CA2174232A1 - Therapie genique de la restenose au moyen de vecteur adenoviral - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une méthode pour le traitement de la resténose par la thérapie génique, comprenant l'administration d'un adénovirus recombinant comportant un gène suicide.

Description

~ WO 96/05321 r ~ ~ S 2 1 7 4 2 3 2 PCTJFRgS/0l074 THERAPIE GENIQUE DE LA RESTENOSE AU MOYEN DE VECTEUR ADENOYIAL

La présente invention concerne une méthode pour le tr~itemP.nt de la resténose par la thérapie génique, con~prellallL l'~-~mini~tration d'un adénovirus 5 recolllbillallL comportant un gène suicide. Elle concerne ég~lPmP.nt des compositions pharm~ce~ltiques particulières permettant l'~mini~tration locale et ~ffic~ce des virus recG,I,b"~allLs .
L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépôts (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et 0 d'autres dérivés s~n~in~ dans la paroi des grosses artères (aorte, artères colonailes, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelees à des lésions et sont liées à l'accum~ tion dans les artères de dépots graisseux constitués eSsenti~llPment d'esters de cholestérol. Ces plaquess'accomp~gnent d'un épai~ic~Pmçnt de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle 5 lisse, apparition de cellules spume~-.ses et acc~m~-lation de tissu fibreux. La plaque athérom~te...~e est tres nett~mPnt en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus ~ttçintC Ces lésions peuvent donc conduire à
des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, 20 I'in.cllffi~nce cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, etc.
Depuis 1977, la technique d'angioplastie a été développée pour permettre une intervention non chirurgicale au niveau de la plaque d'athérosclérose. Cependant, le tr~ite.mPnt d'une lésion athéroscleuse par angioplastie résulte de façon très fréquente (jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en une resténose consécutive à la blessure 25 méc~nique de la paroi artérielle. Un éVPnPmPnt clef de ce meC~ lle est la prolifération et la migration des cellules m--.ccul~ires lisses vasculaires (CMLV) de la média vers l'intima, not~mmPnt du fait de l'absence de protection et/ou de rétrocontrôle exercé par les cellules endothéliales de l'intima.

Le traitement de la resténose par ~mini~tration de substances chimiques ou protéiques capables de tuer les cellules mllcc~ ires lisses vasculaires a été proposé
dans l'art antérieur. Ainsi, des dérivés de psolarènes, incorporés par les cellules prolifératives et sensibilisant alors ces cellules a l'action de la lumière, ont été utilisés (March et al, 1993, circulation, 87:184-191). De même, certaines c~lolo~ es

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con.~titnéeS d'une protéine de fusion entre un fragment de toxine de plante ou bactérienne et un facteur de croissance ont également été lltili~ées (Pickering et al, J.
Clin. Invest., 1993, 91:724-729; Biro et al, 1992, Circ. Res., 71:640-645; Casscells et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992, 89:7159-7163). Cependant, ces traitemçnts présentent de nombreux inconvénients, tels que leur faible spécifiçité, leur efficacité
moyenne, un délai d'action important et une toxicité pot~nti~lle.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ce problème. La présente invention fournit en effet une méthode particulièrement efficace et sélective pour le traitement de la resténose post-angioplastie par la thérapie génique. La0 méthode de la présente invention consiste principalement à ~mini.strer un adénovirus recombinant comportant un gène suicide, capable de sensibiliser spécifiquement les cellules m~sc~ ires lisses vasculaires en prolifération à un agent thérapeutique.
L'a~mini.ctration ~imlllt~née ou subséquente de cet agent thérapeutique.entraine alors la mort sélective des cellules sensibilisées.
Les avantages de la présente invention résident not~mment dans la forte capacité des adénovirus de l'invention à infecter les cellules mllsc.lll~ires lisses vasculaires en prolifération. Ceci permet d'utiliser des qll~ntités relativement faibles de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace et très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à très hauts niveaux les gènes suicides introduits, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché. Enfin, la demanderesse a également mis au point une méthode d'~rlmini~tration particulièrement 2s avantageuse qui permet d'infecter avec une grande efficacité certaines cellules cibles essentielles à l'effet thérapeutique recherché.

Un premier objet de l'invention concerne donc l'utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharm~ceutique destinée au traitement de la resténose.

Comrne indiqué ci-avant, on entend au sens de la présente invention par gène suicide tout gène dont le produit d'expression confère à la cellule infectée unesensibilité à un agent thérapeutique. A titre d'exemple, on peut citer le gène de la 3s thymidine kinase, dont le produit d'expression confère aux cellules m~l.,,,;~ères une 2~ 74232 WO 96/05321 ,~ PCT/FR95/01074 sensibilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir, ou le gène de la cytosine dés~min~ce~ dont le produit d'expression confère aux cellules m~""";reles une sensibilité à la 5-fluoro-cytosine (5-FC).
La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler 5 les analogues de m1cléosi(les tels que l'acyclovir et le ganciclovir. Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaine d'ADN en cours d'élongation, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276). Cette stratégie permet ainsi d'é.limin~r spécifiquement les cellules exprimant le gène TK. De plus, la synthèse d'ADN étant la o cible de la toxicité, seules les cellules en cours de division sont affectées.Plus prérélel~liellement~ on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1). La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al., Nucleic Acid. Res. 8 (1980) 5931). Il est également possible d'utiliser des dérivés de ceMe 5 séquence présent~nt une plus grande spécificité de substrat ou une meilleure activité
kinase. De tels dérivés peuvent en particulier être obtenus par mutagénèse au niveau du site de liaison comme décrit précédemment (Balasubr~m~ni~m et al., J. Gen. Virol.
71 (1990) 2979; Munir et al., JBC 267 (1992) 6584).

