CA2174753C

CA2174753C - Fragments nucleotidiques capables de s'hybrider specifiquement a l'adnr ou arnr des rickettsia et leur utilisation comme sondes ou amorces

Info

Publication number: CA2174753C
Application number: CA002174753A
Authority: CA
Inventors: Claude Mabilat; Didier Raoult
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1994-08-24
Filing date: 1995-08-24
Publication date: 2002-11-05
Anticipated expiration: 2015-08-24
Also published as: US5976791A; CA2174753A1; WO1996006186A2; EP0724649A1; WO1996006186A3; FR2723950B1; FR2723950A1

Abstract

L'invention concerne des fragments nucléotidiques monocaténaires appartenant à des régions conservées ou variables de l'ARN ribosomique 16S de bactéries du genre Rickettsia. Ces fragments sont capable s de s'hybrider dans des conditions prédéterminées à l'A DNr ou l'ARNr d'au moins une bactérie du genre Rickettsia et non à l'ADNr ou l'A RNr des non Rickettsia. L'invention concerne en outre le s sondes, les amorces dont les séquences appartiennent à celles des fragments de l'invention, ainsi qu'un réactif et un procédé pour i dentifier le genre Rickettsia, ou une espèce du genre Rickettsia.

Description

WO 96106186 1 ~ ~ '~ ~ '~ ~~ p~~pjZgyOII I4 F~aaments n, iPotidir.,~p-.b~ c d s'h5tb liftent à 1 'AnNr ou ARnir riA n ~ ~ ++c ,r uti~icai-ion rommP cnnd c o, mo roc La présente invention relève du domaine des techniques de détection et/ou identification des bactéries du genre Rickettsia et plus particulièrement de celles-utilisant un marqueur génétique.
Les rickettsies sont des bactéries gram négatif qui appartiennent à l'ordre des Rickettsiales et à la famille des Rickettsiaceae comprenant notamment la sous-famille des Rickettsieae sous divisée en trois genres : les Coxiella, dont la seule espèce~connue est Coxiella burnetti ; les Rickettsia, groupant l'ensemble des autres espèces pathogènes pour l'homme et les animaux ; et les Rochalimea.
Le genre Rickettsia comprend trois sous groupes : le groupe du typhus auquel appartient R. typbi responsable- du typhus endémique, R. prowazekü, responsable du typhus épidémique et R. canada ; le groupe du typhus de brousse auquel appartient R. tsutsugamushi ; et 1e groupe des fièvres éruptives auquel appartiennent notamment R. rickettsi.i, R.
siberica, R. conorü, R. australis, R. akari, R. montana et R. rhipicephali.
Les rickettsies sont des bactéries parasites intracellulaires qui se multiplient dans le noyau et le cytoplasme des cellules hôtes pour les souches du groupe des fièvres éruptives et dans le cytoplasme de ces cellules pour les souches des autres groupes. La transmission à
l'homme de la bactérie se fait par l'intermédiaire d'insectes hématophages tels que la tique pour R.
tsutsugamushi (rickettsie du groupe des fièvres éruptives), le pou pour R. prowazekit ou la puce pour R. typbi, lors d'un repas sanguin suivi de dëjections à l'endroit de la piqùre. . _ Le typhus épidémique dù à R. prowazek.ü caractérisé
par une fièvre élevés, des céphalées importantes, une éruption généralisée est aujourd'hui devenu une maladie W O 96106186 ~ ~ ~ 2 PCTIFR95101114 rare. Néanmoins, le risque existe toujours de la survenue d'une épidémie, dès lors que les conditions requises sont réunies, en particulier lorsque 1a population est dense et que les conditions d'hygiène font défaut. , Le typhus murin, ou typhus endémique, dû à R. typbi est répandu dans le. monde entier. Le rat est le réservoir et sa présence conditionne l'apparition de la maladie chez l'homme. L'infection se caraçtérise par des céphalées, des myalgies et de la fièvre mais, le plus souvent, 1a maladie est bénigne.
Certaines des infections associées aux rickettsies du -groupe des fièvres éruptives, et notamment la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses due à R.--rickettsü, peuvent avoir une issue fatale pour 1e malade ou tout.au moins s'accompagner de sévères çomplications telles que myocardite, phlébites, syndrome méningé, encéphalite, myélite et coma. -Le typhus de brousse est une maladie aiguë fébrile dont l'agent causal est R. tsutsugamushi. La maladie se caractérise par une élévation de la température et des céphalées importantes, auxquelles peut être-associée une pneumopathie au cours de lapremière semaine de la maladie.
Par ailleurs, la maladie peut porter atteinte au système nerveux central, avec-des manifestations cliniques telles que délire,-stupeur et fibrillation musculaire. Le taux de mortalité varie de 1 à 60 ~ selon les rëgions géographiques. Il est particulièrement élevé en Asie du Sud-Est,-Corée, Australie, Japon et Inde.
Aujourd'hui, aucune technique de détection n'est à la fois assez spécifique, sensible et rapide pour diagnostiquer une infection due aux bactéries du genre Ri-ckettsia dans un échantillon biologique. Le contrôle de l'infection se fait essentiellement soit par diagnostic direct, très lourd à mettre en oeuvre car il suppose l'inoculation à partir d'échantillons biologiques d'animaux ou d'oeufs embryonnnés : soit par diagnostic sérologique, souvent difficile en raison du manque de spécificité des techniques utilisées ou en raison de l'apparition retardée des anticorps dans les séra des patients.
La présente invention concerne une technique de diagnostic des infections dues aux bactéries du genre Rickettsia, et plus particulièrement celles dues à R.
tsutsugamushi, utilisant un marqueur génétique dans un procédé de détection par hybridation d'acides nucléiques, alliant spécificité, sensibilité et rapidité.
Plus particulièrement, l'ARN ribosomique des bactéries est utilisé comme cible. En effet, cette molécule est retrouvée en abondance dans toutes cellules de tous les organismes vivants. Par ailleurs, elle présente une séquence nucléotidiqüe particulière faite d'une succession de régions caractérisées par une vitesse d'évolution variable.
Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN distinctes réfërencées ARNr(s) 5S, 16S et 235. Historiquement, ces dénominations ont été choisies par référënce à leur vitesse de sédimentation qui reflète la taille de ces molécules d'ARN. Cependant, la taille réelle de ces constituants ribosomiques varie sensiblement, pour un type donné, d'un organisme cellulaire à un autre.
Néanmoins, la terminologie ARNr 5S, 16S et 235 est consacrée pour désigner les molécules d'ARN constitutives des ribosomes chez toutes les bactéries.
La valeur taxonomique des sous-unités 16S et 23S
ribosomiques de diverses espèces bactériennes a été mise en évidence dans des procédés d'hybridation pour quantifier des niveaux d'homologies entre ces espèces_ Ainsi, Woese et coll., Microbiological Reviews 47 : 62I-669 (1983), et Grayet et coll., Nûcleic Acids Research 12 : 5837-5852 (1984) montrent, par des comparaisons de séquences d'ARN
165, que des régions hautement conservées sont intercalées avec des régions de moyenne et basse homologies, même dans le cas d'espèces proches.
A ce jour, seulement six séquences d'ADN correspondant aux ARN ribosomiques 16S (ADNr) de bactéries appartenant à

