BRPI9811518B1 - Composição para biocontrole das doenças de planta e método para fornecer às plantas proteção contra patógenos - Google Patents

Description

"COMPOSIÇÃO PARA BIOCONTROLE DAS DOENÇAS DE PLANTA E MÉTODO PARA FORNECER ÀS PLANTAS PROTEÇÃO CONTRA PATÓGENOS". A presente invenção foi feita com o auxilio do Projeto Embrião n.° NYC153-472 da USDA (United States Department of Agriculture — Departamento de Agricultura dos Estados Unidos) O Governo dos Estados Unidos poderá ter alguns direitos.

Esta solicitação tem seus direitos garantidos pelo Pedido de Patente Provisória N.° de Série 60/053.310, com data de 22 de julho de 1997.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao biocontrole das doenças das plantas com Bacillus subtllis, Pseudomonas putida e Sporobolomyces roseus.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Existem aproximadamente 40 produtos disponíveis no mercado para o controle de doenças de plantas no mundo inteiro. Há produtos de biocontrole para diversas patógenos, como descrito recentemente por Fravel et al. em "Availability and Application of Biocontrol Products", Biological and Culture Tests for Control of Plant Diseases, 11:1-7 (1996). Pelo menos 27 gêneros de fungos, 3 de bactérias e 4 de nematóides são alvos do controle destes produtos. Mais da metade desses produtos controlam os fungos transmitidos pelo solo. Os próprios agentes de biocontrole diferem entre si e incluem pelo menos 9 gêneros de fungos, 4 de bactérias e um actinomicete. Os produtos de biocontrole são usados em uma grande variedade de produtos agrícolas, que inclui produtos cultivados em estufa, em fileiras, em campo, produtos perenes, árvores e lenha, assim como em sistemas especiais, como no cultivo de cogumelos. Os produtos são aplicados de várias formas. Podem ser borrifados ou aplicados diretamente sobre as plantas ou sobre os frutos após a colheita, incorporados ao solo, pode ser feita imersão das raízes, podem ser usados para tratar as sementes ou inseridos nas árvores ou produtos de lenha. Os produtos de biocontrole atualmente disponíveis no mercado americano incluem Aspire, AQ-10, Galltrol A, Norbac 84C, Bio-Save 10, Bio-Save 11, Blightban A506, Victus, Epic, Kodiak, Deny, Mycostop, Bynab-T e W, T-22G e T-22HB, e SoilGard.

Em vários casos, os patógenos são controlados por agentes de biocontrole de sua mesma espécie ou gênero. Por exemplo, o Agrobacterinum radiobacter não patogênico é usado para o controle de galha de coroa (Galltrol-A, Nogall, Diegall). O Fusarium oxysporum não patogênico é usado no controle de F. oxysporum (Biofox C, Fusaclean) e de F. moníliforme (Biofox C) . 0 Pseudomonas solanacearum não patogênico controla o P. solanacearum patogênico (PSSOL) , e o P. fluorescens é usado para controlar P. tolassii (Conquer, Victus). 0 Pythium oligandrum é usado no controle de P. ultimum (Polygandron). Esses agentes podem agir por meio de antibiose (A. Radiobacter; Kerr, A. "Biological Control of Crown Gall through Production af Agrocin 84", Plant Pis.; 64:25-30 (1980)), competição e resistência sistêmica induzida (Fusaclean; Alabouvette, et al., "Recent Advances in the Biological Control of Fusarium Wilts, "Pestic. Sei., 37:365-373 (1993)), ou parasitismo (Polygandron; Vesely, D. "Germinating Power of Oospores of Pythium oligandrum in a Powder Preparation," Folia Microbiol., 32:502 (1987)).

Alguns agentes de biocontrole controlam somente um patógeno. Por exemplo, tanto Conquer quanto Victus contêm P. fluorescens usado para controlar o manchas de cogumelo causadas por P. tolassii Costuma-se crer que os agentes de biocontrole servem a um nicho limitado do mercado devido ao fato de muitos produtos terem uma aplicabilidade limitada. Por causa, em parte, dessa percepção, muitos produtos de biocontrole são fabricados por pequenas empresas. Contudo, a maior parte desses produtos atuam sobre múltiplos patógenos ou plantas. O SoilGard, por exemplo, controla o tombamento causado por espécies de Pythium e Rhizoctonia solani em plantas cultivadas em sementeiras e transplantes de vegetais, bem como por Sclerotium rolfsii em cenouras e pimentões cultivados no campo (Lumsden et al. , "Biological Control of Damping-off Caused by Pythium ultimum and Rhizoctania solani with Gliocladium virens in Soilless Mix", Phytopatholoqy, 79:361-66 (1969); Ristaino et al., "Influence of lsoiates of Gliocladium virens and Delivery Systems on Biological Control of Southern Blight on Carrot and Tomato in the Field", Plant Pis., 78:153-56 (1994);

Ristaino et al., "Soil Solarization and Gliocladium virens Reduce the Incidence of Southern Blight in Bell Pepper in the Field", Phytopatholoqy, 84:1114 (1994)). Alguns produtos chegam a controlar patógenos dissimilares. Deny controla o Rhizoctonia, o Pythium e o Fusarium, bem como uma série de nematóides. BlightBan A506 pode ser borrifado em árvores ou plantas de morango, tomate e batata para prevenir danos causados por geadas e fogo selvagem causado pelo Erwinia amylovora. Espécies de Trichoderma podem controlar uma vasta gama de patógenos e aparecem em mais produtos do que qualquer outro microorganismo (Anti-Fungus; Binab T; Supresivit; T-22G e T22HB; Trichopel, Trichoject, Trichodowels e Trichoseal; TY) . Produtos que contêm espécies de Trichoderma controlam espécies de Amillaria, Botrytis, Chondrostrenum, Colletotrichum, Fulvia, Fusarium, Monilia, Nectria, Phytophthora, Plasmopara, Pseudoperonospora, Pythium,· Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium, Verticillium e fungos que causam apodrecimento de madeiras.

