CA2182905C

CA2182905C - Method for ordering macromolecules by means of a moving meniscus, and uses thereof

Info

Publication number: CA2182905C
Application number: CA2182905A
Authority: CA
Inventors: David Bensimon; Aaron Bensimon; Francois Heslot
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur
Priority date: 1994-02-11
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 2010-08-17
Anticipated expiration: 2015-02-10
Also published as: JP3741718B2; US5840862A; CN1144540A; WO1995022056A1; WO1995021939A1; FR2716263B1; NZ281255A; ATE249045T1; EP0743988B1; CN1125342C; CN1088110C; US6265153B1; US6294324B1; FR2716263A1; AU1814595A; US7122647B2; DE69531666T2; CA2182906A1; AU1712095A; AU699136B2

Abstract

A method for ordering one or more macromolecules on the surface (S) of a support, wherein a triple line S/A/B (meniscus) resulting from a solvent (A) contacting the surface (S) and a medium (B) is moved over said surface, said macromolecules having a portion, particularly one end, anchored to the surface (S), and another portion, or the other end, dissolved in the solvent (A). A method for revealing, measuring the intramolecular distance of, separating and/or assaying a macromolecule in a sample in which said ordering method is carried out, is also disclosed.

Description

2182q~5 Wo 95/21939 ~ r~. 165 PROCEDE D'ALIGNEMENT DE MACROMOLECULES PAR PASSAGE D'UN
MENISQUE ET APPLICATIONS
La présente invention concerne une méthode d'~ nf~m~ont 5 de macromolécules telles que des polymères ou des macromolécules à
activité biologique, notamment de l'ADN, ou des protéines. La présente invention concerne également l'application de cette méthode dans des procédés de mise en évidence, de mesure de distance intra mol~c~ ire, de séparation et/ou de dosage d~une macromolécule dans un é~h~ntill- n Controler la conformation de macromolécules représente un enjeu industriel important, par exemple dans la fabrication de capteurs ou d'assemblages moléculaires contrôlés ou encore dans les problèmes de détection et d'analyse. Il peut être intéressant d'avoir une conformation moléculaire allongée. A titre d'exemple, dans le cas où des polymères sont greffés sur un substrat, il a été proposé de les étendre par l'action d'un champ électrique, d'un écoulement ou à l'aide de pinces optiques. En particulier, en biologie, I'alignement de l'ADN - par électrophorèse (Zimmerman et Cox Nucl. Acid Res. 22, p ~92, 1994), écoulement libre (Parra et Windle, Nature Genetics, 5, p 17, 1993 et WO 93/22463) ou dans un gel (Sch~vartz et al. Science 262, p 110, i993 et USP 33531) ou à l'aide de pinces optiques (Perl;ins et al., Science 26~1 p 819, 1994 et aussi USP
5079169) - ouvre de nombreuses possibilités en cartographie, ou dans la détection de pathogènes.
Ces méthodes ne permettent en général qu'un alignement imparfait, ou encore transitoire - c'est-à-dire qu'on a relaxation de la molécule, une fois la contrainte disparue. Dans le cas des pinces optiques, la méthode est lourde, limitée à une seule molécule à la fois, et délicate à
mettre en oeuvre par des personnels non qualifiés.
Il a été proposé (1. Parra et B. Windle et WO 93/22463) une tcchnique particulière d'alignement de l'ADN par écoulement après Iyse dc cellule, puis séchage. L~alignement obtenu est très imparfait et inhomogène et de nombreux amas non alignés sont observés.
La présente invention a pour objet une méthode origin:-le et simple pour aligner des macromolécules sur la surface S d'un support caractérisée en ce que l'on fait se déplacer sur ladite surface S la ligne 21 ~2q(~
WO95/21939 r~,l/rl~5 16'i triple S/A/B (ménisque) résultant du contact d'un solvant A avec la surface S et un milieu B, lesdites macromolécules ayant une partie, notamment une extrémité, ancrée sur la surface S, I'au~re partie, no~ rll~ I'autre extrémité, étant en solution dans le solvant A.
On a observé selon la présente invention, que le seul passage d'un ménisque sur des molécules dont une partie est ancrée sur un substrat, le reste de la molecule étant librement en solution permet de les aligner uniformément perp~nriif~ rement au ménisque en mouvement les laissant adsorbées sur la surface derriere le ménisque. Ce ph~nomi~ne est appelé ici "peignage moléculairen.
Plus p~ r~lt~ I'étirement de la partie libre de la molécule se fait par le passage de la ligne triple S/A/B, con~titl~nt le ménisque entre la surface S, le solvant A et un milieu B qui peut etre un gaz (en général de l'air) ou un autre solvant.
Dans un mode de réalisation particulier, le ménisque est un ménisque eau-air, c'est-à-dire que le solvant A est une solution aqueuse et le milieu B est de l'air.
De plus 11 est possible d'étendre le ménlsque air/eau utilisé
ici aiin d'étirer la molécule à d'autres systèmes tels que huile/eau ou 20 eau/surfactant/air, notamment.
Le déplacement du ménisque pcut se faire par tout moyen de déplacement relatlf des fluides A et B par rapport à la surface S. Dans un mode de réallsation, la surface S peut etre retirée du solvant A ou inversement, le solvant A peut etre retlré de la surface S.
En particulier le ménisque peut être déplacé à l'aide d'un moyen mécanique, pneumatique nf~t~mm~nt en aspirant ou soufflant un gaz, ou hydraulique notamment en poussant ou en aspirant ie solvant A ou le milieu B.
Ainsi le déplacement du ménisque peut se faire par évaporation progressive du solvant A.
Lorsque le déplacement du ménisque se fait par voie mecanique, il peut se faire soit par translation de l'interface A/B, soit par translation de la surface S.
Dans un modc de réalisation particulier, le solvant est placé
entre deux supports dont un au moins correspond audit support de surface S et le ménisque est déplacé par exempie par évaporation.
.. _ .. , . .. ,,, . , . , . , ..... , _ , _ , , _ _, _ _ _ ,, _ _ .

~W095/21939 21 ~9~ r~l~r~5~ 6s On entend ici par ~support", tout substrat dont la cohésion est suffisante pour résister au passage du ménisque.
Le support peut etre constitué au moins en surface, par un polymère organique ou inorganique, un métal notamment de l'or, un 5 oxyde ou sulfure de métal, un élément semi-conducteur ou un oxyde d'élément semi-conducteur, tel qu'un oxyde de silicium ou une comhin~ic-m de ceux-ci, telle que du verre ou une céramique.
On cite plus particulièrement le ~erre, le silicium o,Yydé en surface, le graphite, le mica et le sulfure de molybdène.
A titre de "support~, on peut utiliser un support unique tel qu'une lame, des billes, notamment de polymère, mais aussi des formes quelconques telles que barre, Rbre ou support structuré, et également des particules, qu'il s'agisse de poudres, notamment de poudres de silice, lesquelles peuvent d'ailleurs être rendues magnetiques fluorescentes ou colorées comme cela est connu dans les différentes n~( hnolo~ie.c de dosage.
Le support est avantageusement sous forme de plaques. De préférence, le support ne présente que peu ou pas de fiuorescence.
Des macromolécules, telles que polymères quelconques, ou polymères biologiques tels que ADN, ARN ou Protéines, peuvent être ancrés par des méthodes 4uelcull4u.~ sur un support.
La macromolécule à aligner peut être choisie parmi les macromolécules biologiques telles que les proteines, notamment les al1ticorps, antigènes, ligands ou leurs récepteurs, les acides nucléiques, ADN, ARN ou PNA, les lipides, les polysaccharides et leurs dérivés.
On a observé selon la présente invention, que la force d'étirement agit localement au voisinage immédiat du ménisque. Elle est indépendante de la longueur de la molécule, du nombre de molécules ancrées, et dans une large gamme, de la vitesse du ménisque. Ces caractéristiques sont particulièrement intéressantes pour aligner les molécules de fason homogène et reproductible.
On peut, selon la présente invention, ajouter des éléments tensio-actifs dans le sol~ant A et/ou ie milieu B, qui viennent modifier les propriétés des interfaces. Selon la présente invention l'étirement peut en crrct etre controlé par l'addition de tensio-actifs, ou par un traitement de 3~ surrace adéquat.

21 82~5 ~ r~ l65 wo 95121939 Une trop grande attraction surface-macromolécule (par exemple un niveau trop élevé d'adsorption) peut gerler l'alignement des molécules par le ménisque, celles-ci restant adsorbées à la su}face dans un état pas néc~ di~ ..t étiré. De préférence, la surface présente un faible S taux d'adsorption de ladite macromolécule, de sorte que seules les molécules ancrées seront alignées, les autres étant entrainées par le ménisque.
C.-rf~n-l~nt, on peut jouer sur les différences d'adsorption entre une partie de la macromolécule rll~t~mm~nt ses extrémités et ses 10 autres parties (en particulier pour de longues molécuies, telles l'ADN ou le collagène) pour ancrer par adsorption les molécules par une partie notamment leur(s) extrémité(s) seulement, le reste de la molécule étant librement en solution, sur une très grande variété de surfaces et les aligner par passage du ménisque comme décrit précédemment.
L'adsorption d'une macromolécule sur une surface peut se contr61er aisément à l'aide du pH ou de la teneur du milieu ionique du milieu ou d'une tension électrique appliquée sur la surface. On change ainsi les charges surfaciques et les interactions électrostatiques (répulsives ou attractives) entre la surface et 1~ molécule, ce qui permet de passer d'un état d'adsorp~ion complet de la molécule sur 1~ surface à une absence totale d'adsorption. Entre ces deux cas extremes, il exdste une plage des paramètres de controle ou l'adsorption se fait préférentiellement par l'extrémité des molécules et que l'on utilisera donc, avec avantage, pour les ancrer à la surface, puis les aligner par le 25 passage du ménisque.
Les molécules, une fois alignées, adhèrent fortement à la suriace. Dans le cas de l'ADN, elles ont pu etre observées par fiuorescence, plusieurs mois après leur alignement.
La présente invention est donc très différente de la méthode 30 proposée par Parra et Windle, car selon la présente invention, les molécules sont ancrées à la suriace puis uniformément alignées par le passage du ménisque, alors que dans la méthode de Parra et Windle un écoulement hydrodynamique est utilisé pour étirer de facon inhomogène Ic~ molécules q~ ~on~ s'ads~r~er n~n ~péci'quemen~ ~ ~a ~urface.

~Wo95J21939 ~1 82~0~ /r~ i6~
D'autres techniques peuvent aussi conduire à l'étirement et ipneml~nt de molécules. Ainsi une orientation dynamique de molécules en solution ancrées à une extrémité, peut etre obtenue par électrophorèse ou par un écoulement hydraulique.Toutefois, les résultats observés 5 montrent que ces techniques, sont beaucoup moins performantes que I'utili~:~rion du ménisque.
Par "ancrage~ de la macromolécule sur la surface il faut entendre une fixation résultant d'une réactivité chimique aussi bien par un lien covalent que par un lien non covalent tel qu'une liaison résultant 10 d'interactions physico-chimiques, tel l'adsorption comme décrit ci-dessus.
Cet ancrage de la macromolécule peut se faire directement sur (ou avec) la surface, ou indi~ e~ ..t, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un lien tel qu'une autre molécule, notamment une autre molécuie à
activité biologique. Lorsque l'ancrage se fait de maniere indirecte, la 15 macromolécule peut etre greffée chimiquement sur ledit lien, ou interagir de manière physico-chimique avec ledit lien, en p~rticulier lorsque ledit lien in~ c.iiai~ est une molecule à activité biologique l~ n~ t et interagissant avec ladite macrnmol~cl~le Dans un mode de réalisation, la macromolécule et ledit lien 20 sont toutes deux des molécules à activité biologique qui interagissent telles qu'antigène et anticorps respectivement, acides nucléiques complémentaires ou lipides. Dans ces cas, la fixation non covalente de la macromolécule consiste en une liaison de type antigène-anticorps, ligand-récepteur, hybridation entre fragments d'acides nucléiques 25 complémentaires ou interaction hydrophobe ou hydrophile entre lipides.
On met ainsi à profit la très grande specificité et la très grande sélectivité de certaines réactions biologiques, notamment les réactions antigènes/anticorps, les réactions d'hybridation d'ADN ou d 'ARN, les réactions interprotéines ou de type 30 avidine/streptavidine/biotine, de même que les réactions des ligands et de ~eurs réCepteurS.
Ainsi, pour réaliser l'ancrage direct ou indirect de la macromolécule sur la surface S on peut utiliser une surface solide présentant certaines spécificités. Il est en particulier possible d'utiliser wogsl21939 ~1 82~05 ~ r~a~ l65 certaines surfaces p~ C~.s pe~ cult de ftxer certaines protéines ou de l'ADN, qu'il ait été ou non modifié.
De telles surfaces sont commercialement disponibles (Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal par exemple) sous différentes 5 formes ~ ul~ à leur suface des ~ tC COOH, NH2 ou OH par exemple.
On peut alors fonctionnaliser l'ADN avec un groupement réactif, amine par exemple, et procéder à une réaction avec ces surfaces.
Ces méthodes nécessitent cependant une fonctionnalisation particulière 10 de l'ADN à fixer.
On a P~alPnnPnt décrit une technique permettant l'ancrage sans traitement préalable de l'ADN. Ce procédé consiste à faire réagir un phosphate libre de l'extrémité 5' de la molécule d'ADN avec une amine secondaire de la surface (surface NH Covalink).
L'ancrage par adsorption peut se faire par adsorption de l'extrémité de la molécule en contr61ant la charge surfacique à l'aide du pH, de la teneur ionique du milieu ou de l'application d'une tension électrique sur la surface compte-tenu des différences d'adsorption entre les e~ s de la molécule et sa partie inte~ . Selon la présente 20 Invention, on a ainsi ancré à titre d'exemple des molécules d'ADN non foncti-lnn~lic~P~ sur des surfaces recouvertes de molécules terminées par un groupe vinyl ou amine telles que des molécules de polylysine ou des surfaces diverses telles que du verre, recouvertes de molécules du type silane terminées par des ~l VU~ lts vinyl ou amine ou encore des 25 lamelles de verre préalablement nettoyées dans un bain d'acide. Dans ce dernier cas, la surface du verre présente en fait des groupes SiOH.
Dans tous ces cas, la plage de pH où l'ADN est ancré est choisie pour etre entre un état d'adsorption complet et une absence d'adsorption, cette dernière se situant à pH plus basique. Il est entendu que cette 30 technique est très générale et peut être étendue par l'homme de l'art à de très nombreux types de surfaces.
On peut aussi fonctionnaliser l'ADN avec un premier groupement réactif ou une protéine P0 pour la faire réagir avec une surface recouverte d'un deuxième ~ u~elll,.lt réactif ou d'une protéine 35 Pl, susceptibies de réagir spécifiquement entre eux (ou elles) respectivement, c'est-à-dire par exemple, Pl avec P0. Le couple Po/PI peut ~W095/21939 21829~ r~l/r~a 165 être un couple de type biotine/streptavidine (Zimmermann et Cox) ou digoxdgénine/anticorps dirigé contre la digoxigénine (anti-DiG), par exemple (Smith et al., Science ;~, 1122 (1992)).
De préference, les surfaces d'ancrage présenteront un bas S taux de nu~ ce pour ne pas gener ia détection des molécules après leur ~ nPmPrlt, en particulier si celle-ci se fait par f uorescence.
Selon la présente invention, on utilisera de préférence un support solide présentant dans les conditions de réaction une surface ayant une affinité pour une partie de la macromolécule sP~IlPmPnt~ le reste 10 de celle-ci restant librement en solution.
Dans.un mode de réalisation, on utilise un support solide présentant en surface au moins une couche d'un composé organique ~ S~ dll~, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé ayant une affinité pour un type de molecule à activité biologique qui peut être ladite 15 macromolécule elle-même ou une molécule reconnaissant et/ou interagissant avec elle.
Le support peut donc présenter une surface recouverte d'un groupement réactif ou d'une molécule à activité biologique.
Par ~affinite", il faut entendre ici aussi bien une réactivité
20 chimique qu'une adsorption d'un type quelconque, ceci dans les conditions éventuelles de fixation des molécules sur le groupement exposé
modifié ou non.
Dans un mode de réalisation, la surface est essentiellement compacte, c'est-à-dire qu'elle limite l'accès de la macromolécule à activité
25 biologique au,Y couches inférieures et/ou au support, ceci afin de minimiser les interactions non-spécifiques.
On peut aussi utiliser des surfaces recouvertes d'un groupement exposé réactif (par exemple NH2, COOH, OH, CHO) ou d'une macromolécule à activite biologique (par exemple: des proteines, telles la 30 streptavidine ou des anticorps, des acides nucléiques tels des oligonucléotides, des lipides des polysaccharides et leurs dérivés) capable de fixer une partie éventuellement modifiée de la molécule.
Ainsi des surfaces recouvertes de streptavidine ou d'un anticorps suivant des procédés connus ("Chemistry of l'rotein Conlugation 35 and Cross-linking~, S.C. Wong, CRC Press (1991)) sont capables de fixer une macromolécule présentant en un site particulier une biotine ou un antigène.