W096106186 ,, 4 PCf/FR95/01114 - .~ r t la famille_des Rickettsiaceae sont décrites dans la littérature : R. rickettsü, R. prowezekü, R. typhi, , Coxiella burnetti, Ehrlichia ristierü et Wolbachia persicae. , On a maintenant découvert sur 1!ADN codant pour l'ARN
ribosomique de la sous-unité 16S certaines zones qui sont conservées pour diverses espèces appartenant au genre des Rickettsia. Par ailleurs, on a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique 16S des zones variables -au sein du genre Rickettsia. Ces résultats ont permis d'établir des sondes de genre permettant de discriminer le genre Rickettsia des genres taxonomiquement proçhes, ainsi que des sondes spécifiques d'espèces appartenant au genre Rickettsia. Ges résultats ont-été vérifiés notamment sur les espèces suivantes : R.tsutsugamushi, R. canada, R.
conorü, R. akari, R. mooseri*R. australis, R.
rhipicephali, R. montana, R. bellü, R. japonica, R.
parkeri, R. helvetica; R. sibirica, R. massiliae, R.
slovaca et R. africae.
Avant d'exposer l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après - un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide est un enchainement de motifs-nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé
par la séquence informationnelle des acides nuçléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique dans des_-conditions prédéterminées, l'enchaïnement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir dune molécule d'acide nucléiquenaturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, - un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ~ selon qu'il s'agisse de WO 96106186 5 ~, ~ ~ C~ ~~ PCTIFR95/OI114 l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomere est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles qûe l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, 1a désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit aû niveau du sucre, pas exemple le remplacement d'au moins un désoxyriboseparun polyamide (P. E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit encore au niveau du groupemént phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates, - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels, - par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent étre déterminées dans chaque cas de façon connue.
Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sondeJcible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La WO 96106186 ~ ~ ~ °~ ~ â ~ ~ 6 PCT/FR95101114 stringence peut également étre fonction des paramètres de -la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation,- la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une rëaction-d'hybridation doit étre réalisée dépendra principalement des sondes utilisées.
Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
En général, selon la longueur dès sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulièr entre f5 et 65°C
dans une solution saline à une çoncëntration d'environ 0,8 à 1M.
- une sonde est un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35 monomères, possédant une spécifïcité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise dans un ARN ribosomiqu2, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcrip-tion ; une sonde peut étre utilisée à des fins de -diagnostic (notamment sondes de-capture ou de détection) ou à des fins de thérapie, - une sonde de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire-directement ou indirectement, par exemple-par covalence ou adsorption, - une sonde de détection peut étre marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase alcaline, ou une enzyme suscèptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent), des composés chimiques chromophores; des composés chromogènes, s fluorigénes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine, - une amorce est une sondé comprenant de 5 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité
d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique- d'amplification telle que la PCR
(POlymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc., -l'homologie caractérise le degré de similitude de deux fragments nucléotidiques comparés, - les sondes et amorces selon l'invention sont celles. dont les séquénces sont identifiées c-i-après, ainsi que les analogues de ces sondes ou amorces qui sont celles dont les séquences présentent au moins 70 ~ d'homologie, et au moins 5 motifs nucléotidiques consécutifs de séquence informationnelle ïdentique avec ces dernières. De telles séquences sont appelées ici-"séquences homologues".
Les sondes selon l'invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent étre mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépSt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT"
(MANIATIS et al, Molecular Cloning, Col.d Spring Harbor, 1982), les te-chniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN
BLOT" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol., ,gg, 503 (1975), les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques SANDWICH (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, ~, 23 (1977)) ; on utilise en particulier la technique SANDWICH, avec une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes.
Une autre application de l'invention est une sonde de thérapie pour traiter les infections dues aux bactéries du genre Rickettsia, ladite sonde étant susceptible de s'hybrider-in vivo sur l'ARN ribosomique 16S desdites bactéries et/ou sur l'ADN génomique pour bloquer les t Ö
phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou la réplication.
La F i g u r e 1 représente les séquences d'ADNr correspondant à l'ARNr 16S de diverses bactéries du genre Rickettsia, dont~la liste figure à ~la suite de la partie expérimentale ci-après. La numérotation de la séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique 16S de R. rickettsii, complètement identifiée par~Weisburg et al. (1989, Genbank (M21293)), a été utilisée à titre de référence afin de définir les fragments et pour les aligner.
La présente invention a notamment pour objet un fragment nucléotidiqüe monocaténaire capable de s'hybrider avec l'ADNr ou l'ARNr des Rickettsia et non à l'ADNr ou à
l'ARNr des non-Rickettsia.
En particulier, le fragment nucléotidique monocaténaire n'est pas susceptible de s'hybrider spécifiquement à l'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantium, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et Coxiella burnatti.
Le fragment nucléotidique monocaténaire de l'invention présente une séquence nucléotidique d'au moins 5 nucléotides consécutifs choisie dans les séquences suivantes .
commençant au nucléotide N° 130 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 241 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 289 et finissant au nucléotide N°

