BRPI9815090B1

BRPI9815090B1 - vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um antígeno rhesus d fraco, bactéria ou levedura compreendendo o mesmo, bem como processos de produção do referido antígeno, para testar a presença de tal molécula, para a caracterização de anticorpos ou anti-soro, identificação de cadeias vh ou vl ou de um anticorpo, de avaliação de afinidade, avidez e/ou reatividade de anticorpos monoclonais anti-d ou de antissoro policlonal anti-d ou de antiglobulina ou de antissoro antiglobulina-humana, uso do referído ácido nucleico e kit

Info

Publication number: BRPI9815090B1
Application number: BRPI9815090A
Authority: BR
Inventors: Franz F Wagner; Willy A Flegel
Original assignee: Drk Blutspendedienst Bw; Drk Blutspendedienst Baden Württemberg Hessen Gemeinnützige Gmbh
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 2016-05-10
Also published as: CA2318486C; ES2241195T3; JP2002500884A; WO1999037763A2; EP1047777A2; PT1047777E; ATE292176T1; EP1047777B1; IL137424A0; BR9815090A; DE69829587T2; US7005276B1; WO1999037763A9; WO1999037763A3; AU748222B2; CA2318486A1; DE69829587D1; AU2274699A

Abstract

patente de invenção: <b>''moléculas de ácido nucléico correlacionadas com o fenótipo rhesus d fraco''<d>. a presente invenção refere-se a novas moléculas de ácido nucléico codificando um antígeno rhesus d contribuindo para o fenótipo d fraco que são caracterizadas por uma ou uma combinação de mutações de sentido errado ou por uma conversão de gene envolvendo exons 6 a 9 dos genes rhd e rhce. a presente invenção ainda refere-se a vetores compreendendo as moléculas de ácido nucléico da invenção, a hospedeiros transformados com referidos vetores, a proteínas codificadas por referidas moléculas de ácido nucléico e a processo para produzir estes polipeptídeos. o fato que as mutações de sentido errado mudam e a conversão referida acima podem estar diretamente correlacionados com o fenótipo d fraco que tem um impacto significante sobre o teste de rotina de amostras de sangue. por exemplo, oligonucleotídeos e anticorpos podem agora ser projetados que geralmente permite a detecção de fenótipos d fraco em uma amostra. estes oligonucleotídeos, anticorpos assim como uma variedade de processos diagnósticos estão todos no escopo da presente invenção. os antígenos rhd codificados pelas novas moléculas de ácido nucléico podem ser usados para a caracterização, padronização e controle de qualidade de anti-soro anti-d monoclonal e policlonal. finalmente, a invenção refere-se a um kit utilizável para testar a presença de fenótipos d fraco.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR COMPREENDENDO UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO UM ANTÍGENO RHESUS D FRACO, BACTÉRIA OU LEVEDURA COMPREENDENDO O MESMO, BEM COMO PROCESSOS DE PRODUÇÃO DO REFERIDO ANTÍGENO, PARA TESTAR A PRESENÇA DE TAL MOLÉCULA, PARA A CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS OU ANTI-SORO, IDENTIFICAÇÃO DE CADEIAS VH OU VL OU DE UM ANTICORPO, DE AVALIAÇÃO DE AFINIDADE, AVIDEZ E/OU REATIVIDADE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-D OU DE ANTISSORO POLICLONAL ANTI-D OU DE ANTIGLOBULINA OU DE ANTISSORO ANTIGLOBULINA-HUMANA, USO DO REFERIDO ÁCIDO NUCLEICO E KIT". A presente invenção refere-se a novas moléculas de ácido nu-cléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para o fenótipo D fraco que são caracterizadas por uma, ou uma combinação de mutações de sentido errado ou por uma conversão de genes envolvendo 6 a 9 exons dos genes RHD e RHCE. A presente invenção refere-se, além disso, a vetores compreendendo as moléculas de ácido nucléico da invenção, a hospedeiros transformados com referidos vetores, a proteínas codificadas por referidas moléculas de ácido nucléico e a processos para produzir estes polipeptí-deos. O fato de que mutações de sentido errado e a conversão referida acima poder ser diretamente correlacionada ao fenótipo D fraco tem um impacto significativo nos testes de rotina de amostras de sangue. Por exemplo, oligonucleotídeos e anticorpos podem agora ser designados, que geralmente permitem a detecção de fenótipos D fraco em uma amostra. Tais oligonucleotídeos, anticorpos bem como uma variedade de processos de diagnóstico estão todos dentro do escopo da presente invenção. Antígenos RhD codificados pelas novas moléculas de ácido nucléico podem ser usados para a caracterização, padronização e controle de qualidade de anti-soros mono-clonais e policlonais. Finalmente, a invenção refere-se a um kit utilizável para testar a presença de fenótipos D fraco. O antígeno Rhesus D (ISBT 004.001; RH1) transportado pela proteína de RhD é o antígeno de grupo sangüíneo mais importante determi- Segue-se folha 1a nado por uma proteína. Ele é ainda a causa principal para a doença hemolí-tica de recém-nascidos (Mollison et al., 1993). Cerca de 0,2% a 1% dos brancos têm glóbulos vermelhos com uma expressão reduzida do antígeno D (D fraco, anteriormente Du) (Mourant et al., 1976; Stratton, 1946; Wagner et al., 1995). Uma fração pequena de amostras de D fraco é explicada por proteínas RhD qualitativamente alteradas, denominada D parcial (Salmon et al., 1984) e causada freqüentemente por alelos híbridos de RHD/RHCE (estudado recentemente em Huang, 1997). Outra fração é causada pelos efeitos supressivos de haplótipos C na posição trans (Ceppellini et al., 1955). Este D fraco possui provavelmente o alelo de RHD normal, porque os pais e crianças portadoras expressam freqüentemente uma densidade de antígeno RhD normal. Este D fraco mostra somente uma redução menor da expressão do antígeno RhD, foi livremente denominado "D de grau alto" e representado atualmente freqüentemente como RhD normal, devido à sensibilidade aumentada dos anticorpos anti-D monoçlonais. A maior parte de antígeno D moderadamente a fortemente enfraquecido é devido a genótipo (s) localizados tanto ao local do gene Rhe-sus por si mesmo ou próximo, porque a expressão de D fraco é herdada junto com o fenótipo RhD (Stratton, 1946). Além da mera redução quantitativa, nenhuma diferença qualitativa pode ser discernida no antígeno RhD deste tipo mais predominante de D fraco. Dois estudos recentes descrevem a causa molecular dos fenótipos D fraco predominantes. Ambos os grupos, Rouillac et al. (1996) e Beckers et al. (1997), realizaram RT-PCR e encontraram nenhuma mutação quando da seqüenciamento de cDNA de RHD em amostras de D fraco. Usando RT-PCR semi-quantitativo, Rouillac et al. (1996) descreveram níveis no estado estável reduzidos de transcritos de RHD em amostras de D fraco e descreveram, que suas observações deram evidência direta de uma diferença somente quantitativa em RhD entre células do sangue vermelho de D fraco. Em uma abordagem similar, Beckers et al. (1995 e 1997), no entanto, não encontraram nenhuma diferença nas quantidades de transcritos de RHD e excluíram um excesso de variantes splice (Kajii et al., 1995), cujos produtos podem ser inadequadamente ou não no todo incorporados na membrana de glóbulos vermelhos (Beckers et al., 1997). Eles concluíram que D fraco não é causado por defeitos regulatórios do processo de transcrição e propuseram genes regulatórios não-identificados ou fatores envolvidos no complexo relacionado a Rh como causa possíveis de D fraco. Conseqüentemente, apesar do mecanismo da expressão de D fraco permanecer equívoco, nenhuma causa molecular foi estabelecida.

Triagem de amostras de D fraco aleatórias por PCR para poli-morfismos específicos de RHD confirmou padrões de amplificação de PCR representativos para um alelo de RHD normal (Avent et al., 1997b; Legler et al., 1997). No entanto, evidência foi se acumulando que D muito pouco fraco não consegue representar D parcial, pode transportar alelos de RHD estruturalmente anormais: Quatro de 44 D fraco na Inglaterra necessitados de 4 construções amplificadas de PCR de íntron específico RHD (Avent e colaboradores, 1997b) e um de 94 D fraco no Norte da Alemanha necessitado de 5 construções amplificadas de PCR de exon específico RHD (Legler e colaboradores, 1997). Na última amostra, o nucleotídeo T na posição 667 foi substituído pela codificação G específica de RHCE para uma substitução do aminoácido F223V (TJ Legler e A Humpe, personal Communications).

Assim, alelos aberrantes foram observados somente em uma fração pequena de fenótipos D fraco dando a possibilidade improvável de que estas trocas no nível molecular foram certamente responsáveis pelo fenômeno geral do fenótipo D fraco; ver também Aubin et al., 1997; Avent et al., 1997b; Fukumori et al., 1997; Huang, 1997; Issitt e Telen, 1996; Roubi-net et al., 1996. Conseqüentemente, a técnica anterior combinada falhou em prover até agora um meio convenientemente aplicável e seguro para de-tectar o fenótipo Rhesus D fraco ^~umã“ãmõ'stra^ Conseqüentemente, o problema técnico subjacente à presente invenção feri estabelecer um meio bem como processos que podem, conve-nientemente-e-amplamente. ser empregados na análise do fenótipo fraco Rhesus D. A solução para referido problema técnico é obtida provendo as formas de realização caracterizadas nas reivindicações. Assim, a presente invenção refere-sejajjma moléculajde ácido nucléico codificando urn antP geno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco, referida molécula de ácido nucléico transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem, em suas regiões de transmembranã e/ou intracelular—:---------------------' De acordo com a presente invenção, o termo "contribuindo para o fenótipo D fraco" implica um papel ativo da mutação que pode ser causada por uma troca de aminoácidos, enquanto o termo "indicativo de fenótipo fraco" não implica necessariamente este papel, mas pode se referir também a uma mutação silenciosa. Uma mutação silenciosa pode ocorrer, por exemplo, em conjunto com outras mutações como mutações de sentido errado que são descritas em mais detalhe abaixo.

De acordo com a presente invenção, verificou-se que as mutações de sentido errado observadas não estão somente associadas com, mas realmente causaram uma integração de proteína de RhD reduzida nas membranas de glóbulos vermelhos. Assim, pela presente irívenção de-monstra-se que (i) alelos de D fraco evoluem independentemente nos ha-plótipos diferentes, cada caso distinto estando associado com uma troca na seqüência de codificação de RhD; (ii) nenhuma amostra ocorreu com a sequência de codificação normal a despeito da observação de 16 alelos diferentes em 164 amostras; e (iii) tipo e distribuição das substituições de nu-cleotídeos observadas não foi compatível com a hipótese nula de trocas aleatórias. A descoberta de que mutações de sentido errado em RHD levam a expressão de antígeno D reduzida, ajustada no modelo atual de integração de membrana RhD; ver tabela 7. Ambas as proteínas Rh ocorrem em um complexo com a proteína Rh50, que pode ser unida por várias proteínas adicionais, como LW, CD47 e glicoforin B (Huang, 1997). A expressão do complexo de Rh total na integridade de pelo menos uma proteína Rh (JP Cartron, apresentação oral na conferência ISBT/DGTI, Frankfurt, setembro, 1997) e a proteína Rh50 (Cherif-Zahar et al., 1996). Trocas estruturais sutis na proteína Rh50 causadas por mutações de sentido errado são suficientes para evitar a expressão do complexo de Rh (Cherif-Zahar et al., 1996). Do mesmo modo, estas trocas estruturais sutis na proteína de RhD parecem, também afetar a expressão do complexo de Rh envolvendo RhD.

