CA1088010A - Compositions enzymatiques pour l'isomerisation du glucose en levulose - Google Patents

Abstract

Compositions enzymatiques pour l'isomérisation du glucose en lévulose, comprenant des plaquettes ou des filaments d'ester de cellulose dans lesquels sont incluses des cellules d'un microorganisme contenant de la glucose-isomérase capable d'isomériser le glucose en lévulose. Les compositions enzymatiques selon l'invention sont caractérisées en ce que les plaquettes ou filaments renferment à titre de charge, au moins un composé du magnésium peu soluble dans l'eau. Ces compositions permettent d'isomériser en continu du glucose en lévulose avec une addition faible ou nulle d'ions magnésium dans le sirop de glucose à isomériser et aucune addition d'ions de cobalt.

Description

La présente invention a trait à des compositions à base de glucose-isomérase e~ ~ leur utilisation pour l'isomérisation du glucose en lévulose.
L'emploi de la glucose-i~omérase pour l'isomérisation du glucose en lévulose est bien connu. En général, pour obtenir de bons résultats indu~triels, et notamrnent pour pouvoir travail-ler en continu, on utilise de la glucose-isomérase immobilisée.
Cette enzyme est produite par divers microorganismes. On peut soit l'extraire du bouillon de culture et éventuellement la , .
purifier, soit utiliser directement les cellules la contenant, séparées du bouillon, ce qui est moins onéreux. ;~
On a déj~ proposé de nombreuses méthodes d'immobilisation des enzymes en général et de la glucose-isomérase en particulier.
Cette immobilisation peut se faire par absorption sur des supports minéraux tels que charbon actif ou divers carbonates ou~oxydes alcalino-terreux. Ainsi, selon le brevet français 2 201 341, on absorbe la glucose-isomérase sur du carbonate de magnésium basique. Toutefois, ce procédé ne peut s~appliquer qu~à de la glucose-isomérase extra-cellulaire.
On a aussi proposé d~enrober les enzymes ou les cellules en contenant dans des substances polymères semi-perméables telles que les polyamides ou les dérivés de la cellulose, les compositions obtenues pouvant ensuite être fa~connées en films, en fibres ou en particules (brevet francais 1 306 6~0, 2 016 102, 2 169 105).
On a également proposé d'englober les cellules contenant l'enzyme dans des ~loculats de polyélectrolytes (brevet franc~ais

2 1~5 ~86) et d'accroftre la résistance mécanique des compositions ainsi obtenues par addition de composés minéraux du magnésium, calcium, fer et manganèse ~brevet francais 2 295 966).
Si ces divers procédés permettent d'obtenir des compositions d'une activité enzymatique de départ satisfaisante ou d'une bonne résistance à l'abrasion, ils ne contribuent ,:

--1-- .

~.~ ' :, .:. .. :, .. .. :. - ~ ,. ;

. nullement à améliorer la durée de vie des préparations en `. questions du point de vue de l'activité enzymatique. Cette durée de vie n'excède généralement pas une quinzaine de jours.
D'autre part, on sait que les glucose-isomérases ~
habituellement utilisées exigent, pour donner de bons résultats, . .
la présence d~ions magnésium et éventuellement d~une faible . quantité d'ions cobalt dans le sirop de glucose à isomériser.
.
Cela nécessite ~ue le sirop de lévulose obtenu subisse.un traite~
ment de désionisa~ion par des.échangeurs d'ions, ce qui augmente ..
~ 10 le prix de revient du lévulose. ~ .
~- On a maintement trouvé qu'on pouvait obtenir des compositions de glucose-isomérase intracellulaire ayant une durée . de vie accrue et ne nécessitant qu'une addition faible ou nulle :
d'ions magnésium dans le sirop de glucose à isomériser et aucune addition d~ions cobalt, en lncluant les cellules de microorganis-mes contenant de la glucose-isomérase dans des plaquettes ou des filaments d'esters de cellulose renfermant, comme charge, au moins. un composé du magnésium peu soluble dans l'eau et éventuellement un composé du cobalt peu soluble dans l'eau.
Par aomposé du magnésium peu soluble dans l'eau, on entend tout composé du magnésium dont la solubilité est telle qu'il libère de lmg ~ au plus 50mg d'ions magnésium par litre d'eau.
Par composé du cobalt peu soluble dans l'eau, on entend tout composé du cobalt dont la soluhilité est telle qu'il libère de lmg à au plus 2Omg d'ions cobalt par litre d'eau.
. Les microorganismes dont les cellules sont utilisées dans l~s compositions selon l'invention sont ceux qui produisent une glucose-isomérase dont l'action enzymatique se manifeste ....
en présence d'ions magnésium et d'ions cobalt. On peut citer, .. sans se limiter ~ cette liste, Aerobacter cloacae, les .. --2--.