Il est egalement possible d'utiliser le gène de la cytosine dés~min~ce, dont le produit d'~ ession confère aux cellules m~"~ ;rères une sensibilité à la 5-fluoro-cytosine (5-FC). La cytosine dés~min~ce est capable de catalyser la cles~min~tion de la cytosine en uracile. Les cellules qui expriment ce gène sont donc capables de convertir la 5-fluoro-cytosine (5-FC) en 5-fluoro-uracile (5-FU), qui est un métabolite toxique.
2s La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (Anderson et al. Arch.
Microbiol. 152 (1989) 115).
Plus généralement, tout gène capable de conférer aux cellules infectées une sensibilité à un agent thérapeutique peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. Le gène de la thymidine kinase constitue un mode de réalisation particulièrement av~nt~gellx.
Pour la construction des adénovirus selon l'invention, différents sérotypes peuvent être utilisés. Il existe en effet de nombreux sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfèrecependant utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus hllm~in.c de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir dem~nde FR 93 ~ ~ s ~ t 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple:
Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De p,~rérence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus s canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De l~r~r~lel,ce, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Comme indiqué ci-avant, les adénovirus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.
o Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et not~mmerlt par le gène suicide. P,éfélel1liellement, l'adénovirus défectif conserve 5 néanmoins les séquences de son génome qui sont necessaires à l'encapsidation des particules virales.
P,~rére"liellement, les adénovirus défectifs de l'invention cor"prennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et le gene suicide. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au 20 moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré
peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et not~mm~nt par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des 25 techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes.
Plus prérei enliellement on utilise un adénovirus défectif, rendu non fonctionnel par une délétion totale ou partielle de la région El et une délétion dans la région E4. La région E4 comprend 7 phases de lecture. La délétion dans la region E4 peut être transcomplémentée par la présence, dans la lignée cellulaire servant à la 30 multiplication des virus, soit simplement de la phase de lecture 0RF6 soit des phases de lecture 0RF6 et 0RF6/7.
Les adénovirus préférés selon l'invention sont choisis parmi les suivants:
-Adénovirus recombinant défectif ~E1, ~E4 comprenant une délétion de tout ou partie de la région E1 et une délétion de tout ou partie de la région E4.

~ WO 96/05321 ~ t ~ I S 2 1 7 4 2 32 PCT/1;~95101074 -Adénovirus recombinant défectif ~El, ORF3-, ORF6-, comprenant une délétion de tout ou partie de la région E1 et des nucléotides 34801-34329 et 34115-33126 de la région E4.
-Adénovirus recombinant défectif ~El, ~E4, ORF1+ comprellallL une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF1. Plus spécifiquement la délétion dans la région E4 a son t;xlli;lllilé 5' comprise dans la phase de lecture ORF7 et son ~xll~llliLé 3' comprise dans la phase de lecture ORF2. Par exemple dans la région couvrant les nucléotides 33093-35053.
0 -Adénovirus recombinant défectif ~El, ~E4, ORF4+ conlplenan~ une délétion de tout ou partie de la région E 1 et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF4. Plus particulièrement deux délétions sont faites, I'une dont l'~xLl~lllilé 5' est comprise dans la phase de lecture ORF7 et dont l'~xlli;lllilé 3' est située dans la phase de lecture ORF6, I'autre dont l~ én~ilé 5' est comprise dans la phase de lecture ORF3 et dont 1~ll8lll;lé 3' est située dans la phase de lecture ORFl ou dans la région promotrice de E4. Par exemple une délétion couvrant les nucléotides 33093-33695 et une délétion couvrant les nucléotides 34634-35355.
-Adénovirus recombinant défectif ~El, ~E4, comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion couvrant la totalité de la région E4 chiosie par exemple parmis les déletions suivantes: nucléotides 32720-35835, ou 33466-35355, ou 33093-35355.
La construction de ces vecteurs est décrite dans les brevets nQ FR 9500749 et nFR 9506532 Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent 8tre préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène suicide. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire applup.iée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome del'adénovirus défectif, de pr8rélellce sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de reinembryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus WO 96tO5321 ~ S 2 1 7 4 2 3 2 PCT/IiR95/01074 ~

Ad~ (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les dem~n~es n FR 93 05954 et FR 93 08596.
Fncllite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selonles techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
s Avantage~lc~m~nt dans les adénovirus de l'invention, le gène suicide est placé
sous le controle d'un promoteur permettant son ~,spl-ession dans les cellules in~ectées.
Il peut s'agir du propre promoteur du gène suicide, d'un promoteur hétérologue ou d'un promoteur synthétique. Notamment, il peut s'agir de promoteurs issus de genes lO eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences 5 d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules mllsclll~ires lisses vasculaires, de manière à ce que le gène suicide ne soit exprimé et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule m~lcclll~ire lisse vasculaire. Parmi les 20 promoteurs actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules mll.cclll~ires lisses vasculaires on peut citer not~mment le promoteur de l'actine a du muscle lisse.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un adénovirus recombinant defectif comprenant un gène suicide sous le contrôle d'unpromoteur viral, choisi de plérerence parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du 25 CMV.
Selon un autre mode avantageux, il s'agit d'un promoteur actif spécifiquement ou majoritairement dans les cellules mll.ccul~ires lisses vasculaires.