Baseado na distribuição e espécie de substituições de aminoá-cidos, uma descrição geral da relação da estrutura de RhD e expressão de RhD pode agora ser estabelecida: Todas as substituições de aminoácidos em D fraco estão localizadas nas partes intracelulares e de transmembrana da proteína de RhD onde o alinhamento foi realizado de acordo com o mo- delo atual acima mencionado (ver tabela 7). Alelos de RhD conhecidos com substituições exofaciais (Avent et al., 1997a; Jones et al., 1997; Liu et al., 1996; Rouillac et al., 1995) foram descobertos em virtude de seu antígeno D parcial, mas podem exibir reduções discretas (DNU e Dv") a moderadas (Dn, DHR e DHMi) na expressão de RhD (Flegel e Wagner, 1996; Jones et al., 1997; Jones et al., 1996). A maior parte das substituições descritas de acordo com esta invenção foram não-conservativas e os aminoácidos introduzidos, em particular prolina, provavelmente romperam a estrutura secundária ou terciária. Dois alelos de D fraco (tipo 2 e 11) foram associados com substituições conservativas, indicando que as regiões de aminoácidos envolvidas nas posições 295 e 385 foram muito importantes para uma integração de membrana RhD ótima. Em dois alelos (tipo 4 e tipo 14), partes de 4 e 5 exons foram substituídas pelas partes correspondentes do gene RH CE. Trocas similares ocorreram em DVI tipo I e DVI tipo II que demonstraram uma expressão da proteína de RhD consideravelmente reduzida (Jones et al., 1996), também. Observações paradoxais anteriores podem ser explicadas se a substituição N152T no exon 3 é considerada facilitar a integração de membrana: (i) Dllla (Huang et al., 1997), diferindo de D fraco tipo 4 pela substituição N152T somente, tem uma densidade do antígeno RhD normal (Jones et al., 1996), e (ii) Dlllc, D ,va e DVI tipo III abrigando a substituição N152T têm densidades de antígeno melhoradas (Flegel et al., 1997; Jones et al., 1996) comparado a seus controles apropriados (RHD normal e DVI tipo II). Vários fenótipos com expressão de D fraco, como DVI, Dv, DBT, algum DIV e DFR, foram reconhecidos há muito tempo como entidades separadas por sua propensão do portador para produzir anti-D (Lomas et al., 1994; Tippett e Sanger, 1977; Tippett e Sanger, 1962). Estes fenótipos foram subseqüentemente confirmados e agrupados por padrões de reação distintos com anti-D monoclonal (Lomas et al., 1993; Lomas et al., 1989; Scott, 1996). Uma classificação serológica da maior parte dos fenótipos D fraco, no entanto, não foi bem-sucedida, porque eles eram desprovidos de um padrão de reação consistente com anti-D monoclonal e seus portadores pareciam não propensos à imunização anti-D (Moore, 1984). Não houve ainda nenhum limite definido entre D normal e D fraco (Agre et al., 1992; Moore, 1984; Nelson et al., 1995). Contudo, variabilidade da densidade do antígeno RhD (antígenos por célula) em fenótipos D fraco (Hasekura et al., 1990; Jones et al., 1996; Nelson et al., 1995; Nicholson et al., 1991; Tazzari et al., 1994; Wagner, 1994) e padrões aberrantes raros em PCR RHD (Avent et al., 1997b; Legler et al., 1997) não excluem uma diversidade molecular subjacente. A presente invenção pela primeira vez permite a classificação conveniente de D fraco e para a correlação não-ambígua de alelos distintos com dado clínico. Em conjunto com alelos de RHD raros anteriormente definidos, a definição molecular exata da maior parte dos fenótipos com densidade do antígeno D reduzida torna-se agora possível. No caso em que pacientes transportando tipos moleculares particulares de D fraco eram propensos a desenvolver anti-D, a classificação tornada possível pela presente invenção ajudará a guiar um programa de transfusão negativa de Rhesus. A disponibilidade de amostras de D fraco que são caracterizadas com respeito à estrutura molecular e densidades do antígeno RhD promoverá a segurança da qualidade de reagentes anti-D. Eles devem de modo confiável ser do tipo probrandas como RhD positivo, cujas proteínas RhD não são propensas a imunização anti-D freqüente (Wagner et al., 1995). Consequentemente, o uso de unidades de células do sangue vermelho RhD negativas para transfusões em pacientes com D fraco, que foi justificado por um potencial presumido para imunização anti-D, pode, finalmente, ser reduzido a um mínimo, que pode ser cientificamente reduzido.

Alternativamente, verificou-se, de acordo com a invenção, que as mutações agrupam-se em certas extensões do polipeptídeo Rhesus D. Além disso, detectou-se uma conversão de gene correlacionando com o fe-nótipo D fraco. Assim, a invenção refere-se também a uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco, referida molécula de ácido nucléico (a) transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem, nas posições de aminoácidos 2-16, 114-149, 179-225 ou/e 267 a 397, com a condição de que referido antígeno D não transporte uma mutação de sentido errado única levando a uma substituição de fenilalanina na posição de aminoácidos 223 por valina ou treonina na posição 283 por isoleucina; ou (b) transportando uma conversão de gene envolvendo 6 a 9 exons que são substituídos pelos exons correspondentes do gene RHCE.

Todas as mutações de sentido errado encontradas de acordo com a presente invenção e localizadas nas regiões acima estão associadas com a região de transmembrana ou a porção intracelular do polipeptídeo quando o modelo atual acima indicado de RhD é empregado. No entanto, quando modelos diferentes são empregados, as mutações associadas com o fenótipo D fraco podem também ser encontradas nas regiões extracelula-res. As regiões acima compreendem também posições de aminoácidos que estão localizadas nas regiões êxtracelulares quando o modelo atual é aplicado. Referidas posições também podem ser as que sofreram mutações e correlacionáveis com o fenótipo D fraco. Estas mutações estão também dentro do escopo do pedido.

Além das mutações de sentido errado, uma conversão de gene indicativa de D fraco foi identificada. Referida conversão pode ser usada para fins de diagnóstico basicamente na mesma extensão que as mutações de sentido errado. De acordo com a invenção, os pontos de ruptura são determinados ser introns 5 e 9: ver também figura 3.

Os mutantes acima referidos, e ainda por todo este relatório, podem ser empregados convenientemente para a caracterização de anticorpos monoclonais e policlonais usados em conexão com diagnóstico, pro-filaxia e tratamento de RhD. Por exemplo, expressando moléculas de ácido nucíéico desejadas codificando estes mutantes em um sistema apropriado, perfis de reatividade de referidos anticorpos ou anti-soros podem ser estabelecidos. Os mutantes também podem ser empregados para a caracterização de anticorpos monoclonais e policlonais que são usados como anticorpos secundários, por exemplo, anti-soros antiglobulina e antiglobulina-humana.

Preferivelmente, a mutação de sentido errado causa uma subs- tituição de aminoácidos na posição 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 ou 393 ou uma combinação de/ou envolvendo referidas substituições.

Esta forma de realização preferida, além das mutações únicas indicadas, pode compreender uma combinação destas substituições. Adicionalmente, contempla-se a possibilidade de que uma ou mais de referidas substituições estejam envolvidas, e mutações adicionais como mutações levando a substituições estão presentes. De acordo com a presente invenção, entende-se que tais mutações adicionais podem ser testadas quando avaliando o estado de RhD em uma amostra. Uma descoberta desta mutação permitirá ao versado na técnica concluir que outras mutações identificadas neste relatório, ocorrendo em combinação com referida primeira mutação, estarão presentes. Consequentemente, as formas de realização refletindo a detecção de mutações adicionais ocorrendo em combinação com as mutações identificadas neste relatório estão também compreendidas pela invenção.

Em uma forma de realização particularmente preferida da molécula de ácido nucléico da invenção, referida substituição de aminoácidos na posição 3 é de Ser para Cys, na posição 10 de Arg para Gin, na posição 16 de Trp para Cys, na posição 114 de Arg para Trp, na posição 149 de Ala para Asp, na posição 182 de Ser para Thr, na posição 198 de Lys para Asn, na posição 201 de Thr para Arg, na posição 220 de Trp para Arg, na posição 223 de Phe para Vai, na posição 270 de Vai para Gly, na posição 276 de Ala para Pro, na posição 227 de Gly para Glu, na posição 282 de Gly para Asp, na posição 294 de Ala para Pro, na posição 295 de Met para lie, na posição 307 de Gly para Arg, na posição 339 de Gly para Glu, na posição 385 de Gly para Ala e na posição 393 de Trp para Arg.

Em uma outra forma de realização preferida da molécula de ácido nucléico da invenção, referida mutação de sentido errado ocorre nas posições de nucleotídeo 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 e 1177 ou em uma combinação de referidas posições.

Particularmente preferido é que referida mutação de sentido errado na posição 8 é de C para G, na posição 29 de G para A, na posição 48 de G para C, na posição 340 de C para T, na posição 446 de C para A, na posição 544 de T para A, na posição 594 de A para T, na posição 602 de C para G, na posição 658 de T para C, na posição 667 de T para G, na posição 809 de T para G, na posição 819 de G para A, na posição 826 de G para C, na posição 830 de G para A, na posição 845 de G para A, na posição 880 de G para C, na posição 885 de G para T, na posição 919 de G para A, na posição 1016 de G para A, na posição 1154 de G para C e na posição 1177 de T para C.

No caso em que combinações de mutações de sentido errado estão envolvidas na geração de fenótipos D fraco, prefere-se que referida combinação de substituições esteja nas posições 182, 198 e 201 e é, preferivelmente, S182T, K198N, T201R ou na posição 201 e 223 e é, preferivelmente, T201R e F223V, ou na posição 16, 201 e 223, e é preferivelmente W16C, T201R e F223V.

Mais preferivelmente, referida combinação de mutações de sentido errado compreende posições 544, 594 e 602 e é, preferivelmente T -> A na posição 544, A->Tna posição 594 e C -> G na posição 602 ou compreende posições 602, 667 e 819 e é, preferivelmente, C G na posição 602, T -» G na posição 667 e G -> A na posição 819, ou compreende posições 48, 602, 667 e 819 e é, preferivelmente, G ^ C na posição 48, C -» G na posição 602, T -> V na posição 667 eG^Ana posição 819.

Apesar da molécula de ácido nucléico da invenção poder ser de várias origens, incluindo origem (semi) sintética, prefere-se que a molécula de ácido nucléico seja mRNA ou DNA genômico. Procedimentos padrões podem ser empregados para obter quaisquer dos ácidos nucléicos acima; ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2- ed., 1989. CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y. A invenção refere-se, também, a um vetor compreendendo a molécula de ácido nucléico da invenção. O vetor pode ser usado para propagação e/ou expressão ou pode ser designado para transferência de gene ou fins de marcação. Processos para produzir tais vetores são bem conhecidos na técnica. O mesmo se mantém verdadeiro para clonar os ácidos nucléicos da mutação em referidos vetores, bem como a propagação de vetores em hospedeiros apropriados, etc. O vetor pode, particularmente, ser um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus ou um bacteriófago usado convenientemente em engenharia gené- ——...—~'" *“ > tica que compreende a molécula de ácido nucléico da invenção. Vetores de expressão derivados de vírus como retrovírus, vírus vacínia, vírus adeno associados, vírus do herpes ou vírus de papiloma bovino, podem ser usados para liberação das moléculas de ácido nucléico ou vetor da invenção em populações de células marcadas. Processos que são bem conhecidos dos versados na técnica podem ser usados para construir vetores virais recom-binantes; ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, os polinucleotí-deos e vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para liberar células de marcação. Os vetores contendo as moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser transferidos em célula hospedeira por processos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares; ver Sambrook, supra.

Estes vetores podem compreender ainda genes como genes marcadores que permitem a seleção de referido vetor em uma célula hospedeira apropriada e em condições apropriadas. Preferivelmente, a molécula de ácido nucléico da invenção é ligada operativamente a seqüência de controle de expressão permitindo expressão em células procarióticas ou eucari-óticas. Expressão de referido polinucleotídeo compreende transcrição do polinucleotídeo em um mRNA traduzível. Elementos regulatórios assegu- rando expressão em células eucarióticas, preferivelmente células de mamíferos, são bem conhecidos dos versados na técnica. Eles compreendem geralmente seqüências regulatórias assegurando início de transcrição e, opcionalmente, sinais poli-A assegurando terminação de transcrição e estabilização do transcrito. Elementos regulatórios adicionais podem incluir me-Ihoradores transcripcionais bem como translacionais, e/ou regiões de promotor heterólogas ou associadas naturalmente. Elementos regulatórios possíveis permitindo expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o promotor PL, lac, trp ou tac em E. coli, e exemplos de elementos regulatórios permitindo expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOX1 ou GAL1 em levedura ou o promotor CMV, SV40, RSV-promotor (vírus de sarcoma Rous), melhorador de CMV, melhorador de SV40 ou um íntron globina em células de mamífero e outras células de animal. Ao lado de elementos que são responsáveis pelo início de transcrição, estes elementos regulatórios também podem compreender sinais de terminação de transcrição, como o sítio SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante da molécula de ácido nucléico. Além do mais, dependendo do sistema de expressão usado, seqüências líderes capazes de dirigir o polipeptí-deo a um compartimento celular ou secretar o mesmo no meio, podem ser adicionadas à seqüência de codificação do polinucleotídeo da invenção e^ são bem conhecidas na técnica. A(s) seqüência(s) líder (es) é (são) reunidas na fase apropriada com seqüências de tradução, iniciação e terminação e, preferivelmente, uma seqüência líder capaz de dirigir secreção da proteína traduzida, ou uma porção da mesma, no espaço periplásmico ou meio extracelular. Opcionalmente, a seqüência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação C- ou N-terminal conferindo características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expressado. Neste contexto, vetores de expressão apropriados são conhecidos na técnica como vetor de expressão pcDV1 Okayama-Berg (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (ln-vitrogene), ou pSPORTI (GIBCO BRL).

Preferivelmente, as seqüências de controle de expressão serão sistemas de promotor eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas seqüências de controle para hospedeiros eucarióticos também podem ser usadas.

Como acima mencionado, o vetor da presente invenção também pode ser um vetor de marcação ou de transferência de gene. Terapia genética, que é baseada em introduzir genes terapêuticos em células por técnicas~ex-vivo ou in-vivo é uma das aplicações mais importantes de transferência de gene. Processos e vetores apropriados para térapia genética in vitro ou in vivo são descritos na literatura e são conhecidos dos versados na técnica; ver, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957 ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, e referências ali citadas. Os polinucleotídeos e vetores da invenção podem ser designados para introdução direta ou para introdução via lipossomas, ou vetores virais (por exemplo, adenovírus, retrovírus) na célula. Preferivelmente, referida célula é uma célula de linhagem de germe, célula embriônica, ou célula de ovo ou derivada do mesmo, mais preferivelmente referida célula é uma célula indiferenciada.

Adicionalmente, a invenção refere-se a um hospedeiro transformado com o vetor da invenção.

Hospedeiros apropriados compreendem animais transgênicos, células como bactérias, células de levedura, animais preferivelmente células de mamífero, células fúngicas ou células de inseto. Protocolos de transformação, incluindo transfecção, microinjeção, eletroporação, etc., também são bem conhecidos na técnica.

Além disso, a invenção refere-se a um processo para produzir um antígeno Rhesus D contribuindo para o fenótipo D fraco compreendendo cultivar o hospedeiro da invenção em condições apropriadas e isolar o antígeno Rhesus D produzido.

Prefere-se que o antígeno seja exportado no meio de cultura onde pode ser coletado de acordo com convenções/processos. O termo "cultivar", como usado de acordo com a presente invenção, compreende também o aumento de animais transgênicos. Usando construções de vetores apropriados e, opcionalmente, rações apropriadas, o antígeno pode, por exemplo, ser isolado de leite, por exemplo, de vacas transgênicas. A invenção refere-se adicionalmente a antígeno Rhesus D codificado pela molécula de ácido nucléico da invenção ou produzido pelo processo da invenção.