- ~ , .

o rthrobacter, Bacillus coagulans, Lactobacillus brevis, Streptomyces sp, (echinatus, flavovirens, achromogenes, albus, ;~;
olivaceus, olivochromogenes, violaceoniger, bikiniensis, venezuelae, etc...~, Actinoplanes missouriensis, etc... Le microorganisme préféré pour Ia mise en oeuvre de la présente invention est Streptomyces phaeochromogenes.
Les esters de cellulose utilisés pour constituer les plaquettes ou filaments sont de préférence le diacétate ou un mélange technique de diacétate et de triacétate tel qu'on l'emploie pour la fabrication du collodion.
La charge magnésienne est de préférence choisie parmi l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de magnésium, le phosphate de - magnésium, le carbonate basique de magnésium ou leurs mélanges, par exemple des mélanges techniques tels que l'hydroxy-carbonate de magnésium. Le phosphate tribasique de magnésium est la charge préférée.
La charge à base de cobalt est choisie, de préférence, parmi les composés du cobalt II tels que l'hydroxyde de cobalt II, le carbonate, l'orthophosphate ou l'oxalate de cobalt II.
':
Ces charges ont pour rôle, outre le lestage de la préparation, d'absorber l'enzyme et de fournir des ions magnésium et cobalt ~ui lui sont nécessaires.
; On peut au99i utiliser pour ces charges comme composé
: . : . '.
insoluble du magn~sium (et du cobalt), des résines ~changeuses de cations portant des groupes sulfoniques qui ont été saturés d'ions Mg ou Mg et Co , séchées à l'air ~ une température d'environ 50C puis broyées pour obtenir des particules de moins , de 0,25 mm de diamètre. Ces résines sulfoniques sont lar~ement .,. - .;: décrites dans la littérature (Ion exchange Technology F.C.

~AC~IOD. Jack SCHUBERT Academic Press in New-York 1956).

Les compositions enz~matiques de la présente invention , . , ' "' '' ,' ' .
.

- ~ ~0~o~

renferment donc des cellules d'un microorganisme contenant de la glucose-isomérase, un ester cellulosique et une char~e, : en quantités ci-après définies.
La quantité d~ester cellulosique mise en oeuvre dans .
lesdites compositions, exprimée.. par le pourcentage en poids de .
produit sec par rapport aux cellules sèches de m1croorganismes ~- :
peut varier de 25 à 100 % et de préférence environ 50 %.
La charge également comptée en matière sèche peut ~ représenter de 5 à 100 % du poids des cellules sèches et de `10 préférence environ 50 %. La proportion relative du composé de magnésium.et du cobalt formant la charge peut varier respectivement de 50 à 100 % et de O à 50 % du poids de la charge totale. . -.
.
Les proportions maximales de chargas et d'ester de cellulose peuvent etre augmentées au-delà des limites indiquées ci-dessus, mais évidemment a~ dépens de l'activité enzymatique : de l'ensemble obtenu. D'autre part, si on utilise trop peu d'ester, on aboutit ~ un produit ayant une mauvaise cohésion.
Ci-après, on définit les proportions de cellules de microorganismes, d'ester cellulosique et de charge entrant en jeu dans les compositions enzymatiques préférentielles de l'inven-tion. Les proportions pondérales sont rapportées à la ma~.ière sèche entre les différents éléments des compositions enzymatiques:
- de 40 à 60 % en poids de cellules de microorganismes - de 20 à 30 % en poids d'ester de cellulose .
- de 20 à 30 % en poids de charge représentant de lS à 20 %
en poids d!un composé du magnésium et de 5 à 10 % en poids d'un composé du cobalt.
Les compositions enzymatiques selon l'invention peuvent etre obtenues avantageusement de la façon décrite ci-dessous.
On s~pare par centrifugation les cellules du substrat ~IB~

