CA2158140A1 - Compositions pharmaceutiques stabilisees et leurs procedes de preparation - Google Patents
Compositions pharmaceutiques stabilisees et leurs procedes de preparationInfo
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Abstract
L'invention concerne une composition pharmaceutique stabilisée comprenant une ou plusieurs macromolécule(s) choisie(s) parmi les acides nucléiques, les lipides ou les glucides, et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs véhicule(s) pharmaceutiquement acceptable(s), l'un au moins de ces véhicules contenant de l'eau lourde (D2O). Application à la préparation de vaccins.
Description
~ WO 94/21298 2 ~ 5 8 ~ 4 ~ PCT/FR94/00296 COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES STABILISEES ET LEURS
PROCEDES DE PREPARATION
La présente invention concerne des compositions pharm:~relltiques stabilisées et leurs procédés de préparation.
La présente invention concerne plus particulièrement l l stabilisation d'agents prophylactiques, ou thérapeutiques ou de ~ gnnstic con~titl-és OU
contenant des macromolécules ou des complexes macromoléculaires.
L'importance sociale et commerciale des macromolécules biologiques augmente.
La plupart des agents thél~peuLiques ou protecteurs agissent dans le milieu aqueux des espaces inter- ou intracellulaires, ou les surfaces muqueuses.
Certains agissent dans le milieu hydrophobique constituant les phases membranaires, lipidiques ou dans l'environnement des acides aminés hydrophobes.
Au cours de ces dernières années, les biotechnologies ont eu des influences considérables dans les industries du secteur de la santé. Les nouveaux procédés pour la fabrication et l'isolement de lllaL~liau~ macromoléculaires sont capables de réaliser, en qll~ntités commerciales, des produits naturels ou issusdu génie génétique, dotés de spécificités précéd~ll..llellL irréalisables. (Virus, ADN, ARN, ribozymes, agents anti-sens, etc...) Les anciens composés thérapeutiques de poids moléculaires relativement faibles (aspirine, par~cét~mol, catécholamines, pénicilline) ont été caractérisés par une certaine facilité de formulation dans les comprimés, les émulsions, suspensions ou solutions.
Certaines macromolécules - telles que les acides nucléiques, et leurs complexes avec les ~lotéines (et leurs cofacteurs), les glucides complexes, les lipides - et leurs complexes, deviennent d'un intérêt de plus en plus important en tant que vaccins, ou thc;l~uLiques ou de diagnostic.
Dans les milieux aqueux, toutes les macromolécules et les complexes macromoléculaires indiqués ci-dessus ont une tendance à la dégradation, ce qui limite leur utilité d'agent thérapeutique, vaccinant ou de diagnostic.
Pour beaucoup d'agents, la dégradation n'est pas un problème sérieux (par exemple, en suivant les indications du fabricant, on évite les problèmes associés éventuellement avec l'utilisation d'un vaccin périmé). Néanmoins, même dans le meilleur des cas, l'a--gm~nt~tion de la durée de vie de l'ordre de 50% à 100% (à
WO 94/21298 ~ PCT/FR94/00296 Ia température de 20 C) d'un produit thérapeutique, sera la bienvenue (par exemple: le vaccin contre la poliomyélite).
Pour d'autres agents, le stockage sous forme de poudre Iyophilisée est tout à fait satisfaisant, la dégradation commençant simplement au moment de 1' incorporation dans un milieu aqueux.
Pour plusieurs autres agents, les problèmes de stockage sous forme sèche ne peuvent pas être résolus. Pour certains, stables sous forme sèche, la dégradation en milieu aqueux est tellement rapide que la stabilité présente un problème, même dans la courte période entre l'incorporation en milieu aqueux et l'utilisation.
Il y a plusieurs facteurs causant la dégradation: les procédés de fabrication, les enzymes de dégradation (les enzymes protéolytiques, les nucléases, les lipases, les enzymes glycolytiques), les agents d'oxydation ou deréduction (comme l'oxygène, ou les produits chimiques organiques ou inorganiques), la co,~l; ",i"~ti~ n microbienne.
Les liaisons chimiques faibles sont importantes pour les macromolécules biologiques.
La dénaturation thermale ne peut pas être évitée, en raison des nombreuses liaisons ~himiqlles faibles qui caractérisent les macromolécules biologiques.
Néanmoins, cela peut-être limité, par exemple, en gardant les températures relativement basses (réfrigération ou congélation). Parfois, de faibles augmentations de Lt:lllpé,dlule peuvent produire des changements specf~r~ ires dans l'activité des agents biologiques. De tels changements impliquent la rupture d'une org~ni.c~tion moléculaire qui dépendent des effets coopératifs non-associés avec la dénaturation spécifique d'une protéine ou d'un acide nucléique . .
speclrlque.
Afin de remédier au phénom~n~ de déstabilisation, on peut utiliser des adjuvants tel que MgC12, (pour le vaccin contre la poliomyélite) le polyéthylèneglycol, etc; cependant ceux-ci peuvent présenter l'inconvénient de ne pas toujours (en fonction des conce,llldtions) être physiologiquement applol.,iés.
Pour chaque température ambiante, il y a un spectre d'énergie disponible pour les changements de structure dans une macromolécule ou dans un complexe macromoléculaire (REF: Watson, James et al. pages 126 à 162, Molecular Biology of the Gene, 4th Edition (1987) Publishers Benjamin Cummingc, ISBN 0-8053-9612-8). Dans le pire des cas, ces changements peuvent être associés à la rupture ou à la création de liaisons chimiques covalentes. Les énergies moins importantes seront peut-être sufflc~ntes pour la création ou la rupture des liaisons chimiques secondaires (les liaisons ~ WO 94/21298 21~ 8 1~ ~ PCT/FR94/00296 hydrogène, les interactions hydrophobes, les interactions de Van-der-Waals) qui jouent un rôle important dans les processus biologiques et les activités des macromolécules biologiques. L'importance des liaisons discutées ci-dessous, est la plus prononcée entre les températures de 0C et 45C, correspondant à la gamme des températures associées aux processus vivants dans les organi~m~s superieurs.
Ces interactions faibles sont toutes favorisées par une complémentarité de structure physique. Par exemple, une hormone et son site d'att~c~hPment sont liés par plusieurs liaisons faibles. La complémentarité de structure augmente lenombre des interactions du type Van-der-Waals, hydrophobes ou hydrogène, et ainsi évite l'effet disruptif de l'énergie ambiante.
L'eau elle-même joue un rôle important dans la stabilisation des macromolécules en milieu aqueux.
Les liaisons hydrogène entre les molécules d'eau ordonnent la structure.
La structure peut-être mise en évidence avec les techniques de diffraction des rayons-X ou des neutrons.
A la périphérie des macromolécules, des molécules d'eau folll~nt une sorte de couche, d'une profondeur de plusieurs molécules d'eau. Comme une cage, cette couche, renforcée par les liaisons hydrogène - entre des molécules d'eau et entre des molécules d'eau et les macromolécules - a pour effet de préserver l'intégrité du contenu.
La structure électronique de l'eau permet le libre échange des protons (noyaux des atomes d'hydrogène) entre les éléments du treillis d'eau et avec lessites favorables sur les macromolécules en milieu aqueux.
Dans les macromolécules, les molécules d'eau servent souvent de rôle de composant structurel, créant des ponts rigides entre les résidus protéiques, desbases nucléiques, des glucides ou des composants polaires des lipides. Les études cristallographiques montrent clairement l'inclusion des molécules d'eau dans plusieurs cristaux macromoléculaires. L'effet c~ml~l~fif coopératif de ces ponts moléculaires dans les structures comme les virus picorna est très sensibleaux augmentations de te~ )cldlllle.
L'eau lourde (ou l'oxyde de deutérium, D2O ou 2H2O) a été découverte par Urey en 1932. Cette découverte a précipité un intérêt immPrii~t, surtout concernant les éventuelles répercussions sur la chimie de la vie. Pendant des années 1932-1939, plus de 200 publications ont montré les effets de l'eau lourdesur les org~ni~mPs vivants et leurs physiologie et biochimie. Dans tous les cas,D2O a été utilisée pour remplacer (entre 5% et 100%) H2O dans les milieux aqueux, mais les résultats obtenus n'ont pas permis de considérer l'eau lourde comme un agent stabili.c~teur.
Pendant les années 1970-80, I'eau lourde est devenu un outil important, dans le domaine des études biophysiques, tel que la RMN (résistance magnétique nucléaire) ou la diffusion des neutrons monochromatiques.
Pour la RMN, le noyau de deutérium possède l'atout de ne pas avoir de spin nucléaire. En milieu H2O, dans un champs magnétique, les signaux de fréquence radio émis pars les noyaux excités ne peuvent pas être détectés, parceque tous les hydrogènes de l'eau créent un bruit de fond énorme. Dans le milieu D2O, I'eau ne contribue pas à un bruit de fond, et la technique de résonance magnétique des protons est devenue très pui~s~nt~- surtout pour les molécules qui contiennent des protons (lH) et qui sont solubilisées par D2O.
Les propriétés nucléaires des noyaux H et D sont bien différentes. Pour un f~i~ce~l de neutrons, le deutérium est relativement transparent, tandis que l'eau ordinaire est relativement opaque (S~lhrtn~n H. (1974) J. Appl. Cryst. 7, 173-187). Les diverses techniques permettent la dirrére.lliation des informations structurelles venant des différentes macromolécules. La cristallographie des neutrons est devenu un outil puissant.
Ceci étant, bien qu'il soit connu que l'eau lourde apporte une augmentation d'énergie des liaisons hydrogène par un facteur de 0,24 kilocaloriepar mole, rien ne permettait de prévoir l'influence de l'eau lourde sur la stabilisation de molécules solubilisées par I 'eau, car interviennent des phénomènes autres que la nature de la liaison entre le solvant et la molécule, ces phénomènes tels que l'effet cage, étant à ce jour mal connus. Les effets coopératifs eau/ADN/protéines à l'intérieur des virus restent également à ce jour mal connus. Les confirmations peuvent éventuellement être données par les études cristallographiques (neu~lolls et rayons X).
L'un des buts de l'invention est de proposer des compositions pharm~relltiques stabilisées, physiologiquement compatibles.
L'un des buts de l'invention est de fournir un ensemble de compositions pharm~el-tiques stabilisées, dans lesquelles les doses d'agents pharm~euti-lues peuvent être réduites par rapport aux mêmes compositions thérapeutiques non stabilisées.
L'un des autres aspects de l'invention est de proposer un procédé de préparation simple d'un ensemble de compositions pharrn~rel~tiques,notamment thérapeutiques,vaccinantes ou de diagnostic, stabilisées.
Ces dirrele~ aspects sont obtenus par les compositions de l'invention.
~ WO 94/21298 2 ~ ~ 8 1 4 ~ PCT/FRg4/00296 A cet égard, la composition pharm~ce~ltique stabilisée de l'invention, comprenant une ou plusieurs macromolécule(s) choisie(s) parmi les acides nucléiques, les lipides ou les glucides et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), est caractérisée en ce qu'elle comporte un ou plusieurs véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s), I'un au moins de ces véhicules contenant de l'eau lourde (D2O).
On a trouvé que la substitution de la totalité ou d'une partie des noyaux d'hydrogène par des noyaux de d~uL~liulll, dans les molécules d'eau qui servent de solvant à une molécule ou à un complexe macromoléculaire qui constitue la substance active d'une composition pharm~eutique, permettait de stabiliser ladite composition pharm~eeutique.
Dans la nature, l'hydrogène est composé de 0,0156% de deutérium. Celui-ci peut-être puri~lé par la distillation ou l'électrolyse de l'eau, pour obtenir de l'eau lourde pure, qui peut-être alors électrolysée pour obtenir du deutérium pur.
L'invention concerne l'utilisation de D2O, ou des mélanges de D2O et de H2O, comme agents de stabilisation des macromolécules choisies parmi les acides nucléiques, les lipides ou des glucides ou des complexes macromoléculaires en phase aqueuse (solutions, suspensions ou émulsions).