3 0 commençant au nucléotide N° 299 et finissant au nucléotide N° 315 commençant au nucléotide N° 334 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 661 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléot~'ide N° 940 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N°1035 et finissant au nucléotide N°1055 commençant au nucléotide N°1078 et finissant au nucléotide N°1107 commençant au nucléotide N°1199 et finissant au nucléotide N°1213 commençant au nucléotide N°1330 et finissant au nucléotide N°1350 commençant au nucléotide N°1361 et finissant au nucléotide N°1387 commençant au nucléotide N°1429 et finissant au nucléotide N°1463 commençant au nucléotide N°1501 et finissant au nucléotide N°1520 commençant au nucléotide N°1555 et finissant au nucléotide N°1576 et leurs séquences complémentaires.
L'invention concerne notamment les fragments nucléotidiques monocaténaires ayant üne séquence d'au moins 8. et en particulier d'au moins 10, nucléotides consécutifs choisie dans les séquences mentionnées ci-dessus (ou dans des séquences complémentaires). Bien entendu, l'invention s'étend à tout fragment nucléotidique suffisamment homologue d'un fragment tel que défini ci-dessus pour être capable de s'hybrider spécifiquement avec l'ADNr ou l'ARNr des Rickettsia.
Plus particulièrement, les séquences nucléotidiques des fragments de l'invention sont choisies dans les séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 22, décrites en fin de description, ou leurs séquences complëmentaires.
La numérotation de la séquence de l'ARNr 165 de R.
rickettsü, appliquée aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO
22 ci-dessus, ne reflète pas toujours le nombre de nucléotides ou monomères constituant ces séquences en raison des variations de taille existant entre les séquences et la séquence de l'ARNr 16S de R. rickettsü .
Les variations sont dues à des insertions ou délétions naturelles dans le matëriel génétique.
Conformément à la définition ci-dessus les fragments de l'invention sont des fragments d'ADN, mais ils peuvent aussi âtre dés fragménts monocaténaires d'ARN, ou leurs fragments complémentaires, ainsi que des fragments monocatënaires d'ADN génomique dont les produits de transcription sont les fragments d'ARN précités, ou leurs fragments complémentaires.

r s , .,

2.~.~~ l~~
Les fragments nucléotidiques monocaténaires de l'invention sont utilisables enparticulier comme.sondes notamment comme sondes de capture ou de détection, selon les techniques d'hybridation connues-.
Les sondes spécifiques du genre Rickettsia sont notamment celles présentant une séquence choisie parmi les séquences:
commençant au nucléotide N° 181 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 284 et finissant au nuclëotide N°

commençant au nucléotide N° 561 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 940 et finissant au nucléotide N°

commençant au nuclÉotide N°1199.et finissant au nucléotide N°1213 commençant au nucléotide N°1429 et finissant au nucléotide N°1463 et leurs séquences complémentaires, ou leurs analogués.
Les sondes d'espèce ~. tsutsugamushi sont notamment celles- présentant une séquence choisie parmi les séquences:
commençant au nucléotide N°130et finissant au nucléotide N°170 commençant au nucléotide N°291 et finissant au nucléotide N°272 commençant au nucléotide N°299 et finissant au nucléotide N°315 2Q commençant au nuclëotide N°334 et finissant au nucléotide N°357 commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 661 et finissant au. nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N°1035 et finissant au nucléotide N°1055 commençant au nucléotide N°1078 et finissant au nucléotide N°1107 commençant au nucléotide N°1330 et finissant au nucléotide N°1350 commençant au nucléotide N°1361 et finissant au nucléotide N°1387 commençant au nucléotide N°1501 et finissant au nucléotidé
N°1520 commençant au nucléotide N°1555 et finissant au nucléotïde N°1576 et leurs séquences complément-aires, ou leuxs analogues.
Un autre objet de l'invention est-une sonde de -thérapie pour le traitement des infections dues aux bactéries du genre Rickettsia et notamment une sonde de thérapie pour le traitement des infections dues une-espèce déterminée dè Rickettsia, l'une et l'autre comprenant au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que -défini précédemment.