La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace 30 pour le traitement de la resténose. Par ailleurs, pour ~ugmçnter encore l'efficacité et la spécificité du traitement, la dem~n(leresse a mis au point une méthode permettant une a~lmini~tration locale des adénovirus recombinants au niveau des sites à traiter. Plus particulièrement, cette méthode repose sur l'~ltili.c~tion d'un ballon d'angioplastie enrobé d'un film hydrophile (par exemple un hydrogel) imbibé d'adénovirus, qui peut ~ WO 96/05321 r ~ 2 1 7 4 2 3 2 PCT/FR95/01074 ainsi être appliqué de manière précise sur le site à traiter, et permettre une libération locale et efficace des adénovirus au niveau des cellules à traiter.
En outre, la dçm~n~resse a montré que, sur des artères saines, cette méthode d'a~mini~tration permettait d'infecter un pourcentage élevé de cellules de la média 5 Gusqu'à 9,6%), qui sont les cibles les plus logique pour la prévention de la resténose.
De manière tout à fait avantageuse, la d~m~n~eresse a également montré que les virus et la méthode selon l'invention permettaient un transfert efficace et sélectif de gènes dans une artère athérom~te~e. Plus particulièrement, la d~n~n~çresse a démontré pour la première fois la capacité des adénovirus de transférer un gène o thérapeutiquement efficace dans une artère athérom~tel-~e. Ceci est tout à fait essentiel puisque l'efficacité thérapeutique du traitement de la resténose passe par la démonstration de la capacité à transférer le gène thérapeutique, dans les bonnescellules et avec une efficacité appropriée, dans les conditions physiopathologiques. Les artères athéromateuses sont caractérisées par la présence au niveau de l'intima (i) de 5 dépots de matrice extracellulaire, (ii) de dépots lipidiques constitués essentiellement de cellules spumeuses de type macrophagique et (iii) de cellules musculaires lisses en prolifération.
Les résultats présentés ci-après montrent que, dans ces artères athéromateuses, les virus selon l'invention permettent un pourcentage d'infection 20 moindre mais d'une plus grande spécificité (compte tenu de fait de la présence de cellules de type macrophagique dans ce cas, les cellules macrophagiques n'étant pas transduites) et s'accompagn~nt d'une efficacité thérapeutique importante. Les résultats obtenus montrent notamment un transfert très sélectif de l'adénovirus dans les cellules cibles, c'est à dire les cellules mll.ccul~ires lisses en prolifération. Sur l'ensemble de la 25 population cellulaire présente au niveau de la zone athérom~tel-~e, plus de 95% des cellules infectées sont des cellules ml~sclll~ires lisses vasculaires. Ainsi, les cellules macrophagiques présentes au niveau de l'intima ne sont pas infectées du tout (aucune cellule macrophagique infectée n'a été détectée). S'agi.~s~nt des cellules mllccul~ires lisses en prolifération (dans la néointima), le traitement selon l'invention permet 30 d'infecter un pourcentage inférieur à 1% (0.2% par exemple). Ceci est bien inférieur aux résultats décrits antérieurement dans des artères saines ou présentant des lésions de la paroi mais qui ne représentent pas une situation physiopathologique de la resténose (abrasion endothéliale d'une artère saine). La dem~nderesse a également montré que l'infection de ce faible pourcentage de cellules permettait néanmoins un 35 effet thérapeutique important, mis en évidence notamment par la mesure du diamètre WO 96/OS321 ~ f . ~ 2 1 7 4 2 3 2 PCT/1i~95/01074 ~
. . .

Illmin~l Ce résultat est particulièrement surprenant et implique l'existence d'un effet cytotoxique induit (effet "by-stander") in vivo. L'invention décrit donc pour lapremière fois une méthode permettant le transfert sélectif de genes dans les cellules mll.ccul~ires lisses vasculaires en prolifération dans une artère athérom~te ~se5 col,lprena~ lmini.~tration dans ladite artère d'un adénovirus recombinant défectif contenant ledit gène au moyen d'un cathéter à ballonet d'angioplastie. Le terme transfert sélectif implique un transfert essentiellement dans les cellules mll.ccl-l~ires lisses vasculaires en prolifération et pas de transfert dans les cellules macrophagiques en~hu~ es Cette méthode permet un trait~ment de la resténose par transfert d'un o gène suicide tel que le gène TK puis traitement par le gancyclovir ou l'acyclovir par exemple. Cette méthode de traitement est en outre caractérisée par un effet de toxicité
induite in vivo.
Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharm~ce~tique complellant un adénovirus recombinant défectif et un hydrogel. Plus 5 spécifiqllçment, I'invention conceme une composition coml), e"an~ un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide, et un hydrogel. L'hydrogel utilisé
dans le cadre de la présente invention peut etre préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non c~totoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande W093/08845. Certains d'entre eux, comme 20 not~mmçnt ceux obtenus a partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux.