Dans le cGl~le~Le de cette invention, ce sont les propriétés de l'oxyde de deutérium, ou eau lourde, qui sont particulièrement inté,~s~nt~s. Les noyaux H
ou D qui s'échangent librement entre les molécules d'eau et entre les nombreux sites des macromolécules biologiques dissoutes, suspendues ou é~l-lcifiées. D etH sont librement échangeables entre les sites d'hydrogène labiles, par exemple tous les hydrogènes dans la masse d'eau, ou beaucoup d'hydrogènes dans les macromolécules biologiques. D'autres hydrogènes, parfois cachés dans le milieu hydrophobe, sont moins accessibles, mais à l'issue d'une période variable, peuvent eux aussi être échangés.
Dans H2O, D2O ou des mélanges des deux, les propriétés physiques des solutions montrent une graduation linéaire des propriétés physiques (telles que la densité ou le point d'ébullition ou les valeurs molaires pour l'énergie des liaisons hydrogènes).
Les macromolécules et complexes macromoléculaires visés dans l'invention sont tels qu'ils ont un poids moléculaire d'au moins 1500 Da, et avantageusement supérieur à 5000 Da.
Pour fixer les idées, la stabilisation des macromolécules est telle que pour une l~",pé,a~ul~ donnée, par exemple aux environs de 40C, on peut observer une augmentation de stabilité des macromolécules ou complexes WO 94/21298 ~ 314 ~ PCT/FR94/00296 macromoléculaires, conservés dans une solution contenant D2O, par rapport à
ces mêmes macromolécules ou comp!exes macromoléculaires conservés dans une solution contenant H2O.
Par exemple, pour les virus de la poliomyélite (voir résultats), cette stabilisation se traduit par une augmentation du nombre de particules virales actives d'un facteur d'environ 103 à environ 104.
Comme indiqué ci-dessus, les macromolécules visées dans l'invention sont des acides nucléiques, des glucides ou des lipides.
Quant aux complexes macromoléculaires, ils sont avantageusement choisis parmi les complexes protéines-glucides, protéines-lipides, acides nucléiques-glucides, acides nucléiques-lipides, acides nucléiques-protéines, éventuellementcomplexés avec des glucides et/ou des lipides, et parmi les virus.
A titre d'exemples de macromolécules biologiques et de complexes macromoléculaires, susceptibles d'entrer dans les compositions de l'invention figurent:
1) les acides nucléiques:
I'ADN, pour les applications in vivo (par exemple: thérapie génique) et in vitro (par exemple: applications fii~gnostitll-es);
I'ARN, des ribozymes pour les applications in vivo (modifications des acides nucléiques ou des complexes acides nucléiques/~roteil,es);
I'ADN et l'ARN, font partie des génomes des virus utilisés comme vecteurs dans la thérapie ou la vaccinologie;
des complexes d'ADN/ARN naturels ou artificiels;
les acides nucléiques utilisés peuvent être ceux existant sous des formes naturelles ou artif1cielles (créées par le génie génétique);
PROCEDES DE PREPARATION
La présente invention concerne des compositions pharm:~relltiques stabilisées et leurs procédés de préparation.
La présente invention concerne plus particulièrement l l stabilisation d'agents prophylactiques, ou thérapeutiques ou de ~ gnnstic con~titl-és OU
contenant des macromolécules ou des complexes macromoléculaires.
L'importance sociale et commerciale des macromolécules biologiques augmente.
La plupart des agents thél~peuLiques ou protecteurs agissent dans le milieu aqueux des espaces inter- ou intracellulaires, ou les surfaces muqueuses.
Certains agissent dans le milieu hydrophobique constituant les phases membranaires, lipidiques ou dans l'environnement des acides aminés hydrophobes.
Au cours de ces dernières années, les biotechnologies ont eu des influences considérables dans les industries du secteur de la santé. Les nouveaux procédés pour la fabrication et l'isolement de lllaL~liau~ macromoléculaires sont capables de réaliser, en qll~ntités commerciales, des produits naturels ou issusdu génie génétique, dotés de spécificités précéd~ll..llellL irréalisables. (Virus, ADN, ARN, ribozymes, agents anti-sens, etc...) Les anciens composés thérapeutiques de poids moléculaires relativement faibles (aspirine, par~cét~mol, catécholamines, pénicilline) ont été caractérisés par une certaine facilité de formulation dans les comprimés, les émulsions, suspensions ou solutions.
Certaines macromolécules - telles que les acides nucléiques, et leurs complexes avec les ~lotéines (et leurs cofacteurs), les glucides complexes, les lipides - et leurs complexes, deviennent d'un intérêt de plus en plus important en tant que vaccins, ou thc;l~uLiques ou de diagnostic.
Dans les milieux aqueux, toutes les macromolécules et les complexes macromoléculaires indiqués ci-dessus ont une tendance à la dégradation, ce qui limite leur utilité d'agent thérapeutique, vaccinant ou de diagnostic.
Pour beaucoup d'agents, la dégradation n'est pas un problème sérieux (par exemple, en suivant les indications du fabricant, on évite les problèmes associés éventuellement avec l'utilisation d'un vaccin périmé). Néanmoins, même dans le meilleur des cas, l'a--gm~nt~tion de la durée de vie de l'ordre de 50% à 100% (à
WO 94/21298 ~ PCT/FR94/00296 Ia température de 20 C) d'un produit thérapeutique, sera la bienvenue (par exemple: le vaccin contre la poliomyélite).
Pour d'autres agents, le stockage sous forme de poudre Iyophilisée est tout à fait satisfaisant, la dégradation commençant simplement au moment de 1' incorporation dans un milieu aqueux.
Pour plusieurs autres agents, les problèmes de stockage sous forme sèche ne peuvent pas être résolus. Pour certains, stables sous forme sèche, la dégradation en milieu aqueux est tellement rapide que la stabilité présente un problème, même dans la courte période entre l'incorporation en milieu aqueux et l'utilisation.
Il y a plusieurs facteurs causant la dégradation: les procédés de fabrication, les enzymes de dégradation (les enzymes protéolytiques, les nucléases, les lipases, les enzymes glycolytiques), les agents d'oxydation ou deréduction (comme l'oxygène, ou les produits chimiques organiques ou inorganiques), la co,~l; ",i"~ti~ n microbienne.
Les liaisons chimiques faibles sont importantes pour les macromolécules biologiques.
La dénaturation thermale ne peut pas être évitée, en raison des nombreuses liaisons ~himiqlles faibles qui caractérisent les macromolécules biologiques.
Néanmoins, cela peut-être limité, par exemple, en gardant les températures relativement basses (réfrigération ou congélation). Parfois, de faibles augmentations de Lt:lllpé,dlule peuvent produire des changements specf~r~ ires dans l'activité des agents biologiques. De tels changements impliquent la rupture d'une org~ni.c~tion moléculaire qui dépendent des effets coopératifs non-associés avec la dénaturation spécifique d'une protéine ou d'un acide nucléique . .
speclrlque.
Afin de remédier au phénom~n~ de déstabilisation, on peut utiliser des adjuvants tel que MgC12, (pour le vaccin contre la poliomyélite) le polyéthylèneglycol, etc; cependant ceux-ci peuvent présenter l'inconvénient de ne pas toujours (en fonction des conce,llldtions) être physiologiquement applol.,iés.
Pour chaque température ambiante, il y a un spectre d'énergie disponible pour les changements de structure dans une macromolécule ou dans un complexe macromoléculaire (REF: Watson, James et al. pages 126 à 162, Molecular Biology of the Gene, 4th Edition (1987) Publishers Benjamin Cummingc, ISBN 0-8053-9612-8). Dans le pire des cas, ces changements peuvent être associés à la rupture ou à la création de liaisons chimiques covalentes. Les énergies moins importantes seront peut-être sufflc~ntes pour la création ou la rupture des liaisons chimiques secondaires (les liaisons ~ WO 94/21298 21~ 8 1~ ~ PCT/FR94/00296 hydrogène, les interactions hydrophobes, les interactions de Van-der-Waals) qui jouent un rôle important dans les processus biologiques et les activités des macromolécules biologiques. L'importance des liaisons discutées ci-dessous, est la plus prononcée entre les températures de 0C et 45C, correspondant à la gamme des températures associées aux processus vivants dans les organi~m~s superieurs.
Ces interactions faibles sont toutes favorisées par une complémentarité de structure physique. Par exemple, une hormone et son site d'att~c~hPment sont liés par plusieurs liaisons faibles. La complémentarité de structure augmente lenombre des interactions du type Van-der-Waals, hydrophobes ou hydrogène, et ainsi évite l'effet disruptif de l'énergie ambiante.
L'eau elle-même joue un rôle important dans la stabilisation des macromolécules en milieu aqueux.
Les liaisons hydrogène entre les molécules d'eau ordonnent la structure.
La structure peut-être mise en évidence avec les techniques de diffraction des rayons-X ou des neutrons.
A la périphérie des macromolécules, des molécules d'eau folll~nt une sorte de couche, d'une profondeur de plusieurs molécules d'eau. Comme une cage, cette couche, renforcée par les liaisons hydrogène - entre des molécules d'eau et entre des molécules d'eau et les macromolécules - a pour effet de préserver l'intégrité du contenu.
La structure électronique de l'eau permet le libre échange des protons (noyaux des atomes d'hydrogène) entre les éléments du treillis d'eau et avec lessites favorables sur les macromolécules en milieu aqueux.
Dans les macromolécules, les molécules d'eau servent souvent de rôle de composant structurel, créant des ponts rigides entre les résidus protéiques, desbases nucléiques, des glucides ou des composants polaires des lipides. Les études cristallographiques montrent clairement l'inclusion des molécules d'eau dans plusieurs cristaux macromoléculaires. L'effet c~ml~l~fif coopératif de ces ponts moléculaires dans les structures comme les virus picorna est très sensibleaux augmentations de te~ )cldlllle.
L'eau lourde (ou l'oxyde de deutérium, D2O ou 2H2O) a été découverte par Urey en 1932. Cette découverte a précipité un intérêt immPrii~t, surtout concernant les éventuelles répercussions sur la chimie de la vie. Pendant des années 1932-1939, plus de 200 publications ont montré les effets de l'eau lourdesur les org~ni~mPs vivants et leurs physiologie et biochimie. Dans tous les cas,D2O a été utilisée pour remplacer (entre 5% et 100%) H2O dans les milieux aqueux, mais les résultats obtenus n'ont pas permis de considérer l'eau lourde comme un agent stabili.c~teur.
Pendant les années 1970-80, I'eau lourde est devenu un outil important, dans le domaine des études biophysiques, tel que la RMN (résistance magnétique nucléaire) ou la diffusion des neutrons monochromatiques.
Pour la RMN, le noyau de deutérium possède l'atout de ne pas avoir de spin nucléaire. En milieu H2O, dans un champs magnétique, les signaux de fréquence radio émis pars les noyaux excités ne peuvent pas être détectés, parceque tous les hydrogènes de l'eau créent un bruit de fond énorme. Dans le milieu D2O, I'eau ne contribue pas à un bruit de fond, et la technique de résonance magnétique des protons est devenue très pui~s~nt~- surtout pour les molécules qui contiennent des protons (lH) et qui sont solubilisées par D2O.
Les propriétés nucléaires des noyaux H et D sont bien différentes. Pour un f~i~ce~l de neutrons, le deutérium est relativement transparent, tandis que l'eau ordinaire est relativement opaque (S~lhrtn~n H. (1974) J. Appl. Cryst. 7, 173-187). Les diverses techniques permettent la dirrére.lliation des informations structurelles venant des différentes macromolécules. La cristallographie des neutrons est devenu un outil puissant.
Ceci étant, bien qu'il soit connu que l'eau lourde apporte une augmentation d'énergie des liaisons hydrogène par un facteur de 0,24 kilocaloriepar mole, rien ne permettait de prévoir l'influence de l'eau lourde sur la stabilisation de molécules solubilisées par I 'eau, car interviennent des phénomènes autres que la nature de la liaison entre le solvant et la molécule, ces phénomènes tels que l'effet cage, étant à ce jour mal connus. Les effets coopératifs eau/ADN/protéines à l'intérieur des virus restent également à ce jour mal connus. Les confirmations peuvent éventuellement être données par les études cristallographiques (neu~lolls et rayons X).