aux dépens duquel elles se sont développées, après leur avoir fait subir un traitement thermique qui a pour résultats, entre autres, de stériliser la masse cellulaire et de détruire cer-taines enzymes indésirables ~teIles que les protéases) moins résistantes à la chaleur que la glucose-isomérase. On sèche ensuite la bouillie obtenue jusqu~à ce qu~elle ait une teneur en matiere sèche de 20 à 95 % (de préférence environ 30 %)~
- On mélange intimement la bouillie résultante avec la charge de composé du magnésium, et éventuellement de composé du ; 10 cobalt, la proportion de cette charge totale étant de 5 ~ 100 %
du poids total des cellules ~e préférence 50 %.
;~ On ajoute au mélange ainsi obtenu l'ester de cellulose ~par exemple le mélanye technique de di- et de triacétate men-tionné ci-dessus ), à raison de 25 à 100 % (de préférence environ 5G %) du poids de cellules sèches, et sous forme d'un sol à 5 à
, 20 % (de préférence environ 10 %) dans un solvant miscible ~
l'eau, de préférence l'acétone. ~`
, . . .
A la bouillie obtenue contenant l'ester de cellulose, .
~ on ajoute un mélange d'eau et de solvant semblable à celui utilisé pour former le sol d'ester d~e cellulose, afin de donner au mélange final la consistance convenant à la mise en forme que l'on envisage d'emplo~er. La quantlte de solvant à ajouter peut ; être de 1 à 10 fois le poids des cellules sèches mises en oeuvre.
La quantité d'eau pr~alablement mélangée au solvant est telle qu'en tenant compte de l'humidité des cellules, l'eau contenue dans le mélange final représente 0,6 à 8 fois (de préférence environ 3 -fois) le poids d'ester de cellulose mis en oeuvre ; il convient aussi que le rapport pondéral final eau/
solvant soit inférieur à 0,2.
Ces limites des proportions relatives d'eau, de solvant ~ et d'ester de cellulose conditionnent les propriétés du produit ' .: -final : ainsi, avec trop peu d'eau la porosité de la structure obtenue est faible et les capacités d'échanges seront donc mauvaises; avec trop d'eau, ou pas assez de solvant, le produit final manque de cohésion ou retient ma~ l'enzyme.
L ' ordre de mise en oeuvre des éléments n'est pas nécessairement celui qu'on vient d'indiquer ci-dlssus peut être modifié pour la commodité de la fabrication.
Dans le cas, fréquent, o~ le mode de préparation des cellules contenant l'enzyme engendre des parois de cellules laissant fortement diffuser l'enzyme (selon les conditions de la culture des microorganismes, de leur traitement thermique ou de - leur séparation), il est préférable de faire subir aux cellules un traitement léger par du glutaraldéhyde. Ce traitement peut se faire soit à la fin de la culture, soit sur la bouillie cellulaire, de préférence avec l'ester de cellulose mais avant l'introduction de la charge (celle-ci devant alors être introduite en dernier lieu), soit encore, comme on le verra plus loin, aprbs mise en forme du mélange. Dans le cas où l'on effectue le traitement au glutaraldéhyde sur les cellules ou sur la bouillie de cellules et d'ester, on utilise 0,5 à 6 % ~de préférence environ 3 %) de glutaraldéhyde par rapport au poids de cellules sèches. Le mélange avec le glutaraldéhyde est de préférence intime et on le laisse réagir pendant 10 minutes à 1 heure, entre 10 et 30C.
- Finalement, la pate ~luide obtenue, qu'on peut avoir homogénéisée, par exemple à l'aide d'un agitateur à hélice ou à
turbine, contient les cellules, la charge, l'ester de cellulose, l'eau, le solvant et éventuellement du glutaraldéhyde.
On peut alors étendre cette pâte en couche mince (1

3 mm d'épaisseur) et la laisser sécher ~ l'air à un~température -de 15 à 30C. Après environ une heure, lorsqu'elle n'est pasencore cassante, on peut la découper en petits éléments de quelques millimètres de côté. Après décollage de la pate, on continue le séchage, mais en évitant d'atteindre la phase cassante.
Si on le désire, c'est à ce stade de la préparation qu'on peut effec-tuer le tr~itement au glutaraldéhyde, par trem-page dans une solution aqueuse de ce corps.
On peut alors utiliser le produit obtenu pour isomériser des solutions de glucose.
La fabrication de plaquettes d'ester de cellulose chargé de composé du magnésium et du cobalt et contenant de la glucose-isomérase sous forme intracellulaire, telle qu'elle est décrite ci-dessus, représente une for~e préférée de l'lnvention.
Mais il est possible de mettre en forme la pâte obtenue comme ci dessus par tout autre moyen connu, en particulier par extrusion si on désire obtenir des filaments au lieu de plaquettes. Avant ; le séchage éventuel dans la masse des filaments, on coagule leur surface immédiatement après l'extrusion, soit par un courant d'air chaud, soit par immersion dans l'eau durant quelques minutes.
., .
Les plaquettes et les filaments peuvent être conserv~s soit à
l'état sec, soit en suspensio~ dans un liquide de préférence l'eau additionnée diun antiseptique convenable (formol par exe~ple).
Les plaquettes et l~s filaments selon l'invention pr~sentent de nombreux avantages, notamment pour l'utilisation en ~ontinu dans une colo~ne.