21 8~90~i WO gS/21939 r~,llrr~ l65 ~

De meme des surfaces traitées de manière a présenter des oligonucléotides simple-brin peuvent servir pour y ancrer des ADN/ARN
possédant une séquence ~u~ e.
Parmi les surfacês ~u~u,uul L~ul~ un ~. u~ t réactif exposé, S on cite celles sur lesquelles le ~IOu,u..ll~.lt exposé est un groupement -COOH, -CHO, NH2, -OH, ûU un ~IUUIJ..ll~.l~ vinyl .UIIIUUII~t une double liaison-CH=CH2 utilisée telle quelle ou qui peut etre activée pour donner nùl .,.,.. ,1 les groupes -CHO, -COOH, -NH2 ou OH.
Les supports à surfaces hautement spécifiques selon la 10 présente invention peuvent etre obtenues par la mise en oeuvre de divers procédés. On peut citer à titre d'exemple:
(A) une couche de polymère carboné, éventuellement branché, d'au moins 1 nm d'épaisseur présentant des ~IOU,u.. L~ réactifs tels que définis ci-après et 15 (B) des surfaces obtenues par dépot ou ancrage sur un support solide d'une ou plusieurs couches moléculaires, celles-ci peuvent etre obtenues par la formation de couches successives fixées par liaisons non-covalentes, a type d'exemple non limitatif, les films de Langmuir-Blodgett, ou par auto-~cc~mhl~e moléculaire, ceci permettant la formation d'une couche fixée par liaison covalente.
Dans le premier cas, la surface peut etre obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère ledit ~;IUU,U~:lll..lt exposé, ou bien par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé, ou Z5 encore par dépot de polymère.
Dans ce procédé, le polymère formé présente des liaisons vyniles tel un dérivé polyenlque, notamment des surfaces de type caoutchouc synthétique, tel que le polybutadièn~, le polyisoprène ou le caoutchouc naturel.
Dans le deuxième cas, la surface h~utement spécifique comporte - sur un support, une couche sensiblement monomoléculaire d'un compos~ organique de structure allongée ayant au moins:
un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et .

~ WO95121939 21 829155 r llrl 16~

un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant éventuellement, après une modification chimique suivant la fixation, une affinité pour un type de molécule biologique.
La fixation peut etre tout d'abord de type non-covalent, notamment de type hydrophile/hydrophile et hydrophobe/hydrophobe, comme dans les films de Langmuir-Blodgett (K.B. Blodgett, J. Am. Chem.
Soc 57, 1007 (1935).
Dans ce cas, le ~1uu~ t exposé ou le groupement de fixation seront, soit hydrophiles, soit hydrophobes, notamment des groupements alkyles ou halogénoalkyles tels que CH3, CF3, CHF3, CH~F, I'autre groupement étant hydrophile.
La fixation peut etre également de type covalent, le groupement de fixation va alors réagir chimiquement sur le support.
Certaines surfaces de structure approchante ont déjà été
mentionnées dans le domaine électronique, notamment lorsque les fixations sont covalentes, L Netzer et ~. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) et US-A-4 539 061.
Parmi les groupements de fixation, il faut citer plus particulièrement les groupements de type alkoxyde de métal ou de semiconducteur, par exemple silane, notamment chlorosilane, silanol, méthoxy et éthoxysilane, silazane, ainsi que les groupements phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d~acide, aldéhyde.
Tout particulierement, comme groupement de fixation on préfèrera utiliser des groupements susceptibles de réagir transversalement avec un groupe équivalent, voisin, pour fournir les liaisons transversales, par exemple il s'agira de dérivés de type alkoxyde de métal ou de semiconducteur, par exemple silane, notamment dichlorosilane, trichlorosilane, diméthoxysilane ou diéthoxysilane et trimétho.~y ou triéthoxysilane.
Le choix du groupement de fixation dépendra évidemment de la nature du support, les ~luu~ ts de type silane sont bien adaptés pour la fixation covalente sur le verre et la silice.

~1 829~5 W0 9S12193g ~ rl ''C 16 Pour ce qui concerne les gro-lrf-m.-nt.~ eAposés, et quelle que soit la surface, ils seront choisis de préférence parmi les ~ lUUp~ S
éthyléniques, acétyléniques ou des radicaux aromatiques, les amines primaires, tertiaires ou se.ulldcu.~O, les esters, les nitriles, les aldéhydes, 5 les halogènes. Mais il pourra s'agir tout particulièrement du groupement vinyl; en effet, celui-ci peut etre soit modifié chimiquement après fiAation pour conduire, par exemple, à un groupement carboxylique ou des dérivés de ~;luu~ l..ltS carboAyliques tels que des ~ luul,.,--..l~ alcools, aldéhydes, cétones, acides, amines primaires, secondaires ou tertiaires, soit 10 conduire à un ancrage direct pH dépendant des macromolécules biologiques telles que acides nucléiques et protéines sans modification chimique de la surface ou des macromolécules.
De préférence, les chaines reliant le groupement eAposé au 1 ~ UU,U..Il..lt de fixation sont des chaines co...pu. ~UIt au moins 1 atome de 15 carbone, de préférence plus de 6 et en général de 3 à 30 atomes de carbone.
Pour ce qui concerne le support lui-même, on préfère utiliser de facon générale, du verre, du silicium oYydé en surface, un polymère ou de l'or avec ou sans prétraitement de la surface.
On peut a~ r~ "t utiliser, dans le cas du verre ou de æ la silice, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisant des derivés silanes, par exemple: Si-OH + Cl3-Si-R-CH=CH2 donne Si-O-Si-R-CH=CHz, R consistant par exemple en (CH 2)-~- Une telle réaction est connue dans la littérature, avec utilisation de solvant ultra-purs. ia réaction conduit à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface 25 exposée à l'eAterieur.
Dans le cas de l'or, celui-ci étant éventuellement sous la forme d'une couche mince sur un substrat, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisent des dérivés thiols, par exemple: Au + HS-R-CH=CH2 donne Au-S-R-CH=CH2, R consistant par exemple en (CH2)~.
30 Une telle réaction est décrite en milieu liquide et conduit, de même que la réaction précédente trichlorosilane-silice, à un tapis de molécules présentant leur eAtrémité C=C à la surFace exposée à l'extérieur.

~WO95121939 ~ i r~llrl~ 6s Bien entendu la terminologie de "support" englobe aussi bien une surface unique telle qu'une lame, mais ~ mPnt des particules qu'il s'agisse de poudre de silice ou de billes de polymère, et aussi des formes quelconques telles que barre, fibre ou support structure, lesquelles 5 peuvent d'ailleurs être rendues magnétiques, fiuorescentes ou colorées, cornme cela est connu dans dir~ es tl~hnrllrlgi~c de dosage.
De l,l.r~.~..ce, le support sera choisi pour être pas ou peu lluuL.O.elll lorsque la détection sera effectuée par fiuorescence.
Les surfaces obtenues selon les modes (A) ou (B) ci-dessus présentent:
(i) un très faible taux de fiuorescence intrinseque, lorsque cela est requis, un bruit de fond de fiuorescence (d'une aire typique de 100 x 100 llm) plus faible que le signal de fluorescence d'une seule molécule à détecter;
15 (ii) la possibilité de détecter des molécules isolées avec un rapport S/N
indépendant du nombre de molécules, qui est possible grace à
différentes techniques à grand rapport S/N décrites plus bas et basées sur l'identification de la présence d'un marqueur macroscopique presentant une faible interaction non-spécifique avec la surface.
Les surfaces ainsi obtenues sont, de préfcrence, revêtues d'une macromolécule à activité biologique choisie parmi:
- les protéines, - les acides nucléiques, 25 - les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.
Parmi les protéines, il faut citer les antigènes et les anticorps, les ligands, les lé~el.L~ul~, mais également des produits de type avidine ou streptavidine ainsi que les dérivés de ces composés.
Parmi les ARN et les ADN, il faut egalement citer les dérivés ~, f, ~insi que les dérivés thio et les composés mixtes tels que les PNA.
On peut également flxer des composés mixtes tels que les glycopeptides et les lipopolysaccharides par exemple, ou bien d'autres éléments tels que virus, cellules notamment, ou composés chimiques tels que la biotine.

21 8~9Q5 wogs/21s3s ~ r~t~l6 La fixation des macromolécules biologiques peut etre covalente ou non-covalente, par exemple par adsorption, liaisons hydrogènes, ~ .ls h~ ilopllobes, ioniques, par exemple, auquel cas on pourra procéder avantageusement à un pontage (Ucross-linking'') S entre les molécules greffées par les méthodes connues (Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) et ceci afin de renforcer leur cohésion.
Comme cela a été mentionné précédemment, il est possible d'avoir un ~IOU~ ,.t exposé qui permet la réaction directe avec les 10 molécules à activité biologique, mais il est égaiement possible de prévoir que le ~ u~ lL exposé est traité, après fixation, pour etre ~ rO.I..~, comme cela a eté indiqué précédemment, en un radical hydroxy, amine, alcool, aldéhyde, cétone, COOH ou dérivé de ces groupements avant la fixation de la molécule biologique.
iorsque de tels y,lOUI.)~III~III:> ont été exposés, les techniques de fixation des protéines et/ou de l'ADN, par exemple, sont connues, il s'agit en effet de réactions mises en oeuvre pour des surfaces qui sont déjà
utilisées dans ie cadre des analyses biologiques, notamment pour les surfaces Costar et les surfaces Nunc ou des microbilles telles qu'Estapor, 20 Bang et Dynai par exemple, sur lesquelles on ancre des molécules d'intéret biologique, ADN, ARN, PNA, protéines ou anticorps par exemple.
Dans le cas où le groupement exposé est un radicai -CH=CH2 qui est nommé ci-après ~surface C=C~ ou "surface à liaison éthylénique~, il n'existe pas de document m~ntionn~nt l'ancrage direct, en particulier de 25 I'ADN ou des protéines.
Dans le cadre de la présente invention, il a été démontré que ces surfaces présentent une réactivité fortement pH dépendante. Cette particularité permet d'ancrer les acides nucléiques ou les protéines en utilisant des zones de pH et souvent avec une vitesse de réaction qui peut 30 ~tre controlée par le pH.
On peut réaliser l'ancrage de l'ADN par son eAtrémité sur une surface préserltant des ~roupements a double liaison éthylénique en mettant l'ADN en présence de la surface à un pH inferieur à 8.
i-n particulier la réaction est conduite à un pH compris entre 35 5 et ~ puis est stoppée à pH 8.

Wo95/21939 21 8~9~ /r~ 165 Ainsi, pour l'ADN à pH 5,5, la réaction d'ancrage est totale en une heure (si pas limitée par la diffusion) et se produit par les t:,.Llénli~t~.A pH 8, par contre, I'd~ , est très faible (vitesse de réaction de 5 à 6 ordres de grandeur plus faibles). Cet effet d'accrochage pH ~l~r~nfl~nt et 5 spécifique des ~l élld~és, présente une amélioration par rapport aux autres surfaces qui nécessitent une fonctionn~lic?tior~ de l'ADN (biotine, DIG, NHS, ...) ou des réactifs spécifiques tcarbodiimide, diméthyle pimélidate) qui réalisent une liaison peptidique ou phosphorimide entre -NHt et -COOH ou -POOH.
On peut aussi realiser l'ancrage d'ADN par adsorption de ses extrémités seulement sur une surface recouverte de polylysine ou d'un ou~ silane terminé par un groupe amine.
Pour réaliser l'ancrage de l'ADN par son extrémité sur une surface recouverte par un ~.~,u},~ .lt amine on met l'ADN en présence de la surface à pH entre 8 et 10.
De meme on peut réaliser l'ancrage d'ADN par son extrémité
sur une surface de verre traité auparavant dans un bain d'acide, en mettant l'ADN en présence de ladite surface à pH entre 5 et 8.
Il va de soi que la présente invention implique, dans le même esprit, I'accrochage éventuellement pH dépendant de toutes macromolécules d'intéret biologique.
De meme ces surfaces peuvent ancrer des protéines dil~ llt (protéine A, anti-DlG, anticorps, streptavidine, etc.). Il a été
observé que (i) I'activité de la molécule peut etre préservée et (ii) que la réactivité de la surface préparée (initialement C-C) est totalement occultée pour faire place à la seule réactivité de la molécule d'intéret. Il est donc possible, à partir d'une réactivité initiale relativement large, de passer à
une surface possédant une réactivité très hautement spécifique, par exemple celle de sites spécifiques sur une protéine.
En ancrant un anticorps spécifique sur la surface (par exemple anti-DlG), on crée une surface dont la réactivité est limitée à
l'antigène (par exemple le groupement DIG). Ceci indique que les groupements chimiques initiaux ont tous été occultés par les anticorps greffés. 2182q ~ 5 Wo 95/21939 ~ r ~. 165 METHOD FOR ALIGNING MACROMOLECULES BY PASSING A
MENISQUE AND APPLICATIONS
The present invention relates to a method of ~ nf ~ m ~ have Macromolecules such as polymers or macromolecules to biological activity, including DNA, or proteins. The current The invention also relates to the application of this method in methods of highlighting, measurement of intra-molar distance, Separation and / or dosing of a macromolecule in an e ~ h ~ ntill-Controlling the conformation of macromolecules represents a important industrial issue, for example in the manufacture of sensors or controlled molecular assemblages or even in the problems of detection and analysis. It may be interesting to have a conformation elongated molecular. For example, in the case where polymers are grafted onto a substrate, it has been proposed to extend them by the action of a electric field, a flow or using optical tweezers. In particular, in biology, the alignment of DNA - by electrophoresis (Zimmerman and Cox Nucl Acid Res 22, p-92, 1994), free-flowing (Parra and Windle, Nature Genetics, 5, p 17, 1993 and WO 93/22463) or in a gel (Schartartz et al., Science 262, p 110, 1993 and USP 33531) or with the aid of optical tweezers (Perl; ins et al., Science 26 ~ 1 p 819, 1994 and also USP
5079169) - opens up many possibilities in cartography, or in the detection of pathogens.
These methods generally allow only an alignment imperfect, or transient - that is to say, we have relaxation of the molecule, once the constraint disappears. In the case of optical tongs, the method is cumbersome, limited to one molecule at a time, and delicate to implemented by unqualified staff.
It has been proposed (1. Parra and B. Windle and WO 93/22463) a particular technique of aligning the DNA by flow after Iyse dc cell, then drying. The alignment obtained is very imperfect and inhomogeneous and many non-aligned clusters are observed.
The subject of the present invention is an original method:
simple to align macromolecules on the surface S of a support characterized in that the line S is moved on the line 21 ~ 2q (~
WO95 / 21939 r ~, l / r1 ~ 5 16'i triple S / A / B (meniscus) resulting from the contact of a solvent A with the S surface and a medium B, said macromolecules having a portion, in particular one end, anchored on the surface S, the other part, no ~ rll ~ the other end, being in solution in the solvent A.
It has been observed according to the present invention that the only passage of a meniscus on molecules some of which is anchored on a substrate, the rest of the molecule being freely in solution allows them to align evenly with the meniscus in motion leaving them adsorbed on the surface behind the meniscus. This phenomenon is called here "molecular combing.
Longer stretching of the free part of the molecule is done by the passage of the triple line S / A / B, con ~ titl ~ nt the meniscus between the surface S, the solvent A and a medium B which can be a gas (in general air) or other solvent.
In a particular embodiment, the meniscus is a meniscus water-air, that is to say that the solvent A is an aqueous solution and medium B is air.
Moreover it is possible to extend the air / water used here to stretch the molecule to other systems such as oil / water or 20 water / surfactant / air, in particular.
The displacement of the meniscus can be done by any means of Relative displacement of fluids A and B with respect to the surface S. In a mode of réallsation, the surface S can be removed from the solvent A or conversely, the solvent A can be recycled from the surface S.
In particular the meniscus can be moved using a mechanical means, pneumatic nf ~ t ~ mm ~ nt by sucking or blowing a gas, or hydraulic, especially by pushing or sucking the solvent A or the middle B.
Thus the meniscus can be moved by progressive evaporation of the solvent A.
When the movement of the meniscus is effected by mechanically, it can be done either by translation of the A / B interface, or by translation of the surface S.
In a particular embodiment, the solvent is placed between two supports, at least one of which corresponds to said surface support S and the meniscus is displaced for example by evaporation.
.. _ ..,. .. ,,,. ,. ,. , ....., _, _,, _ _, _ _ _ ,, _ _.

~ W095 / 21939 21 ~ 9 ~ r ~ l ~ r ~ 5 ~ 6s By "support" is meant here any substrate whose cohesion is sufficient to resist the passage of the meniscus.
The support can be constituted at least on the surface by a organic or inorganic polymer, a metal, in particular gold, a Metal oxide or sulfide, a semiconductor element or an oxide semiconductor element, such as silicon oxide or comhin ~ ic-m of these, such as glass or ceramics.
We cite more particularly the erre, the silicon o, Yydé in surface, graphite, mica and molybdenum sulfide.
As a "support", it is possible to use a single support such that a blade, beads, especially polymer, but also forms any such as bar, Rbre or structured support, and also particles, whether they be powders, in particular silica powders, which can also be made fluorescent magnetic or colored as is known in the various n ~ (hnolo ~ ie.c dosing.
The support is advantageously in the form of plates. Of preferably, the carrier shows little or no fluorescence.
Macromolecules, such as any polymers, or biological polymers such as DNA, RNA or Proteins, can be anchored by 4uelcull4u. ~ methods on a support.
The macromolecule to be aligned can be chosen from biological macromolecules such as proteins, especially antibodies, antigens, ligands or their receptors, nucleic acids, DNA, RNA or PNA, lipids, polysaccharides and their derivatives.
It has been observed according to the present invention that the force stretching acts locally in the immediate vicinity of the meniscus. She is independent of the length of the molecule, the number of molecules anchored, and in a wide range, the speed of the meniscus. These features are particularly interesting for aligning homogeneous and reproducible fason molecules.
According to the present invention, it is possible to add elements surfactants in the soil ~ ant A and / or medium B, which modify the properties of the interfaces. According to the present invention stretching can in can be controlled by the addition of surfactants, or by a treatment of 3 ~ adequate surrace.

