CA1052306A

CA1052306A - Procede d'obtention de proteines virales et proteines ainsi obtenues

Info

Publication number: CA1052306A
Application number: CA221,238A
Authority: CA
Inventors: Robert Fontanges
Original assignee: Science Union et Cie
Current assignee: Science Union et Cie
Priority date: 1974-03-05
Filing date: 1975-03-04
Publication date: 1979-04-10
Also published as: FR2262962A1; DK141172B; BE826275A; CH595106A5; DK85775A; AU7878175A; US4136168A; ES435323A1; GB1469901A; JPS50160487A; NL7502623A; DK141172C; DE2508396A1; ZA751357B; FR2262962B1

Abstract

L'invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention de l'hémagglutinine et de la neuraminidase du virus de la grippe qui consiste à soumettre un culture de virus grippal à l'action d'un enzyme ou d'un mélange d'enzymes isolé de cultures de Streptomyces fradiae. L'invention concerne également ces deux fractions glycoprotéiques obtenues selon le procédé de la présente demande. Ces deux fractions glycoprotéiques trouvent un emploi en thérapeutique, notamment pour l'immunisation contre la grippe.

Description

~ ~5 ~3 ~

L'invention a pour objet un nouYeau proced~ d'obten-tion de proteines virales9 notamment a partir des virus de la grippe.
On sait que l'enveloppe des Myxovirus Influenzae contient au moins deux glycoprot~ines specifiques qui peuvent être isolees soit par action de detergents, soit par action de proteases, soit par l'action combin~e de ces deux types de reactifs.
Toutefois, une publication recente de Skehel ~ ature-10 New Biology 238 (1972) 14 ~ a montr~ que les traitements par une prot~ase, tout en assurant une separation de ces deux constituants a partir de l'enveloppe virale, entrainent une degradation complete de la Neuram~nidase virale. L'autre , glycoproteine ou Hemagglutinine, obtenue dans ces conditions est partiellement denaturee quoiqu'elle se trouve sous forme cristallisee, et perd de ce fait, ses proprletes hemaggluti-nantes.
Or, il s'av~re être tres interessant de pouvoir isoler et disposer de ces deux fractions glycoprot~iques puri-fi~es, car elles constituent un mat~riau antigenique precieux,qui permet d'envisager une vaccination contre la grippe soit en administrant l'hemagglutinine ou la neuraminidase virale seules, soit en recombinant ces deux fractions glycoproteiques pour obtenir un agent de vaccination presentant des caract~-ristiques antigeniques plus larges.
Il s'avere egalement interessant d'obtenir une neura-minidase produite par les virus de la grippe sous forme suffi-samlnent pure et active car la neuraminidase est la fraction genetique la plus stable du virus grippal. En outrle, les anticorps anti-neuraminidase virale formes dans ces condltions, sans avoir la possibilit~ d'inactiver le virus de la grippe, ., j~ .

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~ ~ ~2 3 ont neanmoins la propriet~ de r~duire l'importance ou la gravite de la maladie grippale ou de reduire la proliferation du virus (Kilbourne, J. of Virology 2 (1968) 281 et 778).
La pr~sente invention a donc pour objet un nouveau proced~ d'obtention de ces deux fractions glycoproteiques d'origine virale, qui perme~ de les obtenir ~ l'etat pur et assure leur sêparation sans denaturation.
Le procede selon l'invention consiste en ce que l'on soumet le virus grippal prealablement purifie, provenant d'oeufs embryonnes infectés ou de cellules supports infectees, a l'action d'un enzyme ou d'un melange d'enzymes protéolytiques obtenus ~ partir de cultures de Streptomyces fradiae, concentre les fractions renfermant la neuraminidase et l'hemagglutinine par diafiltration en solution aqueuse sur une membrane à perme-abilité selective a structure reticulee, recueille la fraction retenue par la membrane de la cellule de diafiltration puis soumet cette derniere ~ un fractionnement par des moyens physiques pour recueillir successivement une fraction contenant essentiellement l'hemagglutinine virale, puis une fraction contenant essentiellement la neuraminidase virale.
Le proc~de selon l'invention peut encore ~tre défini par les modes d'execution suivants:
; 1) l'enzyme ou le melange d'enzymes protéolytiques est constitue principalement par une protease isol~e des cultures de Streptomyces fradiae t~trant au moins 5000 U.
Anson/mg.