Preferivelmente, o antígeno está no mesmo modo pós-transito-riamente modificado e tem a mesma estrutura química como antígeno de ocorrência natural. Conseqüentemente, referido antígeno, quando produzido pelo processo da invenção, é preferivelmente produzido em células humanas.

Além do mais, áln\^nção"refere-se a um oligonucleotídeo hibri-dizando em condições estringentes em uma porção da molécula de ácido nucléico da invenção compreendendo referida pelo menos uma mutação de sentido errado ou na porção complementar da mesma ou hibridizando em um ponto de ruptura da conversão de gene identificada aqui acima.

Nesta forma de realização da invenção, entende-se que os oli-gonucleotídeos hibridizam diretamente na seqüência que sofreu mutação ou no ponto de ruptura. O conjunto de condições de hibridização estringentes é bem descrito, por exemplo, em Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Labora-tory Handbook" CSH Press, Cold Spring Harbor 1989 ou Hames e Higgins, "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford (1985). Assim, a detecção das seqüências hibridizando especificamente requisitarão geralmente hibridização e condições de lavagem como 0,1xSSC, 0,1% SDS a 65°. Como é bem sabido, o comprimento da sonda e a composição do ácido nucléico a ser determinado substituem outros parâmetros das condições de hibridização estringentes. Preferivelmente, o oligonucleotídeo é um deoxinucleotídeo. Prefere-se ainda que o oligonucleotídeo compreenda 12 a 50 nucleotídeos e, mais preferivelmente, 15 a 24 nucleotídeos. A hibridização no ponto de ruptura pode ser em condições estringentes ou não-estringentes. Um exemplo de condições de hibridização não-estringentes é hibridização e lavagem a 50°C em 4xSSC, 0,1% SDS.

Além disso, a invenção refere-se a um anticorpo ou uma ligação especificamente aptãmero ao antígeno Rhesus D da invenção. O anticorpo pode ser testado e usado em qualquer técnica se-rológica bem conhecida na técnica, como técnicas de aglutinação em tubos, géis, fase sólida e técnicas de captura com ou sem anticorpos secundários, ou em citometria de fluxo com ou sem melhoria de imunofluorescência. O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo derivado de ou compreendido em um anti-soro policlonal. O termo "anticorpo", como usado de acordo com a presente invenção, compreende ainda fragmentos de referido anticorpo como fragmentos Fab, F(ab’)2, Fv ou scFv; ver, por exemplo, Harlow e Lane, "Antibodies, A Labo-ratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, N.Y. o anticorpo ou o fragmento do mesmo pode ser de origem natural ou pode ser produzido (semi) sinteticamente. Os produtos sintéticos compreendem também material não-proteináceo como material semi-proteináceo que tem a mesma ou essencialmente a mesma especificidade de ligação como o anticorpo da invenção. Estes produtos podem, por exemplo, ser obtidos por peptidomi-méticas.

Adicionalmente, a invenção refere-se a um anticorpo ou umjaptâ-mero ou um fago ligando-se especificamente ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem ou a antígenos Rhesus D aberrantes, mas não ao antígeno Rhesus D da invenção. O anticorpo pode ser testado e usado em qualquer técnica serológica bem conhecida na técnica, como técnicas de aglutinação em tubos, géis e técnicas de fase sólida, técnicas de captura ou citometria de fluxo com imunofluorescência. A este respeito, a definição, teste e origem do anticorpo ou do aptãmero, as mesmas definições acima aplicam-se aqui.

Com respeito ao termo "antígeno Rhesus D aberrante", o termo compreende mutações de sentido errado da técnica anterior, bem como conversões da técnica anterior encontradas nos genes RH D e nos antígenos correspondentes. O termo "aptâmero" é bem conhecido na técnica e definido, por exemplo, em Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. I (1997), 5-9 ou em Stall e Szoka, Pharm. Res. 12 (1995), 465-483.

Além do mais, a invenção refere-se a um processo para testar a presença de uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhe-sus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco em uma ãrfiostra, compreendendo Jnibridizar o oligonucleotídeo da invenção'õü ünrOligonu-cleotídeo hibridizando um molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco, referida molécula de ácido nucléico transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem, referida mutação de sentido errado causando uma substituição de aminoácidos na posição 223 ou 283 que está na posição 223, preferivelmente de Phe para Vai e na posição 283, preferivelmente de Thr para lie, referida mutação de sentido errado ocorrendo ainda, preferivelmente, na posição de nucleotí-deo 667 ou 848, em que, mais preferivelmente, referida mutação na posição 667 é de T para G e na posição 848 de C para T, em condições estringentes em moléculas de ácido nucléico compreendidas na amostra obtida de um humano e detectar referida hibridização.

Preferivelmente, o processo da invenção compreende ainda digerir o produto de referida hibridização com uma endonuclease de restrição ou submeter o produto de referida hibridização à digestão com uma endonuclease de restrição e analisar o produto de referida digestão. A forma de realização preferida da invenção permite, por meios convenientes, a diferenciação entre uma hibridização eficaz e uma hibridização não eficaz. Por exemplo, se o antígeno Rhesus D do tipo selvagem compreende uma sítio de restrição de endonuclease, o produto hibridizado será clivável por uma enzima de restrição apropriada, enquanto uma se-qüência que sofreu mutação não dará nenhum produto de filamento duplo ou não compreenderá o sítio de restrição reconhecível e, conseqüente-mente, não será clivado. Alternativamente, o oligonucleotídeo em hibridização pode somente hibridizar na seqüência que sofreu mutação. Neste caso, somente um híbrido compreendendo a seqüência que sofreu mutação, mas não a seqüência do tipo selvagem, será clivado pela enzima de restrição apropriada. A análise do produto de digestão pode ser efetuada por meios convencionais, como por eletroforese de gel que pode ser opcionalmente combinada pela coloração do ácido nucléico com, por exemplo, brometo de etídio. Combinações com outras técnicas como Southern blotting também são consideradas.

Detecção de referida hibridização pode ser efetuada, por exemplo, por um anticorpo de filamento duplo anti-DNA ou empregando um oli-gonucleotídeo rotulado. Convenientemente, o processo da invenção é empregado junto com técnicas de coloração como "Southern" ou "Northern blotting" e técnicas relacionadas. A rotulação piode ser efetuada, por exemplo, por protocolos padrão e inclui rotulação com marcadores radioativos, rótulos fluorescentes, fosforescentes, quimioluminescentes, enzimáticos, etc. A invenção refere-se adicionalmente a um processo para testar a presença de uma molécula de~ácido nucléióõ codificando um~"ãntígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenõtípó D fraco em uma amostra, compreendendo determinar a seqüência de ácido nucléico de pelo v ------ menos uma porção da molécula de ácido nucléico da invenção, referida porção codificando pelo menos uma de referidas mutações de sentido errado ou um ponto de ruptura de referida conversão de gene ou uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco, referida molécula de ácido nucléico transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao an-tígeno Rhesus D do tipo selvagem, referida mutação de sentido errado causando uma substituição de aminoácidos na posição 223 ou 283 que está na posição 223, preferivelmente de Phe para Vai e na posição 283, preferivelmente de Thr para lie, referida mutação de sentido errado ocorrendo ainda, preferivelmente, em uma posição de nucleotídeo 667 ou 848 em que, mais preferivelmente, referida mutação na posição 667 é de T para G e na posição 848 de C para T.

Preferivelmente, o processo da invenção compreende ainda, antes de determinar referida seqüência de aminoácidos, amplificação de pelo menos referida porção de referido molécula de ácido nucléico.

Preferivelmente, a amplificação é efetuada por reação de cadeia de polimerase (PCR). Outros processos de amplificação como reação de cadeia de ligase também podem ser empregados.

Além do mais, a invenção refere-se a um processo para testar a presença de uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhe-sus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco em uma amostra, compreendendo transportar uma reação de amplificação em que pelo menos um dos iniciadores empregados de referida reação de amplificação é o oligonucleotídeo da invenção ou um oligonuclèotídeo hibridizando em uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para o fenótipo D fraco, referida molécula de ácido nucléico transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem, referida mutação de sentido errado causando uma substituição de aminoácidos na posição 223 ou 283, que está na posição 223, preferivelmente de Phe para Vai e na posição 283, preferivelmente de Thr para lie, referida mutações ocorrendo ainda, preferivelmente, na posição de nucleotídeo 667 ou 848, em que, mais preferivelmente, referida mutação na posição 667 é de T para G e na posição 848 de C para T e testando para um produto de amplificação. O processo da invenção resultará em uma amplificação somente da seqüência de marcação, se referida seqüência de marcação conduz a ou pelo menos uma mutação. Isto é porque o oligonucleotídeo não irá preferivelmente, em condições de hibridização estringentes, hibridizar na seqüência do tipo selvagem (com a conseqüência de que nenhum produto de amplificação é obtido), mas somente na seqüência que sofreu mutação. Naturalmente, oligonucleotídeos iniciadores hibridizando em um ou mais de um, de modo que duas seqüências que sofreram mutações podem ser empregadas no processo da invenção. A última forma de realização pode ser favorável em casos onde combinações de mutações são testadas. É importante notar que nem todas ou nenhuma de referidas mutações são necessária- mente mutações de sentido errado. Isto pode ser verdadeiro para casos onde outros tipos de mutações ocorrem em combinação com as mutações de sentido errado acima ou com a conversão de gene acima.

Preferivelmente, no processo da invenção, referida amplificação ou reação de amplificação é ou é efetuada pela reação de cadeia de polime-rase (PCR). Outros processos de amplificação como reação de cadeia de ligase também podem ser empregados.

Além disso, a invenção refere-se a um processo para testar a presença de um antíaeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenó-tipo D fraco em uma amostra, compreendendo testar uma amostra obtida de um humano para ligação específica ao anticorpo ou aptâmero ou fago da invenção ou a um anticorpo ou aptâmero ou fago em um antígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo de fenótipo D fraco e codificado por uma molécula de ácido nucléico transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem, referida mutação de sentido errado causando uma substituição de aminoácidos na posição 223 ou 283, que está na posição 223, preferivelmente de Phe para Vai e na posição 283, preferivelmente de Thr para lie, referida mutação de sentido errado ocorrendo ainda, preferivelmente, na posição de oligonu-cleotídeo 667 ou 848, onde, mais preferivelmente, referida mutação na posição 667 é de T para G e na posição 848 de C para T.

Teste para ligação pode, novamente, envolver o emprego de técnicas padrão como ELISAs; ver, por exemplo, Harlow e Lane, "Antibodi-es, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor. A invenção refere-se também ao processo para testar uma amostra para a presença de antígeno Rhesus D do tipo selvagem e a ausência de antígeno Rhesus D da invenção, compreendendo testar uma amostra obtida de um humano para ligação específica ao anticorpo ou aptâmero ou fago da invenção, referido anticorpo ou aptâmero ou fago ligan-do-se especificamente ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem ou a antíge-nos Rhesus D aberrantes, mas não ao antígeno Rhesus D da invenção.

Resultados obtidos de acordo com seu processo da invenção podem bem ser empregados em estratégias de transfusão de sangue, como descrito acima.

Preferivelmente, no processo da invenção, referida amostra é sangue, soro, plasma, tecido fetal, saliva, urina, tecido mucosal, muco, tecido vaginal, tecido fetal obtido da vagina, pele, cabelo, folículo de cabelo ou outro tecido humano.

Além do mais, o processo da invenção compreende, preferivelmente, a etapa de enriquecimento de células fetais. Este enriquecimento pode ser obtido usando anticorpos apropriados, lecitinas ou outros reagen-tes ligando especificamente células fetais ou por qualquer técnica experimentando a separação diferencial de células maternas e fetais, como por gradientes de densidade. Também preferivelmente, em referido processo, DNA fetal ou mRNA de tecido de material como sangue periférico, soro ou plasma podem ser extraídos vantajosamente, de acordo com procedimentos convencionais.

Em uma outra forma de realização preferida do processo da invenção, referida molécula de ácido nucléico ou material proteináceo de referida amostra é fixada a um suporte sólido.

Preferivelmente, referido suporte sólido é um chip.

As vantagens dos chips são bem conhecidas na técnica e não necessitam ser discutidas aqui em detalhe. Estas incluem o tamanho pequeno bem como um acesso fácil de análises baseadas em computador para análitos.

Além do mais, a presente invenção refere-se ao uso da molécula de ácido nucléico da invenção ou de uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D, contribuindo para ou indicativo de fenó-tipo D fraco, referida molécula de ácido nucléico transportando pelo menos uma mutação de sentido errado, como comparado ao antígeno Rhesus D do tipo selvagem, referida mutação de sentido errado causando uma substituição de aminoácidos na posição 223 ou 283, que está na posição 223, preferivelmente de Phe para Vai e na posição 283, preferivelmente de The para lie, referida mutação de sentido errado ocorrendo ainda, preferivelmente, na posição de nucleotídeo 667 ou 848, em que, mais preferivelmente, referida mutação na posição 667 é de T para G e na posição 848 de C para T ou de uma combinação das mesmas para a análise de um fenótipo D de Rhesus fraco. A análise pode ser efetuada, por exemplo, na base dos processos acima descritos. A invenção refere-se também ao uso da molécula de ácido nu- ciéico da invenção, do vetor da invenção ou do antígeno Rhesus D da in- < "■ ~ ~~~ -------------------------------------------------------------------— venção para a avaliação da afinidade, avidez é/ou reatividade de anticorpo anti-D monoclonais ou de anti-soros anti-D policlonais ou de anti-soros antP globulina e antiglobulina^humana ou de preparações dos mesmos. ~ A invenção refere-se, também, ao uso de células, preferivelmente de células do sangue vermelho, de probandas para a avaliação da afinidade, avidez e/ou reatividade de anticorpo anti-D monoclonais ou de anti-soros anti-D policlonais ou de anti-soros antiglobulina e antiglobulina-humana ou de preparações dos mesmos.