.: , :
Leur tenue mécanique est très bonne même au bout d'un très long temps d'utilisation. La perte de charge lors du passage de la solution à isomériser dans la colonne est très faible et stable dans le temps. -La longévité de ces préparations est très bonne, la demi-activité, ou temps au bout duquel la préparation a une activité réduite de moitié, dépasse facilement 1000 heures. De plus, la baisse d'activité se fait très progressivement et - :
réguli~rement. - :
La vitesse moyenne de production de lévulose par unité de poids est bonne. ::~
: Il n'est pas nécessaire d~ajouter des ions magnésium ~ et des ions cobalt, sous forme de sels solubles, dans les ; solutions à isomériser, le magnésium et le cobalt de la charge suffisant à activer l'enzyme. Toutefois, il est possible dans certains cas, d'ajouter aux solutions à isomériser jusqu'à
.:~. 10 mg d'ions magnésium par litre de solution. Quoiqu'il en soit, la quantité d'ions magnésium dans le sirop de lévulose obtenu ne . dépasse pas 10 mg/l ce qui est tout-à-fait acceptable du polnt de vue alimentaire. Quant à la.teneur en cobalt, elle ne dépasse pas 1 mg/litre. Ces teneurs très faibles en ions magnésium et cobalt ne nécessitent donc pas de longues et coûteuses opérations de purification, le sirop isomérisé étant, par ailleurs, exempt . k d'impuretés. ~.
. La mise en oeuvre des préparations selon l'invention pour isomériser le glucose peut se faire de la manière décrlte ci-après :

On place les éléments de préparations enzymatiques, plaquettes ou filaments très courts, dans un cylindre vertical, : par exemple en verre, entouxé d'une enveloppe parcourue par un courant d'eau permettant de maintenir une température de 50 à 75C
. (de préférence environ 60C). On alimente ce cylindre, de préfé-rence par le haut, avec un~ solution aqueuse de glucose ayant une concentration ne dépassant pas 60 % en poids (de préférence environ ~5 %), la préparation en~ymatique étant noyée dans le liquide. On ajuste préalablement le pH de.cette solution alimentaire à 8-9 ~de préférence environ 8,5), par exemple avec .
.; 30 de la soude. Il est avantageux de régler le débit alimentaire de ; façon à maintenir un taux de transformation du glucose constant .~ . . .

~ -8-: :.

tout au long de l'opération. Pour une bonne rentabilité de l'opération, ce taux est généralement de l'ordre de ~0 à 50 %
(de préférence environ 42 %). On est donc amené à r~duire progressivement le débit d'alimentation à mesure que l'activité
de la préparation diminue. Comme mentionné précédemmentl il est inutile d'ajouter à la solution de glucose alimentaire des ions cobalt et il n'est pas indispensable d'y ajouter des ions magnésium, mais une addition allant jusqu'à 10 mg par litre de solution peut être jugée souhaitable. La solution sortante contient en général entre 2 et 10 mg/litre d'ions magnésium et la teneur en ions cobalt ne dépasse jamais lmgJlitre.
Il n'est pas non plus nécessaire de réajuster le pH
en cours d'opération. Le pH de la solution sortante est de l'ordre de 7,5.
On ne constate pas d'apparition de coloration anormale dans les solutions sortantes isomérisées, sauf pendant les premières heures de marche. Pour remédier à cela, on peut, pendant ces premières heures, augmenter le débit d'alimentation ~, , .
en solution de glucose de façon à laver la colonne. En marche normale, l'au~mentation de coloration de la solution entre l'entrée et la sortie du réacteur reste inférieure à 20 AP~
(NORME ASTM D 1209-5~
Dans les exemples qui vont suivre, le l~vulose formé
est dosé par une méthode colorirnétrique à l'anthrone, avec réfé-rence à des soiutions de titre connu. / l~ALHOOL et KLEINBERG - ;
Analytical Biochemistry, 50, p 337-343 (1972)7 Les activités enzymatiques exprimées en U/g sont le nombre de micromoles de lévulose ~ormées en 1 minute à p~I 7,5 et à 60C.

. . .

On utilise une bouillie à 16 % de matière s~che . ~', . . .
' . .

provenant de la centri~ugation d'une cuve de production de Streptomyces phaeochromogenes. Liactivité des cellules est de 150 U par gramme de matière sèche. On place cette bouillie dans une étuve ventillée à 35-40C et on laisse jusqu'à obtention `
d'une pate à 30 % de matière sèche. On mélange 52 g de cette p~te à 1,1 g d'hydroxycarbonate de magnésium. On ajoute au mélange 69 cm3 d'une solution acétonique de cellulose à 100 g/litre. On ajoute 60 cm3 d'acétone et on homogénéise le tout à l'aide d'un agitateur ~ hélice (11 000 tours/mn) pendant quelques minutes. On étale la bouillie sur des plaques de verre, .; .
- en couche de 2 à 3 mm d'épaisseur, à l'aide d'un appareil de préparation de plaques de chromatographie en couche mince. On laisse sécher les plaques à llair pendant 2 heures, puis on découpe la préparation en plaquettes de 3 à 5 mm de côté. On décolle ces plaquettes et on laisse s'achever le séchage jusqu'à
une teneur de ~0 à 90 % de matière sèche. On obtient la compo-sition enzymatique suivante : (les % sont exprimés en poids de matière sèche).
~ 66 % de cellules de microorganismes