Muitos produtos de biocontrole são aplicados em ambientes agrícolas com baixa diversidade ecológica para facilitar o estabelecimento do agente de biocontrole O SoilGard e o T-22G, por exemplo, são misturados a um preparado para plantio sem solo. Da mesma maneira, o AntiFungus é adicionado ao solo após a aplicação de vapor ou fumigação. Outros agentes de biocontrole são usados para proteger partes das plantas. O Galltrol-A, o Nogall, o Diegall e o Norbac 84C são usados como imersão para raízes durante transplantes para prevenir o apodrecimento da coroa. 0 Aspire, o Bio-Save 10 e o Bio-Save 11 são aplicados após a colheita em frutas cítricas e pomos para protegê-las de doenças características dessa fase. Vários agentes de biocontrole, inclusive o Blue Circle, o Epic, o Kodiak e ο T-22HB são aplicados diretamente nas sementes. O Binab é borrifado, misturado a preparados para plantio sem solo, aplicado em superfícies ou inserido em péletes no tronco para controlar o apodrecimento da madeira e seus derivados. O Mycostop é aplicado por meio de borrifo, encharque ou irrigação.

Para que o biocontrole seja um componente válido de um sistema integrado de manejo de pestes, é necessário que sejam feitas pesquisas em várias áreas. Esta abordagem integrada dependerá de avaliações precisas das populações de patógenos presentes em um campo agrícola e do conhecimento dos limites econômicos em relação aos danos aos patógeno. A pesquisa deve der direcionada á compreensão dos parâmetros ecológicos importantes para a produção agrícola e para a sobrevivência e eficácia dos agentes de biocontrole, bem como à identificação e ao desenvolvimento de novos agentes de biocontrole para o controle de doenças de plantas. Um bom conhecimento da biologia e ecologia do agente de biocontrole, do patógeno e da planta hospedeira pode ajudar a explorar os pontos fortes e fracos desses organismos com o intuito de melhorar o desempenho da ação de controle. Da mesma forma, um bom conhecimento das condições ecológicas, biológicas e físicas necessárias para um biocontrole bem sucedido permitirão otimizar essas condições e assim atingir os melhores níveis possíveis de controle. A influência da planta hospedeira na composição e tamanho das comunidades microbianas recebeu, até agora, pouca atenção. Larkin e seus colaboradores (Larkin et al., "Ecology of Fusarium oxysponum f. sp. Niveum in Soils Suppressive and Conducive to Fusarium Wilt of Watermelon", Phytopatholoqy, 83:1105-16 (1993); (Larkin et al., "Effect of Successive Watermelon Planting on Fusarium oxysporum and other Microorganisms in Soils Suppressive and Conducive to Fusarium Wilt of Watermelon", Pathology, (1993)) observaram um efeito específico de cultivo de rizosfera no solo e comunidades microbianas na rizosfera associadas a diferentes cultivos de melancia, üm cultivo em particular, a Crimson Sweet, promoveu o desenvolvimento de microorganismos antagônicos ao patógeno de murcha de Fusarium. Faz-se necessária uma pesquisa mais aprofundada para determinar o papel desse tipo de interação no aperfeiçoamento do biocontrole. A falta de técnicas adequadas de análise de amostras de solo constitui uma barreira para uma boa compreensão dos sistemas de solo microbianos. Vários motivos dificultam o cálculo preciso das populações de muitos microorganismos do solo, principalmente fungos. 0 termo "unidade de formação da colônia", ou CFU, reflete o fato de as colônias que surgem em uma lâmina poderem derivar de microconídias, macroconídias, clamidosporos, ascosporos, fragmentos de hifa ou outros propágulos, por exemplo. Além disso, a eficiência de recuperação dos propágulos pode variar de um solo para outro. Em alguns casos, como nas espécies de Fusarium, os patógenos não são distinguíveis morfologicamente dos não-patógenos. Aliás, a cultura de muitos microorganismos em meios de cultura padrões não é fácil, embora eles tenham um papel significativo na supressão de doenças, como é o caso do micoparasita Sporidesmium sclerotivorum para o controle da baixa de Sclerotinia (Adams et al., "Economical Biological Control of Sclerotinia Lettuce Drop by Sporidesmium sclerotivorum Phytopathology, 80:1120-24 (1990)). Por último, mesmo quando a quantidade de propágulos pode ser calculada com exatidão, a eficácia desses propágulos depende de seu status nutricional e dos tipos e quantidades de outros microorganismos presentes no sistema do solo. Todas esses problemas derivam da dificuldade de coletar amostras, principalmente de micrositas. A pesquisa é necessária para desenvolver técnicas rápidas, confiáveis e precisas de análise das comunidades microbianas de solo.