L'un des buts de l'invention est de proposer des compositions pharm~relltiques stabilisées, physiologiquement compatibles.
L'un des buts de l'invention est de fournir un ensemble de compositions pharm~el-tiques stabilisées, dans lesquelles les doses d'agents pharm~euti-lues peuvent être réduites par rapport aux mêmes compositions thérapeutiques non stabilisées.
L'un des autres aspects de l'invention est de proposer un procédé de préparation simple d'un ensemble de compositions pharrn~rel~tiques,notamment thérapeutiques,vaccinantes ou de diagnostic, stabilisées.
Ces dirrele~ aspects sont obtenus par les compositions de l'invention.
~ WO 94/21298 2 ~ ~ 8 1 4 ~ PCT/FRg4/00296 A cet égard, la composition pharm~ce~ltique stabilisée de l'invention, comprenant une ou plusieurs macromolécule(s) choisie(s) parmi les acides nucléiques, les lipides ou les glucides et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), est caractérisée en ce qu'elle comporte un ou plusieurs véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s), I'un au moins de ces véhicules contenant de l'eau lourde (D2O).
On a trouvé que la substitution de la totalité ou d'une partie des noyaux d'hydrogène par des noyaux de d~uL~liulll, dans les molécules d'eau qui servent de solvant à une molécule ou à un complexe macromoléculaire qui constitue la substance active d'une composition pharm~eutique, permettait de stabiliser ladite composition pharm~eeutique.
Dans la nature, l'hydrogène est composé de 0,0156% de deutérium. Celui-ci peut-être puri~lé par la distillation ou l'électrolyse de l'eau, pour obtenir de l'eau lourde pure, qui peut-être alors électrolysée pour obtenir du deutérium pur.
L'invention concerne l'utilisation de D2O, ou des mélanges de D2O et de H2O, comme agents de stabilisation des macromolécules choisies parmi les acides nucléiques, les lipides ou des glucides ou des complexes macromoléculaires en phase aqueuse (solutions, suspensions ou émulsions).
Dans le cGl~le~Le de cette invention, ce sont les propriétés de l'oxyde de deutérium, ou eau lourde, qui sont particulièrement inté,~s~nt~s. Les noyaux H
ou D qui s'échangent librement entre les molécules d'eau et entre les nombreux sites des macromolécules biologiques dissoutes, suspendues ou é~l-lcifiées. D etH sont librement échangeables entre les sites d'hydrogène labiles, par exemple tous les hydrogènes dans la masse d'eau, ou beaucoup d'hydrogènes dans les macromolécules biologiques. D'autres hydrogènes, parfois cachés dans le milieu hydrophobe, sont moins accessibles, mais à l'issue d'une période variable, peuvent eux aussi être échangés.
Dans H2O, D2O ou des mélanges des deux, les propriétés physiques des solutions montrent une graduation linéaire des propriétés physiques (telles que la densité ou le point d'ébullition ou les valeurs molaires pour l'énergie des liaisons hydrogènes).
Les macromolécules et complexes macromoléculaires visés dans l'invention sont tels qu'ils ont un poids moléculaire d'au moins 1500 Da, et avantageusement supérieur à 5000 Da.
Pour fixer les idées, la stabilisation des macromolécules est telle que pour une l~",pé,a~ul~ donnée, par exemple aux environs de 40C, on peut observer une augmentation de stabilité des macromolécules ou complexes WO 94/21298 ~ 314 ~ PCT/FR94/00296 macromoléculaires, conservés dans une solution contenant D2O, par rapport à
ces mêmes macromolécules ou comp!exes macromoléculaires conservés dans une solution contenant H2O.
Par exemple, pour les virus de la poliomyélite (voir résultats), cette stabilisation se traduit par une augmentation du nombre de particules virales actives d'un facteur d'environ 103 à environ 104.
Comme indiqué ci-dessus, les macromolécules visées dans l'invention sont des acides nucléiques, des glucides ou des lipides.
Quant aux complexes macromoléculaires, ils sont avantageusement choisis parmi les complexes protéines-glucides, protéines-lipides, acides nucléiques-glucides, acides nucléiques-lipides, acides nucléiques-protéines, éventuellementcomplexés avec des glucides et/ou des lipides, et parmi les virus.
A titre d'exemples de macromolécules biologiques et de complexes macromoléculaires, susceptibles d'entrer dans les compositions de l'invention figurent:
1) les acides nucléiques:
I'ADN, pour les applications in vivo (par exemple: thérapie génique) et in vitro (par exemple: applications fii~gnostitll-es);
I'ARN, des ribozymes pour les applications in vivo (modifications des acides nucléiques ou des complexes acides nucléiques/~roteil,es);
I'ADN et l'ARN, font partie des génomes des virus utilisés comme vecteurs dans la thérapie ou la vaccinologie;
des complexes d'ADN/ARN naturels ou artificiels;
les acides nucléiques utilisés peuvent être ceux existant sous des formes naturelles ou artif1cielles (créées par le génie génétique);
2) les ~ ri-l~s:
ces macromolécules n'ont pas encore trouvé d'applications comme thérapeutiques indépen~ntrs, mais dans leurs complexes avec les p,otéilles, elles sont reconnues comme facteur majeur dans la modification des activités de ces protéines; les différentes formes glllrirliques peuvent invoquer des activités physiologiques ~ignifir~tives (comme c'est le cas pour la tPA, où les dirrél~"Les "glycoformes" ont des activités bien dirre,~ les);
ces macromolécules n'ont pas encore trouvé d'applications comme thérapeutiques indépen~ntrs, mais dans leurs complexes avec les p,otéilles, elles sont reconnues comme facteur majeur dans la modification des activités de ces protéines; les différentes formes glllrirliques peuvent invoquer des activités physiologiques ~ignifir~tives (comme c'est le cas pour la tPA, où les dirrél~"Les "glycoformes" ont des activités bien dirre,~ les);
3) les lipides:
les macromolécules lipidiques jouent des rôles importants dans les membranes cellulaires, mais hormis les molécules relativement petites comme les prost~gl~n-linrs et les vit~min~s de groupe A, ces agents n'ont pas trouvé
beaucoup d'applications thérapeutiques; leur intérêt se trouve dans leurs complexes macromoléculaires et en particulier dans leurs utilisations dans les WO 94/21298 ~ PCT/FR94/00296 liposomes utilisés comme sys.èmes de livraisons pour d'autres agents thérapeutiques;
les macromolécules lipidiques jouent des rôles importants dans les membranes cellulaires, mais hormis les molécules relativement petites comme les prost~gl~n-linrs et les vit~min~s de groupe A, ces agents n'ont pas trouvé
beaucoup d'applications thérapeutiques; leur intérêt se trouve dans leurs complexes macromoléculaires et en particulier dans leurs utilisations dans les WO 94/21298 ~ PCT/FR94/00296 liposomes utilisés comme sys.èmes de livraisons pour d'autres agents thérapeutiques;
4) les complexes macromoléculaires:
les plus typiques sont les complexes des acides nucléiques et les protéines, ou les protéines et les glucides;
un virus est un complexe macromoléculaire composé éventuellement d'acides nucléiques, de protéines, de glucides et de lipides (par exemple, le virus de la grippe ou le virus HIV);
on peut également citer les complexes artificiels, telle qu'une couche lipidique enrobant un agent thérapeutique, ciblé par des activités localisées dans la couche lipidique, ayant une spécificité de liaison avec des composants de la cible visée.
Les compositions pharrn~reutiques impliquées dans la présente invention peuvent être définies par:
A - soit une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), maintenus dans un ou plusieurs véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s), B - soit une ou plusieurs macromolécule(s), et un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), maintenus séparément par rapport à un ou plusieurs véhicule(s) pharm~ceutiqllemPnt acceptable(s), la (les) macromolécule(s), le (les) complexe(s) macromoléculaire(s) et le (les) véhicules pharm~reutiquement acceptable(s) étant destinés à être rassemblés en vue de l'~lmini.~tration à un patient, C - soit au moins deux éléments, maintenus séparément les uns par rapport aux autres, et comportant chacun une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), I'un au moins de ces éléments étant en présence d'un véhicule pharm~reutiquement acceptable conlella~lL de l'eau lourde, ces dir~lenL~ éléments étant destinés à être rassemblés en vue de l'atlmini~tration à un patient, D - soit au moins deux des compositions pharm~re~ltiques selon l'une des variantes A, B, ou C, maintenues séparément l'une par rapport à l'autre et destinPes à être rassemblées en vue de l~imini~tration à un patient.
A titre d'exemple, une composition correspondant au rassemblement en vue de l'atlTnini.~tration à un patient des variantes selon B et C comprend les caractétristiques suivantes:
- d'une part une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s) sont maintenus séparément par rapport à un ou plusieurs véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s), et d'autre part au moins WO 94/21298 2 ~ ~ 814 ~I PCT/FR94/00296 deux éléments sont maintenus séparément les uns par rapport aux autres, et comportent chacun une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), I'un au moins de ces éléments étant en présence d'un véhicule pharm~ceutiquement acceptable contenant de l'eau lourde, la (les) macromolécule(s), le (les) complexe(s) macromoléculaire(s), le (les) véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s) et les susdits éléments étantdestinés à être rassemblés en vue de l'a~mini~tration à un patient.
Les macromolécules et/ou les complexes macromoléculaires peuvent être conservés ou non avec le véhicule pharm~reutiquement acceptable contenant de l'eau lourde.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les compositions sont telles que les macromolécules ou les complexes macromoléculaires sont soit en suspension, soit en solution, soit en émulsion dans le véhicule pharm~e~-tique.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de I ' invention, les compositions sont telles que la ou les macromolécule(s) et/ou le ou les complexe(s) macromoléculaire(s) et le véhicule pharm~eutiquement acceptable sont m~intemlc séparément et sont destinés à être rassemblés en vue de mini~tration à un patient.
A titre d'exemple, les macromolécules et/ou les complexes macromoléculaires peuvent être Iyophilisés et mélangés avec le véhicule pharm~-eutiquement acceptable peu de temps avant l'~-lmini~tration à un patient, ou au moment de cette ~iminictration.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention le volume du véhicule pharm~e~tique varie d'environ 0,1 ml à
environ 20 ml, notamment d'environ 0,1 ml à environ 5 ml, et la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire varie d'environ 1,ug à environ 3g.
Selon un mode de réalisation avantageux pour une dose unitaire, la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire est d'environ lO~g pour un volume d'environ 1 ml de véhicule pharrnaceutique.
Selon encore un autre mode de réalisation, dans les compositions de l'invention, le véhicule pharm~re~tique est un mélange H2O-D2O et le rapport en poids entre D2O et H2O varie d'environ 10% à environ 100%, avantageusement d'environ 40% à environ 95%, et de préférence d'environ 80 % à environ 95 % .
En général, les mélanges D2O/H2O, contenant des concentrations élevées en D2O (90-100%), donnent une stabilisation équivalente à une réduction de WO 94/21298 ~ 1 5 ~ ~ 4 ~ PCT/FR94/00296 température ambiante d'un facteur de 4-5C (c'est à dire dans 95% de D2O à
25C - par exemple - une macromolécule subit un effet de dégradation qui équivaut à celui observé normalement dans H2O à 20C).
De plus, les concentrations élevées en D2O offrent une protection importante contre les suites de la cont~min~tion microbienne. Peu de microbes tolèrent les concentrations de D2O dépassant les 70%. Ainsi l'eau lourde est effectivement un milieu auto-stérilisant (à noter, que certaines microbes, généralement non-pathogéniques, peuvent être adaptés à la vie en milieu D2O).