- 4,7 % d'hydroxycarbonate de magnésium - 29,3 % d'acétate de cellulose.
Ia mesure d'activité de ces plaquettes donn~ 52 U/g ce qui correspond à un rendement de fixation voisin de 50 %.
On charge 25 g de la composition enzymatique ainsi obtenue dans un cylindre vertical en verre de 25 mm de diamètre, équipé d'une double enveloppe où circule de l'eau à 60-61C.
On alimente le cylindre ainsi préparé avec une solution de glucose à ~50 g/litre, la composition enzymatique étant noyée dans la solution. Le pH de la solution de ~lucose est ajusté
à 8,5-&,7 à l'aide de la soude. On règle le débit alimentaire de fac~on à maintenir un taux de transformation constant de 42 %.

. . .

: -10--.

. ~

` On est donc amené à baisser progressivement le débit durant ; 1'opération. Au départ, ce débit est de 65.cm3/heure. Au bout de 900 heures, il a diminué de moitié et il est réduit au quart .. au bout de 2200 heures.
. Si l'on arrête l'opération à ce moment, la production , moyenne de lévulose est évaluée à 480 kg de la composition :
.. enzymatique mise en oeuvre. -:
La teneur en ions magnésium dans la solution sortante évolue, au cours de l'opération, entre 10 et 2 mg/l~ --.. 10 Le pH de la solution sortante est voisin de 7,5.
; La tenue mécanique de la composition ne s'est pas . .
modi~iée et la perte de charge est restée inférieure à l.cm .
d'eau par mètre. :: .
.: EXEMPLE 2 .. . ..
On prépare une composition enzymatique comme décrit dans l'exemple l, à cela près qu'on remplace l'hydroxycarbonate . de magnésium par 2,2 g de phosphate tribasique de magnésium . / M~3 (PO4~2, 8H2O~ , et que les cellules utilisées avaient une activité enzymatique par unité de poids de matière sèche double . 20 de celle des cellules de l'exemple 1. La composition enzymatique ,: obtenue est la suivante : (les % sont exprimés en poids de matière sèche) . :.
- 63 % de cellules de microorganismes `
. - 9 % de phosphate tribasique de magnésium - 28 % diacétate de cellulose ; On utilise la composition comme décrit dans l'exemple 1. Le débit initial est de 65 cm3/heure~ Il est diminué de moitié au bout de 1300 heures et réduit au quart au bout de 1700 ..
heures. Le taux d'ions magnésium dans la solution sortante est . 30 du même ordre que.dans l'exemple précé~ent.
.

. ,.
--11-- , : ~ \

` On prépare une composition enzymatique comme décrit dans l'exemple 1, à cela près qu'on utilise comme charge 1,1 g d'hydroxycarbonate de magnésium et 1,1 g de carbonate de cobalt II (CoCO3). On obtient la composition enzymatique suivante:
(les % sont exprimés en poids de matière sèche) - 63 % de cellules de microorganismes - 4,5 % d'hydroxyxarbonate de magnésium - 4,5 % de carbonate de cobalt II
- 28 % d'acétate de cellulose On utilise la composition comme décrit dans l'exemple -~
1. Le débit initial est de 75 cm3~1eure. Au bout de 1000 heures, il a diminué de moitié et il est réduit au quart au bout de 2250 heures.
La teneur en ions magnésium dans la solution sortante évolue, au cours de l'opération, entre 9 et 2 m~/l. La teneur en ions cobalt reste inférieure à 0,9 mg/l.
ESSAI A
On prépare à titre comparatif des plaquettes comme décrit dans l'exemple 1, ~ partir de la même bouillie mais sans adjonc-tion d'aucune charge.
On charge des plaquettes terminées dans un réacteur tubulaire. Les plaquettes se tassent mal, car elles ont tendance ; à flotter danq la solution sucrée. La solution alimentaire ne contient pas de magnésium. Pour assurer un pH de ~,5 ~ la sortie, on doit ajuster le p~I de la solution alimentaire ~ 9-9,3.
De ce fait, la solution sortante est un peu colorée. Pour obte-nir un taux de conversion de 42 %, le débit, au départ, doit être limité à 30 cm ~heure pour une solution de glucose à 450 g/litre. `

Après loQ heures de marche, le débit est inférieur ~ 15 cm3/heure.
., , :
.: :. .
~ ,.

-12~
' :

. .

.

