da Mistura de vírus concentrada. A amostragem foi diretamente neutralizada com algum bi-sulfeto de sódio para parar a ação do formaldeído residual. A suspensão de vírus inativado e homogeneizado foi então retirada do incubado a + 37°C após a inativação do 12° dia. O volume foi diretamente neutralizado com algum bissulfeto de sódio e armazenado a +4°C.

Para preparar um lote trivalente concentrado de

IPV tipo (Mahoney)

400 unidades de antígeno D tipo (MEF-1) unidades de antígeno D tipo (Saukett) unidades de antígeno D

Meio

199 - pH 7,2

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A mistura foi agitada para homogeneizar filtrado em uma membrana de porosidade 0,22 micron.

produto de volume final foi obtido dos lotes de volume trivalentes concentrados, como aqueles descritos, por diluição com meio 199, pH 7,2, sem vermelho fenol de modo que a dose unitária contém por 0,5 ml.

103/120

cinco antígenos de coqueluche (10 ug PT, 5 ug FHA, 5 ug FIM 2 e 3, 3 ug 69K) , 15 Lf de toxóide de difteria, 5 Lf de toxóide de tétano, 1,5 mg de fosfato de alumínio como adjuvante e 0,6 % de 2-fenoxietanol como conservador por 0,5 ml (Clássico). A vacina foi utilizada individualmente oüjem combinação com IPV produzido em células MRC-5 (mlPV) preparadas como descrito acima, IPV produzido em células Vero (vIPV) preparadas como descrito acima, ou com OPV (Connaught Laboratories Limited). Para não romper seu programa de imunização de rotina, vacina conjugada de toxóide de tétano-Haemophilus influenzae b foi administrada no momento da visita de.....acompanhamento.

População

Crianças de 17 a 19 meses de idade saudáveis que tinham sido imunizadas com três doses de DTP e 2 doses de OPV, ou 3 doses de DTP-IPV antes de 8 meses de idade foram recrutadas no estudo. Após consentimento informado por escrito de pais ou guardiães, as crianças foram alocadas por uma lista de bloco equilibrado gerada por computador de números aleatórios para receber um de cinco regimes de vacina (Tabela 10?) Vacinas de combinação contendo A3DT foram dadas por via intramuscular com uma agulha de 25 mm no músculo deltóide do braço ou no músculo vasto lateral da

104/120 coxa se o deltóide fosse de massa insuficiente. IPV (0,5 ml; mlPV ou vlPV) quando dados individualmente eram administrados pela via subcutânea utilizando uma agulha de 12,5 a 16 mm em comprimento, vacinas contendo APDT foram dadas no membro esquerdo; o membro direito foi utilizado para as vacinas de poliovírus inativadas quando dadas separadamente e para todas as vacinas conjugadas Haemophilus influenzae b na segunda visita.

Monitoração laboratorial e clínica

Amostras de sangue foram coletadas por venopuntura ou por picada do dedo antes de e 2 8 dias após a imunização. Anticorpos IgG a PT foram medidos por imunoensaio de enzima e anticorpo de neutralização de PT por neutralização CHO. Anticorpos IgG anti-FHA, anti-FIM, e anti-69K foram medidos por imunoensaio de enzima; as unidades foram calculadas utilizando a antisoro de referência de FDA US (#3). Aglutininas de coqueluche também foram medidos. Antitoxina de difteria foi medida por ensaio de microneutralização e antitoxina de tétano por imunoensaio. Anticorpos de anticorpo-poliovírus tipo 1, 2 e 3 foram medidos por neutralização viral. Títulos de anticorpo foram expressos como títulos de média geométrica; amostras de soro com títulos menores do que o limite de detecção de teste foram atribuídos um valor de metade do limite de detecção inferior para fins de título de cálculos estatísticos.

Títulos de anticorpo de média geométrica e 95% de intervalos de confiança foram computados para o título de anticorpo para cada antígeno de vacina pré- e pós

105/120 imunização. Títulos de registro médio e aumentos de título de anticorpo de registro de vezes médios foram comparados por análise de perfil e análise de variância. A proporção de pessoas que atingiram níveis pré-especifiçados em cada grupo foi comparada por regressão logística. As comparações foram feitas entre cada vacina de poliovírus dada separadamente ou como uma injeção combinada, entre mlPV e vIPV (tanto separadamente como combinado) e entre as vacinas IPV combinadas e OPV. Nenhum ajuste foi feito para múltiplas comparações.

Um total de 425 crianças (52% do sexo feminino) foi registrado no estudo e recebeu a imunização de reforço (Tabela 10) . A idade média no registro foi de 17,8 meses (faixa de 17,0 a 20,0). Espécimes de soro pós-imunização foram obtidos de 422 (99,3%) participantes uma média de 29,2 dias após imunização (faixa de 28 a 41 dias). Eventos adversos categorizados como graves não foram comuns no estudo.