Un autre objet de 1'inventinn est une amorce pour la transcription inverse spécifique en une séquence d'ADN
complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 16S de Rickettsia appartenant soit à une région conservée ' S seulement parmi les Rickettsia, soit à une région spécifique de 1!espèce R. tsutsugamushi ; ou une amorce, notamment pour l'amplification spécifique d'une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de 1a séquence de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia, appartenant soit à
une région région conservée seulement parmi les Rickettsia, soit à une région spécifique de l'espèce R. Tsutsugamushi.
Une telle amorce comprend ou est constituée par un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini précédemment.
L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique comprenant au moins une sonde de l'invention, et en particulier une sonde de capture et/ou une sonde de détection répondant à la définition d'une sonde donnée ci-dessus. Le réactif peut comprendre un mélange de sondes.
Enfin, l'invention apporte un procédé pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique selon lequel on met en contact soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 165, extrait des rickettsies et éventuellement dénaturé, soit l'ADN
génomique, extrait et dénaturé, des bactéries, soit encore l'ADN obtenu â partir de la transcription inverse de l'ARN
ribosomique 16S, avec au moins une sonde de l'invention, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde, de façon connue en soi.
. Bien entendu, il convient d'effectuer l'hybridation dans des conditions suffisamment discriminantes (stringence) pour qûe l'hybridation d'au moins une des sondes soit spécifique.
Si désirë, avant d'exposer l'acide nucléique à la sonde de l'invention, on réalise une amplification de cet R'U 96/06186 12 PCT/FTt95/01114 acide nucléique en Pré6ence d'un système enzymatique adapté
et d'au moins une ,amorce d'amplification de l'invention.
L'invention concerne en particulier un procédé de détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractéris'è-en ce qu'il comprend:
a- la mise en contact dudit échantillon avec au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini ci-dessus, dans des conditions prédéterminées qui permettent audit fragment de s'hybri-der à-l'ADNr ou à l'ARNr d'une bactérie du genre Richettsia, s'il est présent ; et b- la détection dudit hybride comme indicateur de la présence de.Rickettsia dans l'échantillon.
Bien entendu, lés conditions prédéterminées d'hybridation sont celles qui permettent une hybridation spécifique.
Les Exemples suivants illustrent l'invention.

Détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN
correspondant à l'ARN ribosomique 16S de rickettsies.
La séquence. nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN
ribosomique 16S des 16 souches suivantes a été déterminée:
R.tsutsugamushi ATCC Gilliam -R. canada Gamaleya Research Institute Collection 2678 R. conor ATCC VR-141 R. akari ATCC VR-148 R. mooseri ATCC VR-144 R. australis -R. -shiplcephali-R. montana R. bell --R. japonica R. parkeri R. helvetica R. sibirica ATCC VR-151 ..