2) l'enzyme ou le melange d'enzymes protéolytiques est constitu~ principalement par une protease isolee des .~ cultures de Streptomyces fradiae~ souches No. 1998 et No. 2019 de la collection du Museum National d'Histoire Naturelle de Paris.
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3) l'action de l'enzyme ou du melange d'enzymes sur la culture virale a lieu ~ une temp~rature variant de 25 a 45C.

4) l'action de l'enzyme ou du melange d'enzymes sur la culture virale est effectuee à un pH variant de 5 ~ 8.

5) l'action de l'enzyme ou du melange d'enzymes est effectuee pendant une duree variant de 1 ~ 7 heures.

6) la concentration en enzyme ou melange d'enzymes varie entre 1 et 30%.

7) la s~paration des fractions proteiques apres diafiltration est effectuee par centrifugation dans un gradient de denslte discontinu.

8) le gradient de densite discontinu est obtenu a partir de solutions de glutamate de sodium dont les concentra-tions varient de 1 a 40%.
; 9) en variante du procede selon l'invention, la ~; prolongation de l'action enzymatique sur les cultures virales entraine une degradation de l'hemagglutinine et permet d'obte-nir une seule fraction glycoproteique renfermant la neuramini-20 dase virale. -10) la souche de virus grippal utilise pour l'ense-mencement est de preference la souche Hong-Kong Virus A2/68 (H3N2), la souche NWS du virus Ao~ le mutant de la souche RI/5+ du virus A~, la souche A3-XL du virus A2.
Le procede est egalement applicable a d'autres souches du virus de la grippe comme par exemple, le virus humain A2/Singapour/1/57i le virus A2/Angleterrel52/64; le virus A2/Angleterre/76/66 ou le virus recombin~ X-7 (F-l).
L'invention s'~tend aussi a la neuraminidase d'ori-gine virale obtenue selon le proced~ d~fini ci-dessus. Elle s'etend plus particul~erement à la neuraminidase du virus :.

~ ~ S'~ 3 ~ ~
A2/Hong-Kongl68 (H3N2) obtenue selon le proced~ defini ci-dessus.
L'invention s'etend encore ~ l'hemagglutinine d'origine virale obtenue par le proc~de defini ci-dessus et plus particulierement l'hemagglutinine du virus A2/Hong-Kong/6 (H3N2) obtenue selon le proced~ defini ci-dessus.
L'invention concerne ~galement l'application comme m~dicament de la neuraminidase d'origine virale obtenue par le procede de l'invention, utile notamment comme agent curatif ou prêventif de la grippe.
A cette fin, la neuraminidase obtenue selon le procede de l'invention a partir de cultures de virus de la grippe est presentee sous forme de compositions pharmaceutiques comme par exemple, les preparations solides, liquides ou gazeuses pour aerosols.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Ils ne la limitent en aucune façon.