21 82 ~ 5 ~ r ~ l65 wo 95121939 Too much surface-macromolecule attraction (by an excessively high level of adsorption) can affect the alignment of molecules by the meniscus, the latter remaining adsorbed at the surface in a condition not necessary ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Preferably, the surface has a low S adsorption rate of said macromolecule, so that only the anchored molecules will be aligned, the others being driven by the meniscus.
C.-rf ~ nl ~ nt, we can play on the adsorption differences between a part of the macromolecule rll ~ t ~ mm ~ nt its ends and its 10 other parts (especially for long molecules, such as DNA or collagen) to adsorb adsorption molecules in particular their end (s) only, the rest of the molecule being freely in solution, on a very wide variety of surfaces and align by passing the meniscus as previously described.
The adsorption of a macromolecule on a surface can easily check with the pH or ionic media content of the medium or electrical voltage applied to the surface. We change thus surface charges and electrostatic interactions (repulsive or attractive) between the surface and the molecule, which allows go from a full adsorpion ion state of the molecule on 1 ~ surface to a total absence of adsorption. Between these two extreme cases, it exdste a range of control parameters or adsorption is done preferentially by the end of the molecules and which will be used so, with advantage, to anchor them to the surface and then align them by 25 passage of the meniscus.
The molecules, once aligned, strongly adhere to the suriace. In the case of DNA, they could be observed by fluorescence, several months after their alignment.
The present invention is therefore very different from the method Proposed by Parra and Windle, because according to the present invention, the molecules are anchored to the superficial then uniformly aligned by the passage of the meniscus, whereas in the method of Parra and Windle a hydrodynamic flow is used to stretch inhomogeneously Ic ~ q ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

~ Wo95J21939 ~ 1 82 ~ 0 ~ / r ~ i6 ~
Other techniques can also lead to stretching and ipneml ~ nt of molecules. Thus a dynamic orientation of molecules in solution anchored at one end, can be obtained by electrophoresis or by a hydraulic flow.However, the observed results 5 show that these techniques are much less efficient than The use of the meniscus.
By "anchoring" of the macromolecule on the surface it is necessary hearing a fixation resulting from a chemical reactivity as well by a covalent bond only by a non-covalent bond such as a resulting bond 10 of physicochemical interactions, such as adsorption as described above.
This anchoring of the macromolecule can be done directly on (or with) the surface, or indi ~ e ~ ..t, ie via a link such as another molecule, especially another molecule to biological activity. When the anchoring is done indirectly, the Macromolecule can be chemically grafted onto said link, or interact in a physico-chemical way with said link, particularly when said link in ~ c.iiai ~ is a molecule with biological activity l ~ n ~ t and interacting with said macrnmol ~ cl ~ le In one embodiment, the macromolecule and said link Both are interacting biological molecules such as antigen and antibodies respectively, nucleic acids complementary or lipid. In these cases, the non-covalent attachment of the macromolecule consists of an antigen-antibody binding, ligand-receptor, hybridization between nucleic acid fragments Complementary or hydrophobic or hydrophilic interaction between lipids.
We thus take advantage of the very great specificity and the very high selectivity of certain biological reactions, including antigen / antibody reactions, DNA hybridization reactions or of RNA, interprotein or type reactions Avidin / streptavidin / biotin, as well as the reactions of ligands and RECEIVERS.
Thus, to achieve the direct or indirect anchoring of the macromolecule on the surface S can be used a solid surface presenting certain specificities. In particular it is possible to use wogsl21939 ~ 1 82 ~ 05 ~ r ~ a ~ l65 some surfaces may be required to attach certain proteins or DNA, whether or not it has been modified.
Such surfaces are commercially available (Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal for example) under different 5 forms ~ ul ~ at their surface ~ tC COOH, NH2 or OH by example.
We can then functionalize the DNA with a grouping reagent, amine for example, and react with these surfaces.
These methods, however, require particular functionalization 10 of the DNA to be fixed.
A technique for anchoring has been described.
without prior treatment of the DNA. This process consists of reacting a free phosphate from the 5 'end of the DNA molecule with an amine secondary surface (NH Covalink surface).
Adsorption anchoring can be by adsorption of the end of the molecule by controlling the surface charge using the pH, the ionic content of the medium or the application of a voltage on the surface given differences in adsorption between the e ~ s of the molecule and its inte ~ part. According to this Invention, non-native DNA molecules have thus been anchored by way of example.
functi-lnn ~ lic ~ P ~ on surfaces covered with molecules terminated by a vinyl or amine group such as polylysine molecules or various surfaces such as glass, covered with molecules of the type silane terminated by ~ l VU ~ lts vinyl or amine or even 25 glass slides previously cleaned in an acid bath. In this In the latter case, the glass surface actually has SiOH groups.
In all these cases, the pH range where the DNA is anchored is chosen to be between a complete adsorption state and a lack of adsorption, the latter being at a more basic pH. It is understood that this The technique is very general and can be extended by those skilled in the art to very many types of surfaces.
We can also functionalize the DNA with a first reactive group or a P0 protein to react with a surface covered with a second ~ u ~ elll, .lt reagent or protein 35 Pl, susceptible to react specifically between them (or they) respectively, that is, for example, P1 with P0. The Po / PI couple can ~ W095 / 21939 21829 ~ r ~ l / r ~ a 165 biotin / streptavidin combination (Zimmermann and Cox) or digoxdgenin / antibody against digoxigenin (anti-DiG), by example (Smith et al., Science, 1122 (1992)).
Preferably, the anchoring surfaces will have a bottom S rate of nu ~ ce not to gener ia the detection of molecules after their ~ nPmPrlt, especially if it is forescent.
According to the present invention, a solid support having in the reaction conditions a surface having an affinity for part of the macromolecule sP ~ IlPmPnt ~ the rest 10 of it remaining freely in solution.
In one embodiment, a solid support is used having on the surface at least one layer of an organic compound ~ S ~ dll ~, outside the layer, an exposed group having a affinity for a type of biologically active molecule that can be said Macromolecule itself or a recognizing molecule and / or interacting with her.
The support can therefore have a surface covered with a reactive group or a molecule with biological activity.
By "affinite", we must understand here also a reactivity Chemical adsorption of any type, this in the possible conditions for fixing the molecules on the exposed group modified or not.
In one embodiment, the surface is essentially compact, that is to say that it limits the access of the macromolecule to The lower layers and / or the support, in order to minimize non-specific interactions.
It is also possible to use surfaces covered with a reactive exposed group (eg NH2, COOH, OH, CHO) or a macromolecule with biological activity (for example: proteins, such as Streptavidin or antibodies, nucleic acids such as oligonucleotides, lipids and polysaccharides) capable to fix an optionally modified part of the molecule.
Thus surfaces coated with streptavidin or a antibodies according to known methods ("Chemistry of Rotein Conlugation 35 and Cross-Linking, SC Wong, CRC Press (1991)) are able to set a macromolecule having at a particular site a biotin or a antigen.

21 8 ~ 90 ~ i WO 7 S / 21939, R1, R1, L65 Similarly surfaces treated so as to present single-stranded oligonucleotides can be used to anchor DNA / RNA
having a sequence ~ u ~ e.
Among the surfacês ~ u ~ u, uul L ~ ul ~ a ~. u ~ t exposed reagent, We cite those on which the above-mentioned one is a grouping -COOH, -CHO, NH2, -OH, a ~ IUUIJ..ll ~ .l ~ vinyl .UIIIUUII ~ t a double bond-CH = CH2 used as it is or which can be activated to give ## STR5 ## wherein the groups -CHO, -COOH, -NH 2 or OH.
Supports with highly specific surfaces according to the The present invention can be obtained by the use of various processes. As an example:
(A) a carbon polymer layer, possibly connected, from minus 1 nm thick with ~ IOU, u .. L ~ reagents as defined below and (B) surfaces obtained by depositing or anchoring on a solid support of one or more molecular layers, these can be obtained by the formation of successive layers fixed by bonds non-covalent, as a non-limiting example, the films of Langmuir-Blodgett, or by molecular auto-~ cc ~ mhl ~ e, this allowing the formation of a covalently bonded layer.
In the first case, the surface can be obtained by polymerization of at least one monomer generating at the surface of polymer said ~; IUU, U ~: lll..lt exposed, or by partial depolymerization the surface of a polymer to generate said exposed group, or Z5 again by polymer deposit.
In this process, the polymer formed has vyniles such as a polyenic derivative, especially surfaces of the type synthetic rubber, such as polybutadiene ~, polyisoprene or natural rubber.
In the second case, the specific heme surface includes on a support, a substantially monomolecular layer of a organic compound of elongate structure having at least:
a fixing group having an affinity for the support, and .

~ WO95121939 21 829155 r llrl 16 ~

an exposed group with little or no affinity for said support and said fixing group in the fixing conditions, but possibly with after a chemical modification following fixation, a affinity for a type of biological molecule.
The attachment may be first of a non-covalent type, in particular of hydrophilic / hydrophilic and hydrophobic / hydrophobic type, as in Langmuir-Blodgett's films (KB Blodgett, J. Am. Chem.
Soc. 57, 1007 (1935).
In this case, the ~ 1uu ~ t exposed or the grouping of fixation will be either hydrophilic or hydrophobic, alkyl or haloalkyl groups such as CH 3, CF 3, CHF 3, CH 2 F, The other group being hydrophilic.
The attachment may also be of the covalent type, the fixing group will then react chemically on the support.
Some surfaces of similar structure have already been mentioned in the electronic domain, especially when fixations are covalent, L Netzer and ~. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) and US-A-4,539,061.
Among the fixation groups, it is necessary to mention more particularly the groups of the metal alkoxide or semiconductor, for example silane, in particular chlorosilane, silanol, methoxy and ethoxysilane, silazane, as well as phosphate groups, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonic, carboxylic, boronic, halogen, halide acid, aldehyde.
Especially, as a fixing group on will prefer to use groups likely to react transversely with an equivalent group, neighbor, to provide the cross-links, for example it will be alkoxide-type derivatives metal or semiconductor, for example silane, in particular dichlorosilane, trichlorosilane, dimethoxysilane or diethoxysilane and trimetho. ~ y or triethoxysilane.
The choice of fixing group will obviously depend on the nature of the support, the ~ luu ~ ts of silane type are well adapted for covalent attachment to glass and silica.

~ 1 829 ~ 5 W0 9S12193g ~ rl '' C 16 With regard to the reports, and whichever the surface, they will be chosen preferably from the ~ lUUp ~ S
ethylenic, acetylenic or aromatic radicals, amines primary, tertiary or sulphonyl ether, esters, nitriles, aldehydes, Halogens. But it could be especially the grouping vinyl; indeed, it can be either chemically modified after FiAation to lead, for example, to a carboxylic group or derivatives of carbohydric salts such as luul, alcohols, alcohols, aldehydes, ketones, acids, primary, secondary or tertiary amines, or 10 lead to a direct anchoring pH dependent on macromolecules biologicals such as nucleic acids and proteins without modification chemical surface or macromolecules.
Preferably, the chains connecting the group eAposed to 1 ~ UU, U..Il..lt fixing are chains co ... pu. ~ UIt at least 1 atom of Carbon, preferably more than 6 and in general from 3 to 30 carbon atoms.
Regarding the support itself, we prefer to use in a general way, glass, silicon dioxide on the surface, a polymer or gold with or without pretreatment of the surface.
It is possible to use, in the case of glass or silica, the known techniques of surface functionalization using silane derivatives, for example: Si-OH + Cl3-Si-R-CH = CH2 gives Si-O-Si-R-CH = CHz, R being for example (CH 2) - ~ - Such a reaction is known in the literature, using ultra-pure solvent. the reaction leads to a carpet of molecules presenting their C = C end to the surface 25 exposed to the interior.
In the case of gold, this being possibly under the form of a thin layer on a substrate, the known techniques of surface functionalization use thiol derivatives, for example:
+ HS-R-CH = CH 2 gives Au-SR-CH = CH 2, R being for example (CH 2) -.
Such a reaction is described in a liquid medium and conducted, as well as previous reaction trichlorosilane-silica, to a carpet of molecules presenting their end C = C at the surface exposed on the outside.

~ WO95121939 ~ ir ~ llrl ~ 6s Of course, the terminology of "support" also encompasses well a single surface such as a blade, but ~ mPnt particles whether it is silica powder or polymer beads, and also any forms such as bar, fiber or support structure, which 5 can also be made magnetic, fiuorescent or colored, as is known in the literature.
From there, the support will be chosen to be not or little lluuL.O.elll when the detection is carried out by fluorescence.
The surfaces obtained according to the modes (A) or (B) above present:
(i) a very low level of intrinsic fluorescence, when this is required, a background of fluorescence (with a typical x 100 μm) weaker than the fluorescence signal of a single molecule to be detected;
(Ii) the ability to detect isolated molecules with a S / N ratio independent of the number of molecules, which is possible thanks to different S / N techniques described below and based on the identification of the presence of a marker Macroscopic with weak non-specific interaction with the surface.
The surfaces thus obtained are, preferably, coated a macromolecule with biological activity chosen from:
- the proteins, nucleic acids, Lipids, polysaccharides and their derivatives.
Among the proteins, we must mention antigens and antibodies, ligands, lé ~ el.L ~ ul ~, but also products of the type avidin or streptavidin and the derivatives of these compounds.
Among RNAs and DNAs, derivatives must also be mentioned.
~, f, ~ as thio derivatives and mixed compounds such as PNA.
Mixed compounds such as glycopeptides and lipopolysaccharides, for example, or other elements such as viruses, especially cells, or chemical compounds such than biotin.

21 8 ~ 9Q5 wogs / 21s3s ~ r ~ t ~ l6 Fixation of biological macromolecules can be covalent or non-covalent, for example by adsorption, bonds for example, in which case hydrogen, h ~ ilopllobes, ionic we can proceed advantageously to a bridging (Ucross-linking '') S between the grafted molecules by known methods (Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking ", SC Wong, CRC Press (1991)) and this to strengthen their cohesion.
As mentioned previously, it is possible to have a ~ IOU ~, .t exposed which allows the direct reaction with the 10 molecules with biological activity, but it is also possible to predict that the ~ u ~ lL exposed is treated, after fixation, to be ~ rO.I .. ~, as has been indicated previously, to a hydroxy, amine radical, alcohol, aldehyde, ketone, COOH or derived from these groups before fixation of the biological molecule.
when such y, lOUI.) ~ III ~ III:> were exposed, the techniques protein binding and / or DNA, for example, are known, it is This is in fact reactions implemented for surfaces that are already used in the context of biological analyzes, in particular for Costar surfaces and Nunc surfaces or microbeads such as Estapor, 20 Bang and Dynai for example, on which we anchor molecules of interest biological, DNA, RNA, PNA, proteins or antibodies for example.
In the case where the exposed group is a radicai -CH = CH2 which is named below ~ surface C = C ~ or "surface with ethylenic bond ~, it There is no document that provides direct anchoring, particularly DNA or proteins.
In the context of the present invention, it has been demonstrated that these surfaces have a strongly pH-dependent reactivity. This particularity allows to anchor nucleic acids or proteins in using pH areas and often with a reaction rate that can 30 ~ be controlled by the pH.
It is possible to anchor the DNA by its end on a surface presembling ~ roupements with double bond ethylenic in putting the DNA in the presence of the surface at a pH below 8.
in particular the reaction is conducted at a pH between 35 and ~ then is stopped at pH 8.

Wo95 / 21939 21 8 ~ 9 ~ / r ~ 165 Thus, for DNA at pH 5.5, the anchoring reaction is total in one hour (if not limited by diffusion) and occurs by the t:,. Llénli ~ t ~ .A pH 8, by cons, I'd ~, is very low (reaction rate of 5 to 6 orders of magnitude lower). This effect of hooking pH ~ l ~ r ~ nfl ~ nt and 5 specific to the elld ~ és, presents an improvement over other surfaces which require a ~ lic ~ tior ~ function of the DNA (biotin, DIG, NHS, ...) or specific reagents tcarbodiimide, dimethyl pimelidate) which carry out a peptide or phosphorimide bond between -NHt and -COOH or -POOH.
It is also possible to carry out the DNA anchoring by adsorption of its ends only on a surface covered with polylysine or a or ~ silane terminated with an amine group.
To anchor the DNA by its end on a surface covered by a ~. ~, u}, ~ .lt amine is put the DNA in the presence the surface at pH between 8 and 10.
Similarly one can achieve the anchoring of DNA by its end on a previously treated glass surface in an acid bath, in placing the DNA in the presence of said surface at pH between 5 and 8.
It goes without saying that the present invention implies, in the same mind, possibly pinning pH dependent on all macromolecules of biological interest.
Similarly these surfaces can anchor proteins dil ~ llt (protein A, anti-D1G, antibody, streptavidin, etc.). He was observed that (i) the activity of the molecule can be preserved and (ii) that the reactivity of the prepared surface (initially CC) is completely obscured to make room for the only reactivity of the molecule of interest. It is therefore possible, from a relatively broad initial reactivity, to move to a surface having a very highly specific reactivity, by example that of specific sites on a protein.
By anchoring a specific antibody on the surface (by example anti-DlG), we create a surface whose reactivity is limited to the antigen (for example the DIG group). This indicates that initial chemical groups were all obscured by the antibodies grafted.