Referidas preparações podem ser providas de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica. Referidas preparações podem compreendem estabilizadores como albuminas, outra azida de sódio, íons de sal, tampões, etc. A formulação da preparação pode ter uma influência sobre as características de ligação dos anticorpos, como é bem conhecido na arte.

Por exemplo, em uma primeira etapa, o gene Rhesus D de um portador ou doador de sangue e seu estado alélico é analisado e é determinado se referido gene compreende uma mutação que foi verificada de acordo com a presente invenção. Em uma segunda etapa, referida mutação é correlacionada a uma certa densidade de antígeno RhD na superfície de células do sangue vermelho. Convenientemente, referida correlação pode ser estabelecida pelo dado provido na presente invenção (como mutações per se) e técnicas que são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Jones et al., 1996, Flegel e Wagner, 1996). Em uma terceira etapa, os aspectos de um anticorpo ou de um anti-soro como reatividade, sensibilidade, afinidade, avidez e/ou especificidade são determinados com técnicas serológicas de grupos sangüíneos usando, preferivelmente, células do sangue vermelho que foram, molecularmente e com respeito à densidade de superfície do antígeno RhD, caracterizadas como descrito na etapa 2. Estes dados podem ser usados, por exemplo, em controles de qualidade, padronização, etc. A invenção será mais útil para caracterização, padronização e controle de qualidade de anti-soros monoclonais e policlonais, preferivelmente anti-soros ou monoclonais anti-D. Além disso, por exemplo, anti-soros antiglobulina e globulina anti-humano podem ser caracterizados na base dos ensinamentos da presente invenção. Um anticorpo monoclonal anti-D apropriadamente caracterizado pode ser usado convenientemente em diagnósticos de RhD. Por exemplo, um anticorpo monoclonal apropriadamente caracterizado será utilizável na determinação da densidade do antígeno Rhesus D na superfície de células do sangue. Valores de corte para anticorpos monoclonais utilizáveis em diagnóstico podem ser assim estabelecidos. Isto é importante para o controle de qualidade de anticorpos usados em diagnósticos de RhD.

Assim, a invenção refere-se também a um processo para a caracterização de anticorpos monoclonais ou anti-soros policlonais ou de uma preparação dos mesmos, referido processo compreendendo: (a) testar o ácido nucléico da amostra de uma probanda para a presença de uma mutação, como definido de acordo com a invenção; (b) correlacionar, na base do estado de mutação e do estado alélico do gene RhD, o ácido nucléico com a densidade do antígeno RhD na superfície de células do sangue vermelho dé referida probanda; (c) reagir referidos anticorpos monoclonais ou anti-soros policlonais ou referida preparação dos mesmos com uma célula transportando o antígeno RhD em sua superfície; (d) caracterizar referidos anticorpos monoclonais e anti-soros policlonais ou referida preparação dos mesmos na base dos resultados obtidos na etapa (c).

Com respeito ao termo "estado alélico", este termo descreve as possibilidades de que os alelos de RHD em uma probanda estão presentes em um estado homozigótico, heterozigótico ou hemizigótico. Também compreendida por este termo é a possibilidade de que dois alelos transportem duas mutações diferentes (incluindo a conversão) acima definida.

Em uma forma de realização preferida do processo da invenção, referida caracterização compreende a determinação da reatividade, sensibilidade, avidez, afinidade, especificidade e/ou outras características de anticorpos e anti-soros.

Além disso, prefere-se um processo em que referida célula transportando o antígeno RhD em sua superfície é uma célula do sangue vermelho. A invenção refere-se também a um processo para determinar se um paciente necessitando de uma transfusão de sangue deve ser transfun-dido com sangue Rh D negativo de um doador, compreendendo a etapa de testar uma amostra de referido paciente para a presença de um ou mais an-tígenos Rh D da invenção, em que um teste positivo para pelo menos um de referidos antígenos é indicativo da necessidade-de transfusão com sangue Rh negativo. A invenção tem implicações importantes para planejar uma terapia de transfusão em humanos. Por, exemplo, agora pode ser conveni-entemente testado se um paciente necessita realmente de uma transfusão cornTím sangue Rh D negativo ou se estas precauções não necessitam ser tomadas. A transfusão de glóbulos vermelhos de alguns subgrupos molecularmente definidos do fenótipo D fraco determinada por tais processos pode ser imunogênica, se portadores Rhesus D do tipo selvagem, um antígeno D aberrante ou outro tipo de D fraco da invenção foram transfundidos por alguns subgrupos do fenótipo D fraco. Os portadores, como doadores de sangue, podem ser determinados por processos previamente estabelecidos na arte ou por processos estabelecidos na invenção, e, subseqüente-mente, a transfusão de alguns subgrupos do fenótipo D fraco pode ser impedida.

Além do mais, a invenção refere-se a um processo para determinar se sangue de um doador pode ser usado para transfusão em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a etapa de testar uma amostra de referido doador para a presença de um ou mais antígenos Rh D da invenção, em que um teste positivo para pelo menos um de referidos antígenos exclui a transfusão de pacientes que são tipados como tendo antígeno D do tipo selvagem ou (a) tipo(s) de D fraco diferentes de tipo(s) D fraco de referidos doadores.

Na base do processo da invenção, é vantajoso e desejado impedir transfusão de um paciente com sangue tipado D de um doador, se os antígenos D fraco em ambos doador e recipiente não são totalmente idênticos.

As amostras referidas nos processos descritos acima podem ser amostras que são referidas por todo o relatório, como sangue, soro, etc.

Com respeito às regras para transfusão em um paciente na base de qualquer um dos processos descritos acima, o máximo cuidado deve ser tomado para que programa de transfusão subótima seja evitado. O fator de risco deve sempre ser considerado pelo clínico encarregado. Em todos os casos, o risco potencial para o paciente deve ser minimizado. A presente invenção é particularmente apropriada para estabelecer critérios que guiarão as estratégias futuras no programa de transfusão de sangue. De acordo com os critérios moleculares estabelecidos pela invenção, o fenótipo D fraco pode ser agrupado. Alguns subgrupos molecularmente definidos do fenótipo D fraco determinado por estes processos podem tender à imunização, se os portadores foram transfundidas com o antígeno Rhesüs D do tipo selvagem, um antígeno D aberrante ou outro tipo D fraco da invenção, e podem produzir um anti-D. Estes portadores podem ser determinados por processos estabelecidos na invenção e, subseqüente-mente, transfundidos com componentes do sangue Rhesus negativo, como unidades do sangue de eritrócito, trombócito e plasma. A maioria dos portadores com fenótipo D fraco não é, na técnica atual, considerada com tendência a ser imunizada deste modo por transfusões de sangue Rhesus D positivo e pode, conseqüentemente, por meios estabelecidos pela invenção, ser seguramente transfundida com RhD positivo, devido a sua classificação em um tipo de D fraco distinto de acordo com a presente invenção. A invenção refere-se também ao uso de um fago, aptâmero, anticorpo monoclonal ou um anti-soro policlonal ou uma preparação dos mesmos, como caracterjzado na presente_invençã&-pafa-detefmtnaçao:do antí-geno RhD.

Em uma forma de realização preferida de referido uso, referida determinação do antígeno RhD é efetuada em conexão com tipo de grupo sangüíneo.

Além do mais, a invenção refere-se a uma preparação compreendendo o anticorpo ou aptâmero ou fago da invenção.

Os tipos de D fraco definidos pela invenção correlacionam-se com certas densidades de antígeno RhD e epítopo RhD, isto é, antígenos RhD por célula expressada na superfície de células do sangue (Flegel e Wagner, 1996) (dados de poucos exemplos são providos na tabela 8). Anticorpos e preparações dos mesmos podem ser testados por qualquer técnica de sorologia de grupo sangüíneo padrão com um ou mais tipos de D fraco da invenção. A reatividade, sensibilidade, avidez, afinidade, especificidade e/ou outras características de anticorpos e anti-soros conhecidas na técnica podem ser determinadas por sua reação com um ou mais tipos de D fraco da invenção, nas condições predeterminadas em técnicas de serologia de grupo sangüíneo padrão bem conhecidas na técnica. A preparação pode ser um diagnóstico ou preparação farmacêutica.

A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um diluente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos deTveículos farmacêuticos apropriados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, como emulsões óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. Composições compreendendo estes veículos podem ser formuladas por processos convencionais bem conhecidos. As composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo em uma dosagem apropriada. Administração das composições apropriadas pode ser efetuada por meios diferentes, por exemplo, por administração intravenosa, intraperitoneal, subcu-tânea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal ou intrabronquial. O regime de dosagem será determinado pelo médico atendente e fatores clínicos. Como é conhecido nas técnicas médicas, dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área superficial do corpo, idade, do composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e de outras drogas sendo administradas simultaneamente. Uma dosagem típica pode ser, por exemplo, na faixa de 0,001 a 1000 μg,■ no entanto, dosagens abaixo ou acima desta faixa exemplar são previstas, considerando especialmente os fatores acima mencionados. Em geral, o regime como uma administração regular da composição farmacêutica deve estar na faixa de 1 pg a 10 mg unidades por dia. Se o regime é uma infusão contínua, deve estar também na faixa de 1 μg a 10 mg unidades por quilograma do peso do corpo por minuto, respectivamente. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica. As composições da invenção podem ser administradas localmente ou sistemicamente. A administração será geralmente parenteralmente, por exemplo, intravenosamente. DNA também pode ser administrado diretamente ao sítio de marcação, por exemplo, por liberação biolística em um sítio de marcação interno ou externo ou por cateter em um sítio em uma artéria. Preparações para administração parenteral incluem soluções não-aquosás e aquosas estéreis, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polieti-leno glicol, óleos vegetais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquo-sas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tampona-dos. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos fixados e de Ringer lactados. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de nutriente e de fluido, rea-bastecedores de eletrólito (como os baseados em dextrose de Ringer), e outros. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatantes e gases inertes, e outros. Além disso, a composição farmacêutica da invenção pode compreender ainda agentes como interleucinas ou interferons dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica.

Um anticorpo e sua preparação pode ser caracterizado por sua reação ou falta de reação em superfícies com certas densidades de epítopo de RhD. Por exemplo, preparações de anticorpo podem ser caracterizadas por células do sangue vermelho aglutinantes com 1.000 antígenos RhD por célula - uma densidade de antígeno RhD deliberadamente selecionada para ser reunida para fins de controle de qualidade. A invenção refere-se também ao tratamento de mulher grávida sendo Rhesus D negativo ou sendo hemizigótica para uma mutação definida acima, em que a criança é Rhesus D positivo ou porta uma mutação diferente acima definida em um estado hemizigótico, compreendendo administrar anti-D à referida mulher.

Mulher grávida pode ser tratada atualmente com uma profilaxia anti-D, quando uma mãe Rhesus negativo está gerando um feto RhD positivo. A invenção permite a discriminação de um requisito de profilaxia anti-D dependendo do estado da mãe e/ou do feto possuindo uma proteína de RhD da invenção. Uma ou mais das proteínas RhD da invenção pode tender a imunização de seus portadores e, conseqüentemente, pode ser indicativa para a terapia da mãe. Similarmente, uma ou mais proteínas RhD da invenção, quando realizada pelo feto, pode ser conhecida ser de baixa imunoge-nicidade para a mãe e, assim, pode ser indicativa da omissão da profilaxia anti-D em diferença da terapia clínica atual. A administração pode ser efetuada por vias padrão e dosagens que podem ser definidas pelo médico atendente: Mollison, 1993. Preferivelmente, um anti-D monoclonal ou combinações/misturas de anti-D monoclo-nais é/são administrado (s) em dosagens de 50 μg a ou excedendo 500 pg anti-D anticorpo/anti-soros para administração intravenosa ou intramuscular (Bowman, 1998). Para o controle de qualidade destes anticorpos/anti-soros anti-D, os resultados e processos fornecidos pela presente invenção podem ser empregados vantajosamente. A presente invenção refere-se também a um processo para identificar uma cadeia VH ou VL~dé anticorpo ou uma combinação das mes-masõü um aptâmero ligando-se especificamente a um polipeptídeo D fraco da invenção, compreendendo: (a) contactar o polipeptídeo D fraco da invenção com uma biblioteca de fago exibindo cadeias VH e\ou VL ou combinações das mesmas na superfície do fago ou com aptâmeros; (b) identificar fago e aptâmeros que ligam-se a referido poli-peptídeo D fraco; e opcionalmente (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes. A preparação da biblioteca de fago e a triagem/identificação do anticorpo (cadeias) desejada per se é bem conhecida na técnica e estudada, por exemplo, em Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455 e referências ali citadas. Também, aptâmeros podem ser preparados e clo-nados em fago de acordo com protocolos convencionais. Apesar de cadeias VH ou VL únicas poderem ser identificadas pelo processo da invenção como ligando-se ao polipeptídeo D fraco da invenção, prefere-se identificar combinações Vh-Vl expressadas pelo fago porque esta situação assemelha-se à situação de ligação do anticorpo natural. Repetindo as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes, especificidades de ligação melhores podem ser identificadas. Protocolos para a otimização de propriedades de ligação como afinidades, incluindo etapas de eluição para remover fago ligado, são bem estabelecidos na técnica. Por exemplo, uma vez uma cadeia VH com uma capacidade de ligação conveniente tenha sido encontrada, cadeias VL podem ser identificadas que melhoram significativamente a capacidade de ligação do anticorpo, por exemplo, substituindo a cadeia VL, que estava associada com a cadeia VH na primeira etapa de seleção, com uma cadeia VL mais apropriada. A invenção refere-se também a um processo para identificar um anticorpo monoclonal ligando-se especificamente a um antígeno/ polipeptídeo D fraco da invenção, compreendendo: (a) contactar o polipeptídeo D fraco da invenção com um ou mais anticorpos monoclonais; (b) identificar anticorpos monoclonais que ligam-se ao referido polipeptídeo D fraco; (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes. A invenção refere-se também a um processo para identificar uma cadeia VH ou VL de anticorpo ou uma combinação das mesmas ou um aptâmero ligando-se especificamente a um antígeno/polipeptídeo D fraco da invenção, compreendendo: (a) contactar o polipeptídeo D fraco e (aa) um segundo ou mais polipeptídeo (s) D fraco e/ou / (ab) um polipeptídeo Rhesus D normal em que um segundo ou mais polipeptídeo (s) D fraco e/ou o polipeptídeo Rhesus D normal estão presentes em uma massa molar que é mais alta, igual ou menor do que o polipeptídeo D fraco de (a) com uma biblioteca de fago exibindo cadeias VH ou VL ou combinações das mesmas na superfície do fago ou com aptâmeros; (b) identificar fago ou aptâmeros que ligam-se a referido polipeptídeo D fraco de (a); e opcionalmente (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes.