No futuro, a pesquisa deverá dar ênfase a combinações de dois ou mais agentes de biocontrole, pois essas podem oferecer um controle mais consistente e eficaz do que um único agente de biocontrole. Seria possível combinar, por exemplo, agentes de biocontrole com condições ambientais otimais diferentes, ou agentes com diversos mecanismos de ação. Os agentes de biocontrole podem até atuar em sinergia, como na combinação de espécies de Fusarium oxysporum com Pseudomonas para controlar o murchamento Fusário (Lemanceau et al., "Biological Control of Fusarium Diseases by Fluorescent Pseudomonas and Non-pathogenic Fusarium," Crop Prot., 10:279-86 (1991)). É necessário pesquisar, também, a interação do biocontrole com outros métodos de controle. 0 aquecimento subletal (solarização) ou o estresse causado por pesticidas, por exemplo, podem enfraquecer um patógeno, tornando-o mais vulnerável à ação dos agentes de biocontrole. (Lifshitz et al., "The Effect of Sublethal Heating on Sclerotia of Sclerotium rolfsii" Can. J. Microbiol., 29:1607-10 (1983); Tjamos, et al., "Detrimental Effects of Sublethal Heating and Talaromyces flavus on Microsclerotia of Verticillium dahliae," Phytopatholoqy, 85:388-92 (1995)). Devem ser desenvolvidos, também, sistemas adequados para a produção, formulação e entrega de agentes de biocontrole, pois esses processos podem afetar enormemente a eficácia dos mesmos.

Apesar da existência e uso de agentes de biocontrole na agricultura, há uma necessidade constante de desenvolver novos agentes. Esta invenção visa suprir tal necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção trata de Bacillus subtilis, Pseudomonas putida e Sporobolomyces noseus isolados, os quais são muito úteis como agentes de biocontrole.

Os agentes de biocontrole constituem uma forma eficaz de fornecer às plantas uma proteção contra os patógenos de plantas. Este método envolve a aplicação de agentes de biocontrole diretamente nas plantas, no solo ao redor destas ou nas sementes, em condições efetivas de oferecer proteção contra doenças aos espécimes tratados ou produzidos a partir de sementes tratadas.

Apresente invenção também visa uma melhora no crescimento das plantas, mediante a aplicação de agentes de biocontrole diretamente nas plantas, no solo ao redor destas ou nas sementes, em condições efetivas de melhorar o crescimento dos espécimes tratados ou produzidos a partir de sementes tratadas.

Os agentes de biocontrole desta invenção são muito úteis na agricultura para a proteção das plantas contra uma variedade de doenças causadas por bactérias, fungos e vírus. Além disso, esses agentes podem melhorar o crescimento das plantas tratadas. 0 mais significativo é que esses efeitos são atingidos sem oferecer perigos à saúde de animais ou seres humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A Figura 1 mostra ensaios de cultura pareadas in vitro para a antibiose de Fusarium graminearum e F. moniliforme pelos seguintes bioprotetores potenciais: A) F. graminearum com e sem Bacillus subtilis; B) F. monili forme com e sem Pseudomonas putida; e C) F. graminearum com e sem Sporobolomyces roseus. A Figura 2 mostra sementes de trigo infectadas naturalmente com F. graminearum. A planta da direita foi cultivada a partir de uma semente tratada com Bacillus subtilís, ao passo que a da esquerda provém de uma semente não-tratada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção trata de Bacillus subtilis, Pseudomonas putida e Sporobolomyces roseus isolados, todos úteis como agentes de biocontrole para proteger as plantas de doenças e melhorar seu crescimento. 0 Bacillus subtilis é uma bactéria formadora de esporos, Gram positiva. É conhecida como isolado 144 e seus Números de Registro na Embrapa Trigo, na Cornnll e na ATCC são, respectivamente: 144/88.4Lev, Pma007BR-97 e ATCC 202152. Essa bactéria apresenta uma forte antibiose sobre Cochliobolus sativus (mancha marrom/ podridão comum das raizes de cereais), Colletotrichum graminicola (antracnose do milho), Fusarium graminearum (fusariose ou giberela dos cereais, podridão dos grãos, do colmo e da espiga do milho), Fusarium moniliforme (podridão do grão, do caule, fusariose do milho), Pyrenophora tritici-repentis (mancha bronzeada do trigo), Stagonospora nodorum (mancha de stagonospora), Stagonospora avenae f. sp. triticea (mancha de stagonospora avenae), e Stenocarpella maydis (podridão branca dos grãos e do caule do milho). O Bacillus subtilis desta invenção apresenta um excelente controle da transmissão por sementes de Cochliobolus sativus, Pyrenophora triticirepentis e Fusarium graminearum no trigo e de Fusarium moniliforme no milho. Também previne a inoculação aérea de espigas de trigo floridas com Fusarium graminearum, diminui a fregüência de infecção de grãos por Fusarium, reduz a perda de peso dos grãos causada por Fusarium, além de reduzir drasticamente a contaminação de grãos pela micotoxina de oxinivalenol. Além disso, esta bactéria pode ser usada para reduzir a contaminação de grãos e outros produtos agrícolas com metabolitos secundários que são prejudiciais. A capacidade endofítica dessa bactéria sugere outras aplicações no controle de doenças de plantas. Mudinhas de sementes e outras unidades de propagação de plantas podem receber inoculação para uma proteção a longo prazo.

0 Pseudomonas putida é uma bactéria não esporogênia Gram negativa. É conhecida como biátipo B isolado 63 e seus Números de Registro na Embrapa Trigo, na Comeu e na ATCC são, respectivamente: 63/88 4B, Ppu002BR-97 e _____________.