Les compositions de l'invention sont non toxiques. En effet, il est connu que D2O à une concentration inférieure à 10% de l'eau corporelle n'a pas d'effet toxique signific~tif. (Voir A. Barbour, H.G., (1937), Yale J. Biol. Med.9, 551 - B: Barbour, H.G., (1938), Am. J. Cancer, 32, 440- C: Barbour, H.G.
(1938), J. Pharm. Exp. Therap., 62, 158 - D: Barbour, H.G., (1936), J.
Pharm. Exp. Rherap., 58, 460).
Les agents pharmaceutiques susceptibles de bénéficier de ces effets stabilisateurs sont souvent chers et contenus dans des petits volumes (vaccin oral, par exemple 0,15 ml); ainsi le prix relativement élevé de D2O a moins d ' importance.
Comme D2O et H2O sont entièrement miscibles, et comme les atomes d'hydrogène (lH et 2H) labiles s'échangent rapidement, on peut consLater qu' une dose de D20 conle~ un agent plotect~ul ou thérapeutique sera rapidement dispersée dans la masse d'eau corporelle. Avec une abondance naturelle de 0,0156% des atomes d'hydrogène, la masse de d~uleliulll dans une personne de poids de 75kg sera d'environ lg, équivalent à 10g d'eau lourde.
L'~fiminictration des petits doses (par exemple: 0,1 à 5,0 ml) ne dépassera pas la quantité d'eau lourde déjà présente dan le corps d'un adulte. Même les doses très élevées (10 ml à 50 ml) ne contribuent pas à un niveau de d~u~liulll (ellviroll 0,1%) approchant les concentrations toxiques (soit 10% - 20%) ou mortelles ( 25% et plus).
L'eau lourde ne s'arcnmllle pas dans l'org~nicm~ et elle est rejetée dans l'urine, la transpiration et la respiration, au même titre que l'eau.
En résumé, les expériences et les observations licc~-tees démontrent qu'il y a un effet stabilic~tenr pour les macromolécules et leurs complexes, d'environ5C, associé à l'eau lourde. Malgré les changements de température relativement faibles et qui sont de l'ordre de 2C à 5C, les effets co~,~e~aLir~
mentionnés au-dessus peuvent contribuer à une ~llgmPnt~tion importante de stabilité. Les macromolécules et même les org~ni.cm~s vivants (certains microbes, généralement non-pathogéniques, pouvant être adaptés à la vie en Wo 94/21298 ~ PCT/FR94/00296 milieu D2O) ont montré une résistance aux tempél~ules normalement associées (en milieu H2O) à la dénaturation thermale. Certains complexes ont montré une résistance réversible à la désagrégation induite par les solutions de faible force ionique (en H2O, par exemple inférieure à KCl lmM).
Dans les compositions de l'invention, le véhicule pharm~celltique peut contenir un adjuvant de stabilisation, avantageusement MgC12, de la carboxymethyl cellulose, du polyéthylène glycol, des molécules glucidiques, telsque glycérol, glucose, sucrose, (et autres sucres C6), les sucres pentoses et leurs polymères (les amidons par exemple), ces molécules glucidiques pouvant être complexées avec le polyéthylène glycol, le polyéthylène glycol présentant avantageusement un poids moléculaire d'environ 500 à environ 5000 daltons, et notamment d'environ 1000 à environ 5000 daltons.
En application clinique, D2O (et ses mélanges) peut également être utilisé
avec les régulateurs de tonicité, de pH, de viscosité et d'autres agents stabili.~teurs tels que ceux indiqués ci-dessus.
Dans les compositions de l'invention, le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharm~celltique est tel que le véhicule ph~rm~reutirlue ne présente pas une viscosité supérieure à environ 0,2 Pascal-secondes (20 centipoises).
Dans les compositions de l'invention le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule ph~rm~reutique est h~litlll à environ 30%, et est avantageusement d'environ 1% à environ 30%, et de préférence encore d'environ 10% à environ 30%.
Dans les compositions de l'invention les complexes macromoléculaires et les macromolécules sont ceux utilisés:
- dans des compositions vaccil~ s, telles que celles contre la poliomyélite, contre la rougeole, contre l'hépatite, notamment l'h~p~til~ B ou C, contre la grippe, contre le virus du ~ylld~llle immlmo déficitaire acquis (virusdu SIDA ég~lem~nt désigné par HIV = human immllnodeficiency virus), contre la diphtérie, contre le tétanos, contre la coqueluche ou contre une culllbillaison d'au moins deux des susdites pathologies, (par exemple le vaccin contre la diphtérie, le tétanos et la poliomyélite [DTP], ou le vaccin contre la diphtérie, le tétanos, la poliomyélite et la coqueluche, commercialisé sous la marque TETRACOQ, - en tant qu'agent de diagnostic, nola~ ellL pour le diagnostic de la rougeole, de la méningite ou de HIV ou, - en tant qu'agent thérapeutique, tels que des acides nucléiques ou des ribozymes.
Wo 94121298 ~ ~'5 8 14~ PCT/FRg4/00296 L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique de l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- soit la dilution à l'aide de D2O en quantité appropriée, de la susdite composition pharm~eutique se présentant sous forme de solution aqueuse, préalablement concentrée, par exemple à raison de 20 mg/ml, - et/ou la dialyse, contre D20 en quantité applupliée, de la susdite composition pharm~re~ltiqlle se prése~t~nt sous forme de solution aqueuse, - soit la resuspension de la susdite composition pharm~reutique, se présentant sous forme de solide, à l'aide de D2O, en quantité suffl.c~nte pour obtenir la col,ce,~ tion ap~lopliée de la composition pharm~reutique.
On utilise avantageusement la dialyse dans le cas où la composition pharm~reutique contient une substance active fragile, résistant mal aux autres traitements physiques.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'une préparation stabilisée d'origine virale, contenant des complexes macromoléculaires, caractérisé en ce que lesdits complexes macromoléculaires sont mis en solution, suspension ou émulsion dans un milieu contenant de l'eau lourde.
Par ple~ar~tion d'origine virale, on entend notamment - les virus complets, inactivés ou ~tter~l~es, - les protéines glycoprotéines virales, qu'elles soient de surface ou internes et qu'elles soient obtenues à partir de virus ou par recombinaison génétique connue, par exemple la protéine de surface du virus de l'hépatite B, - les vecteurs viraux, tels que les adénovirus, les poxvirus comme le canary pox, ou le virus de la vaccine exprimant les protéines d'origine virale ou bactérienne (voir par exemple le brevet européen: EP 083 286), - les acides nucléiques (ARN ou ADN) encapsulés ou non, connus par exemple sous le nom de "naked DNA" par la demande de brevet européen EP 465 529 (WO 90/11092), ou le brevet américain USP 4 394 448, qui décrit l'encapsulation de l'ADN ou de fragments d'ADN dans des vésicules lipidiques.
L'invention concerne également un procédé de stabilisation d'une préparation vaccinante d'origine virale, notamment d'une suspension virale, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incorporation d'eau lourde:
- soit au virus ou aux cellules à infecter, avant la mise en contact entre les cellules à infecter et le virus, - soit dans le milieu de culture des cellules infectées par le virus, Wo 94/21298 ~ 12 PCT/FR94/00296 - soit dans la préparation vaccinante obtenue à l'issue de l'étape précédente.
L'eau lourde peut être ajoutée à n'importe quelle étape impliquée dans le procédé de préparation de la suspension virale, de préférence après la récupération des particules virales, à l'issue de l'étape de culture des cellules infectées par le virus.
Dans le cas d'un vaccin préparé sous forme Iyophilisée, I'eau lourde peut être utilisée pour la préparation de la suspension virale, avant la lyophilisation et/ou pour la réhydratation du susdit vaccin Iyophilisé. On utilise de préférence l'eau lourde au stade de la réhydratation.
Les vaccins auxquels s'appliquent avantageusement l'invention sont les suivants: grippe, varicelle, rougeole, oreillons, rubéole, dengue, HIV, herpès.
Les exemples cités ci-dessous ont purement une valeur illustratrice, et ne doivent pas être inL~ s comme limit~nt la portée de cette invention.
Ils démontrent:
1:- la thermostabilisation d'un vaccin important;
2:- la stabilisation d'un complexe macromoléculaire modèle, illustrant la réversibilité des effets de thermostabilisation dus à D2O est ses effets isotopes associés.
Ces exemples peuvent être appliqués aux cas suivants:
à un ribozyme, au vaccin recombinant contre l'hépatite B et C, au vaccin contre la grippe, au vaccin contre la rougeole, au vaccin DTP (diphtérie, tétanos, poliomyélite), au vaccin contre le tétanos, au kit pour le fli~gnostic d'HIV.
Il convient de noter que dans ce qui précède et ce qui suit, l'ensemble des documents de la li~Lel~ cités est incorporé par référence.
r~eScription~ des figures:
I ~ figure 1 représente la thermostabilité, à 37C, d'une composition pharmaceutique selon l'invention.
L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la concentration des particules virales (exprimé en unité DICCso/ml, DICCso étant la dose infectieuse cytotoxique dans la cellule).
WO 94/21298 ~ 1 S 81 ~ O PCT/FR94/00296 La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharm~el-ti-lue en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharm~relltique en solution aqueuse, contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharmaceutique de I ' invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharm~reutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant.
T ~ flgure 2 représente la thermostabilité à 42C d'une composition pharmaceutique selon l'invention.
L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la conce~ tion des particules virales (exprimé en unité DICCso/ml).
La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharm~re~ltique en solution ~qllel~e; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharm~re~ltique en solution aqueuse, co,lLe,la MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharm~reutique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharm~ceutique de l'invention, solubilisée dans D20 et contenant MgC12 (à raison de lM) com~ne adjuvant.
T ~ fi~ure 3 représente la thermostabilité à 45C d'une composition pharm~ceutique selon l'invention.
L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au loga,iLI-",e de la conce~ tion des particules virales (exprimé en unité DICCso/ml).
La courbe représentée par des losanges correspond à une composition ph~ reutique en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharm:lre~ltique en solution aqueuse, contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharm~rel~tique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 9~%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharm~reutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant.
wo 94/21298 PCT/FR94/00296 2 ~ 4 T.~ figure 4 représente l'inactivation thermale du poliovirus Sabin de type 3. La concentration initiale du virus est fixée à 5 x 106 DICCso/50~1. (DICCso = dose infectieuse cytotoxique dans la cellule).
Des suspensions du virus de Sabin de type 3 de titres égaux (5 x 106 DICCso/50~1) sont préparés dans les milieux suivants:
a) Dulbecco-MEM dans l'eau normale (correspondant à l'abbréviation "milieu H" sur la figure);
b) Dulbecco-MEM dans D2O de conce~ tion finale 87% (correspondant à l'abbréviation "milieu D" sur la figure);
c) MgC12 lM dans H2O, Tris tamponné à pH 7.2 (correspondant à
l'abbréviation "milieu H-Mg" sur la figure); et d) MgC12 lM dans D2O de concentration finale 87%, Tris tamponné à pH
7.2 (correspondant à l'abbréviation "milieu D-Mg" sur la figure).
Après 3 jours d'inr~lb~tion (partie A de la figure 4) et après 7 jours d'incubation (partie B de la figure 4) à 4C, 37C, 42C et 45C, le type du virus est dételll,i"é. Les résultats sont exprimés comme différence de log de DICCso/SO,ul entre le titre initial du virus m~intPml à -30C et le titre de chaque échantillon. La moyenne et l'erreur standard sont indiqués pour chaque résultat.
r ~ f~ure S représente l'inactivation thermale du poliovirus Sabin de type 1 en présence de D2O et/ou MgC12 (voir détails figure 4). La partie A de la figure S correspond à 3 jours d'incubation, et la partie B de la figure 5 correspond à 7 jours d'incubation.
T ~ fu~ure 6 représente l'inactivation thermale du poliovirus Sabin de type 2 en présence de D2O et/ou MgC12 (voir détails Figure 4). La partie A de la figure 6 correspond à 3 jours d'incubation, et la partie B de la figure 6 correspond à 7 jours d'incubation.