Antes da imunização, níveis de anticorpo eram equivalentes entre os grupos para a maioria dos antígenos. As exceções foram que participantes alocados para receberem APDT e mlPV como injeções separadas tiveram níveis de anticorpo anti-FIM, aglutinina, anti-difteria e anti-tétano significativamente inferiores do que o grupo alocado para receber a vacina APDT-mIPV combinada. Similarmente, o grupo randomizado para receber as injeções separadas de APDT e vIPV teve níveis de anticorpo anti-tétano mais baixos do que o grupo que estava para receber o APDT-vIPV combinado.

106/120

Após imunização, houve um aumento de anticorpo significativo em todos os grupos de vacina contra todos os antígenos incluídos nas vacinas. Houve poucas diferenças na resposta de anticorpo aos antígenos de coqueluche dependendo do grupo de vacina de pólio. Não houve diferença em anticorpo anti-PT por imunoensaio de enzima ou neutralização de CHO ou em anticorpos anti-FHA. Anticorpos anti-69K foram significativamente mais elevados no grupo que recebeu a vacina mlPV combinada com APDT (77,7 unidades) do que o grupo que recebeu mlPV como uma injeção separada (37,9 unidades; p<0,001) ou o grupo que recebeu OPV (47,7; p<0,05). Anticorpos anti-FIM e aglutininas também eram mais elevadas no grupo que recebeu o grupo APDT-mIPV combinado do que o grupo que recebeu injeções separadas; contudo, estas mesmas diferenças também foram detectadas nos soros pré-imunização.

As diferenças foram detectadas nas respostas de anticorpo anti-poliovírus. Tanto APDT-mIPV como APDT-vIPV causaram anticorpos anti-poliovírus tipo 1 e tipo 3 mais elevados (P<0,001 para todas as comparações). Níveis de anticorpo anti-poliovírus tipo 2 também foram mais elevados após APDT-mIPV (10.633 diluição reciproca) e APDT-vIPV (10.256) do que OPV (7185); contudo, isto apenas atingiu importância estatística para APDT-mIPV (p < 0,05) . Os títulos de anticorpo anti-poliovírus obtidos com APDT-MIPV combinado também foram mais elevados do que quando o mlPV foi dado como uma injeção separada (6620-1 p<0,05).

Títulos de anticorpo anti-tétano eram mais elevados em

107/120 receptores de OPV do que qualquer uma das combinações IPV (p<0,05). Títulos anti-difteria também eram mais elevados em receptores OPV porém este apenas atingiu importância estatística comparado com o grupo APDT-vIPV (p < 0,05). Após imunização, todas as crianças tiveram níveis de anticorpo contra difteria e tétano em excesso de 0,01 IU/ml e todas exceto uma criança tiveram níveis em excesso de 0,1 IU/mi.

Os resultados deste estudo demonstram que uma vacina de coqueluche de componente contendo PT, FHA, 69K, e FIM combinado com toxóides de difteria e tétano também podem ser combinados com vacina de poliovírus inativada sem qualquer aumento significativo em reatogenicidade ou perda de imunogenicidade. Em contraste com os resultados com o DTP de célula integral, não houve diminuição da resposta de anticorpo aos antígenos de Bordetella pertussis. Não houve diferenças substancias entre as vacinas IPV preparadas em linhagens de célula MRC-5 ou Vero; as duas vacinas induziram níveis de anticorpo anti-poliovírus de soro mais elevados do que OPV. A demonstração da equivalência de mlPV e vIPV facilita a implementação da vacina de coqueluche acelular em jurisdições com preferência para um IPV y, derivado de uma linhagem de célula específica.

Em conclusão da experimentação reportada neste Exemplo, isto demonstra que uma vacina de coqueluche acelular de cinco componentes pode ser séguramente combinada com qualquer uma das duas vacinas IPV para a quarta dose de vacina entre 17 e 19 meses de idade.

108/120

SUMÁRIO Da INVENÇÃO

Em sumário desta revelação, a presente invenção fornece novas preparações de antígenos de Bordetella e não Bordetella para produzir vacinas de coqueluche de multi5 componente. Tais vacinas são seguras, não reatogênico, imunogênicas e de proteção em seres humanos. Modificações são possíveis no âmbito da presente invenção.

109/120

Centre for Applied Microbiology and Research.

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Tabela 1. Vacinas de coqueluche acelulares

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TABELA 3. Resultados sorológicos de vacinas de coqueluche de componentes em bebês (2, 4 e 6 meses de idade)

113/120

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CLI - Connaught Laboratories Incorporated, Swiftwater, Pennsylvania

115/120

Tabela 4 - Eficácia de Vacinas de Coqueluche Acelulares

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A: definição do caso: 21 dias de tosse espasmódica e cultura positiva

B: definição do caso: tosse de coqueluche branda de pelo menos um dia

Observação 1: limites de confiança

Observação 2: vacina de coqueluche de célula integral

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85. Scheifele D, Gold R et al. Canada Communicable Disease Report 22-3, F1-F3 Feb 1, 1996.