Particularmente preferido na etapa (ab) é que a massa molar do segundo polipeptídeo D fraco e o polipeptídeo Rhesus D normal é mais alta do que a do polipeptídeo D fraco de (a).

No caso de que somente um ciclo de seleção é empregado para a identificação (isto é, quando a etapa (c) não se aplica), prefere-se que o número de moléculas de polipeptídeo D fraco de (a) esteja em excesso molar sobre o número de partículas de fago. As formas de realização preferidas do processo para identificar uma cadeia VH ou VL de anticorpo ou de uma combinação das mesmas ou de um aptâmero descrito acima aplicam-se igualmente a esta forma de realização da invenção. A invenção refere-se também a um processo para identificar um anticorpo monoclonal ligando-se especificamente a um antígeno/polipeptídeo D fraco da invenção, compreendendo: (a) contactar o polipeptídeo D fraco, e (aa) um segundo ou mais polipeptídeo(s) D fraco e/ou (ab) um polipeptídeo D normal quando o segundo ou mais polipeptídeo (s) D fraco e/ou o polipeptídeo D normal estão presentes em uma massa molar, que é mais alta, igual ou menor do que o polipeptídeo de fraco de (a) com um ou mais anticorpos mono-clonais; (b) identificar anticorpos monoclonais que ligam-se a referido polipeptídeo D fraco de (a); e, opcionalmente (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes.

Preferivelmente, o polipeptídeo D fraco é exposto na superfície de uma célula. Uma superfície apropriada é a superfície de um eritrócito. No entanto, outras células hospedeiras podem ser transfectadas com um vetor apropriado para expressão do polipeptídeo D fraco e expressam o mesmo em sua superfície. Anticorpos também podem ligar-se a proteínas recombi-nantes de ou partes de proteínas de proteínas purificadas e de D fraco.

Prefere-se ainda que o polipeptídeo ou célula hospedeira seja fixado a um suporte sólido. Exemplos apropriados para suportes sólidos são placas de microtítulo ou contas.

Em um anticorpos adicionalmente preferido, subsequente à etapa (b) ou (c), a seguinte etapa é realizada: (d) identificar a seqüência de aminoácidos das cadeias VH ou VL e/ou identificar as seqüências de ácido nucléico codificando referida seqüência de aminoácidos. A identificação das seqüências de ácido nucléico/aminoácidos pode ser efetuada de acordo com protocolos convencionais: ver, por exemplo, Sambrook et al., loc. cit.

Finalmente, a invenção de refere a um kit compreendendo: (a) o oligonucleotídeo da invenção; e/ou (b) o anticorpo da invenção; (c) o aptâmero da invenção; e/ou (d) o fago da invenção. O kit da invenção que pode compreender vários tipos de anticorpos descritos acima, é particularmente apropriado para a análise de D fraco em amostras obtidas de humanos. Os componentes do kit podem ser embalados como apropriado. Preferivelmente, componentes diferentes são embalados em frascos diferentes. A descrição do teor dos documentos como citado neste relatório é incorporado aqui por referência.

As figuras mostram: Figura 1. Representação esquemática das variações de amino-ácidos observadas nos tipos de D fraco com mutações de sentido errado únicas. Os aminoácidos afetados da proteína de RhD normal predominante e suas posições são mostradas no topo. Suas substituições ocorrendo nos tipos de D fraco são mostradas abaixo da barra.

Figura 2. O nucleotídeo de cDNA e seqüências de aminoácidos pré-ditas do alelo predominante do gene RHD. As seqüências de consenso são mostradas, as quais são depositadas na base de dados da seqüência de nucleotídeos EMBL sob o número de acesso X54534 por Avent et al. e modificadas como indicado na descrição (C a 1.036). As posições dos nucleotídeos e aminoácidos são indicadas pelos números acima e abaixo das seqüências, respectivamente.

Figura 3. Parte do íntron 5 dos genes RHCE e RHD. A seqüência de nucleotídeos do gene RHCE é mostrada. Números indicam a posição relativa à primeira base do exon 5 no gene RHCE. Traços indicam nucleotídeos no gene RHD que são idênticos ao gene RHCE. A região de ponto de ruptura 5’ (178 bp) da característica de conversão de gene para categoria D do tipo III e IV é indicada por asteriscos. As seqüências de nucleotídeos de íntron 5 completas são depositadas em EMBL/GenBank sob os números de acesso Z97333 (RHCE) e Z97334 (RHD).

Figura 4. Detecção de tipos de D fraco por PCR-RFLP. Quatro tipos de D fraco abrigando mutações de ponto que obliteraram sítios de restrição: tipo 1 de D fraco desprovido de um sítio Alw4A (Painel A), tipo 3 de D fraco um sítio Saci (Painel C), tipo 4 de D fraco um sítio Alu\ (Painel D) e tipo D fraco um sítio Msp\ (Painel E). Em um quinto tipo de D fraco, uma mutação de ponto introduziu um sítio de restrição: tipo 2 de D fraco ganhou um sítio Alu\ (Painel B). No lado esquerdo dos géis, escadas de 100 bp são mostradas; a posição dos fragmentos de 500 bp e 100 bp são indicadas no lado direito dos painéis. Para a reação PCR do painel A, a aproximação de 3.000 bp do fragmento de restrição maior não é mostrada. O exemplo ilustra a invenção.

Exemplo: Análise molecular de amostras do fenótipo D fraco Um processo para seqüenciamento específica de RHD dos dez exons de RHD e seus sítios de união foi desenvolvido (tabelas 1 e 2). Em uma estratégia de análise sequencial, amostras de sangue com expressão fraca de antígeno D foram checadas por este processo, PCR-RFLP (tabela 3) e PCR-SSP RHD (Gassner et al., 1997). Para este fim, amostras de sangue anticoaguladas com citrato ou EDTA foram coletadas de doadores de sangue brancos e caracterizadas como D fraco durante tipãgêrrrdo doador de acordo com padrões publicados ("teste Du") (Wissenschafflicher Beirat der Bundesãrztekammer and Bundesgesundheitsamt, 1992), como descrito (Wagner et al., 1995). Amostras VI de categoria D foram excluídas deste estudo.

Seaüência de codificação de RHD em fenótipo D fraco. Seaüen-ciamento de dez exons de RHD de DNA aenòmico. DNA foi preparado como descrito anteriormente (Gassner et al., 1997). Seqüenciamento de nucleotí-deos foi realizada com uma unidade de seqüenciamento de DNA (Prism dye terminator cycle-sequencing kit with AmpliTaq FS DNA polymerase; ABI 373A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). Seqüenciamento de nucleotídeos de extensões representativas de todos os dez exons de RHD e partes do promotor (ver abaixo) foi realizada usando iniciadores (tabela 1) e procedimentos de amplificação (tabela 2) que obviaram a necessidade de etapas de subclonagem.

Controle da especificidade de RHF. Exons 3 a 7 e 9 de RHD transportam pelo menos um nucleótídeo específico de RHD, que foi usado para verificar a origem de RHD das seqüências. Para exon 1, nucleotídeos característicos nas partes adjacentes do íntron 1 foram usados (base de dados da seqüência de nucleotídeos EMBL, números de acesso Z97362 e Z97363). Para exon 8, a especificidade de RHD da amplificação PCR foi checada por seqüenciamento não-específica de RHD do exon 9 informativo, uma vez que exons 8 e 9 foram amplificados como um amplicon PCR (tabela 2). Exons 2 e 10 foram amplificados em um modo específico de RHD (tabela 2) com base nas sequências de nucleotídeos específicas de RHD publicadas usadas (base de dados da seqüência de nucleotídeos EMBL, números de acesso U66340 e U66341; Kemp et al., 1966; Le Van Kim et al., 1992); nenhum amplicon PCR foi obtido em controles de RhD negativo. Todas as amostras de D fraco e de D normal mostraram um G na posição 654 (Arce et al., 1993) e um C na posição 1036 (Le Van Kim et al., 1992), su-portando a noção (Cartron, 1996) que o C (Le Van Kim et al., 1992) e T alternativamente descritos (Arce et al, 1993), respectivamente, foram erros de seqüenciamento.

Detecção de mutações específicas de D fraco por PCR-RFPL e PCR-RFLP. PCR-RFPL bem como PCR-SSP RH (Gassner et al., 1997) foram desenvolvidos ou aplicados para caracterizar substituições de nucleotídeos distintas detectadas em cinco alelos de RHD (ver também tabelas 3 e 4): A substituição de C para G na posição 8 leva à perda de um sítio de restrição Saci em amplicons obtidos com re01 e re11d (G para A em 29, perda do sítio Msp\, re01/re11d; C para A em 446, perda do sítio Alu\, rb20d/rb21d, T para G em 809, perda do sítio AM44I, rf51/re71; G para C em 1154, introdução do sítio Alui, re82/re93). Condições para a reação PCR de rf51/re71 foram como mostrado na tabela 2. A reação de rb20d/rb21d foi feita com poli-merase Taq não-revisada (Boehringer Mannhaim ou Qiagen), com desnatura-ção em 2 s a 94°C, recombinação em 30 s a 60°C e extensão em 30 s a 72°C. As outras reações PCR foram feitas com polimerase Taq não-revisada com desnaturação em 20 s a 94°C, recombinação em 30 s a 55°C e extensão em 1 min a 72°C.

Outros quatro alelos de RHD foram detectados por um PCR-M SSP)5 RH padrão: os alelos (T201R, F223V^ RHD e (S182T, K198N, T201R) RHD desprovidos de amplicons específicos para exon 4 de RHD, os alelos (G307R) RHD e (A276P) RHD dos para o exon 6 de RHD. Para todos os outros tipos de D fraco, a autenticidade das mutações de ponto foi checada por seqüenciamento de nucleotídeos de amplicons PCR independentes.

Seaüenciamento de exons 6 a 9 no tipo III DIV No tipo III DIV exons 6 a 9 foram amplificados e seqüenciados usando iniciadores que foram específicos para RHCE e RHD. Conseqüentemente, o iniciador re71 (tabela 2) foi substituído com iniciador rb7; iniciador re621 por rb26; e inici-\ ador re52 por re74. ^ Dezesseis alelos de RHD com trocas de nucleotídeos distintas codificando substituições de aminoácidos foram identificados (tabela 4). Um alelo representou um alelo híbrido de RHD-CE-D típico, ainda não-publicado, apelidado aqui tipo III DIV. Outro alelo foi DHMi (Liu et al., 1996). Dos 14 alelos restantes, 12 mostraram mutações de sentido errado desconhecidas únicas, mas anteriormente distintas. Nenhum dos aminoácidos variantes codificados nas posições ocorreu nas posições correspondentes nas proteínas RhCE. Dois alelos demonstraram trocas de nucleotídeos múltiplas típicas para o gene RHCE, que foram espalhados por seqüências específicas de RHD.

Distribuição de alelos de D fraco em brancos. Um conjunto de 161 amostras com expressão fraca de antígeno D foram escolhidos de doadores de sangue aleatórios do Sudoeste da Alemanha. Categoria D VI amostra mas nenhum outro D parcial foi excluído por processos sorológicos. Assim, três amostras representaram D parcial conhecido (DHMi (Liu et al, 1996) e categoria D IV (Lomas et al 1989)). Sem qualquer exceção, todas as amostras podem ser concedidas a alelos RHD distintos, com seqüências de codificação aberrantes (Tabela 5). Para o fim da presente invenção, é proposto que novos tipos D fraco moleculares devem ser referidos por nomes triviais, por exemplo Tipo 1 D fraco, ou por suas estruturas moleculares, por exemplo RHD (V270G). O tipo 1 D fraco foi o alelo RHD conhecido mais freqüentemente (f= 1:277), com sequência de codificação aberrante, excedendo mesmo a freqüência do alelo Dv" (Wagner et al, 1997).

Substituições de aminoácidos em alelos D fraco são agrupadas. As substituições de aminoácidos observadas em tipos D fraco com mutações de sentido errado únicas não foram uniformemente distribuídas na proteína RhD (figura 1). A maior parte das substituições ocorreu na região de posições de aminoácido 267 a 397. As substituições de aminoácidos úni- cas e múltiplas em menores porções de proteína RhD em torno de posições 2 a 13, 149 e 179 a 225 (tipo D fraco 4 e 14) foram também encontradas em alelos D fraco. De acordo com o modelo de laço RhD corrente, os aminoáci-dos envolvidos foram posicionados nos segmentos de proteína intracelular e transmembrana.