La méthode de traitement de l'invention consiste donc avantageusement à
introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant un hydrogel imbibé
25 d'adenovirus recombinants. L'hydrogel peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale. Avantageusement, I'hydrogel être introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un c~théter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, notamment lors de l'angioplastie, ce qui permet d'éviter tout tr~lm~ti.~me supplémentaire du à une nouvelle intervention au site d'angioplastie. De 30 manière particulièrement avantageuse, I'hydrogel imbibé est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet, protégé par un manchon. Comme décrit dans les exemples, I'hydrogel présente de nombreux avantages: il permet d'ameliorer le glissement du ballonnet ce qui lui permet de passer par des artères fortementsténosées. De plus l'hydrogel est utilisable avec n'importe quel type de ballonnet 35 d'angioplastie ce qui permet en particulier d'utiliser des ballonet à perfusion. Ainsi, ~ wo 96/05321 S ~ r~ ~ ~ S 2 1 7 4 2 3 2 PCT/FRg5/01074 selon un mode particulier de réalisation, les adénovirus selon l'invention sont af~mini~trés au moyen de ballonnets a perfusion, en particulier de c~theters à ballonnet à canaux ("ch~nnPlled balloon angioplasty cathéter", Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA). Ce dernier est constitué d'un ballonnet 5 conventionnel recouvert d'une couche de 24 canaux perforés qui sont perfusés par un lumen indépendant à travers un orifice d'infusion supplémPnt~ire.Ces ballonnets à
perfusion qui permettent de m~intenir un flux sanguin et ainsi de ~liminuer les risques d'i.cchémie du myocarde, lors du gonflement du ballonnet, permette.nt ég~lemPnt de délivrer localement un médicament a pression normale, pendant un temps relativement 0 long, plus de vingt minlltes7 qui est necessaire pour une infection optimale.
Il est particulièrement interessant d'utiliser un cathéter à ballonnet à perfusion enrobé d'hydrogel. Dans ce cas on cumule les avantages des deux c'est à dire; lapossibilité de garder le ballonnet gonflé pendant une période de temps plus longue tout en gardant les propriètés de glissement facilité et de site-spécificité de l'hydrogel. On 15 obtient dans ce cas une efficacité d'infection optimale.
Les résultats présentés dans les exemples démontrent en effet l'efficacité de ce système pour le transfert percutané de gènes dans les parois artérielles.
Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharm~ceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif et du poloxamère.
20 Plus spécifiquempnt~ l'invention concerne une composition comprenant un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide, et du poloxamère. Le poloxamère407 est un polyol biocompatible non toxique, il est disponible dans le commerce (BASF, Parsippany, NJ).
Une méthode de traitement de l'invention consiste donc avantageusement à
2s introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant du poloxamère imbibé d'adénovirus recombinants. Le poloxamère peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale.
Avant~ge~ls~.ment le poloxamère être introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, not~mment lors de l'angioplastie, 30 ce qui permet d'éviter tout tr~llm~ti~me supplémçnt~ire du à une nouvelle intervention au site d'angioplastie. De manière particulièrement avantageuse, le poloxamère imbibé
est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet, protégé par un manchon. Le poloxamère présente essentiellement les mêmes avantages que l'hydrogel tout en ayant un viscosité moindre.

WO 96/OS321 ''~ 2 1 7 4 2 3 2 pCrlFR9'~/01074 Il est particulièrement intéressant d'utiliser un catheter à ballonnet à perfusion enrobé de poloxamère en particulier de cathéters à ballonnet à canaux. Dans ce cas on cumule les avantages des deux c'est à dire; la possibilité de garder le ballonnet gonflé
pendant une période de temps plus longue tout en gardant les propriétés de gli.~se.ment 5 facilité et de site-spécificité du poloxamère. On obtient dans ce cas aussi une efficacité
d'infection optimale.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non l;.~ ;rx o Le~ende des fi~ures Figure 1: Re~rese,l~a~ion du vecteur pONT-tk Figure 2: Représçnt~tiQn du vecteur pRSV-tk Figure 3: Effet cytotoxique de la combinaison ganciclovir/Ad-LTR-tk sur cellulesmusculaires lisses en culture.
1~ Figure 4: Réduction de la resténose par transfert adénoviral du gène tk et 7~tlmini.ctration de ganciclovir.
Techninues ~énérales de bioloYie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions p,~pal~Li~es d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en 20 gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fra~m~nt~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abon~ment décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragmentc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorese en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~tions du fournisseur.

~ wo 96/0S321 ~ 4 ~ i ~ 2 1 74 232 PCT~5/01074 Le remplissage des ~ é-"i~és 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécific~tions du fournisseur. La destruction des e~Ll-enliLés 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n-l~tions dus fabricant. La destruction des e~ Il~ilés 5' proéminentes est effectuée par un tr~it~ment ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en lltili.c~nt le kit distribué par Amersham.
0 L'amplification enzymatique de fragment~ d'ADN par la technique dite de PCR
[Polymérase-catalyzed Chain_eaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples Exemple 1. Construction du vecteur Ad-LTR-TK portant le gène TK sous le contrôle du promoteur du LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV) (figure 1).
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un promoteur viral (promoteur LTR-RSV). Cet adénovirus a été construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-dll324 et le pl~.~micle pRSVtk portant le gène tk sous controle du promoteur RSV (exemple 1.3.). Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.1.), par substitution du promoteur transactivable par EBNAl par le promoteur RSV (exemple 1.2.).
1.1. Construction du plasmide pONTtk a) Construction du plasmide p7tkl Wo 96/05321 ~ ~ l 2 1 7 4 2 3 2 PCT/FR95101074 ~

Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1131 paires de bases (ATG 114-116 et codon stopTGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage.
Le fragment BglII-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus herpès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenow puis inséré au site SmaI du plasmide pGEM7zf~+) (commercialisé par Promega). Les sites SmaI et BgIII sont détruits lors de cette étape, le site NcoI est conservé.
Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl.