.:. EXEMPLE 4 On prépare un~composition enzymatique comme décrit dans l'exemple 1, ~ cela près qu'on remplace l'hydro~ycarbonate de magnésium par 2,2 g de phosphate tribasique de magnésium / Mg3(P04)2, 8 H20~ et de l,lg de carbonate de cobalt II
(CoCO3~, et que les cellules utilisées avaient une activité
; enzymatique par unité de poids de matière sèche double de celle des cellules de l'exemple 1.
La composition enzymatique obtenue est la suivante :
~les % sont exprimés en poids de matière sèche) - 60,5 % de cellules de microorganismes - 8,5 % de phosphate tribasique de magnésium - 4,2 % de carbonate de cobalt II ~ ;
- 26,8 % d'acétate de cellulose On utilise la composition comme décrit dans l'exemple 1.
Le débit initial est de 65 cm3/heure. Il est diminué de moitié
; au bout de 1500 heures et réduit au quart au bout de 1900 heures.
Les taux de magnésium et d0 cobalt dans la solution sortante sont du même ordre que dans l'exemple 3.

On met ~ tremper 25 g de plaquettes de composition . . .
~; enzymatique préparées comme décrit dans l'exemple 3 dans un volume d~eau suffisant pour noyer les plaquettes et contenant ' 0,5 g de glutaraldéhyde. On laisse au contact pendant 30 minutes, à 20C.
On essore ensuite les plaquettes et on utilisa la composition ainsl traitée pour une opération d'isomerisation du glucose exécutée dans les mêmes conditions que dans l'exemple - 1. Le débit initial est de 45 cm3/heure. Il est dlminuë de ; 30 moitié au bout de 1500 heures.
-- , , - Les taux d'ions magnésium et c~balt dans la solution .. . .

,. . .

sortante sont du m~me ordre que dans l'exemple 3.

Dans la cuve de production de Streptomyces phaeochro-mogenes, en fin de production, on ajoute du glutaraldéhyde à
raison de 6g pour 100 g de matière sèche. On laisse en - contact pendant 1 heure, à pH 7,5 et ~ 25C.
On centrifuge les cellules puis on les traite comme d~crit dans 1'exemple 1. Le d~bit initial est de 77 cm /heure.
Il est diminu~ de moitié au bout de 1100 heures et rduit au quart au bout de 1600 heures.
Les taux d'ions magnésium et cobalt dans la solution sortante sont du même ordre que dans les exemples pr~cédents.
ESSAI B
On prépare une composition enzymatique de la manière décrite dans l'exemple 1 mais sans ajouter de charge et en introduisant 0,5 g de glutaraldéhyde (sous forme de solution aqueuse commerciale ~ 25 %) en meme temps qu'on mélange la solution d'acétate de cellulose à la bouillie de cellules.

.. :
On utilise 25 g de la composition obtenue pour isom~riser, dans le même cylindre que celui de l'exemple 1, une solution de glucose à 450 g/litre à laquelle on a ajouté 1,23 g/litre de / MgSO4, 7H2O~ ~ On ~prouve une certain~ di~iaulté ~ charger le tube et à assurer la bonne circulation de la 501ution car les ; plaquettes ont tendance ~ ~lotter.
Le débit initial est de 48 cm3/heure. Il est diminué ;;
de moiti~ au bout de 1500 heures et réduit au quart au bout de : . .
2300 heure~. , ' La production de lévulose est évalu~e ~ 560 kg par kg de composition. Mais le taux d'ions magn~sium dans la solution sortant est de 100 mg/l, ce qui nécessite la purification de cette solution par des ~changeurs d'ions.

.
.. . . .

.` EXEMPLE 7 ~
__ .
En opérant comme décrit dans l'exemple 1, on prépare une bouillie de cellules à 30 % de mati~re sèche, dont l'activité
est de 250 U/g. On mélange 100 g de cette bouillie avec 13 g de / ~g3(P04)2, 8 H2O~ , 125 cm3 dlune solution d'acétate de cellu-lose ~ 100 ~/litre et 60 cm d'acétone. On homogénéise la bouillie obtenue et on l'introduit dans le cylindre d~une seringue (pompe à graisse ) pourvue d'un orifice de 2 mm de diamètre. Le tortillon qu'on obtient ainsi par extrusion est re~u dans un récipient contenant 2 litres d'eau à 25 C. Les extrudés sont laissés 2 minutes dans l'eau, puis essorés et mis à s~cher à l'étuve ventilée à 35 C. Lorsqu'ils sont devenus cassants, ce qui se produit pour une teneur en mati~re sèche de 85-90 %, on les concasse grossièrement pour obtenir des batonnets de 3 ~ 8 mm de long, dont la composition est la suivante : ( les % sont exprimés en poids de matière sèche) - 54 % de cellules de microorganismes - 23,5 % de triphosphate basique de magnésium - 22,5 % d'acétate de cellulose.
Z0 Un test d'activité montre qu'ils présentent une activité de 85 U/g, ce qui correspond à un rendement de Ei~ation `;
de 70 %.
; On introduit 25 g de ces batonnets dans un tube ;
d'essai de durée, et un débit lnitial de 120 cm3~heure de solution de glucose à 450 g/l ne contenant pas de magnésium, permet d'obte-; nir un taux de conversion en lévulose de 42 %. Le débit est encore de 60 cm3~heure après 600 heures de marche.
-` On constate finalement que la production globale est de 525 kg de lévulose par kg de bâtonnets mis en oeuvre, à la vitesse moyenne de 15 kg par jour.
.. , ' ' ' , .