T ~ ~Igure 7 représente la stabilisation du poliovirus Sabin de type 3, avec diverses concentrations d'eau lourde et de MgC12.
~ WO 94/21298 PCT/F R94/00296 15 : . .
On réunit les mêmes conditions expérimentales que celles décrites dans la ~lgure 4, sauf pour la concentration de D2O (partie A de la figure 7) ou MgC12 (partie B de la figure 7).
Les résultats sont exprimés comme différence entre le titre initial de la suspension virale conservée à -30C (log de DICCso/50,ul) et le titre de chacun des échantillons après 3 jours d'inr~lk~tion à 45C. Le titre initial du virus est de 5X106 DICCso/50~1.
T.~ f~ure 8 représente la présence ou l'absence de sédimentation de PNN
(noyau de nucléosome), selon la force ionique de l'eau, et selon la présence ou non d'eau lourde.
La sédimentation des PNN a été faite à pH 7,75 (en milieu de D2O, pH
8,15 selon l'électrode de verre) 0,2mM EDTA, à une force ionique selon le Tableau 1 ci-après. Tr,utes les sédimentations sont faites dans le MSE
CENTRISCAN, ultracenL,irugeuse analytique, dans le rotor comportant 6 cellules de mesure à 50.000 t/mn. Les parties A à C correspondent à un intervalle de mesure de 6 minlltes, les parties D à G correspondent à un intervalle de mesure de 8 mimlt~s, longueur d'onde: 254nm; concellLl~ion des éch~ntillQns: 0,5 à 1,0 mg/ml.
L'axe des abscisses coll~s~olld au rayon de la mesure et l'axe des ordonnés à la concentration en ADN. Cette figure démontre que l'eau lourde consolide les particules de PNN autant que la force ionique.
Therrnostabilisation du poliovirus avec l 'eau lourde L'immlmogénicité des virus atténués dans le vaccin de Sabin contre la polio, dépend de leur degré infectieux au moment de l'~(h"i~ L. ~tion. Les niveaux de prises du vaccin oral contre la polio (OPV) sont liés à la dose de ch~r-lnP des trois souches virales 1, 2 et 3, con~tit~l~nt le vaccin. Une explication pour les niveaux de prises assez bas dans certains pays du tiers t monde, peut être les lU~Lulc~s dans la chaîne du froid avant l'a~lmini~tration du vaccin. La souche 3 du vaccin de Sabin est très critique, à cause de son immllnogénicité et de sa thermostabilité qui sont relativement médiocres.
L'Org~ni~tion Mondiale de la Santé (OMS) demande à ce jour que l'OPV
soit stabilisé par l'addition de MgC12 (concentration 1 M) dans le vaccin. Loin d'être la solution idéale, (perte de moins de 0,5 log d'activité après sept jours à
45C), cette méthode est actuellement le meilleur co~ ,roll,is.
WO 94/21298 2~ 1 5 8 ~ ~ ~ 16 PCT/FR94/00296 Il est démontré ici que selon l'invention, I'eau lourde à 95% offre, même sans aucun autre adjuvant, une stabilisation équivalente ou supérieure à celle offerte par MgC12, en suivant les procédés entièrement standard (à part, bien sûr, le fait d'utiliser l'eau lourde).
Objectifs expérimentaux Toutes les références à l'eau lourde (D2O), dans les exemples ci-après, font référence à l'eau lourde à 95%.
1 Détermination et ql-~ntific~tion des effets de D2O sur la stabilisation du vaccin de Sabin.
2 Comparaison des effets de thermostabilisation de: (a) D2O et (b) D2O
additionné de MgC12.
La souche type 3 est responsable de la plupart des problèmes associés au vaccin de Sabin. Pour cette raison, ce virus a été la cible des études prélimin~ires .
Contexte globale de l'étude sur le vaccin de polio.
Dans l'homme, l'imml-nogénicité de l'OPV est associée au caractère infectieux de la suspension virale. La possibilité que ~lesellle l'OPV de se dégrader dans les régions ayant des tempe~dLuies ambiantes élevées est un problème (voir ci-dessus). Pour l'OMS, le but d'éliminer la polio avant l'année 2000 dépend en partie de l'amélioration des procédés de stabilisation des vaccins actuels (surtout pour les pays en voie de développement).
Les résultats suivants montrent que la souche 3 du vaccin de Sabin, bénéficie d'une stabilisation très marquée dans l'eau lourde à 95% (les autres conditions étant semblables à celles l-tili~ées avec l'eau), sans autre agent destabilisation. L'effet de D20 est lége~ l supérieure à la meilleure des solutions actuelles (MgC12, lM) Méthodes expérin~er~t~es La souche Sabin 3 est choisie comme modèle. La culture des virus est faite selon les procédés classiques.
L'addition d'eau lourde est effectuée en resuspendant le culot de virus (sédimenté dans une ultracentrifugeuse selon les conditions standard) dans D2O
(19 volumes) et un tampon PBS (tampon salin phosphaté) 20 fois concentré (1 volume). L'ultracentrifugation est sans gêne signffil~tive pour les virus. Les ~ WO 94/21298 ~2 ~ 5 ~ 14 ~ PCT/FRg4/00296 études comparatives sont faites avec les milieux standard (H2O, H2O/MgCI2 et MgC12 + D20) La concentration du virus est ajustée à approximativement 101 unités/ml dans D2O à 95%.
Les virus sont soumis à dirrél~nles conditions thermiques selon les courbes montrées ci-après.
virus - tztration Pour tous les échantillons, des dilutions en série sont effectuées (MEM
Eagles avec sels d'Earle, 4%SVF, 3% bicarbonate de sodium, pénicilline, el.Loll~ycine). Une suspension de cellules Hep2C est ajoutée et l'ensemble est incubé à 35C pendant 5 à 7 jours. Les plaques sont colorées avec du "noir de naphtalène" pour évaluer la viabilité des cellules. Les titres sont ensuite calculés. Chaque expérience comporte des contrôles.
Les résultats ci-après concernent la mesure de la stabilité des compositions de l'invention aux trois températures suivantes:
37C, 42C, 45C.
RESULTATS, Jours à 37C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H2O MgC12 D2O MgC12/D2O
2 8.6 9.5 9.6 9.6 7.8 8.1 8.1 8.2 7 6.8 7.5 7.7 7.8 RESULTATS, Jours à 42C Log des unités virales, moyenne de trois éch~ntillons Jours H2O MgC12 D2O MgC12/D2O
2 5.4 8.8 9.4 9.3 3.4 5.4 6.0 6.2 7 2.8 5.2 5.5 5.4 WO 94/21298 ~ i9 18 PCT/FR94/00296 RESULTATS, Jours à 45C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H2o MgC12 D2o MgC12/D2O
2 4.6 7.8 8.5 8.7 1.8 4.8 5.8 6.5 7 0.4 4.7 4.7 4.9 Stabilisation de l 'architecture de la nucléosome par D20 Le noyau de la nucléosome (PNN) est composé de quatre paires de molécules protéiques, les histones H2a H2b, H3 et H4. Chaque octamère de protéine est entouré de 144 paires de base d'ADN, complétant 1,75 tours superhélicale (Noll M. (1974) Nature 251, 249-251; Kornberg R.D. (1974) Science 184, 868-871; Finch J. et al. (1977) Nature 269, 29-35). Gordon a étudié l'effet de la force ionique (en milieu H2O) sur les propriétés de sé-limt~nt~tion de la PNN (Gordon V.C. et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci (USA). 75, 660-663). L'exemple ci-après illustre les différences impolL~ es entre les propriétés de stabilisation de l'eau ordinaire et de l'eau lourde envers la PNN. La PNN peut être considérée comme une sorte de système modèle de la famille des complexes acide nucléique/prol~ille.
Méthodes expénnlent~ 1es La sédimentation des PNN préparées à partir d'éryt'nrocytes de poulet (Suau P. et al (1977) Nuc. Acids. Res. 4, 3769-3786) est étudiée avec l'ultracentrifugeuse analytique (MSE CENTRISCAN) dans plusieurs conditions de force ionique et de concellLl~tions en eau lourde. Plusieurs éch~ntillons en H2O sont après ré-équilibrés dans l'eau lourde en dialysant contre un volume important d'eau lourde, à diverses concel"l~tions et compositions ioniques.
Toutes les solutions sont tamponnées avec 0,2nM EDTA, pH 7,75 (en D20 ajusté à pH 8,15 selon l'électrode de verre). La force ionique a été apportée par KCl.
Rf,~sl~t~t~
La sédilllcl,~tion des PNN est dépendante de la composition ionique de l'eau. Très évidente est la désagrégation des PNN en milieu H2O à faible wo 94/21298 ~ ~ 5 ~ PCT/FR94/00296 p~ s~nre ionique (Fig 4A). Dans l'eau lourde, cette dégradation des PNN ne se manifeste pas (Fig 4D). Même la dépendance ionique de la valeur de sédimentation (en unités Svedburg - s) devient très limitée (Voir Tableau 2 et Fig 4). La PNN désagrégée (4A), après dialyse contre l'eau lourde, redevient une particule discrète avec une sédimentation caractéristique pour une PNN.
Dans toutes les études, les PNN ont adopté - en milieu D2O - la forme la plus compacte observée dans les milieux H2O (après norm~ tion des valeurs de sé~limto~t~tion pour corriger les différences de densité et de viscosité de l'eau lourde et de ses mélanges).
Dans les donnés complémentaires, non plesenL~es ici, il est observé que la stabilisation à faible force ionique est manifeste à partir d'environ 40% de D2O.
rayon de la première Echantillon[KCI] mM Solvant Valeur s mesure (volr indice) mm A 0 H2O - 63.15 B 5 " 10.2 63.15 C 25 " 11.2 65.43 D 0 D2O 11.0* 63.29 E 25 " 11.2* 63.44 F- A redialysé 0 " 11 0* 63.00 G- C redialysé 0 " 11.1* 63.22 * valeurs corrigées selon viscosité et densité de D2O.
Exemple 3: Stabilisation du vaccin poliovirus Cette stabilisation est effectuée dans les conditions décrites dans les figures 4 à 7.
Les résultats représentés sur les figures 4 à 7 démontrent l'effet stabilisant de l'eau lourde. Quand les poliovirus (Sabin type 1, 2 et 3) sont pl~parés selonles procédures industrielles (dilution d'une suspension virale primaire: fluide surnageant clarifié de cultures de cellules infectées) en remplaçant les solutions WO 94/21298 PCT/FR94/00296 ~
21~14~ 20 d'eau par des solutions contenant D2O, dont la concentration finale est d'environ 90%, les résultats obtenus sont plus marquants que ceux obtenus avec les virus remis en suspension après la centrifugation (voir figs. 1-3).
Exemple 4: Stabilisation du vaccin poliovirus dans différentes solutions contenant de l'eau lourde.
L'addition de D2O se fait au moment de la préparation du mélange de trois vaccins monovalents (Sabin de type 1, type 2, type 3) préparés en solutionaqueuse. La concentration ~male en D2O est de 80%.
L'essai porte sur les formules suivantes:
1. Mélange albumine-MgC12 en solution aqueuse 2. Mélange albumine-MgC12 en solution contenant D2O
3. Mélange acides aminés-MgC12 en solution contenant D2O
4. Mélange acides aminés-saccharose en solution colllenant D2O
Titre global (DICC50/dose) Essais 70C 7j à perte 5j à perte 7j à perte 37C (en 45C (en 45C (en log) log) log) 6,63 5,481,15 3,47 3,16 3,20 3,43 témoin alb.
2 alb. 6,575,90 0,67 4,67 1,90 4,13 2,44 3 A.A. 6,705,95 0,75 4,53 2,17 4,10 2,60 DO
4 6,41 5,341,07 4,04 2,37 3,44 2,97 Sacch.
Exemple 5: Stabilisation du vaccin varicelle Le virus Varicelle est un virus fragile.
La solution stabilisante habituelle du vaccin Varicelle a été ~l~palee en solution aqueuse et en solution contenant de l'eau lourde (D2O), à une concentration de 80%.