b) Construction du plasmide pONTI
Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence nécessaire a la transactivation par l'antigène EBNAl et du promoteur TPl du virus EBV.
Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8. La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al.
(Nature 310 (1984) 207). Ce fragment contient les séquences néceC.~ires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNAI) (D. Reisman & B. Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol. 6 pp. 3838-3846). Ce fragment a ensuite étéfusionné au fragment NruI(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été
digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TPI. Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II
SK pour générer le plasmide pONTl.
c). Construction du plasmide pONTtk Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) cloné dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNAl-RE/TPl cloné dans le plasmide pONT1.
Pour construire ce pl~midç, le fragment BamHI-XhoI de pONT1 qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-l et EBNA-2, et le fragment XhoI-ClaI de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clonés aux sites BamHI (478) et ClaI (4550) du plasmide pAd.RSVbgal. Le plasmide pAd.RSVbGal contient, dans l'orientation 5'->3', - le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus AdS
co.llprenant: la séquence ITR, I'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplific~teur ElA;

wo 96/05321 ~ S ~ 1 t ~ 2 1 7 4 2 3 2 PCT/FR95/01074 - le gène codant pour la b-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous), - un second fragment du génome de l'adénovirus AdS, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324. Le plasmide pAd.RSVbGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné
pONTtk.
1.2. Construction du plasmide pRSVtk 0 Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.1.), par substitution du promoteur transactivable par EBNAI par le promoteur RSV. Pour cela, le promoteur RSV a été isolé sous forme d'un fragment BamHI-SalI a partir du plasmide pAd.RSV.Bgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), puis cloné aux sitesBamHI(478) et SalI(1700) du plasmide pONTtk. Le plasmide résl-lt"nt a été désigné pRSVtk (figure 1).

1.3. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-RSV-tk Le vecteur pRSVtk a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions E 1 (E 1 A et E 11 B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-RSV-tk a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimm"l~paya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pRSVtk, selon le protocole suivant: le plasmide pRSVtk, linéarisé par XrnnI, et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-tr~n~fectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour pellllc;llle la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été
sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, I'ADN de l'adénovirusrecombinant a été amplifie dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre - 30 d'environ 101 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient dechlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-RSV-tk peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.

WO96/0532~ 2 1 74232 PCT~g5/01074 F,Y~mple 2: Activité d'un adenovirus selon l'invention en présence de ganciclovir sur les cellules m~ cnl~ires lisses en culture.

L'activité de l'adénovirus contenant le gène TK préparé dans l'exemple 1 a été
s contrôlée sur des modèles in vitro de cellules mllcc.lll~ires lisses. Pour cela, les cellules mll~clll~ires lisses isolées à partir d'aorte de rat et de lapin ont été infectées par l'adénovirus recombinant Ad-RSV-tk, et incubées en présence de ganciclovir. L'effet de la combinaison Ad-RSV-tk/ganciclovir sur la viabilité cellulaire est ensuite confirmé
par test colorimétrique MTT, 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide, selon la technique décrite par Mosman (J Tmmllnol.Meth 65 (1983) 55), ou de manière plus précise par comptage cellulaire.
Brièvement, les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont mises en culture par digestion enz~matique d'aorte de lapin NZW selon une méthode adaptée de Chamley et al. (Cell Tissue Res. 177: 503-522 1977). Les cellules sont m~intenlles en 1S présence de 20% de sérum de veau foetal et utilisées pour l'ensemble des tests (cf.
infra) avant le dixième passage. Dans l'ensemble de nos expériences, les cellules mllsc~ ires lisses sont caractérisées par immunnmarquage à l'aide d'anticorps anti-aSM-actine (Sigma).
Afin de mesurer l'activité cytotoxique de la combinaison Ad-RSV-20 TK/ganciclovir, les CMLV d'aorte de lapin sont incubées en présence de l'adénovirusdilué dans du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF). Apres environ une heure à 37C
en atmosphère humide, le milieu contenant la solution adénovirale est aspiré et remplacé par du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF) pour une période de 18 à 24 heures. Différentes concentrations de ganciclovir sont alors ajoutées dans un milieu 25 riche en SVF (10%). Quatre jours après l'addition du ganciclovir, les cellules sont dénombrées (100% de la viabilité cellulaire correspondant aux cellules non tr~n.c~l~ites par Ad-RSV-TK et non traitées par le ganciclovir).
La combinaison Ad-RSV-TK/ganciclovir induit un effet cytotoxique vis-à-vis des CMLV de lapin (cf. Figure 3). Cette cytotoxicité varie en fonction de la 30 concentration de ganciclovir et de la multiplicité d'infection d'Ad-RSV-TK. Dans nos conditions expérimentales i.e. quatre jours d'incubation en présence de 10% SVF, la combinaison Ad-RSV-TK (M.O.I. 1000)/ganciclovir (25 ~LM) entrâîne une cytolyse totale. Dans ces conditions expérimentales où une forte multiplicité d'infection permet de transduire la majorité des cellules, la CI50 est 0,3 IIM. A faible multiplicité
d'infection (M.O.I. 10), la CI50 est inférieure à 5 IlM. Ainsi, les concentrations de Wo 96/05321 ~ S 4 ~ ~ S 2 1 7 4 2 3 2 PCT/liR95/01074 ganciclovir actives in vitro, sur CML, sont compatibles avec une utilisation thérapeutique. En effet, chez les patients traités pour infection virale par une dose non toxique de ganciclovir, il est possible d'atteindre des concentrations pl~m~tiques supérieure à 15 ,uM (Paul et Dummer, Am.J.Med.Sci. 4: 272-277, 1992).
En outre, cette étude in vitro démontre qu'il est possible d'induire un effet cytotoxique majeur en dépit d'un faible pourcentage de tr~n~ ction par l'adénovirus Ad-RSV-TK. La présence de la protéine HSV-TK a été mise en évidence par immllnofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques de HSV-TK (anticorps monoclonal 4C8, Yale University). Dans les CMLV de lapin (et o hl]m~ines) traitées par Ad-RSV-TK, la localisation de la protéine TK est cytoplasmique mais également nucléaire. Nous avons ainsi montré que l'utilisation d'une multiplicité d'infection de 10 est associée à une transduction de moins de 5% des CMLV. De manière générale, à multiplicité d'infection équivalente, le pourcentage de cellules transduites par Ad-RSV-TK est similaire à celui obtenu à l'aide d'un adénovirus contrôle codant pour la 13-galactosidase (ex.: plus de 90% de cellules transduites à multiplicité d'infection 1000). Ces données démontrent donc que latransduction de moins de 5% de CMLV entraine une cytotoxicité importante en présence d'une concentration optimale de ganciclovir (cf. figure 3: baisse de 80% de la viabilité cellulaire à 25 ~lM). L'immllnodétection de la protéine HSV-TK illustre donc l'importance de l'effet "bystander" observé sur les CMLV traitées par la combinaison Ad-RSV-TK/ganciclovir. Cet effet "bystander" peut avoir sa contrepartie in vivo. En particulier, ces données suggèrent fortement qu'un transfert limité
d'adénovirus Ad-RSV-TK, not~mm~n~ dans une artère pathologique, peut aboutir à
une réduction significative de la masse néointimale, riche en CML et responsable de la resténose chez le patient.
D'autre part, I'effet cytolytique est sélectif puisque ni le simple traitement par ganciclovir ni la tr~n~dl-ction par Ad-RSV-TK per se n'est associé à une mort cellulaire. La cytotoxicité de l'association Ad-RSV-TK/ganciclovir a été confirmée par le test colorimétrique MTT.
Enfinl des résultats similaires, à savoir une toxicité sélective en présence de ganciclovir et d'adénovirus, ont été observés sur culture primaire de cellules mllsc~ ires lisses h~lm~lnes.
Ces données mettent donc en évidence le blocage efflcace de la prolifération de CMLV i~7 vifro par Ad-RSV-TK.