Controles de fenótipo RhD normal e promotor RHD. Seis amostras de controle com fenótipo RhD normal mostraram uma sequência de proteína RhD normal por sequenciamento específico RHD de dez exons RHD. Para verificar mutações no promotor RHD, uma região de 675 bp usando par de iniciador rb13 e rb11d foi amplificada (tabela 2). A região de promotor foi sequenciada usando iniciadores re02 e re01 partindo em posição de nucleotídeo - 545 com relação ao primeiro nucleotídeo de códon de partida. Uma amostra de cada tipo D fraco, DHMi e tipo DIV III foi empregada. Não foi encontrado desvio de seqüência de promotor RHD publicado (Huang, 1996).

Evidência estatística que mutações de sentido errado podem causar fenótioos D fraco. A freqüência de proteínas RhD alteradas em D fraco (158 de 158) e amostras D normais (0 de 6) foi estatisticamente signi-ficantemente diferente (p < 0,0001, 2x2 tabela de contingência, teste exato de Fisher). Uma seqüência de codificação RhD normal no fenótipo D fraco foi esperada para ocorrer em menos que 1,9% (limite superior de 95% de intervalo de confiança, distribuição Poisson). Foi ainda excluído que estas substituições de aminoácidos refletiram mudanças de nucleotídeos aleatórias somente, devido a duas observações: (i) nos 417 códons de gene RHD, 2.766 mutações de sentido errado e 919 silentes, podem ocorrer. Se as mudanças de meridianos em alelos D fraco forem aleatórias, as mutações silentes foram esperadas com uma freqüência de 0,249. Uma mutação silente foi observada dentre um total de 18 mutações em alelos D fraco (p = 0,039, distribuição binomial). As mutações sem sentido foram consideradas para evitar expressão RhD (Avent et al, 1997b) e assim excluídas do cálculo, (ii) 1.796 bp de gene RHD foram sequenciadas representando uma seqüência de codificação de 1.251 bp e seqüência de não-codificação de 545 bp. Se as mudanças de nucleotídeos forem aleatórias, sua ocorrência na seqüên-cia de não-codificação de alelos D fraco foi esperada com uma frequência de 0,303. Todas as 18 mutações foram, no entanto, localizadas na seqüên-cia de codificação (p = 0,005, distribuição binomial).

Polimorfismos RHD específicos para haolotipo . íntrons 3 e 6 foram analisados. Para verificar o íntron RHD 3 por RFLP, a parte 3' de ín-tron 3 usando par de iniciador específico RHD rb46 e rb12 foi amplificada e os produtos PCR digeridos com Haelll. Para examinar as repetições em tandem TATT em íntron 6 RHD, o íntron 6 de comprimento completo usando o par de iniciador específico para RHD rf51 e re71 e iniciador rg62 foi amplificado usado para sequenciamento.

As sequências RHD polimórficas que diferiram entre os alelos RHD prevalecentes de haplotipos CDe e cDE foram detectadas (tabela 6). No íntron RHD 3, se tem um polimorfismo G/C que determinou um Haelll-RFLP em posição -371 com relação à junção íntron 3/ exon 4. Em íntron RHD 6, se tem um comprimento variável TATT de repetição em tandem partindo de 1.915 bp 3' de exon 6. No alelo RHD prevalecente de haplotipo CDe, o sítio de restrição Haelll estava presente e a região de repetição TATT compreendia 9 repetições. No alelo RHD prevalecente do haplotipo cDE, o sítio de restrição Haelll estava ausente e a região de repetição TATT compreendia 8 repetições. Os alelos D fraco foram idênticos aos alelos prevalecentes do mesmo haplotipo RH com relação a estes polimorfismos em íntron 3 e 6, com a única exceção de D fraco tipo 4 que mostrou 13 repetições TATT. Foi concluído que os alelos D fraco evolveram independentemente em diferentes haplotipos RH.

Tabela 1. Iniciadores usados Região RH D

Nome Sequência de nucleotídeos genômica Posição1 Filamentos específico ra21 gtgccacttgacttgggact íntron 2 2.823 a 2.842 sentido não rb7 atctctccaagcagacccagcaagc exon 7 f .022 a 998 anti-sentido sim rb11 tacctttgaattaagcacttcacag íntron 4 161 a185 sentido sim rb12 tcctgaacctgctctgtgaagtgc fntron4 198 a175 anti-sentido sim rt>13 cíagagccaaacccacatctcctt promoter -675 a -652 sentido não rb15 ttattggctacttggtgcc íntron 5 -612 a-630 anti-sentido não rb20d tcctggctctccctctot íntron 2 -25a -8 sentido sim rb21 aggtccctcctccagcac íntron 3 28 a 11 anti-sentido não rb21d cccaggtccctcctcccagcac íntron 3 32 a 11 anti-sentido não rb22 gg gagattttttcagccag íntron 4 82 a 64 anti-sentido não rb24 agacctttggagcaggagtg íntron 4 -53 a -34 sentido não rb25 agcagggaggatgttacag íntron 5 -111 a -93 sentido não rb26 aggggtgggtagggaatatg íntron 6 -62 a -43 sentido não rb44 gcttgaaatagaagggaaatgggagg íntron 7 * 3,000 anti-sentido não rb46 tggcaagaacctggaccttgacttt íntron 3 -1,279 a -1,255 sentido não rb52 ccaggttgttaagcattgctgtacc íntron 7 «- 3.300 sentido sim re01 atagagaggccagcacaa promoter -149 a-132 sentido Sjm re02 tgtaactatgaggagtcag promoter -572 a -554 sentido sjm re11d agaagatgggggaatctttttcct íntron 1 129 a 106 anti-sentido não re12d attagccgggcacggtggca íntron 1 -1.188 a-1,168 sentido sim re13 actctaatttcataccaccc íntron 1 -72 a -53 sentido não re23 aaaggatgcaggaggaatgtaggc íntron 2 251 a 227 anti-sentido não re31 tgatgaccatcctcaggt exon 3 472 a 455 anti-sentido sim re617 tctcagctcactgcaacctc íntron 6 1,998 a 2,017 sentido não re621 catccccctttggtggcc íntron 6 - -102a -85 sentido Sim re71 acccagcaagctgaagttgtagcc exon 7 1,008 a 985 anti-sentido sim re73 cctttttgtccctgatgacc íntron 7 - 67 a -48 sentido η§ο re74 tatccatgaggtgctgggaac íntron 7 * -200 sentido não re75 aaggtaggggctggacag íntron 7 * 120 anti-sentido sjm re82 aaaaatcctgtgctccaaac íntron 8 % -45 sentido sjm re83 gagattaaaaatcctgtgctcca íntron 8 «-50 sentido não re91 caagagatcaagccaaaatcagt íntron 9 »-40 sentido não re93 cacccgcatgtcagactatttggc íntron 9 * 300 anti-sentido não rf51 caaaaacccattcttcccg íntron 5 -332 a-314 sentido não rg62 tgtattccaggcagaaggc íritron6 1.736'a 1,755 sentido não rh5 gcacagagacggacacag 5’UTR: -19 a-2 sentido não rh7 acgtacaaatgcaggcaac 3' UTR2 1,330 a 1,313 anti-sentido não rr1 tgttggagagaggggtgatg 5‘ UTR -60 a -41 sentido não rr3 cagtctgttgtttaccagatg 3’UTR 1,512 a. 1,492 anti-sentido sim rr4 agcttactggatgaccacca 3'UTR 1,541 a 1,522 anti-sentido sim 1 As posições dos oligonucleotídeos sintéticos são indicadas com relação a suas distâncias da primeira posição de nucleotídeo do códon ANTÍGENO RHESUS D de partida para todos os iniciadores no promotor e nos exons, incluindo a parte não-traduzida 3’ do exon 10, ou com relação a seus limites exon/íntron adjacentes para todos os outros iniciadores. Iniciador ra21 foi descrito anteriormente (Poulter et al., 1996). 2 5’ UTR: região não-traduzida 5’ do exon 1; UTR"região não-traduzida 3’ do exon 10.

Tabela 2. Processo de seqüenciamento para todos os dez exons de RHD de DNA genômico iniciadores de PCR RHD Condições de PCR1 RHD RH D exon Recombinação de extensão específica anti-sentido sentido2 Iniciadores, Específico2 Exon 1 rb13 rb11d não 10 min 60°C re01 sim Exon 2 re12d re23 sim 3 min 65°C re13 não Exon 3 ra21 rb21 não 10 min 60°C re31 e rb20d sim Exon 4 rb46 rb12 sim 10 min 60°C rb22 não Exon 5 rb 11 rh2 sim 10 min 60eC rb24 não Exon 6 rf51 re71 sim 10 min 60*C rb25 não Exon 7 re617 rb44 não 10 min 60eC re621 e re75 sim Exon 8 rb52 rb93 Sim 10 min 60°C re73 não Exon 9 rb52 rb93 sim 10 min 60“C re82/re83 sim/não Exon 10 re91 rr4 sim 10 min 60°C rr3/rh7 sim/não 1 Iniciadores foram usados em uma concentração de 1 mM no Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). No PCR do exon 10, a concentração de MgCI2 foi 2,0 nM. Desnaturação foi 20 s a * 92°C, recombinação 30 s, temperatura de alongamento 68°C, Tempo de alinhamento foi aumentado em 20 s para cada ciclo após ο 105 ciclo, exceto para o par de iniciadores re12d/re23. 2 Para obter especificidade de RHD para seqüenciamento de nucleotídeos genômica, os pares de iniciadores de PCR ou o iniciador de seqüenciamento ou ambos não devem detectar seqüências de nucleotídeos derivadas de RHCE simultaneamente. Seqüências de iniciador são dadas na tabela 1.

Tabela 3. Análise PCR-RFLO de cinco alelos de RHD

Alelo Substituição Iniciadores PCR Enzima de restrição RHD( S3C) 8C-+G re01 re11d Saci RHD(R10Q) 29 G-»A re01 re11d Mspl RHD(A149D) 446 C->A rb20d rb21 Alui RHD(V270G) 809T-*G rf51 re71 Alw44l RHD(G385A) 1154G->C re82 re93 Alui 1 Condições para a reação PCR de rf51/re71, como mostrado na tabela 2. Todas as outras reações PCR foram feitas com polimerase Taq não-revisada (Boehringer Mannheim) com desnaturação em 20 s a 94°C, recombinação em 30 s a 55°C e extensão em 1 min a 72°C. Exemplos destes PCR-RFLPs de tipos 1, 2, 3, 5, 6 de D fraco são mostrados na figura 4.

Tabela 4: Bases moleculares de fenótípo D Iraco Efeitos na troca de Seqiiênciade Localização prevista Membrana de nudeotldeos proteína exons envolvida na célula alelo1 RH0(S3C) C->G a β SeraCys 3 i ÍC

RHD(R10Q) G-+A 329 AigaGIn 10 1 IC

RHD(W16C, T201R, F223V) G-»Ca«, TrpaCys:16 1 TM

C-»G a 602, Thr aArg 201 4 IC

T->G a 662 Phe a Vai 223 5 TM G-A a819 nenhuma mudança 6 RHD(R114W) C-+T a340 Arg aTrp 114 3 TM

R/®(A149D) C-.A 3446 Ala .a Asp 149 3 TM

RHD(S182T,K198N.T201R) T-»A aS44, Ser aThr 182 4 TM

A->T a 594, Lys a Asn 198 4 IC

C~>Ga602 ThraArg 201 4 IC

RW0|T2O1R,F223V) C->Ga602, ThraArg 201 4 IC

T-*G 3667, Phe a Vai 223 5 TM G->A a 819 nenhuma mudança 6 RH0(W22OR] T-»C a 858 TrpaCys 220 5 TM

RHD(V270G) T-»Ga809 ValaGly 270 6 TM

RHD(A276P) G-+C a 826 AlaaPro 276 6 TM

RHD(G277E) G-*Aa830 GlyaGlu 277 6 TM

RHD(G282D) G-+A a 845 GlyaAsp 282 6 TM

RHD(A294P) G->Ca'880 AlaaPro 294 6 TM

RWD(M295I) G-+T a885 Mel alie 295 6 TM

R//D(G307R) G-)Aa919 GlyaArg 307 6 IC

R//0(G339E) G >A a 1016 GlyaGlu 339 7 TM

RMD(G385A) G-»Ca1154 Gly aAla 385 9 TM

RHD(W393R) T-.C :1177 Trp aArg 393 9 IC

DHUi C-»T a 848 T.hr a lie a 263 6 EF

Dw tipo III múltiplo ^ D EF/TM7IC IC intracelular. TM1 transmembranoso, EF - exofacial Tabela 5. Nomenclatura proposta para alelos de RHD codificando fenótipos D fraco e suas fregüências de população mínimas Nome Bases moleculares Fregüpncia Fregtiência de população mínima3 comum (alelo) n' fenófipo* fénótipo' haplotipo fraco D tipo 1 RHD(V270G) 95 70.29% 0.2964% 0.003606 (1:277) fraco D tipo 2 RHD(G385A) 43 18.01% 0.0759% 0.000924 (1:1,082) fraco D tipo 3 Rf/D(S3C) 7 5.19% 0.0219% 0.000266 (1:3,759) fraco d tipo 4' RHD(T201R,F223V) 6 1.30% 0.0055% 0.000067 (1:14,925) fraco o tipo 5 RHD(G307R) 1- 0.74% 0.0031% 0.000038 (1:26,310) fraco D tipo 6 RHO(RIOQ) 1 0.74% 0.0031% 0.000038 (1:26,316) fraco D tipo 7 RHO(G339E) 1 0.74% 0.0031% 0.000038 (1:26,316) fraco D tipo 8 RHD(A294P) 1 0.42% 0.0017% 0.000021 (1:47,619) fraca D tipo 9 RHD(A149D) 1 0.42% 0.0017% 0.000021 (1:47,619) fraco d tipo 10 RHD(W393R) 1 0.42% 0.0018% 0.000021 (1:47,619) fraco D tipo 11 RRD(M295I) 1 0.22% 0.0009% 0.000011 (1:90,909) fraco Dtip012 RHD[G27?E) 0 . · - fraco D tipo 13 RHD(A276P) 0 - fraco D tipo 14 RHD(S182T,K198N,T201R)' 0 ■ fraco D tipo 15 RHD(G282D) 0 - · fraco D tipo 18 RHO(W220R) 0 - - fracoOtípo 17 RHO(R114W) 0 ... DHMi RHD(T283I) 2 0.84% 0.0035% 0.000043 (1:23,256) p" tipo III RHD-CE(6-9)-D 1 0.60% 0.0025% 0.000031 (1:32,258) Vr —.......... f~......................—.......—......... ■■.... ....................................