On inocule 200 oeufs de poule embryonnes de 11 jours avec 0.2 ml/oeuf de suspension de virus de la grippe A2/Hong-Kong/68 (H3N2) dans du llquide physiologique tamponn~, a la concentration de 1/1000.
Apras 48 heures d'incubation, on recueille environ 900 ml de liquide allantoïque infect~ titrant environ 2050 U.lhemagglutinantes et 130 U./neuraminidasiques/ml. On procede a une premiere separation par cen~rifugation a 5000 9 ' pendant 1/2 h pour ~llminer les debris cellulaires et les mucoproteines. Le surnageant est ensuite centrifug~ a 105,0CO
g pendant 2 heures tout en maintenant la temperature au voisi-~ 30 nage de 4C. Les culots de centrifugation sont r~unis et mis $ en suspension dans du serum physiologique. La susplension , .
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~ LO5'~3~6~
ainsi obtenue est soumise pendant 3 mn ~ l'action des ultra-sons (12K cycles). On recueille une suspension titrant 12,000 U. hemagglutinantes/ml et 190 U/neuraminidasiques/ml.
On pr~leve alors 20 ml de cette suspension virale et on y ajoute la protease de Streptomyces fradiae ~ raison de 1 mg/ml. On laisse en contact ~ 37 pendant 2 heures. Le melange est ensuite concentre par diafiltration sur une cellule de diafiltration Diaflo retenant des mol~cules de poids moleculaire superieur ~ 10,000 vis-à-vis de l'eau dis-tillee.
On recueille ainsi dans la cellule 9 ml constltue par une solution concentree titrant 2~0 U./neuraminidase/ml.
On preleve en trois fois 7.5 ml de cette solution que l'on dispose sur trois gradients discontinus de 28 ml de solutions de glutamate de sodium dont les concentrations varient de 5 a 40%. On centrifuge pendant 30 heures a 24,000 t/mn en maintenant la temperature ~ 10C. A la sortie de la centrifugeuse, on recueille des fractions de 1.2 ml que l'on traite a 1~ ide d'un analyseur de ~ractions fabrique par la firme ISCO modele 640.
On recueille ainsi 3 gradients successifs a raison d'un gradient pour chaque lot donc trois fois 3 ml de la solution contenant exclusivement la neuraminidase. Ces 9 ml renferment approximativement 750 U./neuraminidasiques et correspondent ~ 20 ml de suspension virale traitee par l'enzyme proteolytique. La recolte des autres pics permet d'obtenir l'hemagglutinine.
L'activite neuraminidasique exprimee en Unites est ; determin~e en mesurant la quantite d'acide neuraminique liber~
selon la methode de Warren modifie par C. Bottex, G. Chatot et R. Fontanges en util~sant le serum de poulain comme substrat.
.. :

; - 5 -~ 5~36g~i Le taux en hemagglutinine est apprecie par les methodes d'hemagglutination en utilisant les erythrocytes de poulet et humains 0-Rh +.
La protease de Streptomyces fradiae u~ilisee, r~pond aux normes analytiques suivantes:
Activite prot~olytique totale 7000 U Anson/mg Activite proteolytique non : inhibee par l'iniprol 5610 U Ansontmg 10Activit~ proteolytique non inhibee par l'inhibiteur de trypsine extrait du soja 5570 U Anson/mg ,~
: Teneur en proteines ~methode de Lowry) 45.7% sur sec Enzymo electrophorese : presence pr~ponderante du composant Z.
. Elle est obtenue apres culture de Streptomyces fradiae et amenee à sec des bouillons de culture, par adsorp-tion sur une resine echangeuse d'ions et elution fractionn~e.

. Influence de la concentration en enzyme sur la cinetique de la libération de l'hemagglutinine et de la neuraminidase d'origine virale. ~ .;

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CINETIQUE ENZYMATIQUE

Temps pour ob- Temps pour ob- Concen-tenir la teneur tenir la teneur tration optimale en optimale en optimale hemagglutinine neuraminidase en enzyme _ Bromelaine 1 mg/ml (+ 4C) 3 h 30 mn 1%
Bromelaine 1 mg/ml (37C) 30 mn 30 mn 1%
Trypsine 1 mg/ml (~ 37C) 30 mn 30 mn 1%
a chymotrypsine .
1 mg/ml (+ 37C) 30 mn 60 mn 5%
Enzymes obtenus S. Fradiae 60 mn 60 mn 10%
1 mg/ml (~ 37C) L'enzyme obtenu a partir des cultures de Strepto-myces fradiae est celui qui permet d'obtenir dans un delal tres court la lib~ration maximale des deux prot~ines virales .:
avec une concentration la plus faible en enzyme.

Influence du temps de contact de l'enzyme proteo-lytique sur la possibilite de s~paration de la neuraminidase virale et de l'hemagglutinine virale apres centrifugation en gradient de dens1te dlscontinu.