Wo96/05321 ~ C ~ 5 2 1 74232 PCT/FR9S/01074 ~

Exemple 3: Transfert artériel d'un adénovirus recombinant par voie percutanée Cet exemple décrit la mise au point d'une technique particulièrement efficace pour le transfert de gènes par voie percutanée. Cette technique repose sur l'utilisation s d'un cathéter à ballonet à hydrogel. Les résultats présentés montrent que, de manière tout à fait avantageuse, cette technique permet d'infecter effic~cem~nt certaines populations cellulaires provilégiées, not~mment pour le trait~m~nt de la resténose.

Cet exemple a été réalisé au moyen d'un adénovirus recombinant défectif 0 comprenant le gène de la 13-galactosidase d'E.coli sous le contrôle du promoteur du RSV-RSV et d'un signal de localisation nucléaire. La construction de cet adénovirus a été décrite notamment dans Stratford-Perricaudet et al., (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).
Les expériences ont été réalisées sur des lapins blancs de Nouvelle Zélande anesthésiés à l'acépromazine et maintenus sous pentobarbital. Le transfert de gène a été effectué au niveau de l'artère iliaque externe.
L'adénovirus Ad-RSV.13-Gal (1-2.101 pfu dans 100 Ill de tampon phosphate) a été déposé sur un cathéter à ballonnet préalablement enduit d'hydrogel (Hydroplus, Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA) (Riessen et al., Hum.Gene Ther. 4 (1993) 749). Le cathéter utilisé est un cathéter à ballonnet de 2 cm de longueur, et de diamètre compris entre 2,5 et 3 mm. Le cathéter a ensuite été
introduit, en utili~nt un manchon protecteur, dans l'artère fémorale droite. Unepression de une atmosphère a ensuite été appliquée, puis le cathéter a été dirigé jusqu'à
l'artère iliaque externe où une pression de 6 atmosphère a alors été appliquée au ballonnet pendant 30 mimltes Cette expérience a été réalisée sur 27 lapins. 3 à 28 jours après l'administration, les animaux ont été sacrifiés par overdose de pentobarbital.

Transfert et expression du gène dans la paroi artérielle Les arteres des animaux sacrifiés ont été isolées, et l'expression de la 13-galactosidase a été détectée par coloration en présence de X-gal selon la technique de Sanes et al (EMBO J. 5 (1986) 3133). Pour chaque animal, deux segments artériels au moins ont été soit montés sur OCT (Laboratoires Miles Inc.; IL) pour des expériences de cryosection, ou enduit de paraffine, coupés en sections de 6 ,um et contrecolorés à

WO 96105321 ~ 4 r~ I ~ 2 1 7 4 2 3 2 PCT/FR95/01074 I'hématoxyline et l'eosine. L'expression a été considérée comme positive seulement lorsqu'une coloration bleu foncé était observée dans le noyau. Les résultats obtenus montrent clairement que les artères des animaux infectés présentent une coloration bleu caractéristique de la 13gal. Une analyse microscopique révèle qu'il n'y a pas 5 d'endothéliu~n intact résiduel, mais que la continuité de la lamina élastique interne est préservée. L'analyse microscopique montre également que les cellules de la média ont été infectées par les adénovirus et expriment le gène transféré. Plus préci~ém~nt, alors que dans le cas d'une a(lmini~tration par cathéter à double ballonnets, 0,4% seulement des cellules de la média ont été infectées, 9,6% le sont en utili~nt un cathéter à
o ballonnet enduit d'hydrogel (voir analyse morphométrique ci-après). De plus, les 9,6 %
sont calculés par rapport à l'épaisseur totale de la média mais dans les couchessuperficielles de la média, 100% des cellules sont infectées. Ces résultats sont bien supérieurs à ceux obtenus avec les cathéters à double ballonnets, ou par transfert de gène nu ou au moyen de liposomes. Ces expériences démontrent combien les 5 adénovirus peuvent constituer un vecteur particulièrement avantageux pour l'~tlmini~tration de gènes suicides en vue du traitement de la resténose.