Total . 161 100% 0.4185% 0.005094 • tipo 4 de D fraco pode ser subdividido em duas formas: • tipo 4a de D fraco; ver tipo 4 de D fraco, na tabela • tipo 4b de D fraco RHD (W16C, T201R, F223V) 1 Número de amostras observadas entre 161 amostras de sangue com expressão de antígeno D fraco, Tipos 12 a 17 não foram detectadas entre estas amostras de sangue, mas encontradas independentemente. 2 As freqüências de fenótipo dentre amostras de D fraco foram calculadas ajustando as freqüências dos fenótipos D fraco serológicos (Wagner et al., 1995) Amostras de D fraco ccDEE foram assumidas ser cDE/cdE. 3 Freqüências de fenótipo na população foram calculadas da freqüência de população do fenótipo D fraco no sudoeste de Alemanha (Wagner et al., 1995). Estas são estimativas mínimas, porque algumas amostras com expressão de D somente moderadamente podem ter sido agrupadas em D potente normal. Freqüências de haplótipos foram calculadas usando uma freqüência de haplótipo de 0,411 para haplótipos de RhD negativo (Wagner et al., 1995) assumindo que todas as amostras de D fraco foram heterozigó-ticas.

Tabela 6. Polimorfismos de RHD em genes RHD de vários haplótipos Sítio Haelll Repetição TATT

Haplótipo1 Aleío no íntron 3 No íntron 6 CDe RHD predominante presente 9 CDe fraco D tipo 1 presente 9 CDe fraco D tipo 3 presente 9 CDe fraco D tipo 5 presente 9 CDe fraco D tipo 7 presente 9 CDe fraco D tipo 12 presente 9 CDe fraco D tipo 13 presente 9 CDe fraco D tipo 17 N.D. 9 CDe DIV tipo III Presente -2 cDE RHD3 predominante ausente 8 cDE fraco D tipo 2 ausente 8 Tabela 6. (Continuação) Sítio Haelll Repetição TATT

Haplótipo1 Alelo no íntron 3 No íntron 6 CDE fraco D tipo 8 ausente 8 CDE fraco D tipo 9 ausente 8 CDE fraco D tipo 10 ausente 8 CDE fraco D tipo 14 ausente 8 CDE fraco D tipo 15 ausente 8 CDE fraco D tipo 16 ausente 8 CDE DHMi ausente 8 C(W16C)De RHD4 predominante presente 9 C(W16C) fraco D tipo 4 presente 13 CDe RHD4 predominante geralmente presente 8 ou 9 CDe fraco D tipo 11 presente 8 1 A associação de haplótipo do sítio Haelll foi testada em amostras de 10 CCDee, 8 ccDEE, 10 cc (W16C) De e 10ccDee. A associação de haplótipo da repetição TATT foi testada em amostras 3 CCDee, 3 ccDEE, IccDEe, 2cc (W16C)De e 2 ccDee. 2 íntron 6 derivado de RHCE devido a uma conversão de gene. 3 Seis de sete alelos investigados mostraram 8 repetições, um 9 repetições. 4 O sítio Haelll estava presente em 8 de 10 amostras testadas com sítio Ha-elll mostrou 9 repetições TATT, amostras sem sítio Haelll, 8 repetições. ND= não determinado Tabela 7. Localização prevista de segmentos da proteína de RhD relativa às membranas de células do sangue vermelho Faixa de ami- Intracelular Transmembra- Exofacial Comprimento noácidos noso (aminoácidos) 1-11 X 102 12-31 X 20 32- 53 X 22 54-71 X 18 Tabela 7. (Continuação) Faixa de ami- intracelular Transmembra- Exofacial Comprimento noácidos noso (aminoácidos) 72- 75 X 4 76-93 X 18 94-110 X 17 111-130 X 20 131-134 X 4 135-153 X 19 154-169 X 16 170-187 X 18 188-207 X 20 208-225 X 18 226-238 X 13 239-256 X 18 257- 264 X 8 265-282 X 18 283- 286 X 4 287- 306 X 20 307-333 X 27 334-351 X 18 352-370 X 19 371-388 X 18 389-417 X 29 Total 5 laços e 12 hélices 6 laços 4162 2 segmento s 1 Localização da extremidade da proteína terminal carbóxi e amino de acordo com Avent et al. {J. Biol. Chem. 1992} e Hermand et al. {Blood 1993}. As hélices transmembranosas foram previstas por PHDhtm (www.embl-heidelberg. de/predictoprotein/predictoprotein.html}, a hélice nas posições 371 a 388 por TMpred {ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html}. 2 O aminoácido (metionina) na posição 1 não é expressada na proteína RhD madura como mostrado pela seqüenciamento de aminoácidos {Avent et al., Biochem J., 1988}.

Tabela 8. Densidades do epítopo de RhD na amostra para tipos de D fraco D fraco Densidade do epítopo de RhD (antígenos RhD/glóbulos vermelhos) tipo 3 1.500 tipo 1 900 tipo 2 500 Tipo 12 <100 Uma amostra de cada tipo de D fraco foi testada com um anti-D policlonal (Lorne Laboratories Ltd., Redding, Berkshire, Inglaterra), como descrito anteriormente (Flegel e Wager, 1996). Resultados similares foram obtidos por anti-D monoclonal (BS228, Biotest AG, Dreieich, Alemanha’e P3x290, Diagast, Lille, França).

Referências Agre, P.C.. Davies. D.M., Issitt. P.D.. Lamy, B.M., Schmidt, P.J.. Treacy, M„ and Vengeien-Tyler, V. 1992. A proposal to standardize terminology for weak D antigen [Letter]. Transfusion 32:86-87.

Arce, M.A.. Thompson, E.S.. Wagner, S„ Coyne, K.E., Ferdman. B.A., and Lublin. D.M. 1993. Molecular cloning of RhD cDNA derived from a gene present in RhD-positive, but not RhD-negative individuais. Blood82:651-655.

Aubin, J.T., Le Van Kim, C., Mouro, i., Colin. Y., Bignozzi, C„ Brossard, Y.. and Cartron, J.P. 1997. Specificity and sensitivity of RHD genotyping methods by PCR-based DNA amplification. Briiish Journal of Haematology 98:356-364.

Avent. N.D., Butcher, S.K., Liu, W.. Mawby. W.J.. Mallinson, G.t Parsons, S.F., Anstee, D.J., Tanner, M.J. 1992. Localization of the C termini of the Rh(rhesus) polypeptides to the cytoplasmic face of the human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem. 267:15134-15139.

Avent. N.D., Jones, J.W., Liu, W., Scott, M.L., Voak, D., Flegel, W.A., Wagner, F.F., and Green, C. 1997a. Molecular basis of the D variant phenotypes DNU and Dll allows localization of criticai amino acids required for expression of Rh D epitopes epD3, 4 and 9 to the sixth externai domain of the Rh D protein. British Journal of Haematology 97:366-371.

Avent. N.D., Martin, P.G.r Armstrong-Fisher, S.S., Liu, W.t Finning, K.M., Maddocks, D., and Urbaniak, S.J. 1997b. Evidence of genetic diversity underlying Rh D negative, weak D (Du) and partial D phenotypes as determined by multiplex PCR anaJysis of the RHD gene. Blood 89:2568-2577.

Avent, N.D., Rigwell, K., Mawby, W.J., Tanner, M.J., Anstee. D.J., Kumpel, B. 1988. Protein-sequence studies on Rh-related polypeptides suggest the presence of at least two groups of proteins which associate in the human red-cell membrane. Biochem. J. 256:1043-1046.

Beckers. E.A., Faas, B.H., Ligthart, P.. Overbeeke, M.A.. von dem Borne, A.E., van der Schoot, C.E., and van Rhenen, D.J. 1997. Lower antigen site density and weak D immunogenicity cannot be explained by structural genomic abnormalities cr regulatory defects of the RHD gene. Transfusion 37:616-623.

Beckers, E.A.M., Faas, B.H.W., Overbeeke. M.A.M., vort dem Borne, A.E.G.K., van Rhenen, D.J., and van der Schoot. C.E. 1995. Molecular aspects of the weak-D phenotype. Transfusion 35:50S

Bowman. J.M. 1998. RhD hemolytic disease of the newborn. N. Engl. J. Med. 339:1775-1777 Cartron, J.-P. 1996. Rh DNA - coordinatods report. Transfusion Clinique et Biologique 3:491-495.

Ceppellini, R., Dunn, L.C., and Turry, M. 1955. An interaction between alleles at the Rh locus in man which weakens the reactivity of 1he Rho factor (Du). Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 41:283-288.

Cherif-Zahar, B., Raynal. V.. Gane, P.. Mattei, M.G.. Bailly, P., Gibbs, B., Colin, Y., and Cartron. J.-P. 1996. Candidate gene acting as a suppressor of the RH locus in most cases of Rh-deficiency. Nature Genetics 12:168-173.

Flegei, W. A., Müller. T.H., Schunter, F., Gassner, C., Schdnitzer, D., and Wagner, F.F. 1997. D category VI type UI: A D-Ce(3-6)-D hybrid protein with normal RhD antigen density on red cells [Abstract]. Transfusion 37S:101S

Flegei, W.A. and Wagner, F.F. 1996. RHD epitope density profiles of RHD variant red cells analyzed by flow cytometry. Transfusion Clinique ei Biologique 3:429-431.

Fukunriori, Y., Hori, Y., Ohnoki, S„ Nagao, N.. Shibata, H., Okubo, Y., and Yamaguchi, H. 1997. Further analysis of Del (D-elute) using polymerase chain reaction (PCR) with RHD gene-specific primers. Transfusion Medicine 7:227-231.

Gassner, C., Schmarda, A., Kilga-Nogler, S., Jenny-Feldkircher, B., Raíner, E.t Müller, T.H., Wagner, F.F.. Flegei, W.A., and Schõnitzer, D, 1997. RhesusD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. Transfusion 37:1020-1026.

Hasekura. H., Ota, M.. Ito. S.. Hasegawa, Y., Ichinose. A., Fukushima, H.. and Ogata, H. 1990. Flow cytometric studies of the D antigen of various Rh phenotypes with particular reference to D“ and D*'. Transfusion 30:236-238.

Hermand, P., Mouro, I., Huet, M., Bloy, C., Suyama, K., Goldstein, J., Cartron, J.P., Bailly, P. 1993. Immunochemical characterization of rhesus proteins with antibodies raised against synthetic peptides. Bfood 82:669-676.

Huang, C.H. 1996. Alteration of RH gene structure and expression in human dCCee and DCW- red blood cells: phenotypic homozygosity versus genotypic heterozygosity. Blood 88:2326-2333.

Huang, C.H. 1997. Molecular insights into the Rh protein family and associated antigens. Current Opinion in Hematology 4:94-103.

Huang, C.H., Chen. Y., and Reid, M. 1997. Human D(lila) erythrocytes: RhD protein is associated with multipie dispersed amino acid variations. Am. J Hematot. 55:139-145.

Issitt. P.D. and Telen. M.J. 1996. D. weak D (Du), and partial D: the moiecular story unfolds. Transfusion 36:97-100.

Jones, J.W.. Finning, K.M., Mattock. R., Voak. D.. Scott, M.L., and Avent, N.D. 1997. The serological profile and molecular basis of a new partia) D phenotype, DHR. Vox Sanguinis 73:252-256.

Jones. J.W.. Lloyd-Evans, P.. and Kumpel. B.M. 1996. Quantitation of Rh D antigen sites on weak D and D variant red cells by flow cytometry. Vox Sanguinis 71:176-183.

Kajii, E.. Umenishi, F.. Omi. T., and Ikemoto. S. 1995. Intricate combinatoria! patterns of exon spücing generate multiple Rh- related isoforms in human erythroid cells. Human Genetics 95:657-665.

Kemp, T.J., Poulter, M., and Carritt. B. 1996. A recombination hot spot in the Rh genes revealed by analysis of unrelated donors with the rare D-- phenotype. American Journal of Human Genetics 59:1066-1073.

Le Van Kim, C.t Mouro, I.. Cherif-Zahar, B., Raynal, V., Cherrier, C., Cartron, J.P., and Colin, Y. 1992. Molecular cloning and primary structure of the human blood group RhD polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 89:10925-10929.

Leader, K.A., Kumpel. B.M., Poole G.D., Kirkwood, J.T., Merry A.H. and Bradley, B.A. 1990. Human monoclonal anti-D with reactivity against category DVl cells used in blood grouping and determination of the incidence of the category DVl phenotype in the DU population. Vox Sang 58:(2):106-11 Legler, T.J., Blaschke, V.,' Bustami,. N., Malekan, M., Schwartz, D.W.M., Mayr, W.R., Panzer, S„ and Kohler, M. 1997. RHD genotyping on exons 2. 5, 7, intron 4 and the 3' non-coding region in Dw”\ Dvi, DFR and D-- individuais. Transfusion 37:100S

Liu, W., Jones. J.W., Scott, M.L., Voak, D., and Avent, N.D. 1996. Molecular analysis of two D-variants, D””* and D”**1 [Abstract], Transfusion Medicine 6(suppl 2):21 Lomas, C.. Grâssmann, W.f Ford, D., Watt, J., Gooch, A., Jones, J., Beolet, M., Stem, D.. Walface, M.. and Tippett, P. 1994. FPTT is a low-incidence Rh antigen associated with a ''new" partial Rh D phenotype, DFR. Transfusion 34:612-616.