Claims (6)

REIVINDICAÇÕES

1,5 mg de fosfato de alumínio, e um conjugado de uma molécula portadora contendo 20 pg de toxoide tetânico e 10 pg de poliribosil-ribitol fosfato (PRP) de Haemophilus influenzae do tipo b, em que o toxoide pertussis, hemaglutinina filamentosa, aglutinogênios fimbriais, pertactina, toxoide diftérico, toxoide tetânico e poliovírus são formulados de modo que a imunogenicidade dos ditos componentes individuais não é prejudicada pelos outros componentes individuais da composição.

7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de ainda compreender, por dose de 0,5 ml, 0,6% de 2-fenoxietanol.

8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação

1, 2 e 3 nas proporções de 40 D unidades antigênicas de poliovírus do tipo 1, 8 D unidades antigênicas de poliovírus do tipo 2, 32 D unidades antigênicas de

poliovírus do tipo 3 em uma dose única humana.

1, de

1. Composição imunogênica multi-valente para proporcionar proteção em um hospedeiro contra doença causada por infecção por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium

Haemophilus influenzae, essencialmente em:

(a) toxoide pertussis de de nitrogênio,

2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que contém 20 pg de nitrogênio de toxoide pertussis, 20 pg de nitrogênio

de hemaglutinina filamentosa, 5 pg de nitrogênio de aglutinogênios e 3 pg de nitrogênio de pertactina em uma dose única humana. 3. Composição imunogênica, de acordo com a

reivindicação 2, caracterizada pelo fato do componente de toxoide tetânico (b) estar presente em uma quantidade de 5 Lfs e do componente de toxoide diftérico (c) estar presente em uma quantidade de 15 Lfs.

2/3 dose única humana, a dita composição imunogênica sendo formulada como uma vacina para administração in vivo a um hospedeiro, em que os componentes individuais da dita composição são formulados de uma forma em que a imunogenicidade dos ditos componentes individuais não é prejudicada pelos outros componentes individuais da dita composição, e em que a composição ainda compreende um adjuvante que é fosfato de alumínio.

2 e 3, na quantidade de poliovírus do tipo 1, na

3 pg de pertactina,

15 Lf de toxoide diftérico,

5Lf de toxoide tetânico,

40 D unidades antigênicas de poliovírus do tipo 1,

8 D unidades antigênicas de poliovírus do tipo 2,

3/3 reconstituído para administração na dita composição imunogênica pelos componentes da composição.

6. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende, por 0,5 ml dose:

20 pg de toxoide pertussis,

20 pg de hemaglutinina filamentosa,

3 em diphtheriae, caracterizada poliovírus e por consistir em uma quantidade de

4. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do poliovírus compreender uma mistura de poliovírus inativado dos tipos

5 pg de aglutinogênios fimbriais dos tipos 2 e 3,

5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do conjugado (e) ser proporcionado em uma forma liofilizada e ser

Petição 870180160549, de 10/12/2018, pág. 10/12

5 a 10 D unidades antigênicas de poliovírus quantidade do tipo 3,

e) um conjugado de de 20 a 50 D unidades antigênicas uma molécula portadora contendo de a 35 pg de toxoide tetânico e de 5 a

15 pg de poliribosil-ribitol fosfato (PRP) de Haemophilus influenzae do tipo b, sendo que as quantidades respectivas dos componentes (a), (b), (c) , (d) e (e) são determinadas na base de uma

Petição 870180160549, de 10/12/2018, pág. 9/12

5 a 30 pg hemaglutinina filamentosa em uma quantidade nitrogênio, pertactina em uma quantidade de nitrogênio e aglutinogênios fimbriais dos uma quantidade de 1 a 10 pg de nitrogênio;

toxoide pertussis, hemaglutinina filamentosa, e aglutinogênios fimbriais dos tipos 2 e 3 presentes em forma purificada,

Lfs, (b)

c)

d) estão toxoide tetânico em uma quantidade de 1 a 10 toxoide diftérico em uma quantidade de 10

Lfs, poliovírus inativado poliovírus

20 a 50 D quantidade do de na forma de uma mistura de tipo 2, inativado dos tipos unidades antigênicas de na poliovírus

5 a 30 pg de a 15 pg de tipos 2 em que pertactina

6, caracterizada pelo fato do conjugado ser proporcionado em forma liofilizada e ser reconstituído para administração na dita composição imunogênica pelos componentes da composição.