Analyse morphométrique L'efficaçité de transfert a été déterminée sur 7 lapins traités. Tous ces ~nim~l-x ont re~u 5.109 pfu d'adénovirus pour infecter un segment artériel de 2 cm de longueur, de telle sorte que la multiplicité d'infection est similaire pour chaque animal.
Pour chaque artère iliaque transfectée, deux segments sériés de 5 mm de longueur ont été prélevés de la zone cible et, pour chaque se~m~nt, au moins trois sections au hasard ont été ex~minées au microscope optique après coloration au X-gal. Sur chaque section, I'efficacité de transfert a été déterminée par le rapport des cellules de la média colorées sur le nombre total des cellules de la média. Au total, plus de 30.103 cellules provenant des artères infectées par les adénovirus (48 sections) ont été
comptées. Le pourcentage moyen de cellules de la média infectées est de 4.02%, avec des valeurs pouvant atteindre 9,6%. Dans le cas d'un transfert par cathéter à double ballonnet, le pourcentage moyen est seulement de 0,18%.

Cinétique d'expression W096/OS321 ~ ,; t ~; 2 1 74232 PCT~5/0l074 ~

Pour déterrniner la durée de l'expression du gène transfëré par les adénovirus selon l'invention, une étude de l'ex~ulession de la 13-gal a été réalisée au cours du temps sur 20 lapins traités soit par cathéter à double ballonnet (10 animaux), soit par c~theter à ballonnet imbibé d'hydrogel (10 animaux). Pour chaque groupe, 2 ~nim~llx ont été
sacrifiés au jour 3, 7, 14, 21 et 28. L'expression a été détectée par examens macroscopique et microscopique d'artères colorées au X-gal comme décrit plus haut.
Les résultats obtenus montrent, pour chaque groupe, une expression stable pendant 14 jours, suivie d'une baisse à 21 jours. Aucune expression n'est détectée à 28 jours. La même cinétique à pu être mise en évidence dans une artère pathologique dans le o modèle de lapin athéromateux Ces résultats confirment l'effet transitoire des vecteurs de l'invention, particulièrement avantageux et adapté au traitement de la resténose notamment au niveau des parois athéromateuses.

Sélectivité du transfert et de l'expression au niveau des parois artérielles ~fin de contrôler la dissémination possibles à d'autres tissus des adénovirus injectés, dans tous les animaux sacrifiés 3 jours après l'injection, des échantillons de tissu provenant du foie, cerveau, testicules, coeur, poumon, rein, et muscle squelettique, ainsi qu'un segment artériel adjacent au site traité ont été prélevés 20 immédiatement après le sacrifice. Sur chaque échantillon, le transfert et l'expression du gène ont été mis en évidence par PCR (au moyen de sondes dirigées contre le gènecodant pour la protéine IX de l'adénovirus et contre le gène lacZ) et histochimie. Les résultats obtenus montrent que aucun des érh~ntillons prélevés à partir des animaux traités par cathéter à ballonnets enduits d'hydrogel, ne présente de coloration dans les 25 tissus testés. De la meme manière, aucune présence de virus n'a pu être détectée par PCR dans les éch~ntillons testés, même en ~1tili~nt un protocole optimisé et très sensible de 45 cycles d'amplifications.
Ces résultats démontrent l'efficacité du mode d'~(lmini.~tration selon l'invention pour délivrer de manière très locale les gènes thérapeutiques.
~xemple 4: Transfert artériel de l'adénovirus Ad-RSV-TK.

Cet exemple démontre les propriétés de l'adénovirus-TK de l'invention pour le traitement de la resténose par transfert sélectif dans une artère athérom~te -ee.

~ W096/OS321 ~ t ~ ~ S 2 1 74232 PCT/FR95/01074 Modèle animal L'efficacité du transfert artériel a été évaluée dans un modèle de resténose chez le lapin blanc de Nouvelle 7:él~nc~e. Les lapins ont été préalablement soumis à un régime riche en cholestérol (1%) pendant deux sem~ines. L'artère iliaque a été abrasée 5 à l'aide d'un ballonnet de latex (4F) par cinq inflations succes.~ives. Les ~nim~llx ont de nouveau été soumis à un régime hypercholestérolémiant pendant six s~m~ineS- Le transfert artériel a été effectué par voie percutanée, selon la procédure précédçmm~nt décrite, au niveau de l'artère lésée. L'adénovirus Ad-RSV-TK (4.109 pfu dans 40 ,ul de tampon phosphate) a donc été déposé sur un cathéter à ballonnet préalablement enduit 0 d'hydrogel (Hydroplus, Mansfield Medical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA) (Riessen et al., Hum.Gene Ther. 4 (1993) 749). Le cathéter utilisé est un c~th~ter à
ballonnet de 2 cm de longueur, et de diamètre de 2,5 mm.
Basé sur une lésion double, consécutive à l'abrasion et l'angioplastie, ce modèle de resténose, et non pas uniquement de sténose, permet d'évaluer l'~ffic~çité du 5 transfert adénoviral d'un gène suicide dans une artère athéromateuse.

A la lumière des données expérimentales in vitro et afin de vérifier la sélectivité du traitement par Ad-RSV-TK, les animaux ont été divisés en deux groupes, traités ou non par ganciclovir. Le traitement par ganciclovir a été prolongé
20 pendant cinq jours (du deuxième au septième jour suivant l'angioplastie) à raison de 2x25 mg/lcg/jour.