WO 94/21298 2 1 S ~ 1 ~ a PCTtFR94/00296 Une récolte de virus a été diluée dans les mêmes proportions avec chacun des stabilisants et Iyophilisée. Les produits Iyophilisés ont été réhydratés dans leur solvant respectif.
Titres (PFU/dose) après réhydratation 2h à 37C
H2O Perte = 0,69 log D2O Perte = 0,37 log PFU = unité con~ nt à la formation de plaque.
les plus typiques sont les complexes des acides nucléiques et les protéines, ou les protéines et les glucides;
un virus est un complexe macromoléculaire composé éventuellement d'acides nucléiques, de protéines, de glucides et de lipides (par exemple, le virus de la grippe ou le virus HIV);
on peut également citer les complexes artificiels, telle qu'une couche lipidique enrobant un agent thérapeutique, ciblé par des activités localisées dans la couche lipidique, ayant une spécificité de liaison avec des composants de la cible visée.
Les compositions pharrn~reutiques impliquées dans la présente invention peuvent être définies par:
A - soit une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), maintenus dans un ou plusieurs véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s), B - soit une ou plusieurs macromolécule(s), et un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), maintenus séparément par rapport à un ou plusieurs véhicule(s) pharm~ceutiqllemPnt acceptable(s), la (les) macromolécule(s), le (les) complexe(s) macromoléculaire(s) et le (les) véhicules pharm~reutiquement acceptable(s) étant destinés à être rassemblés en vue de l'~lmini.~tration à un patient, C - soit au moins deux éléments, maintenus séparément les uns par rapport aux autres, et comportant chacun une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), I'un au moins de ces éléments étant en présence d'un véhicule pharm~reutiquement acceptable conlella~lL de l'eau lourde, ces dir~lenL~ éléments étant destinés à être rassemblés en vue de l'atlmini~tration à un patient, D - soit au moins deux des compositions pharm~re~ltiques selon l'une des variantes A, B, ou C, maintenues séparément l'une par rapport à l'autre et destinPes à être rassemblées en vue de l~imini~tration à un patient.
A titre d'exemple, une composition correspondant au rassemblement en vue de l'atlTnini.~tration à un patient des variantes selon B et C comprend les caractétristiques suivantes:
- d'une part une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s) sont maintenus séparément par rapport à un ou plusieurs véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s), et d'autre part au moins WO 94/21298 2 ~ ~ 814 ~I PCT/FR94/00296 deux éléments sont maintenus séparément les uns par rapport aux autres, et comportent chacun une ou plusieurs macromolécule(s) et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), I'un au moins de ces éléments étant en présence d'un véhicule pharm~ceutiquement acceptable contenant de l'eau lourde, la (les) macromolécule(s), le (les) complexe(s) macromoléculaire(s), le (les) véhicule(s) pharm~reutiquement acceptable(s) et les susdits éléments étantdestinés à être rassemblés en vue de l'a~mini~tration à un patient.
Les macromolécules et/ou les complexes macromoléculaires peuvent être conservés ou non avec le véhicule pharm~reutiquement acceptable contenant de l'eau lourde.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les compositions sont telles que les macromolécules ou les complexes macromoléculaires sont soit en suspension, soit en solution, soit en émulsion dans le véhicule pharm~e~-tique.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de I ' invention, les compositions sont telles que la ou les macromolécule(s) et/ou le ou les complexe(s) macromoléculaire(s) et le véhicule pharm~eutiquement acceptable sont m~intemlc séparément et sont destinés à être rassemblés en vue de mini~tration à un patient.
A titre d'exemple, les macromolécules et/ou les complexes macromoléculaires peuvent être Iyophilisés et mélangés avec le véhicule pharm~-eutiquement acceptable peu de temps avant l'~-lmini~tration à un patient, ou au moment de cette ~iminictration.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans les compositions de l'invention le volume du véhicule pharm~e~tique varie d'environ 0,1 ml à
environ 20 ml, notamment d'environ 0,1 ml à environ 5 ml, et la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire varie d'environ 1,ug à environ 3g.
Selon un mode de réalisation avantageux pour une dose unitaire, la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire est d'environ lO~g pour un volume d'environ 1 ml de véhicule pharrnaceutique.
Selon encore un autre mode de réalisation, dans les compositions de l'invention, le véhicule pharm~re~tique est un mélange H2O-D2O et le rapport en poids entre D2O et H2O varie d'environ 10% à environ 100%, avantageusement d'environ 40% à environ 95%, et de préférence d'environ 80 % à environ 95 % .
En général, les mélanges D2O/H2O, contenant des concentrations élevées en D2O (90-100%), donnent une stabilisation équivalente à une réduction de WO 94/21298 ~ 1 5 ~ ~ 4 ~ PCT/FR94/00296 température ambiante d'un facteur de 4-5C (c'est à dire dans 95% de D2O à
25C - par exemple - une macromolécule subit un effet de dégradation qui équivaut à celui observé normalement dans H2O à 20C).
De plus, les concentrations élevées en D2O offrent une protection importante contre les suites de la cont~min~tion microbienne. Peu de microbes tolèrent les concentrations de D2O dépassant les 70%. Ainsi l'eau lourde est effectivement un milieu auto-stérilisant (à noter, que certaines microbes, généralement non-pathogéniques, peuvent être adaptés à la vie en milieu D2O).
Les compositions de l'invention sont non toxiques. En effet, il est connu que D2O à une concentration inférieure à 10% de l'eau corporelle n'a pas d'effet toxique signific~tif. (Voir A. Barbour, H.G., (1937), Yale J. Biol. Med.9, 551 - B: Barbour, H.G., (1938), Am. J. Cancer, 32, 440- C: Barbour, H.G.
(1938), J. Pharm. Exp. Therap., 62, 158 - D: Barbour, H.G., (1936), J.
Pharm. Exp. Rherap., 58, 460).
Les agents pharmaceutiques susceptibles de bénéficier de ces effets stabilisateurs sont souvent chers et contenus dans des petits volumes (vaccin oral, par exemple 0,15 ml); ainsi le prix relativement élevé de D2O a moins d ' importance.
Comme D2O et H2O sont entièrement miscibles, et comme les atomes d'hydrogène (lH et 2H) labiles s'échangent rapidement, on peut consLater qu' une dose de D20 conle~ un agent plotect~ul ou thérapeutique sera rapidement dispersée dans la masse d'eau corporelle. Avec une abondance naturelle de 0,0156% des atomes d'hydrogène, la masse de d~uleliulll dans une personne de poids de 75kg sera d'environ lg, équivalent à 10g d'eau lourde.
L'~fiminictration des petits doses (par exemple: 0,1 à 5,0 ml) ne dépassera pas la quantité d'eau lourde déjà présente dan le corps d'un adulte. Même les doses très élevées (10 ml à 50 ml) ne contribuent pas à un niveau de d~u~liulll (ellviroll 0,1%) approchant les concentrations toxiques (soit 10% - 20%) ou mortelles ( 25% et plus).
L'eau lourde ne s'arcnmllle pas dans l'org~nicm~ et elle est rejetée dans l'urine, la transpiration et la respiration, au même titre que l'eau.
En résumé, les expériences et les observations licc~-tees démontrent qu'il y a un effet stabilic~tenr pour les macromolécules et leurs complexes, d'environ5C, associé à l'eau lourde. Malgré les changements de température relativement faibles et qui sont de l'ordre de 2C à 5C, les effets co~,~e~aLir~
mentionnés au-dessus peuvent contribuer à une ~llgmPnt~tion importante de stabilité. Les macromolécules et même les org~ni.cm~s vivants (certains microbes, généralement non-pathogéniques, pouvant être adaptés à la vie en Wo 94/21298 ~ PCT/FR94/00296 milieu D2O) ont montré une résistance aux tempél~ules normalement associées (en milieu H2O) à la dénaturation thermale. Certains complexes ont montré une résistance réversible à la désagrégation induite par les solutions de faible force ionique (en H2O, par exemple inférieure à KCl lmM).
Dans les compositions de l'invention, le véhicule pharm~celltique peut contenir un adjuvant de stabilisation, avantageusement MgC12, de la carboxymethyl cellulose, du polyéthylène glycol, des molécules glucidiques, telsque glycérol, glucose, sucrose, (et autres sucres C6), les sucres pentoses et leurs polymères (les amidons par exemple), ces molécules glucidiques pouvant être complexées avec le polyéthylène glycol, le polyéthylène glycol présentant avantageusement un poids moléculaire d'environ 500 à environ 5000 daltons, et notamment d'environ 1000 à environ 5000 daltons.
En application clinique, D2O (et ses mélanges) peut également être utilisé
avec les régulateurs de tonicité, de pH, de viscosité et d'autres agents stabili.~teurs tels que ceux indiqués ci-dessus.
Dans les compositions de l'invention, le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharm~celltique est tel que le véhicule ph~rm~reutirlue ne présente pas une viscosité supérieure à environ 0,2 Pascal-secondes (20 centipoises).
Dans les compositions de l'invention le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule ph~rm~reutique est h~litlll à environ 30%, et est avantageusement d'environ 1% à environ 30%, et de préférence encore d'environ 10% à environ 30%.
Dans les compositions de l'invention les complexes macromoléculaires et les macromolécules sont ceux utilisés:
- dans des compositions vaccil~ s, telles que celles contre la poliomyélite, contre la rougeole, contre l'hépatite, notamment l'h~p~til~ B ou C, contre la grippe, contre le virus du ~ylld~llle immlmo déficitaire acquis (virusdu SIDA ég~lem~nt désigné par HIV = human immllnodeficiency virus), contre la diphtérie, contre le tétanos, contre la coqueluche ou contre une culllbillaison d'au moins deux des susdites pathologies, (par exemple le vaccin contre la diphtérie, le tétanos et la poliomyélite [DTP], ou le vaccin contre la diphtérie, le tétanos, la poliomyélite et la coqueluche, commercialisé sous la marque TETRACOQ, - en tant qu'agent de diagnostic, nola~ ellL pour le diagnostic de la rougeole, de la méningite ou de HIV ou, - en tant qu'agent thérapeutique, tels que des acides nucléiques ou des ribozymes.
Wo 94121298 ~ ~'5 8 14~ PCT/FRg4/00296 L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique de l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- soit la dilution à l'aide de D2O en quantité appropriée, de la susdite composition pharm~eutique se présentant sous forme de solution aqueuse, préalablement concentrée, par exemple à raison de 20 mg/ml, - et/ou la dialyse, contre D20 en quantité applupliée, de la susdite composition pharm~re~ltiqlle se prése~t~nt sous forme de solution aqueuse, - soit la resuspension de la susdite composition pharm~reutique, se présentant sous forme de solide, à l'aide de D2O, en quantité suffl.c~nte pour obtenir la col,ce,~ tion ap~lopliée de la composition pharm~reutique.
On utilise avantageusement la dialyse dans le cas où la composition pharm~reutique contient une substance active fragile, résistant mal aux autres traitements physiques.
L'invention concerne également un procédé de fabrication d'une préparation stabilisée d'origine virale, contenant des complexes macromoléculaires, caractérisé en ce que lesdits complexes macromoléculaires sont mis en solution, suspension ou émulsion dans un milieu contenant de l'eau lourde.
Par ple~ar~tion d'origine virale, on entend notamment - les virus complets, inactivés ou ~tter~l~es, - les protéines glycoprotéines virales, qu'elles soient de surface ou internes et qu'elles soient obtenues à partir de virus ou par recombinaison génétique connue, par exemple la protéine de surface du virus de l'hépatite B, - les vecteurs viraux, tels que les adénovirus, les poxvirus comme le canary pox, ou le virus de la vaccine exprimant les protéines d'origine virale ou bactérienne (voir par exemple le brevet européen: EP 083 286), - les acides nucléiques (ARN ou ADN) encapsulés ou non, connus par exemple sous le nom de "naked DNA" par la demande de brevet européen EP 465 529 (WO 90/11092), ou le brevet américain USP 4 394 448, qui décrit l'encapsulation de l'ADN ou de fragments d'ADN dans des vésicules lipidiques.