Essa bactéria apresenta uma forte antibiose sobre o Fusarium graminearum e uma certa antibiose sobre o Cochliobolus sativus, o Colletotrichum gnaminicola, o Fusarium moiliforme, o Stagonospona nodorum e o Stenocarpella maydis (podridão de grãos/caule de milho). A Pseudomonas putida da presente invenção é eficaz no controle da transmissão por meio de sementes de Biopolaris sorokinianum e Fusarium graminearum no trigo e de Fusarium moniliforme no milho. Apresenta, também, um excelente controle da transmissão pelo solo de Fusarium graminearum no milho, bem como uma prevenção da inoculação aérea de espigas de trigo floridas com Fusarium, além de reduzir substancialmente a contaminação de grãos por Fusarium mycotoxin deoxinivalenol (DON). 0 Sporobolomyces roseus é um fermento, de pigmentação vermelha. É conhecido como isolado 53 e seus Números de Registro na Embrapa Trigo n° 53/94.535, na Cornell e na ATCC, SroOOl BR-97 e __________ Este agente de biocontrole é útil na prevenção da inoculação de espigas floridas com Fusarium graminearum, diminui a freqüência de infecção de grãos por Fusarium, e reduz a contaminação de grãos pela micotoxina. É um organismo muito competitivo na colonização de substratos orgânicos e é um esporulador de profusão. Pode suprimir a sobrevivência e a esporulação de patógenos de plantas transmitidos por restos de plantas em resíduos de produtos agrícolas e assim reduzir as doenças em produtos plantados posteriormente, principalmente quando se faz uso do sistema de plantio direto.

Os agentes de biocontrole desta invenção são úteis em um método de proteção das plantas contra os patógenos de plantas. Este método envolve a aplicação de agentes de biocontrole diretamente nas plantas, no solo ao redor destas ou nas sementes, em condições efetivas de oferecer proteção contra doenças aos espécimes tratados ou produzidos a partir de sementes tratadas. 0 método de proteger as plantas contra patógenos usado nesta invenção é útil no que diz respeito a uma vasta gama de patógenos, incluindo virus, bactérias e fungos. As plantas podem ser protegidas, entre outras coisas, dos seguintes fungos pelo uso do método da presente invenção: Fusarium oxysporum, Fusarium gramínearum, Fusarium monilíforme, Cochliobolus sativus, Collectotrichum graminicola, Stagonospora nodorum, Stagonospora avenae, Stenocarpella maydis e Pyrenophoma tritici-repentis.

Esta invenção também visa uma melhora no crescimento das plantas mediante a aplicação de agentes de biocontrole diretamente nas plantas, no solo ao redor destas ou nas sementes, em condições efetivas de melhorar o crescimento dos espécimes tratados ou produzidos a partir de sementes tratadas.

No que diz respeito ao uso dos agentes de biocontrole da presente invenção para melhorar o crescimento de plantas, são contempladas várias formas de aprimoramento ou promoção do crescimento de plantas. É possível fazê-lo desde o estágio inicial de crescimento das sementes, até quando a planta já é adulta. Por exemplo, conforme esta invenção, o crescimento de plantas inclui uma maior produção, mais sementes produzidas, uma percentagem maior de sementes germinadas, um aumento no tamanho das plantas, uma biomassa maior, frutos maiores e em mais quantidade, coloração precoce dos frutos, bem como maturação precoce das plantas e dos frutos. Como resultado, a presente invenção oferece um benefício econômico significativo aos agricultores. Δ germinação e maturação precoces, por exemplo, permitem a cultivação de plantas em áreas onde uma estação cultivável muito curta impediría seu cultivo normal. Uma maior percentagem de sementes germinadas resulta em uma melhor aproveitamento das plantações e em um uso mais eficiente das sementes. Maior produtividade, plantas maiores e a produção de uma biomassa maior levam a um aumento na receita gerada por uma determinada área cultivada.

Os métodos desta invenção podem ser utilizados para tratar uma variedade de plantas ou sementes, protegendo-as de doenças e/ou melhorando seu crescimento. As plantas adequadas incluem dicotiledôneos e monocotiledôneos. Essas podem incluir, mais especificamente: alfafa, arroz, trigo, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endivia, repolho, couve de Bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolos, rabanete, espinafre, cebola, alho, beringela, pimentão, aipo, cenoura, abóbora squash, abóbora, abobrinha, pepino, maçã, pêra, frutas citricas, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo e cana-de-açúcar. Exemplos de plantas ornamentais adequadas incluem: Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petúnia, pelargônio, poinsétia, crisântemo, cravo e zínia.

Os métodos desta invenção podem ser realizados mediante uma série de procedimentos, com o tratamento total ou parcial das plantas, compreendendo as folhas, caules, raizes, produtos das plantas (por exemplo: grãos, frutos, forrageria, fragmentos de plantas) , propágulos (borbulhas, por exemplo), etc. Alguns métodos adequados de aplicação são os borrifos a alta ou baixa pressão, as imersões e as injeções. Quando se trata de sementes, o agente de biocontrole pode ser aplicado com borrifos a alta ou baixa pressão, revestimento, imersão ou injeção. Os agentes de biocontrole também podem ser aplicados sobre restolhos de plantas infestados com patógenos para reduzir o inóculo que podería infectar outras plantas, principalmente quando se pratica uma agricultura de conservação de colheitas. Produtores experientes podem, certamente, pensar em outras formas de aplicação. Uma vez tratadas com o agente de biocontrole desta invenção, as sementes podem ser plantadas em solo natural ou artificial e cultivadas usando métodos de cultivo tradicionais. Após terem sido propagadas a partir de sementes tratadas conforme a presente invenção, as plantas podem ser tratadas com uma ou mais aplicações dos agentes de biocontrole desta invenção a fim de protegê-las de doenças e/ou melhorar seu crescimento.

Conforme a presente invenção, os agentes de biocontrole podem ser aplicados nas plantas ou sementes sozinhos ou misturados a outros materiais. Podem também ser aplicados separadamente nas plantas, e os outros materiais serem aplicados em outros momentos.