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- 7 ~

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~5'~3~6 GRADIENTS DE TARTRATE DE K A DES CONCENTRATIONS
. ALLANT DE 1 A 40%
Centrifugation : 20 h a 1 oc Depôt 2.5 ml de suspension virale trait~e Temps de contact 1 H 3 H 5 H 20 H
virus - protease ' Bromelaine Neuramini- Neuramini-1 mg/ml (+ 4C) dase seule clase seule .
Bromelaine ~ .
1 mg/ml (~ 37C) :
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Trypsine 1 mg/ml Neuramini-. 10% (+ 37C) dase seule _ ,. .
:. Enzymes obtenus ;: a partir des cultures de .
S. FRADIAE :~.
1 mg/ml 5% a 37 ~+ (30 h de centri~u- :~
. 2~ gation) separation tres bonne de la Neuraminidase et de l'Hemagglutinine ' ~+ separation moyenne separation partielle , .. .

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~5~

Activit@ des enzymes prot~olytiques pour liberer NA et HA du virus A2 Hong-Kong (NA - neuraminidase et HA - Hemagglutinine) Les resultats expriment les quantites de HA et NA
lib~rees par rapport aux titres du virus ini~ial et pour un temps de contact virus - protease optimum.

_ HA liberee ~ de NA lib~ree Bromelaine x 12 1%

Br3m7aine x 2 1%

Trypsine x 8 5%

a chymotrypsine x 3 2X ~;

enzymes de S. Fradiae x 5 5X
bruts 37 enzymes de S. Fradiae x 10 8%
purifies 37 ( Ainsi qu'il ressort de ce tableau, les enzymes obtenus ~ partir des cultures de Streptomyces Fradiae per-mettent d'obtenir le rendement le plus elev~ en neuraminidase et en hemagglutinine virales.

;~ Le mode operatoire est celui de l'exemple 1 l@g~re-ment modifie. On inocule dans des conditions semblables 200 oeufs de poule avec une suspension de virus de la grippe A2/Hong-Kong/68 (H3N2). Apres deux jours d'incubation, on ' ~

~ 0~ ~3 ~ ~

recueille 1500 ml de liquide allanto~que infecte titrant 400 U
hemagglutinantes/ml et 350 U neuraminidasiques/ml (corres-pondant a la libération de 0.107 9 d'acide sialique/ml). On procède a une double centrifugation et les culots de centri-fugation sont remis en suspension dans un tampon phosphat~.
On obtient ainsi 500 ml de suspension de virus purifiée titrant 12,000 unit~s hémagglutinantes/ml et 520 unités neura-minidasiques/ml (correspondant ~ la liberation de 0.157 9 d'acide sialique/ml?. On préleve des fractions aliquotes de cette suspension et on les soumet ~ l'action de la prot~ase de Streptomyces Fradiae ~ 37 pendant deux heures. Ces fractions sont reunies et concentrées par diafiltration à 60 ml. Ces 60 ml sont repartis en 6 fractions de 10 ml deposëes sur 6 gradients successifs de glutamate de sodium ~ des concen-trations allant de 5 à 40% additionnees de 1% de dodecyl succinate de sodium. On a recueilli apres diafiltration 60 ml de suspension de virus traitee, concentree et purifiee titrant 48000 U hemagglutinantes/ml et 710 U neuraminidasiques/ml (correspondant ~ la liberation de 0.212 mg d'acide sialique/
ml).
Apres centrifugation a 60.000 9 pendant 30 heures a 15C, on recueille en 6 fois 144 ml de suspension titrant 1600 U hemagglutinantes/ml soit au total 228,000 U et 48 ml de suspension titrant 310 U neuraminidasiques/ml soit au total 13800 U neuraminidasiques. Les suspensions sont ensuite frac-tionnees sur une colonne de sephadex G 15 destinee a retenir les impuretes telles que glutamate de sodium et dodecyl succinate de sodium. Les fractions obtenues apr~s ~lection poss~dent des activites sensiblement iden~iques a celles mentionnees ci-dessus.