L'invention concerne également un procédé de stabilisation d'une préparation vaccinante d'origine virale, notamment d'une suspension virale, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incorporation d'eau lourde:
- soit au virus ou aux cellules à infecter, avant la mise en contact entre les cellules à infecter et le virus, - soit dans le milieu de culture des cellules infectées par le virus, Wo 94/21298 ~ 12 PCT/FR94/00296 - soit dans la préparation vaccinante obtenue à l'issue de l'étape précédente.
L'eau lourde peut être ajoutée à n'importe quelle étape impliquée dans le procédé de préparation de la suspension virale, de préférence après la récupération des particules virales, à l'issue de l'étape de culture des cellules infectées par le virus.
Dans le cas d'un vaccin préparé sous forme Iyophilisée, I'eau lourde peut être utilisée pour la préparation de la suspension virale, avant la lyophilisation et/ou pour la réhydratation du susdit vaccin Iyophilisé. On utilise de préférence l'eau lourde au stade de la réhydratation.
Les vaccins auxquels s'appliquent avantageusement l'invention sont les suivants: grippe, varicelle, rougeole, oreillons, rubéole, dengue, HIV, herpès.
Les exemples cités ci-dessous ont purement une valeur illustratrice, et ne doivent pas être inL~ s comme limit~nt la portée de cette invention.
Ils démontrent:
1:- la thermostabilisation d'un vaccin important;
2:- la stabilisation d'un complexe macromoléculaire modèle, illustrant la réversibilité des effets de thermostabilisation dus à D2O est ses effets isotopes associés.
Ces exemples peuvent être appliqués aux cas suivants:
à un ribozyme, au vaccin recombinant contre l'hépatite B et C, au vaccin contre la grippe, au vaccin contre la rougeole, au vaccin DTP (diphtérie, tétanos, poliomyélite), au vaccin contre le tétanos, au kit pour le fli~gnostic d'HIV.
Il convient de noter que dans ce qui précède et ce qui suit, l'ensemble des documents de la li~Lel~ cités est incorporé par référence.
r~eScription~ des figures:
I ~ figure 1 représente la thermostabilité, à 37C, d'une composition pharmaceutique selon l'invention.
L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la concentration des particules virales (exprimé en unité DICCso/ml, DICCso étant la dose infectieuse cytotoxique dans la cellule).
WO 94/21298 ~ 1 S 81 ~ O PCT/FR94/00296 La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharm~el-ti-lue en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharm~relltique en solution aqueuse, contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharmaceutique de I ' invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharm~reutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant.
T ~ flgure 2 représente la thermostabilité à 42C d'une composition pharmaceutique selon l'invention.
L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au logarithme de la conce~ tion des particules virales (exprimé en unité DICCso/ml).
La courbe représentée par des losanges correspond à une composition pharm~re~ltique en solution ~qllel~e; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharm~re~ltique en solution aqueuse, co,lLe,la MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharm~reutique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 95%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharm~ceutique de l'invention, solubilisée dans D20 et contenant MgC12 (à raison de lM) com~ne adjuvant.
T ~ fi~ure 3 représente la thermostabilité à 45C d'une composition pharm~ceutique selon l'invention.
L'axe des abscisses correspond au temps (exprimé en jours) et l'axe des ordonnés correspond au loga,iLI-",e de la conce~ tion des particules virales (exprimé en unité DICCso/ml).
La courbe représentée par des losanges correspond à une composition ph~ reutique en solution aqueuse; la courbe représentée par des carrés correspond à une composition pharm:lre~ltique en solution aqueuse, contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant; la courbe représentée par des triangles correspond à une composition pharm~rel~tique de l'invention, solubilisée dans de l'eau lourde à 9~%; la courbe représentée par des croix correspond à une composition pharm~reutique de l'invention, solubilisée dans D2O et contenant MgC12 (à raison de lM) comme adjuvant.
wo 94/21298 PCT/FR94/00296 2 ~ 4 T.~ figure 4 représente l'inactivation thermale du poliovirus Sabin de type 3. La concentration initiale du virus est fixée à 5 x 106 DICCso/50~1. (DICCso = dose infectieuse cytotoxique dans la cellule).
Des suspensions du virus de Sabin de type 3 de titres égaux (5 x 106 DICCso/50~1) sont préparés dans les milieux suivants:
a) Dulbecco-MEM dans l'eau normale (correspondant à l'abbréviation "milieu H" sur la figure);
b) Dulbecco-MEM dans D2O de conce~ tion finale 87% (correspondant à l'abbréviation "milieu D" sur la figure);
c) MgC12 lM dans H2O, Tris tamponné à pH 7.2 (correspondant à
l'abbréviation "milieu H-Mg" sur la figure); et d) MgC12 lM dans D2O de concentration finale 87%, Tris tamponné à pH
7.2 (correspondant à l'abbréviation "milieu D-Mg" sur la figure).
Après 3 jours d'inr~lb~tion (partie A de la figure 4) et après 7 jours d'incubation (partie B de la figure 4) à 4C, 37C, 42C et 45C, le type du virus est dételll,i"é. Les résultats sont exprimés comme différence de log de DICCso/SO,ul entre le titre initial du virus m~intPml à -30C et le titre de chaque échantillon. La moyenne et l'erreur standard sont indiqués pour chaque résultat.
r ~ f~ure S représente l'inactivation thermale du poliovirus Sabin de type 1 en présence de D2O et/ou MgC12 (voir détails figure 4). La partie A de la figure S correspond à 3 jours d'incubation, et la partie B de la figure 5 correspond à 7 jours d'incubation.
T ~ fu~ure 6 représente l'inactivation thermale du poliovirus Sabin de type 2 en présence de D2O et/ou MgC12 (voir détails Figure 4). La partie A de la figure 6 correspond à 3 jours d'incubation, et la partie B de la figure 6 correspond à 7 jours d'incubation.
T ~ ~Igure 7 représente la stabilisation du poliovirus Sabin de type 3, avec diverses concentrations d'eau lourde et de MgC12.
~ WO 94/21298 PCT/F R94/00296 15 : . .
On réunit les mêmes conditions expérimentales que celles décrites dans la ~lgure 4, sauf pour la concentration de D2O (partie A de la figure 7) ou MgC12 (partie B de la figure 7).
Les résultats sont exprimés comme différence entre le titre initial de la suspension virale conservée à -30C (log de DICCso/50,ul) et le titre de chacun des échantillons après 3 jours d'inr~lk~tion à 45C. Le titre initial du virus est de 5X106 DICCso/50~1.
T.~ f~ure 8 représente la présence ou l'absence de sédimentation de PNN
(noyau de nucléosome), selon la force ionique de l'eau, et selon la présence ou non d'eau lourde.
La sédimentation des PNN a été faite à pH 7,75 (en milieu de D2O, pH
8,15 selon l'électrode de verre) 0,2mM EDTA, à une force ionique selon le Tableau 1 ci-après. Tr,utes les sédimentations sont faites dans le MSE
CENTRISCAN, ultracenL,irugeuse analytique, dans le rotor comportant 6 cellules de mesure à 50.000 t/mn. Les parties A à C correspondent à un intervalle de mesure de 6 minlltes, les parties D à G correspondent à un intervalle de mesure de 8 mimlt~s, longueur d'onde: 254nm; concellLl~ion des éch~ntillQns: 0,5 à 1,0 mg/ml.
L'axe des abscisses coll~s~olld au rayon de la mesure et l'axe des ordonnés à la concentration en ADN. Cette figure démontre que l'eau lourde consolide les particules de PNN autant que la force ionique.
Therrnostabilisation du poliovirus avec l 'eau lourde L'immlmogénicité des virus atténués dans le vaccin de Sabin contre la polio, dépend de leur degré infectieux au moment de l'~(h"i~ L. ~tion. Les niveaux de prises du vaccin oral contre la polio (OPV) sont liés à la dose de ch~r-lnP des trois souches virales 1, 2 et 3, con~tit~l~nt le vaccin. Une explication pour les niveaux de prises assez bas dans certains pays du tiers t monde, peut être les lU~Lulc~s dans la chaîne du froid avant l'a~lmini~tration du vaccin. La souche 3 du vaccin de Sabin est très critique, à cause de son immllnogénicité et de sa thermostabilité qui sont relativement médiocres.
L'Org~ni~tion Mondiale de la Santé (OMS) demande à ce jour que l'OPV
soit stabilisé par l'addition de MgC12 (concentration 1 M) dans le vaccin. Loin d'être la solution idéale, (perte de moins de 0,5 log d'activité après sept jours à
45C), cette méthode est actuellement le meilleur co~ ,roll,is.
WO 94/21298 2~ 1 5 8 ~ ~ ~ 16 PCT/FR94/00296 Il est démontré ici que selon l'invention, I'eau lourde à 95% offre, même sans aucun autre adjuvant, une stabilisation équivalente ou supérieure à celle offerte par MgC12, en suivant les procédés entièrement standard (à part, bien sûr, le fait d'utiliser l'eau lourde).
Objectifs expérimentaux Toutes les références à l'eau lourde (D2O), dans les exemples ci-après, font référence à l'eau lourde à 95%.
1 Détermination et ql-~ntific~tion des effets de D2O sur la stabilisation du vaccin de Sabin.
2 Comparaison des effets de thermostabilisation de: (a) D2O et (b) D2O
additionné de MgC12.
La souche type 3 est responsable de la plupart des problèmes associés au vaccin de Sabin. Pour cette raison, ce virus a été la cible des études prélimin~ires .
Contexte globale de l'étude sur le vaccin de polio.
Dans l'homme, l'imml-nogénicité de l'OPV est associée au caractère infectieux de la suspension virale. La possibilité que ~lesellle l'OPV de se dégrader dans les régions ayant des tempe~dLuies ambiantes élevées est un problème (voir ci-dessus). Pour l'OMS, le but d'éliminer la polio avant l'année 2000 dépend en partie de l'amélioration des procédés de stabilisation des vaccins actuels (surtout pour les pays en voie de développement).
Les résultats suivants montrent que la souche 3 du vaccin de Sabin, bénéficie d'une stabilisation très marquée dans l'eau lourde à 95% (les autres conditions étant semblables à celles l-tili~ées avec l'eau), sans autre agent destabilisation. L'effet de D20 est lége~ l supérieure à la meilleure des solutions actuelles (MgC12, lM) Méthodes expérin~er~t~es La souche Sabin 3 est choisie comme modèle. La culture des virus est faite selon les procédés classiques.
L'addition d'eau lourde est effectuée en resuspendant le culot de virus (sédimenté dans une ultracentrifugeuse selon les conditions standard) dans D2O
(19 volumes) et un tampon PBS (tampon salin phosphaté) 20 fois concentré (1 volume). L'ultracentrifugation est sans gêne signffil~tive pour les virus. Les ~ WO 94/21298 ~2 ~ 5 ~ 14 ~ PCT/FRg4/00296 études comparatives sont faites avec les milieux standard (H2O, H2O/MgCI2 et MgC12 + D20) La concentration du virus est ajustée à approximativement 101 unités/ml dans D2O à 95%.
Les virus sont soumis à dirrél~nles conditions thermiques selon les courbes montrées ci-après.
virus - tztration Pour tous les échantillons, des dilutions en série sont effectuées (MEM
Eagles avec sels d'Earle, 4%SVF, 3% bicarbonate de sodium, pénicilline, el.Loll~ycine). Une suspension de cellules Hep2C est ajoutée et l'ensemble est incubé à 35C pendant 5 à 7 jours. Les plaques sont colorées avec du "noir de naphtalène" pour évaluer la viabilité des cellules. Les titres sont ensuite calculés. Chaque expérience comporte des contrôles.
Les résultats ci-après concernent la mesure de la stabilité des compositions de l'invention aux trois températures suivantes:
37C, 42C, 45C.