Conforme a presente invenção, uma composição adequada para o tratamento de plantas ou sementes é constituída por um agente de biocontrole em um vetor. Alguns vetores adequados são a água, soluções aquosas, pastas semifluidas, sólidos (por exemplo: turfa, trigo, vermiculita e solo pasteurizado) ou pós secos. Nessa forma, a composição deve conter de 106 a 108 preferivelmente 107, unidades de formação de colônias do agente de biocontrole por mililitro do vetor.

Embora não seja necessário, essa composição pode conter aditivos adicionais como fertilizantes, inseticidas, fungicidas, nematocidas ou misturas desses, Entre os fertilizantes adequados encontra-se o (NH4)2N03. Um exemplo de inseticida é o Malathion. Entre os fungicidas, pode-se citar o Captan.

Outros aditivos adequados incluem agentes de tampão, agentes umectantes, agentes de revestimento e agentes abrasivos. Esses materiais podem ser usados para facilitar a ação desta invenção. Além disso, o agente de biocontrole pode ser aplicado nas sementes com outros materiais convencionais de formulação e tratamento de sementes, tais como argila e polissacarideos.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Ensaios in vitno para a Antibiose de F. graminearum por Bioprotetores Em tratamentos com culturas pareadas, o crescimento radial (mm) do F. graminearum na presença ou ausência de Bacillus subtilis, Pseudomonas putida ou Sporobolomyces roseus foi medido como um meio de verificar a antibiose do patógeno pelo bioprotetor potencial. Caso isolado de bactéria ou fermento foi transferido, criando um circulo, no meio H ágar de dextrose de batata (PDA - potato dextrose ágar) de por meio de um pequeno funil estéril de vidro. Após dois dias de incubação em temperatura ambiente, um disco de ágar contendo micélio do patógeno foi transferido para o centro da colônia circular do bioprotetor ou, no tratamento de controle, para uma lâmina de meio não-inoculado. 0 crescimento radial do patógeno foi medido após cinco dias de incubação. Houve um mínimo de quatro repetições para cada tratamento.

Exemplo 2 - Efeito de Bioprotetores na Infecção de Sementes de Milho Infestadas com E. moniliforme Sementes de milho infectadas naturalmente com F. moniliforme e tratadas com Bacillus subtilis e Pseudomonas putida foram testadas para recuperação de patógenos. Cem sementes foram postas em várias lâminas de cultura com PDA de 25% (dez sementes por lâmina) . A presença de patógenos nas lâminas foi avaliada após um período de incubação de cinco dias sob luz fluorescente em temperatura ambiente. Cada tratamento foi repetido quatro vezes.

Exemplo 3 - Efeito de Bioprotetores na Emergência de Sementes de Milho Plantadas em Solo Infestado com F. graminearum Sementes de milho tratadas com Bacillus subtilis e Pseudomonas putida foram plantadas em solo de estufa autoclavado (Metro Mix) misturado na proporção de 9:1 de volume com grãos de aveia autoclavados e inoculados com F. graminearum. Foram feitas quatro repetições de cem sementes (dez sementes por pote) para cada tratamento. Todos os tratamentos foram avaliados com base na percentagem de emergência vinte e um dias após o plantio.

Exemplo 4 — Efeito de Bioprotetores Aplicados nas Sementes na Emergência de Sementes de Trigo Infectadas com F. graminearum Ά cultivar de trigo NY Batavia infectado naturalmente com F. graminearum foi tratada com pastas de Bacillus subtilis e Pseudomonas putida e depois plantada em solo de estufa (Metro Mix). Foram feitas quatro repetições de 100 sementes (10 sementes por pote) para cada tratamento. Todos os tratamentos foram avaliados com base na percentagem de germinação vinte e um dias após o plantio.

Exemplo 5 — Efeito de Bioprotetores Aplicados nas Sementes na Emergência de Trigo Plantado em Solo Infestado com F. graminearum Sementes de trigo tratadas com pastas de Bacillus subtilis, Pseudomonas putida ou tiabendazol (Gustafson LSP, 0.25 onças fluidas por 100 libras de sementes) foram plantadas em solo de estufa (Metro Mix). Foram feitas quatro repetições para cada tratamento. Todos os tratamentos foram avaliados com base na porcentagem de germinação sete dias após o plantio.

Como demonstrado abaixo na Tabela 1, os tratamentos com Bacillus subtilis e P. putida reduziram significativamente o crescimento radial de F. graminearum in vitro. 0 mesmo não ocorreu com o tratamento com S. roseus.

Tabela 1. Efeito de Bioprotetores no Crescimento de Fusarium graminearum e F. moniliforme em Cultura.

Como demonstrado abaixo na Tabela 2, todos os tratamentos reduziram significativamente a recuperação da F. moniliforme de sementes de milho infectadas naturalmente. A Bacillus subtilis apresentou' os maiores índices de controle. Nesta tabela, as médias dentro de uma mesma coluna diferem significativamente entre elas (P=0.05) quando seguidas por letras diferentes, de acordo com o teste de significância de múltiplo alcance de Duncan (Little, et ai., Aqriculture Experimentation, p. 350 (1978), aqui incorporado por via de referência).

Tabela 2. Efeito de Bioprotetores no Crescimento de F. monilifomme a partir de Sementes de Milho Infestadas Naturalmente.

Como demonstrado na Tabela 3, todos os tratamentos resultaram em uma emergência significativamente maior do que nos espécimes não-tratados. Nesta tabela, as médias dentro de uma mesma coluna diferem significativamente (em P=0.05) quando seguidas por letras diferentes, de acordo com o teste de significância de múltiplo alcance de Duncan.

Tabela 3. Efeito de Bioprotetores Aplicados nas Sementes na Emergência de Milho Plantado em Solo Infestado com F. graminearum.