.

0~

. EXEMPLE 8 On prépare une composition enzymatique comme décrit dans l'exemple 7, à cela près qu'on utilise comme charge 10 g de ~ Mg3(PO4)2, 8H2O ~ et 3 g de carbonate de cobalt (CoCO3).
Les extrudés obtenus, ayant une teneur en matière sèche de 85-90 %
sont concassés pour obtenir des batonnets de 1 à 8 mm de long, qui présentent la composition suivante : (les % sont exprimés en - poids de matière sèche) - 54 % de cellules de microorganismes - 10 - 18,1 % de phosphate tribasique de magnésium

- 5,4 % de carbonate de cobalt - 22,5 % d'acétate de cellulose.
Un test d'activité montre qu'ils présentent une activité de 100 U/g ce qui correspond à un rendement de fixation de 90 %.
On charge 25 g de ces extrudés dans un tube d'essais de durée et on alimente ce tube avec 120 cm3/heure d'une solution de glucose à ~50 g/l ne contenant pas d'ions cobalt et contenant 10 mg/kg de solutions d'ions magnésium sous forme de phosphate :
le taux de transformation est de 42 %. Après 9SO heures de marche on a encore un taux de transformation de 42 % pour un ` débit de 60 cm /heure. La production globale est alors de 865 ;
kg de lévulose par kg de batonnets mis en oeuvre ~ la vitesse moyenne de 14 kg/jour, si on arrate la productian lorsque l'on a atteint 25 % du débit initial en maintenant le taux de trans~
formation ~ 42 %.
Le dosage des ions métalliques dans le sirop effluent indique une teneur en ions magnésium de 10 mg/l de solution isomérisée et en ions cobalt de 0,8 mg/l de solution isomérisée.
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On prépare la même composition enzymatique telle que .
décrite dans l'exemple 8, mais sans adjonction du composé de cobalt.
: On réalise l'isomérisation d'une solution de glucose ~ l'aide de 25 g d'e~trudés en opérant dans les conditions décrites dans l'exemple 8. Le débit initial est de 115 cm3~heure, : - Après 600 heures de marche on a un taux de . transformation de 42 % pour un débit de 58 cm3/heur~, ~
'`: 10 ' ~ On atteint 25 % du débit initial en maintenant le ;. taux de transformation à 42 % après 1 300 heures, - La production g]obale est de 620 kg de lévulose par ~.
kg de bâtonnets mis en oeuvre, à la vltesse moyenne de 9 kg/jour.

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Claims (26)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit :

1. Compositions enzymatiques pour l'isomérisation du glucose en lévulose, comprenant des plaquettes ou des filaments d'ester de cellulose dans lesquels sont incluses des cellules d'un microorganisme contenant de la glucose-isomérase capable d'isomériser le glucose en lévulose, caractérisées en ce que ces plaquettes ou filaments renferment à titre de charge au moins un composé du magnésium peu soluble dans l'eau.

2. Composition enzymatiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les plaquettes ou filaments renferment en outre un composé du cobalt peu soluble dans l'eau.

3. Compositions enzymatiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les esters de cellulose constituant les plaquettes ou filaments sont le diacétate de cellulose ou un mélange technique de diacétate et de triacétate de cellulose.

4. Compositions enzymatiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les cellules contenant de la glucose-iso-mérase capable d'isomériser le glucose en lévulose sont des cellu-les de microorganismes choisis dans le groupe que constituent Aerobacter cloacae, Arthrobacter, Bacillus coagulans, Lactobacillus brevis, Streptomyces sp. (phaeochromogenes, echinatus, flavovirens, achromogenes, albus, olivaceus, olivochromogenes, violaceoniger, bikiniensis, venezuelae) et Actinoplanes missouriensis.

5. Compositions enzymatiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que le composé du magnésium peu soluble dans l'eau est choisi dans le groupe que constituent l'oxyde de magnésium, le phosphate de magnésium, le carbonate basique de magnésium et leurs mélanges.