2 1 82q~5 ~ 16S
Wo 95/21939 P~l/r On peut aussi greffer sur les surfaces réactives (chimiquement ou biochimiquement) d'autres molécules à activité
biologique, nvL;-.~ .lt des virus ou d'autres composants: membranes, léce~utt:u.... , membranaires, polysaccharides, PNA, not:lmm~nt S 11 est IS~ Pmrnt possible de fixer le produit d'une réaction d'intéret biologique (par exemple la PCR) sur les surfaces préparées.
Le procédé selon la présente invention permet la mise en évidence et/ou la u...- .t;li.~linn de molécules biologiques, mais également la mesure de distance intramoléculaire, la séparation de certaines molécules biologiques, l1u~ .lt un prélèvement par mise en oeuvre des techniques de couplage antigène/anticorps et/ou ADN/ARN.
En particulier, la présente invention a pour obje~ un procédé
de mise en évidence d'une macromolécule consistant en une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, selon la présente invention, caractérisé en ce que:
- on met l'échantillon ~ul~OI,o.~dant ~tu solvant A, dans lequel ladite macromolécule est en solution, en contact avec la surface du support dans des conditions de formation d'un hybride ADN~ADN, ADN/ARN ou de formation du produit de reaction protéine/proteine, 20 - I'hybride ou une macromolécule de marquage de l'hybride ou du produit de réaction étant ancré en une partie, le reste étant libre en solution, on l'étire par deplacement du ménisque créé par le contact du solvant avec la surface pour orienter les hybrides ou lesdites macromolécules de marquage et on effectue la mesure ou I'observation des hybrides ou desdites macromolécules de marquage ainsi orientés.
Avantageusement, I'ADN fixé et l'ADN de l'échantillon sont colorés de façon différente et après étirement on mesure la position de la séquence complémentaire par rapport à l'extrémité de l'ADN de 1 'échantillon.
De façon appropriee on peut utiliscr les méthodes de détection ELISA ou FISH.
L'~h~ntillon d'ADN peut être le produit ou le substrat d'une amplification enzymatique d'ADN telle que la PCR, c'est-à-dire qu'on peut réaliser l'amplification de l'ADN une fois celui-ci ancré et aligné selon le procédé de l'invention ou avant son ancrage et son ~ nempnt~
. , . .. .. . _ . ..... .. . _ _ _ ~ W095/21939 21 8~9~ rr~ 5 Le passage du ménisque, en étirant linéairement les molécules, sous forme de bâtonnets, les rend plus f~rilr-nnr-nt d~t~C~hlP~ si elles sont marquées. Par ailleurs, ces molécules allongées sont stables à
l'air libre et peuvent etre observées meme après plusieurs mois, sans 5 présenter de dégradation apparente.
Lors d'une réhydratation, les molécules d'ADN peuvent rester adsorbées et allongées. De plus, il est possible de procéder à une hybridation sur la molécule allongée.
De plus, présentant un signal corrélé et d'orientation 10 uniforme de par leur étirement, ces molécules sont distinctes du bruit environnant. Il est donc facile d'ignorer les poussières, les inhomogénéites, qui ne présentent pas de corrélation spatiale particuliere. L'alignement est aussi intéressant car en solution, les molécules en pelote fluctuent thermiquement, ce qui entraine des 15 variations tres importantes de leur signal de fluorescence recueilli de préférence avec une faible profondeur de champs et limite leur observation. La présente invention permet donc l'observation de molécules isolées avec un très grand rapport signal sur bruit. (S/N).
Il est remarquable que ce rapport soit indépendant du 20 nombre de molécules ancrées. Le rapport S/N posé par la détection d'une molécule est le meme que pour 10 000. De plus cette techniquc d'étirement permet de discriminer aisément entre des molécules de longueurs variées.
On peut a~d..~p~ procéder aux étapes suivantes pour améliorer encore le rapport S/N:
- La molécule étant immobile, on peut intégrer son signal de fluorescence.
- L'observation au microscope présente un champ réduit (typiquement 100 ~m x 100 ~m avec un objectif x 100 à immersion, N.A. = 1.25). Pour un rrh~ntillon de 1 cm2 on peut soit procéder à un balayage, soit envisager l'utilisation d'objectifs d'agr~nrli~r-Tn~nts moindres (x 10 ou x 20) mais d'ouverture numérique élevée.
- Les batonnets étant toujours parallèles, on peut envisager une méthode de filtrage spatial optique pour augmenter encore le rapport S/N.

wo g5121939 D ~l/r~ .65 - D'autres méthodes de fluorescence globale sont envisageables telles que celles décrites dans la demande de brevet européen EP 103426.
- La linéarisation des molécules s'observe aussi bien dans le cadre d'un ancrage physico-chimique que dans le cas de liaisons de type imml1nrllrlgique (DlG/anti-DlG).
- Une fois la surface à l'air libre, les molécules d'ADN sont stables (restent intègres, meme après plusieurs semaines) et fh~
On peut avantageusement utiliser cette propriété pour différer l'étape d'ancrage de l'étape de repérage/comptage des mol.6c~ c ancrées, si cette détection se fait par exemple, mais sans s'y limiter, par ~ o~;e à lluule~ ce. Une telle utilisation est couverte par ia présente invention.
- Une technique de double (ou multi) fluorescence peut év~ntl..ollPm~n~ serv~r à améliorer le rapport S/N ou à détecter une double fonctionnalité.
Les molécules étirées peuvent etre révélées par différentes méthodes enzymologiques ou autres, telles la fluorescence ou l'utilisation de sondes chaudes ou froides. Leur détection peut se faire par mesure d'un signal global (par exemple la fluorescence) ou par l'observation individuelle des molécules par Illi.l usco~,ie optique à flu~ e~ce~
ie électronique, méthodes à sondes locales (SlM, AFM, etc.).
Ainsi de facon générale, la présente invention permet la mise en évidence, la séparation et/ou le dosage d'une molécule dans un Prh~ntill~n, par un procédé ~al,~ .isé en ce qu'on utilise une surface capable de fixer spécifiquement ladite molécule, et en ce que la mise en évidence, la séparation ou le dosage sont effectués grace à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.
Parmi les réactifs on distingue les réactifs fluorescents et les réactifs non-fluorescents.
Les réactifs fluorescents contiennent des molécules flu~JIescellle;~, choisies avec avantage pour être des molécules longues de taille superieure à 0,1 ~m et réagissant de manière spéciflque directement ou indirectemerlt avec les surfaces prétraitées. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, une molécule d'ADN double brin teintée à l'aide de wogsnl93g 21 8~9~5 I~l/r~ 6~

sondes flU~ C~AAt~ s (ethidium bromide, YOY0, nucléotides fluorescents, etc.) pouvant s'ancrer di~ lt par une ou plusieurs eA~ és sur une surface ~,l;..~.lldllL éventuellement un groupement de type vinyl, amine ou autre. ~ f.,l par un choix judicieux du pH ou de la teneur 5 ionique du milieu ou par application d'une tension électrique sur la surface.
Il est f ~qlf~mf nt possible d'utiliser une fonctinnnqli~qtion particulière de la molécule (DIG, biotine etc...) pour l'ancrer en un ou plusieurs points sur une surface présentant des sites complémentaires 10 (anti-DlG, streptavidine, etc).
Les réactifs non-fluorescents permettant la détection de molécules pr~qlqhl~mf^nt alignées selon la présente invention, peuvent consister notamment en des billes ou microparticules ancrées par l'intermédiaire d'une autre molécule fixée de manière spécifique directement ou indirectement à la molécule alignée et ne présentant qu'une faible interaction non-spécifique avec la surface.
Par exemple, on peut citer des billes Dynal recouvertes de streptavidine permettant l'ancrage sur ADN biotynilé, aligne selon la présente invention.
Selon que la molécule recherchée est détectée directement par fluorescence ou indi. ~L~.ll.llt à l'aide des réactifs ci-dessus, on parlera de "détection directe~ ou par drapeau~.
Afin de limiter les problèmes associés à des temps de réaction trop lents, on peut avantageusement réduire les temps de diffusion des réactifs vers la surface en utilisant de petits volumes de réaction. Par exemple, mais sans s'y limiter, en conduisant la réaction dans un volume de quelques microlitres déterminé par l'espacement entre deux surfaces dont l'une est traitée pour présenter des sites réactifs et l'autre est inerte ou traitée pour ne pas présenter de sites réactifs, dans les conditions de la réaction.
La détection du nombre de molécules alignées peut elre réalisée sur un petit nombre de molécules (typiquement 1 à 1 000), par un test physique macroscopique faible bruit ne nécessitant ni microscope électronique ni radioactivité ni néc~di~ lent la PCR

21 8290~
woss/2ls3s r~llr~-l-i6s Les procédés d'~ n~m~nt et de détection selon la présente invention sont susceptibles d'etre mis en oeuvre par des personnes n'ayant qu'une expérience de laboratoire réduite.
La spécificité de certaines réactions biologiques peut etre S limitée. Ainsi, dans le cadre de l'hybridation, les hybrides peuvent être alra.ilO (réactions avec d'autres sites) tout en présentant un nombre réduit d'appariement et donc une qualité de liaison moindre. La présente invention couvre ~g,~l..l.~.ll I'utilisation possible d'une étape de test de la qualité des liaisons obtenues. Ce test permet de dissocier les produits 10 appariés de faSon non-spécifique hible, par adsorption, forces hybrophobes, liaisons hydrogènes imparfaites, hybridation i,.lpa. rdile, nr,t~mm~nt C'est pourquoi, I'invention concerne également dans un procédé de mise en évidence ou de dosage tel que décrit pr~6r~ mmrnt, un 15 procédee où l'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité
biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais ;I~IJdl i.. ts avant la détection.
Ce procédé offre, outre la possibilité de détruire les couples s, la possibilité d'orienter les produits du couplage, ce qui 20 facilite les mesures ou les observations.
On peut ainsi appliquer aux surfaces, apres fixation des éléments ~ taires, une contrainte qui peut etre constituée par l'utilisation simple ou combinée de:
- centrifugation, 2S - gradient de champ magnétique appliqué aux réactiFs non-fiuorescents pris alors pour inclure des microbilles m~nétic~hles ou magnétiques, - agitation, - écoulement liquide, 30 - passage de ménisque, - électrophorèse - variation de température, et/ou gradient de temperature.
On détermine alors par les techniques de détection faible bruit décrites ci-dessus le nombre de systèmes étant restés intègres ou 35 s'étan~ détruits.
-~WO95/21939 ~1 ~29~5 r~llr~ 6~

Les techniques d'alignement et de détection décrits selon la présente invention peuvent etre utilisés pour de nombreuses applicationsparmi lesquelles, mais sans s'y restreindre:
- I'identification d'un ou plusieurs élémènts de séquence d'ADN ou d'ARN que l'on peut utiliser avec avantage pour le diagnostic de pathogènes ou la cartographie physique d'un génome. En particulier, les techniques décrites ci-dessus permettent l'obtention d'une cd-~uK.dphie physique directe sur ADN génomique, sans passer par une étape de clonage. Il est entendu que la molécule peignee étant étirée par rapport à sa longeur crystallographique, on procède à des mesure relatives. Il est ainsi possible de mesurer la taille de fragments d'ADN et la distance entre fragments avec une résolution de l'ordre de 200 nm pour des méthodes optiques ou de l'ordre de 1 nm par l'utilisation de méthodes de champs proche telles que AFM ou STM pour visualiser et mesurer la distance entre sondes sur de l'ADN aligné.
Ceci conduit naturellement à:
1) la détection de délétions, additions ou translocations de séquences ~0 Kenomiques, en particulier dans le diagnostic de maladies génétiques (par exemple la myopathie de Duchesne);
2) I'identification de promoteurs de différents gènes par la mesure de la distance entre les séquences régulatrices et celle e ;primées; 2 1 82q ~ 5 ~ 16s Wo 95/21939 P ~ l / r It can also be grafted onto reactive surfaces (chemically or biochemically) other molecules with activity biological, virus, or other components: membranes, léce ~ utt: u ...., membrane, polysaccharides, PNA, not: lmm ~ nt It is possible to fix the product of a reaction of biological interest (eg PCR) on the prepared surfaces.
The method according to the present invention makes it possible to evidence and / or the use of biological molecules, but also the measure of intramolecular distance, the separation of certain biological molecules, it is necessary to take a sample antigen / antibody and / or DNA / RNA coupling techniques.
In particular, the object of the present invention is to provide a method highlighting a macromolecule consisting of a sequence of DNA or a protein in a sample, according to this characterized in that:
the sample ~ ul ~ OI, o. ~ dant ~ tu solvent A, in which said macromolecule is in solution, in contact with the surface of the support under conditions of formation of a DNA ~ DNA hybrid, DNA / RNA or protein / protein reaction product formation, Hybrid or a macromolecule for labeling the hybrid or reaction product being anchored in one part, the rest being free in solution, it is stretched by displacement of the meniscus created by the solvent contact with the surface to orient the hybrids or said marking macromolecules and the measurement or The observation of the hybrids or said labeling macromolecules so oriented.
Advantageously, the fixed DNA and the sample DNA are colored differently and after stretching one measures the position of the sequence complementary to the end of the DNA of 1 sample.
Appropriately, one can use the methods of ELISA or FISH detection.
The DNA sample may be the product or substrate of a enzymatic amplification of DNA such as PCR, i.e.
perform amplification of the DNA once it is anchored and aligned according to the method of the invention or before its anchoring and ~ nempnt ~
. ,. .. ... _. ..... ... _ _ _ ~ W095 / 21939 21 8 ~ 9 ~ rr ~ 5 The passage of the meniscus, by linearly stretching molecules, in the form of rods, renders them more fertile than c ~ hlP ~ if they are marked. Moreover, these elongated molecules are stable at free air and can be observed even after several months without 5 exhibit apparent degradation.
During rehydration, DNA molecules can remain adsorbed and elongated. In addition, it is possible to hybridization on the elongated molecule.
In addition, having a correlated signal and orientation Uniform by their stretch, these molecules are distinct from the noise surrounding. It is therefore easy to ignore dust, inhomogeneities, which do not exhibit a spatial correlation special. The alignment is also interesting because in solution, the molecules in flakes fluctuate thermally, which leads to 15 very important variations of their fluorescence signal collected from preferably with shallow depth of field and limits their observation. The present invention therefore makes it possible to observe isolated molecules with a very large signal-to-noise ratio. (S / N).
It is remarkable that this report is independent of Number of anchored molecules. The S / N ratio posed by the detection of a molecule is the same as for 10,000. In addition this technique of stretching makes it easy to discriminate between molecules of varying lengths.
We can a ~ d .. ~ p ~ proceed to the following steps to further improve the S / N ratio:
- The molecule being immobile, we can integrate its signal of fluorescence.
- Observation under the microscope presents a reduced field (typically 100 ~ mx 100 ~ m with a 100 x immersion lens, NA = 1.25). For a size of 1 cm2 you can either proceed to a sweeping, or consider the use of objectives of approval ~ tn ~ ~ ~
less (x 10 or x 20) but with high numerical aperture.
- The sticks being always parallel, one can envisage a optical spatial filtering method to further increase the S / N ratio.

wo g5121939 D ~ l / r ~ .65 - Other methods of global fluorescence are possible such than those described in the European patent application EP 103426.
- The linearization of molecules is observed both in the context physico-chemical anchoring than in the case of Immunoglobulin (DlG / anti-DlG).
- Once the surface is in the open, the DNA molecules are stable (remain upright, even after several weeks) and fh ~
This property can be advantageously used to delay the step of anchoring the step of locating / counting mol.6c ~ c anchored, if this detection is done for example, but not limited to, by ~ o ~; e to lluule ~ ce. Such use is covered by the present invention.
- A double (or multi) fluorescence technique can Ev ~ ntl..ollPm ~ n ~ serves to improve the S / N ratio or to detect a double functionality.
The stretched molecules can be revealed by different enzymological or other methods, such as fluorescence or the use of hot or cold probes. Their detection can be done by measuring a global signal (eg fluorescence) or by observation individual molecules by Illi.l usco ~, ie optical flu ~ e ~ this ~
ie electronics, local probe methods (SlM, AFM, etc.).
Thus, in a general way, the present invention allows the highlighting, the separation and / or the determination of a molecule in a Prh ~ ntill ~ n, by a process ~ al, ~ .ized in that a surface is used able to specifically fix said molecule, and in that the setting Obviously, the separation or the dosage is carried out thanks to a reagent fluorescent or non-fluorescent detecting the presence of the fixed molecule.
Among the reagents are distinguished fluorescent reagents and non-fluorescent reagents.
Fluorescent reagents contain molecules flu ~ JIescellle; ~, chosen with advantage to be long molecules of size greater than 0.1 ~ m and specifically reacting directly or indirectly with the pretreated surfaces. For example, but without however limited, a double-stranded DNA molecule stained with the aid of wogsnl93g 21 8 ~ 9 ~ 5 I ~ l / r ~ 6 ~