Os tratamentos com Bacillus subtilis e Pseudomonas putida resultaram em uma emergência significativamente maior do que nos espécimes não-tratados, como demonstra a Tabela 4. Nesta tabela, as médias dentro de uma mesma coluna diferem significativamente (em P=0.05) quando seguidas por letras diferentes, de acordo com o teste de significância de múltiplo alcance de Duncan.

Tabela 4. Efeito de Bioprotetores Aplicados nas Sementes na Emergência de Sementes de Trigo Infectadas com E. gmaminearum Plantadas em Solo.

Como demonstrado na Tabela 5, todos os tratamentos resultaram em uma emergência significativamente maior do que nos espécimes não-tratados. A Bacillus subtilis apresentou a maior percentagem de emergência após o tratamento com tiabendazol. Nesta tabela, as médias dentro de uma mesma coluna diferem significativamente (em P=0.05) quando seguidas por letras diferentes, de acordo com o teste de significância de múltiplo alcance de Duncan.

Tabela 5. Efeito de Bioprotetores Aplicados nas Sementes na Emergência de Sementes de Trigo Plantadas em Solo Infestado com F. qraminearum, Todos os bioprotetores testados apresentaram um certo controle da podridão das sementes e da queima das mudinhas causadas por Fusarnium graminearum ou F. moniliforme. A bactéria esporogênia Bacillus subtilis é a mais promissora como agente bioprotetor contra as espécies de Fusarium transmitidas via semente e via solo.

Exemplo 6 — Bioproteção do Trigo Sementes de cultivar de trigo Embrapa 24 infectadas com Pyrenophora tritici-repentis foram obtidas do serviço básico de produção de sementes da Embrapa, em Passo Fundo, RS, Brasil. Os seguintes fungos e bactérias bioprotetores foram aplicados nas sementes: Bacillus subtilis e Pseudomonas putida biótipo B. Sementes tratadas e não-tratadas com Iprodione mais Thiram foram usadas como controle. Foram criadas colônias de cada bactéria em ágar de dextrose de batata (isto é, PDA) por vinte e quatro horas a uma temperatura de 24 ± 2°C. As células bacterianas foram removidas da superfície do meio de cultura com um pincel e postas em água destilada estéril. A concentração de cada bactéria era, aproximadamente, 106 CFU/ml. Foi, então, aplicada uma suspensão por meio de imersão das sementes durante três minutos; em seguida, elas secaram em temperatura ambiente por vinte e quatro horas. Δ mistura fungicida foi testada com uma dosagem de 150 g de Rovrin WP por cada 100 kg de sementes. As sementes não-tratadas foram embebidas em água destilada estéril por três minutos, e depois secaram da mesma maneira das sementes tratadas. Para o experimento em laboratório, cada tratamento foi repetido quatro vezes (em cada repetição, cem grãos, dez por cada lâmina) e posto sob uma luz negra por um fotoperíodo de doze horas a uma temperatura de 24 ± 2°C. A disposição experimental foi um design completamente randômico. A presença de P. tritici-repentis foi determinada cinco dias após o plantio. Os dados foram expressos em percentagem de sementes das quais foi recuperado o patógeno. Foi feito um experimento para avaliar a incidência de transmissão em lotes de sementes altamente infectadas. A transmissão foi baseada na percentagem de mudinhas com lesões características nos coleóptilos. 0 crescimento radial foi medido, no teste feito em laboratório, usando o método do funil (Luz, W.C., "Controle biológico das doenças na espermosfera," Controle biológico de doenças de plantas, EMBRAPA-CNPDA, Jaguarina, Brasil páginas 25-31 (1991), aqui incorporado por via de referência).

Para o experimento de campo, as sementes de cada tratamento foram plantadas manualmente em lotes com doze fileiras de três metros de comprimento. 0 espaço entre as fileiras era de vinte centímetros e a quantidade de sementes era equivalente a cento e vinte quilos por hectare. Os lotes tratados em cada experimento foram distribuídos de forma randômica. A emergência foi medida vinte e um dias após a semeadura. Quando maduros, foi feita a colheita em oito fileiras centrais de cada lote e a produção foi calculada em kg/ha. Os dados foram sujeitos a análise de variação e as médias obtidas de acordo com o teste de múltiplo alcance de Duncan (P =0.05).

Ambas as bactérias bioprotetoras inibiram fortemente o crescimento radial da P. tritici-repentis e sua recuperação a partir de sementes infectadas (Tabela 6). Tratamentos com Bacillus subtilis e Pseudomonas putida biótipo B inibiram totalmente a transmissão de P. tritici-repentis em mudinhas (Tabela 6).

Tabela 6. Efeito de Bioprotetores sobre Crescimento Radial, a Recuperação a Partir de Sementes Infectadas, e a Transmissão Percentual de Pyrenophora tritici-repentis em Sementes.

As sementes também estavam infectadas naturalmente, com uma menor incidência, por Fusarium graminearum Schwabe e por Bipolaris sorokinianum (Sacc.) Shoem; as duas bactérias também inibiram a recuperação de patógenos a partir de sementes.

Os dados do experimento de campo encontram-se na Tabela 7.

Tabela 7. efeito de Bioprotetores Aplicados nas Sementes sobre emergência de Mudinhas e a Produção de Trigo no Campo.

Todos os tratamentos químicos ou biológicos aumentaram significativamente a emergência de mudinhas de trigo em relação ao que normalmente ocorre em campos não-tratados. O Bacillus subtilis e o Pseudomonas putida biótipo B apresentaram o maior aumento de produção em relação aos campos não-tratados (Tabela 7).