Analyse morphométrique:
Six sem~ineS après l'angioplastie, les animaux ont été sacrifiés par 25 pentabarbital, les artères iliaques fixées et prélevées en vue de l'analyse morphométrique. Les contours de la lumière ainsi que des limit~ntçs élastiques internes/externes ont été évalués après coloration à l'orcéine/hématoxyline. Au total, six blocs ont été analysées par artère, dont 4 compris dans la zone d'angioplastie et deux immédi~tement en amont et en aval de cette zone. Pour chaque bloc, trois 30 sections adjacentes ont été analysées. Brièvement, dirrélel"s paramètres tels que le diamètre ll-min~l, le rapport intima/média ont été calculés. Les échantillons pour lesquels ces contours n'ont pu être mis en evidence, en raison d'une rupture de la limitante élastique interne ou d'une occlusion thrombotique, ont été exclus.
L'analyse morphométrique met en évidence un rapport intima/média élevé
35 dans le groupe controle ayant été soumis au transfert adénoviral par angioplastie mais WO 96/05321 ~ ~ C~ 2 1 7 4 2 3 2 PCT/FR9S/01074 non traité par ganciclovir (5,73 +/- 0,81, n=3). La sévérité de la lésion permet donc d'évaluer l'efficacité d'un traitement par transfert de gène sur une artere pathologique.
En outre, ainsi que le montre l'étude imm~-nohistochimique, les lésions in~l~ites dans ce modèle animal sont riches en macrophages mais également riches en cellules 5 musculaires lisses qui constitl~ent le cible thérapeutique du transfert génique.
L'ensemble de ces données solllign~nt l'intérêt du modèle utilisé qui ne repose pas sur une simple abrasion endothéliale au niveau d'une artère saine et par conséquent mime, du moins partiellement, la pathologie de la resténose post-angioplastie chez l'homme.
L'analyse morphométrique montre que le rapport intima/média est réduit de o 42% (p<0.05) dans le groupe d'animaux soumis à la co,l,binaison Ad-RSV-TK/ganciclovir (3,30 +/- 1,26, n=6). La réduction significative de ce paramètre démontre que le transfert local du gène TK par adénovirus recombinant, en association avec l'~minictration de ganciclovir, constitue une approche thérapeutique prometteuse comme traitement préventif de la restenose post-angioplastie.

Claims (35)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose.

2. Utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose par transfert sélectif dudit gène dans les cellules musculaires lisses de la plaque athéromateuse.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le gène suicide est choisi parmi le gène de la thymidine kinase et le gène de la cytosine désaminase.

4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que le gène suicide est le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (HSV-1 TK).

5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le gène suicide est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées.

6. Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs viraux, de preférence le promoteur LTR-RSV et CMV.

7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et le gène suicide.

8. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène suicide, et dans lequel le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel.

9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène suicide, et dans lequel le gène E1 et le gène E4 est rendu non fonctionnel.

10. Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que l'adénovirus comprend les ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène suicide, et dans lequel tout ou partie des régions E1 et E4 sont délétées.

11. Utilisation selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine humaine, choisi de préference parmi les sérotypes Ad2 et Ad5.

12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que l'adénovirus est un adénovirus d'origine animale, choisi de préférence parmi lesadénovirus canins.

13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que l'adénovirus est imbibé dans un hydrogel.

14. Utilisation selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'hydrogel est déposé sur un cathéter à ballonet.

15. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que l'adénovirus est administré par l'intermédiaire d'un cathéter à ballonet de type cathéter à perfusion.

16. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'adénovirus est administré par l'intermédiaire d'un cathéter de type cathéter à ballonnet à canaux.

17. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'adénovirus perfusé par l'intermédiaire d'un cathéter de type cathéter à ballonnet à perfusion est imbibé dans un hydrogel

18. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que l'adénovirus est imbibé dans du poloxamère.

19. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que l'adénovirus perfusé par l'intermédiaire d'un cathéter de type cathéter à ballonnet à perfusion est imbibé dans du poloxamère.

20. Composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif imbibé dans un hydrogel.

21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 caractérisée en ce que l'adénovirus recombinant défectif comporte un gène suicide.

22. Dispositif pour l'administration de gènes par voie percutanée caractérisé ence qu'il comprend un cathéter à ballonet enduit d'un hydrogel, l'hydrogel étant imbibé
d'un adénovirus recombinant défectif comportant le dit gene.

23. Dispositif selon la revendication 22 caractérisée en ce que l'administrationde génes est réalisée de manière selective au niveau de la plaque athéromateuse.

24. Dispositif selon la revendication 23 caractérisée en ce que l'administrationde génes est réalisée de manière selective au niveau des cellules musculaires lisses.

25. Dispositif selon la revendication 24 caractérisée en ce que lors de l'administration de génes celle-ci se fait avec une selectivité supérieure à 95%.

26. Dispositif selon les revendications 23 à 25 caractérisée en ce que l'administration de génes est suivie d'un traitement au ganciclovir.

27. Dispositif selon la revendication 26 caractérisée en ce que le pourcentage de cellules infectées est supérieur ou égal à 0.2%.

28. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration de gènes par voie percutanée au moyen d'un cathéter à ballonet enduit d'un hydrogel, l'hydrogel étant imbibé d'un adénovirus recombinant défectif comportant le dit gène.

29. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 28 caractérisée en ce que l'administration de génes se fait de manière selective au niveau de la plaque athéromateuse.

30. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 29 caractérisée en ce que l'administration de génes se fait de manière selective au niveau des cellules musculaires lisses.

31. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'administration de génes se fait avec une selectivité supérieure à 95%.

32. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 31 caractérisée en ce que l'administration de génes suicide TK est suivie d'un traitement au ganciclovir.

33. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 32 caractérisée en ce qu'elle induit un effet "bystander".

34. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 33 caractérisée en ce que cet effet bystander induit permet une efficacité
thérapeutique même avec un faible pourcentage de cellules infectées.

35. Méthode de traitement thérapeutique de la resténose selon la revendication 34 caractérisée en ce que le pourcentage de cellules infectées estsupérieur ou égal à .02%.