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~ 3 ~
Finalement ~ partir de 1500 ml de liquide allanto~que infecté il est ainsi possible d'obtenir un rendement elev~ en une fraction hémagglutinine purifiee et une fraction neuramini-dasique purifiee. La pr~sence de dodecyl sulfate de sodium a une concentration de 1% dans le gradient de glutamate de sodium permet de separer tres nettement les sous unites hemagglutinine et neuraminidase. La fraction h~magglutinine est recueillie dans les premieres fractions d'election de la colonne de sephadex G 15; la neuraminidase est obtenue dans les fractions suivantes assurant ainsi une separation tres nette.
L'électrophorese sur gel de polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie a 0.25% montre pour la neura-minidase une bande unique correspondant ~ un seul type de polypeptide et pour l'h~magglutinine l'existence de deux chafnes polypeptidiques.
Le spectre infra-rouge de la neuraminidase (KBr) est caract~rise par une forte bande d'absorption a 3333 cm 1 (-NH2 et NH- monosubstitu~) indiquant la presence de cha~nes polypeptidiques, une faible bande a 2849 cm 1 qui correspondant aux vibrations de valence des -CH2- et une bande large dont le maximum se situe a 1613 cm 1 qui reunit vraisemblablement les absorptions des carbonyles, des amides primaires et des amides secondaires, une absorption plus faible a 1379 cm 1 (-CH3) et une bande large avec maximum d'absorption a 1050 cm 1 que l'on peut attribuer aux vibrations de valence des C-OH des poly-saccharides. Le spectre infra-rouge de l'hemagglutinine differe assez peu de celui de la neuraminidase. Cependant le pic a 2849 cm 1 est beaucoup plus important que dans le spectre de la neuraminidase. En outre, l'existence d'un ~paulement ~ 2778 cm 1 traduit la presence de vibrations de valence des O-H lies.
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Claims

Les réalisations de l'invention au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Un nouveau procédé d'obtention de protéines virales à partir des virus de la grippe, caractérisé en ce que l'on soumet des cultures de virus de la grippe à l'action d'un enzyme ou d'un mélange d'enzymes protéolytiques obtenus à
partir des cultures de Streptomyces fradiae, concentre les fractions renfermant la neuraminidase et l'hémagglutinine par diafiltration en solution aqueuse sur une membrane à permé-abilité sélective de structure réticulée, recueille la fraction retenue par la membrane de la cellule de diafiltra-tion, puis soumet celle-ci à un fractionnement par des moyens physiques pour recueillir successivement une fraction contenant essentiellement l'hémagglutinine virale puis une fraction contenant essentiellement la neuraminidase virale.

2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé
en outre par les modes d'exécution suivants:
a) l'enzyme ou le mélange d'enzymes protéolytiques est constitué principalement par une protéase produite par les cultures de Streptomyces fradiae, titrant au moins 5,000 U
Anson/mg.
b) les cultures de S. fradiae sont celles obtenues à partir des souches déposées au Muséum National d'Histoire Naturelle de Paris sous les Nos. 1998 et 2019.
c) l'action de l'enzyme ou des enzymes sur la culture virale a lieu à une température variant de 25 à 45°C.
d) l'action de l'enzyme ou des enzymes sur la culture virale est effectuée à un pH variant de 5 à 8.

e) l'action de l'enzyme ou des enzymes sur la culture virale est effectuée pendant une durée variant de 1 à 7 heures.
f) la concentration en enzyme ou enzymes de Streptomyces fradiae varie de 1 à 30%.
g) la séparation des fractions protéiques après diafiltration, est effectuée par centrifugation dans un gradient de densité discontinu.
h) le gradient de densité discontinu est obtenu au moyen de solutions de glutamate de sodium dont les concentra-tions varient de 1 à 40%.
i) le gradient de sensité discontinu contient en outre un agent tensio actif.
j) l'agent tensio actif est le dodecyl sulfate de sodium à une concentration comprise entre 0.5 et 2%.
k) la souche de virus grippal est la souche Hong-Kong Virus A2/68 (H3N2)

3. La neuraminidase d'origine virale, chaque fois qu'elle est obtenue par le procédé de l'une des revendications 1 ou 2.

4. La neuraminidase du virus A2/Hong-Kong/68 (H3N2) obtenue par le procédé de l'une des revendications 1 ou 2.

5. L'hémagglutinine d'origine virale obtenue par le procédé de l'une des revendications 1 ou 2.

6. L'hémagglutinine du virus A2/Hong-Kong/68 (H3N2) obtenue par le procédé de l'une des revendications 1 ou 2.