Os efeitos benéficos da rizobactéria promotora de crescimento e bioproteção de plantas (isto é, PGPBR) foram analisados (Bakker et al., "Suppression of Soil-Borne Plant Pathogens by Fluorescent Pseudomonads: Mechanisms and Prospects," Biotic Interactions and Soil Borne Diseases, Ed. A.B.R. Beemster, et al., páginas 21 7-23, Amsterdam, The Netherlands, Elsevier (1991); Kloepper, J.W. "Plant Growth-Promoting Rhizobacteria as Biological Control Agents of Soilbome Diseases," The Biological Control of Plant Diseases, páginas 142-52 (1991); Luz, W.C., "Microbiolização de selo mentes para o controle de doenças das plantas," Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, Brasil, W.C. da Luz, J.M.C. Fernandes, A.M. Prestes e E.C. Picinini, ed., páginas 35-77 (1993); Luz, W.C., "Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas e de bioproteção, "Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, Brasil, W.C. da Luz, J.M.C. Fernandes, A.M. Prestes e E.C. Picinini, ed., páginas 1-49 (1996), aqui incorporados por via de referência), verificando os benefícios de fungos bioprotetores (Harman, G.E., "Seed Treatments for Biological Control of Plant Disease," Crop. Prot., 10:166-71 (1991), aqui incorporado por via de referência). Os agentes microbianos usados como bioprotetores e estimulantes de produção constituirão uma tática importante para o controle de doenças no próximo século (Luz, W.C. da, "Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas e de bioproteção". Páginas 1-49 em W.C. da Luz, J.M.C. Fernandes, A.M. Prestes and E.C.

Picinini, ed. , Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, Brasil (1996), aqui incorporados por via de referência). As duas PGPBRs aqui apresentadas demonstraram-se muito promissoras como estimulantes de crescimento e bioprotetores do trigo contra doenças.

Exemplo 7 - Biocontrole da Sarna do Trigo com Antagonistas Microbianos Foram cultivadas algumas plantas de trigo de primavera ND594 em uma estufa na Universidade Cornell, em Ithaca, NY. Na fase de meia antese, algumas espigas foram borrifadas com água ou com suspensões de células de microorganismos bioprotetores potenciais. Vinte e quatro horas depois, todas as espigas foram então inoculadas, para fins de teste, com uma suspensão de esporos de F. graminearum, e as plantas foram incubadas durante a noite a uma alta umidade relativa. Em seguida, as plantas cresceram em uma bancada em uma estufa em condições ambientes durante a fase de maturação dos grãos. As espigas colhidas foram analisadas em termos da incidência de sementes infectadas por Fusarium ,■ peso de 100 grãos, e conteúdo de desoxinivalenol (DON). A infecção por Fusarium foi determinada pelo crescimento característico do patôgeno a partir de sementes incubadas em teste de biotter após o inicio da germinação seguida por congelamento para matar os embriões das sementes. 0 DON foi analisado mediante uma cromatografia líquida de alta pressão no Laboratório de Diagnose Veterinária de Cornell. 0 Bacillus subtilis (Embrapa-Trigo) , o Pseudomonas putida biótipo B (Embrapa-Trigo) e o Sponobolomyces roseus (EmbrapaTrigo) ofereceram uma proteção consistente às espigas, resultando em aumentos médios (três experimentos) no peso dos grãos em relação às espigas não-protegidas. A Tabela 8 demonstra a proteção dos grãos de trigo por classes microbianas em relação à redução de peso, a infecção por Fusarium e a contaminação pela micotoxina de Fusarium, desoxinivalenol (As médias das quatro repetições aparecem entre parênteses com erros padrão; os resultados apresentados são aqueles de um dos três experimentos).

Tabela 8 Exemplo 8 - Inibição do Crescimento de Micélio (Antibiose) de Patóqenos de Fungos de Cereais por Isolado 144 de Bacillus subtillis do Brasil Uma indicação de que uma certa classe de microorganismos pode ser útil para o biocontrole de patógenos de fungos é sua habilidade de inibir o crescimento micélico (filamentoso) de fungos in vitro. O isolado 144 de Bacillus subtilis, uma bactéria esporogênia isolada a partir de raizes de trigo no Brasil, foi testada para a antibiose in vitro de uma série de patógenos de fungos de trigo e milho importantes do ponto de vista econômico.

Em tratamentos comparados, tanto na presença quanto na ausência de Bacillus subtilis isolado 144, o crescimento radial (mm) dos patógenos de fungos foi medido como um meio de estimar a antibiose. As células bacterianas foram transferidas para uma placa de Petri com um ágar de dextrose de batata (PDA) de % de potência por meio de um pequeno funil de vidro. Após dois dias de incubação em temperatura ambiente, um disco de ágar contendo micélio do fungo foi transferido para o centro da colônia circular do bioprotetor ou, no caso dos não-tratados, para uma lâmina de meio não-inoculado. 0 crescimento radial do patôgeno foi medido após 5 dias. Houve um mínimo de quatro repetições para cada tratamento. 0 isolado 144 de Bacillus subtilis inibiu fortemente o crescimento micélico de vários patógenos de cereais in vitro (Tabela 9). Isso demonstra a produção de antibióticos que agem sobre uma vasta gama de fungos patogênicos de plantas. A antibiose é um aspecto útil para o biocontrole de doenças das plantas. Os antibióticos também podem ser utilizados diretamente como antimicóticos, tanto na agricultura quanto na medicina.

Tabela 9. Inibição in vitro do Crescimento Micélico de Fungos Patogênicos de Cereais por parte Do Isolado 144 de Bacillus subtilís. * Médias dentro da mesma fileira (mesmo fungo) seguidas de letras diferentes apresentam uma diferença significativa, de acordo com o teste de múltiplo alcance de Duncan.