R. massiliae ' R. slovaca R. africae Gamaleya Research.Institute Collection L'ADN total des souches a été isolé selon la technique décrite par Maniatis et al.(Molecular cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Des produits d'amplification PCR ont été
générés à partir de l'ADN génomique~isolé de ces souches à
l'aide d'amorces d'amplification choisies dans des régions conservées dans les séquences connues de R. rickettsii, R.
typbi et R. prowazekii.
Les produits d'amplification obtenus ont été purifiés sur billes magnétiques marquées à la streptavidine (Dynabead M-280 ; Dynal Inc., N.Y.) et séquencés en utilisant la technique préconisée dans le kit commercial "Autoread sequencing kit".
EXF~ LE 2 Utilisation d'une sonde spécifique dirigée contre l'ARN
ribosomique 16S pour l'identification de R. tsutsugamushi.
La sonde commençant au nucléotide N°903 et finissant au nucléotide N°929 de la SEQ ID NO 13, est spécifique pour les souches de R. tsutsugamushi. Une collection de souches de rickettsies a été testée par hybridation sur l'ARN
ribosomique 16S et a permis de constater la spécificité de cette sonde.
L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de détection non-radioactif et semi-automatisé décrit dans le brevet français n° 90 07249 et modifié pour la détection de l'ARN
ribosomique par l'addition d'un déstabilisant. Ce déstabilisant (qui est une sonde de capture, commençant au nucléotide N°940 et finissant au nucléotide N°970 de la séquence de R. Tsutsugamuchi (référencée 23 dans la figure annexée)) et un conjugué de détection oligonucléotide-enzyme (l'oligonucléotide correspondant à la~sonde définie au début du présent exemple) sont utilises. La manipulation a été conduite dans une plaque de microtitration selon le protocole suivant.
* (marque de commerce) T
r L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries à Gram positif décrit dans "Current Protocole in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York. Dans une plaque de microtitration (Nunc 439959) est déposée une solution de 1 ng/ul de l'oligonucléotide de capture dont l'extrémité 5' a réagi avec le réactif Aminolink 2*(Applied Biosystems, Foster city , Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCl 0.15 M phosphate de sodium pH
7.0). La plaque est incubée 2 h à 37° C puis lavée 3 fois avec 300 u1 de PBST (PBS 1x, Tween 20* . 0, 5 % (Merck 822184)). Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à
l'extrémité 5' de la~sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle. La sonde ainsi couplée à un ligand possédant un groupement polaire (amine primaire), et fixée de façon passive sur le support, procure un signal amélioré ; voir la demande FR 91 09057.
La cible constituée par 10 u1 d'extrait d'ARN totaux est mélangée.avec 40 u1 de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de sperme de saumon 10 ug/ml (Sigma D 9156)). L'ensemble est ajouté dans le puits à 50 u1 d'une solution du conjugué
oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de 0.1 ng/ul en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 sérum de cheval (BioMérieux 55842)). La plaque est incubée 1 h à 37° C puis lavée par 3 fois avec 300 u1 de tampon PBST. Dans chaque puits, on rajoute 100 u1 de substrat OPD
(ortho-phénylènediamine Cambridge Medical Biotechnology ref/456) dans un tampon 0,055 M acide citrique, 0,1 M
monohydrogénophosphate de sodium, pH 9,93) à la concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément du peroxyde d'hydrogéne à 30 $ dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique est bloquée par 100 u1 d'acide sulfurique 1N et la lecture est effectuée sur un appareil Axia Microreader (ARIA . marque enregistrée) (bioMérieux) à 492 nm.
Les bactéries-cibles é,~aient notamment les suivantes .
* (marques de commerce) r 30 souches appartenant à l'ordre des Rickettsiale - 20 souches appartenant au genre des Rickettsia - 7 souches appartenant à l'espèce de R tsutsugamushi L'adaptation de la combinaison spécifique sur l'automate 5 VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société
bioMérieux-VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR (marque de commerce) ("Solid Phase Receptacle") qui est un support conique réalisé à partir d'un matériau vendu sous la 10 dénomination K résine (copolymère butadiène-styrène) et commercialisé par la société bioMérieux-VITEK (USA). Les divers réactifs sont disposés dans une barrette à plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR
qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs et 15 qui fait donc office de pipette. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône.
Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement l'oligonucléotide de capture comportant à son extrémité 5' le ligand Aminolink 2*(Applied Biosystems-réf.400808) à une concentration de 1 ng/ul dans un volume de 315 u1 d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM). Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37°C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween* puis séchés sous vide. La barrette contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire . 200 u1 d'une solution à 0,1 ng/ul du conjugué de détection oligonucléotide-phosphatase alcaline, 2 fois 600 u1 de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat.
Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10 u1 de l'ARN extrait dans le même tampon que pour le protocole microplaque ci-dessus.
Après incubation 30 minutes du cône par le mélange cible plus sonde de détection, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween* 250 u1 de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon * (marques de commerce) W096/06156 16 PC1'/FR95/01114 diéthanolàmine sont aspirés dans le cbne, puis relâchés dans une cuvette de-lecture. L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette.
Les résultats obtenus avec ce système sont les mêmes que ceux obtenus en microplaque.
De façon analogue; on peut vérifier le caractère spécifique de genre ou d'espèces des autres fragments nucléotidiques qui font l'objet de l'invention.
Liste et origine des bactéries dont la séquence d'ADNr correspondant à l'ARNr 16S est représentée en anneze.
1 R.ricketts Genbank 14 thai (tick typhus rickettsia) 10 R.slovaca (M-91 isolat diffrent de R siberica) 11 R.japonica

3 R.conor 18 astrakan fever rickettsia 13 israeli tick typhus rickettsia 7 R.sibirica R.parkeri 16 R.africae 8 R.massiliae 17 Bar29 (GS isolat diffrent de massiliae) R

6 R.rhipicephali 9 R.montana 12 R.helvetica

4 R.australis

5 R.akari 3I RSDNAX (EBL bacterium) Genbank 2 R.bell Z1 Coccinelle (AB j~acterium) Genbank 22 R.canada . ' 19 R.prowazek Genbank R.typhi Genbank 23 R. tsutsugamushi 26 Cowdria ruminantium (CRDNA) Genbank Ehrlichia chaffeensis (EHRRRNAF)Genbank 27 Anaplasma marginale (APMRR16SA) Genbank 28 Wolbachia pipientis (WP'16SCP) Genbank 24 Ehrlichia ristic (EHRRGBSA) Genbank Rochalimea (Bartonella)quintana ROCRR16SA Genbank 29 Coxiella burnatti COXRRSA Genbank FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) LISTE DES SEOUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
( i ) DÉPOSANT
(A) NOM . Société Anonyme dite BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme (C) VILLE: Marcy l'Étoile (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69280 (G) TÉLÉPHONE: (33) 78 87 20 00 (H) TÉLÉCOPIE: (33) 78 87 20 90 (ii) TITRE DE L'INVENTION: Fragments nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement à
l'ADNr ou ARNr des Rickettsia et leur utilisation comme sondes ou amorces.
( i i i ) NOMBRE 'DE SÉQUENCES : 22 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disc (B) ORDINATEUR: PC* Compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: DOS*#6.2 wINDOws*#3.o (D) LOGICIEL: Microsoft Word*#6.0 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO . 1 1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

liA LONGUEUR . 33 nuclotides liB TYPE . acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS . simple liD CONFIGURATION . linaire Iii TYPE DE MOLCULE . ADN

liii HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS . non * (marques de commerce) W 0 96106186 18 FCT'/FR95/01114 liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE . bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 130-170 lviC UNI TES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 130-170 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:

SEQ ID NO : 1 CGAATTAATG
CTGAGTTTGC
TTAGTATTAA

R'O 96/06186 19 PCT/FR951011I4 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 21 nuclotides liB TYPE : acide nclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

1vi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GNOME:

lv iA CHROMOSOMEJSEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 181-201 lviC UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:-lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 181-201 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

3S lxi DESCRIPTION
DE LA
SQUENCE:

SEQ ID NO : 2 GTGAGTAACA
CGTGGGAATC

6 2 0 PCT/FR95101114 ?1'~~i5~
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQU1VCE:

liA LONGUEUR : 27 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

1i HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi - POSITION DANS LE GENOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 241-272 lviC UNITES:

lix CAgpCTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 241-272-lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude -lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:

SEQ ID NO : 3 TCACGTATGC
CCTCTATAAG
GAGGAAA

W0 96106186 21 PCT/FTt95/01114 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 15 nuclotides 1iB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE: -lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

1v iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 284-298 lviC UNI TES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 284-298 lixC METHODE D~IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:

SEQ - ID NO : 9 TATCGCTGAT
GGATG

WO 96106186 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 2 PC1'1FR95101114 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 17 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:-lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.rickettsfi : 299-315 lviC UNITES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 299-315 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:

SEQ ID NO : 5 AGCCCGCGGC
AGATTAG

W O 96106186 2 3 ; ' - PCT/FR95/01114 1 INFORMATIONS POUR LA-SEQ ID NO :

1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 24 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

1i HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lv i POSITION DANS LE GENOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

1v iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts ü : 334-357 lvüiC UNITES:
lix CARACTERISTIQUE:
lixA NOM/CLE : ADN
lixB EMPLACEMENT : 339-357 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:
lxiDESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 6 WO 96106186 ~ ~'2 4 PCT/FR95101114 ;:.
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 22 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE bEVELOPPBMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 460-481 lviC UNI TES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 460-481 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:

SEQ ID NO : 7 CCAGCAATGC
CGCGTGAGTG

~.~ ~4'~~$
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 21 nuclotides IiB TYPE :-acide nuclique -TiC NOMBRE DE BRINS : Simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYP:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvilA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE

lvi POSITION DANS LE GNOME:

lv iA CHROMOSOMEJSEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 504-536 lviC UNI TES:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 504-536 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 8 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGEUR : 21 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRSNS : simple liD CONFIGURATION : linaire -l TYPE DE MOLECULE : ADN

1i HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE r lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lviB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 550-570 lviC UNITES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 550-570 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par Similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUNCE:

SEQ ID NO : 9 GACAGTACCT
ACAGAAAAAG

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 25 nuclotides liB TYPE : acide nuclique -liC NOMBRE DE BRINS : simple -liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE :-ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lv i POSITION DANS LE GENOME:

lvi.A CHROMOSOME/SEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 561-585 lviC UNITES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 561-585 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 10 CAGAAAAAGC CCGGGCTAAC TCCGT _-25 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 11 1i - CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 24 nuclotides 1iB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE -: ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE -.' lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE;

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE: -lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IP~IEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE

lv i POSITION DANS LE GENOME:

lvlA CHROMOSOME/SEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT -A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 661-684 lviC UNITES:

1ix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE ; ADN

lixB EMPLACEMENT : 661=684 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 11 TAATAAGTTA GGAGTGAAAT CCCA 2q WO 96106186 2 g PCTIFR95/01114 1 INFORMATIONS POUR LA-SEQ ID NO : 12 1i CARACTERISTIQUES DE. LA SEQUENCE:

1iA LONGUEUR : 30 nuclotides 1iB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE-CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

1vi11B POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 710-739 lviC -UNITES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE .-ADN

lixB EMPLACEMENT : 710-739 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

Ixi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 12 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ZD NO : 13 1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

liA LONGUEUR : 23 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLCULE : ADN

li HYPOTHTIQUE

1iv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:-lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GNOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviliB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 903-929 lviC UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 903-929 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SQUENCE:

SEQ ID NO : 13 GATATTGGGG
GATTTTTCT-T

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 14 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 21 nuclotides liB TYPE : acide nclique liC NOMBRE DE BRINS : simple .

liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE :-ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE i3APLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lviiB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATTON DE R.ricketts : 940-960 lviC UNITES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 940-960 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par-smilitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:
-SEQ ID NO : 14 TAACGCATTA
AGCACTCCGC

N
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ-ID NO : 15 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 21 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPEDE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE -; bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE

lv i POSITION DANS LE GENOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviliB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 1035-1055 lviiiC UNITES:

lix CARACTERISTIQUE: -lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1035-1055 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION
DE LA
SEQUENCE:

SEQ ID NO : 15 AATTCGATGA
TCCGCGAAAA

W0 96/06186 33 PCT/FR95/OlII4 ., t,.; ~;

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 16 1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

liA LONGUEUR : 30 nuclotides liB TYPE : acide nuclique ' liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLCULE-: ADN

li HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :/

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE: -lviH LIGNE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE: -lvi POSITION DANS LE GNOME:

lvlA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 1078-1107 lviC UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 107$-1107 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

1xi DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 16 WO 96106186 3 q PCT/FIt95101114 ~~.:'~:~75~
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 17 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