FLU ~ C ~ AAt ~ s probes (ethidium bromide, YOY0, fluorescent nucleotides, etc.) can be anchored di ~ lt by one or more eA ~ és on a surface ~, l; .. ~ .lldllL possibly a group of type vinyl, amine or other. ~ f., l by judicious choice of pH or content Ionic medium or by application of a voltage on the area.
It is very easy to use a functinnnqli ~ qtion molecule (DIG, biotin etc ...) to anchor it in one or several points on a surface with complementary sites 10 (anti-D1G, streptavidin, etc.).
Non-fluorescent reagents allowing the detection of molecules pre ~ qlqhl ~ mf ^ nt aligned according to the present invention, can consist in particular of balls or microparticles anchored by via another molecule specifically fixed directly or indirectly to the aligned molecule and not presenting as a weak non-specific interaction with the surface.
For example, mention may be made of Dynal beads coated with streptavidin for anchoring to biotinylated DNA, aligns with present invention.
Depending on whether the desired molecule is detected directly by fluorescence or indi. ~ L ~ .ll.llt using the reagents above, one speak of "direct detection ~ or flag ~.
To limit the problems associated with reaction times too slow, we can advantageously reduce the diffusion times of reagents to the surface using small reaction volumes. By example, but not limited to, driving the reaction in a volume a few microliters determined by the spacing between two surfaces one of which is treated to present reactive sites and the other is inert treated in order not to present reactive sites, under the conditions of the reaction.
Detection of the number of aligned molecules may be performed on a small number of molecules (typically 1 to 1000), by a low noise macroscopic physical test that does not require a microscope neither radioactivity nor nec ~ di ~ slow PCR

21 8290 ~
woss / 2ls3s r ~ llr ~ -l-i6s The methods of ~ n ~ m ~ nt and detection according to the present invention are likely to be implemented by persons having only reduced laboratory experience.
The specificity of certain biological reactions can be S limited. Thus, in the context of hybridization, hybrids can be alra.ilO (reactions with other sites) while presenting a number reduced matching and therefore a lower link quality. The current invention covers ~ g, ~ l..l. ~ .ll the possible use of a test step of the quality of the links obtained. This test makes it possible to separate the products Paired in a non-specific, adsorption, forceful manner hybridophobes, imperfect hydrogen bonds, hybridization. rdile, nr, t ~ mm ~ nt Therefore, the invention also relates in a method of detection or dosage as described pr ~ 6r ~ mmrnt, a Process wherein the reaction product is subjected to the activity molecule biological and sample molecule to a constraint in order to destroy the bad ones; I ~ iJdl i .. ts before detection.
This process offers, in addition to the possibility of destroying couples s, the possibility of orienting the products of the coupling, which 20 facilitates measurements or observations.
It is thus possible to apply to surfaces, after fixing elements, a constraint that may be the simple or combined use of:
- centrifugation, 2S - magnetic field gradient applied to non-reactive fiuorescents then taken to include microbeads m ~ ntic ~ hles or magnetic, - agitation, - liquid flow, 30 - meniscus passage, - electrophoresis - temperature variation, and / or temperature gradient.
It is then determined by the weak detection techniques noise described above the number of systems remained intact or 35 were destroyed ~.
-~ WO95 / 21939 ~ 1 ~ 29 ~ 5 ~ r ~ llr ~ 6 ~

The alignment and detection techniques described in the The present invention can be used for many applications, including but not limited to:
- the identification of one or more elements of DNA sequence or of RNA that can be used with advantage for the diagnosis of pathogens or the physical mapping of a genome. In In particular, the techniques described above make it possible to obtain of a direct physical CDDphie on genomic DNA, without go through a cloning step. It is understood that the molecule comb being stretched with respect to its crystallographic length, relative measurements are made. It is thus possible to measure the size of DNA fragments and the distance between fragments with a resolution of the order of 200 nm for optical or the order of 1 nm by the use of near field methods such as AFM or STM to visualize and measure the distance between probes on aligned DNA.
This naturally leads to:
1) the detection of deletions, additions or translocations of sequences ~ 0 Kenomics, especially in the diagnosis of diseases genetic (eg Duchesne myopathy);
2) the identification of promoters of different genes by measurement the distance between the regulatory sequences and that e;

3) la localisation de protéines régulatrices par l'identification de leur position le long de l'ADN ou de la position de leur séquence cible;
1) le séquencage partiel ou total par mesure de la distance à l'aide de microscopies à champs proche (par e~;emple AFM ou ST~I) entre des sondes hybridées ap~al le.la~lt à une base d'oligonucléotides de longueur donnée.
- L'amplification enzymatique in situ sur des ADN alignés.
- I'amélioratioll de la sensibilité des techniques d'ELlSA avec 1 possibilité de détecter un faible nombre (éventuellement infcrieur à 1 000) de réactions immunologiques.

WO95/21939 ~1 829~5 l~llr~ 16s Ainsi, on peut procéder à une cartographie physique directement sur un ADN génomique sans passer par une étape de clonage.
L'ADN génomique est extrait, purifié, éventuellement coupé par un ou plusieurs enzymes de restriction puis peigné sur des surfaces selon le 5 procédé de la présente invention.
La position et la taille du gène reche}ché sur l'ADN
génomique sont alors déterminées par hybridation avec des sondes spécifiques dudit gène, notamment extraites de parties de l'ADN
complémentaire (cDNA) du produit dudit gène reche}ché.
De faSon similaire en hybridant un ADN génomique peigné, puis dénaturé avec du cDNA total marqué par fluorescence ou tout autre marqueur p~ llt de localiser l'hybride, on identi~le la position, la taille et le nombre des exons du gène en question, d'où l'on déduit sa taille et son or~nic~tk-n génétique (exons, introns, séquences régulatrices).
La position du gène étant déterminée comme décrit ci-dessus, ou connue, il est alors possible d'identifier par hybridation les séquences flanquantes du gène. Pour cela, on procèdeFa, avec avantage, par hybridation avec des sondes marquées, provenant par e,Yemple d'une librairie d'oligo-~ucl~otides, pour identifier deux ou plusieurs sondes qui 20 s'hybrident de part et d'autre du gène.
A partir de cette déte}mination, il est alors possible par les techniques d'amplification enzymatique, par exemple la PCR in situ (Nuovo G.J. PCR in situ hybridization: ~n.~l~.ul~ and applications, Raven Press (lg9 )) d'amplifier le fragment délimité par les sondes flanquantes 25 qui peuvent servir d'amorces à la réaction, rragment qui peut contenir le gène recherché avec ses régions régulatrices qui peuvent etre tissu ou développement spécifique et qu'on peut alors isoler et purifier.
On peut aussi proceder par polymérisation in situ sur des amorces extraites du cDNA du gène en question pour extraire des 30 fragments d'ADN complémentaires des régions flanquantes du gène comme mentionné par Mortimer et al. (Yeast 5, 3~1 1989). Ces fragments peuvent alors servir dans la préparation d'amorc~s pour un proccdé
d' tmp~ii~ication enz~matique du g~ne et de ses séquences nanquantes.

~WO95121939 ~ 9~5 r~llr~c~-l6~
On peut aussi utiliser les méthodes citée par A. Thierry et B.
Dujon (Nucl. Acid Research 20 5625 (1992)) pour insérer par recomhin~icon homologue ou alé~loi~ cnt des sites spécifiques connus d'endonucléase dans un ADN génomique ou un fragment d'ADN
génomique. Le peignage de cet ADN permet l'identification du gène d'intérêt et des sites spécifiques insérés, par les méthodes d'hybridation in situ décrites ci-dessus. A partir de cette identification et préférablement si les sites d'intéret sont des régions d'intérêt proches du gène, on les utilisera comme amorce d'une réaction d'amplification enzymatique (in situ ou autre) du gène en question et de ses séquences flanquantes.
L'amplification du gène recherché procède alors par les techniques d'ampilfication enzymatique connues telles que PCR sur le Fragment amplifié comme décrit ci-dessus en utilisant des amorces accessibles par les exons constituant le cDNA, ou des amorces correspondant à des séquences flanquantes.
Par le peignage d'ADN génomique ou autre, il est aussi possible de déterminer par hybridation la présence ou l'absence de séquences régulatrices d'un gène particulier proximal, à partir desquelles on déterminera les familles possibles de protéines régulatrices de ce gène (par exemple: helix-loop-helix, zinc-finger, leucine-zipper).
Les réactions spécifiques entre séquences particulières d'ADN/ARN/PNA et une autre molécule (ADN, ARN, protéine) peuvent se faire avant ou après alignement des molécules selon la présente invention.
Ainsi, dans le cadre du diagnostic génétique et de la cartographie physique, on utilise avec avantage les méthodes connues de FISII (Pinl;el et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA ~, 293 1 ( 1986)) pour hybriderdes oligonucléotides simple-brin marqués à de l'ADN d'abord aligné, puis dénaturé. La révélation des hybrides se fera par les techniques connues 30 (fluorescences, microbilles etc) avec une résolution dans la mesure des distances allant de 0,2 llm (en optique) à Inm (en microscopie a champ proche; AFM, STM etc...).
Alternativement, on peut d'abord hybrid~r des ADN
marqueurs fiuorescents à de l'ADN simple-brin en solution, puis aligner 35 cette construction par l'action du ménisque après l'avoir transformé en ADN double-brin et ancré à une surface adéquate.

~ 1 8~9Q5 WO 95/21939 ~ rn7."'~ ~16S

On peut aussi utiliser la présente invention pour la détection de la présence d'un pdlllG~,_.Ie. A titre d'exemple, on pourra procéder de deux manières différentes selon que la réaction de ~o~ nre (hybridation, ,.~ ..t de protéine) ait lieu avant ou après ~ nFmFnt par le ménisque.
Ainsi, à titre d~exemple, un ou plusieurs oligonurl~otiFlF~c sondes sont ancrées 3. une ou plusieurs régions d'une surface.
L'hybridation de l'ADN po~ iFIl~ "Fnt pathogénique est effectuée in situ dans des conditions stringentes de facon à n'ancrer que les molécules hybridées. Leur détection et ~IUdll~iri~d~iOn s'eFfectuent après ~ nF~mF~nt par le ménisque selon la présente invention.
Alternativement, I'ADN potentiellement pathogénique est d'abord aligné, puis dénature et hybridé avec un oli~ ol~u~léotide sonde dans des rr~nflitir~nc ~llillhF~ La détection de l'hybride s'effectue alors par les méthodes connues notamment de FISH, comme décrit ci-dessus.
D1une manière similaire, on peut détecter la présence (ou l'absence) d'un petlt nombre de mr~ c, telles des protéines, des lipides, des sucres ou des antigènes. On procèdera avec avantage, à une mr,~lifir:?ticn mlneure des techniques d'ELlSA, la méthode de détection habituelle étant remplacee par la détection d~une molécule fluorescente alignée selon la présente invention et couplée à l'un des réactifs de la réaction d'ELlSA.
Par ailleurs, comme mentionné par K.R. Allan et al. (US
84 114), La cartographie génétique peut procéder par une mesure de la taille de rld~ d~ADN. Or les techniques originales d'étirement des molécules décrites plus haut (I'étirement par le ménisque) permet une mesure de la longueur des molécules étirées et cela sur un très petit échantillon (quelques milliers de molécules).
On peut, par exemple, mais sans sy restreindre, procéder de la manière suivante:
Un échantillon d'ADN est fragmenté (à l'aide d'enzymes de restriction), teinté avec un fluorophore puis ancré sur une surface. Les molécules sont ensuite étirées par le ménisque et la taille des fragments étirés déterminée par microscopie optique à fluorescence avec une resolution et une taille limite de l'ordre de 1 000 bp (0,3 ~m).

WO95121939 21 ~Q5 r~llr~5/c-l6s .

Dans ce but, mais aussi si l'on veut aligner des molécules très longues (2 lO~,lm) on utillsera avec avantage des techniques connues pour limiter la dégradation de longues macromolécules lors de leur manipulation (par cisaillement hydrodynamique).
Ainsi comme mentionné par D.C. Schwartz, on procèdera avec avantage, à une condensation des molécules à l'aide d'un agent condensateur (par exemple la spermine ou un alcool) lors de leur manipulation. Eventuellement, leur décondeDsation s'effectuera lors du contact du solvant A avec la surface d'ancrage S.
Afin de réduire la dégradation des macromolécules lors de l'étirement par le ménisque, on utilisera des techniques de translation du ménisque qui ~ lls-llt le fi~ rnl~nt hydrodynamique. Par exemple, mais sans pour autant s'y restreindre, en retirant très lentement (s200 ~/sec) la surface S, d'un volume ffn~f~ nt (2 100~1) du solvant A.
La présente invention a également pour objet une surface présentant un ou plusieurs types de macromolecules alignées obtenues selon la présente invention. En particulier, on peut obtenir une surface ou un empilement de surfaces présentant des propriétés électriques ou optiques anis~lo~c~.
La présente invention a aussi pour objet un procédé
d~alignement et de mise en évidence de l'ADN dans lequel l'ADN est étiré
par un procédé d'alignement selon l'invention, puis dénaturé puis hybridé avec des sondes spécifiques pour déterminer la position ou la taille d'une ou plusieurs séquences spéciflques.
La présente invention a également pour objet un procédé de cartographie physique d'un gène sur un ADN génomique dans lequel l'ADN est aiigné ou mis en évidence selon un procéde de l'invention.
En particulier, la position et la taille du gène recherché sur l~ADN génomique, sont déterminées par hybridation avec des sondes specifiques dudit gène à cartographier.
La présente invention a égalemcnt pour objet -un coffret utilc pour la mise en oeuvre d'un procédé de cartographie selon l'invention, constituc p~r de l'ADN
génomique total d'un hôte de référence, Wo95/21939 ~1 8~9~5 r~llr~llol6s ~4 - un support présentant une surface permettant l'ancrage et l'ali~m~m~nl de l'ADN du patient conformément au procédé
de l'invention - des sondes spécifiques du ou des gène(s) à cartographier et des réactifs pour l'hybridation et la détection de l'ADN.
La présente invention a également pour objet un procédé
d'alignement et de mise en évidence de l'ADN dans lequel l'ADN est étiré
puis dénaturé puis hybridé avec des sondes spécifiques pour déterminer la présence ou l'absence d'une ou plusieurs séquences d'ADN dans ledit ADN
10 aligné.
La présente irlvention permet la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic d'une pathologie liée à la présence ou l'absence d'une séquence d'ADN spécifique de la pathologie dans lequel on utilise un procédé d'alignement selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un coffret utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic selon l'invention caractérisé en ce qu'il comporte un support dont la surface permet l'ancrage et l'alignement de l'ADN du patient selon un procéde de l'invention, des sondes spécifiques du gène impliqué dans la pathologie recherchée et des réactifs pour l'hybridation et la detection de l'ADN.
La présente invention a également pour objet un coffret utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic selon l'invention caractérisé en ce qu'il comporte un support dont la surface présente des sondes spécifiques du gène impliqué dans une pathologie, en particulier 25 de l'ADN pathogène éventuellement marqué, alignées selon le procédé de la présente invention et éventuellement dénaturées; les réacti~s pour préparer et marquer l'ADN du patient en ~ue de son hybridation (par e~;emple la photobiotine, I;it de ~nicl;-translalion" ou de "random priming") et des réactifs pour l'hybridation et la détection de l'ADN
30 suivant les techniques d'hybridation in situ commc décrites ci-dessus.
Il est entendu que des sondes peignées rclatives à des ~athogènes différents peuvent être présentes sur di~Férents supports ou sur le meme support. L'identification du pathogènc correspondant pcut se Faire apres hybridation, soil spacialement (les différentes sondes sont ~W095/21939 21 8~9~ r~Jlr~co~;l6~
séparées Sp~ri~PmPnt par exemple par ancrage photochimique a~ant leur peignage) soit par une difference du spectre de fluo}escence des différents hybrides, résultant d'un marquage différentiel préalable des sondes.
S Enfin, ~a présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un gène dans lequel on identifie la position dudit gène syr de l'ADN génomique aligné par le procédé selon l'invention à l'aide d'une sonde spécifique dudit gène on amplifie par amplification enzymatique, notamment, PCR in situ la séquence dudit gène et éventuellement ses séquences flanquantes.
La présente invention permet donc de mettre en oeuvre un procédé de remplacement d'un gène dans le génome d'une cellule eucaryote par l'insertion ciblée d'un gène étranger à l'aide d'un vecteur contenant ledit gène étranger préparé selon le procédé de préparation de gène ci-dessus.
L'insertion ciblée peut être effectuée selon les techniques décrites dans WO90/11354 en transfectant des cellules eucaryotes avec un vecteur contenant ledit ADN étranger à insérer flanqué de deux séquences génomiques qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le gène receveur. L'ADN d'insertion peut comporter soit une séquence codante, soit une séquence régulatrice. Les séquences flanquantes sont choisies afin de permettre par recombinaison homologue, selon le cas, soit l'eYpression de la séquence codante de l'ADN d'insertion sous le contrôle des séquences régulatrices du gène receveur, soit l'expression d'une ~5 séquence codante du gène receveur sous le contrôle de séquence régulatrice de l'ADN d'insertion.
Les gènes génomiques et les cDNA obtenus en utilisant le procédé de localisation de gènes selon l'invention peuvent être insérés dalls des vecteurs d'e~pression capables de s'insérer dans une cellule hôte procaryote, eucaryote ou virale. Les protéines polypeptides et peptides dérivés sont inclus dans la présente invention.
La description qui va suivrc, est faite en se référant aux figures annexées sur lesqucllcs:
- la figure 1 schcmatise la détection d'un pathogène dans une molécule d'ADN fluorescente par hybridation avec une molécule ancre;

21 829Q~
Wo 95/21939 A ~,I/r~ . 165 ~6 - la figure ~ hl~m~tic.o la cartographie génétique par extension de l'ADN et l'utilisation d'un ADN marqueur;
- la figure 3 c~-hrm~ticr la détection d'une ré~ction immunologique (ELISA) à l'aide d'une molécule "drapeau": un ADN fluorescent 5 utilisé comme marqueur de réaction;
- la figure ~ est une microphotographie de fluorescence montrant l'extension d'ADN de phage A par l'avancée du ménisque, à gauche on aperçoit des molécules d'ADN en solution étirées par l'ecoulement d'évaporation parallèle au ménisque, à droite des molécules d'ADN à l'air libre après leur étiremerlt perpendiculairement au ménisque;
- les figures 5(a) et 5(b) sont des microphotographies de fluorescence montrant, respectivement, un ADN marqué à la digogixénine (DIG) sur une surface recouverte d'anti-DlG et étiré par le ménisque, et, en contrôle, un ADN non marqué sur une surface anti-DlG, on remarquera la très grande spécificité des surfaces et l'absence d'ancrage non-spécifique;
- la figure 6 représente le schéma de l'étalement de l'ADN par passage du ménisque. L'ADN en solution est ancré sur une surface traitée. La solution d'ADN est recouverte d'une lamelle ronde non-traitée;
- la figure 7 represente des histogrammes de la longueur des molécules d'ADN ~ peignées sur des surfaces de verre:
a) recouvertes de molecules silanes terminées par un groupement ~5 amine, b)recouvertes de polylysine, c~ nettoyées dans un mélange eau ox~génee/acide sulfurique.
- la figure 8 représente des molécules d'ADN peignées sur des surfaces de verre recouvertes de pol~lSsine. On remarque que les molécules attachées par leurs deux e~trémités forment des boucles.
- la figure 9 représente des YACs peignés par retrait d'une lamelle traitée d'une solution de ces molécules.
- la figure L0 montre l'identification de la présence e~ de la taille d'un cosmide sur un YAC par hybridation in situ.