6. Compositions enzymatiques selon la revendication 2, caractérisées en ce que le composé du cobalt peu soluble dans l'eau est choisi dans le groupe que constituent l'hydroxyde de cobalt II, le carbonate de cobalt II, l'orthophosphate de cobalt II, et l'oxalate de cobalt II.

7. Compositions enzymatiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que la charge est une résine échangeuse de cations portant des groupes sulfoniques qui a été saturée d'ions Mg++ ou Mg++ et CO++, séchée et broyée.

8. Compositions enzymatiques selon la revendication 2, caractérisées en ce que la proportion relative du composé du magnésium et du composé du cobalt formant la charge varie respectivement de 50 à 100 % et de 0 à 50 % du poids de la charge totale.

9. Compositions enzymatiques selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles renferment des cellules de micro-organismes contenant de la glucose-isomérase, un ester cellulosique et une charge formée d'un composé du magnésium peu soluble et éventuellement d'un composé du cobalt peu soluble en quantités définies de telles sortes que le pourcentage d'ester de cellulose compté en poids de produit sec par rapport aux cellules sèches varie de 25 à 100 % et que le pourcentage de la charge compté en poids de matière sèche par rapport aux cellules sèches varie de 5 à 100 %.

10. Compositions enzymatiques selon la revendication 9, caractérisées en ce que le pourcentage d'ester de cellulose compté en poids de produit sec par rapport aux cellules sèches est d'environ 50 %.

11. Compositions enzymatiques selon la revendication 9, caractérisées en ce que le pourcentage de la charge compté
en poids de matière sèche par rapport aux cellules sèches est d'environ 50 %.

12. Procédé de préparation des compositions enzymatiques telles que définies à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare les cellules de microorganismes du substrat aux dépens duquel elles se sont développées, on sèche la bouillie obtenue jusqu'à une teneur en matière sèche de 20 à 95 %, on mélange la bouillie séchée avec 5 à 100 % par rapport au poids des cellu-les d'une charge comprenant de 50 à 100 % d'un composé du magnésium peu soluble et de 0 à 50 % d'un composé du cobalt peu soluble; on ajoute au mélange résultant l'ester cellulosique, à raison de 25 à 100 % du poids des cellules sèches, sous forme d'un sol à 5 à 20 %, dans un solvant miscible à l'eau, on ajoute une quantité de solvant égale à 1 à 10 fois le poids des cellules sèches et une quantité d'eau telle que le mélange final contienne une quantité d'eau représentant 0,6 à 8 fois le poids d'ester de cellulose, le rapport pondéral final eau/solvant étant inférieur à 0,2, on met en forme le mélange obtenu et on sèche lentement la composition mise en forme, à une température de 15 à 30 °C.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé
en ce que la bouillie obtenue est séchée jusqu'à une teneur en matière sèche d'environ 30 %.

14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la bouillie séchée est mélangée avec environ 50 % de ladite charge.

15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'ester cellulosique est ajouté à raison d'environ 50 % du poids des cellules sèches.

16. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'ester cellulosique est ajouté sous forme d'un sol à
environ 10 % dans un solvant miscible à l'eau.

17. Procédé selon les revendications 12 ou 16, carac-térisé en ce que le solvant miscible à l'eau est l'acétone.

18. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la quantité d'eau ajoutée représente environ 3 fois le poids d'ester de cellulose.

19. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on fait subir aux cellules un traitement par le glutaraldéhyde soit à la fin de leur production, soit au sein de la bouillie de cellules et d'ester de cellulose avant l'adjonction de la charge, soit dans la composition mise en forme et séchée.

20. Procédé selon les revendications 12 ou 19, caracté-risé en ce que la mise en forme de la composition se fait par étendage sur une plaque en couche de 1 à 3 mm d'épaisseur, séchage partiel, découpage en plaquettes, et complément de séchage.

21. Procédé selon les revendications 12 ou 19, caractérisé en ce que la mise en forme de la composition se fait par extrusion, coagulation de la surface des filaments extrudés au moyen d'air chaud ou par immersion dans l'eau, puis séchage.

22. Procédé d'isomération du glucose en lévulose, caractérisé en ce qu'on fait passer un sirop aqueux de glucose d'une concentration ne dépassant pas 60 % en poids à travers un lit renferment une composition telle que définie à la revendication 1, la solution de glusose à traiter ayant un pH de 8 à 9 et étant maintenue à une température de 50 à 75°C.

23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que le sirop aqueux de glucose renferme des ions magnésium à
une teneur de 2 à 19 mg/l.

24. Procédé selon les revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que le sirop aqueux de glucose a une concentra-tion d'environ 45 %.

25. Procédé selon les revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la solution de glucose à traiter a un pH
de 8,5.

26. Procédé selon les revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la solution de glucose est maintenue à une température d'environ 60°C.