1iA LONGUEUR : 15 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE: -lviI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lv i POSITION DANS LE GNOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

lv 1B POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 1199-1213 lviC UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1199-1213 lixC MTHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS: .

lxi DESCRIPTION
DE LA
SQUENCE:

SEQ ID NO : 17 ATTCTTATTT
GCCAG

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 18 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 20 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire =

1 TYPE DE MOLECULE : ADN

1i HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE :~

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

2 1vi I ORGANELI~E

lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvilA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GENOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMBNT:

1v iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 1330-1350 lviC- UNITES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1330-1350 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION DE LA'SEQUENCE:
SEQ ID NO : 18 WO 96106186 3 g PCTIFR95/01114 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 19 1i -- CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

liA LONGUEUR : 26 nuclotides 1iB TYPE . acidenuclique 1iC NOMBRE DE BRINS.: simple liD CONFIGURATION :linaire 1 TYPE DE MOLCULE : ADN

1i HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tSUtsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:

1v SOURCE IMMDIATE : hioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GNOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lv iB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE-R.ricketts : 1361-1387 lviC UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1361-13$7 lixC MTHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 19 W096106186 3~ - - - - PCT/FR95/01114 ~i'~4~~~~ u 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 20 1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

liA LONGUEUR : 35 nuclotides -liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire -l TYPE DE MOLCULE : ADN

li HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

1vi ORIGINE:

lviA-- ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STADE DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU.

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE:

lvI ORGANELLE:

lv SOURCE IMMDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GNOME:

lv 1A CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE R.ricketts : 1429-1463 lviC UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1429-1463 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxi DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 20 W096/06186 ,~ ''r~~~ 38 1 INFORMATIQNS POUR LA SEQ-ID NO : 21 1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

liA LONGUEUR : 20 nuclotides liB TYPE : acide. nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLCULE- _ ADN

1i HYPOTHTIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

lviD STAD$ DE DVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE: -lv -- SOURCE TMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lvi POSITION DANS LE GNOME:

lviA CHROMOSOME/SEGMENT:

lvi.B POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMROTATION DE-R.ricketts _ : 1501-1520 lviC -UNITS:

lix CARACTRISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1501-1520 lixC MTHODE D'IDENTIFICATION : par-similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxiDESCRIPTION DE LA-SÉQUENCE:
SEQ ID NO : 21 W096106186 3~~~~ (~~
rcT~xvsiolua 1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 22 1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

liA LONGUEUR : 22 nuclotides liB TYPE : acide nuclique liC NOMBRE DE BRINS : simple liD CONFIGURATION : linaire 1 TYPE DE MOLECULE : ADN

li HYPOTHETIQUE

liv ANTI-SENS : non 1v TYPE DE FRAGMENT:

lvi ORIGINE:

lviA ORGANISME : R.tsutsugamushi lviB SOUCHE

lviC INDIVIDU/ISOLE:

15, lviD STADE DE DEVELOPPEMENT

lviE HAPLOTYPE:

lviF TYPE DE TISSU:

lviG TYPE DE CELLULE:

lviH LIGNEE CELLULAIRE:

lviI ORGANELLE:-lv SOURCE IMMEDIATE : bioMrieux S.A.

lvA BIBLIOTHEQUE:

lvB CLONE:

lv i POSITZON DANS LE GENOME:

lv iA CHROMOSOME/SEGMENT:

lviB POSITION PAR RAPPORT

A LA NUMEROTATION DE R.ricketts : 1555-1576 lviC UNI TES:

lix CARACTERISTIQUE:

lixA NOM/CLE : ADN

lixB EMPLACEMENT : 1555-1576 lixC METHODE D'IDENTIFICATION : par similitude lixD AUTRES RENSEIGNEMENTS:

lxi DESCRIPTION DÉ LA SEQUENCE:
SEQ ID NO : 22

Claims

REVENDICATIONS

1. Fragment nucléotidique monocaténaire ayant au maximum 35 motifs nucléotidiques, capable de s'hybrider à l'ADNr ou l'ARNr d'au moins une bactérie du genre Rickettsia et non à
l'ADNr ou l'ARNr des non-Rickettsia, ledit fragment étant choisi dans le groupe constitué par:
a) les fragments polynucléotidiques d'au moins 8 nuclé-otides consécutifs inclus dans une séquence choisie dans le groupe constitué par: les séquences 130-170, 181-201, 241-272, 284-298, 299-315, 334-357, 460-481, 504-536, 550-570, 561-585, 661-684, 710-739, 940-960, 1035-1055, 1078-1107, 1199-1213, 1330-1350, 1361-1387, 1429-1463, 1501-1520, ou 1555-1576 correspondant aux références 1 à 22 et 31 de la Figure 1, leurs séquences complémentaires, et les séquences substantiellement identiques à ces séquences;
b) les fragments polynucléotidiques d'au moins 8 nucléotides inclus dans une séquence choisie dans le groupe constitué par: les séquences 130-170, 181-201, 241-272, 284-298, 299-315, 334-357, 460-481, 504-536, 550-570, 561-585, 661-684, 710-739, 940-960, 1035-1055, 1078-1107, 1199-1213, 1330-1350, 1361-1387, 1429-1463, ou 1555-1576 correspondant à la référence 23 de la Figure 1, leurs séquences complémentaires et les séquences substantielle-ment identiques à ces séquences; et c) les fragments polynucléotidiques d'au moins 10 nucléotides consécutifs inclus dans une séquence choisie dans le groupe constitué par: les séquences 903-929 correspondant à l'une des références 2, 5, 18 et 21-23 de la Figure 1, leurs séquences complémentaires, et les séquences substantiellement identiques à ces séquences.