Lomas, C., McColl, K., and Tippett, P. 1993. Further complexities of the Rh antigen D disclosed by testing category D" c-ells with monoclonal anti-D, Transfusion Medicine 3:67-69.

Lomas. C.. Tippett, P., Thompson, K.M., Melamed, M.D., and Hughes-Jones, N.C. 1989. Demonstration of seven epitopes on the Rh antigen D using human monoclonal anti-D antibodies and red cells from D categories. Vox Sanguinis 57:261-264.

Mdlison. P. L.t Engelfriet, C.P., and Contreras, M. 1993. Blood transfusion in clinicai medicine. 9th ed. London: Blackwel! Scientific Publications.

Moore, B.P.L. 1984. Does knowledge of D“ status serve a useful purpose? Vox Sanguinis 46S1:95-97.

Mourant. A. E., Kopec, A.C., and Domaniewska-Sobczak, K. 1976. The distribution of the human blood groups and other potymorphisms. 2nd ed. London: Oxford University Press.

Nelson. M., Barrow, LA., Popp, H., and Gibson. J. 1995. Some observations on D antigen expression of D-positive and 'weak D- positive' red cells as assessed by flow cytometry. Vox Sanguinis 69:152-154.

Nicholson, G.. Lawrence, A., Ala. FA., and Bird. G.W.G. 1991. Semi-quantitative assay of D antigen site density by flow cytometric analysis. Transfusion Medicine 1:87-90.

Poulter, M., Kemp, T.J., and Carritt, B. 1996. DNA-based Rhesus typing: simultaneous determination of RHC and RHD status using the polymerase chain reaction. Vox Sanguinis 7:164-168.

Roubinet, F., Apoil, P.A., and Blancher, A. 1996. Frequency of partial D phenotypes in the south western region of France. Transfusion Clinique et Biologique 3:247-255.

Rouillac, C., Gane, P., Cartron, J.-P., Le Pennec, P.Y., and Colin, Y. 1996. Molecular basis of the altered antigenic expression of RhD in weak D (Du) and RhC/e in RN phenotypes. Blood 87:4853-4861.

Rouillac, C., Le Van Kim, C., Beolet, M., Cartron, J.P., and Colin, Y. 1995. Leu110Pro substitution in the RhD poiypeptide is responsible for the Ο”' category blood group phenotype. American Journal of Hematology 49:87-88.

Salmon, C„ Cartron, J.-P., and Rouger, P. 1984. The human blood groups. New York: Masson.

Scott, M. 1996. Rh serology - coordinator's report. Transfusion Clinique et Biologique 3:333-337.

Siegel, D.L., Silberstein, L.E. 1994. Expression and characterization of recombinant antr-Rh(D) antibodies on filamentous phage: a model system for isolating human red blood cell antibodies by repertoire cloning. Blood Apr. 15:83(8):2334-44 Stratton. F. 1946. A new Rh allelomorph. Nature 158:25 Tazzari, P.L., Bontadini, A., Belletti, D., Malferrari. F., and Conte, R. 1994. FSow cytometry: a tool in immunohematology for D+w <DU) antigen evaluation? Vox Sanguinis 67:382-386.

Tippett. P. and Sanger, R. 1962. Observations on subdivisions of Rh antigen D. Vox Sanguinis 7:9-13.

Tippett, P. and Sanger, R. 1977. Further observations on subdivisions of the Rh antigen D. Das Àrztliche Laboratorium 23:476-480.

Wagner, F.F. 1994. Infiuence of Rh phenotype on the antigen density of C, c, and D: flow cytometric study using a frozen standard red cell. Transfusion 34:671-676.

Wagner, F.F., Hillesheim, B., and Flegel, W.A. 1997. D-Kategorie VII beruht einheitlich auf der Aminosãuresubstitution Leu(110)Pro. Beitràge zur infusionstherapie und Transfusionsmedizin 34:220-223.

Wagner, F.F., Kasulke. D., Kerowgan, M., and Flegel, W.A. 1995. Frequencies of the blood groups ABO, Rhesus, D category VI, Kell, and of clinically relevant high-frequency antigens in South-Western Germany. infusionstherapie und Transfusionsmedizin 22:285-290.

Wissenschaftlicher Beirat der Bundesãrztekammer and Bundesgesundheitsamt. 1992. Richtiinien zur Blutgruppenbestimmung und Btuttransfusion. Kõln: Deutscher Ãrzte-Verlag.

Claims

1. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora heteróloga operavelmente ligada a uma molécula de ácido nucléico de SEQ ID NO:41 compreendendo pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo consistindo em uma mutação na posição 8 de C para G, na posição 29 de G para A, na posição 48 de G para C, na posição 340 de C para T, na posição 446 de C para A, na posição 544 de T para A, na posição 594 de A para T, na posição 602 de C para G, na posição 658 de T para C, na posição 667 de T para G, na posição 809 de T para G, na posição 819 de G para A, na posição 826 de G para C, na posição 830 de G para A, na posição 845 de G para A, na posição 880 e G para C, na posição 885 de G para T, na posição 919 de G para A, na posição 1016 de G para A, na posição 1154 de G para C, e na posição 1177 de T para C.

2. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as mutações são (i) T -> A na posição 544, A4Tna posição 594 e C -> G na posição 602; (ii) C -> G na posição 602, T -> G na posição 667 e G -> A na posição 819; ou (iii) G -> C na posição 48, C->Gna posição 602, T->Gna posição 667 e G -> A na posição 819.

3. Bactéria ou levedura, caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Processo para produzir um antígeno Rhesus D contribuindo para o fenótipo D fraco, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria ou levedura, como definida na reivindicação 3, sob condições apropriadas e isolar o antígeno Rhesus D produzido.

5. Processo para testar a presença de uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para o fenótipo D fraco em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende hibridizar um oligonucleotídeo consistindo em um segmento de 12 a 50 nucleotídeos consecutivos da molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1 ou 2 em que o referido segmento compreende pelo menos uma das posições 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 e 1177 sob condições estringentes de hibridiza- ção e lavagem de 0.1*SSC, 0.1% SDS a 65Ό com moléculas de ácido nu-cléico compreendidas na amostra obtida de um ser humano e detectar a referida hibridização.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda digerir o produto da referida hibridização com uma endonuclease de restrição e analisar o produto de referida digestão.

7. Processo para testar a presença de um ácido nucléico de codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo do fenótipo D fraco em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende se-quenciar pelo menos uma porção da molécula de ácido nucléico presente na amostra e verificar a presença de uma ou mais das mutações como definidas na reivindicação 1.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as mutações são (i) T -> A na posição 544, A -> T na posição 594 e C 4 G na posição 602; (ii) C -> G na posição 602, T -> G na posição 667 e G 4 A na posição 819; ou (iii) G -> C na posição 48, C -> G na posição 602, T4Gna posição 667 e G 4 A na posição 819.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes de determinar referida sequência de ácido nucléico, a amplificação da pelo menos uma porção da referida molécula de ácido nucléico por uma reação em cadeia de polimerase (PCR).

10. Processo para testar a presença de uma molécula de ácido nucléico codificando um antígeno Rhesus D contribuindo para ou indicativo do fenótipo D fraco em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende realizar uma reação em cadeia de polimerase (PCR), em que um dos iniciadores empregado na referida reação consiste em um segmento de 12 a 50 nucleotídeos consecutivos da molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1 ou 2 em que o referido segmento compreende pelo menos uma das posições 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 e 1177.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida amostra é sangue, soro, plasma, tecido fetal, saliva, urina, tecido mucosal, muco, tecido vaginal, tecido fetal obtido de vagina, pele, cabelo, folículo do cabelo ou outro tecido humano.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende o enriquecimento de células fetais ou extração de DNA fetal ou mRNA de tecido maternal, como sangue periférico, soro, ou plasma.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 12, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico da referida amostra é fixada em um suporte sólido.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido suporte sólido é um chip.

15. Uso da molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a análise de um fenóti-po Rhesus D fraco.

16. Uso da molécula de ácido nucléico ou do vetor como definidos na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a avaliação da afinidade, avidez e/ou reatividade de anticorpos monoclonais ou de antisoro policlonal preferivelmente antisoro anti-D, antiglobulina ou anti-soro de antiglobulina-humana.

17. Processo para a caracterização de anticorpos monoclonais ou anti-soro policlonal ou de uma preparação dos mesmos, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) testar o ácido nucléico de amostra de um indivíduo testado pela presença de uma mutação, como definida na reivindicação 1 ou 2; (b) correlacionar, com base no estado de mutação e o estado alélico de gene RHD, o ácido nucléico com a densidade de antígeno RhD na superfície de glóbulos vermelhos do referido indivíduo testado; (c) reagir referidos anticorpos monoclonais ou anti-soro policlonal ou referida preparação dos mesmos com uma célula transportando o antígeno RhD em sua superfície; (d) caracterizar referidos anticorpos monoclonais ou anti-soro policlonal ou referida preparação dos mesmos com base nos resultados obtidos na etapa (c).

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida caracterização compreende a determinação de reatividade, sensibilidade, avidez, afinidade, especificidade e/ou outras características de anticorpos e anti-soro.

19. Processo de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a referida célula transportando o antígeno RhD em sua superfície é um glóbulo vermelho.

20. Processo para identificar uma cadeia VH ou VL de, ou uma combinação das mesmas, ou um aptâmero especificamente ligando a um polipeptídeo D fraco, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar um polipeptídeo D fraco compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 com pelo menos uma mutação na posição de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 e 393 com uma biblioteca de fagos expondo cadeias VH ou VL ou combinações das mesmas, na superfície do fago ou com aptâmeros; (b) identificar o fato ou aptâmeros que se ligam ao referido polipeptídeo D fraco; e opcionalmente (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes.

21. Processo para identificar um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um antígeno/polipeptídeo D fraco, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contar um polipeptídeo D fraco compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 com pelo menos uma mutação na posição de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201,220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 e 393, com um ou mais anticorpos monoclonais; (b) identificar os anticorpos monoclonais que ligam ao referido polipeptídeo D fraco; e opcionalmente (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes.

22. Processo para identificar cadeias VH ou VL de um anticorpo, ou uma combinação das mesmas, ou um aptâmero que se liga especificamente a um antígeno/polipeptídeo D fraco, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar um primeiro polipeptídeo D fraco compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 com pelo menos uma mutação na posição de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201,220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 e 393; e um segundo polipeptídeo D, que é (i) um polipeptídeo D fraco diferente fraco compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 com pelo menos uma mutação na posição de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201,220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 e 393; e/ou (ii) um polipeptídeo D de SEQ ID NO:42, em que o segundo polipeptídeo D está presente em uma massa molar que é maior, igual ou menor que o primeiro polipeptídeo D fraco, com uma biblioteca de fagos expondo cadeias VH ou VL ou combinações das mesmas na superfície do fago ou com aptâmeros; (b) identificar um fago ou aptâmeros que se ligam ao referido primeiro polipeptídeo D fraco; e opcionalmente (c) repetir etapas (a) e (b) uma ou mais vezes.

23. Processo para identificar um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um antígeno/polipeptídeo D fraco, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar um primeiro polipeptídeo D fraco compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 com pelo menos uma mutação na posição de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201,220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 e 393; e um segundo polipeptídeo D, que é (i) um polipeptídeo D fraco diferente compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42 com pelo menos uma mutação na po- sição de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas posições 3, 10, 16, 114, 149, 182, 198, 201, 220, 223, 270, 276, 277, 282, 294, 295, 307, 339, 385 e 393; e/ou (ii) um polipeptídeo D de SEQ ID NO:42 em que o segundo polipeptídeo D está presente em uma massa molar que é maior, igual ou menor que o primeiro polipeptídeo D fraco com um ou mais anticorpos monoclonais, (b) identificar os anticorpos monoclonais que ligam ao referido primeiro polipeptídeo D fraco e opcionalmente (c) repetir as etapas (a) e (b) uma ou mais vezes.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo D fraco é exposto sobre a superfície de uma célula.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou bactérias e leveduras são fixados a um suporte sólido.

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado pelo fato de que subsequente à etapa (b) ou (c), a seguinte etapa é realizada: (d) identificar a sequência de aminoácidos das cadeias VH ou VL e/ou identificar a sequência de ácido nucléico codificando a referida sequência de aminoácido.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que, no caso em que somente um ciclo de seleção é empregado para a identificação, o número de moléculas do primeiro polipeptídeo D fraco está em excesso molar sobre o número de partículas de fagos.

28. Processo para a avaliação de afinidade, avidez e/ou reativi-dade de anticorpos monoclonais anti-D ou de antissoro policlonal Anti-D ou de antiglobulina ou de antissoro antiglobulina-humana, ou de preparações dos mesmos, caracterizado pelo fato de que compreende utilizar células, preferivelmente glóbulos vermelhos, compreendendo um ácido nucléico co- dificando um antígeno Rhesus D contribuindo ou indicativo de um fenótipo D fraco como definido na reivindicação 1 ou 2.

29. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonu-cleotídeo consistindo em um segmento de 12 a 50 nucleotídeos consecutivos da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 2, em que o referido segmento compreende pelo menos uma das posições 8, 29, 48, 340, 446, 544, 594, 602, 658, 667, 809, 819, 826, 830, 845, 880, 885, 919, 1016, 1154 e 1177; e em que o referido oligonucleotíudeo está contido em uma embalagem.