Exemplo 9 - Controle de Doenças dos Cereais Transmitidas pelas Sementes por meio de Tratamento das Sementes com Antagonistas Microbianos Os bioprotetores microbianos podem oferecer uma alternativa ou complemento seguro e eficaz aos fungicidas químicos usados no controle de patógenos de fungos transmitidos pelas sementes de cereais e outras plantas.

Lotes de sementes de trigo e de milho infectadas naturalmente por fungos patogênicos foram localizados e usados para testar a eficácia de bioprotetores aplicados nas sementes. Estas foram imersas na água ou em suspensões celulares de isolado 144 de Bacillus subtilis ou de isolado 63 de Pseudomonas putída biótipo B e, em seguida, foram deixadas secando por um breve período antes da incubação em papel toalha (para isolar os fungos) ou plantadas no solo. As mudinhas foram avaliadas em relação à emergência percentual e transmissão de patógenos (com base nas lesões dos coleóptilos). 0 isolado 144 de Bacillus subtilis e o isolado 63 de Pseudomonas putida biôtipo B aplicados nas sementes infectadas com fungos de milho e trigo resultaram em uma redução significativa de inóculo transmitido pela semente e em uma menor transmissão de doenças das se-mentes às mudinhas, no caso de vários patógenos de fungos (Tabela 10) . Resultaram também em um aumento na emergência de mudinhas infectadas no solo. Ambas demonstraram um potencial considerável como protetores biológicos de sementes de cereais.

Tabela 10. Biocontrole de Patógenos de Fungos de Cereais Transmitidos pelas Sementes, segundo Medição baseada na Diminuição da Recuperação de Fungos das Sementes, Diminuição da Transmissão de Fungos às Mudinhas e Aumento da Emergência das Mudinhas. * Médias dentro da mesma fileira (mesmo lote de sementes) seguidas de letras diferentes apresentam uma diferença significativa, de acordo com o teste de múltiplo alcance de Duncan.

Exemplo 10 - Caracterização do isolado TriqoCor 1448 Bacillus subtilis (número de acesso ATCC 202152) O isolado bacteriano de número de acesso ATCC 202152 (também referido como "TrigoCor 1448") foi inicialmente identificado como Paenibacillus macerans (com base em análises de cromatografia gasosa [GC-FAME] e consulta a uma base de dados de pesquisa fornecida pelo laboratório Microbe Inotech Laboratories, localizado na cidade de St. Louis no estado norte-americano de Missouri). No entanto, em fevereiro de 2001, TrigoCor 1448 foi reclassifiçado como Bacillus subtilis, com base em uma busca de sequências, utilizando o algoritmo "BLAST" (sigla do inglês para Basic Local Alígnment Search Tool) , do gene 16S do RNA ribossomal (rRNA) . Um segmento de 500 pares de bases do rRNA 16S de TrigoCor 1448 foi sequenciado pelo laboratório Microbe Inotech Laboratories (St. Louis, Mo) e foi então identificado como o Bacillus subtilis, com 99 % de confiança, com base na similaridade desta sequência com as entradas na base de dados de nucleotideos do GenBank do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Com base nesta análise, 529 dos 532 pares de bases do gene 16S rRNA de TrigoCor 1448 correspondem àqueles de Bacillus subtilis cepa TB 11 (utilizada para a produção de um floculante de biopolimero) sequenciado na Coréia. Foram identificadas ainda diversas relações de similaridade com outras cepas de B. subtilis e com cepas identificadas apenas como Bacillus sp. A similaridade com outras espécies de bactérias cai bruscamente quando pesquisada fora desse grupo (Bacillus sp).

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com o propósito de ilustrar, entende-se que tal detalhamento visa somente esse objetivo, e que variações poderão ser feitas por pessoas da área sem, com isso, distanciar-se do espirito e escopo desta invenção, definidos nas seguintes reivindicações.

Claims (8)

1. Composição para biocontrole das doenças de planta caracterizada por compreender (i) o micro-organismo Bacillus subtilis registrado com o código ATCC 202152, 144/88.4Lev na Embrapa Trigo e Pma007BR97 na Cornell; e: (ii) pelo menos um vetor selecionado a partir do grupo que consiste de turfa, trigo, vermiculita e solo pasteurizado; e/ou (iii) pelo menos um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste de fertilizantes, inseticidas, fungicidas, nematocidas, agentes de tampão, agentes de revestimento, agentes abrasivos, argila, polissacarídeos.

2. Método para fornecer às plantas proteção contra patógenos caracterizado por compreender: aplicação nas plantas, no solo em torno destas e em suas sementes, da composição de biocontrole definida na reivindicação 1 em condições eficazes para oferecer proteção contra doenças aos espécimes tratados ou àqueles produzidos a partir de sementes tratadas.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do agente de biocontrole ser o Bacillus subtilis com N. de Registro na ATCC 202152.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do agente de biocontrole ser usado no tratamento de plantas por aplicação tópica.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do agente de biocontrole ser usado no tratamento de plantas por aplicação tópica, compreendendo também a propagação de plantas a partir de sementes tratadas topicamente com o agente de biocontrole.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do agente de biocontrole ser usado no tratamento do solo ao redor das plantas.

7. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da planta ser selecionada de um grupo que consiste em a alfafa, arroz, trigo, cevada, centeio, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve de Bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolos, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimentão, aipo, cenoura, abóbora, abóbora squash, abobrinha, pepino, maça, pêra, melão, frutas cítricas, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo e cana-de-açúcar.

8. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da planta ser selecionada de um grupo que consiste em Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petúnia,