2. Fragment nucléotidique monocaténaire, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il ne s'hybride pas à
l'ADNr ou l'ARNr de Cowdria ruminantium, Ehrlichia chafffeensis, Anaplasma marginale, Wolbachia pipientis, Ehrlichia risticii, Rochalimea quintana et Coxiella burnatti.

3. Fragment selon la revendicatian 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il présente une séquence nucléotidique choisie dans les séquences SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 22.

4. Fragment nucléotidique monocaténaire d'ARN, caracté-risé en ce qu'il correspond au produit de transcription d'un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendica-tions 1 à 3, ou son fragment complémentaire.

5. Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, caracté-risé en ce qu'il est obtenu par transcription inverse d'un fragment d'ADN selon la revendication 4, ou son fragment complémentaire.

6. Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN génamique, caractérisé en ce que son produit de transcription est un fragment d'ARN selon la revendication 4, ou son fragment complémentaire.

7. Sonde nucléotidique pour l'identification de bactéries du genre Rickettsia, ladite sonde ayant au plus 35 nucléotides et comprenant un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6.

8. Sonde pour l'identification de bactéries d'espèce R.
tsutsugamushi, ladite sonde ayant au plus 35 nucléotides et comprenant un fragment nucléotidique tel que défini à la revendication 4.

9. Sonde selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence choisie dans les séquences suivantes illustrées à la Figure 1:

commençant au nucléotide N°181 et finissant au nucléotide N° 201 commençant au nucléotide N°284 et finissant au nucléotide N° 298 commençant au nucléotide N°561 et finissant au nucléotide N° 585 commençant au nucléotide N°940 et finissant au nucléotide N° 960 commençant au nucléotide N°1199 et finissant au nucléotide N.degree1213 commençant au nucléotide N° 1429 et finissant au nucléotide N°1463 et leurs séquences complémentaires.

10. Sonde selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence choisie dans les séquences suivantes illustrées à la Figure 1:
commençant au nucléotide N°130 et finissant au nucléotide N°170 commençant au nucléotide N°241 et finissant au nucléotide N°272 commençant au nucléotide N°299 et finissant au nucléotide N°315 commençant au nucléotide N°334 et finissant au nucléotide N°357 commençant au nucléotide N° 460 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 504 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 550 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 661 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 710 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N° 903 et finissant au nucléotide N°

commençant au nucléotide N°1035 et finissant au nucléotide N°1055 commençant au nucléotide N°1078 et finissant au nucléotide N°1107 commençant au nucléotide N°1330 et finissant au nucléotide N°1350 commençant au nucléotide N°1361 et finissant au nucléotide N°1387 commençant au nucléotide N°1501 et finissant au nucléotide N°1520 commençant au nucléotide N°1555 et finissant au nucléotide N°1576.

11. Sonde de thérapie pour le traitement des infections dues au genre Rickettsia ou à urge espèce déterminée de rickettsies, ladite sonde ayant au plus 35 nucléotides et comprenant un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.

12. Amorce pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN ribosomique 16S des Rickettsia appartenant à
une région conservée parmi ce seul genre de rickettsies, en une séquence d'ADN complémentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au plus 35 nucléotides appartenant à la séquence d'un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à
6.

13. Amorce pour l'amplification enzymatique spécifique d'une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire ou homologue de la séquence de l'ARN ribosomique 16S des Rickettsia caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au plus 35 nucléotides appartenant à la séquence d'un fragment nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 6.

14. Réactif pour détecter et/ou identifier au moins une espèce de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 7 à 11.

15. Réactif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend comme sonde de capture et/ou de détection au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 7 à 11.

16. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce que la sonde de capture est fixée sur un support solide.

17. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce que la sonde de détection est une sonde marquée.

18. Réactif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon la revendication 12 et/ou au moins une amorce selon la revendication 13.

19. Procédé de détection et/ou d'identification de Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) la mise en contact dudit échantillon avec au moins un fragment nucléotidique monocaténaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans des conditions prédéterminées qui permettent audit fragment de s'hybrider à l'ADNr ou à l'ARNr d'une bactérie du genre Richettsia, s'il est présent; et b) la détection dudit hybride comme indicateur de la présence de Rickettsia dans l'échantillon.

20. Procédé de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce du genre Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ARN
ribosomique 16S, extrait des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, et on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde.

21. Procédé de détection et/ou d'identification d'au moins une espèce du genre Rickettsia dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ADN
génomique extrait et dénaturé des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde.

22. Procédé de détection et/ou d'identification d'une espèce de rickettsie dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met en contact l'ADN obtenu par transcription inverse de l'ARN ribosomique 16S des bactéries contenues dans ledit échantillon avec au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, puis on détecte l'hybridation éventuelle de ladite sonde.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à
22, caractérisé en ce qu'avant d'exposer l'acide nucléique à ladite sonde, on réalise une amplification dudit acide nucléique en présence d'un système d'amplification enzymatique comprenant au moins une amorce selon l'une des revendications 12 et 13.