~ W095121939 21 ~d?q@,5 1~,1/r~ 165 Dans le mode "diagnostic~, les sondes (les ancresn) possèdent un ~ U~ réactif (DIG, biotine, etc.) capable de s'ancre} de - manière spécifique à une surface selon la présente invention (ayant par exemple comme site d'ancrage un anticorps anti-DlG ou la streptavidine).
La détection de la réaction d'ancrage peut se faire directement par détection de la llu~les;~ de la molécule d'ADN teintée par des molécules flUul~ (ethidium bromide, YOYO, nllc~ ti~ fluorescents) (figure 1). Elle peut aussi se faire ill~ par détection d'une "molécule drapeau: un réactif capable de se fixer sur la molécule d'ADN/ARN (par exemple par hybridation, interaction protéine-ADN, etc.), mais ne présentant pas d'affinité pour les sites d'ancrage de la sonde.
Dans le mode 'icartographie~ on peut utiliser les techniques d'hybridation in situ (FISH). Il est aussi possible d'envisager d'autres techniques, par exemple en hybridant en solution de l'ADN avec des sondes présentant des réactifs fluorescents selon la présente invention. La détection de la position des sondes se fait après l'~ n~m~nt de la molécule selon la présente Invention.

Maténels et méthodes L'ADN-~ et l'anticorps monoclonal (Anti-DlG) proviennent de Boehringer-Mannheim. Les trichlorosilanes proviennent de Roth-Sochiel. Les sondes nucleiques fluorescentes (YOYO1, YOY03 et POPO1) proviennent de Molecular Probes. Les lamelles de verre ultrapropres proviennent de Erie Scientiflc (Lamelles (ESCO). Les particules magnétiques proviennent de Dynal. Le microscope est un microscope inversé Diaphot de NIKKON, équipé d'une lampe Xenon pour l'épi-iluorescence et d'une caméra CCD intensifiée Hamamatsu pour la visualisation.
Trai~f~ment de surface Des lamelles de verre sont nettoyées pendant une heure par irradiation UV sous atmosphère d'oxygène (par formation d'ozone). Elles sont ensuite imm~ t~m~nt déposées dans un dessicateur préalablement purgé de traces d'eau par un courant d'argon Un volume d'environ 100 à
500 ~LI du trichlorosilane approprié (H2C=CH-(CH2)N-SiCI3 est introduit dans .

-WO95/21939 ~ 829~5 i~I~r~ c.65 ~, le d~si~rel-r, d'où les surfaces sont retirées après environ 12 heures (n = 6) ou 1 heure (n = 1). Au sortir les surfaces sont nettes et non-mouillantes.
Les groupes fonctionnels de ces surfaces double liaison S (H2C=CH-) peuvent etre transformés en ~;IVU~ tS carboxyles (-COOH) en trempant les larnelles traitées, comme décrit précédemment, pendant une dizaine de minutes dans une solution de 25 mg KMnO4, 750 mg NalO4 dans 1 I d'eau, puis en les rincant trois fois dans de l'eau ultrapure.
Les lamelles ainsi fonctionnalisées peuvent réagir avec des protéines. Un volume de 300 1ll d'une solution aqueuse (20 ~g/ml) de protéines (protéine A, streptavidine, etc.) est déposé sur une lamelle fonctionnalisée en groupement (H2C=CH-). Cette lamelle est incubée environ deux heures à température ambiante, puis rincée trois fois dans de l'eau ultrapure. Les surfaces ainsi traitées sont nettes et mouillantes.
Les surFaces traitées à la protéine A peuvent ensuite réagir avec un anticorps, par exemple anti-DlG, par incubation dans une solution de 20 g/ml d'anticorps.
Par ailleurs, sur les surfaces presentant des groupements carbo~les, on peut greffer des uligolluclévvides présentant une extrémité
amine (-NH2), 20rv`~ll d'une solution de MES (50 mM, pH 55), Carbodiimide (lmg/ml) et 5il1 d'oligo-aminé (10 pmole/140 ~11) sont déposés sur une surface carboxylée et incubés environ 8 heures à température ambiante.
La lamelle est fin~ rnf~nt rincée trois fois dans NaOH (0.4 M) puis quatre fois dans de l'eau ultrapure. Les lamelles ainsi préparées peuvent 25 hybrider des ADN complémentaires de l'oiigonucléotide ancré.
~ncras~e d'ADN natif sur surface double liaison Une goutte de ~ ~11 d~une solution d'A[)N-~ marqué par Quorescence (YOYOl, POPOl ou YOYO3, mais sans tcrminaison particulière) de concentration variable et dans différents tampons (nombre total de 30 molécules < 107) est déposé sur une lamelle prétraitée (C=C) et recouverte d'une lamelle de verre non traitée (diamètre 18 mm). 1~ préparation est incubée environ l heure à température ambiante dans une atmosphère saturée ell vapeur d'eau. Dans un tampon de 0,0~ ~1 MES (pH = 5,5), on obser~e un ancrage quasi-général des molécules d'ADN. Par contre dans WO9SJ21939 ~1 829~5 ~ r~55.1 165 un tampon de 0,01 M Tris (pH = 8) il n'y a p~ u~ducune molécule d'ancrée (rapport > 106). Cette dépendance peut permettre le controle de I'activation/désactivation des surhces (vis-à-vis de l'ADN) par l'intermédiaire du pH.
L'action du ménisque sur la molécule est limitée au voisinage immédiat de celui-ci. La partie de la molécule en solution devant le ménisque fluctue librement et la partie laissée collée à la surface derrière le ménisque est insensible à un ~ I''"&f "f .,t de direction du ménisque. Le taux d'extension de la molécule est donc uniforme et inf~pf~nf~nt de sa taille.
Alicnement et détection de l'ancra~e Par l'action du ménisaue En transférant la préparation précédente dans une almosphère sèche, la solution en s'évaporant va étirer les molécules d'ADN, ancrées à la surface, perpendlculairement au mf nicqu~ La force capillaire sur la molécule d'ADN (quelques dizaines de picoNewtons) est en effet suffisante pour étirer f r~mrl~tf-mf~nt la molécule (plus grande que les forces d'élasticité entropique), mais trop faible pour briser la liaison entre l'extrémité de la molécule et la surface traitée. L'ADN étant marqué
par fluorescence, on observe indivi~ m~nt et aisément les molécules étirées (longueur totale environ 22 llm). L'ancrage entre la surface et l'ADN étant limité aux extrémités, on a pu aussi bien étirer des ADN de phage ~, de YAC ou de E coli (longueur totale supérieure à 400 ~m). Cette préparation d'ADN étirés, lluo~D~cllts et à l'air libre est stable pendant plusieurs jours et peut etre observée de facon non destructive, par épifluorescence (microscope inversé Nikkon Diaphot avec objectif xlO0, O.N.: 1.25).
Ancra~e et détection sPécifiques En traitant les surfaces comme décrit précf ~mm~nt avec un anticorps monoclonal spécifique, on peut contrôler très précisément leur spécificité. Ainsi, on a testé la spécificité de surfaces traitées anti-DlG vis-à-vis d'ADN-~ hybridés avec un oligonucléotide complémentaire d'une des extrémites Cos et possédant un groupement digoxigénine (DIG) et vis-à-vis d'ADN non hybridés. Dans le premier cas, on a observé une extension, par action du ménisque, quasi-générale des molécules ancrées. Dans le second 21 829~5 W0 95121939 P~ r~.~A-16~i cas, on n'a observé que quelques molécules d'ADN (< 10) ancrées dans tout l'échantillon. On estlme donc que la spécificité de la méthode selon l'invention est meilleure 4ue 106.
Des ADN-~ ont aussi été hybridés avec des olif/~n~rl~tides 5 complémentaires d'une des extrémités COS et fixés sur des surfaces carboxylées, comme décrit ci-dessus. Les c~nrliti~nc d'hybridation (eau pure à 40C) n'étaient pas ~L~ lt~o~ car dans des ~)nriition~ LCo thaute salinité) la fluorescence des sondes YOYO1 disparait et les ADN
hybridés ne peuvent etre vus. Les ADN ainsi hybridés ont aussi pu etre 10 alignés par passage du ménisque.
Sensibilité de la dé~ection Afin de déterminer la sensibilité de la méthode de détection p~r extension du ménisque, on a déposé sur des surfaces double liaison des gouttes de 2,5 1ll d'une solution d'ADN-~ dans 0,05 M MES (pH = 5,5) contenant un total de 105,10~ et 1000 molecules. L~ancrage et l'~lifinl~m~nt s'effectuent comme décrit précédemment. Les lamelles sont ensuite observées en microscopie par epifluorescence, pour déterminer la densite de molécules peignées. Celle-ci correspond bien à celle estimée: environ 3) the localization of regulatory proteins by the identification of their position along the DNA or the position of their sequence target;
1) Partial or total sequencing by measuring the distance using near-field microscopy (eg AFM or ST ~ I) between probes hybridized to the base of an oligonucleotide base given length.
- Enzymatic amplification in situ on aligned DNAs.
- Improving the sensitivity of ELlSA techniques with 1 possibility of detecting a small number (possibly to 1000) of immunological reactions.

WO95 / 21939 ~ 1 829 ~ 5 l ~ llr ~ 16s Thus, one can proceed to a physical cartography directly on a genomic DNA without going through a cloning step.
The genomic DNA is extracted, purified, possibly cut by one or several restriction enzymes then combed on surfaces according to the Process of the present invention.
The position and size of the gene retrieved on the DNA
genomic are then determined by hybridization with probes specific to said gene, in particular extracted from parts of the DNA
complementary (cDNA) of the product of said retrieved gene.
In a similar manner by hybridizing a combed genomic DNA, then denatured with fluorescently labeled total cDNA or any other marker to locate the hybrid, we identify the position, the size and number of exons of the gene in question, from which its size is deduced and its genetic ~ nic ~ tk-n (exons, introns, regulatory sequences).
The position of the gene being determined as described above, or known, it is then possible to identify by hybridization the sequences flanking the gene. For this, we proceed, with advantage, by hybridization with labeled probes, derived from e, the example of a library of oligo- ~ ucl ~ otides, to identify two or more probes that 20 hybridize on both sides of the gene.
From this point of view, it is then possible by enzymatic amplification techniques, for example in situ PCR
(Nuovo GJ PCR in situ hybridization: ~ n. ~ L ~ .ul ~ and applications, Raven Press (lg9)) to amplify the fragment delimited by the flanking probes 25 which can serve as primers for the reaction, which fragment may contain the sought gene with its regulatory regions that can be tissue or development and can then be isolated and purified.
It is also possible to carry out polymerization in situ on primers extracted from the cDNA of the gene in question to extract 30 DNA fragments complementary to the flanking regions of the gene as mentioned by Mortimer et al. (Yeast 5, 3-1, 1989). These fragments can then be used in the preparation of primers for a process enz ~ m ~ t ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^

~ WO95121939 ~ 9 ~ 5 r ~ llr ~ c ~ -l6 ~
We can also use the methods mentioned by A. Thierry and B.
Dujon (Nucl Acid Research 5625 (1992)) to insert by recomhin ~ icon homologous or random ~ law ~ cnt known specific sites of endonuclease in a genomic DNA or a fragment of DNA
genomics. The combing of this DNA allows the identification of the gene of interest and specific sites inserted, by hybridization methods in described above. From this identification and preferably if sites of interest are regions of interest close to the gene, they are will use as a primer an enzymatic amplification reaction (in situ or other) of the gene in question and its flanking sequences.
The amplification of the desired gene then proceeds by known enzymatic amplification techniques such as PCR on the Amplified fragment as described above using primers accessible by the exons constituting the cDNA, or primers corresponding to flanking sequences.
By combing genomic or other DNA, it is also possible to determine by hybridization the presence or absence of regulatory sequences of a particular proximal gene, from which we will determine the possible families of regulatory proteins of this gene (for example: helix-loop-helix, zinc-finger, leucine-zipper).
Specific reactions between particular sequences of DNA / RNA / PNA and another molecule (DNA, RNA, protein) can be do before or after aligning the molecules according to this invention.
Thus, in the context of genetic diagnosis and physical mapping, the known methods of FISII (Pin et al., Proc Nat Acad Sci USA ~, 293 1 (1986)) to hybridize single-stranded oligonucleotides labeled with first aligned DNA, then denatured. The revelation of hybrids will be by known techniques (Fluorescences, microbeads, etc.) with a resolution in the measurement of distances ranging from 0.2 llm (in optics) to Inm (in field microscopy close; AFM, STM etc ...).
Alternatively, one can first hybridize ~ DNA
fluorescence markers to single-stranded DNA in solution, then align 35 this construction by the action of the meniscus after transforming it into Double-stranded DNA and anchored to a suitable surface.

~ 1 8 ~ 9Q5 WO 95/21939 ~ rn7. "'~ ~ 16S

The present invention can also be used for detection of the presence of a pdlllG ~, _ .Ie. For example, we can proceed from two different ways depending on the reaction of ~ o ~ nre (Hybridization,. ~ ..t of protein) takes place before or after ~ nFmFnt by the meniscus.
Thus, by way of example, one or more oligonuclei ~ otiFlF ~ c probes are anchored to one or more regions of a surface.
Hybridization of the pathogenic DNA is carried out in situ.
under stringent conditions in order to anchor only the molecules hybridized. Their detection and ~ IUdll ~ iri ~ d ~ iOn are done after ~ nF ~ mF ~ nt by the meniscus according to the present invention.
Alternatively, the potentially pathogenic DNA is first aligned, then denature and hybridized with a oli ~ ol ~ u ~ leotide probe in detection ~ nc ~ llillhF ~ The detection of the hybrid takes place then by known methods including FISH, as described above.
In a similar way, the presence (or the absence) of a small number of mr ~ c, such as proteins, lipids, sugars or antigens. We will proceed with advantage, to a mr, ~ lifir:? ticn mlneure techniques ELlSA, the detection method usually replaced by the detection of a fluorescent molecule aligned according to the present invention and coupled to one of the reagents of the reaction of ELlSA.
Moreover, as mentioned by KR Allan et al. (US
84 114), genetic mapping can proceed by measuring the size of rld ~ d ~ DNA. But the original techniques of stretching molecules described above (stretching by the meniscus) allows measuring the length of the stretched molecules and this on a very small sample (a few thousand molecules).
For example, but without restricting it, proceed from following way:
A DNA sample is fragmented (using enzymes from restriction), tinted with a fluorophore and then anchored to a surface. The molecules are then stretched by the meniscus and the size of the fragments stretched determined by fluorescence optical microscopy with a resolution and a size limit of the order of 1000 bp (0.3 ~ m).

WO95121939 21 ~ Q5 r ~ llr ~ 5 / c-16s .