RESULTATS, Jours à 37C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H2O MgC12 D2O MgC12/D2O
2 8.6 9.5 9.6 9.6 7.8 8.1 8.1 8.2 7 6.8 7.5 7.7 7.8 RESULTATS, Jours à 42C Log des unités virales, moyenne de trois éch~ntillons Jours H2O MgC12 D2O MgC12/D2O
2 5.4 8.8 9.4 9.3 3.4 5.4 6.0 6.2 7 2.8 5.2 5.5 5.4 WO 94/21298 ~ i9 18 PCT/FR94/00296 RESULTATS, Jours à 45C Log des unités virales, moyenne de trois échantillons Jours H2o MgC12 D2o MgC12/D2O
2 4.6 7.8 8.5 8.7 1.8 4.8 5.8 6.5 7 0.4 4.7 4.7 4.9 Stabilisation de l 'architecture de la nucléosome par D20 Le noyau de la nucléosome (PNN) est composé de quatre paires de molécules protéiques, les histones H2a H2b, H3 et H4. Chaque octamère de protéine est entouré de 144 paires de base d'ADN, complétant 1,75 tours superhélicale (Noll M. (1974) Nature 251, 249-251; Kornberg R.D. (1974) Science 184, 868-871; Finch J. et al. (1977) Nature 269, 29-35). Gordon a étudié l'effet de la force ionique (en milieu H2O) sur les propriétés de sé-limt~nt~tion de la PNN (Gordon V.C. et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci (USA). 75, 660-663). L'exemple ci-après illustre les différences impolL~ es entre les propriétés de stabilisation de l'eau ordinaire et de l'eau lourde envers la PNN. La PNN peut être considérée comme une sorte de système modèle de la famille des complexes acide nucléique/prol~ille.
Méthodes expénnlent~ 1es La sédimentation des PNN préparées à partir d'éryt'nrocytes de poulet (Suau P. et al (1977) Nuc. Acids. Res. 4, 3769-3786) est étudiée avec l'ultracentrifugeuse analytique (MSE CENTRISCAN) dans plusieurs conditions de force ionique et de concellLl~tions en eau lourde. Plusieurs éch~ntillons en H2O sont après ré-équilibrés dans l'eau lourde en dialysant contre un volume important d'eau lourde, à diverses concel"l~tions et compositions ioniques.
Toutes les solutions sont tamponnées avec 0,2nM EDTA, pH 7,75 (en D20 ajusté à pH 8,15 selon l'électrode de verre). La force ionique a été apportée par KCl.
Rf,~sl~t~t~
La sédilllcl,~tion des PNN est dépendante de la composition ionique de l'eau. Très évidente est la désagrégation des PNN en milieu H2O à faible wo 94/21298 ~ ~ 5 ~ PCT/FR94/00296 p~ s~nre ionique (Fig 4A). Dans l'eau lourde, cette dégradation des PNN ne se manifeste pas (Fig 4D). Même la dépendance ionique de la valeur de sédimentation (en unités Svedburg - s) devient très limitée (Voir Tableau 2 et Fig 4). La PNN désagrégée (4A), après dialyse contre l'eau lourde, redevient une particule discrète avec une sédimentation caractéristique pour une PNN.
Dans toutes les études, les PNN ont adopté - en milieu D2O - la forme la plus compacte observée dans les milieux H2O (après norm~ tion des valeurs de sé~limto~t~tion pour corriger les différences de densité et de viscosité de l'eau lourde et de ses mélanges).
Dans les donnés complémentaires, non plesenL~es ici, il est observé que la stabilisation à faible force ionique est manifeste à partir d'environ 40% de D2O.
rayon de la première Echantillon[KCI] mM Solvant Valeur s mesure (volr indice) mm A 0 H2O - 63.15 B 5 " 10.2 63.15 C 25 " 11.2 65.43 D 0 D2O 11.0* 63.29 E 25 " 11.2* 63.44 F- A redialysé 0 " 11 0* 63.00 G- C redialysé 0 " 11.1* 63.22 * valeurs corrigées selon viscosité et densité de D2O.
Exemple 3: Stabilisation du vaccin poliovirus Cette stabilisation est effectuée dans les conditions décrites dans les figures 4 à 7.
Les résultats représentés sur les figures 4 à 7 démontrent l'effet stabilisant de l'eau lourde. Quand les poliovirus (Sabin type 1, 2 et 3) sont pl~parés selonles procédures industrielles (dilution d'une suspension virale primaire: fluide surnageant clarifié de cultures de cellules infectées) en remplaçant les solutions WO 94/21298 PCT/FR94/00296 ~
21~14~ 20 d'eau par des solutions contenant D2O, dont la concentration finale est d'environ 90%, les résultats obtenus sont plus marquants que ceux obtenus avec les virus remis en suspension après la centrifugation (voir figs. 1-3).
Exemple 4: Stabilisation du vaccin poliovirus dans différentes solutions contenant de l'eau lourde.
L'addition de D2O se fait au moment de la préparation du mélange de trois vaccins monovalents (Sabin de type 1, type 2, type 3) préparés en solutionaqueuse. La concentration ~male en D2O est de 80%.
L'essai porte sur les formules suivantes:
1. Mélange albumine-MgC12 en solution aqueuse 2. Mélange albumine-MgC12 en solution contenant D2O
3. Mélange acides aminés-MgC12 en solution contenant D2O
4. Mélange acides aminés-saccharose en solution colllenant D2O
Titre global (DICC50/dose) Essais 70C 7j à perte 5j à perte 7j à perte 37C (en 45C (en 45C (en log) log) log) 6,63 5,481,15 3,47 3,16 3,20 3,43 témoin alb.
2 alb. 6,575,90 0,67 4,67 1,90 4,13 2,44 3 A.A. 6,705,95 0,75 4,53 2,17 4,10 2,60 DO
4 6,41 5,341,07 4,04 2,37 3,44 2,97 Sacch.
Exemple 5: Stabilisation du vaccin varicelle Le virus Varicelle est un virus fragile.
La solution stabilisante habituelle du vaccin Varicelle a été ~l~palee en solution aqueuse et en solution contenant de l'eau lourde (D2O), à une concentration de 80%.
WO 94/21298 2 1 S ~ 1 ~ a PCTtFR94/00296 Une récolte de virus a été diluée dans les mêmes proportions avec chacun des stabilisants et Iyophilisée. Les produits Iyophilisés ont été réhydratés dans leur solvant respectif.
Titres (PFU/dose) après réhydratation 2h à 37C
H2O Perte = 0,69 log D2O Perte = 0,37 log PFU = unité con~ nt à la formation de plaque.
Claims (13)
1. Composition pharmaceutique stabilisée comprenant une ou plusieurs macromolécule(s) choisie(s) parmi les acides nucléiques, les lipides ou les glucides, et/ou un ou plusieurs complexe(s) macromoléculaire(s), caractérisée en ce qu'elle comprend nd un ou plusieurs véhicule(s) pharmaceutiquement acceptable(s), l'un au moins de ces véhicules contenant de l'eau lourde (D2O).
2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle les complexes macromoléculaires sont choisis parmi les complexes protéines-glucides, protéines-lipides, acides nucléiques-glucides, acides nucléiques-lipides, acides nucléiques-protéines, éventuellement complexés avec des glucides et/ou des lipides, et parmi les virus.
3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les macromolécules ou les complexes macromoléculaires sont soit en suspension, soit en solution, soit en émulsion dans le véhicule pharmaceutiquement acceptable.
4. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la ou les macromolécule(s) et/ou le ou les complexe(s) macromoléculaire(s) et le véhicule pharmaceutiquement acceptable sont maintenus séparément et sont destinés à être rassemblés en vue de l'administration.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le volume du véhicule pharmaceutique varie d'environ 0,1 ml à environ 20 ml, notamment d'environ 0,1 ml à environ 5 ml, et la quantité de macromolécule ou de complexe macromoléculaire varie d'environ 1µg à environ 3g.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le véhicule pharmaceutique est un mélange H2O-D2O et en ce que le rapport en poids entre D2O et H2O varie d'environ 10% à environ 100%, avantageusement d'environ 40% à environ 95%, et de préférence d'environ 80% à environ 95%.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications précedentes, caractérisée en ce que le véhicule pharmaceutique contient un adjuvant de stabilisation, avantageusement MgCl2, de la carboxymethyl cellulose, du polyéthylène glycol, des molécules glucidiques, tels que glycérol,glucose, sucrose (et autres sucres en C6), pentoses et leurs polymères, ces molécules glucidiques pouvant être complexées avec le polyéthylène glycol, le polyéthylène glycol présentant avantageusement un poids moléculaire d'environ 500 à environ 5000 daltons, et notamment d'environ 1000 à environ 5000 daltons.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharmaceutique est tel que le véhicule pharmaceutique ne présente pas une viscosité supérieure à environ 0,2 Pascal-secondes (20 centipoises).
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que le rapport en poids entre l'adjuvant de stabilisation et le véhicule pharmaceutique est inférieur à environ 30%, et est avantageusement d'environ 10% à environ 30%.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à
9, caractérisée en ce que les complexes macromoléculaires et les macromolécules sont ceux utilisés:
- dans des compositions vaccinantes, telles que celles contre la grippe, contre la poliomyélite, contre la rougeole, contre la varicelle, contre les oreillons, contre la rubéole, contre la dengue, contre l'hépatite, notamment l'hépatite B ou C, contre le virus du syndrome immuno déficitaire acquis (virus du SIDA), contre la diphtérie, contre le tétanos, contre la coqueluche ou contreune combinaison d'au moins deux des susdites pathologies, ou - en tant qu'agent de diagnostic, tel que pour le diagnostic de la rougeole, de la méningite ou de HIV ou, - en tant qu'agent thérapeutique, tels que des protéines, le facteur VIII, des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des hormones, des acides nucléiques ou des ribozymes.
9, caractérisée en ce que les complexes macromoléculaires et les macromolécules sont ceux utilisés:
- dans des compositions vaccinantes, telles que celles contre la grippe, contre la poliomyélite, contre la rougeole, contre la varicelle, contre les oreillons, contre la rubéole, contre la dengue, contre l'hépatite, notamment l'hépatite B ou C, contre le virus du syndrome immuno déficitaire acquis (virus du SIDA), contre la diphtérie, contre le tétanos, contre la coqueluche ou contreune combinaison d'au moins deux des susdites pathologies, ou - en tant qu'agent de diagnostic, tel que pour le diagnostic de la rougeole, de la méningite ou de HIV ou, - en tant qu'agent thérapeutique, tels que des protéines, le facteur VIII, des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des hormones, des acides nucléiques ou des ribozymes.
11. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- soit la dilution à l'aide de D2O de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse préalablement concentrée, par exemple à raison de 20 mg/ml, - et/ou la dialyse contre D2O de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse, - soit la resuspension de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solide, à l'aide de D2O en quantité
suffisante pour obtenir la concentration appropriée de la composition pharmaceutique.
- soit la dilution à l'aide de D2O de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse préalablement concentrée, par exemple à raison de 20 mg/ml, - et/ou la dialyse contre D2O de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solution aqueuse, - soit la resuspension de la susdite composition pharmaceutique se présentant sous forme de solide, à l'aide de D2O en quantité
suffisante pour obtenir la concentration appropriée de la composition pharmaceutique.
12. Procédé de préparation d'une composition stabilisée contenant des complexes macromoléculaires d'origine virale, caractérisé en ce que lesdits complexes macromoléculaires sont mis en solution, suspension ou émulsion dans un milieu contenant de l'eau lourde.
13. Procédé de stabilisation d'une préparation d'origine virale, éventuellement vaccinante, notamment d'une suspension virale, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incorporation d'eau lourde:
- soit au virus ou aux cellules à infecter avant la mise en contact entre les cellules à infecter et le virus, - soit dans le milieu de culture des cellules infectées par le virus, - soit dans la préparation vaccinante obtenue à l'issue de l'étape précédente.
- soit au virus ou aux cellules à infecter avant la mise en contact entre les cellules à infecter et le virus, - soit dans le milieu de culture des cellules infectées par le virus, - soit dans la préparation vaccinante obtenue à l'issue de l'étape précédente.
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