For this purpose, but also if we want to align very molecules long (2 lO ~, lm) it will be useful to use techniques known for limit the degradation of long macromolecules during their manipulation (by hydrodynamic shear).
So as mentioned by DC Schwartz, we will proceed with advantage, to a condensation of molecules using an agent capacitor (for example, spermine or an alcohol) during their handling. Eventually, their decision will be made at the contact of the solvent A with the anchoring surface S.
In order to reduce the degradation of macromolecules stretching by the meniscus, we will use translational techniques of the meniscus which ~ lls-llt fi ~ rnl ~ nt hydrodynamic. For example, but without restricting it, removing very slowly (s200 ~ / sec) the surface S, of a volume ffn ~ f ~ nt (2 100 ~ 1) of the solvent A.
The present invention also relates to a surface having one or more types of aligned macromolecules obtained according to the present invention. In particular, one can obtain a surface or a stack of surfaces having electrical properties or optics anise ~ lo ~ c ~.
The present invention also relates to a process d alignment and highlighting the DNA in which the DNA is stretched by an alignment method according to the invention, then denatured then hybridized with specific probes to determine the position or the size of one or more specific sequences.
The present invention also relates to a method of physical mapping of a gene on a genomic DNA in which the DNA is highlighted or highlighted according to a process of the invention.
In particular, the position and size of the gene sought on genomic DNA are determined by hybridization with probes specific to said gene to map.
The present invention also relates to a box utilc for the implementation of a method of cartography according to the invention, constituc p ~ r of the DNA
total genomics of a reference host, Wo95 / 21939 ~ 1 8 ~ 9 ~ 5 r ~ llr ~ llol6s 4 ~
a support having a surface allowing anchoring and the ali ~ m ~ m ~ nl of the DNA of the patient according to the method of the invention probes specific for the gene (s) to be mapped and reagents for hybridization and detection of DNA.
The present invention also relates to a method aligning and highlighting the DNA in which the DNA is stretched then denatured and then hybridized with specific probes to determine the presence or absence of one or more DNA sequences in said DNA
10 aligned.
The present invention enables the implementation of a method of diagnosing a pathology related to the presence or absence of a specific DNA sequence of the pathology in which one uses a alignment method according to the invention.
The present invention also relates to a box useful for the implementation of a diagnostic method according to the invention characterized in that it comprises a support whose surface allows anchoring and aligning the patient's DNA according to a method of the invention, probes specific for the gene involved in the pathology and reagents for hybridization and detection of DNA.
The present invention also relates to a box useful for the implementation of a diagnostic method according to the invention characterized in that it comprises a support whose surface has probes specific for the gene involved in a pathology, in particular Optionally labeled pathogenic DNA, aligned according to the method of the present invention and optionally denatured; the reactions to prepare and mark the DNA of the patient in ~ ue of its hybridization (by e ~; example the photobiotin, I; it of ~ nicl; -translalion "or" random priming ") and reagents for hybridization and detection of DNA
Following the in situ hybridization techniques described above.
It is understood that combed probes related to ~ different athogenous may be present on di ~ Férent supports or on the same support. The identification of the pathogen corresponding to After hybridization, so spatially (the different probes are ~ W095 / 21939 21 8 ~ 9 ~ r ~ Jlr ~ co ~ l6 ~
Separated Sp ~ ri ~ PmPnt for example by photochemical anchoring ~ ~ their combing) or by a difference in the fluence spectrum of different hybrids, resulting from a differential differential marking of the probes.
Finally, the subject of the present invention is a method of preparing a gene in which the position of said syr gene is identified genomic DNA aligned by the process according to the invention with the aid of a specific probe of said gene is amplified by enzymatic amplification, in particular, PCR in situ the sequence of said gene and possibly its flanking sequences.
The present invention therefore makes it possible to implement a method of replacing a gene in the genome of a cell eukaryote by the targeted insertion of a foreign gene using a vector containing said foreign gene prepared according to the process for the preparation of gene above.
Targeted insertion can be done according to techniques described in WO90 / 11354 by transfecting eukaryotic cells with a vector containing said foreign DNA to be inserted flanked by two sequences genomics that adjoin the desired insertion site in the gene recipient. The insertion DNA may comprise either a coding sequence, a regulatory sequence. Flanking sequences are chosen to allow homologous recombination, as the case may be, to be the expression of the coding sequence of the insertion DNA under the control regulatory sequences of the recipient gene, ie the expression of a ~ 5 coding sequence of the recipient gene under sequence control Regulator of insertion DNA.
Genomic genes and cDNAs obtained using the gene locating method according to the invention can be inserted dalls e ~ pression vectors able to fit into a host cell prokaryotic, eukaryotic or viral. Protein polypeptides and peptides derivatives are included in the present invention.
The following description is made with reference to the following annexed figures on which:
FIG. 1 schematizes the detection of a pathogen in a fluorescent DNA molecule by hybridization with a molecule anchor;

21 829Q ~
Wo 95/21939 A ~, I / r ~. 165 6 ~
- the figure ~ hl ~ m ~ tic.o genetic mapping by extension of DNA and the use of a marker DNA;
FIG. 3 shows the detection of an immunological re ~ ction (ELISA) using a molecule "flag": a fluorescent DNA
Used as a reaction marker;
Figure ~ is a fluorescence photomicrograph showing phage A DNA extension by advancing meniscus, left we can see DNA molecules in solution stretched by the evaporation flow parallel to the meniscus, to the right of DNA molecules in the open air after their stretching perpendicular to the meniscus;
FIGS. 5 (a) and 5 (b) are fluorescence photomicrographs showing, respectively, a DNA labeled with digogixenin (DIG) on a surface covered with anti-DlG and stretched by the meniscus, and in control, unlabeled DNA on an anti-DlG surface, will notice the very great specificity of the surfaces and the absence non-specific anchoring;
FIG. 6 represents the diagram of the spreading of the DNA by passage of the meniscus. DNA in solution is anchored on a surface treated. The DNA solution is covered with a non-woven treated;
FIG. 7 represents histograms of the length of the DNA molecules combed on glass surfaces:
a) covered with silane molecules terminated by a group ~ 5 amine, (b) coated with polylysine, c ~ Cleaned in a mixture of water ox ~ genee / sulfuric acid.
FIG. 8 represents DNA molecules combed on glass surfaces covered with polysiline. We note that molecules attached by their two e ~ tremities form loops.
FIG. 9 represents YACs combed by removal of a coverslip treated with a solution of these molecules.
- Figure L0 shows the identification of the presence e ~ of the size of a cosmid on a YAC by in situ hybridization.

~ W095121939 21 ~ d? Q @, 5 1 ~, 1 / r ~ 165 In the "diagnostics" mode, the probes (the anchors) have a ~ U ~ reagent (DIG, biotin, etc.) capable of anchoring surface-specific manner according to the present invention (having by as an anchoring site an anti-D1G antibody or streptavidin).
The detection of the anchoring reaction can be done directly by detection of llu ~ les; ~ of the DNA molecule dyed by molecules flUul ~ (ethidium bromide, YOYO, nllc ~ ti ~ fluorescents) (figure 1). It can also be done ill ~ by detecting a "molecule flag: a reagent capable of binding to the DNA / RNA molecule (eg hybridization, protein-DNA interaction, etc.), but having no affinity for the anchor sites of the probe.
In the 'icartography' mode one can use the techniques in situ hybridization (FISH). It is also possible to consider other techniques, for example by hybridizing in solution DNA with probes having fluorescent reagents according to the present invention. The detection of the position of the probes is done after the ~ n ~ m ~ nt of the molecule according to the present invention.

Matenals and methods The ~ -DNA and the monoclonal antibody (Anti-D1G) come from from Boehringer-Mannheim. Trichlorosilanes come from Roth-Sochiel. Fluorescent nucleic probes (YOYO1, YOY03 and POPO1) come from Molecular Probes. Ultra-clean glass slats come from Erie Scientiflc (Lamelles (ESCO).
Magnetics come from Dynal. The microscope is a microscope Inverted Diaphot of NIKKON, equipped with a Xenon lamp for epi iluorescence and intensified CCD camera Hamamatsu for the viewing.
Surface treatment Slats of glass are cleaned for one hour by UV irradiation under oxygen atmosphere (by ozone formation). They are then imm ~ t ~ m ~ nt deposited in a desiccator previously purged of traces of water by a stream of argon A volume of about 100 to 500 ~ LI of the appropriate trichlorosilane (H2C = CH- (CH2) N-SiCI3 is introduced into .

-WO95 / 21939 ~ 829 ~ 5 i ~ I ~ r ~ c.65 ~, the d ~ si ~ rel-r, from where the surfaces are removed after about 12 hours (n = 6) or 1 hour (n = 1). On leaving the surfaces are clear and not wetting.
The functional groups of these double bond surfaces S (H2C = CH-) can be converted to ~; IVU ~ tS carboxyl (-COOH) by soaking the treated larelles, as previously described, during ten minutes in a solution of 25 mg KMnO4, 750 mg NalO4 in 1 l of water, then rinsing them three times in ultrapure water.
The slats thus functionalized can react with proteins. A volume of 300 μl of an aqueous solution (20 μg / ml) of proteins (protein A, streptavidin, etc.) is deposited on a coverslip group functionalized (H2C = CH-). This coverslip is incubated about two hours at room temperature and then rinsed three times in ultrapure water. The surfaces thus treated are sharp and wetting.
Protein A-treated surFaces can then react with a antibodies, for example anti-D1G, by incubation in a solution of 20 g / ml of antibody.
Moreover, on surfaces presenting groups carbo ~ les, one can graft uligolluclévvides having an end amine (-NH2), 20 rpm of a MES solution (50 mM, pH 55), carbodiimide (1 mg / ml) and 5 μl of oligo-amine (10 pmol / 140 -11) are deposited on a carboxylated surface and incubated for about 8 hours at room temperature.
The coverslip is finely rinsed three times in NaOH (0.4 M) and then four once in ultrapure water. The slats thus prepared can Hybridize complementary DNAs of the anchored oligonucleotide.
~ ncras ~ e native DNA on double bond surface A drop of ~ ~ 11 of a solution of A [) N- ~ labeled with Quorescence (YOYOl, POPOl or YOYO3, but without particular tcrminaison) of varying concentration and in different buffers (total number of 30 molecules <107) is deposited on a pretreated coverslip (C = C) and covered an untreated glass slide (diameter 18 mm). 1 ~ preparation is incubated for about 1 hour at room temperature in an atmosphere saturated with water vapor. In a buffer of 0.0 ~ ~ 1 MES (pH = 5.5), observed ~ an almost universal anchoring of DNA molecules. In contrast WO9SJ21939 ~ 1 829 ~ 5 ~ r ~ 55.1 165 a buffer of 0.01 M Tris (pH = 8) there is no ~ uune molecule anchored (ratio> 106). This dependence can allow the control of Activation / deactivation of the excess (vis-à-vis the DNA) by via the pH.
The action of the meniscus on the molecule is limited to the neighborhood immediate of it. The part of the molecule in solution in front of the meniscus fluctuates freely and the part left stuck to the surface behind the meniscus is insensitive to a direction of the meniscus. The rate of extension of the molecule is therefore uniform and inf ~ pf ~ nf ~ nt of its cut.
Alone and detection of the ancestor By the action of menisaue By transferring the previous preparation into a dry atmosphere, the solution while evaporating will stretch the molecules of DNA, anchored to the surface, perpendicular to the mf nicqu ~ The force capillary on the DNA molecule (a few tens of picoNewtons) is in sufficient effect to stretch the molecule (larger than the forces of entropy elasticity), but too weak to break the bond between the end of the molecule and the treated surface. DNA being labeled by fluorescence, the molecules are indivi ~ m ~ nt and easily observed stretched (total length about 22 μm). The anchorage between the surface and the DNA being limited to the extremities, it was also possible to stretch DNA from ~ phage, YAC or E coli (total length greater than 400 ~ m). This DNA preparation stretched, lluo ~ D ~ cllts and in the open air is stable during several days and can be observed in a non-destructive way, by epifluorescence (Inverted microscope Nikkon Diaphot with objective xlO0, ON: 1.25).
Ancra ~ e and specific detection By treating the surfaces as described precf ~ mm ~ nt with a specific monoclonal antibody, one can very precisely control their specificity. Thus, the specificity of anti-D1G treated surfaces against DNA-hybridized with an oligonucleotide complementary to one of the extremities Cos and having a digoxigenin group (DIG) and vis-à-vis unhybridized DNA. In the first case, an extension was observed, action of the meniscus, quasi-general of the anchored molecules. In the second 21,829 ~ 5 W0 95121939 P ~ r ~. ~ A-16 ~ i In this case, only a few DNA molecules (<10) anchored in any the sample. It is therefore clear that the specificity of the method according to the invention is better than 106.
DNA ~ were also hybridized with olif / ~ n ~ r ~ tides 5 complementary of one of the ends COS and fixed on surfaces carboxylated as described above. Hybridization c ~ nrliti ~ nc (water pure at 40C) were not ~ L ~ lt ~ o ~ because in ~ ~ nition ~ LCo thait salinity) the YOYO1 probe fluorescence disappears and the DNA
hybridized can not be seen. The DNAs thus hybridized could also be 10 aligned by passing the meniscus.
Sensitivity of the detection To determine the sensitivity of the detection method For meniscus extension, double bonded surfaces were drops of 2.5 μl of a ~ DNA solution in 0.05 M MES (pH = 5.5) containing a total of 105.10 ~ and 1000 molecules. The anchorage and the lifeline are carried out as described previously. The slats are then observed by epifluorescence microscopy, to determine the density of combed molecules. This corresponds well to that estimated: approximately

4-6 molécules d'ADN par champ de vision (100 ~lm x 100 I-m) pour un total de 105 molécules d'ADN. Pour la plus faible concentration, on a pu observer une dizaine de molecules étendues par action du ménisque. Ce nombre est essentiellement limité par le grand nombre de champs de vision n~CcOO.~ O à couvrir tout l'échantillon (environ 25 000), ce qui rend une recherche manuelle difficile, mais peut etre avantageusement effectuée a~lt~matiquement ou aussi avec un objectif plus faible, mais à
plus grand champ. En conclusion, la sensibilité de la méthode selon l'inventlon permet une détection et un comptage individuel de moins de 1 000 molécules d'ADN.
Dét~endance de l'étirement sur le traitement de surface L'histogramme des longueurs d'ADN-i~, greffés sur des surfaces différentes, puis alignés par passage du ménisque montre un pic bien défini, m^ais différent pour les différentes surfaces. Ainsi sur des surFaces recouvertes d'un silane se terminant par un groupement vinyl l'ADN est étiré jusqu'à environ 22 ~,-m (voir ci-dessus) pour des surfaces ~wo 95~21939 21 82 905 J ~I/r~' ~ l6~

siianisées avec un ~IUU~ IC~It amine (-NH2), I'histogramme présente un pic à 21 ,~-m (Fig. 7 (a)) et sur du verre propre à environ 18.5 llm (hg.
7(c)).
L'étirement dépend donc du traitement de surface.
S E~ pr ~ 2 pf~iPn~re de molécules d'ADI~ sur dl~.~ . sutfaces On a observé le peignage moléc~ ire de l'ADN sur des surfaces de verre traitées de différentes facons. On joue sur la différence d'adsorption entre les e.~ , de la molécule et le reste de celle-ci. En 10 adsorbant des polymères chargés positivement sur une surface de verre on hvorise une adsorption des molécules d'ADN chargées négativement, '`"rlon'l~nt lorsque cette charge est grande la molécule d'ADN est collée sur toute sa longueur et le peignage est impossible. Mais il est possible de modifier la charge des polymères adsorbés sur le verre en modifiant les 15 conditions de pH, en effet, les charges positives sont portées par exemple par des groupes NH2 qui passent à l'état protonné NH~ pour un pH
inférieur au pK de la base correspondante. En pH basique les charges disparaissent et la surface n'attire plus l'ADN. En controlant flnement le pH on a observé que les molécules d'ADN en solution passaient d'un état où
20 elles sont c~ llcllt collées à la surface à une ph~se intLI ulédi~ où
elles ne sont ancrées que par leurs extrémités puis à une phase où la surface ne présente plus d7affinité pour l'ADN. Dans la phase intermédiaire le peignage mnl~c~ ire est réalisable.
On a étudié des surfaces recouvertes d'un silane terminé par 25 un ~ I~U~ t N~2 pour lesquelles on observe un collage total à pH < 8, un peignage pour 8.5 < pH < 9.5. Le nombre de molécules peignées est maximum à pH = 8.5 il est divisé par 2 à pH = 9 el par 4 à pH = 9.S. On a aussi déterminé l'extension relative sur cette surface qui correspond à 1.26 comme on peut le voir sur l'histogramme 2 de la figure 7 qui représente 30 des histogrammes de la longueur des molécules d'ADN A peignées sur des surfaces de verre:
a) recouvertes de silane terminés par un groupement amine, b)recouvertes de polylysine, c) nettoyées dans un mélange eau oxygénée/acide sulfurique.

,, Zl ~29~5 Wog~/21939 r~llrl~ s, :i6s ~
-On a aussi regardé des surfaces recouvertes de polylysine qui présentent des caractéristiques d'accrochages similaires en pH: domaine de peignage 8.5 et présentent une extension relative plus faible: 1.08. On peut avoir un exemple typique sur la figure 8 qui represente des molécules d'ADN peignées sur des surfaces de verre recouvertes de polylysine. On remarque que les molécules attachées par leurs deux extrémités forment des boucles.
Finalement, on a retrouvé le même comportement sur des surfaces de verre fraîchement nettoyées dans un mélange eau ox,vgenée /
acide sulfurique concentré. Ces surfaces sont très moulllantes et se polluent rapidemenr, cependant, on a observé un domaine de peignage entre 5.5 c pH < 7.4 tandis que le domaine d'adsorption forte se situe à
pH = 4.5 L'extension relative des molécules correspond à 1.12.
E~PL~
Ali~nement uniforme et directionel de YAC
lllg de YAC préalablement teint dans son bloc d'agarose à
l'aide d'une sonde fluorescente YOYO1 est chauffé à 68C, agarasé, puis dilué dans 10 ml de MES (50m~f pH S.5). Deux Iamelles silanisées (surfaces C=C) sont incubées pendant -I,Sh dans cette solution puis retirees à
environ 170 ~ m/sec. Les molécules de YAC sont toutes alignees parallèlement à la direction du retrait des lamelles (Fig. 9). L'intégrité des molécules ainsi alignées est meilleure que par évaporation après déposition entre deux lamelles.
~Ivbridation d'un cosmide sur un YAC t~ei~né
Un YAC teinté comme décrit précédemment est ancré sur une surface C=C (e3;~tre deux lamelles) puis aligne par le ménisque, lors de l'évaporation de la solution. Les sondes (cosmides) sont marquées par inco}poration d'un nucléotide biotynilé par la technique de "randon priming~. Les sondes marquées (100 ng) et 5 ~g d'ADN de sperme de saumon soniqu~ (.=500 bps) sont purifiees par precipitation dans Na-acétate et éthanol, puis dénaturees dans du formamidc.
Les YAC peignés sont dénaturés entr~ deux lamelles avec 1~0 ,d do solu~Qq dén~ur~n~e (f~rm~mide 70 i, ~ ~ SSC) sur une pl~que wos5l2l939 21 829Q~i P~llr~ ~-165 chauffante à 80C pendant 3 minutes. Les sondes (20 ng) prr~l~hl~m~nt dénaturées sont déposées sur la lamelle dans une solution d'hybridation (formamide 55 %, 2 x SSC, 10 % dextran sulfate) recouvertes d'une lamelle qui est scellée avec du caoutchouc liquide (rubber cement). L'hybridation 4-6 DNA molecules per field of view (100 ~ lm x 100 Im) for a total of 105 molecules of DNA. For the lowest concentration, we could observe a dozen molecules extended by action of the meniscus. This number is essentially limited by the large number of fields of vision n ~ CcOO. ~ O to cover the entire sample (about 25 000), which makes a manual search difficult, but can be advantageously carried out either automatically or with a lower objective, but larger field. In conclusion, the sensitivity of the method according to Inventlon allows detection and individual counting of less than 1,000 molecules of DNA.
Det ~ endance of the stretch on the surface treatment The histogram of the lengths of DNA-i ~, grafted onto different surfaces and then aligned by passing the meniscus shows a peak well defined, but different for different surfaces. So on silan-coated surfaces with a vinyl group the DNA is stretched to about 22 ~, -m (see above) for surfaces ~ wo 95 ~ 21939 21 82 905 J ~ I / r ~ ~ l6 ~

siianized with a ~ IUU ~ IC ~ It amine (-NH2), the histogram presents a peak at 21 ° C (Fig. 7 (a)) and clean glass at about 18.5 μm (hg.
7 (c)).
The stretch therefore depends on the surface treatment.
SE ~ pr ~ 2 pf ~ iPn ~ re molecules of ADI ~ on dl ~. ~. sutfaces Molecular combing of DNA was observed on glass surfaces treated in different ways. We play on the difference adsorption between e. ~, the molecule and the rest thereof. In Adsorbing positively charged polymers on a glass surface adsorption of the negatively charged DNA molecules is promoted, when this charge is large the DNA molecule is stuck on all its length and combing is impossible. But it is possible to modify the charge of the polymers adsorbed on the glass by modifying the 15 pH conditions, indeed, positive charges are brought for example by NH 2 groups which pass to the protonated state NH ~ for a pH
less than the pK of the corresponding base. In basic pH the charges disappear and the surface no longer attracts DNA. By controlling flange the pH it was observed that the DNA molecules in solution were passing from a state where 20 they are c ~ llcllt glued to the surface at an ul ~ ul ~ ul ~ where they are anchored only by their ends and then at a stage where the surface no longer has affinity for DNA. In the phase intermediate combing mnl ~ c ~ ire is achievable.
Silicone-coated surfaces have been studied.
25 a ~ I ~ U ~ t N ~ 2 for which there is a total bonding at pH <8, combing for 8.5 <pH <9.5. The number of combed molecules is maximum at pH = 8.5 it is divided by 2 at pH = 9 and by 4 at pH = 9.S. We also have determined the relative extension on this surface that corresponds to 1.26 as can be seen in histogram 2 of FIG.
Histograms of the length of the combed DNA molecules on glass surfaces:
a) coated with silane terminated with an amine group, (b) coated with polylysine, c) cleaned in a mixture of hydrogen peroxide and sulfuric acid.

,, Zl ~ 29 ~ 5 Wog ~ / 21939 r ~ llrl ~ s,: i6s ~
-We also looked at surfaces covered with polylysine which have similar clashing characteristics in pH: domain combing 8.5 and have a smaller relative extension: 1.08. We can have a typical example in Figure 8 which represents DNA molecules combed on glass surfaces covered with polylysine. We note that the molecules attached by their two ends form loops.
Finally, we found the same behavior on glass surfaces freshly cleaned in a mixture of ox, salvaged water /
concentrated sulfuric acid. These surfaces are very moulllantes and pollute quickly, however, an area of combing has been observed between 5.5 c pH <7.4 while the strong adsorption domain is at pH = 4.5 The relative extension of the molecules corresponds to 1.12.
E ~ PL ~
YAC Uniform and Directional Aliement lllg of YAC previously dyed in its agarose block to using a YOYO1 fluorescent probe is heated to 68C, agarated, then diluted in 10 ml of MES (50m ~ f pH S.5). Two silanized tiels (surfaces C = C) are incubated during -I, Sh in this solution and then withdrawn at about 170 ~ m / sec. YAC molecules are all aligned parallel to the direction of lamella removal (Fig. 9). The integrity of molecules so aligned is better than by evaporation after deposition between two lamellae.
~ Ivbridation of a cosmid on a YAC t ~ ei ~ born A tinted YAC as previously described is anchored on a surface C = C (e3; ~ be two lamellae) then aligns with the meniscus, when evaporation of the solution. The probes (cosmids) are marked by Incorporation of a biotinylated nucleotide by the technique of "hiking ~ priming. The labeled probes (100 ng) and 5 ~ g of sperm DNA
salmon (~ = 500 bps) are purified by precipitation in Na acetate and ethanol, then denatured in formamidc.
The combed YACs are denatured between two lamellae with 1 ~ 0, d do solu ~ Qq den ~ ur ~ n ~ e (f ~ rm ~ mide 70 i, ~ ~ SSC) on a pl ~

wos5l2l939 21 829Q ~ i P ~ llr ~ ~ -165 heating at 80C for 3 minutes. The probes (20 ng) prr ~ l ~ hl ~ m ~ n denatured are deposited on the coverslip in a hybridization solution (55% formamide, 2 x SSC, 10% dextran sulfate) covered with a coverslip which is sealed with rubber cement. hybridization

5 est réalisée une nuit à 37C en chambre humide.
La révélation des hybrides se fait suivant les protocoles connus pour les hybridations in situ sur chrrlmos~mr-c drrrnfll~c~c (D.
Pinkel et al., PNAS USA 83, Z931 (1986) et PNAS USA~, 9138 (1988)).
En microscopie, en fluorescence on observe alors des 10 segments hybridés tels celui montré dans la Fig. 10. Cet exemple démontre la possibilité de détecter la présence d'un gène sur une molécule d'ADN, qui peut être utilisé à des fins de diagnostic ou de cartographie physique du génome.
. 5 is performed overnight at 37C in a humid chamber.
The revelation of hybrids is done according to the protocols known for hybridization in situ on chromatin ~ mr-c drrrnfll ~ c ~ c (D.
Pinkel et al., PNAS USA 83, Z931 (1986) and PNAS USA, 9138 (1988)).
In microscopy, fluorescence is then observed Hybridized segments such as that shown in FIG. 10. This example demonstrates the possibility of detecting the presence of a gene on a DNA molecule, that can be used for diagnostic or physical mapping purposes of the genome.
.

Claims

CLAIM

1. Process for alignment of macromolecule(s) on surface S
of a support, characterized in that one causes to move on said surface S the triple line S/A/B/ (meniscus) resulting from contact with a solvent A
with the surface S and a medium B, said macromolecules having a part, in particular one end, anchored on the surface S, the other part, in particular the other end, being in solution in the solvent A.

2. Method according to claim 1, characterized in that the Displacement of the meniscus is done by evaporation of the solvent A.

3. Method according to claim 1, characterized in that the displacement of the meniscus is done by relative displacement of the interface A/B with respect to the surface S.

4. Method according to claim 3, characterized in that for move the meniscus, surface S is removed from solvent A or Solvent A
is removed from the surface S.

5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in what the meniscus is a water-air meniscus.

6. Method according to one of claims 1 to 5 characterized in that that the support is constituted at least on the surface by a polymer organic or inorganic, a metal, a metal oxide or sulphide, a semiconductor element such as silicon or a semiconductor element oxide conductor, or a combination thereof.

7. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the support is constituted at least on the surface by glass, surface oxidized silicon, gold, graphite, molybdenum sulfide or mica.

8. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in whether the support is in the form of plate, ball, fiber or particles.

9. Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the solvent A in which the macromolecules to be aligned are in solution is placed between two supports, at least one of which corresponds to said surface support S, and the meniscus is displaced by evaporation.

10. Method according to one of claims 1 to 9 characterized in that that the anchoring of the macromolecule is done by interaction physicochemical, in particular adsorption or by covalent bond, either l between the surface and the macromolecule, or indirectly between the surface and another molecule recognizing and/or interacting with said macromolecule.

11. Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that a support having a reactive group on the surface is used exposed having an affinity for said macromolecule or a molecule to biological activity capable of recognizing said macromolecule.

12. Method according to one of claims 1 to 11, characterized in that the surface is covered with a group chosen from the groups vinyl, amine, carboxyl, aldehyde or hydroxyl.

13. Method according to one of claims 10 or 12, characterized in that the surface comprises:
- on a support, a substantially monomolecular layer of a organic compound of elongated structure having at least:
- a binding group having an affinity for the bracket, and - an exposed group having little or no affinity for said support and said fixing group in the fixing conditions, but possibly presenting, after a chemical modification following the fixing, a affinity for said macromolecule or molecule with activity biological.

14. Method according to one of claims 1 to 13 characterized in what we achieve is the anchoring of a part of a macromolecule by adsorption on a surface, by bringing said macromolecule into the presence of said surface in a region of pH or ionic content of the medium determined or by applying a determined electrical voltage to the anchor surface.

15. Method according to claims 1 to 14 characterized in that the pH to achieve the anchoring is chosen in a range between a pH favoring a state of complete adsorption and a pH favoring a absence of adsorption.

16. Method according to one of claims 1 to 15 in which one achieves the anchoring of a nucleic acid or a protein by adsorption on a surface having groups with double bonds ethylenic or amine groups, by putting the nucleic acid or the protein in the presence of the surface in a zone of pH or content ion of the medium, determined.

17. Method according to claim 16 characterized in that one carries out anchoring unfunctionalized DNA by adsorption onto surfaces covered with molecules terminated by a vinyl or amine group.

18. Process according to claim 17, in which one carries out the anchoring of the DNA by its extremity on a surface presenting groups with a double ethylenic bond, by bringing the DNA into the presence of the surface at a pH below 8.

19. Method according to claim 18, characterized in that the reaction is carried out at a pH between 5 and 6 and is then stopped at pH 8.

20. Method according to claim 17, characterized in that carries out the anchoring of DNA by its extremity on a surface covered with polylysine or a silane group terminated by an amine group.

21. Method according to claim 17, characterized in that carries out the anchoring of the DNA by its extremity on a covered surface by an amine group by bringing the DNA into the presence of the surface at pH between 8 and 10.

22. Method according to claim 17, characterized in that carries out the anchoring of DNA by its extremity on a surface of treated glass previously in an acid bath, by bringing the DNA into the presence of said surface at pH between 5 and 8.

23. Surface with aligned macromolecule(s) obtained by the Process according to one of Claims 1 to 22.

24. Process for detection, separation and/or assay of a macromolecule in a sample, characterized in that one uses an alignment method according to one of claims 1 to 23 wherein is attached to the surface S a molecule with biological activity capable to recognize said macromolecule of the sample and in that the setting clearly, the separation or the assay are carried out using a reagent fluorescent or not detecting the presence of the fixed molecule or said macromolecule.

25. Method according to one of claims 1 to 24, characterized in what said macromolecule and molecule with biological activity are chosen from proteins, nucleic acids, lipids, polysaccharides and their derivatives.

26. Method according to claim 24, characterized in that said macromolecule and molecule with biological activity are chosen among, antibodies, antigens, DNA and RNA, ligands or their receptors and their derivatives.

27. Method according to claims 24 to 26, characterized in that that the fixed DNA contains the sequence complementary to a sequence of DNA to be isolated from a sample.

28. Method according to claims 24 to 26, characterized in that that the bound protein is able to recognize and bind specifically a protein to be isolated from a sample.

29. Method according to claims 24 to 26, characterized in that that said molecule with biological activity is chosen from biotin, avidin, streptavidin, their derivatives or an antigen-antibody.

30. Method according to claims 24 to 26, characterized in that that the surface is weakly fluorescent and that the reagent is fluorescent.

31. Method according to claims 24 to 26, characterized in that that the reagent consists of beads.

32. Method according to one of claims 24 to 26, characterized in that the detection is made by optical or near-field microscopy.

33. Method according to one of claims 24 to 26, characterized in subjecting the reaction product between the molecule to activity biological agent and the macromolecule of the sample to a stress in order to destroy mismatches before detection.

34. Method for detecting a macromolecule consisting of into a DNA or protein sequence in a sample, depending one of claims 24 to 33, characterized in that:
- the sample corresponding to solvent A is placed, in which said macromolecule is in solution, in contact with the surface of the support under conditions of formation of a DNA/DNA hybrid, DNA/RNA or formation of the protein/protein reaction product, the hybrid or a macromolecule marking the hybrid or the reaction product being anchored in one part, the rest being in solution, it is stretched by displacement of the meniscus created by the contact solvent with the surface to orient the hybrids or said labeling macromolecules and the measurement or the observation of hybrids or said macromolecules of marking thus oriented.

35. Method according to one of claims 24 to 34, characterized in that the fixed DNA and the DNA of the sample are "stained" in a way different and, after stretching, the position of the sequence is measured relative to the end of the sample DNA.

36. Method according to one of claims 24 to 35, characterized in that an ELISA or FISH detection method is used.

37. Method according to one of claims 24 to 36, characterized in whether the sample is the product or substrate of an amplification nucleic acid enzyme.

38. Method according to one of claims 24 to 37, characterized in what the DNA is stretched, then denatured and then hybridized with probes specific to determine the position or size of one or more determined DNA sequences.

39. Method of physical mapping of a gene on a DNA
genomics in which the DNA is aligned and/or highlighted according to a method of one of claims 1 to 38.

40. Method according to claim 39, characterized in that the position and size of the gene sought on the genomic DNA are determined by hybridization with probes specific for said gene at map.

41. Box useful for the implementation of a method according to one of claims 39 or 40 comprising:

- total genomic DNA from a reference host, - a support having a surface allowing anchoring and DNA alignment, - specific probes of the gene to be mapped, and - reagents for hybridization and DNA detection.

42. Method according to one of claims 34 to 37, characterized in what the DNA is stretched, then denatured and then hybridized with probes specific to determine the presence or absence of one or more given DNA sequences.

43. Method for diagnosing a pathology related to the presence or the absence of a given DNA sequence specific to said pathology wherein a method according to claim 42 is used.

44. Box useful for the implementation of a process of diagnostic according to Claim 43, characterized in that it comprises:
- a support whose surface allows anchoring and alignment of the patient's DNA, - specific probes of the gene involved in the pathology wanted, and - reagents for hybridization and DNA detection.

45. Box useful for the implementation of a process of diagnostic according to Claim 43, characterized in that it comprises:
- a support whose surface has specific probes of the gene involved in the pathology sought, said probes being anchored and aligned on the surface;
- reagents for labeling DNA, in particular DNA
of the patient;
- reagents for hybridization and DNA detection.

46. Method for preparing a gene from genomic DNA
characterized in that the position of said gene on the DNA is identified genomics aligned by the method of one of claims 1 to 37 using of a specific probe of said gene and the amplification is carried out enzyme of the sequence of said gene and/or of its flanking sequences and isolating the amplified product.

47. DNA construct containing a gene prepared by the method of claim 46 optionally associated with a sequence homologous or heterologous regulator.

48. Use of a gene obtained by a process according to claim 46 for preparing a DNA construct useful in a method of replacing a gene in the genome of a cell eukaryotic by targeted insertion of a foreign gene, said foreign gene being obtained by the method of claim 46.

49. Vector useful in a method of gene replacement into the genome of a eukaryotic cell by targeted insertion of said gene foreign, characterized in that said foreign gene is prepared according to the method of claim 46.